TRABAJO FIN DE MÁSTER

“PAPEL DEL DOMINIO ADAPTADOR SH2 DE C-SRC EN CÁNCER DE MAMA

TRIPLE NEGATIVO”

Máster en Análisis Sanitarios

Junio 2019

Centro en el que

se ha realizado Instituto de Investigaciones

Biomédicas Alberto Sols TUTOR/ES

Tutor externo (Instituto de investigaciones Biomédicas Alberto Sols)

Tutor académico (Universidad Complutense de Madrid)

Fdo: Jorge Martín Pérez

Fdo: Mª Jesús Oset Gasque

Javier Pecero Carbajo

ANEXO I: DECLARACIÓN DE NO PLAGIO

D./Dña. JAVIER PECERO CARBAJO con NIF 07256266-L, estudiante de

Máster en la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid

en el curso 2018-2019, como autor/a del trabajo de fin de máster titulado

“Papel del dominio adaptador SH2 de c-Src en cáncer de mama triple

negativo” y presentado para la obtención del título correspondiente, cuyo/s

tutor/ es/son: Jorge Martín Pérez (tutor externo) y Mª Jesús Oset Gasque

(tutora académica),

DECLARO QUE:

El trabajo de fin de máster que presento está elaborado por mí y es original. No copio, ni utilizo ideas, formulaciones, citas integrales e ilustraciones de cualquier obra, artículo, memoria, o documento (en versión impresa o electrónica), sin mencionar de forma clara y estricta su origen, tanto en el cuerpo del texto como en la bibliografía. Así mismo declaro que los datos son veraces y que no he hecho uso de información no autorizada de cualquier fuente escrita de otra persona o de cualquier otra fuente. De igual manera, soy plenamente consciente de que el hecho de no respetar estos extremos es objeto de sanciones universitarias y/o de otro orden.

En Madrid, a 18 de Junio de 2019

Fdo.: Javier Pecero Carbajo

Esta DECLARACIÓN debe ser insertada en primera página de todos los trabajos fin de máster conducentes a la obtención del Título.

MÁSTER EN ANÁLISIS SANITARIOS COMPROMISO DEONTOLÓGICO PARA LA ELABORACIÓN, REDACCIÓN

Y POSIBLE PUBLICACIÓN DEL TRABAJO DE FIN DE MÁSTER (TFM) CENTRO: Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC) ESTUDIANTE DE MÁSTER: Javier Pecero Carbajo TUTOR/ES DEL TFM: Jorge Martín Pérez (tutor externo) y MªJesús Oset Gasque (tutora académica) TÍTULO DEL TFM: Papel del dominio adaptador SH2 de c-Src en Cáncer de mama triple negativo FECHA DE PRIMERA MATRÍCULA: Julio 2018 FECHA DE SEGUNDA MATRÍCULA (en caso de producirse):

1. Objeto

El presente documento constituye un compromiso entre el estudiante matriculado en el Máster en Análisis Sanitarios y su Tutor/es y en el que se fijan las funciones de supervisión del citado trabajo de fin de máster (TFM), los derechos y obligaciones del estudiante y de su/s profesor/es tutor/es del TFM y en donde se especifican el procedimiento de resolución de potenciales conflictos, así como los aspectos relativos a los derechos de propiedad intelectual o industrial que se puedan generar durante el desarrollo de su TFM. 2. Colaboración mutua

El/los tutor/es del TFM y el autor del mismo, en el ámbito de las funciones que a cada uno corresponden, se comprometen a establecer unas condiciones de colaboración que permitan la realización de este trabajo y, finalmente, su defensa de acuerdo con los procedimientos y los plazos que estén establecidos al respecto en la normativa vigente.

3. Normativa

Los firmantes del presente compromiso declaran conocer la normativa vigente reguladora para la realización y defensa de los TFM y aceptan las disposiciones contenidas en la misma.

4. Obligaciones del estudiante de Máster

- Elaborar, consensuado con el/los Tutor/es del TFM un cronograma

detallado de trabajo que abarque el tiempo total de realización del

mismo hasta su lectura.

- Informar regularmente al Tutor/es del TFM de la evolución de su trabajo,

los problemas que se le planteen durante su desarrollo y los resultados

obtenidos.

- Seguir las indicaciones que, sobre la realización y seguimiento de las

actividades formativas y la labor de investigación, le hagan su tutor/es

del TFM.

- Velar por el correcto uso de las instalaciones y materiales que se le

faciliten por parte de la Universidad Complutense con el objeto de llevar

a cabo su actividad de trabajo, estudio e investigación.

5. Obligaciones del tutor/es del TFM

- Supervisar las actividades formativas que desarrolle el estudiante; así

como desempeñar todas las funciones que le sean propias, desde el

momento de la aceptación de la tutorización hasta su defensa pública.

- Facilitar al estudiante la orientación y el asesoramiento que necesite.

6. Buenas prácticas

El estudiante y el tutor/es del TFM se comprometen a seguir, en todo momento, prácticas de trabajo seguras, conforme a la legislación actual, incluida la adopción de medidas necesarias en materia de salud, seguridad y prevención de riesgos laborales. También se comprometen a evitar la copia total o parcial no autorizada de una obra ajena presentándola como propia tanto en el TFM como en las obras o los documentos literarios, científicos o artísticos que se generen como resultado del mismo. Para tal, el estudiante firmará la Declaración de No Plagio del ANEXO I, que será incluido como primera página de su TFM.

7. Procedimiento de resolución de conflictos académicos

En el caso de producirse algún conflicto derivado del incumplimiento de alguno de los extremos a los que se extiende el presente compromiso a lo lardo del desarrollo de su TFM, incluyéndose la posibilidad de modificación del nombramiento del tutor/es, la coordinación del máster buscará una solución consensuada que pueda ser aceptada por las partes en conflicto. En ningún caso el estudiante podrá cambiar de Tutor directamente sin informar a su antiguo Tutor y sin solicitarlo oficialmente a la Coordinación del Máster. En el caso de que el conflicto persista se gestionará según lo previsto en el SGIC de la memoria verificada.

8. Confidencialidad

El estudiante que desarrolla un TFM dentro de un Grupo de Investigación de la Universidad Complutense, o en una investigación propia del Tutor, que tenga ya una trayectoria demostrada, o utilizando datos de una empresa/organismo o entidad ajenos a la Universidad Complutense de Madrid, se compromete a mantener en secreto todos los datos e informaciones de carácter confidencial que el Tutor/es del TFM o de cualquier otro miembro del equipo investigador en que esté integrado le proporcionen así como a emplear la información obtenida, exclusivamente, en la realización de su TFM. Asimismo, el estudiante no revelará ni transferirá a terceros, ni siquiera en los casos de cambio en la tutela del TFM, información del trabajo, ni materiales producto de la investigación, propia o del grupo, en que haya participado sin haber obtenido, de forma expresa y por escrito, la autorización correspondiente del anterior Tutor del TFM. 9. Propiedad intelectual e industrial

Cuando la aportación pueda ser considerada original o sustancial el estudiante que ha elaborado el TFM será reconocido como cotitular de los derechos de propiedad intelectual o industrial que le pudieran corresponder de acuerdo con la legislación vigente. 10. Periodo de Vigencia

Este compromiso entrará en vigor en el momento de su firma y finalizará por alguno de los siguientes supuestos: - Cuando el estudiante haya defendido su TFM.

- Cuando el estudiante sea dado de baja en el Máster en el que fue

admitido.

- Cuando el estudiante haya presentado renuncia escrita a continuar su

TFM.

