Obtención del colorante de la semilla de achiote (Bixa orellana) utilizando microorganismos celulolíticos

Achiote (Bixa orellana) seeds colorant extraction using cellulolytic microorganisms

Hernández González María1, Tirado Gallegos Juan Manuel1, Iliná Anna2, López Trujillo Ramiro1, Rebolloso Padilla Oscar Noé1, Ruelas Chacón Xóchitl1.

Resumen El presente estudio se llevo a cabo con la finalidad de extraer el colorante

bixina, presente en la semilla del achiote, ampliamente utilizado por la industria alimentaria, mediante un tratamiento que ofrezca además de buenos rendimientos, un producto libre de componentes tóxicos. El proceso se basa en el uso de microorganismos productores de celulasas, capaces de degradar la pared celular de las semillas donde se encuentra el pigmento para facilitar su liberación en un medio acuoso, obteniéndose rendimientos del 81%, mayores a los ofrecidos por extracción acuosa y ligeramente menores que los obtenidos con tratamiento ácido-base, cuestionados por la comunidad Europea, obteniéndose una pasta que muestra picos en el intervalo de los 1600 cm-1 representativo de los grupos carbonilos característicos de la estructura de la bixina.Palabras clave: Bixina, achiote, microorganismos celulolíticos.

Abstract

This assay was carried out to extract bixine, a colorant attached to achiote seeds, widely used in food industry, by a method which may offer besides good yields, a toxin free product. The process is based on the use of cellulolytic microorganisms able to degrade the seed’s cellular wall, where the pigment is attached, in order to facilitate the pigments liberation in a watery medium. 81% of the pigment was recovered, this percentage is higher than the one offered by the aqueous treatment and lower than the one offered by the acid-basic procedure, not well accepted by the European community. The final paste obtained showed peaks near to 1600 cm-1 representative of the carbonyl groups characteristic of the bixine structure.Key words: Bixine, achiote, cellulolytic microorganisms

Introducción

El color de los alimentos es un atributo que tiene mucho peso dentro del juicio del consumidor, este puede llegar a ser determinante para que un comestible sea aceptado o rechazado. (Badui, 1993). La industria alimentaria utiliza una serie de sustancias , mejor conocidas como aditivos; que tienen como función primordial impartir alguna coloración en particular o simplemente resaltar la que por la naturaleza tienen las materias primas o, en su caso, de los procesos tecnológicos en la coloración del producto final.

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Los aditivos que son utilizados como sustancias colorantes pueden ser

obtenidos por síntesis química en la industria (colorantes sintéticos) o provenir de fuentes naturales como los vegetales (colorantes o pigmentos naturales). En los últimos tiempos los colorantes sintéticos han sido cuestionados debido a sus efectos toxicológicos, inclusive algunos han sido eliminados de algunas legislaciones. Lo anterior aunado a la tendencia que tienen los consumidores, sobre todo en los países desarrollados, a consumir alimentos con un mínimo o nulo contenido de sustancias sintéticas; ello ha provocado que el uso de colorantes naturales vaya en aumento y sustituyendo a los sintéticos (Salas, 2003).

Para abastecer la creciente demanda de colorantes naturales sin problemas de legislación, se procede a la extracción de los pigmentos presentes en los tejidos vegetales o animales por medio de diferentes métodos, cada uno presenta sus limitantes y ventajas.

El colorante obtenido de las semillas de achiote (Bixa orellana), esta compuesto en su mayoría por el carotenoide bixina, que se utiliza en la industria láctica, cárnica, condimentaría, cosmética, farmacéutica, etc.; es un colorante natural exento de certificación. La extracción más rudimentaria se basa en un lavado con agua en ebullición y a escala industrial se ha implementado un proceso de extracción alcalino que es de fácil aplicación, pero que tiene el inconveniente de que el producto final contiene al máximo 30 a 40% de pigmentos (Vázquez, 2001).

Las posibilidades de incrementar el rendimiento y la pureza del colorante obtenido del achiote siguen siendo tema de estudio, se debe buscar un método de extracción de fácil aplicación, que eleve el grado de rendimiento, dando como resultado un extracto exento o con un mínimo de impurezas químicas, que disminuya los riesgos que implica al consumidor el uso de solventes o los tratamientos ácido – alcalinos.

Metodología experimental

Se trabajó con semillas enteras de achiote procedentes del estado de Chiapas, adquiridas en un mercado del municipio de Acala. Las semillas fueron mantenidas en envases plásticos y almacenados en condiciones de oscuridad.

Para los objetivos de la investigación, se procedió a realizar análisis de ceniza, humedad, grasa, fibra cruda, celulosa, lignina y bixina. Todas las determinaciones se realizaron en base a los métodos establecidos por la AOAC en 1980, excepto las de celulosa, lignina, y fibra que se hicieron de acuerdo a Vansoest, et al. (1968), y la de bixina se realizó de acuerdo a las normas oficiales mexicanas.

Una vez efectuada la caracterización de la semilla se procedió a seleccionar e identificar y seleccionar cepas fúngicas con probada actividad celulolítica.

