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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE

MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

Segunda Edición

QFB. Alejandro CAMACHO CRUZ QFB. Martha GILES GÓMEZ QFB. Aurora ORTEGÓN ÁVILA M C. Mercedes PALAO RINCÓN M C. Beatriz SERRANO LÓPEZ M E. Olga VELÁZQUEZ MADRAZO

Editora: María Mercedes Palao Rincón UNAM-UAM

El presente trabajo se desarrolló como parte del proyecto PAPIME EN-211604

Edición autorizada por el Comité Editorial de la Facultad de Química.

México D.F., 2009

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Índice

Índice ___________________________________________________________ 2

Agradecimientos _________________________________________________ 4

Introducción _____________________________________________________ 5

SECCIÓN 1. MÉTODOS DE PRUEBA.

Procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su análisis microbiológico . ___________________________ 6

Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico __________________________________________________ 20

Cuenta en placa de bacterias ______________________________________ 28

Determinación de coliformes totales por cuenta en placa _______________ 38

Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (NMP). _________________________________________________________ 44

Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. _____________ 60

Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. ___ 72

Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos. _________ 84

Método para la determinación de Vibrio cholerae en alimentos, hielo y agua. _________________________________________________________ 106

Método para la determinación de Listeria monocytogenes en alimentos. _ 126

SECCIÓN 2. ANEXOS.

Medios de Cultivo _______________________________________________ 138

Diluyentes, soluciones, reactivos e indicadores ______________________ 186

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Tinciones______________________________________________________ 192

Características de las cepas patógenas de Escherichia coli ____________ 195

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AGRADECIMIENTOS Los autores agradecemos profundamente el apoyo que nos han brindado:

QFB Raúl Garza Velasco, Secretario Académico de Docencia de la Facultad; Dr. Rodolfo Pastelín Palacios, Jefe del Departamento de Biología; QFB María del Pilar Granada Macías, Secretaria de Apoyo del Departamento de

Biología Un agradecimiento especial a las profesoras:

Dra. Gloria Díaz Ruíz QA. Aleida Mina Cetina QFB. Adriana G. Mejía Chávez

Por la revisión, comentarios y sugerencias que nos permitieron mejorar la presente edición.

A todos los profesores y colegas que en algún momento nos orientaron e hicieron sugerencias para mejorar este trabajo. Agradecemos también a la Dirección General del personal Académico de la UNAM quien a través del Proyecto PAPIME EN -211604 apoyó la realización de este material didáctico.

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INTRODUCCIÓN Este manual, que dedicamos con todo afecto a nuestros estudiantes, tiene como propósito apoyarlos en su formación, para adquirir conocimientos, aptitudes y actitudes, en especial en aspectos de control analítico en el campo de la microbiología de alimentos. Hemos tratado de impulsar el desarrollo de un criterio en el área, que permita a los profesionales que pronto serán, actuar como individuos críticos, capaces de elaborar y/o cambiar normas de calidad existentes, que ayuden a garantizar la Salud Pública. El manual está organizado en dos secciones: La primera describe las técnicas microbiológicas que ayudan a detectar a ciertos grupos de microorganismos, géneros y en ocasiones especies, que son patógenos para el hombre y que por sus características metabólicas, de pH, temperatura de desarrollo, etc., se pueden encontrar en determinados alimentos. En esta parte, también se incluyen diagramas de flujo que facilitan desarrollar la técnica en el laboratorio, incluyen medios de cultivo, tiempos y temperaturas de incubación, además de factores específicos que requieren algunos microorganismos para su desarrollo óptimo. Se incluyen las Normas Oficiales Mexicanas (NOM) y se adicionan otras referencias que dan sustento al control de calidad. También dentro de esta sección, se hacen explícitos los aspectos cuantitativos para la expresión adecuada de los resultados. En la segunda sección se localizan los medios de cultivo, se describe su formulación, además de la forma de preparación y condiciones de esterilización. Se anexa su “principio de acción”, el que se refiere a cuál o cuáles son los componentes que inhiben el desarrollo de determinados microorganismos, con lo que el medio de cultivo presenta selectividad para el desarrollo de otro grupo, también se describen las fuentes nutricionales para las bacterias. Aquí se encuentran los diluyentes más comunes utilizados en la preparación de diluciones de las muestras. En esta parte, se incluyen algunos reactivos necesarios para la lectura de pruebas bioquímicas así como colorantes utilizados en tinciones. Esperamos sinceramente que el manual sea útil para nuestros estudiantes, que son quienes dan sentido a nuestro trabajo y esfuerzo diario. Todos los autores estamos abiertos a sus comentarios, especialmente a aquellos que nos permitan mejorar nuestro trabajo docente, a través de este material didáctico, y de las clases. Finalmente, se espera que el presente trabajo sea un apoyo, que impulse la participación de profesionales en la actualización y elaboración de normas, con especificaciones acordes al tipo de alimentos que consume nuestra población.

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Procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

OBJETIVOS

Explicar la importancia del muestreo y sus etapas en la obtención de resultados fidedignos durante el análisis microbiológico de alimentos.

Realizar correctamente la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

GENERALIDADES Para obtener resultados significativos y confiables en el análisis microbiológico de alimentos, son fundamentales: la selección y toma de la muestra, las formas de conservación y transporte al laboratorio. Los alimentos se muestrean principalmente por tres razones:

Realizar el control de la calidad y determinar la vida de anaquel.

Verificar las técnicas de manipulación y producción higiénica.

Determinar la presencia de microorganismos causantes de intoxicaciones o infecciones a través de alimentos.

El control sanitario de los alimentos auxilia en el establecimiento de una fecha de caducidad que garantice el periodo útil o de seguridad para consumir dichos alimentos, esta fecha se establece con base en la vida de anaquel del producto. En algunos casos, el control de calidad se realiza por interés del productor para demostrar la calidad del producto que elabora y si es posible demostrar la superioridad frente a sus competidores. El incremento en la demanda de los consumidores por productos de buena calidad, ha marcado la pauta sobre la producción higiénica de los alimentos, así como el análisis para establecer si las condiciones de almacenamiento o manipulación han sido adecuadas. El muestreo debe diseñarse de tal forma que permita tomar una muestra representativa del alimento por analizar, así como la recolección de cualquier dato útil. Otro aspecto importante que se debe tomar en cuenta es la estandarización de los métodos de prueba para asegurar reproducibilidad, precisión y exactitud en los resultados. Las cuentas numéricas de microorganismos pueden variar considerablemente de acuerdo con la técnica analítica desarrollada, así como con los medios de cultivo utilizados en la misma, entre otros factores; esta variabilidad se elimina utilizando el mismo método de dilución, medios de cultivo, tiempos y temperaturas de incubación, etc., de aquí la importancia de la aplicación de las Normas Oficiales. Finalmente la evaluación de la

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higiene del producto y la aceptabilidad por parte del consumidor, pueden seguirse apropiadamente sólo si se tiene el historial del mismo. En caso de riesgo sanitario o brotes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s), el muestreo se dirige primordialmente al producto sospechoso, sin embargo, cualquier esfuerzo deberá realizarse para colectar tanto los remanentes del alimento sospechoso, platillo de la comida ingerida, así como otros lotes obtenidos durante la misma recolección obtenida del establecimiento, incluso si no se trata del alimento sospechoso será de gran valor, su análisis. Por otra parte si se conoce el microorganismo responsable, la evaluación puede limitarse a su búsqueda. En el diseño del plan de muestreo es muy importante que toda persona implicada en la recolección y envío de las muestras, así como el personal del laboratorio y los analistas que realizan la interpretación de los resultados sean consultados en las primeras etapas del muestreo y análisis microbiológico de las muestras, por lo tanto deberán definirse claramente los objetivos del análisis para evitar pérdida de tiempo y esfuerzo. Todos los análisis microbiológicos tienen sus limitaciones y éstas se deberán tener presentes antes de tomar cualquier acción. El acondicionamiento de la muestra que se va a analizar es de importancia fundamental, por ejemplo si las muestras se colectan inadecuadamente o no se evalúan muestras representativas del lote, los resultados de laboratorio serán poco significativos, ya que las interpretaciones analíticas de un lote grande se basan en una muestra relativamente pequeña, es por esto que los procedimientos de muestreo deben aplicarse rigurosamente. Una muestra representativa es esencial cuando están distribuidos en el alimento microorganismos patógenos o toxinas y la comercialización del mismo depende del contenido bacteriano demostrado en relación a los estándares legales. El número de unidades que comprende una muestra de un lote de alimento determinado deberá ser estadísticamente representativa, de acuerdo con la norma NMX-Z-12-1987, partes 1, 2 y 3 basada en Military Standard (Mil Std 105-D), Norma Militar Americana. La composición y naturaleza de cada lote afecta la homogeneidad y uniformidad del total de la muestra. Un procedimiento estadístico de muestreo correcto, dependiendo si el alimento es sólido, semisólido, viscoso o líquido, deberá determinarse por el muestreador apoyado en la norma NOM-109-SSA-1-1994 la cual determina los “Procedimientos para la toma manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico”. Para asegurar la representatividad del producto por analizar, otro aspecto importante durante el muestreo es que la toma de muestras se realice aleatoriamente en cada lote. Es indispensable tener un control microbiológico de los contenedores usados en la toma de muestras lo cual se logra manteniendo uno de ellos vacío, pero expuesto a las mismas condiciones de recolección de la muestra; también se debe considerar que de acuerdo a la capacidad de estos recipientes y la cantidad de muestra tomada de cada envase correspondiente a un lote, será el número que de ellos se necesite; en el aspecto cuantitativo una muestra unitaria consiste de un mínimo de 100 g de alimento.

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Las condiciones de conservación, transporte, tiempo comprendido entre la recolección de la muestra, su entrega en el laboratorio, así como la realización del análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la población microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos, esto es apreciablemente cierto en los productos perecederos. Además se deben tomar en consideración los siguientes puntos para obtener resultados confiables: La recolección de las muestra se debe de efectuar evitando toda contaminación externa, tanto ambiental, como humana para asegurar la integridad de la misma. Si es posible, enviar las muestras al laboratorio en el empaque original sin abrir. Si el producto es, o se encuentra en empaques de gran tamaño para enviarlos al laboratorio, transferir la porción representativa a un contenedor estéril bajo condiciones asépticas, para lo cual es necesario esterilizar por separado utensilios de acero inoxidable como: cucharas, cuchillos, tenedores, espátulas y tijeras en autoclave o en horno, para que puedan ser utilizados en la toma de muestra. El uso de alcohol y el flamear son insuficientes para esterilizarlos. Utilizar recipientes limpios, secos, libres de fugas, de boca ancha, estériles y de un tamaño apropiado para la toma de las muestras del producto. En lo posible, evitar los recipientes de vidrio que pueden romperse y contaminar el producto alimenticio. Los contenedores como jarras de plástico o latas de metal, deberán estar herméticamente cerrados y a prueba de fugas. Para materiales secos, utilizar cajas de metal estériles, latas, bolsas, o empaques con sellos o cierres adecuados. Las bolsas de plástico estériles (solamente para materiales secos, no congelados) o botellas de plástico, son empaques útiles para líneas de muestras. Se deberá tener cuidado de no sobrellenar las bolsas o fracturar la bolsa por punción. Identificar cada muestra unitaria (definida posteriormente en este apartado) con una etiqueta o cinta adhesiva (maskintape). No etiquetar con una pluma sobre el plástico porque la tinta puede penetrar en el contenedor. De ser posible obtener al menos 100,0 g de cada unidad de muestra. Enviar así mismo controles abiertos o cerrados, dentro de contenedores estériles junto con la muestra. Entregar las muestras al laboratorio rápidamente, manteniendo en lo posible las condiciones de almacenamiento originales. Tomar una muestra adicional para llevar el control de la temperatura, que debe controlarse durante todo el proceso y al llegar al laboratorio. Elaborar una historia de todas las muestras para los tiempos, fechas de recolección y llegada al laboratorio. Los alimentos enlatados o secos que no sean perecederos y sean colectados a temperatura ambiente, no necesitan ser refrigerados. Transportar los alimentos refrigerados o congelados en contenedores seguros y apropiados de construcción rígida, de tal manera que puedan llegar al laboratorio sin cambio alguno. Colectar las muestras congeladas en contenedores pre-enfriados. Colocar los contenedores en un congelador lo suficientemente grande para mantenerlos fríos y espaciados; mantener en congelación las muestras sólidas congeladas todo el

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tiempo. No se deberán congelar los productos refrigerados. Enfriar en hielo entre 0-4 C las muestras refrigeradas, excepto las de mariscos y moluscos bivalvos y colectarlas en un contenedor con refrigerante capaz de mantener la temperatura de la muestra entre

0-4 C hasta su llegada al laboratorio. A menos que se especifique de otra manera, las muestras refrigeradas en general no deberán ser analizadas en un lapso mayor a 36 h después del tiempo de recolección. Empacar las muestras de moluscos bivalvos desconchadas en hielo frapé hasta su análisis. Mantener los mariscos en un intervalo de temperatura entre 0 y 10°C. Examinar los mariscos o moluscos bivalvos en un período de 6 h y no más de 24 h después de que se hayan recolectado. Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservación para los alimentos perecederos ya que para fines oficiales la Ley General de Salud señala claramente que después de la notificación de los resultados del análisis practicado, si existe alguna duda sobre la veracidad de éstos, el particular puede impugnar dentro del plazo contemplado en la misma Ley, lo que da como consecuencia que la Secretaría de Salud analice la muestra testigo en un laboratorio de tercería que ésta señale en presencia de las partes interesadas y el resultado obtenido sea el que en forma definitiva acredite si el producto en cuestión reúne o no los requisitos y especificaciones sanitarias. Sin embargo, los alimentos aún en condiciones apropiadas de conservación, pueden sufrir cambios significativos en sus características biológicas y/o fisicoquímicas, provocando que los resultados de las muestras testigo sean improcedentes. Cualquier información relevante, como la que a continuación se señala, debe acompañar a la muestra del alimento para asegurar que estará sujeta al análisis más adecuado y para permitir que el analista evalúe adecuadamente los resultados:

Nombre y autoridad del oficial muestreador.

Número de identificación de la muestra.

Fecha, hora y lugar del muestreo.

Descripción de la muestra incluyendo número de lote, código de enlatado, etc. y datos de caducidad (úsese por tanto tiempo, mejor antes de tanto tiempo, etc.).

Razón del muestreo.

Nombre del propietario, fabricante, manufacturador, importador, vendedor, comprador, etc.

El proceso y fecha de cocción (si se conoce) de alimentos cocidos.

País de origen, condiciones de almacenamiento en ese país, condiciones y tiempo de transporte (si se conocen).

Condiciones de almacenamiento del lugar del muestreo.

Otros factores importantes, por ejemplo condición del empaque, humedad, sanitización

Método de muestreo (aleatorio a través del lote, aleatorio a través de unidades accesibles, etc.).

Condiciones de almacenamiento y transporte desde que la muestra fue tomada.

Detalles clínicos y epidemiológicos (en caso de sospecha de envenenamiento alimentario, así también en caso de que se considere como fuente de contaminación con patógenos).

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Si fuera necesario transferir las muestras al recibirlas en el laboratorio, deberán colocarse en contenedores adecuados y emplearse las técnicas de asepsia al abrirse. El contenedor deberá estar desinfectado con alcohol al 70%, si es necesario, para evitar la contaminación de la muestra. Otros lotes de un producto similar pueden proporcionar un historial útil y deberán evaluarse junto con cualquier muestra sospechosa. Los siguientes detalles deberán acompañar al formato:

Apariencia- describir la muestra en términos generales, por ejemplo: “100,0 g de jamón color rosado, cocido y rebanado, envuelto en papel”. Deberán registrarse los signos de deterioro, color anormal y presencia de hongos.

Textura- El deterioro microbiano puede causar que los productos se tornen suaves o semi-líquidos, esto aplica particularmente a los productos cárnicos, por ejemplo “el jamón presenta capa acuosa, viscosa, enverdecimiento, etc.).

Olor- Este es un indicador de descomposición o contaminación. Un análisis organoléptico incluye el sabor, pero ÉSTE NO DEBERÁ REALIZARSE EN EL LABORATORIO.

A. Manejo de Muestras en el Laboratorio y Preparación del Homogeneizado de Muestra Tan pronto como la muestra de alimento llega al laboratorio, el analista deberá anotar las condiciones físicas generales de la misma. Si la muestra no puede ser analizada inmediatamente, deberá ser almacenada como se describe posteriormente. Si la muestra va a ser analizada para fines regulatorios, para investigación de un brote por consumo de un alimento, o para una inspección bacteriológica, es esencial el seguimiento estricto a las recomendaciones descritas a continuación. B. Recibo de muestras. 1. Estado del contenedor de muestras. Examinar los contenedores de muestras con

el objetivo de localizar posibles defectos físicos graves. Inspeccionar cuidadosamente bolsas y botellas para comprobar que no presentan hoyos, fracturas, etc., además corroborar que no exista contaminación cruzada proveniente de los defectos descritos anteriormente y que invalidaría el análisis.

2. Etiquetado e Historial. Cada muestra debe estar sellada con tapa y acompañada de

un reporte de recolección completo (como el que se indicó anteriormente) y registrarse el número de muestra y la fecha. Asignar a cada muestra unitaria un número individual y analizarla separadamente a menos de que se trate de una muestra compuesta descrita en el capítulo anterior.

3. Seguimiento de un plan de muestreo. La mayoría de los alimentos se recolectan

de acuerdo a un plan de muestreo. Dependiendo del alimento y el tipo de análisis diseñado, determinar el plan más adecuado.

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4. Almacenamiento. Si es posible, examinar las muestras inmediatamente después de recibirlas. Sin embargo, si el análisis debe ser pospuesto, almacenar las muestras

congeladas a -20 C hasta su realización. Refrigerar las muestras perecederas no

congeladas de 0-4 C por un periodo máximo de 36 h. Los alimentos no perecederos, enlatados o de baja humedad se almacenarán a temperatura ambiente hasta el análisis. C. Descongelado. Utilizar una técnica aséptica para el manejo del producto congelado. Antes de manipular o analizar la muestra de alimento, limpiar las áreas de trabajo y áreas circundantes. Aunado a lo anterior humedecer el área de trabajo y las áreas circundantes con un agente germicida comercial. De preferencia no descongelar las muestras antes del análisis. Si es necesario atemperar la muestra congelada para tomar una porción analítica, descongelar en el empaque original o en el contenedor en el que se recibió en el laboratorio. Cuando sea posible, evitar la transferencia de la muestra a un segundo contenedor para descongelar. Normalmente la muestra puede

ser descongelada de 2 a 5 C en 18 h. Si se desea un descongelado rápido, someta la

muestra a un baño regulado a 45 C por un tiempo no mayor a 15 min. D. Mezclado. En las muestras alimenticias puede presentarse una distribución no homogénea de los microorganismos. Para asegurar una distribución más uniforme, homogenizar circularmente las muestras unitarias líquidas y las muestras secas con una cuchara estéril u otro utensilio antes de tomar la muestra analítica para la determinación de microorganismos mesofílicos aerobios por el método de cuenta en placa y el número más probable para microorganismos coliformes. Utilizar el tamaño de la muestra analítica recomendado en cada práctica. Si el contenido del empaque es obviamente no homogéneo (por ejemplo, una comida congelada), examinar la muestra analítica del alimento macerado, o preferiblemente analizar cada porción por separado, dependiendo del objetivo del análisis. E. Pesado.

Tarar el vaso de licuadora o la bolsa de Stomacher ; pesar asépticamente dentro del vaso de licuadora, el tamaño de muestra analítica recomendado (si es congelado, pese antes de descongelar). F. Homogenización y dilución. Adicionar la cantidad de diluyente (solución amortiguadora de fosfatos 0,1M pH 7,2 o agua peptonada al 0,1% estéril), necesario para tener una dilución decimal (10-1). El volumen total de muestra más diluyente deberá cubrir completamente las aspas del vaso de licuadora. Mezclar por 2 min. Este mezclado será la dilución 10-1. Realizar rápidamente diluciones decimales del homogenizado original, usando pipetas que descarguen el volumen requerido con precisión. No medir menos del 10% del volumen

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total de la pipeta, por ejemplo, no use pipetas con un capacidad mayor a 10 mL para medir volúmenes menores a 1 mL; para medir volúmenes de 0.1 mL, no utilizar pipetas con una capacidad mayor a 1 mL. Preparar todas las diluciones decimales con 90 mL de diluyente estéril y 10 mL de la dilución previa a menos que se especifique de otra manera. Mezclar todas la diluciones vigorosamente 25 veces en un arco de 30 cm. en 7 s. No deben excederse más de 15 min. Desde el licuado de la muestra hasta que las diluciones correspondientes sean vertidas en el medio de cultivo adecuado.

G. Homogeneización con “Stomacher ”.

La molienda con “Stomacher ” como un medio para la preparación de muestras fue introducida por Sharpe y Jackson en 1972. Fue sugerida como una alternativa muy útil para la molienda en la preparación de alimentos para análisis microbiológico. Los

“Stomachers ” (Tekmar Co., Cincinnati, OH) están disponibles comercialmente en 3 tamaños, “Stomachers 80, 400 y 3500”, para el manejo de volúmenes de 8-80, 40-400 y 300-3000 mL, respectivamente. El principio de operación es muy sencillo. La muestra de alimento con el diluyente se coloca en una bolsa de plástico estéril y se introduce en

el “Stomacher ”, una caja de metal rectangular con paletas de metal dentro, de tal manera que las paletas golpeen sobre la bolsa. Estas paletas, accionadas por un motor a velocidad constante, se moverán hacia adelante y atrás golpeando literalmente la muestra. Este golpeteo liberará a las bacterias de las partículas de alimento, debido en parte a la agitación violenta del líquido y en parte por la compresión que sufre la muestra por las paletas. No se necesita una homogenización completa de la muestra. Como las muestras de alimento se colocan en bolsas de plástico, los fabricantes recomiendan que muestras con huesos u otros objetos punzantes no se preparen con este método.

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Análisis Microscópico de Alimentos. Si se sospecha que un alimento ha sido el causante de una infección o toxiinfección o se ha deteriorado, se debe usar el producto original o una dilución baja del mismo. Preparar un frotis para un examen microscópico directo. La tinción de Gram y la morfología celular de la bacteria en el frotis puede indicar la necesidad de otro tipo de evaluaciones. Realizar un examen microscópico incluso si el alimento sufrió tratamiento térmico y los microorganismos podrían estar inactivados. Un gran número de cocos Gram-positivos en el frotis podría indicar la presencia de enterotoxina estafilocóccica, la cual no se destruye por los tratamiento térmicos que eliminan las cepas de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. Un gran número de bacilos Gram-positivos esporulados en un alimento congelado podría indicar la presencia de Clostridium perfringens, un organismo que es sensible a bajas temperaturas. Otros bacilos Gram-positivos esporulados como Clostridium botulinum o Bacillus cereus podría también estar presente en el alimento. Cuando el examen microscópico del alimento en cuestión revela la presencia de muchos bacilos Gram-negativos, considerar los síntomas y períodos de incubación reportados para la enfermedad bajo investigación y seleccionar el método de examen específico para el aislamiento de uno o más de los siguientes géneros: Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia, Vibrio o Campylobacter.

Examen microscópico directo de alimentos SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Colorantes para tinción de Gram.

Aceite de inmersión.

Metanol.

Xileno. MATERIAL Y EQUIPO.

Portaobjetos, con un extremo etiquetado. Un portaobjeto para cada muestra molida (dilución 10-1).

Asa microbiológica.

Microscopio óptico, con objetivo de inmersión (100X) y ocular 10X. PROCEDIMIENTO Preparar un frotis de la muestra molida del alimento (dilución 10-1). Permitir que el frotis seque con el aire y fíjar con calor moderado pasando los frotis rápidamente 3 ó 4 veces sobre un mechero Bunsen o Fisher. Opcionalmente, secar los frotis al aire y fijarlos con metanol 1-2 min., eliminar el exceso de metanol y flamear o secar al aire.

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Enfríar a temperatura ambiente antes de teñir. Desengrasar los frotis de alimentos con alto contenido en grasas sumergiéndolos en xileno 1-2 min., eliminar éste, lavar con metanol, eliminar y secar. Teñir el frotis con el método de Gram. Usar un microscopio equipado con objetivo para aceite de inmersión (95-100X) y ocular 10X; ajustar la iluminación al óptimo. Examinar al menos 10 campos de cada frotis, anotando los tipos de microorganismos predominantes, especialmente las formas de tipo Clostridia (bacilos Gram-positivos), cocos Gram-positivos y bacilos Gram-negativos.

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Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994 “Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis

microbiológico” OBJETIVOS:

Realizar correctamente el muestreo de alimentos para el análisis microbiológico

Diseñar las etiquetas y hoja de toma de muestras para análisis microbiológico de alimentos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

Solución amortiguadora fosfatos 0.1 M pH 7.2, esterilizado en botellas con 90 mL del solución amortiguadora.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Frasco con etanol o isopropanol al 70% (V/V). MATERIAL Y EQUIPO

Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapón esmerilado de material esterilizable, no tóxico de tamaño acorde a la cantidad de muestra deseada.

Bolsas de polietileno estériles de varias medidas.

Hieleras de poliestireno o de otro material aislante.

Papel aluminio.

Papel estraza.

Etiquetas autoadheribles.

Cinta testigo.

Marcadores indelebles.

Algodón.

Cerillos.

Licuadora.

Jarra de vidrio o metal para la licuadora de 1000 mL, con tapa, esterilizada en

autoclave por 15 min. a 121 C.

Balanza, con pesas; 2000,0 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g.

Matraces estériles 250 mL, cubiertos con papel de aluminio.

Pipetas graduadas estériles de 1 y 10 mL.

Utensilios para el manejo de muestras estériles: muestreadotes, cucharones, espátulas, cuchillos, pinzas, etc. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados).

Lámparas de alcohol.

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Hielo o bolsas refrigerantes.

Bata, cofia, cubreboca y guantes estériles.

Autoclave equipada con termómetro de mercurio calibrada a 121 ± 1°C.

Horno que alcance una temperatura de 170 ± 5°C.

Termómetros metálicos (dos si es necesario) para toma de temperaturas de alimentos con rangos de -40 a 100°C, con intervalos no superiores a 1°C.

PROCEDIMIENTO 1. Preparación del material 1. Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y

transporte de muestras, que van a estar en contacto directo con el alimento, debe estar limpio, estéril y libre de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.

2. El material para la toma de muestra que requiera esterilización, se envolverá en forma individual, debidamente identificado, con papel de estraza antes de esterilizarlo.

3. La tapa de los frascos se protegerá con papel de estraza o aluminio fijándolos adecuadamente.

4. Colocar cinta testigo en el material a esterilizar. 5. El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave

a 121°C durante 15 minutos o en horno a 170°C por dos h., de acuerdo a su naturaleza.

6. Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminación posterior.

2. Toma de muestra El procedimiento para la toma de muestra, dependerá del tipo de producto y de la finalidad del examen. A. Obtención 1. Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo antes de realizarlo, se

lave las manos y los brazos hasta los codos, además de cepillarse las uñas con jabón. Para muestreo aséptico debe utilizar: bata, cofia y cubreboca. De ser necesario el contacto directo de las manos con el producto deberán usarse guantes estériles.

2. La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica, tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis, enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.

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3. Tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir éstos y

extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana.

4. Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamente asépticas.

5. Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben tomarse en áreas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminación de las mismas.

6. La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine colocándola sobre un trapo estéril desechable.

7. Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis.

8. Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon, esto únicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración.

9. En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.

10. En alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados, cucharas, cuchillos, etc.

11. En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa.

12. Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.

B. Productos perecederos 1. Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a

granel se consideran como alimentos perecederos y los productos no envasados en los cuales no está definida su vida útil o de anaquel, se determinará la fecha de caducidad, con base en productos de características similares.

2. Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad, se consideran para fines de esta Norma, como no perecederos.

3. Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria será únicamente por duplicado, la primera se enviará al laboratorio oficial para su análisis y la segunda se quedará en poder del interesado para su análisis particular si es necesario.

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C. Impugnación

En caso de impugnación presentada en los términos que señala la Ley General de Salud, en productos perecederos, la toma de muestra subsecuente la llevará a cabo personal autorizado tomando cinco muestras en forma aleatoria del lote existente o la cantidad, o número estipulado en la norma correspondiente del producto, la cual será analizada por el laboratorio acreditado para realizar tercerías y el resultado obtenido será el que definitivamente acredite que el producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas. El número de submuestras del total que determinen el cumplimiento serán tres de cinco, o lo que estipule la norma correspondiente.

D. Identificación de la muestra 1. En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente,

inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra, mediante rótulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos:

2. Fecha, lugar, hora del muestreo, número de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede.

3. La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja, en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.

E. Conservación y transporte 1. El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se

impida su ruptura, alteración o contaminación, evitando su exposición a la luz solar directa.

2. Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8°C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 h. siguientes a su recolección. En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C, empleando para conservarla hielo seco. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con líquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.

3. En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes, o una cantidad excesiva de las mismas, las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura.

4. En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o contaminen con otras.

5. Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente, siempre y cuando ésta no exceda de 45°C

6. Para la conservación, durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas.

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7. Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe

que además de contener la identificación de la muestra, incluya los siguientes datos: F. Número de unidades y/o cantidad. 1. Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante, representante

y/o distribuidor. 2. Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la marca comercial y

cualquier otra información que se considere importante. 3. Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se

encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra, o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios.

4. La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación.

RESULTADOS Diseñar las etiquetas y hoja de toma de muestras para análisis microbiológico de alimentos, utilizar en todos los ejercicios experimentales las etiquetas y hojas de muestreo diseñadas. Tomar las precauciones necesarias para el correcto llenado de estas formas Recolectar, transportar y conservar los alimentos, de acuerdo a todo lo indicado en este protocolo. BIBLIOGRAFÍA NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. ”Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico” Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. International Commission on Microbial Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico

OBJETIVOS

Preparar adecuadamente las muestras de los alimentos bajo estudio, así como las diluciones que les permitan investigar su contenido microbiológico.

Determinar el número de diluciones adecuado, con base en las características y datos de la muestra y de los microorganismos que serán investigados.

GENERALIDADES Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se encuentran presentes en diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algún modo su sobrevivencia o desarrollo. Los alimentos por su producción primaria, generalmente tienen una importante microbiota “normal”, según la región y condiciones en que se producen; además, su composición tiende a conservar dicha flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia de este desarrollo microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos. Además de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la aparición de ETA’s. Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar los cálculos. En esta práctica se establece la forma general de preparar dichas diluciones. En vista de la gran cantidad de productos alimenticios y de la diversidad de sus características, algunos pueden requerir modificaciones o métodos específicos pero, en todos los casos donde sea posible, se recomienda apegarse a estas guías y modificarlas únicamente cuando sea necesario. Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir de ella, todas las necesarias para poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, según la carga microbiana esperada en el alimento. Un analista experimentado puede estimar el

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número de diluciones necesarias a partir del conocimiento que tenga del proveedor y del proceso, e incluso a partir de los datos de muestreo y desde luego, a partir de la experiencia con cada tipo de muestra. El buen resultado del método requiere que las fuentes de variación sean eliminadas en lo posible, por lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones. FUNDAMENTO Posterior a la toma de muestra y como parte del análisis, se hace una dilución primaria cuya finalidad es lograr obtener una muestra representativa del alimento, esto es, tanto en el aspecto cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y así lograr una distribución lo más uniforme posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al análisis. Con este fin, se utiliza un diluyente que favorezca la recuperación de los microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el pH favorables para iniciar la recuperación y actividad de las células microbianas presentes, así como para favorecer aquellas que se buscan entre una población mixta. Se pretende encontrar el número de microorganismos por unidad de volumen, hasta asegurar que después de la incubación se obtenga un resultado cuantificable, esto se logra después de realizar tantas diluciones decimales seriadas como sea necesario, en el mismo diluyente. Este resultado puede ser la cuenta de colonias en placas o la observación de resultados proporcionales al tamaño de la población, en el caso de tubos o matraces. NOTAS

Esta técnica es la primera etapa en el análisis de la mayoría de las prácticas en las que se determina cuantitativamente algún microorganismo o grupo microbiano; por lo tanto, continúa con la determinación específica.

