PRACTICA 2. SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES POR CROMATOGRAFIA DE PAPEL

Introducción

La cromatografía es un poderoso método de separación que tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. La cromatografía en columna fue inventada y de nominada así, a principios del siglo xx por el botánico ruso Mikhail Tswett. El empleo la técnica para separar varios pigmentos vegetales, tales como clorofilas y xantofilas, atreves de una columna de vidrio rellena con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecían como bandas coloreadas en la columna, lo que justifica el nombre que eligió para el método (del griego CHROMA que significa <<color>>, y GRAPHEIN que significa <<escribir>>.)

La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta distintas variantes. En toda separación cromatografía hay dos fases (solida, liquida o gas) una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto intimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar se invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente esta la mayor parte del tiempo en la fase movil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho mas lenta. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

Se dividen en tres categorías:

Análisis por elución. Proceso por el cual el soluto es lavado por la columna añadiendo mas disolvente se llama elución y es la forma más corriente de hacer una separación.

Análisis frontal. En este análisis se alimenta continuamente a la columna con una solución de la muestra.

Por desplazamiento. Se introduce la muestra como una solución. En una sola porción pero se hacen que los componentes bajen por la columna por la adición continua de una solución que por la fase estacionaria que cualquier otro de los componentes de la muestra. La concentración de cada uno de los componentes puede determinarse por las distancias del cronograma.

CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL

Es un método sencillo, ya que se emplea un papel filtro en lugar de una columna de relleno. Se acostumbra describir la trayectoria de un soluto en particular en función de retardo que se define como

Rf= distancia del movimiento soluto entre distancia del movimiento de solvente

PrácticaLa fase móvil será un disolvente apolar (mezcla de éter de petróleo/acetona/benceno en proporción 85/10/5). La fase estacionaria, de naturaleza polar, será el agua adsorbida en el papel de celulosa utilizado como soporte.La fase móvil ascenderá por el papel sin mezclarse con el agua, al tiempo que los pigmentos se irán separando en función de su polaridad. Los pigmentos más polares se retendrán más en la fase estacionaria, mientras que los más apolares avanzarán más rápido junto con la fase móvil. La movilidad de cada compuesto respecto al frente del disolvente tiene un valor característico, en unas condiciones experimentales determinadas, que se conoce como coeficiente o factor de reparto (Rf).

Rf = Xp/XdXp= distancia alcanzada por el pigmentoXd= distancia alcanzada por el disolvente

Método1. Extracción: en el papel de celulosa se dibujan 2 líneas con lápiz. Una a 2 cm de uno de los extremos y otra a 1 cm del otro extremo. Cortar una hoja de espinaca en tiras estrechas. colocar un trozo de hoja y machacarla sobre una superficie plana con las

pinzas. Retirar los restos de hoja. Colocar una mancha sobre la línea situada a 2 cm del papel de celulosa,

repetir el proceso, hasta tener una mancha oscura de pigmentos en el papel.

2. Separación: Tomar un tubo de ensayo seco de calibre grueso y añadir 3 mL de disolvente.

Tomar la tira de papel con la muestra de pigmentos y colgarla del tapón de corcho por el extremo opuesto a la muestra (por encima de la marca de 1 cm).

Introducir la tira de papel en el tubo de manera que no toque las paredes y que el disolvente moje el extremo de la tira, pero sin llegar a tocar la muestra.

Esperar a que el disolvente ascienda por capilaridad hasta aproximadamente la marca superior del papel.

Sacar la tira del tubo, dejar secar y medir el Rf de cada mancha de pigmento que aparezca.

Cuestiones1.      ¿A qué pigmento corresponde cada mancha y cuáles son sus Rf?2.      ¿Qué factores pueden afectar al Rf?