- En caso de incumplimiento de alguna de las clausulas previstas en el

presente documento o en la normativa reguladora de los Estudios de

Posgrado de la Universidad Complutense.

La superación académica por parte del estudiante no supone la pérdida de los derechos y obligaciones intelectuales que marque la Ley de Propiedad Intelectual para ambas partes, por lo que mantendrá los derechos de propiedad intelectual sobre su trabajo, pero seguirá obligado por el compromiso de confidencialidad respecto a los proyectos e información inédita del tutor.

Firmado en Madrid, a 18 de Junio de 2019

El estudiante de Máster, Fdo: Javier Pecero Carbajo

El Tutor externo, Fdo: Jorge Martín Pérez

La Tutora académica, Fdo: MªJesús Oset Gasque

SR. COORDINADOR DEL MÁSTER EN ANÁLISIS SANITARIOS

ÍNDICE

RESUMEN/ABSTRACT …………………………………………………………..1

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 2

1.1 Cáncer de mama triple negativo ............................................................... 2

1.2 Src: estructura y función ........................................................................... 2

1.3 Relación entre c-Src y cáncer ................................................................... 4

2. HIPÓTESIS .................................................................................................... 5

3. OBJETIVO ..................................................................................................... 5

4. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 5

4.1 Línea celular y modelo experimental ......................................................... 5

4.2 Anticuerpos utilizados ............................................................................... 6

4.3 Análisis de proteínas por Western blot ...................................................... 7

4.4 Ensayo de proliferación ............................................................................. 8

4.5 Ensayo de migración por cierre de herida ................................................. 8

4.6 Ensayo de invasividad .............................................................................. 8

4.7 Ensayo de estrés oxidativo ....................................................................... 9

4.8 Ensayo de crecimiento independiente de anclaje ..................................... 9

4.9 Tratamiento de datos ................................................................................ 9

5. RESULTADOS ............................................................................................... 9

5.1 Morfología y fenotipo celular. Efectos de sobreexpresión ......................... 9

5.2 Efecto sobre proliferación ....................................................................... 10

5.3 Efecto sobre migración ........................................................................... 11

5.4 Efecto sobre invasividad ......................................................................... 13

5.5 Efecto sobre estrés oxidativo .................................................................. 13

5.6 Efecto sobre crecimiento independiente de anclaje ................................ 14

5.7 Expresión de otros miembros de SFKs ................................................... 14

6. DISCUSIÓN ................................................................................................. 15

7. CONCLUSIONES ........................................................................................ 18

8. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... 18

1

PAPEL DEL DOMINIO ADAPTADOR SH2 DE C-SRC EN CÁNCER DE MAMA TRIPLE NEGATIVO

RESUMEN

c-Src se encuentra sobreexpresado y/o hiperactivado en un alto porcentaje de tumores humanos, entre los que se encuentra el cáncer de mama triple negativo (ER-

PR-, HER-), uno de los más agresivos. c-Src es la proteína prototípica de la familia de tirosinas quinasas no receptoras de Src (SFKs), que controla de forma fisiológica procesos como la supervivencia, migración, proliferación, invasión... por lo que no es de extrañar su implicación en el desarrollo de cáncer. c-Src cuenta con una estructura modular de la que forman parte los dominios adaptadores SH2 y SH3, los cuales no sólo juegan un papel importante en el control de la conformación y actividad de c-Src regulada por procesos de fosforilación, sino también en la formación de complejos de señalización a través de interacciones intermoleculares con otras proteínas. Para intentar evidenciar la relevancia del dominio adaptador SH2, en cáncer de mama triple negativo (valorando procesos celulares implicados en tumorogénesis) se utilizó la expresión condicional en MDA-MB-231 de la proteína mutante c-Src-T215W (cuyo dominio SH2 participa en interacciones intramoleculares, pero no en las intermoleculares). Los resultados demostraron que el dominio SH2 parece ejercer un papel fundamental en la producción de ROS, así como en la capacidad invasora de las células (y, por tanto, en el proceso metastásico) pero no parece ser importante en lo que a la vía de proliferación, migración ni crecimiento independiente de anclaje se refiere, lo cual puede deberse a la expresión prevalente en MDA-MB-231 de otros miembros de SFKs sobre c-Src, como Yes.

Palabras clave: cáncer de mama, triple negativo, c-Src, dominios adaptadores, SH2.

ABSTRACT

c-Src is overexpressed and/or hyperactivated in a high percentage of humans, among which is triple-negative breast cancer (ER-, PR-, HER-), one of the most aggressive subtype. c-Src is the prototypic protein of Src's family of non-receptor tyrosine kinases (SFKs), which physiologically controls the processes of life, migration, proliferation, invasion ... so it's no wonder its involvement in the development of cancer. c-Src has a modular structure of those that are part of the adapter domains SH2 and SH3, which not only play an important role in the control of the conformation and activity of c-Src regulated by phosphorylation processes, but also in the formation of signaling complexes through intermolecular interactions with other proteins. To try to demonstrate the importance of the SH2 adapter domain in triple breast cancer (evaluating cellular processes involved in tumorigenesis), it was used the conditional expression in MDA-MB-231 of the mutant protein c-Src-T215W (whose SH2 domain participates in intramolecular interactions, but not in intermolecular ones). The results demonstrate that the SH2 domain seems play a fundamental role in the production of ROS, as well as in the invasive capacity of the cells (and, therefore, in the metastatic process) but does not play a key role in the pathway of proliferation, migration and independent anchorage growth is concerned, which may be due to the prevalent expression of other members of SFK over c-Src in MDA-MB-231.

Key words: breast cancer, triple negative breast cancer, c-Src, adapter domains, SH2

2

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Cáncer de mama triple negativo

El cáncer de mama es, dentro del sexo femenino, el tumor más frecuentemente diagnosticado y el que mayor tasa de muerte provoca, seguido del cáncer colorrectal y de pulmón en incidencia, y en orden inverso en mortalidad (Bray et al. 2018; Ferlay et al. 2019). Durante 2018, se diagnosticaron en todo el mundo 2,1 millones de nuevos casos (Bray et al. 2018) y 32.825 de ellos en España, suponiendo esta cifra el 28,7% del total de nuevos casos de cáncer en mujeres de todas las edades en nuestro país (Global Cancer Observatory, 2019).

En términos generales, el cáncer de mama es uno de los tres tipos de cáncer más comunes en todo el mundo y bajo detección temprana es considerado potencialmente curable (Harbeck y Gnant, 2016). El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea que abarca numerosas entidades biológicas, asociadas cada una de ellas a unas características morfológicas e inmunohistoquímicas, comportamiento biológico y evolución clínica diferentes (Reis-Filho y Tutt, 2008; Chacón y Costanzo, 2010).

Actualmente, la clasificación más ampliamente aceptada distingue cuatro grupos principales: dos de ellos con receptores de hormonas positivos, denominados Luminal A (ER+,PR+, HER-) y B (ER+, PR+, HER+) (en función del bajo o alto grado de expresión de receptores de estrógenos y proliferación, respectivamente) y dos grupos con receptores de hormonas negativos: tumores HER2 (sobreexpresión) y tumores de tipo basal (cuyo perfil se asemeja a las células basales o mioepiteliales normales) (Chacón y Costanzo, 2010; Allison, 2012; Harbeck y Gnant, 2016). Dentro de este último grupo se puede enmarcar el cáncer de mama triple negativo, caracterizado por ausencia de expresión de receptores de hormonas (estrógenos y progesterona) y HER2 (Reis-Filho y Tutt, 2008).