Cuando se trabaja con alimentos líquidos, fácilmente homogenizables, que pueden distribuirse con pipetas de 1 mL, y con bajo contenido microbiano, puede omitirse la preparación de diluciones, pero este caso es una excepción, no la regla.

Los diluyentes más utilizados son la solución amortiguadora de fosfatos, el agua peptonada y la solución salina isotónica, pero pueden utilizarse otros diluyentes que cumplan con las funciones de dispersar y homogenizar la carga microbiana y de facilitar la recuperación de los microorganismos en estudio, mediante condiciones de osmolaridad, pH, etc., adecuadas para ellos; por ejemplo, para la determinación de Vibrio cholerae, que es alcalófilo, se utiliza agua peptonada a pH 8.5.

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El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inoculan las diluciones en los medios de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1 matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90,0 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada al 0,1%, o con solución salina isotónica (SSI), al 0,85 %a.

4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapón de rosca, conteniendo 9,0 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada al 0,1 % o con solución salina isotónica (SSI), al 0,85 % a.

MATERIAL Y EQUIPO

Utensilios estériles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a

Pipetas bacteriológicas de 10 mL, estériles, con algodón en el extremo superior (las necesarias de acuerdo con el número de diluciones) a.

Pipetas bacteriológicas de 1 mL, estériles, con algodón en el extremo superior (las necesarias de acuerdo con el número de diluciones) a.

Pipetas Pasteur estériles a

Stomacher (homogeneizador peristáltico) o licuadora con vaso esterilizado.

Bolsas estériles para stomacher a NOTA a Material necesario al inicio de la práctica

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1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

10-1 10-2 10-3

10-4

Pesar 10 g de muestra en condiciones de

asepsia

Homogenizar con 90 mL de solución diluyente

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solución diluyente.

PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

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PROCEDIMIENTO 1. Preparación de la dilución primaria: 1.1. Muestras líquidas no viscosas (como agua, leche, refrescos, etc. en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos como agitación) 1. Agitar la muestra manualmente en un arco de 30 cm., con 25 movimientos de

arriba abajo, efectuados en un tiempo de 7 segundos. 2. En condiciones asépticas, tomar 10.0 mL de la muestra y 3. Diluir con 90.0 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura

similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. 1.1.1. Alimentos originalmente líquidos o licuables y congelados: 1. Fundir por completo en baño de agua entre 40 y 45°C en un tiempo máximo de

15 minutos y homogenizar agitando vigorosamente. 2. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras líquidas no viscosas. 1.1.2. Parte líquida de una muestra heterogénea que sea considerada suficientemente representativa de la muestra total: 1. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras líquidas no viscosas. 1.2. Muestras sólidas o semisólidas. 1.2.1. Muestras sólidas y semisólidas no congeladas: 1. Pesar una cantidad de 10.0 g de la muestra por analizar en un recipiente o

bolsa plástica estéril de tamaño adecuado. 2. Adicionar un volumen de 90.0 mL del diluyente, según sea el caso, llevado a

una temperatura similar a la de la muestra. 3. Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta

obtener una suspensión completa y homogénea, según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, el tiempo de homogenización debe ser < 2.5 minutos.

4. Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada (alícuota), tomando ésta de las capas superiores de la suspensión.

NOTAS

Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para los cálculos y expresión de resultados.

El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede ser inadecuado para algunos productos, por ejemplo, aquellos con partículas agudas o

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constituyentes que no se dispersen fácilmente; sólo debe utilizarse cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.

1.3. Muestras sólidas y semisólidas congeladas: 1. Descongelar en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 h. y no más de 24 h. antes

de diluir y analizar. 2. Proseguir como se indica en el inciso 1 para muestras sólidas y semisólidas no

congeladas NOTAS En todos los casos, si la cantidad disponible de muestra no permite tomar 10 mL o g, la dilución primaria puede hacerse con 1 mL de muestra en 9 de diluyente. Después se prosigue como se indica para las diluciones adicionales. 2. Preparación de las diluciones decimales adicionales.

1. Transferir 1.0 mL o un múltiplo de la dilución primaria, a otro recipiente que

contenga nueve volúmenes del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Si se toma 1.0 mL de muestra en 9.0 mL de diluyente, se obtendrá una dilución 1:10; si se utilizan 10.0 mL de muestra se utilizarán 90.0 mL de diluyente y así se tendrá la misma dilución 1:10

2. Mezclar cuidadosamente cada nueva dilución, siempre de la misma manera que se describe en el punto 1 del inciso A.

3. La selección de las diluciones a preparar, así como de aquellas que se van a inocular, depende del número esperado de microorganismos en la muestra, con base en los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

4. Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas seleccionadas. El volumen transferido debe ser > 10% de la capacidad total de la pipeta. Si es terminal y se transfiere su capacidad total, escurrir aplicando la punta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido.

5. Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.

NOTAS

En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0.1 mL ó 0.1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.

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En todos los casos, deben de prepararse las diluciones que permitan obtener resultados dentro del rango de sensibilidad del método, por lo menos en una de tres diluciones; como el rango de sensibilidad del método generalmente va de n a 10n (de 15 a 150 ó de 25 a 250 colonias, por ejemplo), el obtener resultados dentro del rango en 2 diluciones subsecuentes se considera evidencia de que s ha logrado la distribución uniforme y se han controlado los factores de variación.

El siguiente cuadro, señala los rangos de sensibilidad, estadísticamente confiables, de algunos de los métodos importantes en microbiología de alimentos de acuerdo con cada norma oficial mexicana: Método Intervalo de sensibilidad Cuenta en placa de bacterias termofílicas, Mesofílica, psicrofílicas y psicrotróficas 25 a 250 colonias / placa Coliformes totales en placa 15 a 150 colonias / placa Hongos y levaduras 10 a 150 colonias / placa Staphylococcus aureus en placas extendidas en agar Baird Parker 15 a 150 colonias / placa Cuenta en placa de bacterias esporuladas, totales o termorresistentes en placas vertidas 30 a 300 colonias / placa Clostridium perfringens en placas extendidas con agar TSC y yema de huevo 20 a 200 colonias / placa Bacterias del yogurt 10 a 300 colonias / placa RESULTADOS Este ejercicio experimental es la base de los métodos cuantitativos y cualitativos, pero en esta etapa no se contempla la obtención de resultados numéricos. Siempre se deberán considerar todas las especificaciones planteadas para obtener resultados confiables en los análisis realizados. Después de efectuar el análisis en cuestión, aplicar el factor de dilución; por tratarse de diluciones decimales, el factor es el inverso de la dilución. Es decir, que si los resultados estadísticamente confiables se obtuvieron en la dilución 10-3, el

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factor de dilución es 103. Si se usó otra proporción en las diluciones, el inverso de la proporción en que se diluyó será el factor de dilución. BIBLIOGRAFÍA Secretaría de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. International Commission on Microbial Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall 2nd ed. Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) “Culture Methods for Enumeration of Microorganisms”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 53-67. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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Cuenta en placa de bacterias

OBJETIVOS

Realizar adecuadamente la técnica de cuenta en placa para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos.

Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la calidad del alimento.

GENERALIDADES Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia (o ausencia) de oxígeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios son un indicador general de la población que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para algunos productos, también es importante determinar la presencia de bacterias termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La técnica básica es la misma, pero cambian las condiciones de incubación, medios de cultivo y algunos otros detalles, que se mencionan en la técnica. Si se modifican las condiciones de incubación o se somete la muestra a algún tratamiento previo, el método puede aplicarse también a la detección de otros grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada selección de medios de cultivo. El método permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones. FUNDAMENTO La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo (o de un agregado de microorganismos) presente (s) en la muestra bajo estudio; ese microorganismo (o microorganismos) es capaz de formar la colonia, es decir una

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UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análsis microbiológico”. NOTAS

El medio de cultivo no debe fundirse más de una vez, y debe mantenerse en baño de agua regulado a 45 °C, durante el tiempo suficiente para que alcance esta temperatura, y hasta su utilización.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a.

4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapón de rosca, con 9 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a.

7 a 13 tubos de 22 x 175 con 20 mL c/u (o un matraz con 130 ó 250 mL) de agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estándar) fundido y mantenido en baño de agua a 45 ± 1.0 ºC (para técnica de vertido en placa) a.

7 a 13 cajas de Petri con 20 mL c/u de agar tripotna-glucosa-extracto de levadura (agar cuenta estándar) estériles o el medio requerido en la técnica a.

MATERIAL Y EQUIPO

Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1.0ºC, provista con termómetro calibrado a.

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b.

Registrador mecánico o electrónico b

Microscopio óptico b

Baño de agua con termómetro, que mantenga la temperatura a 45 ± 1.0 °C a

Utensilios estériles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a

Pipetas bacteriológicas de 10 mL, estériles, con algodón en el extremo superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a.

Pipetas bacteriológicas de 1 mL, estériles, con algodón en el extremo superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a.

Varillas de vidrio estériles (en escuadra o “L”) a.

Pipetas Pasteur estériles a

7 a 13 cajas Petri estériles a

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Stomacher (homogeneizador peristáltico) a

Bolsas estériles para Stomacher a

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b.

Registrador mecánico o electrónico b

Microscopio óptico b NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica b Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la práctica

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Homogeneizar la muestra y el agar mediante

movimientos rotatorios

Incubar las cajas en

posición invertida

24 a 48 h /

37°C

1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

10-1 10-2 10-3

10-4

Pesar 10 g de muestra en condiciones de

asepsia

Contar aquellas placas que tengan entre 25 a 250 colonias y reportar

como UFC/g o mL de muestra

Homogenizar con 90.0 mL de

solucion diluyente

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solución diluyente

Adicionar de 15 a 20 mL de agar triptona extracto de levadura fundido

y enfriado a 45°C en cada placa

CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS

Depositar 1.0 mL de cada dilución en cajas de Petri estérilespor duplicado

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PROCEDIMIENTO 1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de

“Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”.

2. Técnica de vertido en placa. 1. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la

inoculación y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular.

2. Inocular por duplicado, 1 mL de la dilución correspondiente en cada caja,

mediante pipeta estéril. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a 45 °C. Para homogenizar, mezclar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

3. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como

testigo de esterilidad. 4. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura

que se requiera, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se indica en el cuadro 1.

3. Técnica de extensión superficial en placa. 1. Distribuir las cajas con el medio estéril en la mesa de trabajo de manera que la

inoculación se pueda realizar cómoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular.

2. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilución correspondiente en cada caja,

mediante pipeta estéril. Para distribuir de manera homogénea, extender el inóculo utilizando una varilla de vidrio estéril (en forma de escuadra o “L”) haciendo movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo, hasta lograr la completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el inóculo se absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera aproximado de 10 minutos). El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

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3. Cuando es necesario utilizar el método de extensión en superficie pero se

esperan cuentas bajas, se pueden utilizar de 3 a 5 cajas de Petri con el medio de cultivo, y sembrar 1 mL de la muestra líquida (o de dilución 10-1), repartiendo el volumen en las 3 (ó 5) cajas, es decir, sembrando 0.3+0.3+0.4 mL (ó 0.2 mL en cada una de 5 cajas).

4. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como

testigo de esterilidad. 5. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo y a la temperatura

que se requiera, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se indica a continuación.

CUADRO 1.

Condiciones de incubación para cuenta en placa de diferentes grupos

Grupo Bacteriano Temperatura Tiempo de Incubación

Termofílicos 55 ± 2ºC 48 ± 2 h

Mesofílicos 35 ± 2ºC 48 ± 2 h

Psicrotróficos 20 ± 2ºC de 3 a 5 días

Psicrofílicos 5 ± 2ºC de 7 a 10 días

6. Después de la incubación, contar todas las colonias desarrolladas en las

placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras; si se sospecha que es una colonia de este grupo de microorganismos, se recomienda confirmar por microscopía), incluyendo las colonias puntiformes. Si hay desarrollo extendido o un número de colonias superior al del rango de sensibilidad del método, aplicar las reglas indicadas en RESULTADOS. Realizar microscopía para resolver los casos en los que no se puedan distinguir las colonias de las partículas pequeñas de alimento. Utilizar el registrador para contar las colonias.

RESULTADOS La selección de las cajas que se toman en cuenta para los cálculos es muy importante para la confiabilidad de los resultados; a continuación se especifican las reglas generales para seleccionarlas, pero conviene enfatizar que la selección de cajas obedece a criterios:

lógicos (elegir las que están en rango),

estadísticos (considerar los duplicados y el mayor número posible de datos) y

funcionales (a falta de datos representativos, tomar los mejores disponibles).

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Las reglas para seleccionar las cajas para los cálculos son las siguientes: 1. Se consideran “representativas“ las cajas que tienen un número de colonias

dentro del rango de sensibilidad del método, en este caso, entre 25 y 250 UFC.

2. Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se aplica el factor de dilución, que es el inverso y se redondea el número a 2 cifras significativas (o dígitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dígito del promedio es 4 o menor, se omite dejando el número de 2 cifras significativas. Por ejemplo, si en una caja se cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X 101, porque el tercer dígito es 2 y se redondea al segundo dígito. Cuando el tercer dígito es 5 o superior, el segundo dígito se redondea al siguiente, por ejemplo si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportará como 20 x 101 UFC, porque el tercer dígito es superior a 5. En el ejemplo 5 del cuadro 2, el promedio es de 237.5 en la dilución 10-3, por lo que se reportará como 24 x 104 UFC.

3. Cuando las 2 placas de una dilución contienen un número de colonias características dentro del rango de sensibilidad del método, se promedian los números y se multiplica por el inverso de la dilución.

4. Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran ésta ni su duplicado.

5. Cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no, se consideran ambas y se promedian.

6. Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se aplica el factor de dilución a cada una y luego se promedia nuevamente.

7. Si en las placas no hay colonias (o no son características del grupo en estudio), reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la más baja utilizada), por ejemplo < 100 / g si la dilución más baja fue 10-2 ó < 1 / mL si la muestra se sembró directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda: “valor estimado”.

8. Si no hay placas representativas pero hay alguna con un número menor de UFC., se consideran las de la menor dilución y se agrega “valor estimado”.

9. Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Agregar la leyenda "valor estimado".

10. Se cuentan como una sola colonia:

Cadenas o pequeños grupos no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias y que están separadas de otras colonias o cadenas.

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Colonias extendidas como película entre el fondo de la caja y el agar y que se diferencian claramente de otras.

Colonias como película en las orillas de la caja, sobre la superficie del agar.

11. Se considera “crecimiento extendido” el que se presenta cuando las colonias abarcan más del 50 % de la superficie de la caja, con o sin inhibición de crecimiento; en ese caso, y/o cuando la inhibición exceda el 25 % de la superficie de la caja, se considera que las placas no son representativas y por lo tanto no se toman en cuenta.

El Cuadro 2, ejemplifica la aplicación de estos lineamientos; consultarlo para seleccionar las cajas a considerar en los cálculos.

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CUADRO 2.

Ejemplos para el cálculo de resultados de cuenta en placa, utilizando ensayos por duplicado. (Rango de sensibilidad: 25 a 250 colonias)

Serie D i l u c i o n e s Resultado

Ejemplo duplic. 10-2 10-3 10-4 UFC. / g o mL Observaciones

1 A > 250 178 16 18 x 104 Si están dentro del rango, se promedian los datos de la dilución 10-3 (184 x 103 se redondea a 18 x 104)

B > 250 190 17

2 A > 250 220 25 23 x 104 En este caso se promedian datos de diluc. 10-3 (= 179 x 103,pasa a 180 x 103 ó 18 x 104). Por otra parte se promedia datos de dilución 10-4 (= 27 x 104). Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones y se redondea el

B > 250 138 28 resultado final

3 A 18 2 0 16 x 102 Se promedian datos de diluc. 10-2 ; aunque están fuera de

B 14 0 0 valor estimado rango, son los más cercanos. Se anota “valor estimado”

4 A > 250 > 250 512 50 x 105 Se toma la más alta que se pueda contar, aunque sea en

B > 250 > 250 495 valor estimado cuadrantes o cuadrícula y se anota “valor estimado”.

5 A > 250 240 34 24 x 104 Se ignora la dilución 10-4 por el crecimiento extendido; se

B > 250 235 Crecim

extend.

promedian los datos de 10-3, se redondea 237.5 a 240.

6 A 0 0 0 < 100 Se reporta como < 1 en la dilución más baja que se utilizó,

B 0 0 0 valor estimado en este caso 10-2. Se registra como “sensibilidad del método”.

7 A > 250 240 24 25 x 104 Se promedia el único dato que está dentro del rango (240),

B > 250 268 19 con su duplicado, aunque éste salga del rango (268).

8 A > 250 216 23 28 x 104 Se consideran las placas que están dentro del rango y se

B > 250 262 42 promedian con sus duplicados, aunque éstos salgan. Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones

9 A > 250 215 20 23 x 104 Se promedian datos de 10-3 , se promedian datos de 10-4

B > 250 235 26 se realizan los cálculos como en el ejemplo 2

Las cifras y recuadros resaltados en negritas son las que se consideran adecuadas para realizar los cálculos.

37

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas y potencias de 10:

Bacterias mesofílicas aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura incubadas por ____ h. a _____ ºC: _______ UFC / g (ó / mL) de muestra.

Sustituir “mesofílicas” por termofílicas, psicrofílicas ó psicrotróficas, según corresponda, anotando el tiempo y la temperatura correspondientes.

Si se analizó un alimento para el cual existe norma y existe especificación sobre el grupo estudiado, incluir en el reporte si el alimento cumple o no con la norma. BIBLIOGRAFÍA Secretaría de Salud. NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimiento para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México. Secretaría de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México. Secretaría de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. México. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) “Culture Methods for Enumeration of Microorganisms”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 53-67. International Commission on Microbial Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

38

Determinación de coliformes totales por cuenta en placa

OBJETIVOS

Explicar el fundamento de la determinación de coliformes totales en un alimento, mediante la cuenta en placa.

Realizar adecuadamente la determinación de coliformes totales en un alimento, mediante la cuenta en placa.

Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables. GENERALIDADES La definición generalmente aceptada para el término “coliformes” describe a estos microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, aunque algunos pueden ser fermentadores tardíos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia, respectivamente. La mayoría de los coliformes pueden encontrarse en la microbiota normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razón, su presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo más ampliamente utilizado en la microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. Como los coliformes también pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre coliformes totales y coliformes fecales. Esta práctica se refiere a coliformes totales. El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

Evaluación del cumplimiento y la eficiencia de las prácticas sanitarias, en el manejo de los alimentos, del equipo y del hielo y agua empleados en su fabricación.

Evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de origen no-fecal.

La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales. Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV).

39

FUNDAMENTO

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación, como se explicó en la técnica de preparación de diluciones. NOTAS Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente:

Si el alimento contiene mono o disacáridos en altas concentraciones, éstos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes.

El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparación; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en baño de agua a 45 °C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo.

Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más adecuadas para los coliformes.

El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubación, especialmente la incubación prolongada, pueden ocasionar la formación de colonias rojas de cocos Gram positivos.

El rango estadístico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de sensibilidad del método) es de 15 a 150 UFC por placa.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1 matraz erlenmeyer de 250 mL con 90.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 ± 0.2 o agua peptonada. a

2 a 4 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapón de rosca, con 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 ± 0.2 o agua peptonada. a

6 a 10 tubos de ensayo sin labio, de 22 x 175 con 20.0 mL de agar bilis rojo violeta c/u, o un matraz erlenmeyer con 125.0 a 210.0 mL. a

40

6 a 10 tubos de ensayo sin labio, de 16 x 150 con 5.0 mL de agar bilis rojo violeta c/u, o un matraz erlenmeyer con 30.0 a 50.0 mL. a

MATERIAL Y EQUIPO

Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1.0ºC, provista con termómetro calibrado. a

Balanza granataria. a

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadrículada y lente amplificador. b

Registrador mecánico o electrónico b

Microscopio óptico b

Baño de agua con termómetro calibrado, que mantenga la temperatura a 45 ± 1.0 °C. a

Utensilios estériles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a

Propipetaa

Pipetas bacteriológicas de 10 mL, estériles, con algodón en el extremo superior (las necesarias de acuerdo con el número de diluciones). a

Pipetas bacteriológicas de 1 mL, estériles, con algodón en el extremo superior. (las necesarias de acuerdo con el número de diluciones) a

Pipetas Pasteur estériles a, b

5 a 9 cajas Petri estériles, de 15 x 100 mm. a

Stomacher (homogeneizador peristáltico). a

Bolsas estériles para stomacher. a NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica b Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la práctica

41

Homogeneizar la muestra con el agar haciendo movimientos rotatorios

Incubar las cajas en

posición invertida

24 h/ 37°C

1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

10-1 10-2 10-3 10-4

Pesar 10 g de muestra en condiciones de

asepsia

Adicionar de 15 a 20 mL de agar bilis rojo violeta fundido y enfriado a 45°C

en cada placa

Contar aquellas placas que tengan entre 15 a 150 colonias y reportar

como UFC/g o mL de muestra

Homogeneizar la muestra con 90.0

mL de diluyente

Depositar 1.0 mL de cada dilución en cajas de

Petri estériles por duplicado

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solución diluyente.

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA

42

PROCEDIMIENTO 1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de

Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Recordar que el rango de sensibilidad del método es de 15 a 150 colonias por placa.

2. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inóculo.

3. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilución correspondiente en cada caja, mediante pipeta estéril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido y mantenido a 45 ± 1.0°C en baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

4. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio, mediante seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fría. No permitir que se mojen las tapas de las cajas.

5. En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, una sobrecapa de 4 ó 5 mL del mismo medio fundido y mantenido a 45 °C, no permitir que se mojen las tapas de las cajas. La sobrecapa de agar se coloca para favorecer el crecimiento de los coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique.

6. Preparar una caja control con 18.0 a 20.0 mL de medio para verificar la esterilidad.

7. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 h.

8. Después de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2.0 mm.

9. Si hay desarrollo extendido o un número de colonias superior al del rango de sensibilidad del método, aplicar las reglas indicadas en el inciso de RESULTADOS de la práctica de Cuenta de Bacterias en Placa. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas partículas de alimento.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para seleccionar cajas y reportar, seguir las indicaciones de la práctica Cuenta de Bacterias en Placa.

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Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas y potencias de 10. Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 + 2 h a 35 ºC: _____ UFC / g (o / mL) de muestra. BIBLIOGRAFÍA Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Secretaría de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México. Secretaría de Salud. NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Métodos para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. Norma Oficial Mexicana. México. Secretaría de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. México. Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) “Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

44

Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo

múltiple (Número más Probable o NMP)

OBJETIVOS

Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.

Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.

GENERALIDADES Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de contaminación fecal. Éstos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias. Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a

45

44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales. Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las características que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca enfermedad mediante un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxigénica (ETEC, por sus siglas en inglés), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. En el cuadro 1 se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas patógenas de Escherichia coli. Esta información se puede ampliar en el anexo 3 de la sección 2, y complementar en la bibliografía. FUNDAMENTO La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a

35°C 1 C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

46

La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir

gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1 C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.

Cuadro 1. Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli patógenas

ETEC EPEC EHEC EIEC

Toxina

Lábil/estable - Shiga o vero -

Invasiva

- - - +

Intiminas

- + + -

Enterohemolisina

- - + -

Aspecto de las heces

Aguadas Aguadas sanguinolentas

Aguadas muy sanguinolentas

Mucoides y sanguinolentas

Presencia de leucocitos en heces

- - - +

Fiebre

baja + - +

Intestino involucrado

Delgado

Delgado

Colon

Colon y parte baja del delgado

Dosis infectiva Alta Alta baja Alta

Serotipos varios

O26, O111 y otros

O157:H7, O26, O111 y otros

Varios

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MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1. Para análisis de agua Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 2.

5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado concentración doble o triple con campana de Durhama.

5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb.

7 ó 12 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC MUG con campana de Durham b.

2 cajas Petri con agar para métodos estándar d

2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c

6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe

3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e

3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons (opcional)e

2. Para análisis de alimentos

1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatosa

2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatos con tapón de roscaa

15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentración sencilla o caldo lactosado concentración sencilla con campana de Durhama

15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb.

17 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb.

2 cajas Petri con agar para métodos estándard

2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc

6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe

3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe

3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere

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SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace

Frascos gotero con indicador rojo de metiloe

Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e

Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2e

Colorantes para tinción de Gramd MATERIAL Y EQUIPO

Mechero, a,b,c,d,e.

Propipetaa.

Gradillaa,b,c,e.

Balanza granatariaa.

Stomachera

Bolsas para stomacher .

Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c

Lentes de seguridadc

Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna.

Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna.

Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d

Asa bacteriológicab,c,d,e

Portaobjetosd

Microscopio ópticod

Termómetro calibradob

Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.b

Incubadora a 35° ± 2,0ºCa.

Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca

Autoclavea NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. c Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica. d Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica. e Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.

49

2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo

37°C

24 - 48 h

37°C

24 – 48 h

44.5°C

24 – 48 h -

Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) doble concentración (2X)

CLSS + 20.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriológica de los tubos positivos (producción de gas) en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC

Tubos con 10.0 mL de caldo Lactosa verde brillante bilis 2%

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /100 ml de muestra

Tubos con 10.0 mL de Caldo EC o EC-MUG

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /100 ml de muestra.

Siembra de tubos positivos en placas de Agar EMB para la búsqueda de Escherichia coli

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

50

Pesar 10.0 g de muestra Homogenizar la muestra Realizar 2 diluciones decimales más en en condiciones de asepsia con 90.0 mL de solución diluyente tubos con 9.0 mL de solución diluyente

10-1 10-2 10-3

10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3

10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2

1.0 mL 1.0 mL

35°C

24 - 48 h

35°C

24 - 48 h

44.5°C

24 - 48 h

Sembrar por triplicado cada dilución en tubos de caldo lauril sulfato de sodio (1X)

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /g de muestra

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /g de muestra. Siembra de tubos positivos en agar Mac Conkey para búsqueda de Escherichia coli

Tubos con 10.0 mL de CLSS concentración sencilla (1X) + 1.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriológica de los tubos positivos (producción de gas) en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC

Tubos con 10.0 mL de Caldo Lactosa verde brillante bilis 2%

Tubos con 10.0 mL de Caldo EC o EC-MUG

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SÓLIDAS O ALIMENTOS

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PROCEDIMIENTO 1. Agua y hielo 1.1 Prueba presuntiva

Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra.

CUADRO 2. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio

INOCULO (mL)

CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (mL)

VOLUMEN DE MEDIO MAS INOCULO (mL)

CALDO LAURIL TRIPTOSA REQUERIDO g/L

CONCENTRACIÓN

1 10 o más 11 o más 35,6 1 X

10 10 20 71,2 2 X

10 20 30 53,4 1.5 X

20 10 30 106,8 3 X

100 50 150 106,8 3 X

100 35 135 124.6 3.5 X

100 20 120 142.4 4 X

Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa producción de gas, incubar 24 h. más.

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.

Agitar los tubos para su homogeneización.

Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h..

Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h..

Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes totales/100 mL.

52

1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham.

Agitar los tubos para su homogeneización.

Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.

Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes fecales/ 100 mL.

Control de calidad 1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras. 1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli

Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.

Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.

Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.

Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.

Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). A partir de las cajas de agar cuenta estándar, selecionar una colonia, resuspenderla en 2 ml de solución salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas.

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a. Producción de indol (I)

Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con medio SIM, incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.

Finalizada la incubación, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs o Ehrlich.

La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera como prueba positiva para la presencia de indol.

b. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM)

Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar a 35°C por 48 ± 2 h.

Finalizada la incubación, adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.

Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.

c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar a 35°C por 48 ± 2 h.

Finalizada la incubación , adicionar 0.6 mL de solución KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2 mL de solución alfa- naftol (VP2 )y agitar.

Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilización del citrato (C)

Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons (opcional) Incubar a 35°C por 96 h.

El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser, se considera una prueba positiva.

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NOTAS Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogíca de forma recta. Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo. Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono, también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva

1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG

(4 metil-umbeliferil- -D-glucuronido)

FUNDAMENTO Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli. a. Prueba confirmativa

A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formación de gas , tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación EC-MUG.

Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más.

Finalizado el periodo de incubación, Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura.

Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.

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Control de calidad

Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae como control negativo. 2. Alimentos 2.1 Preparación de la muestra.

Pesar 10.0 gramos de la muestra previamente picada con cubiertos estériles y mezclar.

Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, homogeneizar en Stomaker y dejar en reposo de 2-3 minutos.

Realizar 2 diluciones decimales más usando tubos con 9.0 mL de agua peptonada al 0.1 %.

2.1.1 Prueba presuntiva.

Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio.

Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo lauril sulfato de sodio.

Incubar a 35-37°C durante 24-48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.

2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a tubos que contienen caldo de bilis verde brillante (brila)

Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.

Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h.

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Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas, después de un período de incubación de 24 a 48 h.

Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el número más probable de organismos coliformes totales por g de muestra.

2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a tubos con caldo EC.

Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.

Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.

Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el número más probable de organismos coliformes fecales por g de muestra

Control de calidad

Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.

2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli.

Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa.

Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h., observar las colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares.

Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las bacterias.

Seleccionar 1 o más colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.

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CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Determinar el número más probable conforme al procedimiento señalado en la tabla siguiente, para estimar la población de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli en muestras de agua.

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TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.

No. de Tubos positivos

NMP/100 mL

95% de Límite de Confianza (aproximado)

Inferior Superior

0 <1,1 0 3,0

1 1,1 0,05 6,3

2 2,6 0,3 9,6

3 4,6 0,8 14,7

4 8,0 1,7 26,4

5 >8,0 4,0 Infinito

TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.

No. de Tubos Positivos

NMP/100 mL

95% de Límite de Confianza (aproximado)

Inferior Superior

0 <1,1 0,0 3,0

1 1,1 0,03 5,9

2 2,2 0,26 8,1

3 3,6 0,69 10,6

4 5,1 1,3 13,4

5 6,9 2,1 16,8

6 9,2 3,1 21,1

7 12,0 4,3 27,1

8 16,1 5,9 36,8

9 23,0 8,1 59,5

10 >23,0 13,5 Infinito

Todos los cultivos que:

Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos, no esporulados, fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h. a 35°C. y se obtenga las siguientes combinaciones para las pruebas IMVIC:

Biotipo 1(++--) Biotipo 2 (-+--) son consideradas como Escherichia coli. Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporción de los tubos positivos de la prueba confirmatoria en caldo EC.

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BIBLIOGRAFÍA

NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos cárnicos troceados y curados. Productos cárnicos curados y madurados. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Apéndice normativo B. De la estimación de la densidad microbiana por la técnica de número más probable.

CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número mas probable, detección de coliformes totales, cliformes fecales y Escherichia coli por el número mas probable” Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed. 2006, pp 935-936 Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica de Jawetz. Manual Moderno 17a Edición 2002, pp 274-275 Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) “Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. OBJETIVOS

Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y levaduras presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano.

Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111-SSA1-1994.

Explicar el fundamento del método de detección y cuantificación de mohos y levaduras en alimentos.

GENERALIDADES Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos probable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como carbohidratos incluyendo pectinas y otros polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas) y (b) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos. El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificación y clasificación de los mohos se basa en observaciones macroscópicas y microscópicas.

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Hifas y micelio. El talo de los mohos está formado por una masa de filamentos ramificados, llamados hifas, llamándose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas pueden ser sumergidas o aéreas. También se pueden clasificar en hifas vegetativas o en crecimiento, las cuales se encargan de la nutrición del moho, y en hifas fértiles o hifas que producen los órganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos: septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no septados cenocíticos, cuyas hifas están formadas por cilindros sin tabiques transversales. Este tipo de hifas posee núcleos diseminados a lo largo del cilindro y se les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados órganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo los rizoides o “anclajes” de los géneros Rhizopus o Absidia, la célula basal del género Aspergillus y la ramificación dicotómica, o en forma de Y, del género Geotrichum. Órganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas asexuales. Algunos mohos también producen esporas sexuales. A tales hongos se les denomina “perfectos”, los cuales se dividen en Oomycetes y Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son septados, en contraposición a los mohos “imperfectos”, Fungi Imperfecti, los cuales sólo poseen esporas asexuales. Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son pequeñas, ligeras y resistentes a la desecación. Se diseminan fácilmente por la atmósfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3) esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas fértiles denominadas conidióforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro de ningún receptáculo, en contraposición a las esporangiosporas, las cuales se encuentran dentro de un esporangio o receptáculo, situado en el extremo de una hifa fértil, el esporangióforo. Las artrosporas se forman por fragmentación de una hifa. El extremo engrosado del esporangióforo se denomina columnela y adopta formas típicas en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una célula especializada, el esterigma o fiálide situada en el extremo del conidióforo. Propiedades fisiológicas. En comparación con la mayoría de las levaduras y de las bacterias, la mayoría de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría se encuentra alrededor de los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son termófilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. Son capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos.

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Poseen enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas. Algunos géneros de mohos importantes en alimentos. Mucor. Intervienen en la alteración de algunos alimentos y se utilizan en la fabricación de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificación del almidón, para la maduración de quesos y para la fabricación de algunos alimentos orientales. Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy común e interviene en la alteración de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc. Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la producción industrial de ácido cítrico y glucónico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricación de ciertos alimentos orientales y en la obtención de enzimas. Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos tóxicos denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las denominadas aflatoxinas (producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la ocratoxina A producida por A. ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina producida principalmente por A. versicolor; el ácido ciclopiazónico producidas por A. flavus y A. tamarii. La citrinina, patulina y ácido penicílico también son producidas por especies de Aspergillus, las tóxinas tremorgénicas son producidas por A. terreus (territremas), A. fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina). Las aflatoxinas son derivados de la difurancumarina. Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se producen en la naturaleza por los mohos ya mencionados. Las letras B y G se refieren a los colores de flurescencia por sus nombres en inglés ( azul y verde, respectivamente) observados bajo longitudes de onda en la región UV, y los subíndices 1 y 2 se refieren a sus patrones de separación cromatográficos. Las aflatoxinas M1 y M2 se producen por la hidroxilación de las respectivas aflatoxinas B. La aflatoxina B1 tal vez sea el carcinógeno de hígado más potente para animales incluyendo al humano. La ocratoxina A y la citrinina afectan la función renal. Las toxinas tremorgénicas afectan el sistema nervioso central. Penicillium. Es otro género de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P italicum producen la podredumbre de frutas cítricas. Las especies P. camemberti, P. roqueforti se utilizan en la maduración de quesos. Se han reportado más de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas. Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la función del hepática o renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por Penicillium son, ocratoxina A, citrinina, patulina, ácido ciclopiazónico, citreoviridina, penitremo A, toxina PR y roquefortina y el ácido secalónico. De éstas la ocratoxina A es

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sin duda la más importante, es un carcinógeno renal y es producida por P. citrinum, P. viridicatum, P. verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o trigo, o a través de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es posteriormente consumida por humanos. Se recomienda consultar la bibliografía para conocer otros géneros de mohos con importancia en los alimentos. Levaduras y hongos levaduriformes. El término levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemación o por fisión. Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, también se utilizan en la obtención de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteración del sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos. Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación microscópica. Su forma puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme, cilíndrica, triangular e incluso alargada. La mayoría se reproducen asexualmente por gemación multicelular o por gemación polar. Unas pocas especies se reproducen por fisión. En los cultivos en placas de agar es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la observación microscópica de los microorganismos es la única forma segura de diferenciarlas. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas; la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. La mayoría de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayoría de las levaduras necesitan mayor humedad que los mohos. Para la mayoría de las levaduras la Aw mínima de crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30°C y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los ácidos orgánicos y el alcohol.

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Algunos géneros de importancia en alimentos son: Schizosaccharomyces. Levaduras de este género se han encontrado en frutas tropicales, en la melaza y en la miel. Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias alimentarias, como en la fermentación del pan, fermentación de la cerveza, fermentación de los vinos, en la producción de alcohol, glicerol e invertasa. Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la obtención de productos lácteos por su capacidad de fermentar la lactosa. Zygosaccharomyces. Las levaduras de este género son importantes por su capacidad para crecer en medios con elevadas concentraciones de azúcar (osmófilas), intervienen en la alteración de la miel, jarabes y melazas, y también en la fermentación de la salsa de soya y de algunos vinos. Pichia. Crecen en la superficie de los líquidos formando una película. P. membranafaciens produce una película en la superficie de las cervezas y vinos. Debaromyces. Forman película en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en la superficie de los quesos y de los embutidos. Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limón y crecen en los zumos de frutas. Torulopsis. Originan problemas en las fábricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la lactosa, alterando productos lácteos. Otras especies alteran la leche condensada azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos ácidos. Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtención de proteína unicelular para incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lácteos. C. lipolytica produce alteración de la mantequilla y margarina. Brettanomyces. Producen grandes cantidades de ácido e intervienen en la fermentación de la cerveza belga de tipo “lambic”, de las cervezas inglesas y de los vinos franceses. Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrándose en las fábricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada. Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color rosado en el sauerkraut.

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FUNDAMENTO El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los polisacáridos que contiene el medio. La hidrólisis de estos compuestos se efectúa por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH ácidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. Así mismo, la acidificación permite la eliminación de la mayoría de las bacterias. Finalmente, las condiciones de

aerobiosis y la incubación a una temperatura de 25 1 ºC da como resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%, estéril a.

3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%, estériles con tapón de algodón a.

4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa o 1 matraz Erlenmayer de 250 mL con 80.0 mL del mismo medio para facilitar la acidificacióna .

4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta o 1 matraz Erlenmayer de 250 mL con 80.0 mL del mismo medio para facilitar la acidificación a.

NOTA La Norma Oficial Mexicana utiliza únicamente el agar papa dextrosa para la detección y cuantificación de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la cuantificación de las levaduras, la utilización del agar extracto de malta acidificado ya que es un medio más rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Solución colorante de lactofenol azul de algodón b.

Colorantes para tinción de Gram b.

Solución estéril de ácido tartárico al 10.0 % a. MATERIAL Y EQUIPO

Vaso de licuadora estéril o bolsa para Stomachera.

Motor para licuadora o Stomachera.

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Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a.

Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón a.

Pipetas Pasteur estériles a, b

Propipetaa, b

Cajas de Petri estériles (una se utiliza para pesar la muestra) a.

Utensilios estériles para la manipulación de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc. a

Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 1°C a.

Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica mantenida a

45 1°C a.

Portaobjetos, cubreobjetos, diurex b.

Microscopio óptico b.

Asa bacteriológica y asa micológicab.

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b.

NOTAS a Material necesario para el inicio de la práctica. b Material necesario para los 3, 4 y/o 5 días después de iniciada la práctica.

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Homogeneizar la muestra con el agar mediante movimientos

rotatorios

Incubar las cajas en

posición invertida

3,4 ó 5 días /

28°C

1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

10-1 10-2 10-3

10-4

Pesar 10 g de muestra en condiciones de

asepsia

Adicionar de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa y/ó agar extracto de malta acidificados con 0.3 mL ácido tartárico 10 % enfriado a 45°C en cada placa

Contar aquellas placas que tengan entre 10 a 150 colonias de hongos y/o levaduras y reportar por separado como UFC/g o mL de muestra, indicando tiempo de

incubación

Homogenizar con 90 .0 mL de

solución diluyente.

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml de solución diluyente

Depositar por duplicado 1.0 mL de cada

dilución en cajas de Petri estériles

DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

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PROCEDIMIENTO 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz Erlenmeyer

que contenga 90.0 mL de una solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%.

2. Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un vaso de licuadora estéril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la licuadora a velocidad mínima, ó 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal. Esta es la dilución primaria.

3. De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operación tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe utilizar una pipeta estéril para cada dilución.

NOTA Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cúmulo de hifas. Debido a esto, el número de UFC/mL puede variar dependiendo de las condiciones de homogeneización de la muestra (a mayor tiempo de homogeneización mayor será la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentarían las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneización citados en esta metodología son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para este grupo microbiano. 4. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las diluciones

de la muestra, utilizando una pipeta estéril. 5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa

dextrosa y/o de agar extracto de malta estériles. Enfriarlos y mantenerlos a 45°C. 6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de

agar, 1.4 mL de ácido tartárico al 10% esterilizado por filtración en membrana, o

bien esterilizar la solución a 121°C 1°C durante 15 minutos. Esto significa que a

cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45°C se le deberá adicionar 0.3 mL del ácido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo precaución de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo.

7. La norma recomienda que después de la acidificación, se utilice un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potenciómetro.

8. En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa

acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45 C. El tiempo transcurrido entre la preparación de las diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.

9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejándolas reposar sobre una superficie horizontal fría.

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10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verterá en una caja

de Petri sin inóculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Después de la incubación estas cajas no deberán presentar desarrollo de colonias.

11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 1 C. 12. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después

de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificación de 4 días de incubación o incluso las de 3 días. En este caso, se informa el período de incubación en los resultados de los análisis.

NOTA Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cúmulo de hifas. Debido a esto, el número de UFC/mL puede variar al revisar las cajas y retirar las mismas en los tiempos recomendados de incubación. (un manejo brusco de las cajas al retirar de la incubadora ocasionará la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentarían las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. 13. Realizar una tinción húmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de

algodón, para un examen microscópico y una posible identificación de los mohos que se hayan desarrollado.

14. Realizar una tinción de Gram para la observación microscópica de las levaduras obtenidas.

15. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 3, 4 y 5 días de

incubación (a 26 1ºC o a temperatura ambiente). 16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el

informe. Multiplicar por el inverso de la dilución. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de

mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 25 1 C durante 5 días.

18. Describir las características macroscópicas y microscópicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada.

19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difícil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 días de incubación y aún a los 3 días. En este caso se debe informar el periodo de incubación de 3 ó 4 días, en los resultados del análisis.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan:

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ANÁLISIS CUANTITATIVO Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este análisis, se deben seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadística). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el número de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado físico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el número de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilución correspondiente a esa caja. En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se debe reportar el número obtenido de UFC indicando la dilución correspondiente. En el caso de no encontrar colonias características de hongos y/o levaduras, el resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g ó bien menos de 10 UFC/mL (Sensibilidad del Método) Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar el tiempo de incubación en el que se realizó la cuantificación. Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar por separado el resultado de la cuantificación de hongos y de levaduras. ANÁLISIS CUALITATIVO Reportar las observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes tipos de colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el análisis. Si es posible reportar el o los géneros probables.

BIBLIOGRAFÍA. Norma Oficial Mexicana. NOM-111-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Frazier W. & Westhoff D. (1994) Microbiología de los Alimentos. 4ª. ed. Acribia, España. 23-50. Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) “Yeasts and Molds”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 209-215. Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 71-87.

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Hocking A. (2001) Toxigenic Aspergillus Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 451-465. Pitt J. (2001) Toxigenic Penicillium Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 467-480. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS

Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana.

Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico. Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

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conservación inapropiadas; este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1.0 microgramo), para causar intoxicación, es de 106 UFC/g de alimento, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno, en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento, es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. También es importante observar, que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo, se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida, aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más bajas, del orden de 0.01 microgramo, suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo, por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2° C y por debajo de 60° C) después de su preparación, son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocóccica. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sándwiches y papas, son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas. En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo, cabello y piel del 50% o más de los individuos, sin causar daño aparente (portadores asintomáticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. La especie aureus, es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis, meningitis, neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas, son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.

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El establecimiento de los síntomas de la intoxicación, por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea, vómito, dolor o espasmos abdominales y postración. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. En casos más severos, se puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días, sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos. El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo, utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son:

Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones.

Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico.

Demostrar la contaminación postproceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.

FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus, consiste en los siguientes pasos: 1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo sólido, el cual inhibe el desarrollo

de géneros diferentes al Staphylococcus, pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado.

2. Recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus.

3. Identificación bioquímica, en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico.

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Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en superficie, es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus aureus/ mL de alimento. El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma importancia, no sólo desde el punto de vista económico, sino en el de salud pública; la Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser consumido. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada, la sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa, utilizando el método de extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10 UFC/mL para alimentos líquidos. NOTA La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL, solamente si se coloca 1.0 mL de la primer dilución del alimento, distribuido en tres placas de agar Baird Parker, esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0.33 mL por caja. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

4 cajas de Petri con 20.0 mL de agar Baird Parker a.

7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b.

1 caja de Petri con 20.0 mL de agar DNA c.

7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL cada uno de caldo manitol c. (opcional)

1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a.

3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Colorantes para Tinción de Gram b

Parafina o aceite mineral estérilc. (sólo si se siembra en caldo manitol)

Colorante azul de orto-toluidina 0.1M, (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d.

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HCl 1N, en caso de no contar con la orto toluidina d. BIOLÓGICOS

Plasma de conejo c.

MATERIAL Y EQUIPO

Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a, c. (se debe utilizar una pipeta para cada dilución)

Pipetas Pasteur estériles a, b. c. d.

Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón. a. (en caso que la muestra sea líquida.

Propipeta. a, b, c, d

Varillas de vidrio de 3.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas en ángulo recto (forma de “L”), estériles (se debe utilizar una por dilución). a

Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras, espátulas y separador de huevo. a

Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a.

Motor para licuadora o Stomacher a.

Asa bacteriológicab.

Portaobjetosb.

Microscopio óptico b.

Balanza granataria a.

Horno para esterilizar material de vidrio.

Autoclave

Baño de agua a ebulliciónd

Incubadora a 35 ± 2°Cd NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica. c Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica. d Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica.

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10-1 10-2 10-3 10-4

10-2 10-3 10-4 10-5

Fermentación

del manitol

Incubar 24 - 48 h a 37°C

Contar aquellas colonias negras con hidrólisis de lecitina

Pesar 10.0 g de muestra en condiciones de

asepsia

Distribuir la muestra con una varilla de vidrio

estéril

0.1 mL

1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Siembra de colonias típicas en tubos con

caldo BHI. Consultar

Cuadro 1

Incubar 24 h

37°C

Coagulasa

DNAsa termoestable Realizar pruebas bioquímicas a cada tubo

Realizar diluciones decimales empleando tubos

con 9.0 mL de solución diluyente

Depositar por duplicado 0.1 mL de cada dilución

en cajas petri con agar Baird Parker.

Homogenizar con 90.0 mL de

diluyente

DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS

Plasma más desarrollo

en BHI

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PROCEDIMIENTO 1. Aislamiento selectivo. 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estéril. 2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. 3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estéril al 0.1% o solución amortiguadora de

fosfatos 0.1M de pH 7.2. 4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en

licuadora a velocidad mínima. 5. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en función de

la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente.

6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker.

7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril, en forma de “L”, iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie).

8. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente.

9. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. durante 45 a 48 h. 10. Después de incubar, observar las colonias características de este microorganismo

en el agar Baird Parker (BP). Éstas se presentan como: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con diámetro de 1 a 2 mm, muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia.

2. Recuperación de la cepa.

1. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S. aureus, si no es posible, seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra más diluidas, no obstante que contengan más de 150 colonias.

2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas, también pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor estimado”.

3. Con ayuda del cuadro 1, determinar el número de colonias a evaluar, tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas; dentro de estas últimas están comprendidas la coagulasa y la termonucleasa.

4. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son características de este microorganismo, utilizando asa bacteriológica recta estéril, en caldo infusión cerebro corazón.

5. Incubar a 35 1 C durante 24 h. 6. Inocular e incubar en la misma forma, cepas tipo de S. aureus ATCC 6538 y S.

epidermidis ATCC 12228, como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioquímicas.

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CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. aureus.

Cuenta total de colonias sospechosas en una caja representativa

Colonias sospechosas a caracterizar bioquímicamente

Menos de 50 UFC 3

51-100 UFC 5

101-150 UFC 7

3. Pruebas bioquímicas. 1. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo, haciendo las pruebas de

presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa. 3.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. 1. Con una pipeta estéril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensión del microorganismo

que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón, adicionar 0.2 mL de plasma de conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril.

2. Incubar en baño María o en incubadora, entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. en intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formación de coágulo, prolongar el período de observación hasta por 24 h.

3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos.

NOTA Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta, de acuerdo con los valores del cuadro 2. Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual o superior a 2 cruces.

CUADRO 2. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa

VALOR CARACTERÍSTICA

negativa No se observa formación de coágulo.

1+ (positiva) Formación de coágulos pequeños desorganizados.

2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado

3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado

4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado. Al invertir el tubo este coágulo se mantiene en el fondo del mismo.

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3.2 Prueba de la enzima termonucleasa. 1. Calentar 0.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión

cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo. 2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión

bacteriana, del punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. aureus ATCC 6538), como negativos (S. epidermidis ATCC 12228).

3. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda, durante 4 a 24 h. 4. Después de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los orificios

hechos en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina).

5. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del orificio, en donde se inoculó, indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa.

6. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como indicador. De encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente alrededor de la colonia, seguido de un precipitado blanco.

NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial, generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina, por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó, en caso de encontrarse dicha enzima. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa; cuando ambas pruebas son positivas, quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima catalasa. 3.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional, no lo exige la norma). 1. Inocular 2 asadas en caldo manitol, de la suspensión del microorganismo que

desarrollado en el medio infusión cerebro corazón. 2. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado, entre 0.3 y 0.5 mL de

parafina o aceite mineral estéril.

3. Incubar a 35C 2 C por 24 h. y observar los resultados. 4. Considerar la prueba como positiva, si se presenta desarrollo y vira el indicador. Si

el medio contiene como indicador el rojo de fenol, el medio debe virar a color amarillo por la producción de acidez.

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3.4 Prueba de la catalasa (opcional, no lo exige la norma). 1. Con una asa bacteriológica, tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón

después de su incubación, y colocarlo sobre un portaobjetos, 2. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%, mezclar perfectamente

bien y observar los resultados. 3. Si se presenta formación de burbujas, se considera positiva la prueba, esto es que

sí contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de esta enzima.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Para determinar el número de S. aureus enterotoxigénico presentes en 1.0 g de alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas. Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología, se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente, contenía 70 UFC sospechosas de S. aureus (negras, brillantes con halo y precipitado blanco). Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0.001g/mL), como en este método se inoculan 0.1 mL el factor que hay que aplicar es 10-4 (0.0001g) para este caso. Tomando en cuenta el cuadro número uno, se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. De estas 5 colonias analizadas, solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. auresus toxigénico, se encuentran en este alimento? y ¿se puede consumir el alimento?, el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S. aureus toxigénico. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas, dos colonias positivas, ¿a qué porcentaje corresponden?, expresado en forma aritmética es:

5 UFC 100% 2 UFC X

X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0.1 mL de dilución 10-3:

70 UFC 0.0001 g (10-4g)

X 1g X= 700,000 UFC/g de alimento.

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De las 700,000 UFC/g de alimento, solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este alimento?

700,000 UFC/g 100% X 40%

X=280,000 UFC/g Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10, la forma correcta de expresar el resultado es:

Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g Estas 280,000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g), de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana, el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones, sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski, 2001) presentan riesgo para la salud pública; por lo que no se debe consumir. NOTA No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que solamente números de unidades formadoras de colonias de S. aureus toxigénico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación alimentaria. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado, para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma específica, pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. Para elaborar un informe de resultados, se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan:

Cuando las UFC encontradas en una caja Petri, están dentro del rango estadístico (de 15 a 150 UFC/caja), se reporta como en el ejemplo antes descrito.

Si se está en el valor estimado, esto es que no existen colonias típicas, se debe reportar la sensibilidad del método, en este caso será de 100 UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas.

Cuando todas las pruebas bioquímicas son negativas, se informará: < 10 UFC/mL en muestras líquidas de la dilución 1:10 < 100 UFC/g para muestras sólidas de la dilución 1:10

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BIBLIOGRAFÍA. Jablonskin L.M. & Bohach G:A. 2001. “Staphylococcus aureus” In:Doyle M. Beuchat. L:R. & Montville T:J. (Eds.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers. ASM. USA: 411-434. NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Lancette G.A. & Bennett W. (2001) “Staphylococcus aureus, and Staphylococcal Enterotoxins”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 387-403. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.

OBJETIVOS

Aplicar adecuadamente la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para la detección del género Salmonella.

Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Salmonella en alimentos.

GENERALIDADES Al inicio del siglo XIX, patólogos clínicos en Francia documentaron la asociación de la ulceración intestinal humana con un agente contagioso; la enfermedad fue denominada como fiebre tifoidea y posteriormente investigadores Europeos aislaron y caracterizaron al bacilo tifoideo responsable de ésta, mientras que en los Estados Unidos, Salmon y Smith en 1885, aislaron de carne de puerco a Bacillus cholerae-suis, ahora conocido como Salmonella enterica serovar Cholaraesius. Salmonella spp. es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este género son capaces de moverse por medio de flagelos perítricos, existen variantes no móviles, S. enterica serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, así como cepas no móviles debido a la presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de Salmonella son quimioorganótrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las vías fermentativa y respiratoria. Las bacterias crecen óptimamente a 37°C y pueden catabolizar la D-glucosa y otros carbohidratos con producción de ácido y gas. Estos microorganismos son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como única fuente de carbono, generalmente producen ácido sulfhídrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayoría de estas características se utilizan para la identificación bioquímica de cepas aisladas de Salmonella. De acuerdo con la definición contemporánea, una cepa de Salmonella típica produce ácido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azúcares, pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa en éste medio, o en medios sólidos selectivos tales como verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entérico de Hektöen. Las especies típicas de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rápida reacción alcalina por la descarboxilación de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad genética observada en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenérico de plásmidos lo cual ha reducido los biotipos típicos de Salmonella. En muestras clínicas y de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rápidamente en KCN. Esta situación ha llevado a reevaluar el esquema de identificación del género, e

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incluso a utilizar tecnologías moleculares para establecer loci genéticos y/o productos únicos para el género Salmonella. La identificación bioquímica de Salmonella se realiza generalmente junto con una confirmación serológica. Esta técnica laboriosa implica la aglutinación de los antígenos superficiales bacterianos con anticuerpos específicos para el género. Estos incluyen los lipopolisacáridos (LPS) somáticos (O) en la superficie externa de la membrana externa, los antígenos asociados con los flagelos perítricos (H) y el antígeno capsular (Vi), este último presente solamente en Salmonella serovar Typhi, Paratyphi C y Dublín. La amplia distribución de Salmonella spp. en el medio ambiente, aunada a las prácticas agrícolas utilizadas en la industria cárnica, pesquera, de moluscos, láctea y el reciclaje de la materia prima como alimento para ganado, ha favorecido la continua permanencia de este patógeno humano en la cadena alimenticia. El sector avícola se sitúa como la principal fuente de Salmonella spp. y enmascara la importancia como vehículos de infección de las carnes de puerco, de res, de cordero, leche y sus derivados. Las frutas y verduras han ganado notoriedad en años recientes como fuentes de salmonelosis humana. Esto se presenta como una consecuencia de diversos factores como: la fertilización de sembradíos con lodos sin tratamiento o efluentes de drenajes potencialmente contaminados con Salmonella spp. resistente a antibióticos, la irrigación de los campos y el lavado de frutas y verduras con aguas contaminadas, la manipulación excesiva por los trabajadores, la exposición a la contaminación ambiental de especies y condimentos durante el secado y la resistencia del microorganismo a valores de pH bajos. El desarrollo incompleto del sistema inmune en recién nacidos e infantes, el abatimiento en la respuesta inmunológica en individuos de la tercera edad, y la baja producción de ácidos gástricos en estos sectores de la población facilita la colonización intestinal y distribución sistémica del microorganismo. Se ha demostrado que la ingesta de solamente algunas células de Salmonella pueden ser infecciosas. La dosis infectiva en humanos fluctúa entre 1 a 10 células. La composición química del alimento es otro factor determinante en la salmonelosis además de la heterogeneidad inmunológica en la población humana y la virulencia de las cepas infectivas. Un denominador común de los alimentos involucrados, es la presencia de un alto contenido de grasa en alimentos como el chocolate, el queso y la carne. Se ha sugerido que las células de Salmonella englobadas en las micelas lipídicas pueden resistir el efecto lítico de los ácidos gástricos. Las infecciones por Salmonella en humanos pueden originar varias condiciones clínicas, incluyendo fiebre entérica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistémicas por microorganismos no tifoides. La fiebre entérica es una infección grave asociada con las cepas tifoidea y paratifoidea, las cuales están particularmente bien adaptadas para invadir y sobrevivir en los tejidos del huésped. Las manifestaciones clínicas de la fiebre entérica aparecen después de un periodo de incubación de 7 a 28 días y pueden incluir diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal, dolor de

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cabeza, y debilitamiento. El diagnóstico de la enfermedad radica en la detección del agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la sintomatología clínica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infección sistémica. En países subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibióticos ha originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad cuando se presenta un brote de este tipo. La infección en humanos con Salmonella spp. no tifoide provoca enterocolitis, ésta aparece de 8 a 72 h después de tener contacto con el patógeno invasivo. La condición clínica es auto limitante y la evacuación de heces típicas diarreicas no sanguinolentas y dolor abdominal se presentan a los 5 días. El tratamiento solo implica reemplazo de fluidos o electrolitos. El uso de antibióticos está contraindicado ya que prolonga la sobrevivencia y la excreción intermitente del microorganismo. Este microorganismo se identificó originalmente en hospitales y laboratorios clínicos y los métodos empleados para su detección, se adaptaron posteriormente al análisis de alimentos. Las modificaciones a los métodos, consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes, debido al proceso al que se somete el alimento (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio. Para diferentes tipos de alimentos, existen distintos protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:

Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable.

Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.

Selección en medios sólidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas.

Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

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Serotipificación, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la identificación específica de un microorganismo.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES NOTA Los medios de cultivo que a continuación se presentan son los utilizados en el procedimiento general. Para los medios de cultivo utilizados durante preenriquecimientos específicos consultar las modificaciones en el inciso 1.0.

1 matraz Erlenmeyer de 500 mL de capacidad, conteniendo 225.0 mL de caldo lactosado a.

1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo selenito-cistina b.

1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo tetrationatob.

1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo Vassiliadis-Rappaport b.

1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) c.

1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar bilis verde brillante (VB) c.

1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar entérico de Hektöen (HE) c.

1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar sulfito de bismuto (SB) c.

1 caja de Petri estéril con 20.0 mL de agar para Salmonella y Shigella (SS) c.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm conteniendo 3.0 mL de agar hierro-triple azúcar (TSI) o agar hierro Kligler (KIA) solidificado e inclinado d.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar hierro-lisina (LIA) inclinado d.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea o caldo Surraco e.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea rápido (puede utilizarse en sustitución del caldo urea o Surraco) e.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de medio sulfuro-indol-manitol (SIM) e.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar citrato de Simmons inclinado

e.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo manitol e.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo malonato e.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo rojo de metilo-Voges Proskauer (RM-VP) e.

2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 5.0 mL de caldo soya tripticaseína e.

2 cajas de Petri con 20.0 mL de agar infusión cerebro corazón e.

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SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

1 frasco gotero con solución salina isotónica estéril d.

1 frasco gotero con solución de verde brillante al 0.1% b

1 frasco gotero con solución yodo yoduro de potasio b

1 frasco gotero con solución salina formalizada e.

1 frasco gotero con reactivo de Kovac’s f.

1 frasco gotero con solución de rojo de metilo r.

1 frasco gotero con solución reactivo de Voges-Proskauer N° 1 (VP1; solución etanólica de alfa-naftol al 5% P/V) f.

1 frasco gotero con solución reactivo de Voges-Proskauer N° 2 (VP2; hidróxido de potasio al 40% P/V) f.

Juego de colorantes para la tinción de Gram d. BIOLÓGICOS

Suero anti Salmonella “O” (somático) polivalente d.

Suero anti Salmonella “H” (flagelar) polivalente d.

Suero anti Salmonella “Vi” d. MATERIAL Y EQUIPO

Balanza granataria a.

1 caja de Petri de vidrio estéril a.

1 bolsa de stomacher o un vaso de licuadora estéril a.

Utensilios necesarios para la manipulación de muestras: cucharas, cuchillos, tenedores, estériles a.

Stomacher o motor para licuadora a.

Pipetas de vidrio de 1 mL, estériles con filtro de algodón b.

Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d, e, f

Asa microbiológica c, d, e.

Mecheros de Bunsen a, b, c, d, e.

Portaobjetos d.

Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón d, e.

Microscopio óptico d, e.

Incubadora a 35°C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1°C a, b, c, d, e.

Incubadora a 42°C que evite variaciones mayores a 0.1°C b.

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NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica. c Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. d Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica. e Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica. f Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.

90

Incubar 18- 24

h a 37°C

Pesar 25 g de muestra en

condiciones de asepsia

Homogeneizar con 225 mL de solución diluyente

según el tipo de muestra

Siembra con asa bacteriológica en caldo tetrationato o Vassiliadis

y Caldo Selenito cistina

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (XLD, SS. Hecktoen, VB,

Sulfito bismuto)

Incubar 18- 24

h a 37°C

Incubar 18- 24

h a 37°C

Búsqueda de colonias típicas. Consultar cuadro 1

Realizar bioquímicas presuntivas Kligler y LIA

Incubar 18- 24

h a 37°C

Resultados característicos

Siembra de bioquímicas complementarias: malonato citrato, RM-VP, urea, SIM, manitol

Resultados positivos para

Salmonella

Confirmación

serológica

Incubar 18- 24

h a 37°C

DETERMINACIÓN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS

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PROCEDIMIENTO El siguiente método se basa en el análisis de 25.0 g de la muestra, que se considera como una unidad analítica, en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción de 1:9 en el medio de preenriquecimiento. La mínima muestra recomendada es de 25.0 g, es decir, una unidad analítica. Para algunos casos donde el riesgo es mayor, se utilizan dos unidades analíticas (50.0 g) o más.

1. Preenriquecimiento. 1.1. Procedimiento general para la preparación de muestras NOTA IMPORTANTE El presente procedimiento se basa en la técnica general para la detección de Salmonella en alimentos. Sin embargo, deben consultarse los siguientes incisos para realizar las modificaciones pertinentes al preenriquecimiento dependiendo del alimento a analizar, los cuales se presentan en el complemento de la presente práctica. 1. Pesar en una bolsa de Stomacher estéril, en área aséptica 25.0 g de muestra a

analizar. 2. Verter 225.0 mL de caldo lactosado estéril en la bolsa. 3. Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg a velocidad media en el

Stomacher. 4. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca

ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura ambiente con la tapa perfectamente cerrada.

5. Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH.

6. Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8 0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estériles. 7. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz

8. Incubar la muestra homogénea a 35 2 C durante 24 h. 2. Enriquecimiento selectivo. 1. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de

preenriquecimiento y agitar suavemente. 2. Transferir 1.0 mL del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de 1

mL, estéril) a un tubo con 10.0 mL de cada uno de los siguientes medios de enriquecimiento:

Caldo tetrationato (antes de su uso, deberá activarse añadiendo al medio base 0.2 mL de solución yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solución de verde brillante al 0.1 %)

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Caldo selenito cistina

Caldo Vassiliadis-Rappaport (en sustitución del caldo tetrationato) 3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo

Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para alimentos altamente contaminados deberán incubarse los medios de enriquecimiento a 42°C por el mismo periodo

3. Aislamiento diferencial. NOTA La metodología descrita en esta sección deberá realizarse para cada uno de los caldos de enriquecimiento descritos en el inciso 2, es decir para los cultivos desarrollados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo Vassiliadis-Rappaport. 1. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado. 2. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiológica estéril y sembrar en

estría por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los siguientes medios selectivos: a) Agar XLD b) Agar VB c) Agar HK d) Agar SB e) Agar SS f) Agar Mac Conkey

3. Incubar las cajas ya sembradas en posición invertida a 35 2 C durante 24 2 h. 4. Observar las características macroscópicas de las colonias en los medios sólidos

selectivos. 5. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de acuerdo

con las características específicas de desarrollo en cada uno de los medios (Consultar el Cuadro 1).

6. Almacenar en refrigeración de 5 a 8°C, las placas con medios selectivos por si es necesario tomar más colonias.

7. Realizar una tinción de Gram a las colonias sospechosas. 8. Registrar las características morfológicas tanto macroscópicas como microscópicas;

anotando la forma de la colonia, su color, color del medio circundante, morfología al Gram, etc.

9. Realizar una purificación de las colonias seleccionadas, sembrando nuevamente en estría por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri conteniendo un medio idéntico del que se tomó la colonia.

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4. Pruebas bioquímicas preliminares

NOTA Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analítica (25.0 g). Seleccionar colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. 4.1. Agar triple azúcar hierro o agar Kligler hierro 1. Registrar las características del medio TSI o KIA antes de la inoculación (color del

medio). 2. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa

bacteriológica recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) o agar de Kligler (KIA) inclinado.

3. Incubar el medio TSI o KIA a 35 2 C durante 24 h. 4. Consultar el Cuadro 2 para la interpretación de los resultados. 4.2. Agar lisina hierro.

1. Hacer la misma operación que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la

asada de la misma colonia con la que se sembró en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA).

2. La interpretación de resultados puede ser consultada en el Cuadro 2. 3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de

Salmonella en los medios TSI (o KIA) y LIA para realizar las pruebas bioquímicas complementarias.

4. Los cultivos desarrollados en TSI o KIA que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA típicos deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestre reacciones atípicas en ambos medios.

5. Pruebas bioquímicas complementarias 5.1. Caldo urea (convencional) 1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e

inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco.

2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den

la prueba negativa.

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5.2. Caldo urea (rápida)

1. Con asa bacteriológica estéril, tomar dos asadas de crecimiento del cultivo

presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular tubos de caldo urea (rápida).

2. Incubar a 37 0.5 C durante 2 h en baño de agua. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den

la prueba negativa. 5.3. Agar citrato de Simmons 1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e

inocular por estría en el tubo con agar citrato de Simmons.

2. Incubar a 35 2 C durante 96 2 h. 3. Interpretar los resultados (Consultar Cuadro 2). 5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad) 1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e

inocular por punción vertical en el tubo con medio de SIM.

2. Incubar a 35 2 C durante 24 h. 3. Para verificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente

crecimiento de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovac’s. 4. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 5.5. Caldo RM-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e

inocular el tubo con caldo RM-VP. 5.5.1. Prueba de Voges-Proskauer (VP)

1. Para la prueba de Voges-Proskauer incubar a 35 2 C durante 48 2 h. 2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estéril un mililitro de cultivo. 3. Adicionar a este cultivo, 0.6 mL de reactivo de VP1 (alfa-naftol etanólico al 5 %),

agitar y agregar 0.2 mL del reactivo VP2 (hidróxido de potasio al 40%). 4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional). 5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto que la

reacción se lleve a cabo en presencia de oxígeno. 6. Interpretar los resultados después de 2 h. de incubación a temperatura ambiente

(Consultar Cuadro 2).

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5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo

1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 2 C el resto del medio RMVP durante 48 h más (96 h. de incubación en total a partir de la inoculación del medio RMVP).

2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora de rojo de metilo.

3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar Cuadro 2). 5.6. Caldo malonato (para confirmar la presencia de S. arizonae) 1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA e

inocularlo en el tubo que contiene caldo malonato.

2. Incubar a 35 2 C durante 40 2 h. 3. Interpretar los resultados después de incubar (Consultar Cuadro 2). 5.7. Caldo manitol 1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e

inocular en el tubo que contiene caldo manitol.

2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). NOTA Las pruebas bioquímicas se pueden interpretar en el Cuadro 2, sin embargo se sugiere que se consulten otras referencias, además de las ya expresadas aquí, con el fin de determinar la especie del género en cuestión, esto quiere decir que no necesariamente se encuentre en el alimento analizado la Salmonella, pero sí puede encontrarse otra Enterobacteria, el que es indispensable identificar. En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioquímicas más generales de Salmonella. 6. Identificación serológica. 6.1. Investigación de los antígenos somáticos de Salmonella (suero anti Salmonella “O” polivalente).

1. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril

(NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.

2. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI/KIA o LIA.

96

3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella “O” polivalente y mezclar

con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. 4. Agitar inclinando la lámina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un

minuto. 5. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción. 6. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva. 7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretación de los resultados. NOTAS

La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Salmonella “O” polivalente se considerará como el control negativo para poder interpretar el resultado.

Cuando la aglutinación es positiva con el suero anti Salmonella “O” polivalente, puede determinarse el subgrupo empleando sueros inmunes para los diferentes subgrupos (los mas frecuentes son B, C, D y E).

Si la aglutinación con el suero anti Salmonella “O” polivalente es negativa, utilizar el suero anti Salmonella “Vi” polivalente y efectuar la prueba en las mismas condiciones ya descritas. Si hay aglutinación con “Vi” calentar a ebullición y repetir nuevamente la prueba con el suero anti Salmonella “O” polivalente.

6.2. Investigación de los antígenos flagelares de Salmonella (suero anti

Salmonella “H” polivalente) .

1. Para ensayo el antígeno flagelar en el mismo día, inocular el crecimiento del cultivo de TSI/KIA o LIA en agar infusión cerebro corazón (BHI).

2. Incubar a 35°C durante 4 a 6 h. 3. Para ensayo del antígeno flagelar al día siguiente inocular una asada del cultivo

desarrollado en el tubo de TSI o KIA, en un tubo de 13 x 100 mm conteniendo 5.0 mL de caldo soya tripticaseína.

4. Incubar a 35 2 C durante 24 h. 5. Adicionar al cultivo (ya sea de agar infusión cerebro corazón o caldo soya

tripticaseína), 2.5 mL de solución salina formalizada. 6. Colocar 0.5 mL del suero antiflagelar “H” polivalente en un tubo de ensayo para

serología (12 x 75 mm). 7. Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 5 de este inciso). 8. Preparar un control de solución salina mezclando 0.5 mL de solución salina

formalizada con 0.5 mL del antígeno formalizado.

9. Incubar las mezclas en baño de agua a una temperatura entre 48 y 50 C. 10. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora. 11. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la muestra de prueba

pero no en el control.

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12. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas

muestre aglutinación. 13. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica. 14. La interpretación de los resultados se puede observar en el Cuadro 3. CUADRO 1. Colonias típicas de Salmonella spp. en medios sólidos selectivos.

MEDIO SELECTIVO Color antes de la inoculación

Características coloniales de

Salmonella spp.

Agar Verde Brillante (VB)

Oscuro, color marrón Rosas o rojas pueden ser transparentes, rodeadas de medio enrojecido. Las bacterias fermentadoras de lactosa son amarillas

Agar Sulfito Bismuto (SB)

Opaco, verde pálido Café, grises o negras; con o sin brillo metálico. Algunas veces presencia de halo café o negro.

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)

Claro, color rojo brillante Rosas o rojas pueden ser transparentes, con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras

Agar para Salmonella y Shigella (SS)

Claro, color rosa Translúcidas en ocasiones opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas

Agar entérico Hektöen Oscuro, color verde Verdes o azul verdes con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras

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CUADRO 2. Reacciones bioquímicas de Salmonella. Medio Resultado

a Color antes de

inocular/incubar Color después de inocular/incubar

Kligler: Fermentación Glucosa

+ Naranja Fondo tubo amarillo Crecimiento

Kligler: Fermentación Lactosa

- c

Naranja Pico de flauta naranja. Crecimiento

Kligler: Producción de H2S

+ Naranja Ennegrecimiento Crecimiento

Agar LIA: Lisin descarboxilasa

+ Púrpura tenue Púrpura intenso Crecimiento

Agar LIA: H2S + Púrpura tenue Ennegrecimiento Crecimiento

Agar LIA: Fermentación Glucosa

+ Púrpura tenue Fondo tubo amarillo Crecimiento

Caldo Surraco: Ureasa

- Rosa mexicano

Rosa-violeta Crecimiento

Caldo Surraco: Fermentación sacarosa

- Rosa Amarillo Crecimiento

Medio SIM: Movilidad

+ d

Amarillo tenue. Semisólido, translúcido

Crecimiento en superficie y picadura,

turbiedad/difusión fuera de picadura

Medio SIM: Indol - Amarillo tenue. Semisólido, translúcido

Con reactivo Kovac’s: Formación de anillo rojo en superficie

Medio SIM: H2S + Amarillo tenue. Semisólido, translúcido

Ennegrecimiento Crecimiento

Caldo RMVP: Prueba de rojo de metilo

+ Amarillo tenue, translúcido

Con indicador rojo de metilo: Rojo

Caldo RMVP: Prueba Voges-Proskauer

- Amarillo tenue, translúcido

Con reactivos VP1 y VP2: Anillo rojizo

Agar Citrato Simmons

V a+

Verde Azul Crecimiento

Caldo malonato - c

Verde Azul

Caldo manitol rojo fenol

+ Rojo Amarillo

Caldo dulcitol rojo fenol

+ b

Rojo Amarillo

Caldo KCN - Sin desarrollo Desarrollo

Caldo manitol rojo fenol

+ Rojo Amarillo

Observación microscópica

Bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados

a +,90% o más positivos en 1 ó 2 días;- 90% o más negativos en 1 ó 2 días; v, variable. b La mayoría de los cultivos de S. arizonae son negativos. c La mayoría de los cultivos de S. arizonae son positivos. d Excepto S. entérica serovar Pullorum y S. entérica serovar Gallinarum y cepas con flagelos disfuncionales

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CUADRO 3. Reacciones serológicas de Salmonella.

Reacciones bioquímicas Reacciones serológicas Interpretación

Típica Antígeno O, Vi o H Positivo

Cepas consideradas como Salmonella

Típica Todas las reacciones positivas

Típica No probada Puede ser Salmonella

Reacciones atípicas Antígeno O, Vi o H Positivo

Reacciones atípicas Todas las reacciones negativas

No debe ser considerada Salmonella

RESULTADOS 1. Interpretación de resultados. Consultar los resultados obtenidos en los cuadros para la identificación de los géneros y especies de las bacterias investigadas. 2. Informe de resultados. Reportar presencia o ausencia de Salmonella spp. o la especie identificada en 25.0 g o mL de alimento, o en la cantidad de muestra inicialmente pesada (mayor a 25.0 g o mL).

100

COMPLEMENTO

Preenriquecimientos específicos en diversos grupos de alimentos para la detección de Salmonella spp. (continúa de inciso 1)

1.2. Preenriquecimiento para huevo en polvo, claras de huevo en polvo, huevos líquidos pasteurizados y congelados, fórmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo como harinas para hot cakes, galletas, donas, biquets y pan.

Si el alimento está congelado, no descongelar sino hasta el momento del análisis.

Descongelar en un baño de agua a 45°C agitando continuamente en un lapso de 15.0 min. aproximadamente, o bien se somete a una temperatura entre 2 y 5°C durante 18.0 h.

1.2.1. Productos líquidos

Realizar el preenriquecimiento como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

1.2.2. Productos en polvo 1. Pesar 25.0 g de muestra y transferirla a una porción del caldo lactosado

(aproximadamente 15.0 mL), para permitir la humectación lenta del alimento. 2. Homogeneizar poco a poco con una varilla de vidrio estéril y agregar más caldo

lactosado hasta completar 225.0 mL 3. Continuar igual que el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.3. Preenriquecimiento para productos no pasteurizados congelados de huevo

1. Descongelar la muestra como se indica en 1.2. 2. Pesar asépticamente y por duplicado 25.0 g de muestra. 3. Colocar una de las muestras en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo selenito

cistina 4. Colocar la segunda muestra en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo

tetrationato, sin verde brillante.

5. Ajustar si es necesario el pH a 6.8 0.2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N.

6. Al matraz que contiene el caldo tetrationato, adicionarle 2.25 mL de verde brillante al 0.1% y 4.5 mL de solución yodo-yoduro. Mezclar bien.

7. Incubar a 35°C durante 18 a 24 h, o en caso de tratarse de alimentos fuertemente contaminados incubar a 42°C por el mismo periodo.

101

1.4. Productos que contienen huevo en su formulación: (pastas para sopa, rollos chinos, etc.); ensaladas preparadas (jamón, huevos, pollo, atún, pavo); frutas frescas, congeladas o secas; crustáceos (camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas) y pescado

1. Preferentemente no descongelar la muestra antes de su análisis, si esto es

necesario, proceder igual que en el inciso 1.2. 2. Pesar 25.0 g de muestra y adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estéril. 3. Licuar el alimento durante 2.0 min. 4. Transferir la mezcla homogeneizada en el matraz que contenía el medio de

preenriquecimiento. 5. Continuar con la incubación como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.5. Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada. 1. Seguir el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla

lentamente a un matraz Erlenmayer con 225.0 mL de solución verde brillante al 0.1%, procurando que el polvo quede en la superficie del líquido y se hidrate suavemente.

2. Dejar la mezcla en reposo por 60 min. 3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.6. Queso 1. Preenriquecer como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando

solución amortiguadora de peptona como medio de cultivo. 1.7. Caseína 1. Seguir la metodología señalada en el procedimiento general (inciso 1.1.). 2. Licuar durante 2 min.

3. Ajustar cuidadosamente el pH a 6.8 0.2 1.8. Coco 1. Proceder como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), ajustar el pH a

6.8 0.2.

2. Adicionar hasta un máximo de 2.25 mL de tergitol aniónico 7 estéril (121 1°C/15 min.) y mezclar bien. También puede utilizarse tritón X-100 estéril. Usar la cantidad necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mínimo para que se inicie la formación de espuma. Puede ser para el tritón X-100 de dos a tres gotas.

3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

102

Levadura seca

1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando como medio de preenriquecimiento caldo soya tripticaseína estéril.

2. Mezclar para formar una suspensión homogénea

3. Ajustar el pH a 6.8 0.2

4. Terminar el procedimiento como se indica en el inciso 1.1.

1.9.1. Levadura seca inactiva.

1. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2

1.9.2. Levadura seca activa

1. Mezclar la muestra incubada (inciso 1.9.) 2. Transferir 1.0 mL a cada tubo de 10.0 mL de caldo tetrationato (con 0.2 mL de

solución yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solución de verde brillante al 0.1%) y 10.0 mL de caldo lauril-triptosa.

3. Incubar los medios de enriquecimiento a 35°C por 24 h 2 h

1.10. Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso)

1.10.1. Productos procesados térmicamente y productos secos.

1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta la homogeneización. 2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse.

3. Después de reposar, mezclar bien y ajustar el pH a 6.8 0.2. 4. Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las similares proporciones y

con las mismas recomendaciones que para el coco (inciso 1.8.) La cantidad de los mismos dependerá en gran medida de la composición del alimento. Los detergentes no serán necesarios en los productos glandulares en polvo.

5. Incubar las muestras como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

103

1.10.2. Productos crudos o altamente contaminados.

1. Pesar porciones de 25.0 g de producto por duplicado en dos vasos para licuadora o en dos bolsas de Stomacher.

2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y pesar directamente el producto en matraces Erlenmayer estériles de 500 mL.

3. Adicionar 225.0 mL de caldo selenito-cistina o 225.o mL de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra pesada.

4. Licuar por dos min. y pasar asépticamente a matraces Erlenmayer de 500 mL.

5. Dejar reposar y ajustar el pH a 6.8 0.2 6. Adicionar al caldo tetrationato, 2.25 mL de solución de verde brillante 0.1% y 4.5 mL

de solución yodo-yoduro de potasio 7. Mezclar el matraz con los reactivos añadidos. 8. Incubar como se describe en el procedimiento general (inciso 1.1.). 9. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2. para muestras

en general.

1.11. Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate)

1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra en un vaso de licuadora o bolsa de Stomacher, y agregar 225.0 mL de leche descremada reconstituida estéril.

2. Licuar por dos min. 3. Continuar igual que en el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta después de

ajustar el pH. 4. Adicionar 0.45 mL de la solución de verde brillante al 0.1% y mezclar bien. 5. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

1.12. Especias

1.12.1. Pimienta negra, pimienta blanca, semilla de apio, comino, perejil seco, romero, tomillo, chile en polvo, páprika o pimentón, ajonjolí, hojuelas de vegetales (vegetales secos)

1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra y verter en un matraz Erlenmeyer con tapón de rosca de 500 mL con 225.0 mL de caldo soya tripticaseína estéril y mezclar bien.

2. Continuar con el procedimiento como en el inciso 1.1.

104

1.12.2. Ajo en polvo u hojuelas; cebolla en polvo u hojuelas

1. Pesar asépticamente 25.0 g de la muestra y verter en un recipiente de tapón de rosca de 500 mL con 225.o mL de caldo soya tripticaseína estéril adicionado con sulfito de potasio y mezclar bien.

2. Continuar con el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.12.3. Pimienta de Jamaica (Pimienta Inglesa), clavo de especia, canela y orégano

1. No se conoce un método para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias. Diluir por lo tanto más allá de su poder de toxicidad.

2. Examinar la pimienta, canela y orégano en una proporción 1:100 muestra/caldo, y el clavo a 1:1000 muestra/caldo.

3. Continuar con el procedimiento descrito en el inciso 1.12.1.

1.13. Gelatina

1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra en un recipiente de boca ancha y tapón de rosca de 500 mL.

2. Adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estéril con 5.0 mL de solución acuosa de gelatinasa al 5.0% y mezclar bien.

3. Dejar reposar 60 min. 4. Continuar como en el procedimiento general (inciso 1.1.) BIBLIOGRAFÍA Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y Servicios. “Método para la determinación de Salmonella en alimentos”. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. D’Aoust J., Maurer J. & Bailey J.S. (2001). Salmonella Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. Doyle M., Beuchat L.R. & Montville T.J. (Eds.) 2d. ed. ASM Press USA: 141-157. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC.

105

Andrews W.H., Flowers R.S., Silliker J., & Bailey S. (2001) “Salmonella”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington: 357-380. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

106

Método para la determinación de Vibrio cholerae en alimentos, hielo y agua.

OBJETIVO

Realizar adecuadamente el análisis microbiológico para detectar Vibrio cholerae en alimentos, agua y/o hielo.

Explicar el fundamento de cada etapa del análisis. GENERALIDADES

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s), pueden ser de tipo infeccioso y de origen químico, como las intoxicaciones. La incidencia de estas enfermedades constituye uno de los problemas de salud pública más extendidos en el mundo contempóraneo y permanecen como una de las causas principales de morbilidad, ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificación obligatoria.

Entre los alimentos involucrados en ETA’s que están contaminados por V. cholerae resaltan los moluscos bivalvos así como los crustáceos y los pescados frescos-refrigerados y congelados. Estos productos pueden generar enfermedades a los consumidores debido a que desde su origen están sometidos a contaminación microbiológica y química entre otras, aunado a la forma de consumo que en muchos casos es cruda. El fin principal de la Norma Oficial Mexicana que regula estos productos desde el punto de vista sanitario es el de proteger la salud del consumidor.

El cólera es una enfermedad relacionada con el abastecimiento de aguas con poca higiene, o bien de los alimentos provenientes de aguas contaminadas con materia fecal y que se consumen crudos. También puede aparecer V. cholerae O1 en moluscos bivalvos, crustáceos o pescados que se obtienen de aguas no contaminadas en donde el microorganismo forma parte de la microbiota autóctona. La enfermedad del cólera fue descrita por primera ocasión por Pacini en 1854. Esta se presenta por la ingesta de la bacteria viable, la cual se establece en el intestino delgado y libera una toxina termolábil. La producción de esta toxina provoca diarrea acuosa causando los síntomas característicos del cólera. Los síntomas del cólera asiático pueden ir desde una diarrea acuosa ligera, hasta una diarrea severa con aspecto de “agua de arroz”. El establecimiento de la enfermedad por lo general es repentino, con periodos de incubación que varían entre las 6 h. y los 5 días. Esta enfermedad generalmente es autolimitante.

107

Las personas con cólera requieren de hidratación intravenosa u oral con soluciones que contengan cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de potasio y glucosa, ya que la muerte sobreviene debido a la deshidratación y pérdida de electrolitos esenciales. Mediante estudios en personas voluntarias saludables, se ha demostrado que la dosis infectiva necesaria para provocar la enfermedad es aproximadamente de un millón de organismos, y se ha concluido que una vez adquirido el cólera la administración de tetraciclina así como de antiácidos, mejora rápidamente el curso de la enfermedad. El género Vibrio incluye a los bacilos rectos o curvos Gram-negativos, oxidasa positivos (excepto las especies metschnikovii y gazogenes), anaerobios o anaerobios facultativos. Muchas especies de Vibrio spp. son patógenas para humanos y están implicadas en toxiinfecciones transmitidas por alimentos. La mayoría de los microorganismos que pertenecen a este género no crecen en medios sin cloruro de sodio a excepción de V. cholerae y V. mimicus, por lo tanto, debido a esta característica no es considerado un vibrio halofílico, aunque requieran trazas del ión sodio para su crecimiento. Las especies de Vibrio cholerae comprenden varios grupos antigénicos somáticos incluyendo el grupo O1, el cual se asocia con los biotipos clásico y El Tor. A su vez, este grupo O1 puede tener varios serotipos incluyendo Inaba, Ogawa e Hikojima. Las especies de V. cholerae no-O1 (referidos en la literatura como vibrios no aglutinables o NAG), se encuentran en aguas estuarinas y pueden causar enfermedad gastrointestinal, aunque típicamente es menos severa que la causada por el V. cholerae O1. El serotipo O139 identificado por primera vez en 1992 como el causante de una nueva epidemia de cólera en la India y Bangladesh y el cual no se ha podido encontrar en aguas estuarinas, es una excepción de los vibrios NAG que si produce los síntomas clásicos del cólera. Otros microorganismos pertenecientes al género Vibrio que son causantes de enfermedades gastrointestinales transmitidas por alimentos son V. parahaemolyticus y V. vulnificus. V. parahaemolyticus es una bacteria halofílica encontradas normalmente con microbiota normal de aguas y animales estuarios. El microorganismo tiene una distribución mundial en ambientes estuarios y costeros, y se ha aislado de muchas especies de pescados, mariscos y crustáceos. V. vulnificus es una bacteria halofílica encontrada en ambientes estuarios y es fenotípicamente similar a V. parahaemolyticus. Esta bacteria causa enfermedades transmitidas por alimentos y en heridas, cualquiera de éstas puede progresar rápidamente hasta una septicemia mortal. Los moluscos bivalvos crudos son la principal fuente de transmisión alimentaria del V. vulnificus.

108

Otros Vibrio spp. halofílicos, V. fluvialis, V. hollisae, V. alginolyticus, V. furnissii y V. metschnikovii, se han asociado con gastroenteritis y están presentes en ambientes estuarios junto con otras especies patógenas y no patógenas de Vibrio. FUNDAMENTO El método de detección estándar para la recuperación y la detección de Vibrio cholerae es cualitativo. Sin embargo se recomienda para las especies aisladas de V. cholerae de los serotipos O1 y no-O1 demostrar la producción de la toxina del cólera. Este método describe un esquema general que consiste en:

Enriquecimiento a diferentes temperaturas, dependiendo del tipo de alimento que se desee analizar, donde se pretende incrementar las poblaciones de Vibrio e inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.

Aislamiento diferencial en medio sólido selectivo, el cual restringe el crecimiento de otros géneros diferentes a Vibrio, permitiendo el reconocimiento de colonias sospechosas de la especie Vibrio cholerae.

Purificación: Las colonias características sospechosas de pertenecer a la especie cholerae, se purifican en medios no selectivos.

Identificación bioquímica, que permite la identificación de los cultivos de V. cholerae.

Pruebas serológicas, que permitan la identificación de los cultivos de V. cholerae. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en agua y hielo:

1 ó 2 matraces Erlenmeyer de 500 mL con 225.0 mL de agua peptonada alcalina

(1% P/V) (pH=8.5 0.2) (APA)a. Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en crustáceos frescos, refrigerados o congelados:

2 matraces Erlenmeyer de 500 mL con 225.0 mL de agua peptonada alcalina (1%

P/V) (pH=8.5 0.2) (APA)a.

4 tubos de 16 x 150 con 9.0 mL de agua peptonada alcalina (APA)a.

Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en pescados frescos, refrigerados o congelados:

1 matraz Erlenmeyer de 500.0 mL con 225.0 mL de agua peptonada alcalina (1%

P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a.

2 tubos de 16 x 150 con 9.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina

(pH=8.5 0.2) (APA)a.

109

Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en moluscos bivalvos frescos, refrigerados o congelados:

1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL con 450.0 mL de agua peptonada alcalina (1%

P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a.

1 matraz Erlenmeyer de 500 mL vacío y estérila.

4 tubos de 16 x 150 con 9.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) (pH=8.5 0.2) (APA)a.

Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en quesos:

1 matraz Erlenmeyer de 1000,0 mL con 500,0 mL de agua peptonada alcalina (1%

P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a.

5 tubos de 16 x 150 con 9,0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina

(pH=8.5 0.2) (APA)a. Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en helados y bases o mezclas para helados:

1 matraz Erlenmeyer de 500,0 mL con 225,0 mL de agua peptonada alcalina (1%

P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a.

5 tubos de 16 x 150 con 9,0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina

(pH=8.5 0.2) (APA)a. NOTA El siguiente material será el mismo para el análisis de cualquier tipo de muestra:

3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)b.

3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar T1N1 (Agar triptona con 1% NaCl) y/o 3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar soya tripticasa con 2% de NaCl (P/V)c.

1 caja de Petri con 20.0 mL de agar gelatina (dividir en tres)c.

1 caja de Petri con 20.0 mL de agar gelatina con 2% de NaCl (P/V) (dividir en tres)c.

3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL de agar triple-azúcar-hierro (TSI) y/o agar de hierro Kligler inclinados (KIA) d.

3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL de agar arginina glucosa inclinados (AAG)d.

3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo triptona sin NaCl (T1N0) y/o 3 cajas con

agar gelatina al 0% de NaCld.

3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo triptona más 3% de NaCl (T1N3) y/o 3 cajas con agar gelatina al 3% de NaCld.

3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo triptona más 6% de NaCl (T1N6) y/o 3 cajas con agar gelatina al 6% de NaCld.

6 tubos de 13 x 100 con 5.0 mL de medio Hugh y Leifson más 1% de glucosa (P/V)d.

3 discos para prueba de oxidasad.

3 discos para prueba de ONPGd.

3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de agar hierro lisina (LIA) inclinadosd.

110

3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo RM/VPd.

3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo rojo de fenol más 1% de arabinosa (P/V)d. Opcional: además del TCBS, 3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC) b. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

1 frasco gotero con reactivo de Kovac’s d.

1 frasco gotero con reactivo o discos para la prueba de la oxidasa (tetrametil-p-fenilendiamina; TMPD) d.

Colorantes necesarios para la tinción de Gramc, d.

Aceite mineral ó vaspar c.

Aceite de inmersiónc,d,e. MATERIAL Y EQUIPO

1 bolsa para Stomacher o vaso de licuadora estérila.

Stomacher o motor para licuadoraa.

Mechero Bunsena.

1 pipeta estéril con algodón de 1.0, 5.0 y 10.0 mLa.

Pipetas Pasteur estériles a, ,b ,c, d, e

Propipetaa,b,c,d,e.

1 caja de Petri estérila.

Baño de agua a 35± 2 y 42 ± 1ºCa,b,c,d.

Incubadora a 37 ± 2ºCa,b,c,d.

Incubadora a 42 ± 2ºCa,b,c,d.

Balanza granataria a.

Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentosa.

Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetrob,c,d.

Asa bacteriológica de platino para efectuar la prueba de oxidasad.

Tijeras y pinzas estérilesa.

Microscopio c,d,e. NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica. c Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. d Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica. e Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.

111

Después de la incubación y sin agitar la película, de cada matraz efectuar aislamiento en uno de los sigs. Medios de cultivo: TCBS (mCPC opcional además del

TCBS).

+ Incubar un matraz a 35-37ºC y otro a 42ºC/24 h

Añadir 25.0 mL de agua o hielo fundido en 2 matraces con 225.0 mL de APA, o bien filtrar 500-1000 mL y

poner la membrana en un tubo con 10.0 mL de APA

Aislamiento en medios selectivos y

diferenciales

Incubar, TCBS 18 - 24 h a 35-37°C. sacarosa (+) = amarillo mCPC 18-24 h a 39 -40ºC. celobiosa ( - ) = púrpura

Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y

aislar

Bioquímicas presuntivas TSI, KIA Y AAG Inc. 35-37 ºC/18-24 h.

Resultados característicos

Siembra de bioquímicas complementarias: pruebas de halofilia

en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP, oxidasa y fermentación de la arabinosa.

Resultados positivos para V.

cholerae

Confirmación

serológica

Agar T1N1 o agar soya tripticasa 2% NaCl. Inc. 35-37ºC/12-18 h. Comprobar pureza en GA o GS en el 2do. día. Inc. 35-37ºC/12-18 h.

DETERMINACIÓN DE V. cholerae EN AGUA Y HIELO

112

+ 10-2 10-3

Realizar 2 mezclas con 10 crustáceos (aprox. 250.0 g c/u). De cada mezcla tomar 25.0 g y colocar en 225.0 mL de APA. Homogeneizar 2 min.

Para cada matraz realizar 2 dil.

seriadas en 9.0 ó 90.0 mL APA.

Aislamiento en medios selectivos y

diferenciales

Incubar, TCBS 18 - 24 h a 35-37°C. sacarosa (+) = amarillo mCPC 18-24 h a 39 -40ºC. celobiosa ( - ) = púrpura

Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislar

Bioquímicas presuntivas TSI, KIA Y AAG Inc. 35-37 ºC/18-24 h.

Resultados característicos

Siembra de bioquímicas complementarias: pruebas de halofilia

en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP, oxidasa y fermentación de la arabinosa.