Se evaluaron 7 cepas, las cuales fueron proporcionadas por la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Coahuila, en función a la producción de celulasas.

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1 Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, 2 Universidad Autónoma de Coahuila

Los hongos fueron viabilizados en un medio líquido y posteriormente inoculados en placas de agar carboximelticelulosa (CMC). Después de 7 días de incubación a 28ºC se evaluó su actividad sobre la celulosa aplicando la técnica del rojo congo de acuerdo con los lineamientos propuestos por Iliná (2002). De esta etapa se logró seleccionar tres cepas para su posterior caracterización.

La caracterización de las cepas se realizó observando los microorganismos tanto macroscópica como microscópicamente, mediante análisis de morfología, esporulación y asimilación de nutrientes. Todos los análisis fueron realizados de acuerdo a los lineamientos propuestos por Barnett et al., (1987) y Romero (1993).

Una vez seleccionadas e identificadas las cepas fúngicas se procedió a establecer un proceso fermentativo aeróbico en medio acuoso, el cual contenía 0.6 g. de NaNO3, 0.1 g. de KH2PO4, 0.1 g. de MgSO4, 0.1 g de KCl y 0.02 g. de K2SO4 y 2.0 g. de semillas de achiote, como única fuente de carbono en 200 ml de Buffer a pH de 5, 3 y 7 preparado de acuerdo a la técnica propuesta por Lynch et al (1987). Posteriormente se inoculó cada unidad experimental con un inóculo que contenía 2,000,000 de esporas/ml., y se mantuvo en baños María para el control de la temperatura a 25º, 30º y 35 ºC, durante 144 hrs. Durante este tiempo se monitoreó la formación de azúcares totales y reductores, los primeros se determinaron de acuerdo a los lineamientos propuestos por Dubois (1956) con fenol sulfúrico, los azúcares reductores se analizaron de acuerdo con Miller (1959).

Terminado el proceso de biocatálisis, cada sistema fue esterilizado en autoclave, para detener el crecimiento y actividad fúngica. Después del proceso de esterilización se recuperó el colorante mediante tratamientos en medio acuoso por calentamiento, prensado y filtrado, hasta obtener la mayor cantidad de colorante posible.

El material obtenido en las operaciones antes citadas, fue sometido a un proceso final de evaporación en horno a una temperatura entre 60-65ºC hasta la eliminación completa de la humedad residual. La determinación del rendimiento se realizó por análisis gravimétrico.

Los datos arrojados por el análisis gravimétrico fueron sometidos a un análisis de varianza factorial con p>0.05, esto, para determinar las condiciones que ofrecen una mayor liberación de colorante.

A fin de determinar la pureza del extracto recuperado, se procedió a aplicar un análisis por espectroscopia infrarroja (IR) a los extractos obtenidos, mediante la preparación de la pastilla de KBr con la muestra del colorante en polvo y se analiza en un espectrofotómetro Perkin – Elmer.

Resultados y discusión

Los resultados arrojados por el análisis químico efectuado a la semilla muestran 1.4% de bixina, 1.61% de humedad, 9.74% de celulosa, 3.76% de lignina, 16.9% de fibra cruda, 3.51% de cenizas y 4.52% de grasa, Se puede observar que el menor componente de la semilla utilizada en la presente investigación fue el agua, esto se traduce en un elevado contenido de materia seca que se caracteriza por su alto contenido en fibras, por lo cual la semilla pude

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funcionar en el proceso de Biocatálisis como una fuente de carbono caracterizada por fibras que pueden ser desdobladas por complejos enzimáticos presentes en organismos como los hongos.

Los resultados obtenidos aplicando la técnica del rojo congo, para seleccionar la cepa con mayor actividad celulolítica, fueron sometidos a un análisis de varianza con una p<0.05; esto con la finalidad de elegir con mayor seguridad cual o cuales microorganismo son los que más se adecuan a la investigación. Los resultados del análisis se reportan en el cuadro número 1, como las medias analizadas por la prueba de t-Student (p<0.05).

Cuadro 1. Resultados de rojo congo analizados mediante t-Student (p<0.05)

CEPA PROMEDIOS DE MÍNIMOS CUADRADOS

Cepa 7 A 3,90 cm.Cepa 5 B 3,40 cm.Cepa 2 B C 3,23 cm.Cepa 8 C D 3,10 cm.Cepa 1 C D 3,05 cm.Cepa 4 D 2,91 cm.Cepa 3 E 2,63 cm.Cepa 9 E 2,43 cm.

El análisis de medias permite concluir que la cepa con mayor producción de celulasas es la cepa 7, ya que en el análisis estadístico fue la mejor, existiendo diferencia significativa con el resto. Por otro lado, la cepa 5 y la cepa 2 resultaron estadísticamente iguales, presentando menor actividad que la cepa 7, pero mayor que el resto de las cepas.

Las cepas 7 y 5 fueron identificadas como genero Aspergillus ssp. y la 2 como una mezcla entre Aspergillus y Penicilium por lo cual solo las dos primeras fueron probadas en el proceso de biocatálisis.