El cáncer de mama triple negativo supone aproximadamente el 15% de todos los tipos de tumores mamarios y afecta a pacientes más jóvenes (menores de 50 años) y de forma más prevalente en África y América. Este subtipo presenta una mayor agresividad, asociada a mayor riesgo de recurrencia entre el primer y tercer año tras el diagnóstico, la mayoría de muertes ocurren durante los primeros cinco años de enfermedad y la supervivencia tras el inicio de metástasis es menor en estas pacientes al ser comparadas con enfermas de otros subtipos (Reis-Filho y Tutt, 2008; Chacón y Costanzo, 2010).

Debido a lo anteriormente expuesto, está claro que el interés en el cáncer de mama triple negativo se debe no sólo a su peor pronóstico, sino también a la falta de terapias efectivas para este grupo de pacientes cuya única opción actualmente es la quimioterapia (Chacón y Costanzo, 2010).

1.2 Src: estructura y función

c-Src es la proteína prototipo de la familia de tirosinas quinasas no receptoras de Src (SFKs) dentro de la cual se engloban nueve miembros: c-Src, Yes, Fyn, Yrk, Fgr, Lyn, Hck, Lck, Blk; siendo los tres primeros aquellos que se expresan de forma ubicua en tejidos de humanos (Guarino, 2010; Espada y Martín-Pérez, 2017).

Los miembros de la SFKs se activan por la estimulación una amplia variedad de receptores para factores de crecimiento, citoquinas, hormonas esteroideas, acoplados a proteínas G…, catalizando la transferencia de grupos fosfato del ATP a residuos

3

específicos de tirosinas en proteínas sustrato que contribuyen a diversificar las señales que llegan a la célula, originando la formación de una amplia red de respuestas (Guarino, 2010; Espada y Martín-Pérez, 2017). Consecuentemente, están implicadas en la regulación de múltiples vías de señalización que controlan de forma fisiológica procesos celulares claves como la supervivencia celular, migración, diferenciación, proliferación, adhesión... por lo que no es de extrañar su implicación en el desarrollo de cáncer, proceso en el que por definición todas esas funciones se encuentran alteradas (Guarino, 2010; Elsberger, 2013; Espada y Martín-Pérez, 2017).

Los miembros de SFKs tienen una estructura modular que los caracteriza, en concreto c-Src es una proteína de 60 kDa compuesta por varios dominios funcionales: en la región N-terminal posee una secuencia conservada que se asocia con un residuo de ácido mirístico que facilita su unión a la cara interna membrana plasmática, esta secuencia es seguida de un dominio único (U o SH4), dominio adaptador SH3 con alta afinidad por secuencias ricas en prolina, dominio SH2 que interactúa específicamente con residuos de tirosinas fosforiladas (estos dos dominios facilitan interacciones intra e intermoleculares que promueven la diversificación de la señal intracelular), secuencia de enlace (involucrada en la unión intramolecular con dominio SH3), dominio catalítico con actividad tirosina quinasa KD o SH1 que contiene el residuo de lisina K295 (necesario para la unión de ATP) y el residuo de tirosina Y416, cuya autofosforilación supone la activación catalítica máxima. Además, c-Src contiene también una cola reguladora en el extremo carboxilo terminal que contiene el residuo de tirosina Y527 (Guarino, 2010; Roskoski, 2015; Espada y Martín-Pérez, 2017).

Imagen 1. Conformación estructural y nomenclatura aviar de c-Src. (Imagen modificada de Espada y Martín-Pérez, 2017).

La conformación y actividad de c-Src está regulada por procesos de fosforilación en la que los dominios adaptadores SH2 y SH3 juegan un papel esencial. La fosforilación en el residuo de tirosina Y527 de la cola reguladora por Csk (principal regulador

4

negativo de c-Src) favorece la interacción molecular con el dominio SH2, facilitando a su vez que el dominio SH3 interactúe con el residuo de prolina de la secuencia de enlace, otorgando a la proteína en su conjunto una conformación inactiva, e impidiendo por tanto la función de los dominios adaptadores (que no pueden interaccionar con otras proteínas) y del catalítico (se enmascara Y416 impidiendo su activación por autofosforilación) (Guarino, 2010; Espada y Martín-Pérez, 2017).

En condiciones fisiológicas básicas c-Src se mantiene inactivo a través de las interacciones inhibitorias intramoleculares SH2/SH3, y la activación (asociada con el movimiento de esta proteína a la membrana celular) ocurre ante señales capaces de interrumpir esas interacciones negativas como la desfosforilación de Y527 (Elsberger, 2013). Por tanto, la actividad de c-Src se relaciona con tres factores: la disponibilidad de los dominios SH2 y SH3 para interactuar con dominios de unión de otras proteínas, la fosforilación/desfosforilación de la cola reguladora C-terminal y la fosforilación/desfosforilación de Y416 (Guarino, 2010; Espada y Martín-Pérez, 2017).

A parte de lo que ya se conoce, otras vías de activación de c-Src como el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o HER2 tienen un efecto inhibitorio sobre CSK, ya que fosforilan a c-Src en Y212 lo cual bloquea la unión a la secuencia reguladora C-terminal resultando en una activación de 50 veces de c-Src (Stover et al. 1996; Elsberger, 2013).

1.3 Relación entre c-Src y cáncer

Como se ha dicho anteriormente, SFKs (entre los que c-Src se encuentra) son transductores clave que transforman señales extracelulares en respuestas intracelulares, por lo que la desregulación de SFKs por sobreexpresión y/o hiperactivación de su actividad quinasa se relaciona con tumorogénesis y metástasis en diferentes órganos (Espada y Martín-Pérez, 2017), siendo considerados los miembros de SFKs como potenciales dianas terapéuticas contra el cáncer.

La activación de c-Src, puede inducir por un lado el incremento del crecimiento celular y la supervivencia de las células de la masa tumoral, pero también puede promover la reorganización del citoesqueleto debilitando las uniones célula-célula y célula-matriz facilitando la migración y la invasión (Guarino, 2010), ya que los dominios SH2 y SH3 pueden unirse a receptores de factores de crecimiento que contienen sus propias actividades tirosinas quinasas (EGFR, HER2, VEGFR), y también pueden unirse y activar proteínas del citoesqueleto tales como FAK (quinasa de adhesión focal) (Elsberger, 2013).

En un alto porcentaje de tumores humanos, entre los que se encuentra el cáncer de mama, c-Src se encuentra sobreexpresado y/o hiperactivado; mientras que no hay evidencias sólidas de mutaciones de c-Src en tumores humanos, lo que indica que anormalidades en su regulación podrían explicar el incremento de su actividad justificando el aumento de proliferación celular, incremento de la supervivencia y mayor capacidad de migración e invasión que caracterizan el fenotipo maligno y la enfermedad metastásica (Verbeek et al. 1996; Elsberger, 2013).

Se conoce que c-Src regula directamente la proliferación celular, así como eventos ligados al citoesqueleto tales como adhesión a matriz extracelular, migración e invasión. Los dominios SH2 y SH3 pueden unirse a receptores de factores de crecimiento que contienen sus propias actividades tirosín quinasa (EGFR, HER2, VEGFR), y también pueden unirse y activar proteínas del citoesqueleto tales como

5

FAK (Elsberger, 2013). c-Src también es sustrato de las quinasas PKC, PKA y CDK1 que lo fosforilan en residuos de serina y treonina de la región N-terminal. Específicamente, la fosforilación de c-Src por CDK1/cdc2 promueve la activación de este complejo durante la mitosis (Espada y Martín-Pérez, 2017).