Resultados positivos para V.

cholerae

Confirmación

serológica

Incubar una serie a 35-37°C y otra a 42°C / 24 h. Después de la incubación y sin agitar la película, efectuar aislamiento en uno de los sigs. medios de cultivo: TCBS (mCPC opcional además del

TCBS).

Agar T1N1 o agar soya tripticasa 2% NaCl. Inc. 35-37ºC/12-18 h. Comprobar pureza en GA o GS en el 2do. día. Inc. 35-37ºC/12-18 h.

35-37ºC/12-18 h.

DETERMINACIÓN DE V. cholerae EN CRUSTACEOS FRESCOS, REFRIGERADOS O CONGELADOS

113

10-2 10-3

Pesar 25.0 g de pescado incluyendo vísceraso helado

Pesar 50.0 g de queso

225.0 mL de APA y realizar 2 dil. seriadas en (5 dil para helado) 9.0 ó 90.0 mL APA. En queso diluir en 500 ml de APA y realizar 5 dil seriadas en

9.0 o 90.0 ml APA

Aislamiento en medios selectivos y

diferenciales

Incubar, TCBS 18 - 24 h a 35-37°C. sacarosa (+) = amarillo mCPC 18-24 h a 39 -40ºC. celobiosa ( - ) = púrpura

Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislar

Bioquímicas presuntivas TSI, KIA Y AAG Inc. 35-37 ºC/18-24 h.

Resultados característicos

Siembra de bioquímicas complementarias: pruebas de halofilia

en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP, oxidasa y fermentación de la arabinosa.

Resultados positivos para V.

cholerae

Confirmación

serológica

Incubar a 35-37°C / 24 h. Después de la incubación y sin agitar la película, efectuar aislamiento en uno de los sigs. medios de cultivo: TCBS (mCPC opcional además del TCBS).

Agar T1N1 o agar soya tripticasa 2% NaCl. Inc. 35-37ºC/12-18 h. Comprobar pureza en GA o GS en el 2do. día. Inc. 35-37ºC/12-18 h.

DETERMINACIÓN DE V. cholerae EN PESCADOS FRESCOS,

REFRIGERADOS O CONGELADOS; QUESOS Y HELADOS.

114

Incubar una serie a 35-37°C y otra a 42°C / 24 h. Después de la incubación y sin agitar la película, efectuar aislamiento en uno de los sigs. medios de cultivo: TCBS (mCPC opcional además del

TCBS).

+ 10-2 10-3

Desconchar 10-12 moluscos (aprox. 50.0 g) y colocar en 450.0 mL de APA. Homogeneizar 2 min. Dividir en 2 matraces estériles.

Para cada matraz realizar 2 dil. seriadas en 9.0 ó 90.0 mL APA.

Aislamiento en medios selectivos y

diferenciales

Incubar, TCBS 18 - 24 h a 35-37°C. sacarosa (+) = amarillo mCPC 18-24 h a 39 -40ºC. celobiosa ( - ) = púrpura

Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislar en;

Bioquímicas presuntivas TSI, KIA Y AAG Inc. 35-37 ºC/18-24 h.

Resultados característicos

Siembra de bioquímicas complementarias: pruebas de halofilia

en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP,

oxidasa y fermentación de la arabinosa.

Resultados positivos para V.

cholerae

Confirmación

serológica

Agar T1N1 o agar soya tripticasa 2% NaCl. Inc. 35-37ºC/12-18 h. Comprobar pureza en GA o GS en el 2do. día. Inc. 35-37ºC/12-18 h.

DETERMINACIÓN DE V. cholerae EN MOLUSCOS BIVALVOS FRESCOS,

REFRIGERADOS O CONGELADOS

115

PROCEDIMIENTO 1. Enriquecimiento.

TIPO DE MUESTRA

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

TEMPERATURA DE INCUBACIÓN DEL

PREENRIQUECIMIENTO

35-37ºC/24 h 42ºC/24 h

Agua y Hielo

25.0 mL del agua o hielo fundido en 225.0 mL de APA, o bien, filtrar 500-1000 mL y colocar la membrana en un tubo con 10.0 mL de APA. Se puede incubar a una ó bien a dos temperaturas diferentes

X

X

Crustáceos frescos,

refrigerados o congelados

Realizar dos mezclas con 10 crustáceos y un peso aprox. de 250.0 g c/u. De cada mezcla tomar 25.0 g y colocar en 225.0 mL de APA. Homogeneizar 2 min. De cada mezcla realizar 2 diluciones más en 9.0 ó 90.0 mL de APA.

X (3 diluciones)

X (3 diluciones)

Pescados frescos,

refrigerados o congelados

Tomar carne del área de las vísceras, incluyendo éstas. 25.0 g de la muestra en 225.0 mL de APA. Homogeneizar 2 min. Realizar 2 diluciones más en 9.0 ó 90.0 mL de APA.

X (3 diluciones)

- - - - -

Moluscos bivalvos, frescos,

refrigerados o congelados

Desconchar 10-12 moluscos (carne y líquido). 50.0 g de la muestra en 450.0 mL APA. Homogeneizar 2 min. Dividir en 2 matraces estériles. Realizar 2 diluciones más en 9.0 ó 90.0 mL de APA.

X (3 diluciones)

X (3 diluciones)

116

TIPO DE MUESTRA

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

TEMPERATURA DE INCUBACIÓN DEL

PREENRIQUECIMIENTO

Quesos de suero

A 50,0 g de queso en cubos de aprox 6 mm y pasar a vasos de 2 litros. Añadir 800,0 a 1000,0 ml de solución hirviente de ácido fosfórico (1:40). Agitar continuamente a baja velocidad por 20 minutos hasta disolver la muestra. Filtrar y lavar la muestra para evitar que el filtro se obstuya. En caso de obstrucción agregar al agua de lavado una solución alcalina (hidroxido de sodio al 5% o acido fosforico 1:40 o alcohol caliente) asta que el filtro quede limpio. Examinar el papel filtro en el microoscopio.

X (6 diluciones)

---

Helado y basespara helado

A 25 g de muestra introducirlos en 225,0 ml de agua peptonada alcalina (APW) y homogeneizar por 2 minutos a la máxima velocidad De cada mezcla realizar 2 diluciones más en 9,0 o 90,0 ml de APA.

X (6 diluciones)

--

Para todos los casos proseguir con el inciso 2.

2. Resiembra

Después de la incubación, y sin agitar la película transferir el inóculo a una placa de agar TCBS y optativo mCPC además del TCBS:

1. Agar con tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS). Incubar durante a 35-37ºC durante 18 a 24 h..

2. Agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC). La polimixina inhibe al biotipo Clásico de V. cholerae. Incubar durante 18 a 24 h. de 39-40ºC.

3. Morfología colonial. Examinar las placas a fin de determinar si se presentan las características coloniales que a continuación se describen:

117

Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para la fermentación de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos.

NOTA

Las especies de Vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en agar TCBS, en cambio las colonias de V. mimicus, que están estrechamente relacionadas con V. cholerae, son verdes (sacarosa negativas). La mayoría de las demás especies de Vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes.

Agar mCPC. Las colonias de V. cholerae El Tor son púrpuras (negativas para la fermentación de la celobiosa). El V. vulnificus produce colonias amarillas achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos. La mayoría de las demás especies de Vibrio no crecen fácilmente en agar mCPC.

4. Selección Seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislarlas en: 1. Agar T1N1 o agar soya tripticasa con 2% de NaCl e incubar a 35-37°C durante 12-

18 h.. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza de las colonias antes de las pruebas bioquímicas, esto es, se puede inocular en:

2. Agar gelatina (GA) o agar gelatina sal (GS) en el segundo día. Los resultados serán confiables si las placas de aislamiento y la observación microscópica muestran que las colonias elegidas están puras.

5. Diferenciación La fórmula para todos los medios de pruebas bioquímicas deberán contener por lo menos un 2% de NaCl. Se recomiendan los siguientes medios porque las reacciones permiten efectuar una diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas y otras bacterias. La diferenciación de las colonias sospechosas se realiza por duplicado en: 5.1. Prueba de oxidasa. 1. Colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas

gotas de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial.

118

2. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en agar soya tripticasa con

NaCl al 2%, u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables (Inciso 4) y depositarlo en el papel filtro anterior.

NOTA Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii).

5.2. Agar triple azúcar hierro (TSI) y Agar Kligler hierro (KIA) 1. Registrar las características del medio TSI y KIA antes de la inoculación (color del

medio). 2. Tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica

recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) y agar de Kligler (KIA) inclinado.

3. Incubar el medio TSI y KIA a 35 2 C durante 18 a 24 h. 5.3. Agar arginina y glucosa (AAG) 1. Registrar las características del medio AAG antes de la inoculación (color del

medio). 2. Tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica

recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con medio AAG inclinado.

3. Incubar el medio AAG a 35 2 C durante 18 a 24 h. 5.4. Prueba de halofilia. 1. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con

asa bacteriológica estéril y suspender el inóculo en un tubo con los siguientes medios:

Caldo triptona con NaCl al 0% (T1N0) Caldo triptona con NaCl al 3% (T1N3) Caldo triptona con NaCl al 6% (T1N6).

2. Incubar los medios a 35 2 C durante 18 a 24 h.

119

NOTAS El V. cholerae y el V. mimicus crecerán en T1N0 y T1N3 y no crecen en T1N6. Algunos géneros de bacterias que no son Vibrio y que presentan reacciones similares a las de V. cholerae en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayoría de las especies de Vibrio spp. que incluyen algunos V. cholerae no O1, crecen únicamente en T1N3 y no crecen en T1N6 ni en concentraciones mayores de sal. 5.5. Prueba de halofilia alternativa. Alternativamente se realiza la prueba de halofilia en cajas de Petri con los siguientes medios de cultivo: Agar gelatina (GA) Agar gelatina con NaCl al 3% (GS 3%) Agar gelatina con NaCl al 6% (GS 6%) 1. Dividir cada placa en ocho sectores. Tomar suavemente una porción del cultivo

desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa bacteriológica estéril e inocular en el centro de cada sector una estría recta.

2. Incubar a 35-37ºC durante 18 a 24 h.. NOTA V. cholerae y V. mimicus crecen al 0% y al 3% de sal, rara vez al 6% de sal y no crecen en concentraciones del 8% ni 10% de cloruro de sodio. Para leer la reacción de la gelatinasa sostener la placa sobre una superficie negra, observar un halo opaco alrededor de la colonia de los microorganismos gelatinasa positivos. 5.6. Prueba de oxidación-fermentación. 1. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con

asa bacteriológica estéril e inocular por picadura en un tubo con el medio Hugh-Leifson.

2. Añadir una capa de aceite mineral estéril a uno de los tubos para incubación en anaerobiosis.

3. Incubar ambos tubos a 35-37ºC durante 18 a 24 h.

NOTA Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la fermentación. Las especies de Pseudomonas, que comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos con métodos de enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio, utilizan sólo la glucosa para la oxidación.

120

6. Identificación y confirmación de V.chloreae O1, V.cholerae no O1 y V. mimicus a través de pruebas bioquímicas complementarias. Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, AAG, T1N0, T1N3, T1N6 o GA y GS con 3% y 6% de NaCl, además del caldo glucosa de Hugh-Leifson. También se sugiere realizar una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 h. de incubación. La interpretación de las pruebas bioquímicas para identificación de V. cholerae y otras especies bacterianas afines figuran en los cuadros 1, 2 y 3. 6.1 Prueba serológica de aglutinación. 1. Inocular los cultivos sospechosos presuntivos en agar tripticasa soya (TSA) e

incubar a 35-37°C durante 16 a 24 h. 2. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril

(NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.

3. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSA. 4. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo

Inaba (factor AC) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.

5. Agitar inclinando la lámina hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto.

6. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción. 7. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva. 8. Realizar el mismo procedimiento con el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1

subgrupo Ogawa (factor AB). NOTAS La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Inaba (factor AC) o el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Ogawa (factor AB) se considerará como el control negativo para poder interpretar el resultado. Existe la posibilidad que los antígenos anti Vibrio cholerae estén relacionados entre sí, por lo que se considera pertinente realizar pruebas bioquímicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae O1 o no O1. Es conveniente incluir cultivos positivos y negativos, además de los controles salinos para cada antisuero usado. Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo O1) y con los sueros Inaba y Ogawa, tienen los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima.

121

Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente, pero no aglutinan con sueros Inaba y Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros. Los cultivos de V. cholerae cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y que no aglutinen con el suero del grupo O1 se deben considerar como V. cholerae O1. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Consultar los resultados obtenidos y comparar con los Cuadros 1, 2 y 3 para la identificación de los géneros y especies de la bacteria investigada. En caso de que los resultados obtenidos no correspondan a ninguna especie del género Vibrio consultar el cuadro de la Familia Enterobacteriaceae e intentar la identificación del problema.

122

CUADRO 1. Reacciones de algunas especies de Vibrio spp. y microorganismos relacionados en medios sólidos diferenciales.

Microorganismo

Agar hierro-Kligler (KIA)

Agar hierro-tres azúcares (TSI)

Agar arginina glucosa (AAG)

Pico de flauta

Fondo de

tubo

Pico de flauta

Fondo de tubo

Pico de flauta

Fondo de

tubo

V. cholerae Lac - Gluc + Lac + (- raro)

Gluc + Arg. Dihid. -

Gluc lig. +

V. mimicus Lac - Gluc + Lac – (+ raro)

Gluc + Arg. Dihid. -

Gluc +

V. parahaemolyticus Lac - Gluc + Lac - Gluc + Arg. Dihid. -

Gluc +

V. alginolyticus Lac - Gluc + Lac + Gluc + Arg. Dihid. -

Gluc +

V. vulnificus Lac – o +

Gluc + Lac – (+ raro)

Gluc + Arg. Dihid. -

Gluc +

A. hydrophila Lac – o +

Gluc + Lac – o +

Gluc + Arg. Dihid. -

Gluc -

P. shigelloides Lac – o +

Gluc + Lac – o +

Gluc + Neutro Neutro

Ninguna de las especies de Vibrio spp. aquí enlistadas producen ácido sulfhídrico en KIA, TSI o AAG, o gas de la glucosa en cantidades detectables en KIA, TSI ó AAG. Algunas especies de Aeromonas spp. pueden producir gas a partir de la glucosa en estos medios.

123

CUADRO 2. Características mínimas para la identificación de Vibrio cholerae

Característica Vibrio cholerae

Morfología Bacilo Gram-negativo (pueden ser curvos)

TSI Lac + (- raro) Gluc + gas - H2S -

Prueba de oxidación-fermentación Fermentación + oxidación +

Citocromo oxidasa +

Dihidrolasa arginina -

Lisina descarboxilasa +

Voges Proskauer El Tor + Tipo Clásico -

Crecimiento a 42ºC +

Prueba de halofilia con NaCl 0% + 3% +

6% usualmente - 8% -

10% -

Fermentación de la sacarosa +

ONPG +

Fermentación de la arabinosa -

124

CUADRO 3. Características diferenciales de especies y biotipos del género Vibrio

V. cholerae

V. alginolyticus

V. fluvialis

V. parahaemolyticus

V. vulnificus

V. mimicus

V. hollisae

V. furnissii

Crecimiento en TCBS

A A V V V V NC A

Agar mCPC P NC NC NC A NC NC NC

Medio AAG Ka KA KK KA KA KA Ka KK

Crecimiento con: 0% NaCl 3% NaCl 8% NaCl 10% NaCl

+ + - -

- + + +

-/d + d d

- + + -

- + - -

+ + - -

- + - -

- + d -

Crecimiento a: 4ºC 30ºC 35ºC 40ºC

- + + +

- + + +

- + + +

- + + +

- + + +

ND ND ND ND

ND ND ND ND

ND ND ND ND

Oxidasa + + + + + + + +

OF/glucosa OF OF OF OF OF OF OF OF

ONPG + - + - + + - +

Voges-Proskauer

d + - - - - - -

Rojo de Metilo + NC - NC NC d - +

Indol + d - + d + + -

Movilidad + + d - + + - +

Citrato + - + d d + - +

Arginina dihidrolasa

- - + - - - - +

Descarboxilación de lisina

+ + - + + + - -

Descarboxilación de: Ornitina

+ + - + + + - -

Gelatinasa + + + + + d - +

Ureasa - - - D - - - -

Producción de: amilasa

+ + + + + ND ND ND

H2S (SIM) - - - - - - - -

Utilización de: D-glucosa

+ + + + + - + +

Gas a partir de glucosa

- - - - - - - +

D-Xilosa - - - - - -

L-Arabinosa - - + d - - + +

D-Galactosa + d + + + + + +

Sacarosa + + + - - - - +

Celobiosa - - d - + - - -

Lactosa - - - - + d - -

Salicina - - - - + - - -

D-Gluconato + + + + +

Putrescina - d d + -

SÍMBOLOS: TCBS, tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa; mCPC, agar celobiosa-polimixina B-colistina; modificado; AAG, agar arginina-glucosa A, amarillo; V, verde; P púrpura; OF, metabolismo oxidativo/fermentativo; N, no crece; K, alcalino; a, ligeramente ácido; V, reacción variable dependiendo de las especies o biotipos; S, sensible; R, resistente; d, resultados diferentes; +, la mayoría de las cepas +, usualmente 90% o más; -, casi ninguna cepa positiva, usualmente positivas; ND, no hay datos.

125

EXPRESIÓN DE RESULTADOS Reportar presencia o ausencia de Vibrio cholerae o la especie identificada en 25.0 ó 50.0 g de alimento (según sea el caso) ó en 25.0 mL de agua o hielo. BIBLIOGRAFÍA Norma Oficial Mexicana NOM-027-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Pescados Frescos Refrigerados y Congelados. Especificaciones sanitarias. México. Norma Oficial Mexicana NOM-029-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Crustáceos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. México. Norma Oficial Mexicana NOM-031-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Moluscos Bivalvos Frescos Refrigerados y Congelados. Especificaciones sanitarias. México. Apéndice B. Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias. México. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Kaysner C. A., & DePaola A. Jr. (2001) “Vibrio”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 405-420. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

126

Método para la determinación de Listeria monocytogenes en alimentos.

OBJETIVO

Aplicar la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para detectar Listeria monocytogenes en alimentos.

Interpretar adecuadamente los resultados del análisis y sus implicaciones en la calidad del alimento.

GENERALIDADES Listeria monocytogenes es un bacilo corto y con extremos redondeados Gram-positivo, móvil mediante flagelos, anaerobio facultativo, catalasa positivo no formador de esporas y crece bien a temperatura de refrigeración. Mide entre 0,5 – 2 µ de largo por 0,2 - 0,5 µ de ancho, a veces adopta forma de cocobacilo. Se presenta aislado, en parejas, cadenas cortas o agrupaciones en V. Este microorganismo se destruye a temperatura de pasteurización (71.7ºC durante 15 segundos). Es extremadamente resistente en comparación con la mayoría de otras células vegetativas, ya que resiste periodos de congelamiento y descongelamiento repetitivo, además de sobrevivir a varios períodos den condiciones de deshidratación. La movilidad que presenta este microorganismo, se debe a flagelos perítricos y se manifiesta mejor entre 20º - 25ºC; a 37ºC llega a ser imperceptible o nula, reduciéndose el número de flagelos a uno o dos situados en la región polar. Se mueve de forma característica mediante un lanzamiento rápido combinado con saltos y rotación. La movilidad es óptima entre 20º - 22ºC. Respecto a la temperatura de crecimiento, sus límites están entre 1º - 45ºC, con una óptima de 30º - 37ºC. Es una bacteria psicrotrófica, aunque a 4º - 5ºC su crecimiento es más lento. Listeria monocytogenes se puede desarrollar entre valores de pH comprendidos entre 5.6 a 9.6, aunque existen reportes que indican que en medios de laboratorio puede iniciar su desarrollo incluso a partir de 4.4 . Pasados estos límites se inhibe su crecimiento, pero sobrevive. Su pH óptimo es 7,5. Se conocen ocho especies del género Listeria: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi, L. murrayi y L. denitrificans. Actualmente L. denitrificans se ha clasificado como Jonesia denitrificans. Originalmente, dentro de L. monocytogenes se encuentran dos grupos que corresponden a cepas hemolíticas patógenas y a cepas no hemolíticas y no patógenas. La cepa no patógena de L. monocytogenes se denomina como L. innocua. La única especie de Listeria patógena para el hombre es L. monocytogenes.

127

Para la caracterización bioquímica y diferenciación de Listeria spp, la fermentación de ramnosa y xilosa son las pruebas cruciales. Ni L. monocytogenes ni L. innocua fermentan xilosa, L. monocytogenes fermenta xilosa. L. monocytogenes fermenta ramnosa al igual que la mayoría de los serotipos de L. innocua. Estas dos especies pueden distinguirse a partir de la ausencia de actividad hemolítica en L. innocua, al contrario de L. monocytogenes y L. seeligeri; aclarando que L. seeligeri solo presenta una leve actividad hemolítica en placas de agar sangre de carnero después de 48 h de incubación, mientras que para L. monocytogenes desde las 24 h se hace evidente. Ya que esta última produce hemolisina beta, característica relacionada con su patogenicidad. Debido a que L. innocua comparte antígenos con L. monocytogenes, es necesario que para su caracterización se realicen las reacciones xilosa-ramnosa y/o patogenicidad en ratones. La prueba Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) es útil para la caracterización de las especies. Básicamente esta prueba consiste en realizar siembras diametralmente opuestas en agar sangre de carnero, tanto de Staphylococcus aureus hemolítico como de Rohodococcus equi, así como siembras en paralelo del cultivo a caracterizar en los ángulos correctos entre las cepas de S.aureus y R. equi, para finalmente examinar la presencia de hemólisis en las placas tras haber incubado a 35 ºC durante 24-48 horas. La hemólisis del L. monocytogenes se incrementa en la zona influenciada por Staphylococcus aureus. Por el contrario, la hemólisis del L. ivanovii se incrementa cerca del R. equi. También L. seeligeri puede dar reacción débilmente positiva pero solo después de 48 h de incubación. Las demás especies permanecen como no hemolíticas. La hemólisis puede interpretarse con mayor facilidad cuando las placas de agar sangre están recién preparadas y con la capa más delgadas de lo usual. La reacción de L. monocytogenes es óptima a las 24 horas más que a las 48 horas. Se recomienda no olvidar incluir el uso de testigos. Otra consideración importante para recuperar L. monocytogenes es la refrigeración de las muestras a 4 ºC durante la manipulación y almacenamiento hasta el arribo al laboratorio donde se analizarán, ya que se propicia el desarrollo del microorganismo, aunque de forma lenta a esta temperatura. Y si la muestra está congelada, deberá mantenerse congelada hasta la realización del análisis. Las pruebas clásicas para definir la patogenicidad de la Listeria incluyen entre otras, la prueba de Antón en conejos, inyecciones intraperitoneales en ratones e inoculación de ratones e inoculación de embriones de pollo. El cuadro No. 2 presenta la información relativa a la caracterización serológica de la Listeria spp. Más del 90% de las cepas de L. monocytogenes aisladas pueden tipificarse serológicamente con suero disponible comercialmente.La mayoría de las cepas puras de L. monocytogenes que se obtienen de pacientes y del medio ambiente corresponde a los tipos 1 ó 4.

128

Debido a que todas las especies patógenas, exceptuando L. welshimeri, comparten uno o más antígenos somáticos con L. monocytogenes, es necesario caracterizar bioquímicamente las cepas antes de aplicar las prueba inmunológicas. La listeriosis es el nombre de la enfermedad provocada por la ingesta de alimentos contaminados con L. monocytogenes. Para que se presente listeriosis, es necesario ingerir los microorganismos vivos. Los síntomas de la enfermedad se caracterizan por inflamación de las meninges con o sin septicemia. Al inicio de la enfermedad se presenta fiebre repentina, avanzando con intenso dolor de cabeza, nausea, vómito, delirio y finalmente puede sobrevenir el coma sobre todo en personas mayores, inmunocomprometidas, infantes, y muyeres embarazadas. En este último grupo de personas, puede causar aborto. El grado de fatalidad es del 30%. Sin embargo, en otro tipo de huéspedes solo suele causar síntomas que van desde ligeros hasta agudos, fiebre, así como síntomas parecidos a un resfriado común. La forma de acción del microorganismo, consiste en invadir el epitelio gastrointestinal. Una vez que el microorganismo ha logrado penetrar a los monocitos, macrófagos o leucocitos polimorfonucleares del huésped, empieza la septicemia y se multiplica. Su presencia intracelular en los fagocitos, también permite la diseminación del microorganismo al cerebro y probablemente exista migración transplacentaria al feto en mujeres embarazadas. La patogenicidad de L. monocytogenes recae en su habilidad para sobrevivir y multiplicarse en células fagocíticas del huésped. La fuente de este microorganismo, son los animales domésticos y salvajes infectados, aves de corral y humanos. Se puede encontrar en agua y lodo. La utilización de ensilaje estacional es seguida por un incremento de listeriosis en animales, lo que hace suponer que tanto la leche como los productos del campo pueden estar contaminados. Además, algunos estudios sugieren que del 1 al 10% de los humanos son portadores de L. monocytogenes en el intestino. Este microorganismo a pesar de ser una bacteria que no posee esporas, es altamente resistente a condiciones adversas tales como: congelamiento, secado y calentamiento. Su transmisión se asocia con el consumo de verduras y productos lácteos contaminados, particularmente variedades de quesos no madurados y helados, así como salchichas fermentadas crudas, carnes crudas pollo crudo y cocido y pescado crudo y ahumado. En neonatos se transmite a través de la madre y cuando el feto se encuentra aún en el útero. La dosis infectiva está relacionada con la susceptibilidad del huésped. Así, para individuos susceptibles la infección ocurre incluso con 100 células, mientras que personas no susceptibles resisten hasta 10 000 000 células. Como medidas de control para evitar la listerioris a través del consumo de alimentos contaminados, se recomienda y solo por mencionar algunas lo siguiente, pH bajo, tratamiento térmico adecuado, evitar la recontaminación y un aw bajo.

129

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el problema de la Listeria no está en impedir su presencia, sino en controlar su supervivencia y crecimiento, con el fin de reducir las cantidades en que se encuentran en los alimentos.

FUNDAMENTO El método para detectar la presencia de L. monocytogenes se basa en el aislamiento y diferenciación de especies de Listeria spp., principalmente utilizando la inhibición selectiva de los componentes dentro de la formulación de los medios de cultivo propuestos, así como el sistema de indicador esculina y el hierro (II). La diferenciación de las especies de este género se sustenta en la fermentación de carbohidratos y la actividad hemolítica. MEDIOS DE CULTIVO

1 matraz Erlenmeyer de 500,0 ml con 250,0 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria (EB) pH 7,3 (también se puede utilizar caldo Fraser)a.

1 caja de medio Oxford (OXA)b.

1 caja de agar cloruro de litio-cloro-feniletano-moxalactam (LPM)b.

5 cajas de agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL) o bien utilizar sólo 2 cajas de ASTEL y realizar las siembras en al menos en 5 cuadrantes diferentesc.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)d. (Para prueba de movilidad en fresco).

1-2 cajas de agar sangre de carnero (para observación de hemólisis)e.

1-2 cajas de agar recién preparadas de sangre de carnero y con una capa más delgado de lo usual (para la prueba de CAMP)e.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo nitratose.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de medio SIM sin inclinar (o medio para movilidad MTM, ver formulación en la sección de medios de cultivo)e.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo púrpura con 0,5% de dextrosae.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo púrpura con 0,5% de esculinae.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo púrpura con 0,5% de maltosae.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo púrpura con 0,5% de ramnosae.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo púrpura con 0,5% de manitole.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo púrpura con 0,5% de xilosae.

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de agar bilis esculina inclinadose. (Para prueba de tolerancia a la bilis y esculina).

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (CSTEL) e. (Para tolerancia a la temperatura).

5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo triptosae. (Para pruebas serológicas).

130

EQUIPO Y MATERIAL

Aceite de inmersiónb.

Asa bacteriológica de plástico,c,d,e.

Cubreobjetosb,c.

Lámpara de luz blancab.

Pipetas estériles con algodón de 1.0, 10.0 y 25.0 mLa,b,c,d,e.

Pipetas Pasteur estériles a, ,b ,c, d, e

1 propipetaa,b,c,d,e.

Portaobjetos escabadob,c.

1 mechero Bunsena,b,c,d,e.

Incubadora a 30°C y a 35°Ca,b,c,d,e.

Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentosa.

Balanzaa.

Microscopio de contraste de fase con un objetivo 100Xb,c.

Licuadora ó stomachera.

2 Tubos limpios, 16 x 125 mm u otros tamaños apropiados con tapón de roscad,e.

Cajas Petrie.

REACTIVOS Y SOLUCIONES

Acrilflavina HCl

Agar

-naftilamina

α-naftol en etanol absoluto al 5%

Agar sangre base No.2

Cicloheximida

Sangre de carnero, desfibrinada

Etanol absoluto

Amortiguador de anticuerpos fluorescente

Glicina anhidra

Colorantes para la Tinción Gram

Solución de peróxido de hidrógeno al 3% para la prueba de catalasa

KOH, solución al 40%

juego de sueros comerciales ante Listeria.

Acido nalidíxco (sal de sodio)

Reactivos A, B o C y/o zinc para la prueba de reducción de nitratos

Caldo nutritivo

Acido sulfanílico

Aceite de inmersión

131

NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. c Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica. d Material necesario a las 7 días de iniciada la práctica. e Material necesario a las 8 días de iniciada la práctica.

132

Aislamiento en medios selectivos y

diferenciales

Purificar 5 colonias típicas en

placas de ASTEL

Almacenar a 4°C hasta la realización de

pruebas bioquímicas

Pesar 25.0 g ó mL de muestra

225.0 mL de caldo de enriquecimiento +

suplementos

Incubar 24 h a

35°C

Resultados positivos para L.

monocytogenes

Confirmación

serológica

Incubar 35°C 24 a

48 h

Incubar 24 a 48

h a 30°C

OXA LPM

Incubar 30°C 24 a

48 h

GRAM movilidad nitratos carbohidratos hemólisis CAMP Tolerancia a bilis esculina

baja temperatura

Movilidad en fresco,

Catalasa

DETERMINACIÓN DE Listeria monocytogenes EN ALIMENTOS

133

PROCEDIMIENTO 1. Enriquecimiento. 1. Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa

como del interior 2. Colocar 25,0 mL o 25,0 g de la muestra en un recipiente que contenga 225,0

mL de caldo de enriquecimiento para Listeria (EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30ºC.

3. En el caso de muestras en donde se sospecha presencia de células dañadas de Listeria spp, se recomienda la incubación en un caldo de enriquecimiento sin suplementos. Incubar a 30°C por 6 h. Después de las 6 h de incubación agregar los suplementos y continuar la incubación hasta un total de 48 h a 30 ºC.

2. Aislamiento. 1. Después de 24 y 48 h de incubación en el medio EB, resembrar en los medios

LMP y OXA. Incubar las placas del medio LMP a 30 ºC por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35 ºC durante 24 a 48 h.

2. Observar el crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un ángulo de 45º (iluminación de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este medio generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul iridiscentes.

3. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas colonias pueden aparecer con un tono café oscuro que se define mejor a los siete días de incubación.

4. Seleccionar cinco o más colonias típicas del medio de OXA y/o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista.

5. Debido a que puede estar presente más de una especie de Listeria en la muestra, deben identificarse como mínimo cinco colonias.

