Práctica 09 y 10

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Mg Bioqumica. Rosario Calixto C.2016

PRCTICA 09

DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LA CASEINA

I. OBJETIVO

Determinar el punto isoelctrico de la casena

II. INTRODUCCIN

Las protenas contiene una secuencia de aminocidos ylas cadenas laterales libres pueden existir en tres formasdependiendo del pH del medio: catinicos, neutros y aninicos.

Cualquier protena tendra una carga neta positiva si se encuentraen un medio lo suficientemente cido debido a que los gruposCOOH de los aminocidos asprtico y glutmico estaran en suforma neutra pero los grupos amino de Arginina y Lisina estaranprotonados (-NH3+). De igual forma si la protena se encuentra enun medio con un pH muy alto estara cargado negativamente yaque en este caso los grupos carboxilo estaran desprotonados(COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra (NH2). De loanterior se deduce que las protenas tienen un pH caracterstico alcual su carga neta es cero.

A este pH se le denomina punto isoelctrico (pI). En el puntoisoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas ynegativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidadpara ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar suagregacin.

La casena est formada por alfa (s1), alfa (s2)-casena,beta-casena, y kappa-casena formando micelas. Ni la alfa ni labeta casena son solubles en la leche, solas o combinadas. Si seaade la kappa casena a las dos anteriores o a cada una de ellaspor separado se forma un complejo de casena que es solubilizado

en forma de micela. Esta micela est estabilizada por la kappacasena mientras que las alfa y beta son fosfoprotenas queprecipitan en presencia de iones calcio.

La propiedad caracterstica de la casena es su bajasolubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente,estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizadacomo sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativade la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato seprotonan) y la protena neutra precipita.

Las protenas que aparecern en el sobrenadante cuando

precipitemos la casena en medio cido son protenas globulares,hidrofilicas y fcilmente solubles en agua as como susceptibles de

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desnaturalizacin por calor. Las principales son beta lactoglobulina,alfa lactoalbumina, albmina de suero de bovino (BSA), einmunoglobulinas (Ig).

La conformacin de la casena es similar a las protenasdesnaturalizadas globulares. El alto nmero de residuos de Prolinaen la casena causa un especial plegamiento en la cadena deprotena e inhibe la formacin de una fuerte y ordenadaestructura secundaria.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de prueba. 2 pipetas de 1 mL y de 5 mL, bombillasuccionadora

Gradilla Sol. de acetato y de cido actico pH metro, Cintas de pH Matraz aforado, Calculadora, Casena

PROCEDIMIENTO

Preparar una gradilla de 9 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente

tablaTubos

1 2 3 4 5 6 7 8 9

mL de casena 5% 1 1 1 1 1 1 1 1 1

mL de agua destilada 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4

mL de cido actico1.0 N

1.6

mL de cido actico0.1 N

0.2

0.5

1.0

2.0

4.0

8.0

mL de cido actico0.01 N 0.

6

1.2

pH terico

pH experimental

Observa la precipitacinde la casena a los 15minutos (X)

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Reactivos

Tubo de Ensayo 2

Tubo de Ensayo 1

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Tubo de Ensayo 5

Tubo de Ensayo 4

Tubo de Ensayo 3

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Seagitasuavemente lostuboscon la

Tubo de Ensayo 7

Tubo de Ensayo 9

Tubo de

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IV. CUESTIONARIO1. Cul es el punto isoelctrico de la glutelinas y , lactoalbumina,

2. Determine el punto isoelctrico del glutamato y de la arginina3. Qu utilidad tiene conocer el punto isoelctrico de las

protenas?

II. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS1. Calixto C. Mara R. Gua de prcticas de Qumica Integrada.

UNMSM-Fac Medicina .Lima, Per 2008 p.302. Da Zagoya. Bioqumica. 1 edicin, Editorial Mc Graw Hill. 2007.

India, p. 4903. Coultate T.P Qumica y Bioqumica de los alimentos. 3 edicin

Edit Acribia Zaragoza-Espaa.200.

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PRCTICA 10

CROMATOGRAFI A DE METABOLI TOS SECUNDARIOS DE

VEGETALES

I. Objetivo: Separar e identificar los metablicos de bajo pesomolecular un mezcla de matriz de alimentos

II. IntroduccinLa tcnica de separacin de TLC consta de un sistema de dos fases,una solida (fase estacionaria) que se aplica en forma de capadelgada, absorbente, usualmente de entre 0.1 a 0.25 mm de grueso

para fines analticos, pero el grosos puede variar. Esta capa puedees fijada a una placa o lmina firme de vidrio, aluminio o plsticoque acta como soporte. A travs de la fase estacionaria transita unliquido o solvente (fase mvil o eluente)La fase estacionaria

La fase estacionaria es un slido fijo al soporte. El sorbente debe serinerte, poroso e insoluble en los solventes usados como fase mvil.Existen diferentes materiales inertes, pero los ms comunes son la desilica gel y el oxido de aluminio. La utilizacin de soportes hidrfobos

facilita la separacin de compuestos no polares (lpidos, porejemplo).

El silica gel tambin es llamada como cido silico o kieselgel, es unpolvo blanco, poroso y amorfo, y una que se elimina el agua daluigar a la formacin de un gel. El control de la temperatura y el pHdurante esta etapa es crucial para la calidad del gel formado. Laspartculas coloidales una vez formadas, con la consiguientecondensacin y encogimiento forma una red tridimensionaldescrita como un hidrogel. Despus de lavado y calentamiento ungel poroso y duro es formado, llamado silica gel, el q se usa para laTLC.