La metástasis abarca un conjunto de procesos que incluyen la pérdida de adhesión celular, incremento de motilidad, angiogénesis invasión, intravasación, extravasación y colonización de un sitio distante al tumor primario. Cada uno de estos procesos es regulado en cierto modo por c-Src, sugiriendo que ésta juega un papel importante en el avance y metástasis de tumores sólidos (Elsberger, 2013). Por tanto, las evidencias sugieren que c-Src tiene un papel fundamental en el mantenimiento del fenotipo neoplásico y en la progresión del tumor, más que en la iniciación y crecimiento del mismo (Guarino, 2010).

Los resultados clínicos indican que los inhibidores de la actividad quinasa de c-Src no inducen suficientes efectos terapéuticos en la metástasis de cáncer de mama triple negativo; esto abre la cuestión de si bloqueando la funcionalidad de los dominios adaptadores SH2 y SH3 en combinación con inhibidores del dominio quinasa, se obtendrían mayores efectos para el tratamiento de procesos metastásicos en tumores en los que los miembros de SFKs están catalíticamente activados (Espada y Martín-Pérez, 2017).

2. HIPÓTESIS

Debido a que los resultados clínicos indican que los inhibidores de la actividad quinasa de c-Src no inducen suficientes efectos terapéuticos en la metástasis de cáncer de mama triple negativo; y dado que los dominios adaptadores participan en la regulación de la actividad y conformación de c-Src se abre la cuestión de que dichos dominios tengan una implicación esencial en las rutas y procesos pro-tumorales y por tanto, al bloquear su funcionalidad se afectaría la función de c-Src en cáncer de mama.

3. OBJETIVO

El objetivo global del trabajo fue definir la relevancia del dominio adaptador SH2 en cáncer de mama triple negativo, valorando los siguientes procesos celulares implicados en tumorogénesis: proliferación, migración, invasión, estrés oxidativo y crecimiento independiente de anclaje.

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Línea celular y modelo experimental

Para llevar a cabo nuestro objetivo, se trabajó con una proteína mutante de un c-Src aviar (nomenclatura de aminoácidos con tres posiciones menos respecto al humano) con la mutación T215W (sustitución de la treonina en posición 215 por un triptófano) en el dominio SH2, que participa en interacciones intramoleculares pero no intermoleculares (Cary et al. 2002).

6

Se utilizó la línea celular MDA MB 231 (ATCC HTB-26) como modelo de cáncer de mama triple negativo, células con origen humano de tipo epitelial procedentes de adenocarcinoma de mama triple negativo derivado de una metástasis pleural.

Estas células se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino libre de tetraciclina 5% (Tet-Free-FCS, PAA Laboratories GmbH), glutamina 2 mM, penicilina

y estreptomicina 100 µg/mL, a 37C de temperatura, 5% CO2 y 95% de humedad. A los stocks también se les incorporó los antibióticos blasticidina y zeocina (InvivoGen).

Dado que son células adherentes, para expandirlas se despegaron de la placa de cultivo con una solución de tripsina.

La sobreexpresión del mutante de interés c-Src-T215W en células MDA-MB-231 se realizó previamente en el laboratorio empleando el sistema de expresión condicional Tet-On. Para ello, se transfectaron en primer lugar las células con el plásmido pcDNA6/TR que contenía el represor de tetraciclina y se seleccionaron aquellas que lo habían incorporado gracias al gen de resistencia a blasticidina del plásmido; posteriormente se seleccionó el clon que expresaban mayor cantidad del represor de tetraciclina. En segundo lugar, se transfectó dicho clon con el plásmido pcDNA4/TO que contenía el gen mutado de interés (c-Src-T215W). En ausencia de tetraciclina, o en nuestro caso, doxiciclina (Doxy, análogo de tetraciclina), el represor se une a los sitios de represión del plásmido pcDNA4/TO por lo que el mutante c-Src-T215W no se expresa; mientras que en presencia de Doxy (0,2 µg/mL), ésta se une al represor cambiando su conformación e impidiendo su unión a los sitios de represión y favoreciendo la expresión de c-Src-T215W (Sánchez-Bailón et al. 2015).

4.2 Anticuerpos utilizados

NOMBRE TIPO CASA COMERCIAL DILUCIÓN

WESTERN BLOT

β-Actin Monoclonal ratón Sigma-Aldrich 1:15000 en leche

Caveolina pY14 Policlonal conejo BD-Biosciences 1:1000 en BSA

Caveolina Policlonal conejo BD-Biosciences 1:5000 en leche

Ciclina D1 (H-295) Policlonal conejo Sta Cruz

Biotechnology 1:1000 en leche

Fak (A17) Policlonal conejo ThermoFisher 1:3000 en leche

Fak pY397 Monoclonal

conejo Invitrogen 1:3000 en BSA

Fak pY576 Policlonal conejo Invitrogen 1:3000 en BSA

Fak pY925 Policlonal conejo Cell Signaling 1:3000 en BSA

Fyn (FYN3) Policlonal conejo Sta Cruz

Biotechnology 1:500 en leche

Lyn (H-6) Monoclonal ratón Sta Cruz

Biotechnology 1:1000 en leche

c-Myc (N-262) Policlonal conejo Sta Cruz

Biotechnology 1:1000 en BSA

p21 (C-19) Policlonal cabra Sta Cruz

Biotechnology 1:500 en leche

p27Kip1 DCS-72.F Monoclonal ratón ThermoFisher 1:500 en leche

7

Paxilina Monoclonal ratón BD-Biosciences 1:1000 en leche

Paxilina pY118 Policlonal conejo Cell Signaling 1:1000 en BSA

SrcEC10 Monoclonal ratón - 1:1000 en leche

Src-327 Monoclonal ratón - 1:1000 en BSA

Secundario GaR-HRP

Cabra anti-conejo-peroxidasa

Biosource-Invitrogen 1:5000 en leche

Secundario SaG-HRP

Cerdo anti-cabra-peroxidasa

Biosource-Invitrogen 1:5000 en leche

Secundario GaM-HRP

Cabra anti-ratón-peroxidasa

Sta Cruz Biotechnology

1:5000 en leche

Yes (C-4) Monoclonal ratón Sta Cruz

Biotechnology 1:1000 en leche

Tabla 1. Anticuerpos utilizados para Western blot. Estos anticuerpos fueron diluidos en la proporción anteriormente indicada en leche o BSA (albúmina de suero bovino) preparadas al 5% en T-TBS. Nota: SrcEC10 se utilizó para el reconocimiento específico de la forma aviar (confirmación de la expresión del mutante); mientras que Src-327 se utilizó para testar la expresión endógena de c-Src en grupo control, ya que reconoce ambas formas: aviar y humana.

4.3 Análisis de proteínas por Western-blot

Para la lisis celular se utilizó tampón RIPA (10mM Tris-HCl pH 7.6, 50mM NaCl, 30mM pirofosfato sódico, 5mM EDTA, 5mM EGTA, 0,1% SDS, 1% Tritón X-100, 50mM NaF, 0.mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1mM benzamidina, 1mM yodoacetamida, 1mM ortho-

fenantrolina). Los lisados se centrifugaron a 15000 rpm a 4C durante 30 minutos. Se determinó la concentración de proteínas del sobrenadante utilizando el “kit” BCA (Thermo Scientific) con una curva patrón de BSA. Posteriormente se igualaron las concentraciones de las distintas muestras a 1,2 mg/mL utilizando el mismo tampón de

lisis, se añadió tampón de carga con ß-mercaptoetanol, y se hirvieron a 95C durante 5 minutos.