3. Identificación. 1. Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de

las pruebas. Seleccionar colonias típicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35 ºC por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a 4 ºC y utilizarse como inóculo para realizar las pruebas de identificación.

3.1. Movilidad en fresco

Hacer preparaciones en fresco a partir de un cultivo líquido incubado a 20ºC en CSTEL durante 24 h. La suspensión debe ser densa y emulsificarse completamente, observar con objetivo 10X o 40X en un microscopio de

134

contraste de fase o microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro.

Las células de Listeria spp. son bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran.

Los bacilos con movimientos rápidos no son Listeria spp.

3.2. Prueba de catalasa

1. Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%. 2. La formación inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. Las

especies de Listeria son catalasa positiva. 3. Precauciones, la emulsión debe realizarse con un asa de plástico o palillo de

madera estéril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre. Cualquier contaminación de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas.

3.3. Tinción de Gram

1. Hacer una tinción de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos Gram positivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse como formas cocoides. En extensiones delgadas se observan de color pálido y pueden confundirse con Bacteroides spp.

3.4. Hemólisis

1. Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5%. Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48 h a 35ºC. Al inocular, observar la reacción hemolítica en las placas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP.

3.5. Reducción de nitratos

1. Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35ºC por 5 días. Para la lectura se debe agregar 0,2 mL del reactivo A y 0,2 mL del reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo después de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos).

2. En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0,2 mL del reactivo B y 0,2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar 0,2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa - naftilamina, que es carcinogénica.

135

3.6. Movilidad en agar

1. Inocular en medio SIM o MTM, incubar por 7 días a temperatura ambiente (20-

25 ºC), observar diariamente. Las especies de Listeria son móviles, dando un crecimiento típico en forma de paraguas.

3.7. Prueba de utilización de carbohidratos

1. Inocular tubos de caldo púrpura para fermentación de carbohidratos al 0,5 % de los siguientes carbohidratos: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35ºC. Una coloración amarilla indica fermentación del carbohidrato probado. Todas las especies de Listeria fermentan la dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol. Si la pigmentación prematura del aislamiento en el medio OXA no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede omitirse.

3.8. Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) para Listeria monocytogenes

1. Sembrar Staphylococcus aureus hemolítico (ATCC 49444, NCTC 7428, ATCC

25923 ó CIP 5710) y Rhodococcus equi ( ATCC 6339 Ó NCTC 1621) en paralelo y diametralmente opuestos en agar sangre de carnero recién preparadas y con una capa más delgada de lo usual. Estriar perpendicularmente las colonias seleccionadas a caracterizar, entre las cepas de S.aureus y R. equi.

2. Incubar a 35ºC por 24-48horas y examinar la hemólisis en las placas. 3. La hemólisis del L. monocytogenes se incrementa en la zona influenciada por

el S. aureus; la hemólisis del L. ivanovii se incrementa cerca del R. equi, y L. seeligeri es débilmente hemolítico cerca del S. aureus después de 48 h de incubación. Las otras especies permanecen como no hemolíticas.

4. La reacción de L. monocytogenes es generalmente óptima a las 24 horas en vez de 48 horas. No olvidar incluir testigos de Listeria spp. en otra caja de agar sangre de carnero lo más fresco posible.

3.9. Tolerancia a la bilis y esculina 1. Inocular densamente tubos con agar bilis esculina inclinados, incubar a 35ºC

durante 48 h. L. monocytogenes tolera la bilis en su crecimiento y es capaz de hidrolizar la esculina.

3.10. Tolerancia a la baja temperatura

1. Inocular tubos con CSTEL, incubar a 4ºC durante 10 días. L. monocytogenes

es tolerante a las bajas temperaturas.

136

4. Serología La determinación de los tipos serológicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones epidemiológicas son cruciales. 1. Inocular en caldo triptosa por 24 h a 35 ºC. Transferir a dos tubos de agar

inclinado de triptosa e incubar 24 h a 35 ºC. Para realizar la prueba utilizar sueros anti Listeria monocytogenes comerciales, siguiendo las instrucciones del fabricante.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el género y especie de las cepas aisladas. CUADRO 1. Diferenciación de las Especies de Listeria

Especies Hemolítico (beta)a

Reducción nitratos

Producción de ácidos de

CAMP

M R X S.a R.e L. monocytogenes

+ - - + - + -

L. ivanovii + - - - + - + L. innocua - - - bV - - - L. welshimeri - - - bV + - - L. seeligeri + - - - + +1 - L. grayic - bV + bV - - -

a Sangre de carnero desfibrinada bV Variable L. grayi incluye ahora las cepas de la especie L. murrayi reductoras de nitratos y ramnosa variable M Manitol R Ramnosa X Xilosa S.a Staphylococcus aureus R.e Rhodococcus equi 1 Puede haber reacciones débilmente positivas, particularmente a las 48 h. de incubación.

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CUADRO 2. Serología de las especies de Listeria

Especies Serotipo L. monocytogenes 1/2A, 1/2B, 1/2C 3A, 3B, 3C 4A, 4AB, 4B 4C, 4D, 4E, "7" L. ivanovii 5 L. innocua 4AB, 6A, 6B, Una L. welshimeri 6A, 6B L. seeligeri 1/2B, 4C, 4D, 6B, Una

Una Indefinido INFORME DE LA PRUEBA Reportar presencia o ausencia en 25.0 g ó 25.0 mL de muestra. BIBLIOGRAFIA Norma Oficial Mexicana. NOM-143-SSA1-1995. Bienes y servicios. Método de prueba microbiológico para alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes. Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Ryser E.T., & Donnelly C.W. (2001) “Listeria”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 343-356. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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ANEXO I

Medios de Cultivo

NOTA Los medios de cultivo son presentados en orden alfabético, independientemente de su estado físico. Agua Peptonada. Peptona 1.0 g Cloruro de sodio 8.5 g Agua destilada 1.0 L Disolver los componentes de la formulación en un litro de agua y ajustar la solución a pH de 7.0, con solución de hidróxido de sodio 1N; distribuir en matraces o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la técnica y esterilizar a 121°C±1°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes y el pH de la solución deben ser iguales a los iniciales. Agua Peptonada Alcalina (APW). Peptona 10.0 g Cloruro de sodio 10.0 g Agua destilada 1.0 L Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8,5± 0,2. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121ºC.

Principio de acción

Medio utilizado para enriquecimiento selectivo del género Vibrio ya que las condiciones óptimas de desarrollo se favorecen por un pH alcalino. Agua de Peptona amortiguadora. Peptona 10.0 g Cloruro Sódico 5.0 g Fosfato sódico dibásico 3.5 g Fosfato potásico monobásico 1.5 g Agua destilada 1.0 L

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Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, después de la esterilización a 7.0 en caso de ser necesario. Distribuir en recipientes de vidrio con la capacidad necesaria para obtener las porciones

necesarias para la prueba. Esterilizar a 121 1°C durante 20.0 minutos. Principio de acción El agua de peptona tamponada al ser un medio nutritivo no selectivo, puede ser utilizada como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperación de células dañadas por los procesos de conservación de alimentos. Almidón, agar. Peptona 5.0 g Extracto de carne 3.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Almidón de maíz 10.0 g Agar 20.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender homogéneamente el almidón, en 100 mL de agua destilada fría, hasta eliminar cualquier grumo. Por otra parte, disolver los demás ingredientes en 900 mL de agua, calentar y agitar continuamente. Ajustar el pH a 7.2±0.1 y añadir la suspensión de almidón a la solución anterior, agitar continuamente hasta completa homogeneización. Esterilizar a 121°C, durante 15 minutos Principio de acción: Esta prueba se basa en la capacidad que tienen algunos microorganismos de hidrolizar el almidón (polisacárido); este compuesto está constituido por un conjunto de unidades de α-D-glucosa cuya estructura química es una hexosa. Por otra parte, se sabe que el almidón forma un complejo de color azul intenso en presencia de yodo, en ocasiones la coloración es rojiza debido al alto contenido de dextrinas que presenta el almidón, sin embargo los mono y disacáridos no se enlazan con el yodo, por lo tanto no dan coloración azul ni rojiza. Algunos microorganismos contienen enzimas como las α o β amilasas, capaces de hidrolizar el almidón dando como productos de la reacción mono o disacáridos, por lo que al adicionar a estos azúcares la solución de yodo, no aparecerá coloración azul ni rojiza (no confundir con el color de la solución de yodo que es café).

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Arginina y glucosa, agar. Peptona 5.0 g Extracto de levadura 3.0 g Triptona 10.0 g Cloruro de sodio 20.0 g Glucosa 1.0 g Clorhidrato de L-arginina 5.0 g Citrato férrico amónico 0.5 g Tiosulfato de sodio 0.3 g Púrpura de bromocresol 0.2 g Agar 13.5 g Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en agua destilada y hervir hasta disolución del agar; envasar cantidades de 5.0 mL en tubos de 13 X 100 mm. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.0. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 10 a 12 minutos. Dejar solidificar el medio inclinando los tubos. Principio de acción: La descarboxilación del aminoácido L-arginina, es realizada por microorganismos que poseen la enzima descarboxilasa y se lleva a cabo cuando se rompe la unión del grupo carboxilo, liberando dióxido de carbono (gas) y formando putrescina, esta última es una diamina que se caracteriza por presentar reacción alcalina. Por otra parte el indicador, púrpura de bromocresol en medio alcalino presenta una coloración púrpura y en medio ácido es amarillo. Por lo tanto si se produce putrescina el medio intensifica el color púrpura por la alcalinidad producida, en caso contrario el medio no cambia de color; finalmente también se podrá observar la fermentación de la glucosa con su respectiva producción de acidez, virando el medio a color amarillo verdoso. ASTEL, agar. (Ver: Soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura, agar). Baird Parker, agar. Ingredientes del medio base* Peptona de caseína 10.0 g Extracto de levadura 1.0 g Extracto de carne 5.0 g Glicina 12.0 g Cloruro de litio 5.0 g Piruvato de sodio 10.0 g Agar 15.0 g Agua destilada 950.0 mL

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Suspender 58.0 g del medio en 950 mL de agua y calentar con agitación constante, dejando hervir durante un minuto, posteriormente esterilizar a 121°C±1.0°C durante 15 minutos. Enfriar y mantener el medio a 45°C. Solución de telurito de potasio: Preparar una solución de telurito de potasio al 1% en agua, esterilizar a 121°C durante 15 minutos. La solución puede ser almacenada por varios meses a una temperatura entre 0 y 5°C. Emulsión de yema de huevo: La preparación de la emulsión de yema de huevo, también se realiza por separado, para lo cual lavar los huevos frescos con agua y jabón, enseguida limpiar los cascarones con una solución de tintura de yodo (solución alcohólica al 2%), o bien sumergirlos en una solución de cloruro mercúrico (1:1000); enjuagar con agua estéril y secar con gasa también estéril. En una campana de flujo laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estéril. Transferir las yemas en una probeta, hasta un volumen de 60.0 mL y completar a 90.0 mL con solución salina isotónica estéril, posteriormente verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer que contenga perlas de vidrio estériles y agitar fuertemente para que se forme la emulsión, después se filtra sobre gasa estéril. Preparación del medio: Medio base 95.0 mL Solución de telurito de potasio 1.0 mL Emulsión de yema de huevo 5.0 mL Mezclar perfectamente bien los ingredientes, manteniendo el medio a 45°C, posteriormente repartir en cajas de Petri entre 15.0 y 20.0 mL de este medio, dejar enfriar hasta solidificación del medio. Las cajas pueden almacenarse hasta por 48 h. después de su preparación, conservándolas a una temperatura entre 0 y 5°C. Principio de acción: S. aureus tiene la capacidad de reducir el telurito de potasio (K2O3Te) a telurio metálico (Te), por esta razón las colonias se presentan de color negras metálicas de acuerdo a la siguiente reacción:

Te4+ Te0

Las lecitinas son fosfoglicéridos, cuya estructura corresponde a ésteres de ácidos grasos unidos con el ácido fosfórico, glicerol y colina; son componentes normales de la yema de huevo. Las lecitinas pueden ser hidrolizadas por enzimas denominadas lecitinasas, existen 4 tipos de ellas, la A; B; C y D, siendo la “C” la producida generalmente por las bacterias; los productos de dicha hidrólisis son ácido fosfórico y colina, por esta razón las colonias de S. aureus patógeno, al

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llevar a cabo la hidrólisis de la lecitina, forma halos transparentes alrededor de la colonia negra (reducción del telurito), además al romperse las uniones lipoprotéicas, se liberan grasas que son insolubles en el medio provocando una opalescencia alrededor de la colonia. Bilis rojo violeta, agar. Peptona de carne 7.0 g Extracto de levadura 3.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Lactosa 10.0 g Mezcla de sales biliares 1.5 g Rojo neutro 0.03 g Cristal violeta 0.002 g Agar 13.0 g Agua destilada 1.0 L Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750.0 mL de agua, posteriormente ajustar el pH a 7.4±0.1 y esterilizar en matraz durante 30 minutos en baño de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento. Principio de acción: La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química básica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno. Bilis verde brillante, agar. Bilis de buey deshidratada 20.0 g Lactosa 10.0 g Peptona de gelatina 10.0 g Verde brillante 0.0133 g Agar 18.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender 40.0 g del medio en un litro de agua destilada, agitando constantemente para ayudar a la humectación, después hervir con agitación constante para evitar que éste se queme. Se esteriliza en matraz a 121°C±1.0°C durante 15 minutos.

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Principio de acción: La bilis de buey que contiene el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes Gram negativas. Las sales biliares son derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química básica es la del ciclo pentano perhidrofenentreno. Salmonella, desarrolla bien en este medio y presenta colonias rosas. Sus requerimientos nutricionales se satisfacen con la lactosa y la peptona de gelatina. Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Bilis de buey deshidratada 20.0 g Lactosa 10.0 g Peptona de gelatina 10.0 g Verde brillante 0.0133 g Agua destilada 1.0 L Suspender 40.0 g de medio en un litro de agua destilada, agitar constantemente para ayudar a la disolución. Distribuir el medio de cultivo en tubos de ensayo que contengan campanas de Durham. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Tener cuidado que ninguna campana de Durham presente gas después de la esterilización. Principio de acción: La enzima β-D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, hidroliza a la lactosa presente en el medio de cultivo, produciendo glucosa y galactosa, monómeros que, secuencialmente, son metabolizados hasta ácidos y CO2; este último subproducto se detecta en las campanas de fermentación después de incubar de 24 a 48 h. Este medio de cultivo posee dos inhibidores bacterianos: las sales biliares y el verde brillante. Las sales biliares inhiben el crecimiento de microorganismos Gram positivos y también tienen efecto tóxico sobre algunos microorganismos Gram negativos. Las sales biliares se presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química básica es la de ciclo pentano perhidrofenantreno. El verde brillante es un colorante que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas y la mayoría de bacilos Gram negativos excepto los coliformes. Incluso suprimen el crecimiento de los microorganismos anaerobios fermentadores de la lactosa como el Clostridium perfringens que daría reacciones falsas positivas.

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BPLS modificado, agar. Peptona de carne 10.0 g Extracto de levadura 3.0 g Extracto de carne 5.0 g Fosfato monobásico de sodio 0.6 g Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4) 1.0 g Lactosa 10.0 g Sacarosa 10.0 g Rojo de fenol 0.09 g Verde brillante 0.0047 g Agar 12.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender 52.0 g del medio en 750.0 mL de agua, para humectar los polvos insolubles, después adicionar el resto del agua y calentar a ebullición durante un minuto, el pH final debe ser de 6.9. No esterilizar el medio y repartirlo en cajas Petri. Principio de acción: En este medio se pueden distinguir las bacterias que fermentan la lactosa, las cuales presentan colonias que viran el medio a color amarillo por la formación de acidez a partir del azúcar. Las colonias rojas indican que los microorganismos no fermentan la lactosa. Brewer anaeróbico, agar. Peptona de caseína 10.0 g Peptona de soya 5.0 g Cloruro de sodio 5.0 g L-cistina 0.4 g Dextrosa 10.0 g Tioglicolato de sodio 2.0 g Formaldehído sulfoxilato de sodio 1.0 g Azul de metileno 0.002 g Agar 12.6 g Agua destilada 1.0 L Suspender 55.0 g del medio en 750.0 mL de agua para humectar perfectamente bien, posteriormente adicionar el resto del agua, agitar y calentar hasta ebullición durante un minuto o bien hasta que el medio se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos; el pH final debe ser de 7.2±0.2.

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Principio de acción: El tioglicolato de sodio consume el oxígeno ambiental, creando una atmósfera anaeróbica, que es el objetivo de este medio. Además este medio contiene más sustancias reductoras como la cistina, el sulfoxilato y el formaldehído, los cuales garantizan una anaerobiosis suficiente para los microorganismos. El azul de metileno es un indicador para reacciones de óxido reducción. Bismuto sulfito, agar. Extracto de carne de res 5.0 g Mezcla de peptonas 10.0 g Glucosa 5.0 g Fosfato sódico dibásico (anhidro) 5.0 g Sulfato ferroso (anhidro) 0.3 g Sulfito de bismuto 8.0 g Verde brillante 0.025 g Agar 20.0 g Agua destilada 1.0 L pH final 7.6 0.2 Suspender todos los ingredientes en el agua destilada. Calentar hasta su disolución completa, agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45°C y verter en cajas de Petri estériles, distribuyendo de manera homogénea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, ce color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. Si la coloración es parda, no deben utilizarse. El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad. Principio de acción: En este medio el sulfito de bismuto actúa con el verde brillante como agente selectivo para la inhibición de coliformes, permitiendo el desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre funcionan como sustrato para la producción de ácido sulfhídrico, mientras que la reducción de las sales de bismuto a bismuto metálico tiñe las colonias de un brillo negro o café metálico por la reducción del sulfito a sulfuro, produciendo ácido sulfhídrico. BRILA, caldo (Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo).

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Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar (mCPC) Solución 1: Peptona 10.0 g Extracto de carne 5.0 g Cloruro de sodio 20.0 g Solución Stock de colorante 1000 X 1.0 mL Agar 15.0 g Agua destilada 0.9 L Ajustar el pH a 7.6, posteriormente hervir hasta que el agar se funda, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 55°C. Solución stock de colorantes 1000 X: Azul de bromotimol 4.0 g Rojo de cresol 4.0 g Etanol al 95% 100.0 mL Para obtener un color firme del medio, usar una solución colorante stock, en lugar de estar pesando repetidamente los colorantes en polvo. Disolver los colorantes en el alcohol etílico hasta obtener una concentración de 4% (peso/volumen); de esta solución se toma un mililitro y se adiciona a un litro del medio mPCP (solución 1), que se encuentra enfriado entre 48 y 55°C. Solución 2: Celobiosa 10.0 g Colistina 400000 UI Polimixina B 100000 UI Agua destilada 0.1 L Disolver la celobiosa por calentamiento en agua destilada, enfriar y agregar los antibióticos. Esterilizar por filtración y adicionar la solución 2 a la solución 1, mezclar y distribuir en cajas Petri. Principio de acción: La polimixina B, es un antibiótico que inhibe el crecimiento de microorganismos Gram positivos, esto es un antibiótico de espectro reducido. Permite entre otros, el desarrollo del género Vibrio, por ser éstos Gram negativos. Además contiene una alta concentración de cloruro de sodio, en el que desarrollan los microorganismos halotolerantes.

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Cianuro, caldo (KCN).

*Cianuro de potasio 0.5 g

Polipeptona 3.0g

NaCl 5.0 g

KH2PO4 0.225 g

Na2HPO4 5.64 g

Agua destilada 1.0 L

Disolver todos los ingredientes excepto el cianuro de potasio, esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.

Principio de acción. Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria aerobia, transfirió electrones al oxígeno con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en oganismos aerobios y anaerobios facultativos, lo que posibilita la identificación de aquéllos que carecen de dicha enzima. El cianuro interrumpe el último eslabón de la cadena respiratoria, sin embargo hay microorganismos que generan su energía metabólica por vías alternas. Cuenta Estándar, agar (Ver Métodos estándar, agar). Citrato Simmons, agar. Sulfato de magnesio 0.2 g Fosfato dihidrogenado de amonio 1.0 g Fosfato dipotásico 1.0 g Citrato de sodio tribásico 2.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Azul bromotimol 0.08 g Agar 15.0 g Agua destilada 1.0 L pH 7.0 ±0.2 Disolver 23.0 g en 1 litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición para disolver completamente los ingredientes. Distribuír en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Inclinar los tubos después de esterilizar. Enfriar antes de su

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uso y conservar en refrigeración (4-10 °C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo en medio sólido (se recomienda agar Kligler hierro); no se recomiendan las suspensiones en caldo. Estriar SOLO EN EL PICO DE FLAUTA Principio de acción. El agar Citrato de Simmons se recomienda para la diferenciación de la familia Enterobacteriaceae basada en la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono. La energía puede ser proporcionada a algunas bacterias en ausencia de fermentación o producción de ácido láctico por la utilización del citrato como única fuente de carbono. Los microorganismos podrán introducir el citrato al citoplasma por una permeasa, donde ocurre un desdoblamiento a través de la enzima citrato oxaloacetato liasa, dando como productos acetato, formato, lactato y/o dióxido de carbono. El medio contiene también sales inorgánicas de amonio. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como fuente de carbono también utiliza las sales de amonio como única fuente de nitrógeno, éstas son degradadas a amoniaco alcalinizando el medio con lo cual se genera el vire del indicador azul de bromotimol de verde a pH neutro a un color azul a pH alcalino, considerándose de esta forma la reacción como positiva. Descarboxilasa (arginina, lisina y ornitina), medio base. Peptona 5.0 g Extracto de levadura 3.0 g Dextrosa (D-glucosa) 1.0 g Púrpura de bromocresol 0.02 g Agua destilada 1.0 L

Se sugiere añadir 20.0 g de cloruro de sodio, en cada litro de medio de cultivo, cuando se desee identificar Vibrio cholerae; para Vibrio spp. halofílicos, adicionar 15.0 g de cloruro de sodio en cada litro de medio base; para otros géneros y especies de microorganismos seguir la formulación descrita.

Adicionar 5.0 g del aminoácido de prueba; arginina, lisina y ornitina, en cada litro de medio base.

Como control, usar base sin suplemento (aminoácido). El medio se distribuye en tubos y se esterilizan a 121°C durante 10 minutos; el pH del medio después de esterilizar debe estar en 6.5±0.2 Principio de acción La base de nutrientes de este medio, permite las mejores condiciones de desarrollo de los microorganismos. La descarboxilación del aminoácido que contiene el medio de cultivo y que se realiza por la enzima descarboxilasa que poseen algunos microorganismos, provocan la liberación del grupo carboxilo, quedando el grupo amino en el medio de cultivo, por lo que el medio se alcaliniza, dando una coloración púrpura.

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La lisina al ser descarboxilada, da como producto la cadaverina, en tanto que la ornitina y arginina, dan como productos finales putrescina. Debido a que la descarboxilación solamente se lleva a cabo en medio ácido (por debajo de pH 6.0), el medio debe acidificarse mediante la fermentación de la glucosa; esto quiere decir que este medio sólo se utiliza para la diferenciación de microorganismos fermentadores de la glucosa y que posean la enzima descarboxilasa. Los microorganismos que son descarboxilasa negativos, pero son fermentadores de la glucosa, ocasionan que el medio se acidifique, por lo que el indicador vira a amarillo. En períodos de incubación muy prolongados, se puede presentar alcalinización de la superficie del medio, dando por consecuencia un cambio en el color del medio, esto es se intensifica el color violeta. DNA, agar. Ácido desoxirribonucléico (DNA) helicoidal de timo de ternera o equivalente

0.03 g

Agar 1.0 g Solución de cloruro de calcio anhidro 0.01M 0.1 mL Cloruro de sodio 1.0 g Solución de azul de toluidina 0.1M 0.3 mL Solución de Tris-(hidroximetil- aminometano) 0.05M, pH 9.0 100.0 mL Mezclar todos los ingredientes, excepto el azul de toluidina y agitar hasta disolución del ácido desoxirribonucléico, calentar a ebullición. Posteriormente adicionar el azul de toluidina y distribuir en frascos pequeños con tapón de hule; NO ES NECESARIO ESTERILIZAR. Este medio es estable a temperatura ambiente aún después de 4 meses, funciona de manera correcta aún después de fundido varias veces. Principio de acción: Los ácidos nucleicos, están constituidos por azúcar-fosfato-bases nitrogenadas, el azúcar es la β-D-desoxirribosa, que forma uniones éster con el ácido fosfórico, unidas también a bases nitrogenadas como la adenina, guanina, timina y citosina, dando una forma en el espacio de una espiral o helicoidal. Estos ésteres pueden ser hidrolizados por enzimas; en el caso de la hidrólisis del DNA por la nucleasa microcóccica (S. aureus), se producen principalmente mono y dinucléotidos, son productos de la ruptura del azúcar (carbono 3´ y 5´) con el fosfato. Es importante hacer notar que la enzima DNAasa, es más activa sobre el DNA desnaturalizado (por calentamiento) que sobre el DNA original, además es una característica de S. aureus patógeno.

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Dulcitol rojo de fenol, caldo. Peptona de caseína 10.0 g Extracto de carne 1.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Rojo de fenol 0.018 g Dulcitol 10.0 g Agua destilada 1.0 L pH 7.4±0.2 Pesar con precisión la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua destilada. Calentar suavemente la solución. El carbohidrato se puede agregar antes de la esterilización. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar 116-118°C durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilización del medio base SIN EL CARBOHIDRATO a 121°C durante 15 min, enfriar el medio base a ±45°C y agregar la solución del carbohidrato esterilizada por filtración en membrana. Distribuir en tubos estériles. Conservar en refrigeración (4-10°C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubación. Principio de acción Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar un carbohidrato específico en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible. La fermentación es un proceso anaeróbio de oxidación-reducción, en el cual un sustrato orgánico actúa como el aceptor final de electrones. Los productos característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos acético y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f) ácido succínico a ácido propiónico y CO2, g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico y h) ácido butírico a alconol butílico. El indicador de pH utilizado para demostrar la fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayoría de los productos finales del metabolismo de carbohidratos son ácidos y generaran un vire del indicador a amarillo. EC, caldo (Escherichia coli, caldo para). Bacto triptosa 20.0 g Bacto lactosa 5.0 g Bacto sales biliares No. 3 1.5 g Fosfato dipotásico 4.0 g Fosfato monopotásico 1.5 g Cloruro de sodio 5.0 g Agua destilada 1.0 L Disolver todos los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para una mejor disolución. Ajustar el pH a 6.9 ± 0.2 (25ªC) y distribuir 10 mL del medio a cada tubo de ensayo, con campanas de Durham. Esterilizar en autoclave

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durante 15 minutos a 121°C. Se recomienda que antes de abrir la autoclave, se deje bajar la temperatura a 75°C para evitar que se introduzcan burbujas de aire en las campanas de Durham. Principio de acción:

La lactosa es hidrolizada por la enzima -D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, generándose como subproductos glucosa y galactosa que, secuencialmente, son metabolizados hasta ácidos y CO2; este último se detecta en las campanas de Durham. Cuando la fermentación de lactosa se lleva a cabo a 44.5 °C la prueba positiva indica presencia de Escherichia coli.

Las sales biliares inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas particularmente los bacilos y los estreptococos fecales. La triptona constituye la fuente más importante de nutrimentos y los fosfatos constituyen el sistema regulador del pH. El cloruro de sodio regula el equilibrio osmótico. EC-MUG, caldo (Escherichia coli, caldo con metilumbeliferil glucurónido). Preparar el caldo EC y adicionar 50.0 mg de 4-metilumbeliferil- (MUG) por cada litro medio de cultivo antes de esterilizar (121°C por 15 minutos). Principio de acción:

Alrededor del 97% de las cepas de E. coli (incluidas las no productoras de gas) producen la enzima β -D-glucuronidasa (GUD), la cual escinde al sustrato MUG dando como producto final la 4-metilumbelliferona; este último compuesto es fácilmente detectable cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta.

Eosina azul de metileno de Levin, agar (EMB-L). Peptona 10.0 g Lactosa 10.0 g Fosfato dibásico de potasio 2.0 g Eosina Y 0.4 g Azul de metileno 0.065 g Agua destilada 1.0 L Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua, calentar a ebullición hasta la disolución completa. Posteriormente distribuir en porciones de 100 ò 200 mL y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos; el pH debe ser de 7.1 ± 0.2. Fundir el medio antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 mL: a) 5 mL de solución de lactosa al 20% b) 2 mL de solución acuosa de eosina al 2%

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c) 4,3 mL de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%. Nota: Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Principio de acción El agar eosina azul de metileno es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La acción selectiva se debe a la presencia de los colorantes eosina y azul de metileno, los cuales inhiben el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa y productores de una gran cantidad de ácido, de aquellos microorganismos que producen poco ácido, o que no fermentan la lactosa. Las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa productores de gran cantidad de ácido se observan de color verde metálico, esto se debe a la precipitación de los colorantes -sobre la superficie de las colonias e incluso en la superficie del medio de cultivo-, cuando las condiciones son extremadamente ácidas. Eosina azul de metileno, agar (EMB-lactosa sacarosa, agar). Peptona 10.0 g Lactosa 5.0 g Sacarosa 5.0 K2HPO4 2.0 g Eosina Yellow 0.4 g Azul de metileno 0.065 g Agar 13.5g Agua destilada 1.0 L Humectar y disolver los ingrediente, posteriormente hervir el medio y ajustar el pH a 7.1 ± 0.2, esterilizar a 121ºC durante 15 minutos y finalmente verter en placas. Principio de acción La sacarosa y lactosa permiten distinguir al género Salmonella y Shigella, (porque ambas no fermentan dichos azúcares), de la flora acompañante, por ejemplo Citrobacter, Aeromonas y Proteus las cuales no fermentan la lactosa pero sí la sacarosa; cuando el resto de la flora acompañante son bacterias Gram positivas, éstas son inhibidas por la eosina y el azul de metileno.

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Entérico de Hektöen, agar. Proteosa peptona 12.0 g Extracto de levadura 3.0 g Lactosa 12.0 g Sacarosa 12.0 g Salicina 2.0 g Sales biliares 9.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Tiosulfato de sodio 5.0 g Citrato férrico amoniacal 1.5 g Azul de bromotimol 0.064 g Fucsina ácida 0.1 g Agar 13.5 g Agua destilada 1.0 L pH final

7.5 0.2 Suspender los ingredientes en el agua destilada estéril, hervir con agitación hasta la disolución completa del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar entre 55 y 60°C, posteriormente distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas. Principio de acción La concentración alta de peptona, disminuye la actividad inhibitoria de las sales biliares en contra de las especies de Shigella. Los carbohidratos adicionales (sacarosa y salicina) mejoran la diferenciación con respecto a la lactosa, y la menor toxicidad del doble indicador mejora la recuperación. Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fucsina ácida, las colonias lactosa-positivas muestran una diferencia cromática de color amarillo, frente a las colonias lactosa-negativas (colonias azules o verdes). Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos. El incremento en el contenido de lactosa ayuda al reconocimiento principal de los organismos que fermentan la lactosa lentamente. El tiosulfato y el citrato férrico se utilizan para la detección de los organismos productores de ácido sulfhídrico por reducción del tiosulfato. Una mezcla de sales biliares inhibe a una gran parte de la microbiota acompañante. Se recomienda la adición de novobiocina en una concentración de 15.0 mg/mL, lo cual mejora la selectividad del medio inhibiendo a especies de Citrobacter y Proteus.