Finalmente fue posible establecer que las mejores condiciones para degradar la pared celular de la semilla del achiote fue la interacción presentada entre la cepa 7 a pH 7 y temperatura de 35ºC, ya que así se manifestó en el monitoreo de azúcares el cual mostraba constante formación y consumo de los mismos a diferencia de las demás interacciones.

En la figura 1 se pueden observar los pesos de pasta de achiote obtenidos después de terminado el tiempo en cada tratamiento. Se observa que la cepa 7 ofrece los mayores rendimientos bajo todas las condiciones de trabajo.

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Efecto de los diferentes tratamientos

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

pH 3,25 ºC

pH 3,30 ºC

pH 3,35 ºC

pH 5,25 ºC

pH 5,30 ºC

pH 5,35 ºC

pH 7,25 ºC

pH 7,30 ºC

pH 7,35 ºC

Condiciones de pH y temperatura

Pas

ta o

bte

nid

a en

g

Cepa 7

Cepa 5

Cepa 1 (testigo)

Figura 1. Pasta colorante obtenida para cada tratamiento.De la misma manera que en el análisis de varianza, se observa que la

interacción que ofrece el mayor rendimiento es cepa 7, pH 7 y temperatura de 35ºC, presentando 1.2 g de extracto colorante, los cuales contienen 0.022 g de bixina total obtenidos a partir de una muestra de 2 g; por lo que se espera que de 100 g de semilla se obtengan 1.13 g de bixina lo que representa el 80.7 % de extracción ya que la semilla contiene 1.4 g de bixina por 100 g de semilla como se citó anteriormente.

En la figura 2 se muestra un espectro infrarrojo (IR) para la pasta colorante recuperada, destacándose un pico sobresaliente cercano a 1600 cm-1, el cual es representativo de los grupos carbonilos, así como un pico en el intervalo de los 1700 a 1880 cm-1 aproximadamente, representativo de los dobles enlaces presentes en las estructuras orgánicas, características de la bixina.

Figura 2 Espectro de Infrarrojo para pasta obtenida.

Conclusiones

En los resultados obtenidos se observó que el mayor constituyente de de la semilla de achiote (Bixa orellana) son las fibras, a las cuales se encuentra adherido el pigmento de interés.

De las cepas evaluadas, la que presentó mayor actividad celulolítca, de acuerdo a la técnica del rojo congo, fue la designada como 7, identificada como

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4000.0 3000 2000 1500 1000 600.0

25.0

30

40

50

60

70

80

90

100

105.2

cm-1

%T

m 'b' esporas

3271.00

2927.12

1974.96

1598.961373.24

1266.98

1048.10

879.51

825.88

772.05

715.39

Aspergillus, lo cual fue confirmado al monitorear la formación y consumo de azúcares totales y reductores presentando un comportamiento típico para este tipo de hongos excretando la enzima al medio para obtener carbohidratos simples y asimilarlos constantemente.

Fue posible establecer que las condiciones para el óptimo desarrollo fúngico, con su consecuente efectividad en la degradación de la materia en cuestión para facilitar la liberación del pigmento, fueron de pH 7 y temperatura de 35ºC, para la cepa 7 identificada como Aspergillus spp. Antes citado.

Comparando los procesos usando las otras cepas estudiadas y sin inóculo, el tratamiento con Aspergillus resultó un 30% mas efectivo que los antes mencionados.

Las condiciones antes citadas ofrecen un rendimiento de extracción de bixina de hasta un 80 % comparado a lo obtenido con agua, e inferior al reportado utilizando los métodos alcalinos, sin contener los residuos químicos tóxicos que se presentan en dicha extracción, cuestionados recientemente por la unión Europea.

Literatura citada

AOAC. 1980. Oficial Methods of Análisis of the Association of Official Alytical Chemists. Thirteenth edition. 353 p.

Badui, D. S. 1993. Química de los alimentos. Addison Wesley Longman de México, S. A. DE C. V. México D. F., México.

Dubois, M., Guilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. and Smith, F. 1956. “Colorimetric meted for determination of sugars and related substances”. Anal. Chem. 28:530.

Iliná A. 2002. Manual de Prácticas de crédito 1 Introducción a la Biotecnología U. A. de C. 38 p.Lynch, M. J. R., S. S. Mellor, D. L. Spare, D. P. Inwood, H. M. J. 1987. Métodos de Laboratorio. 2ª

ed. Vol 2. Ed. Nueva editorial interamericana. México, D. F. pp. 1446-1447.Salas, G. L. 2003. Educación Alimentaria, manual indispensable en educación para la salud. Ed.

Trillas. México, D. F. pp. 97.Vansoest, P. J. y Wine, R. H.1968. Determinación de fibra por el método ácido detergente/

determinación de lignina, celulosa y silicio por el método de permanganato. J. Anal. Chem. 51: 780 p

Vázquez, H. C. 2001. Estudio preliminar de la degradación de bixina en polvo en los diferentes tipos de empaques y temperaturas establecidas. Tesis ING. Instituto Tecnológico de Villahermosa. Villahermosa, Tabasco, México.

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