Para la separación de proteínas utilizamos geles de SDS-poliacrilamida con dos fases: 1º de concentración o “stacking” (H2O, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 40% acrilamida, 2% bisacrilamida, 10% APS y TEMED), y 2º de carrera o “running” al 10% y 12% (H2O, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 40% acrilamida, 2% bisacrilamida, 10% APS y TEMED).

La cantidad de muestra cargada fue de 25 µg de proteína. La electroforesis se desarrolló en dos tiempos de 80 V (concentración de la muestra) y 120 V (separación), utilizando tampón de electroforesis (25 mM Tris-base, 192 mM glicina, 0,1% SDS). El marcador de proteínas utilizado fue Precision Plus Protein Dual color Marker (Bio-Rad).

Finalizada la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P (PVDF), mediante el método seco a intensidad constante de 110 mA durante 45 minutos. Tras comprobar la correcta transferencia tiñendo las membranas con rojo de Ponceau, se procedió a incubarlas en una disolución de bloqueo con leche desnatada (Fluka) o BSA (para detección de fosforilaciones en tirosina) al 5% en T-TBS durante 1 hora y, seguidamente, se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (especificados en sección anterior y disueltos en leche o BSA al 5% en T-TBS según corresponda) durante toda la noche a 4ºC. Las membranas se lavaron con T-TBS y

8

se incubaron con el anticuerpo secundario (anti-especie) conjugado con peroxidasa diluido 1/3000 o 1/5000 según corresponda, en la disolución con leche desnatada al 5% en T-TBS durante 1 hora. Para la detección de las proteínas se utilizan los reactivos Amersham ECL TM (GE Healthcare) (H2O2 y luminol) siguiendo las instrucciones del fabricante, así como películas Amersham HyperfilmTM ECL (GE Healthcare) para poder capturar la señal quimioluminiscencia. Para la posterior cuantificación proteica (con programa ImageJ) se utilizó la ß-actina como control de carga.

4.4 Ensayo de proliferación

Se sembraron 3x105 células en medio completo en 6 placas 60 mm, tres de ellas se trataron con Doxy (0,2 µg/mL) durante 72h. Pasado este tiempo, se levantaron en una solución de tripsina, se lavaron en medio completo, y se procedió a medir la viabilidad celular por contaje por exclusión con azul de tripano (proporción 1:1) en Cell Counter, estimando el número de células totales, vivas, muertas y la viabilidad celular. El ensayo se realizó por triplicado y se repitió tres veces.

Para reevaluar la proliferación desde el punto de vista de estudio de actividad metabólica, se sembraron 4x103 células por pocillo en 24 pocillos de placas MW96. Al día siguiente, la mitad de ellos se trataron con Doxy (0,2 µg/mL) durante 72h. Pasado este tiempo, se añadió 0,5mg/mL de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (reactivo MTT de Sigma-Aldrich) diluido en medio completo a cada pocillo, exceptuando a dos de cada condición a los que sólo se añadió medio de cultivo, para utilizarse como blanco. La placa se incubó durante 4h a 37ºC y 5% de CO2. A continuación, se retiró el medio y se añadió 200µl/pocillo de dimetilsulfóxido (DMSO). Se agitaron hasta disolver los cristales de formazán, y se midió la absorbancia a 570 nm en el espectrofotómetro VersaMax Elisa Microplate Reader. El ensayo se repitió tres veces.

4.5 Ensayo de migración por cierre de herida

Se sembraron 3,5x105 células con medio completo en placas MW6, tres pocillos de ellos se trataron al día siguiente con Doxy (0,2 µg/mL). Tras 48 h de incubación, se realizaron dos heridas por pocillo utilizando una punta de micropipeta p200 y se realizaron dos lavados con medio sin suero antes de incorporar el medio completo y la Doxy (0,2 µg/mL) en los pocillos correspondientes. En el sistema de observación in vivo Cell Observer (Zeiss) se realizaron fotografías de 3 áreas de herida por pocillo cada 30 minutos durante 24h, siendo posteriormente analizada la migración del frente de herida utilizando el programa ImageJ. El ensayo se realizó por triplicado y se repitió tres veces.

4.6 Ensayo de invasividad

Se sembraron 3x105 células en medio completo en 6 placas de 60 mm; tres de ellas se trataron al día siguiente con Doxy (0,2 µg/mL). Se utilizaron insertos con membrana porosa de células en cultivo para placas MW24 (membrana con poro de 8 µm) que se cubrieron con 100 µL de Matrigel diluido con medio DMEM completo e incubado durante toda la noche en campana a temperatura ambiente. Al día siguiente, en cada inserto se depositaron 50.000 células (procedentes de las p60 mm sembradas cuatro días antes) diluidas en medio DMEM sin suero y con glutamina y penicilina/estreptomicina y 600 µL de medio DMEM al 20% de suero fetal bovino en cada pocillo por fuera de la cámara-inserto. Tras 24 h de incubación, los restos de

9

Matrigel y células que no atravesaron el filtro se limpiaron con PBS 1X y aquellas que sí lo hicieron se fijaron en el filtro con metanol, se tiñeron con DAPI y se montaron en portas para su posterior visualización y contaje de núcleos en el microscopio Nikon 90i de fluorescencia. El posterior procesamiento de imágenes se realizó utilizando el programa ImageJ. El ensayo se realizó por triplicado y fue repetido cuatro veces.

4.7 Ensayo de estrés oxidativo

Se sembraron 1,5x104 células por pocillo en 500 µl de medio completo sobre cubreobjetos en 12 pocillos (placa MW24). Al día siguiente, 6 de ellos se trataron con Doxy (0,2 µg/mL) durante 72 h. Pasado este tiempo, se añadió H2O2 al 1% a dos pocillos de cada condición (controles positivos). Se dejó la placa en el incubador a 37ºC y 5% CO2 durante 30 minutos. Después se retiró el medio de todos los pocillos y se añadió 1µg/mL de hidroetidina en medio completo, excepto a un pocillo por condición que no había sido tratado previamente con H2O2, (control negativo). Tras 1 h de incubación a 37ºC y 5% CO2, se fijaron los cristales con paraformaldehído 4% durante 10 minutos, se realizaron lavados con PBS y realizó el montaje de los cubreobjetos con medio de montaje Prolong. Las imágenes se tomaron a 20X en microscopio Nikon Eclipse 90i, con el programa Nis-Element utilizando el filtro TxRED. Posteriormente se procedió al análisis de imagen con el programa ImageJ. El ensayo se realizó por triplicado y fue repetido tres veces.

4.8 Ensayo de crecimiento independiente de anclaje

Se resuspendieron 4,2x105 células en una disolución templada de medio completo con 10% de suero (con o sin Doxy 0,2 µg/mL) al 0.3% de agar y se sembraron en placas 60 mm con una fase inferior preparada 24h antes al 0.5% de agar. Estas placas se realimentaron cada 3 días con 150 µL de medio (con o sin Doxy al 0,2 µg/mL). Tras 4 semanas, se obtuvieron imágenes a distintos planos con el sistema de observación in vivo Cell Observer (Zeiss) y se procedió a contar las colonias de tamaño superior a 20 µm y diferenciando aquellas mayores de 100 µm, utilizando para ello el programa de análisis de imagen ImageJ. El ensayo se realizó por cuadruplicado y fue repetido tres veces.

4.9 Tratamiento de datos

Los valores medios, la desviación estándar y la significación estadística entre los datos de las dos condiciones experimentales diferentes se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas (nivel de confianza 95%).

5. RESULTADOS

5.1 Morfología y fenotipo celular. Efectos de la sobreexpresión del mutante c-Src-T215W

Como se aprecia en la Figura 1, el aspecto celular al microscopio fue similar y no se observaron diferencias fenotípicas ni alteraciones en la morfología o adhesión de las células entre el grupo control y tratado con Doxy (0,2 µg/mL) a las 72 h (sobreexpresión de c-Src-T215W).

10

Figura 1. Morfología de MDA-MB-231 al sobreexpresar c-Src-T215W. Fotos tomadas en microscopio DMIL FLUO a 72 h tras añadir 0,2 µg/mL Doxy al grupo tratado.

5.2 Efecto sobre proliferación

En cuanto a los ensayos de proliferación a las 72h en los que se midió el número de células viables por exclusión con azul de tripano, no se observaron diferencias significativas con la expresión del mutante c-Src-T215W (Figura 2A). Cabe destacar que el porcentaje de células marcadas con azul de tripano fue siempre menor al 7% (datos no mostrados), indicando que la sobreexpresión del mutante, tras 72 h de tratamiento con Doxy, no incrementaba la mortalidad celular.

De manera concordante y como era de esperar, estos resultados en proliferación se mantuvieron también sin diferencias significativas en el ensayo de MTT, con el que también medimos viabilidad celular ya que las enzimas que metabolizan este reactivo son sobre todo las deshidrogenasas mitocondriales, lo cual aporta información sobre la actividad metabólica de las células, íntimamente relacionada con su viabilidad (Figura 2B).

Junto con estos experimentos, se llevó a cabo la valoración por Western Blot de las proteínas más importantes de ciclo celular (Figura 2C): c-Myc (factor de transcripción amplificado sobre todo en células con alta tasa de proliferación que regula la expresión génica de otros muchos genes implicados en carcinogénesis), ciclina D1 (proteína reguladora de ciclo celular que controla la transición entre fases G1-S), p21 y p27 (inhibidores negativos del ciclo celular que interactúan con las quinasas dependientes de ciclina) (Schafer, 1998). Como era de esperar, los niveles de dichas proteínas permanecieron prácticamente invariables, exceptuando una ligera disminución de p27 en la expresión del mutante c-Src-T215W, que no denotó relevancia en el contaje del número de células viables.

11

Figura 2. Efecto de la expresión de c-Src-T215W sobre la capacidad de proliferación. A. Células viables contadas por exclusión con azul de tripano. B. Determinación de actividad metabólica midiendo absorbancia a 570 nm por ensayo de MTT. Los resultados muestran la media de los 3 experimentos realizados ± SD. C. Western Blot de las principales proteínas de ciclo celular procedente de extracto proteico total de células control y tratadas con Doxy.

5.3 Efecto sobre migración

En los ensayos de migración por cierre de herida no se observaron prácticamente

diferencias en el área de herida a las 13 horas: siendo del 18% en el grupo control y

del 16% en el tratado con Doxy (Figura 3A). Además, como se observa en la gráfica

cinética a medida que transcurre el tiempo el frente de migración de ambas

condiciones fue similar (Figura 3B).

12

Figura 3. Efecto de la expresión de c-Src-T215W sobre migración. A. Área de herida (%) a las 13 h. B. Cinética del área de herida (%). Los resultados muestran la media de los 3 experimentos realizados ± SD. C. Western Blot de las principales proteínas de migración procedente de extracto proteico total de células control y tratadas con Doxy.

Al valorar las principales proteínas implicadas en migración por Western blot, se observó que los niveles de FAK y caveolina permanecieron prácticamente invariables, existiendo una ligera disminución de paxilina en las células que expresaban el mutante c-Src-T215W. Sin embargo, en contraposición con los resultados mostrados por el análisis del cierre de herida, todas las formas fosforiladas (activas) de cada una de estas proteínas aumentaron considerablemente con la expresión del mutante (Figura 3C).

13

5.4 Efecto sobre invasividad

En cuanto a los ensayos de invasividad, se observó variabilidad en los resultados debido al difícil control del grado de hidratación del Matrigel de los insertos (fluctuación de temperatura en sala de cultivos). Sin embargo, como se observa en la Figura 4, hubo una disminución muy significativa de la invasividad con la expresión del mutante.

Figura 4. Efecto de la expresión de c-Src-T215W sobre invasividad. Datos del número de células por inserto que atravesaron la membrana porosa. Los resultados muestran la media de los 4 experimentos realizados ± SD.

5.5 Efecto sobre estrés oxidativo

Este ensayo ofrece una aproximación de la cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) que se producen en el interior celular. Para su detección, la hidroetidina en presencia de ROS se combina con éstas y genera un producto fluorescente. Como se observa en la Figura 5, la cantidad de ROS generados en el interior celular fue significativamente menor con la expresión del mutante que en las células control.

Figura 5. Efecto de la expresión de c-Src-T215W sobre el estrés oxidativo. Los datos mostrados corresponden a la media de la cantidad de fluorescencia ± SD (valores procesados por imágenes con ImageJ) tomando el valor de las células control como 1.

14

5.6 Efecto sobre crecimiento independiente de anclaje

El ensayo de crecimiento independiente de anclaje constituye un acercamiento experimental in vitro a la metástasis. Analizando la capacidad de las células de crecer y formar colonias en agar (como ya se ha descrito anteriormente), se obtuvieron resultados que indican que la expresión del mutante c-Src-T215W provocó no sólo un aumento significativo del nº de colonias totales formadas (> 20 µm) sino también un incremento significativo del nº de colonias consideradas en crecimiento (aquellas de >100 µm) (Figura 6).

Figura 6. Efecto de la expresión de c-Src-T215W sobre formación de colonias en agar. Los datos reflejan el nº de colonias totales (>20 µm) y en crecimiento (> 100 µm). Los resultados muestran la media de los 3 experimentos realizados por triplicado ± SD.

5.7 Expresión de otros miembros de SFKs en MDA-MB-231

Figura 7. Valoración por Western Blot de la expresión de c-Src endógeno y otros miembros de SFKs (Fyn, Lyn y Yes) en células de las líneas triple negativas SUM159 y MDA-MB-231.

15

Como se observa en la Figura 7, en la línea MDA-MB-231 (línea celular utilizada en este trabajo) se observó mediante Western Blot un incremento de los niveles de Yes y una disminución de los niveles endógenos de c-Src con respecto a las SUM159, línea celular triple negativa empleada igualmente en el laboratorio con anterioridad.

6. DISCUSIÓN

La actividad quinasa de c-Src es requerida para que las células MDA-MB-231 metastaticen a hueso, pulmón y cerebro (Guarino, 2010). Si los dominios adaptadores SH2 y SH3 fuesen también cruciales para la metástasis de cáncer de mama, se podrían generar inhibidores para los mismos que en combinación con los inhibidores del dominio catalítico ofrecieran un mayor efecto terapéutico en cáncer de mama metastásico.

El dominio SH3 gobierna la dinámica de c-Src en la membrana celular y puede estar involucrado en la rápida transducción de señales en las células (Machiyama et al. 2015).

El dominio SH2 puede contribuir a la función c-Src a través de las interacciones proteína-proteína con otras moléculas vinculantes como FAK, p130cas y PI3K, entre otras. Existen datos que apoyan que las funciones de c-Src independientes de su actividad quinasa presentan el dominio SH2 como un atractivo para la inhibición de la función proteica (Kraskouskaya et al. 2013; García-Martínez et al. 2010).

Los resultados obtenidos en los ensayos de proliferación apuntan que el dominio SH2 de c-Src no ejerce un papel primordial en lo que a la vía de proliferación se refiere.

En células de cáncer de mama, c-Src fosforila p27 en Y74 y Y88 facilitando la fosforilación en T187. Este evento marca p27 para su degradación, promoviendo la consecuente progresión a G1. De hecho, hay correlación entre bajos niveles nucleares de p27 y la activación de c-Src en tumores primarios de mama (Chu et al. 2007, nombrado en Sánchez-Bailón et al. 2015).

Además, la supresión de c-Src disminuye ciclina D1 y ciclina E y regula al alza p27. La posible explicación es que la inhibición de c-Src incrementa la estabilidad de p27. En nuestro caso, dado que no se observaron efectos en la proliferación, se sugiere la no intervención de SH2, y la leve disminución de p27 no sería suficiente para tener efectos a nivel de proliferación y podría relacionarse con la propia sobreexpresión de c-Src (Liu et al. 2013).

Los procesos de adhesión, migración e invasión están asociados con sustratos de c-Src entre los que se incluyen FAK y paxilina, los cuales están involucrados en señalización de integrinas y adhesión. La activación de FAK por factores de crecimiento o integrinas induce su autofosforilación en Y397, lo que le permite interactuar con el dominio SH2 de c-Src con alta afinidad, induciendo la conformación activa de éste y por tanto, promoviendo su activación e indirectamente la propia activación máxima de FAK a través de la fosforilación en varios residuos de tirosina, que formando un complejo con c-Src controla vías que conducen a la migración y reorganización del citoesqueleto coordinando el ensamblaje de las adherencias y su desmontaje. Finalmente, el complejo FAK-Src altamente activo promueve la fosforilación de varios sustratos entre los que se encuentra paxilina, con un papel

16

central en la reorganización del citoesqueleto y en la migración (Guarino, 2010; Espada y Martín-Pérez, 2017).

Los resultados de los ensayos de migración no mostraron diferencias entre las células control y las que sobreexpresaban el mutante c-Src-T215W. Sin embargo, al analizar la expresión de proteínas de migración por Western blot, como fueron FAK, caveolina y paxilina (proteínas implicadas en formación de adhesiones focales) (Gonzalez et al. 2006) se observó un aumento significativo de p-caveolina (Y14) y de p-paxilina (Y118) y formas fosforiladas de FAK. Es decir, las formas activas de estas proteínas se vieron incrementadas, lo cual era contradictorio con los resultados obtenidos en los ensayos de migración.

Debido a ello, para analizar en profundidad el fundamento de estos resultados, sería pertinente realizar un análisis de seguimiento individualizado de las células del frente de herida, ya que pudiera darse el caso de que el grupo tratado con Doxy acumulase mayor distancia recorrida de forma total, pero con una distancia euclidiana similar al grupo control. El hecho de que el grupo con sobrexpresión del mutante c-Src-T215W recorriera “más camino”, es decir, que migrase de forma menos direccional, podría explicar el mayor grado de activación de proteínas de migración.

Por otro lado, además de los niveles de expresión y de activación, una proteína ejerce su función correctamente cuando se encuentra localizada en una determinada región celular. Esto nos lleva a pensar otra posible justificación para nuestros resultados, y es que aunque las células que sobreexpresan c-Src-T215W tienen mayor cantidad de proteínas activas relacionadas con la migración, éstas, probablemente, no se localizan en el lugar adecuado para llevar a cabo sus funciones, y por ello, no se observaron diferencias en la migración. Por tanto, sería pertinente analizar la distribución de dichas proteínas en el interior celular mediante ensayos de inmunofluorescencia confocal, valorando su localización o no en adhesiones focales. Por otro lado, el aumento de las formas activas de estas proteínas a pesar de la incapacidad del dominio SH2 de c-Src para interaccionar con otras moléculas podría deberse al efecto compensatorio de otros miembros de SFKs comentado más adelante en este trabajo. Debido a ello, se puede decir que el dominio SH2 no desempeña por sí sólo un papel fundamental en la vía de migración regulada por c-Src en MDA-MB-231.

La autofosforilación de FAK en Y397 y posterior interacción de pY397-FAK con el dominio SH2 induce la conformación abierta y consecuencia activación de c-Src, lo cual a su vez permite la completa activación de FAK y el reclutamiento de proteínas de señalización y de citoesqueleto (entre ellas paxilina), así que este complejo controla vías relacionadas con proliferación, migración, supervivencia y reorganización del citoesqueleto (Sachdev et al. 2009; Espada y Martín-Pérez, 2017). Es por ello que la expresión y actividad aumentada de FAK se correlacionan con enfermedad metastásica y mal pronóstico en los pacientes (Wu et al. 2013).

La paxilina es una proteína con función de adaptadora, importante en la coordinación de la organización del citoesqueleto, la rotación de adherencias y la migración celular. En el sitio de adhesión de la matriz celular, la paxilina se une a FAK y se somete a la fosforilación en Y118 de manera dependiente de c-Src, creando así sitios de acoplamiento para las moléculas de señalización que contienen dominio SH2 (Guarino, 2010). Por ello, el aumento de los niveles de su forma activa suponen cierta modulación en el citoesqueleto y promueven la actividad de Rho GTPasas que en última instancia facilitan la migración celular (Wu et al. 2013).

17

De hecho, la máxima fosforilación de tirosina de muchos sustratos celulares, tales como paxilina, requiere tanto la actividad de c-Src como la de FAK. Los niveles de FAK y su activación se incrementan en muchos tumores primarios y de forma mucho más significativa en lesiones metastásicas. Por otra parte, la pérdida de actividad o expresión de FAK suprime la progresión metastásica en modelos de xenoinjerto tumoral, subrayando un importante papel para FAK en el desarrollo de malignidad (Sachdev et al. 2009) y, por tanto, otorgando de nuevo relevancia al dominio SH2 de c-Src a través del cual interacciona para conseguir su activación completa.

La capacidad de invasión supone la traslocación de las células del tumor a través de la barrera que supone la matriz, siendo un prerrequisito fundamental para el desarrollo de metástasis. Se sabe que c-Src promueve la expresión de proteasas degradantes de matriz (metaloproteasas) por diversos mecanismos. Además, la sobreexpresión de c-Src en tumores humanos parece tener un papel crítico en invasión, por lo que probablemente su inhibición prevendría la diseminación de las células tumorales, antes que reducir el crecimiento tumoral (Guarino, 2010). Por todo ello, nuestros resultados indican que el dominio SH2 puede ejercer un papel fundamental en la capacidad invasora de las células y, por tanto, en el proceso metastásico.

En los ensayos de estrés oxidativo, la importancia de cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas en el interior celular, reside en que este factor de daño celular se relaciona con otros eventos que alteran la supervivencia celular y conducen a la apoptosis. En nuestros resultados, el estrés oxidativo disminuye con la expresión del mutante c-Src-T215W de forma significativa, lo cual nos indica que el dominio SH2 puede desempeñar un papel fundamental en la producción de estrés oxidativo en las células tumorales.

Por otro lado, una moderada producción de ROS puede ser clave en diferentes procesos que van desde la respuesta inmunitaria contra patógenos a la regulación de la proliferación, diferenciación y programación de muerte celular. En mamíferos, los principales productores de ROS son miembros de la familia NADPH oxidasa (familia NOX). Diferentes observaciones muestran no sólo que c-Src puede ser directamente activada por ROS a través de NOX4 (Espada y Martín-Pérez, 2017), sino que también la formación de ROS inducida por c-Src se debe a su papel en la regulación de la actividad de NOX1 (Gianni et al. 2010).

En células MDA-MB-231, la supresión condicional de c-Src no altera la proliferación ni viabilidad, pero inhibe el crecimiento independiente de anclaje, entre otras capacidades (Sánchez-Bailón et al. 2015).

En este caso, el aumento del número de colonias totales y en crecimiento bajo la expresión del mutante c-Src-T215W nos indica que las interacciones intermoleculares del dominio SH2 no tendrían relevancia para el crecimiento independiente de anclaje y que la propia sobreexpresión de c-Src favorecería el mayor crecimiento de colonias, ya que se sabe que la actividad catalítica de SFKs es necesaria para el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de mama metastásico (Sánchez-Bailón et al. 2015). Otra posible justificación a nuestro resultado podría ser que en c-Src-wt el dominio SH2 interaccionase con un regulador negativo para esta función.

Otra importante característica de SFKs es la redundancia y compensación funcional entre sus miembros. Varios de ellos son normalmente expresados a la vez en muchos tipos celulares, y la ablación de uno de ellos, podría ser al menos en parte,

18

funcionalmente compensada por otro. Este hecho dificulta la asignación de funciones fisiológicas a un miembro en concreto (Espada y Martín-Pérez, 2017).

Dada la experiencia previa en el laboratorio con resultados aún no publicados en la línea celular SUM159 que mostraban efectos mucho más notorios de la mutación T215W y, por tanto, de la importancia del dominio SH2; se evaluaron en MDA-MB-231 los niveles de otros miembros de SFK (en concreto Fyn, Yes, Lyn y c-Src endógeno), obteniendo diferencias de expresión de algunos miembros en ambas líneas celulares. En MDA-MB-231, Yes juega un papel más importante que c-Src, por lo que podría suplir la funcionalidad éste ante la sobreexpresión de nuestro mutante, derivando en los menores efectos que denotan nuestros resultados. Sin embargo, la expresión de c-Src (y, por tanto, su función) fue notablemente mayor en SUM159 que en MDA-MB-231.

7. CONCLUSIONES

1. El dominio SH2 de c-Src en la línea celular MDA-MB-231 parece ejercer un papel importante en la modulación de la producción de estrés oxidativo, así como en la capacidad invasora de las células y, por tanto, en el proceso metastásico.

2. El dominio SH2 de c-Src en la línea celular MDA-MB-231 no parece ejercer un papel importante en lo que a la vía de proliferación y migración se refiere. Tampoco parece ser relevante en el crecimiento independiente de anclaje, propiedad para la que la sobreexpresión de c-Src por sí misma parece ser crucial.

3. La expresión predominante de otros miembros de SFKs (como Yes) sobre c-Src en la línea celular MDA-MB-231 pone de manifiesto la menor importancia de este miembro en dicha línea celular y el posible efecto compensatorio de sus funciones por parte de otros miembros.

8. BIBLIOGRAFÍA

Allison K.H (2012) Molecular pathology of breast cancer: what a pathologist needs to know. Am J Clin Pathol 138: 770-780.

ATCC Cell lines (2019) Información sobre línea celular. Accesible en: http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/HTB-26.aspx?geo_country=ro Último acceso: 26/03/2019

Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel R.L, Torre L.A y Jemal A (2018) Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 68: 394-424.

Cary L.A, Klinghoffer R.A, Sachsenmaier C y Cooper J.A (2002) SRC catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol 22: 2427-2440.

Chacón R.D y Costanzo M.V (2010) Triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 12 (Suppl 2): S3.

Chu I, Sun J, Arnaout A, Kahn H, Hanna W, Narod S, Sun P, Tan CK, Hengst L y Slingerland J (2007) p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell 128:281–294.

Elsberger, B (2014) Translational evidence on the role of Src kinase and activated Src kinase in invasive breast cancer. Crit Rev Oncol Hematol 89: 343-351.

19

Espada J y Martin-Pérez J (2017) An Update on Src Family of Nonreceptor Tyrosine Kinases Biology. Int Rev Cell Mol Biol 331:83-122.

Ferlay J, Colombet M, Soerjomataram I, Mathers C, Parkin D.M, Piñeros M, Znaor A y Bray F (2019) Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods, Int J Cancer 144:1941-1953.

Garcia-Martínez J.M, Calcabrini A, Gonzalez L, Martín-Forero E, Agullo-Ortuño M.T, Simon V, Anderson S.M, Roche S y Martín-Pérez J (2010) A non-catalytic function of the Src family tyrosine kinases controls prolactin-induced Jak2 signaling. Cell Signal 22: 415-426.

Gianni D, Taulet N, DerMardirossian C y Bokoch GM (2010) c-Src-mediated phosphorylation of NoxA1 and Tks4 induces the reactive oxygen species (ROS)-dependent formation of functional invadopodia in human colon cancer cells. Mol Biol Cell. 21:4287-4298.

Global Cancer Observatory (2019). Fact sheets of breast cancer. Accesible en: http://gco.iarc.fr/today/fact-sheets-cancers Último acceso: 24/03/2019

Guarino M (2010) Src signaling in cancer invasion. J Cell Physiol 223: n/a.

Harbeck N y Gnant M (2017) Breast cancer. Lancet. 389:1134-1150.

Kraskouskaya D, Duodu E, Arpin C.C y Gunning P.T (2013) Progress towards the development of SH2 domain inhibitors. Chem Soc Rev 42:3337-3370.

Liu X, Du L y Feng R (2013) c-Src regulates cell cycle proteins expression through protein kinase B/glycogen synthase kinase 3 beta and extracellular signal-regulated kinases 1/2 pathways in MCF-7 cells. Acta Biochim Biophys Sin 45: 586-592.

Machiyama H, Yamaguchi T, Sawada Y, Watanabe T.M y Fujita H (2015) SH3 domain of c-Src governs its dynamics at focal adhesions and the cell membrane. FEBS J 282: 4034-4055.

Reis‐Filho J.S y Tutt A.N.J (2008) Triple negative tumours: a critical review. Histopathology 52: 108-118.

Roskoski R (2015) Src protein-tyrosine kinase structure, mechanism, and small molecule inhibitors. Pharmacol Res 94:9-25.

Sachdev S, Bu Y y Gelman I.H (2009) Paxillin-Y118 phosphorylation contributes to the control of Src-induced anchorage-independent growth by FAK and adhesion. BMC Cancer 12: 9:12.

Sánchez-Bailón M.P, Calcabrini A, Mayoral-Varo V, Molinari A, Wagner K, Losada J.P, Ciordia S, Albar J.P y Martín-Pérez J (2015) Cyr61 as mediator of Src signaling in triple negative breast cancer cells. Oncotarget 6: 13520-13538.

Schafer K.A (1998) The cell cycle: a review. Vet Pathol 35:461-478.

Stover D.R, Furet P y Lydon N.B (1996) Modulation of the SH2 binding specificity and kinase activity of Src by tyrosine phosphorylation within its SH2 domain. J Biol Chem 271:12481-7.

Verbeek B.S, Vroom T.M, Adriaansen-Slot S.S, Ottenhoff-Kalff A.E, Geertzema J, Hennipman A y Rijksen G (1996) c-Src protein expression is increased in human breast cancer. An immunohistochemical and biochemical analysis. J Pathol 180: 383-388.

Wu G.S, Song Y.L, Yin Z.Q, Guo J.J, Wang S.P, Zhao W.W, Chen X.P, Zhang Q.W, Lu J.J y Wang Y.T (2013) Ganoderiol A-enriched extract suppresses migration and adhesion of MDA-MB-231 cells by inhibiting FAK-SRC-paxillin cascade pathway. PLoS One 8:e76620.