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Esculina bilis, agar. Extracto de carne 3,0 g Peptona 5,0 g Sales biliares 40,0 g Citrato férrico amoniacal 0,50 g Esculina 1,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 mL Disolver por calentamiento el extracto de carne, la peptona y el agar en 400,0 mL de agua destilada. Por otra parte, se disuelven las sales biliares en 100,0 mL de agua destilada y el citrato férrico amoniacal en otros 100,0 mL de agua destilada. Mezclar todas las soluciones y completar hasta 1000,0 mL con agua destilada. Calentar la mezcla hasta la completa disolución de los ingredientes. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min. Enfriar a temperatura de 50ºC y añadir 100,0 mL de solución de esculina al 1% esterilizada por filtración. Distribuir asépticamente en tubos de ensayo y dejar solidifcar en posición inclinada. Principio de acción La peptona y extracto de carne proveen de carbono, nitrógeno, minerales, vitaminas y otros factores de crecimiento para que los organismos crezcan. La esculina es hidrolizada por las especies de Listeria para formar esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de fierro (citrato férrico amoniacal) que contiene el medio para producer un complejo negro a café rojizo que aparece en el medio rodeando las colonias. La Listeria monocytogenes es tolerante a las sales biliares. El agar es el agente solidifante. Extracto de Malta, agar. Extracto de malta 30,0 g Peptona de harina de soya 3,0 g Agar 15.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender 33.6 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar humectar el polvo, calentar y agitar frecuentemente, dejar hervir durante un minuto. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Ajustar el pH a 5.6 ± 0,1. Principio de acción: Se utiliza para la demostración, aislamiento y numeración de hongos y levaduras. A partir del extracto de malta y la harina de soya se observa que éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las

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levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del ácido. Fraser base, caldo. Digerido pancreático de caseína 5,0 g Proteosa peptona No. 3 5,0 g Extracto de carne 5,0 g Extracto de levadura 5,0 g Cloruro de sódio 20,0 g Fosfato disódico 9,6 g Fosfato monopotásico 1,35 g Esculina 1,0 g Acido nalidíxico 0,02 g Acrilflavina HCl 24,0 mg Cloruro de lítio 3,0 g Fraser caldo, suplemento Vial com 10 mL de citrato férrico amoniacal 0,5 g Suspender 55 g de polvo en un 1,0 L de agua destilada. Mezclar para homogeneizar. Calentar con agitación frecuente y hervir durante 1 minuto hasta disolución completa. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente. Asépticamente añadir 10,0 mL del suplemento para caldo Fraser. Mezclar bien.

Principio de acción

Las peptonas, extracto de carne y extracto de levadura proporcionan nitrógeno, vitaminas y minerales. El fosfato de sódio y potasio son los agentes amortiguadores. La diferenciación se ve estimulada por la adición del citrato férrico amoniacal. Debido a que todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, la adición de iones fierro al medio detectará la reacción. Un ennegrecimiento del medio por las bacterias que hidrolizan la esculina da como resultado la formación del 6,7-dihidroxicumarina que reacciona con los iones fierro. La selectividad es propiciada por la presencia del cloruro de lítio, ácido nalidíxico y acrilflavina en la fórmula. La alta tolerancia de Listeria a la sal se utiliza como medio para inhibir el crecimiento de los enterococos.

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Gelatina, agar (GA). Tripticasa (digerido pancreático de caseína) 10.0 g Cloruro de sodio 10.0 g Gelatina 30.0 g Agar 15.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolución de la gelatina y el agar; ajustar el pH a 7.2±0.2 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50°C y distribuir en cajas de Petri. Principio de acción: En el caso específico de la determinación de V. cholerae se utiliza este medio de cultivo para purificación de colonias sospechosas provenientes de los medios de cultivo TCBS o mCPC, utilizando el principio de la halofilia o halotolerancia. Gelatina con sal, agar (GS).

Tripticasa (digerido pancreático de caseína) 10.0 g Cloruro de sodio 30.0 g Gelatina 30.0 g Agar 15.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en agua y hervir hasta disolución de la gelatina y el agar; ajustar el pH a 7.2±0.2 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50°C y distribuir en cajas de Petri. Si es necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp, tal como Vibrio alginolyticus, usar entre 25.0 y 30.0 gramos de agar por litro del medio. Principio de acción: En este medio se puede observar si los microorganismos licuan la gelatina o no, en caso afirmativo, se interpreta que el microorganismo contiene enzimas proteolíticas. Por otra parte el medio contiene 3% de cloruro de sodio, lo cual sirve para poner de manifiesto la tolerancia que un microorganismo puede tener a estas concentraciones de sal.

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Gelatina con sal, caldo (GS). Tripticasa (digerido pancreático de caseína) 10.0 g Cloruro de sodio 30.0 g Gelatina 30.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en agua y calentar si es necesario para ayudar a la disolución del medio; ajustar el pH a 7.2±0.2 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos en tubos de 13 x 100. Principio de acción: Este medio se utiliza para observar la tolerancia al cloruro de sodio que presentan algunos microorganismos. Hierro y tres azúcares, agar (TSI). Peptona de carne 10.0 g Peptona de caseína 10.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Lactosa 10.0 g Sacarosa 10.0 g Glucosa 1.0 g Agar 13.0 g Rojo de fenol 0.025 g Sulfato ferroso amónico pentahidratado 0.20 g Tiosulfato de sodio 0.20 g Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar a ebullición agitando

ocasionalmente hasta disolución completa. Enfriar a 60°C y ajustar el pH a 7.3 0.2. Distribuir en volúmenes de 3.0 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3.0 cm. y una profundidad de 4.0 cm. El medio es de color rojo. Principio de acción En esta prueba bioquímica, se pueden observar: a) fermentación de los diferentes azúcares que contiene, b) producción de gas: CO2 e H2 y c) producción de ácido sulfhídrico H2S. En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacárido lo degrada la β-galactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 últimos azúcares pueden ser metabolizados en condiciones aerobias a través del ciclo de Krebs, dando como productos finales CO2, H2O y energía: pero si el metabolismo se realiza en

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condiciones anaerobias por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como producto intermedio, ácido pirúvico, llegando finalmente a través del ciclo de Krebs a CO2, H2O y energía. El indicador rojo de fenol, en medio ácido es amarillo y en alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentación de los azúcares es de color rojo. La glucosa (0.1%) se detecta en el fondo del tubo (bioquímica) y es metabolizada en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando como productos intermedios ATP y ácido pirúvico y como productos finales: ácidos orgánicos, aldehídos, alcoholes, CO2, H2O y energía. La sacarosa (1%) se pone de manifiesto virando todo el tubo a una coloración amarilla, esto puede traer confusión, cuando se encuentra un microorganismo que no fermenta la lactosa, pero sí la sacarosa, sin embargo el resultado del resto de bioquímicas ayudarán a la interpretación de esta prueba. Otro sistema para la diferenciación es aportado por los indicadores de ácido sulfhídrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio férrico, y otro producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar presentes. En una primera etapa de la reacción el microorganismo en ambiente ácido reaccionará con el tiosulfato de sodio para generar el ácido sulfhídrico. En la segunda etapa de la reacción este compuesto reaccionará con los iones férricos generando un precipitado negro insoluble debido a la formación del sulfuro ferroso. Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente ácido, sin embargo para la formación del ácido sulfhídrico existe una condición ácido aunque no sea visible. El TSI es un medio para la diferenciación de Enterobacterias de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa, sacarosa y/o glucosa, y para producir ácido sulfhídrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de éstas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razón se recomienda realizar al mismo tiempo otra prueba bioquímica como el caldo urea o el agar urea. Hugh Leifson con glucosa 1%, medio. Peptona 2.0 g Extracto de levadura 0.5 g Cloruro de sodio 20.0 g Dextrosa 10.0 g Púrpura de bromocresol 0.015 g Agar 3.0 g Agua destilada 1.0 L

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Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta que se disuelva el agar; ajustar el pH a 7.4±0.2, posteriormente colocar el medio en tubos y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. El medio debe quedar de color verde. Principio de acción El metabolismo de los carbohidratos se lleva a cabo en condiciones aerobias o anaerobias, sin embargo la fermentación es un proceso anaerobio y las bacterias que realizan este proceso por lo general son anaerobias facultativas. Los microorganismos al fermentar un azúcar, hidrolizan el carbohidrato, dando como productos finales, compuestos que contienen entre uno y cuatro carbonos, dependiendo de las diferentes bacterias, siendo el principal intermediario el ácido pirùvico. La más importante vía metabólica para fermentar la glucosa es la de Embden-Meyerhof-Parnas. Al añadir un carbohidrato al medio de cultivo, se puede llevar a cabo la degradación de éste con la subsecuente producción de ácido, lo que se hace evidente por el indicador de pH, púrpura de bromocresol, el que vira a color amarillo. La degradación se lleva a cabo mientras el medio está expuesto al aire (esta degradación puede ser oxidativa o fermentativa), o en ausencia del aire (degradación fermentativa solamente). Para cada carbohidrato, inocular un tubo con un cultivo puro del microorganismo seleccionado como patrón positivo, la inoculación se hace por picadura hasta el fondo de los tubos, después de lo cual un tubo se sella con parafina estéril y otro no se sella. El microorganismo utilizado para la inoculación deberá estar en fase logarítmica de desarrollo. Incubar de 24 a 48 h a temperatura de 35°C ± 2°C de incubación. Una coloración amarilla en ambos tubos, abierto y sellado con parafina, significa una degradación fermentativa, mientras que una coloración amarilla sólo en el tubo abierto, indica que el carbohidrato en cuestión es degradado solamente por vía oxidativa. La degradación oxidativa se presenta sólo o cercanamente en la superficie del medio, mientras que la degradación fermentativa, se presenta en todo el tubo, inclusive en la superficie de éste. Se comprueba finalmente el crecimiento microbiano producido mediante la observación de turbidez, si ésta se observa solamente a lo largo de la línea de la picadura (cepa no móvil) o a lo largo de todo el medio (cepa móvil).

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Infusión cerebro corazón, caldo. Infusión cerebro corazón, agar (BHI, caldo/ BHI, agar). Infusión de cerebro de ternera 200.0 mL Infusión de corazón de res 250.0 mL Peptona de gelatina 10.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Fosfato dibásico de sodio, dodecahidratado 2.5 g Glucosa 2.0 g Agar bacteriológico a 15.0 g Agua destilada 1.0 L a En caso de requerirse agar infusión cerebro corazón Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolución de los cristales de agar si es necesario, posteriormente distribuir en matraces o tubosde acuerdo a la monografía correspondiente y esterilizar a 121°C±1.0°C durante 15 minutos. En caso de requerirse en cajas de Petri deberá enfriarse a 45°C y verter en condiciones de asepsia. Principio de acción: Los componentes de la infusión de cerebro de ternera y de la infusión de corazón de res hacen del medio BHI un medio de cultivo de enriquecimiento ideal para microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes. Kligler hierro, agar. Extracto de carne 3.0 g Extracto de levadura 3.0 g Peptona 15.0 g Proteosa peptona 5.0 g Lactosa 10.0 g Glucosa 1.0 g Sulfato ferroso heptahidratado ó Citrato de amonio férrico / citrato de amonio

0.2 g 0.5 g

Cloruro de sodio 5.0 g Tiosulfato de sodio 0.3 g Rojo fenol 0.024 g Agar 12.0 g Agua desionizada 1,000 mL pH 7.4±0.2 Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolución de los cristales de agar si es necesario, posteriormente distribuir en tubos de acuerdo a la monografía correspondiente y esterilizar a 121°C±1.0°C durante 15 minutos. Deberá enfriarse a 45°C e inclinar.

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Principio de acción En esta prueba bioquímica, se pueden observar: a) fermentación de los diferentes azúcares que contiene, b) producción de gas: CO2 e H2 y c) producción de ácido sulfhídrico H2S. En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacárido lo degrada la β-galactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 últimos azúcares pueden ser metabolizados en condiciones aerobias a través del ciclo de Krebs, dando como productos finales CO2, H2O y energía: pero si el metabolismo se realiza en condiciones anaerobias por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como producto intermedio, ácido pirúvico, llegando finalmente a través del ciclo de Krebs a CO2, H2O y energía. El indicador rojo de fenol, en medio ácido es amarillo y en alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentación de los azúcares es de color rojo. La glucosa (0.1%) se detecta en el fondo del tubo (bioquímica) y es metabolizada en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando como productos intermedios ATP y ácido pirúvico y como productos finales: ácidos orgánicos, aldehídos, alcoholes, CO2, H2O y energía. Otro sistema para la diferenciación es aportado por los indicadores de ácido sulfhídrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio férrico, y otro producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar presentes. En una primera etapa de la reacción el microorganismo en ambiente ácido reaccionará con el tiosulfato de sodio para generar el ácido sulfhídrico. En la segunda etapa de la reacción este compuesto reaccionará con los iones férricos generando un precipitado negro insoluble debido a la formación del sulfuro ferroso. Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente ácido, sin embargo para la formación del ácido sulfhídrico existe una condición ácido aunque no sea visible. El agar Kligler hierro es un medio para la diferenciación de Enterobacterias de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa y/o glucosa, y para producir ácido sulfhídrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de éstas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razón se recomienda realizar al mismo tiempo otra prueba bioquímica como el caldo urea o el agar urea

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Koser citrato de, caldo.

NaNH4HPO4 •4H2O 1,5 g

KH2PO4 1,0 g

MgSO4 •7H2O 0,2 g

Citrato de sodio •2H2O 3,0 g

Agua destilada 1.0 L

Disolver todos los ingredientes en el agua, si es necesario calentar para ayudar a la disolución, después ajustar el pH final de 6,7 ± 0,2 y distribuir preferentemente en tubos de ensayo con tapa de rosca. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Esta formulación se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos Estándares para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Principio de acción: En ausencia de carbohidratos fermentables como la glucosa y lactosa, algunos microorganismos son capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono para la obtención de energía. Esta capacidad depende de la presencia de la enzima citrato permeasa, la cual facilita el transporte del citrato dentro de la célula. El citrato es el principal intermediario del ciclo de Krebs y es producido por la condensación del acetilo activo con el ácido oxaloacético. El citrato es hidrolizado por la enzima citrasa, generando como productos ácido oxaloacético y acetato. Estos productos son convertidos enzimáticamente a ácido pirúvico y dióxido de carbono. La presencia de turbidez en el medio de cultivo indica que la prueba es positiva. Lactosa bilis (2%) verde brillante, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Lactosa verde brillante bilis al 2%, caldo (Brila). Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Lactosado, caldo. Extracto de carne 3.0 g Peptona 5.0 g Lactosa 5.0 g Agua destilada 1.0 L

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Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando a 65°C. Distribuir en

porciones de 225.0 mL, en frascos de 500 mL de capacidad. Esterilizar a 121 1°C durante 15.0 min. Principio de acción El caldo lactosado se utiliza para la identificación presuntiva de organismos coliformes en leche, agua y alimentos. Por ser un medio nutritivo no selectivo, puede también utilizarse como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperación de células dañadas por los procesos de conservación. Lauril sulfato de sodio, caldo. Bacto triptosa 20.0 g Bacto lactosa 5.0 g Fosfato potásico, dibásico 2.75 g Fosfato potásico, monobásico 2.75 g Cloruro de sodio 5.0 g Lauril sulfato de sodio 0.1 g Agua destilada 1.0 L Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentando si es necesario, para ayudar a la disolución; posteriormente ajustar el pH a 6.8 ± 0.2 a 25°C y distribuir en tubos de ensayo conteniendo campanas de Dirham la cantidad necesaria del medio. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75°C para que no queden burbujas en las campanas de Durham.

Preparación de caldo lauril sulfato de sodio de acuerdo con el inóculo utilizado

INOCULO (mL)

CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (mL)

VOLUMEN DE MEDIO MAS INOCULO (mL)

CALDO LAURIL TRIPTOSA REQUERIDO g/L

1 10 o más 11 o más 35,6

10 10 20 71,2

10 20 30 53,4

20 10 30 106,8

100 50 150 106,8

100 35 135 137,1

100 20 120 213,6

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Principio de acción Este medio se usa como prueba presuntiva en la detección del grupo coliforme. El lauril sulfato de sodio, es un agente tensoactivo que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, debido a los constituyentes de la membrana de éstos, sin embargo sí se pueden desarrollar bacterias Gram negativas. La triptona proporciona nitrógeno, azufre, carbono y algunos minerales que son esenciales para el crecimiento microbiano. Los fosfatos funcionan como amortiguadores del pH en el medio de cultivo y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. La lactosa es utilizada como fuente de carbono por los microorganismos. La fermentación de la lactosa da como productos finales ácido y gas, este último es detectado en las campanas de fermentación (Durham). Leche descremada reconstituida Leche descremada 100.0 g Verde brillante al 0.1% 0.45 mL Agua destilada 1.0 L Diluirla leche descremada reconstituida en el agua destilada. Agitar circularmente hasta disolución. Distribuir en volúmenes de 225.0 mL en matraces Erlenmayer de

500 mL. Esterilizar a 121 1°C por 15 min. Principio de acción La leche por ser un alimento rico en nutrientes (proteínas y azúcares) puede utilizarse para el preenriquecimiento de Salmonella en ciertos alimentos. Para inhibir la microbiota acompañante se debe adicionar 0.45 mL de una solución de verde brillante al 0.1%. Lisina Hierro, agar (LIA).

Peptona de gelatina 5.0 g Extracto de levadura 3.0 g Glucosa 1.0 g L-Lisina 10.0 g Citrato férrico de amonio 0.5 g Tiosulfato de sodio 0.04 g Púrpura de bromocresol 0.02 g Agar 15.0 g Agua destilada 1.0 L

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Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121ºC. Enfriar de 50-60ºC y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1. Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrían en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.

Principio de acción La lisina puede ser descarborxilada por los microorganismos y transformarla en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol. Puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6.0), es necesario que se produzca previamente la acidificación de medio de cultivo, por fermentación de la glucosa. Por este motivo, este medio de cultivo sólo puede utilizarse para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubación prolongada puede ocasionar una alcalinización en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formación de HxS produce una coloración negra debida al sulfuro de hierro producido. Las cepas del grupo Proteus-Providencia, con excepción de algunas cepas de

Proteus morganii, desamina a la lisina a ácido -cetocarbónico. Este último forma compuestos pardo-rojizos en la región superficial del medio de cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia de oxígeno. Listeria para enriquecimiento (EB) pH 7,3, caldo.

Añadir asépticamente a 500 mL de caldo soya tripticaseína con extracto de levadura (CSTEL) estéril, 5,0 mL de cada una de las siguientes soluciones que integran el medio (solución de acrilflavina, solución de cicloheximida y solución de ácido nalidíxico). El caldo de enriquecimiento así preparado (EB), se distribuye en matraces Erlenmeyer de 500,0 mL estérilies a razón de 250,0 mL:

Solución de acriflavina Clorhidrato de acriflavina

15,0 mg

Agua destilada 10.0 mL Solución de ácido nalidíxico Acido nalidíxico (sal sódica) Hidróxido de sodio 0.05N

40,0 mg 10.0 mL

Solución de cicloheximida Cicloheximida Etanol Agua destilada

50,0 mg

4.0 mL 6.0 mL

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Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante su manejo deben emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos

Principio de acción Las peptonas y el extracto de levadura son fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La dextrosa es la fuente de carbohidratos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio. Los fosfatos proveen de capacidad amortiguadora. El piruvato de sodio ayuda a resucitar organismos estresados. El ácido nalidíxico inhibe el crecimiento de organismos gram-negativo. El clorhidrato de acrilflavina suprime el crecimiento de bacterias gram-positivo. La cicloheximida se incorpora para inhibir hongos saprofíticos.

LMP, medio. Cloruro de litio feniletanol-moxolactam (para Listeria). Fenil etanol agar 35,5 g Glicina anhidra 10,0 g Cloruro de litio 5,0 g Soluciòn de moxolactam al 1% disuelto en soluciòn amortiguadora de fosfatos de pH 6,0

2,0 mL

Agua 1,0 L Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 50ºC y agregar la solución de moxolactam previamente esterilizada por filtración. Distribuir volúmenes de 12 a 15 mL del medio en cajas de Petri estériles. Las placas delgadas facilitan la observación de las colonias. Mac Conkey, agar.

Proteasa peptona o polipeptona 3.0 g Peptona o gelizante 17.0 g Lactosa 10.0 g Sales biliares No. 3 1.5 g Cloruro de sodio 5.0 g Rojo neutron 0.03 g Cristal violeta 0.001 g Agar 13.5 g Agua destilada 1.0 L Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar si es necesario para disolver, ajustar el pH a 7.1 ± 0.2 a 25°C y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri.

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Principio de acción El agar Mac Conkey es un medio selectivo y diferencial. La selectividad del medio esta dada por las sales biliares que inhiben el desarrollo de bacterias Gram-positivas. El cristal violeta es un colorante que también inhibe el crecimiento de algunas bacterias Gram-positivas. Finalmente, las peptonas constituyen la principal fuente de nutrimentos. El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa de los que no lo son, mediante el indicador de pH rojo neutro. Cuando la lactosa es fermentada, el medio de cultivo se acidifica, esto provoca el vire del indicador a rojo; por lo que las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa aparecen de color rojo oscuro o rosadas. Las colonias de las bacterias no fermentadoras de lactosa son transparentes, incoloras o ámbar. Manitol rojo de fenol, caldo Peptona de caseína 10.0 g Extracto de carne 1.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Rojo de fenol 0.018 g Manitol 10.0 g Agua destilada 1.0 L pH 7.4±0.2 Pesar con precisión la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua destilada. Calentar suavemente la solución. El carbohidrato se puede agregar antes de la esterilización. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar 116-118°C durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilización del medio base SIN EL CARBOHIDRATO a 121°C durante 15 min, enfriar el medio base a ±45°C y agregar la solución del carbohidrato esterilizada por filtración en membrana. Distribuir en tubos estériles. Conservar en refrigeración (4-10°C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubación. Principio de acción Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un carbohidrato específico en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible. La fermentación es un proceso anaeróbio de oxidación-reducción, en el cual un sustrato orgánico actúa como el aceptor final de electrones. Los productos característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos acético y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f) ácido succínico a ácido propiónico y Co2, g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico y h) ácido butírico a alconol butílico. El indicador de pH utilizado para demostrar la fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayoría de los

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productos finales del metabolismo de carbohidratos son ácidos y generaran un vire del indicador a amarillo. Malonato, caldo. Extracto de levadura 1.0 g Sulfato de amonio 2.0 g Fosfato dipotásico 0.6 g Fosfato monopotásico 0.4 g Cloruro de sodio 2.0 g Malonato de sodio 3.0 g Glucosa 0.25 g Azul de bromotimol 0.025 g Agua desionizada 1,000 mL pH 6.7±0.2 Pesar la cantidad exacta como se indica en el rótulo. Rehidratar en el agua desionizada. Calentar la solución suavemente. Colocar a proximadamente 3.0 mL en tubos de 13 x 100. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Principio de acción Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono con la resultante alcalinidad. El malonato es un inhibidor enzimático competitivo de la enzima succinato deshidrogenada. El amonato se une a la enzima y ocupa los sitios activos de tal manera que la enzima no puede combinarse con el sustrato normal, el ácido succínico, cesando de esta manera la función normal del ciclo de Krebs. El resultado final es que los microorganismos no pueden crecer y reproducirse a menos que puedan fermentarn o utilizar el malonato como única fuente de carbono. Microorganismos que pueden realizar esta actividad metabólica pertenecen al grupo de Klebsiella-Enterobacter. mCPC, agar. Ver: Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar Métodos Estándar, agar Peptona de caseína 5.0 g Extracto de levadura 2.5 g Dextrosa 1.0 g Agar 15.0 g Agua destilada 1.0 L

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Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para disolver por completo y ajustar el pH a 7.0 0.2 a 25°C. Distribuir en tubos de ensayo con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite. Principio de acción La peptona de caseína proporciona aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los microorganismos como la fuente de carbono y energía. Es un medio general por lo que no contiene inhibidores. MTM, medio. Extracto de carne 3.0 g Peptona 10.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Agar 4.0 g Agua destilada 1.0 L Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos y ajustar el pH final a 7,4 ± 0,2 con HCl 0.1 N o NaOH 0.1 N. Nitratos, caldo. Nitrato de potasio 1.0 g Cloruro de sodio 0.5 g Peptona 2.0 g Agua destilada 1.0 L Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolución completa. Verter en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 minutos. Principio de acción En el presente medio se pretende poner de manifiesto, si el microorganismo tiene reductasas, para lo cual se utiliza como sustrato la sal de nitrato, en caso afirmativo, este sustrato se puede reducir a nitritos (se pueden detectar por una reacciòn de diazoaciòn y copulaciòn) o bien llegar a nitrògeno libre, que se detecta por burbujas en el medio.

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Oxford, medio base (OXA). Base de agar Columbia 39,0 g Esculina 1,0 g Citrato férrico amónico 0,5 g Cloruro de litio 15,0 g Agua 1.0 L Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullición hasta disolución completa. Posteriormente esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos. Enfriar el medio base a 50ºC y en condiciones asépticas agregar los siguientes suplementos: Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos: Cicloheximida 400 mg Sulfato de colistina 20 mg Acriflavina 5 mg Cefotetan 2 mg Fosfomicina 10 mg Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetán y la fosfomicina en 10 mL de una mezcla 1:1 de etanol:agua. Esterilizar por filtración antes de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas Petri estériles. Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como máximo dos semanas. Principio de acción: La flora acompañante indeseable se inhibe con el cloruro de litio, acrilflavina, sulfato de colistina, cefotetán, cicloheximida y fosfomicina. L. monocytogenes degrada la esculina presente en el medio de cultivo, dando esculetina, con formación de hierro (III), que producen compuestos complejos negros, que luego tiñen de negro las colonias de L. monocytogenes.

Papa dextrosa, agar. Infusión de papa 200.0 g Dextrosa 20.0 g Agar 15.0 g Agua destilada 1.0 L Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectación de los polvos, para evitar la formación de grumos que son difíciles de disgregar, calentar el medio hasta ebullición y finalmente esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio de cultivo en baño de agua hasta 45°C ± 1°C, después acidificar a un pH de 3.5±0.1, con ácido tartárico al 10% previamente esterilizado (1.4 mL de ácido tartárico por cada 100 mL de medio de cultivo).

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Después de adicionar el ácido tartárico al medio de cultivo, medir el pH con un potenciómetro. Principio de acción A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusión de papa, se observa que éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que de otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del ácido. Púrpura de bromocresol para fermentación de carbohidratos, caldo. Proteosa peptona No. 3 10.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Extracto de carne 1.0 g Púrpura de bromocresol 0.02 g Agua destilada 1.0 L Calentar si es necesario para disolver los ingredientes. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 ± 1°C. El pH final debe ser de 6,8 ± 0,2. Posteriormente agregar la solución del carbohidrato que se desee, previamente esterilizada por filtración, para obtener una concentración final de 0,5 %. Principio de acción Este medio sirve para observar la fermentaciòn de azùcares con producciòn de acidez. Nota: Los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden usarse como alternativa para las pruebas bioquímicas convencionales. RM-VP, caldo (prueba de rojo de metilo y Voges Proskauer).

Peptona tamponada 7.0 g

Glucosa 5.0 g

K2HPO4 5.0 g

Agua destilada 1000.0 mL

Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario, distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de ensayo de 16x150 mm y esterilizar a 121°C por 15 minutos. El pH final debe ser de 6,9 ± 0,2.

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Principio de acción La glucosa es el principal sustrato utilizado por los microorganismos para la obtención de energía. Los productos finales de la oxidación de la glucosa varían dependiendo de la ruta metabólica y de las enzimas presentes en la bacteria. Por lo tanto se describen a continuación dos vías: Prueba de Rojo de metilo La prueba de rojo de metilo se lleva a cabo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los ácidos orgánicos generados por la fermentación de la glucosa. El indicador de pH rojo de metilo a pH de 4.4 tiene un color rojo y a pH de 6.0 o superior, su color es amarillo. Aunque todos los microorganismos entéricos fermentan la glucosa y producen ácidos orgánicos, esta prueba se emplea para diferenciar Escherichia coli de Enterobacter aerogenes Estos microorganismos en las primeras h. de incubación producen ácidos orgánicos. Escherichia coli es capaz de estabilizar y mantener el pH ácido (4.0-4.4) hasta finalizar el periodo de incubación (24-48 h) debido a que produce más ácidos por lo que vence el sistema amortiguador. Por su parte, Enterobacter aerogenes es capaz de convertir estos ácidos en productos neutros como etanol y acetilmetilcarbinol (acetoina) por lo que el pH se eleva aproximadamente a 6. Prueba de Voges-Proskauer Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos de generar como productos finales del metabolismo de la glucosa, compuestos neutros como el acetilmetilcarbinol (acetoina). La glucosa es metabolizada por algunas bacterias hasta ácido pirúvico, la descarboxilación de dos moléculas de este ácido producen la acetoina, que es un precursor del 2,3-butanodiol. Tanto la acetoina como el 2,3-butanodiol son compuestos neutros. En presencia de oxígeno atmosférico y álcali, la acetoina como el 2,3-butanodiol reaccionan con el alfa-naftol generando diacetilo este compuesto se condensa con la guanidina presente en el medio de cultivo generando un compuesto de color rojo o rosa (prueba positiva) en un tiempo aproximado de 15 minutos. Si la acetoina no esta presente los reactivos no cambian de color (prueba negativa)

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Salmonella y Shigella, agar (SS). Extracto de carne 5.0 g Polipeptona 5.0 g Lactosa 10.0 g Sales biliares 8.5 g Citrato de sodio deshidratado 8.5 g Tiosulfato de sodio pentahidratado 8.5 g Citrato férrico 1.0 g Agar 13.5 g Rojo neutro 0.025 g Verde brillante 0.330 mg Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en agua destilada estéril y calentar hasta disolución completa. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50°C y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado. Principio de acción El agar SS es un medio selectivo diferencial para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras patológicas, alimentos contaminados, etc. Los organismos coliformes, Gram-negativos y la microbiota acompañante son inhibidos por los componentes inhibitorios como el verde brillante, sales biliares. El tiosulfato en combinación con el fierro actúa como indicadores de la producción de ácido sulfhídrico, lo cual se evidencia por el oscurecimiento en el centro de las colonias. Las colonias de coliformes quedan señaladas por la demostración de la degradación de la lactosa a ácido, a cargo del indicador de pH rojo neutro, de tal forma que las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras, y las de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas. Sangre de carnero, agar Base de agar sangre 95.0 mL Sangre de carnero desfibrinada 5.0 mL Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 ± 2ºC y agregar asépticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 - 25°C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de 12 a 15 mL para la prueba de CAMP y de 15 a 20 mL para la prueba de hemólisis.