La eficiencia de la silica gel en la separacin est ligada al tamaode la partcula. El tamao de partcula en TLC tpicamente est

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entre 5 a 40 um, y entre ms pequeo sea su valor, es mejor laresolucin. El tamao de poro tambin incide en la buenaseparacin, tpicamente se emplean silica gel que desarrolla untamao de poro de 40- 150 A

VOLUMEN DE MUESTRA APLICARPara el desarrollo de la cromatografa, las muestras, en un disolventeadecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas,micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen demuestra a aplicar es crtico, ya que va a afectar a la resolucin(separacin de los componentes de una mezcla compleja), ydepende de la concentracin del compuesto o compuestos deinters en la muestra. Para soluciones concentradas bastar unacantidad muy pequea (rango de l) para aplicar suficiente

cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidadde resolucin de la placa cromatogrfica. Para soluciones muydiluidas, deber aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml)para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos deinters. En este caso conviene hacer la aplicacin en pequeosvolmenes fraccionarios, no procedindose a una nueva adicinhasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario lasuperficie de aplicacin se hara muy grande, distando mucho de lasituacin ideal de concentracin de la muestra en un solo punto de

aplicacin). Una vez aplicada y seca la muestra, la placa seintroduce en un recipiente cerrado (cmara cromatogrfico)CAMARA CROMATOGRAFICALa cmara cromatografa consiste en un recipiente con tapa decierre hermtico, a este recipiente se le aade la fase mvil. Quecontiene, butanol, cido actico y agua. La cantidad que seagrega depende de la ubicacin del origen en la placacromatografa. El origen est colocado a una altura de o.5 cm, porlo tanto, si el nivel del solvente no debe llegar hasta el origen, seagregar hasta un nivel de 0.3-0.4 cm de altura. Se tapa y se dejaque el vapor del solvente sature la atmsfera interna del recipienteantes de introducir la palca cromatografa.

III. MATERIALES Y EQUIPOS.

Etanol absoluto.Butanol.cido actico glacial. Agua destilada.

Solucin de FeCl3, 5 %,

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EQUIPOS Y MATERIALES.

Estufa regulada a 50 C.

Cmara de cromatografa.Pulverizador.Secadora de mano.Tubos de prueba de 13 x100mm.Pera de decantacin.Palitos de fosforo, soporte universal, anillo de filtracin, Baguetas,pipetas de 5 ml, 4 capilaresPlacas cromatografas de HPTLC

Guantes, tapa boca, cuatro capilar de hematocrito, frascos detapa boca, fsforos o encendedor, frascos de plsticos de anlisis

con tapa (h= 8 a 10 cm) secador de cabello. Embudo deseparacin, soporte universal, pulverizador., butanol-cido actico- agua destilada (4-1-5 v/v) estndares deaminocidos, alimentos que probablemente contenganaminocidos, etanol, ninhidrina la 5 %, acetona.

IV.PROCEDIMIENTO

a. Preparacin de la cmara cromatogrfica:

En una pera de decantacin se mezclan: butanol: cidoactico: agua, en la proporcin de 4: 1: 5 se agita suavementepor rotacin y luego se deposita en una pera de decantacin,dejarlo por una hora hasta q se separe, usar la fase orgnica, lamicro-cmara, se tapa y se deja en reposo por 15 minutos, ohasta saturacin de la cmara.

b. Preparacin del soporte.

Se prepara una cromatoplaca de 8 x 2.5 cm, a unos cm del bordese traza con lpiz una lnea recta. Sobre esta lnea se marcanpuntos, a distancia de 0.5 cm, donde se depositar la muestraproblema y los standard.

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c.

Preparacin del Cromatograma

Utilizando un capilar se van depositando en uno y otro de

los puntos marcados , la mezcla de 3 estndares, as comouna muestra de material biolgico. Tras cada aplicacin seseca la mancha.

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d. Desarrollo del Cromatograma.

El Cromatograma as preparado se introduce en la cmarapreviamente saturada, cuidando que el solvente impregne elsilica gel, pero no cubra las gotas de muestras aplicadas.Cuando el solvente ha ascendido hasta la parte superior dela placa, se saca sta de la cmara, y se seca bien con unsecador.

e. Reveladod

elCromatograma

A continuacin la cromatoplaca se pulveriza con la solucinde cloruro de fierro y la solucin de tricloruro de aluminio, y seseca en estufa a 60 C. A los pocos minutos aparecern lasmanchas de que se pueden identificar por su Rf (distanciaorigen- mancha / distancia origen - frente del disolvente).

V. RESULTADOS.

Una vez que se revela el Cromatograma, se procede adeterminar el Rf de cada mancha correspondiente al estndar.El Rf permite determinar que aminocido se muestra en lamuestra problema.

VI. CUESTIONARIO.

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a. Describa como realizara la separacin de los aa. TLC yHPTLC.

b. Cmo investigara la presencia de azucares libres enharina de maz.

c. Describa los metabolitos secundarios en los vegetales

d. Que otros solventes podemos usar?

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS1. Calixto C. Mara R. Gua de prcticas de Qumica Integrada.

UNMSM-Fac. Medicina .Lima, Per 2008 p.302. Da Zagoya. Bioqumica. 1 edicin, Editorial Mc Graw Hill. 2007.

India, p. 4903. Coultate T.P Qumica y Bioqumica de los alimentos. 3 edicin

Edit Acribia Zaragoza-Espaa.200.

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