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Principio de acción Este medio detecta a los microorganismos que pueden lisar los eritrocitos, pudiendo diferenciar las hemòlisis alfa o beta. Selenito-cistina, caldo. Triptona o polipeptona 5.0 g Lactosa 4.0 g Fosfato sódico dibásico 10.0 g Selenito ácido de sodio 4.0 g L-cistina 0.01 g Agua destilada estéril 1.0 L pH final 25°C

7.0 0.2 Disolver los ingredientes en el agua destilada estéril. Distribuir en volúmenes de 10.0 (tubos de ensayo) o bien, 225.0 mL en (matraces) recipientes estériles, según se requiera. El caldo así preparado es transparente de color ladrillo. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación. Si se desea conservar el medio

por varios días, puede exponerse al calor en autoclave a 110 1°C durante 5 minutos tomando entonces un color salmón. Precaución: Descartar el medio preparado si se observan grandes cantidades de precipitado rojo debidas al selenito reducido. No se incube por más de 24 h. porque el efecto inhibitorio del selenito disminuye después de 6-12 h. de incubación. El biselenito de sodio es tóxico por inhalación o ingesta. Existe peligro de efectos acumulativos. Cuando se utilice no coma, beba o fume. Después del contacto con la piel, enjuague inmediatamente con abundante agua. En caso de ingestión accidental acuda al médico inmediatamente. Principio de acción El caldo selenito-cistina se utiliza como medio de enriquecimiento de Salmonella a partir de heces, alimentos y otros materiales. El selenito inhibe el crecimiento de bacterias coliformes y enterococos en las primeras 6-12 h. siguientes al inicio de la incubación. La toxicidad del selenito para ciertos microorganismos no es del todo clara, se sugiere que reacciona con los grupos sulfuro y sulfhidrilo de ciertos componentes celulares esenciales. Proteus y Pseudomonas parecen ser resistentes a sus efectos. La lactosa se adiciona como carbohidrato fermentable para prevenir un incremento en el pH durante la incubación ya que cualquier aumento en el pH puede reducir la actividad selectiva del selenito. El hecho de que Proteus y Pseudomonas, y naturalmente Salmonella, no fermenten la lactosa puede explicar que resistan la inhibición. El efecto de la cistina puede deberse a dos factores: 1) Su capacidad reductora, que disminuye la toxicidad microbiana del selenito y 2) Suministra compuestos azufrados adicionales primordiales para la bacteria, reduciendo de nuevo la actividad inhibitoria del selenito.

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Sulfuro Indol Movilidad, medio (SIM). Peptona de caseìna 20,0 g Peptona de carne 6,1 g Sulfato de hierro y amonio 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g Agar 3,5 g Agua 1.0 L Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 minutos. El pH final deberà estar en 7,3 ± 0,2. Principio de acción El presente medio pone de manifiesto: a) si el microorganismo es móvil, esto es que presente flagelos, lo cual se observa si después de incubar existe desarrollo más allá de donde pasó el asa microbiológica al inocular al medio, b) si el microorganismo es capaz de reducir el tiosulfato hasta ácido sulfhídrico, que al estar este último en presencia de sales de hierro, se forma el sulfuro ferroso que es de color negro y c) si el microorganismo es capaz de desdoblar el triptofano que se encuentra en las peptonas, hasta formar el indol, esto implica la eliminación del grupo alquilo, que está constituido por un aminoácido, transformándose esta fracción a ácido pirúvico y amoníaco, gracias a la presencia de la triptofanasa. Sodio lauril sulfato de, caldo. Ver: Lauril sulfato de sodio, caldo. Soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura, agar (ASTEL). (Listeria). Agar soya tripticaseìna 40,0 g Extracto de levadura 6,0 g Agua 1,0 L Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 minutos, el pH final serà de 7,3 ± 0,2. Principio de acción Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc.

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Soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura, caldo (CSTEL. (Listeria). Caldo soya tripticaseìna 30,0 g Extracto de levadura 6,0 g Agua 1,0 L Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 minutos. El pH final de la solución debe ser 7,3 ± 0,2. Principio de acción Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. Soya tripticaseína, caldo / Soya tripticaséina, agar. Tripticasa o triptosa 17.0 g Fitona 3.0 g Glucosa 2.5 g Cloruro de sodio 2.5 g Agar bacteriológico 15.0 g Agua destilada 1.0 L Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa. Distribuir porciones de 225.0 mL dentro de matraces de 500

mL y esterilizar en autoclave a 121 1°C durante 15 minutos. En caso de requerirse en cajas de Petri enfriar el agar a 45°C y verter en condiciones de

asepsia. El pH final debe ser de 7.3 0.2. Principio de acción Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. El caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el preenriquecimiento de Salmonella. Soya tripticaseína estéril adicionado con sulfito de potasio, caldo. Caldo soya tripticasa 1.0 L Sulfito de potasio 5.0 g

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Adicionar al caldo soya tripticaseína el sulfito de potasio por cada 1.0 L de medio, de tal forma que la concentración final del sulfito de potasio sea 0.5%. Esterilizar a

121 1°C por 15 minutos. Principio de acción Este medio es altamente nutritivo y versátil, se recomienda para uso en general. Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. El caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el preenriquecimiento de Salmonella. El sulfito de potasio actúa como un agente selectivo para inhibir el crecimiento de coliformes, mientras que permiten el desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre fungen como sustrato para la producción de ácido sulfhídrico. SS, agar. Ver Salmonella Shigella, agar. Sulfito de Bismuto agar. Ver: Bismuto sulfito, agar. Surraco, caldo Sacarosa 0.8 g Urea 0.8 g Azul de timol 4 gotas Base caldo rojo de fenol 1.5 g Agua destilada 100 mL Disolver 1.5 g del medio base caldo rojo de fenol en 100 mL de agua destilada, agregar 0.8 g de sacarosa y 4 gotas de azul de timol SI. De esta solución se toman 10 mL en un matraz Erlenmayer de 10 mL. Esterilizar ambas soluciones en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 10 minutos (EVITAR SOBRECALENTAMIENTO). Esterilizar un equipo de microfiltración, agujas y jeringas. Una vez esterilizado el material y los médios, dejar enfriar. Al matraz con los 10 mL de caldo sacarosa adicionar en condiciones de esterilidad 0.8 g de urea, agitar para disolver completamente. En condiciones de esterilidad tomar el contenido del matraz con una jeringa de 10 mL y pasar por el filtro (ya preparado) al matraz que contiene los 90 mL restantes del medio. Agitar la mezcla estéril y distribuir volúmenes de 3.0 mL en tubos de ensayo de 13 X 100 mm esterilizados previamente. Principio de acción. Medio para la diferenciación de microorganismos, especialmente de la familia Enterobacteriaceae basándose en la producción de ureasa y/o de fermentar la sacarosa. El medio de cultivo está libre de carbohidratos fermentables, si el

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microorganismo en estudio es capaz de fermentar la sacarosa, se produce vire del indicador a amarillo. Los microorganismos que tienen la capacidad de utilizar la urea, forman amonio, produciendo reacción alcalina en el medio que se manifiesta por un color rosa fuerte por vire de los indicadores rojo de fenol y azul de timol. TCBS, agar. Ver: Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar. T1N1, agar (tripticasa y sal, agar). Triptona o tripticasa o digerido pancreático de caseína 10.0 g Cloruro de sodio 10.0 g Agar 20.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolución del agar. En caso de desearlo inclinado, distribuirlo en tubos y después de esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos, inclinarlos; el pH final deberá estar en 7.2±0.2. Para el llenado de placas, dejar enfriar el medio a una temperatura entre 45 y 50°C antes de llenar las cajas. Principio de acción Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentración del cloruro de sodio de esta fórmula por la deseada. Tripticasa y sal, caldo (T1N1, caldo). Triptona o tripticasa o digerido pancreático de caseina 10.0 g Cloruro de sodio 10.0 g Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en el agua y calentar si es necesario. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos; el pH final deberá estar en 7.2±0.2. Principio de acción Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentración del cloruro de sodio de esta fórmula por la deseada.

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Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar (TCBS). Peptona de caseína 5.0 g Peptona de carne 5.0 g Extracto de levadura 5.0 g Sacarosa 20.0 g Tiosulfato de sodio pentahidratado 10.0 g Citrato de sodio dihidratado 10.0 g Colato de sodio 3.0 g Bilis de buey 5.0 g Cloruro de sodio 10.0 g Citrato férrico 1.0 g Azul de bromotimol 40.0 mg Azul de timol 40.0 mg Agar 15.0 g Agua destilada 1.0 L Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No esterilizar y ajustar el pH a 8.6±0.2 a 25°C; enfriar a 50°C y colocar el medio en cajas Petri. Dejar secar las placas entre 37 y 45°C antes de usarlas. Principio de acción La alta concentración de tiosulfato y citrato, así como la fuerte alcalinidad de este medio, inhiben el crecimiento de la familia Enterobacteriaceae. Las sales biliares y el colato de sodio suprimen primariamente a los enterococos. Cualquier bacteria coliforme que pudiera crecer, no puede metabolizar la sacarosa; solamente unas cuantas especies de Proteus, sacarosa positivas, pueden crecer para formar colonias amarillas, parecidas a las colonias de los vibrios. La mezcla de indicadores azul de timol y azul de bromotimol, cambian a color amarillo cuando hay liberación de ácido, aún en este medio fuertemente alcalino. Se debe incubar a 35°C aeróbicamente durante 18 a 24 h. De acuerdo a las características metabólicas del microorganismo, se presentan las colonias en este medio, como se describen en el siguiente cuadro:

Apariencia de las colonias Microorganismos

Amarillas, planas, con diámetro entre 2 y 3 mm

V. cholerae, V. cholerae variedad El Tor

Pequeñas con centro azul verde Vibrio parahemolyticus

Grandes amarillas Vibrio alginolyticus

Azules Pseudomonas y Aeromonas

Muy pequeñas, transparentes Enterobacteriaceae y otros

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Tetrationato, caldo. Proteosa peptona o triptona 5.0 g Sales biliares 1.0 g Carbonato de calcio 10.0 g Tiosulfato de sodio pentahidratado 30.0 g Agua destilada 1.0 L Disolver los ingredientes en el agua destilada estéril y ajustar el pH a 7.0±0.1. Distribuir, agitando constantemente en porciones de 10.0 y 225.0 mL, en recipientes estériles, de acuerdo a las necesidades. Guardar en refrigeración. Antes de usar el medio agregar 2.0 mL de una solución de yodo-yoduro de potasio y 1.0 mL de solución de verde brillante al 0.1% por cada 100.0 mL de medio. El medio deberá utilizarse el mismo día. Principio de acción El caldo tetrationato se recomienda para el enriquecimiento selectivo de Salmonella typhi y otras especies de Salmonella, presentes en heces, ensilados, etc. Las sales biliares estimulan el crecimiento de las bacterias intestinales e inhiben junto con la solución de verde brillante especialmente a la microbiota Gram-positiva. La adición de la solución yodo-yoduro funciona para formar el tetrationato. Los organismos que poseen la enzima tetrationato reductasa se desarrollan bien en este medio, como por ejemplo Salmonella y Proteus, mientras que muchos microorganismos fecales como E. coli y Shigella son inhibidos. Miembros del grupo Proteus, reducen el tetrationato y en consecuencia disminuyen la selectividad. Esta desventaja se puede disminuir adicionando al

medio de cultivo 40.0 g de novobiocina por cada mililitro de medio antes de la adición del yodo-yoduro. Triptona al 1%, caldo (Prueba de indol). Triptona o tripticasa 10 g Agua destilada 1.0 L Disolver los ingredientes y si es necesario calentar. Distribuir porciones de 5 mL del medio, en tubos de ensaye de 16 x 150 mm. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. El pH final debe ser de 6.9 ± 0.2 Principio de acción La triptona es un compuesto rico en triptofano y por lo tanto se utiliza para la diferenciación de bacterias con base en la prueba de indol. El triptofano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias hasta indol, escatol e indolacétco.

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La enzima triptofanasa cataliza la reacción de desaminación del triptofano produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco. El ácido pirúvico puede ser catabolizado por las bacterias mediante el ciclo de Krebs hasta CO2 y agua; el amoníaco producido puede ser utilizado por el microorganismo para sintetizar nuevos aminoácidos. El indol puede ser detectado si se combina con el paradimetilaminobenzaldehido, el producto de esta combinación es un una quinona de color rojo. TSI, agar. Ver: hierro y tres azúcares, agar. Urea, caldo. Fosfato monopotásico 9.1 g Fosfato disódico 9.5 g Extracto de levadura 0.1 g Urea de alta pureza (20%) 20.0 g Rojo fenol 0.01 g Agua desionizada 1,000 mL pH 6.8 Pesar la cantidad con precisión según las directivas del rótulo. Rehidratar con el agua desionizada. No calentar la solución, con el calor la urea se descompone. Esterilizar el resto de los componentes del medio (medio base) a 121°C durante 15 minutos y enfriar. Esterilizar la urea por filtración en membrana y agregar al medio base ya estéril y frío. De manera aséptica distribuír aproximadamente 3.0 mL en tubos de 13 x 100 con tapón de rosca. Principio de acción El sustrato urea, a menudo se designa como una carbamida. Todas las amidas son hidrolizadas con facilidad. La urea es hidrolizada por una enzima específica, la ureasa (o urea amidohidrolasa), para dar dos moléculas de amoniaco. En solución, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto final. La ureasa es una enzima constitutiva microbiana importante relacionada con la descomposición de compuestos orgánicos, clasificada como una amidasa. La ureasa actúa en los compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto en aquellos que contienen puestes peptídicos. El indicador rojo de fenol virará a un colo rosa-rojo intenso cuando la prueba sea positiva.

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Urea rápido, caldo. Extracto de levadura 0.1 g Urea 20.0 g Fosfato monopotásico 0.091 g Fosfato disódico 0.095 g Rojo fenol 0.01 g Agua desionizada 1,000 mL pH 6.9 Esterilizar por filtración utilizando una membrana de 0.45 μm. Fraccionar en condiciones asépticas 3.0 mL en tubos de 13 x 100 con tapón de rosca estériles. Principio de acción Ver caldo urea. Para la prueba rápida de la urea el indicador virará a color cereza (púrpura rojizo), en caso de ser positiva. Urea y sacarosa, caldo. Ver: Surraco, caldo. Vassiliadis-Rappaport, caldo. Solución A Triptona 5.0 g Cloruro de sodio 8.0 g Fosfato monobásico de potasio 1.6 g Agua destilada 1.0 L

Disolver los componentes en el agua destilada por calentamiento a 70°C. Solución B Cloruro de magnesio hexahidratado 400.0 g Agua destilada 1.0 L Disolver el cloruro de magnesio en el agua destilada. Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un envase recientemente abierto, de tal modo que la concentración de la solución sea de 0.4 g/mL. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. Solución C Oxalato de verde de malaquita 0.4 g Agua destilada 100.0 mL

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Disolver el oxalato de verde de malaquita en el agua destilada. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. Preparación del medio completo Solución A 1000.0 mL Solución B 100.0 mL Solución C 10.0 mL Preparar el medio completo con las proporciones descritas para cada una de las soluciones. Distribuir antes de usar dentro de tubos estériles en cantidades de 10.0 mL. Esterilizar a 115°C durante 15 min. Ajustar el pH si es necesario para que al final de la esterilización sea de 5.2. Almacenar en refrigeración. Principio de acción Este medio se recomienda para el enriquecimiento selectivo durante el aislamiento de Salmonella de alimentos y muestras ambientales. Puede también utilizarse para aislar Salmonella de heces humanas sin el preenriquecimiento utilizando una cantidad de inóculo pequeña. La formulación se desarrolló denotando cuatro características que posee Salmonella cuando se compara con la familia Enterobacteriaceae: 1. Habilidad para sobrevivir a presiones osmóticas relativamente altas 2. Habilidad para multiplicarse a valores de pH relativamente bajos 3. Resistencia ligeramente mayor al verde de malaquita 4. Requerimientos nutricionales relativamente menos estrictos Puede utilizarse novobiocina para inhibir el crecimiento de Proteus. Verde brillante, agar. Extracto de levadura 3.0 g Polipeptona (proteosa peptona No. 3) 10.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Lactosa 10.0 g Sacarosa 10.0 g Rojo de fenol 0.08 g Agar 20.0 g Verde brillante 0.0125 g Agua destilada 1.0 L Suspender los ingredientes en el agua destilada y calentar a ebullición, hasta

disolución completa. Ajustar el pH a 6.9 0.2. Esterilizar en autoclave a 121 1°C durante 15 minutos. Enfriar el medio a 50°C y distribuirlo en cajas de Petri estériles. El aspecto del medio es oscuro color marrón.

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Principio de acción El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce por el viraje a amarillo del rojo de fenol, que actúa como indicador de pH. En ambiente alcalino presenta color rojo intenso. La microbiota acompañante Gram-positiva, así como Salmonella typhi y Shigella resultan muy reprimidas por la presencia del verde brillante. Puesto que Salmonella no puede degradar ni la lactosa ni la sacarosa, el contenido en sacarosa permite el reconocimiento de la microbiota acompañante lactosa-positiva débil o lactosa negativa pero sacarosa-positiva. Para la inhibición de Proteus se recomienda la adición de desoxicolato de sodio al 0.2%. La adición de sulfonamidas mejora el aislamiento de Salmonella. Adicionar 1.0 g de sulfonamida o 0.8 g de sulfadiazina por cada litro de medio y esterilizar en la forma habitual. Verde brillante bilis al 2 % lactosa, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Xilosa lisina desoxicolato, agar (XLD). Xilosa 3.75 g L-lisina 5.0 g Lactosa 7.5 g Sacarosa 7.5 g Cloruro de sodio 5.0 g Extracto de levadura 3.0 g Rojo de fenol 0.08 g Agar 15.0 g Desoxicolato de sodio 2.5 g Citrato férrico amoniacal 0.8 g Tiosulfato de sodio 6.8 g Agua destilada 1.0 L

0.2 Suspender los ingredientes en el agua destilada, y calentar en baño de agua a 55°C, agitando frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH a 6.9

0.2. Enfriar a 50°C y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitación, la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias sueles ser muy pequeñas. Principio de acción Este es un medio selectivo ideal para el aislamiento e identificación presuntiva de Salmonella y Shigella. Basado en la fermentación de la xilosa, la descarboxilación de la lisina y la producción de ácido sulfhídrico para la diferenciación inicial entre Shigella y Salmonella de otras bacterias no patógenas. La Salmonella es reductora de las sales de azufre como el tiosulfato, cuyo producto final es el ácido sulfhídrico, que en presencia de sales de hierro forma el sulfuro ferroso, que es un

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compuesto de color negro. La fermentación rápida de la xilosa es casi universal entre las bacterias entéricas excepto para los miembros de los géneros Shigella, Providencia y Edwardsiella. La xilosa se incluye al medio de tal forma que las especies del género Shigella pueden identificarse por una reacción negativa. Las especies de Salmonella se diferencian de los fermentadores no patogénicos por la incorporación de lisina al medio. Salmonella consume la xilosa y descarboxila la lisina, alterando el pH hacia la alcalinidad, simulando la reacción presentada por Shigella. Sin embargo, la presencia de los géneros Salmonella y Edwardsiella se diferencia de las de Shigella por un indicador de la producción de ácido sulfhídrico. Por otra parte, la gran concentración de ácido producido por la fermentación de la lactosa y sacarosa, evita que los coliformes lisin descarboxilasa-positivos reviertan el pH a un valor alcalino. Los microorganismos no productores de ácido sulfhídrico no descarboxilan la lisina. El nivel de acidez evita el oscurecimiento de estos microorganismos hasta después de 18-24 h. de incubación. El desoxicolato de sodio se incorpora al medio como un inhibidor de coliformes sin disminuir el desarrollo de Shigella y Salmonella.

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DILUYENTES, SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES. Azul de toluidina, solución 0.1M. Azul de toluidina 3.05 g Agua destilada 100.0 mL En un matraz aforado de 100.0 mL disolver el azul de toluidina y aforar a volumen con el agua. Calcio cloruro, solución 0.01M. Cloruro de calcio anhidro (peso molecular 110.99) 1.199 g Agua destilada 1.0 L Disolver el cloruro de calcio en agua y llevar a un litro. Etanol 70 %. Alochol etílico absoluto

70.0 mL

Agua destilada 100.0 mL Solución de desoxicolato de sodio al 0,5% en agua destilada estéril. Desoxicolato de sodio 0,5 g Agua destilada estéril 99,5 mL Disolver el desoxicolato de sodio en agua destilada estéril. Solución reguladora de Fosfatos pH 7.2, (solución concentrada). Fosfato monobásico de potasio 34.0 g Agua destilada 1.0 L Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2, con solución de hidróxido de sodio 1N, aforar con agua a un litro. Esterilizar la solución a 121°C±1.0°C y conservar en refrigeración. Solución de trabajo: Tomar 1.25 mL de la solución anterior (solución concentrada) y transferirlos a un matraz volumétrico de un litro, aforando con agua; después de distribuir en matraces o tubos, los volúmenes especificados en

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cada monografía, se debe esterilizar a 121°C±1.0°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes finales y el pH, deben ser iguales a los iniciales. Reactivo de Kovac’s.

p-dimetilaminobenzaldehído 5 g

Alcohol amílico (normal) 75 mL

HCI concentrado 25 mL

Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal y adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4°C. Para la prueba de indol: Adicionar de 0,2 a 0,3 mL del reactivo anterior, a 5 mL del cultivo de bacterias en caldo triptona. Destapar el tubo e inclinarlo para permitir la entrada de una mayor cantidad de oxígeno ambiental que ayude a la reacción. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. Principio de acción El triptofano es un aminoácido, que por acción de la triptofanasa lo degrada en indol, escatol y ácido indolacético . Un intermediario importante es el ácido indolpirúvico, que al desaminarse forma el indol. En caso de que se descarboxile el ácido indolacètico, se forma el escatol Prueba del Ortonitrofenil galactósido (ONPG). Reactivos Buffer de fosfato de sodio, 1M, pH 7.

o-nitrofenil- -galactosido (ONPG), 0,75 M Solución fisiológica Tolueno Realizar la prueba a partir de agar-hierro de Kligler (KIA) ó agar triple azúcar hierro (TSI). Emulsificar un asa cargada de desarrollo bacteriano con 0,5 mL de solución fisiológica hasta producir una suspensión abundante. Añadir a dicha suspensión una gota de tolueno y mezclar enérgicamente unos segundos para liberar la enzima de las células bacterianas. Añadir a la suspensión igual cantidad de solución buffer de ONPG y colocar la mezcla en baño de agua a 37ºC. Interpretación. La velocidad de hidrólisis del ONPG a ortonitrofenol puede ser rápida en algunos organismos, produciéndose una reacción que se visualiza por la aparición de un color amarillo en 5 a 10 minutos. La mayoría de las pruebas son

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positivas en una hora, sin embargo, las reacciones no se deben interpretar como negativas antes de las 24 horas de incubación. El color amarillo indica que el organismo ha producido ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por acción de la

-galactosidasa.

Principio de acción El ortonitrofenil galactósido (ONPG) es estructuralmente similar a la lactosa, salvo que la glucosa ha sido substituida por el ortonitrofenil.

Por acción de la -galactosidasa, el ONPG se hidroliza en dos residuos, galactosa y ortonitrofenol. El ONPG es un compuesto incoloro mientras que el ortonitrofenol es amarillo, lo cual es una evidencia de la hidrólisis.

Las bacterias fermentadoras de lactosa poseen dos enzimas, permeasa y -galactosidasa, requeridas para la producción de ácido a partir de la fermentación de lactosa. La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa penetre en la

célula bacteriana, donde la -galactosidasa puede romper la unión galactósido, produciendo glucosa y galactosa. Los no fermentadores de lactosa carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir ácido a partir de lactosa. Algunas especies bacterianas aparecen como no fermentadoras de lactosa pues carecen de

permeasa pero si tienen -galactosidasa y dan una prueba de ONPG positiva. Los llamados fermentadores tardíos de lactosa pueden demorar en producir ácido a partir de la lactosa debido a una lenta actividad de permeasa. En estos casos una prueba de ONPG positiva puede proveer una identificación rápida de los fermentadores tardíos.

Reactivo de oxidasa.

N-Tetrametil-p-Fenilendiamina 0.5 g Agua destilada 100 mL

Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días. Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii). Interpretación. La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto.

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Principio de acción Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria aerobia, tranfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba de citocromo oxidasa utiliza el diclorhidrato de Tetrametil-p-Fenilendiamina, que acúa como aceptor artifical de electrones, sustituyendo al oxígeno. La p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol. Plasma de Conejo.

Emplear plasma de conejo liofilizado rehidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticoagulante que se debe de utilizar para obtener el plasma es ácido etilendiaminotetracético (EDTA) al 0.1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado, diluir con agua estéril en proporción 1:3. Puede utilizarse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse plasma de sangre citratada. Principio de acción El plasma en presencia de la enzima coagulasa bacteriana, forma un coágulo de fibrina. El mecanismo esta dado porque la protrombina en presencia de sales de calcio y la enzima trombocinasa (tromboplastina), forman la trombina y ésta última al encontrarse frente al fibrinógeno, forma un coágulo de fibrina. La técnica para determinar la coagulasa ligada o factor de agregación, se realiza en un portaobjetos. Es responsable de la absorción del fibrinógeno, el cual precipita sobre los estafilococos, propiciando la agregación de estos microorganismos, observándose una aglutinación celular. En este caso, el factor de agregación, transforma el fibrinógeno en fibrina de manera directa, no toman parte los factores plasmáticos, tampoco se inhibe por los anticuerpos contra la coagulasa libre. La prueba de la coagulasa en tubo, detecta tanto la coagulasa libre como la ligada; la coagulasa libre extracelular, reacciona con una sustancia denominada factor de reacción de la coagulación, que se abrevia CRF, (sustancia termoestable parecida a la trombina), formando un complejo, el cual transforma el fibrinógeno en fibrina, liberando péptidos. En este caso el CRF, reacciona con la coagulasa, sin necesitar iones de calcio para formar el coágulo.

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Rojo de metilo, reactivo.

Rojo de metilo 0.2 g

Etanol al 95 % 300 mL

Agua destilada 200 mL

Mantener el reactivo en refrigeración cuando no se utilice, el reactivo es estable de 2 a 3 semanas. Prueba de Rojo de metilo Transferir 2.5 mL del cultivo a probar con 48 h. de incubación a un tubo de ensayo. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo e interpretar el color de inmediato: Una coloración roja indica producción de acidez por lo que la prueba es positiva. Salina isotónica, solución. Cloruro de sodio 8.5 g Agua destilada 1.0 L Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C±1.0°C durante 15 minutos. Tartárico ácido al 10%. Ácido tartárico 10.0 g Agua destilada 100.0 mL Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121°C durante 15 minutos, o bien por filtración a través de una membrana de 0.45 µm. Tris-(hidroximetilaminometano), solución amortiguadora 0.05M. Tris-hidroximetilaminometano, (peso molecular 121.1), pH 9.0 6.055 g Agua destilada 100.0 mL Disolver el Tris-(hidroximetilaminometano) en un matraz volumétrico de 100.0 mL y llevar a volumen con el agua.

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Voges-Proskauer, reactivos (VP). VP 1

alfa-naftol 5 g

Alcohol absoluto 100 g

VP 2

Hidróxido de potasio 40.0 g

Agua destilada cbp 100 mL

Prueba de Voges-Proskauer (VP): Transferir 1 mL del cultivo a probar, con 48 h. de incubación, a un tubo de ensayo. Después adicionar 0,6 mL de la solución VP 1 y 0,2 mL de la solución VP 2. Agitar después de la adición de cada solución. Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. Dejar a temperatura ambiente y leer los resultados después de 4 h. de adicionados los reactivos. El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva. Nitritos, reactivos para la determinación de. Reactivo A Alfa-naftilamina 0,5 g Àcido acètico 5N 100,0 mL Reactivo B Àcido sulfanìlico 1,0 g Àcido acètico 5N 125,0 mL Reactivo C Alfa-naftol 1,0 g Àcido acètico 5N 200,0 mL Solución de sulfato de cadmio al 20% Colocar granallas de zinc en solución de sulfato de cadmio al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de cadmio, adicionando ácido clorhídrico 1N.

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TINCIONES

Gram

Alcohol-acetona Etanol (95%) 700,0 mL Acetona 300,0 mL Mezclar perfectamente ambos líquidos. Cristal violeta Solución A Cristal violeta 2.0 g Etanol (95%) 20,0 mL Disolver el cristal violeta en el etanol. Solución B Oxalato de amonio 0.8 g Agua 80.0 mL Disolver el oxalato de amonio en el agua. Después de preparar las soluciones A y B, verter una en la otra y agitar hasta que se mezclen perfectamente. Solución de Yodo Yodo 1,0 g Yoduro de potasio 2,0 g Agua 300,0 mL Triturar finamente el yodo y el yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en una campana de extracción. Añadir una pequeña cantidad de agua para lavar el mortero, agregar el resto del agua y agitar. Guardar la soluciòn en envases de color ambar. Nota: ¡Evitar el contacto de los reactivos con la piel!

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Solución de Safranina Safranina 0,25 g Etanol (95%) 10,0 mL Agua 100,0 mL Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solución con papel filtro. Técnica de la tinción de Gram: 1. Colocar sobre un porta-objetos una gota de agua y la colonia que se desea

teñir, fijando a calor moderado la preparación. En caso de utilizar un cultivo líquido, omitir la gota de agua y colocar directamente sobre un porta-objetos una gota del cultivo líquido.

2. Adicionar cristal violeta a la preparación y dejarlo durante un minuto 3. Lavar con agua (usar de preferencia una piceta) y dejar escurrir 4. Cubrir la preparación el lugol (solución yodo-yodurada), y dejarlo actuar

durante un minuto. 5. Lavar con agua y decolorar con etanol al 95%, hasta que deje de salir

colorante, (aproximadamente 30 segundos). 6. Inmediatamente después enjuagar con agua y escurrir. 7. Aplicar el colorante de contraste (safranina), esperar durante 30 segundos y 8. Enjuagar con agua, escurrir y dejar secar, para posteriormente hacer la

observación microscópica.

Impronta Húmeda Lactofenol azul algodón Agua destilada 20.0 mL Cristales de fenol QP 20.0 g Ácido láctico 20.0 mL Glicerina 20.0 mL Azul algodón 0.05 g Disolver el fenol en el agua, agregar el ácido y la glicerina y calentar a 70°C y adicionar el colorante. Filtrar. Conservar en frascos de vidrio ámbar perfectamente tapados.

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Técnica de la impronta húmeda para observación de hongos. 1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodón sobre un portaobjetos 2. Utilizando técnica aséptica y con asa micológica tomar una muestra del hongo

(desarrollado sobre la caja de Petri), tratando de no romper las estructuras. 3. Si se tiene un cultivo puro, utilizar un bisturí estéril y cortar una porción muy

delgada del agar en el que se desarrolló el hongo, transferirlo al portaobjetos y calentarlo suavemente para fundir el agar, de esta manera no se rompen las estructuras y se asegura una buena observación.

4. Cubrir la preparación, colocarla en la platina del microscopio. 5. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para

mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X. 6. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las características

observadas. Técnica de la impronta húmeda para observación de hongos (DIUREX) 1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodón sobre un portaobjetos 2. Colocar en el último tercio del asa micológica un pedacito de diúrex de 1.5 cm

de largo, enrollándolo ligeramente. 3. En condiciones de asepsia, destapar la caja de Petri que contiene el cultivo del

hongo, introducir el asa con el diúrex y presionar ligeramente sobre una fracción de la colonia, tratando de no romper las estructuras.

4. Depositar la muestra en el portaobjetos que contiene el colorante, extender el diúrex y colocar encima un portaobjetos.

5. Colocar la preparación en la platina del microscopio. 6. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para

mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X. 7. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las características

observadas.

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ANEXO II

CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS PATÓGENAS DE Escherichia coli

Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países subdesarrollados y afecta principalmente a los niños. Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos. La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja. Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crónica. Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plásmido, ambas proteínas permiten su unión a los enterocitos y la destrucción de las microvellosidades intestinales. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar). Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC

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provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal. A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas características importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogénicas. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de mono verde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG. La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne