PRACTICA N 04: TCNICAS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

ASIGNATURA:

MICROBIOLOGIA PARASITOLOGIA

DOCENTES:

Dr. CELINDA USQUIANO MARQUEZDr. EDINSON MORALES CHAVEZLic. SONIA FIESTAS PURIZACA

ALUMNO:Aguilar Maldonado Jean

Ao: 20015

I. INTRODUCCIN

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos.

Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, aireacin la luminosidad.

La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.

II. OBJETIVOS

Adquirir la manualidad y destreza en la siembra de microorganismos que le permitan la obtencin de cultivos puros.

Obtener cultivos puros mediante trasplante en caldo, Agar inclinado y agar por picadura.

PRACTICA N 04: TCNICAS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCION:Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. LA SIEMBRA es el paso inicial en el estudio de las propiedades culturales de un germen. Es el procedimiento por el cual se pone en contacto el microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin pueda desarrollarse y multiplicarse in vitro. La siembra se efecta utilizando el asa bacteriolgica, que permite una diseminacin de los grmenes en el medio de aislamiento, cuando este es slido, la misma que deber esterilizarse previamente. El fin perseguido es el de conseguir que un germen quede aislado de otro en la superficie del medio, donde se reproducir hasta el punto de dar una colonia, cuyos componentes en ultimo termino descienden de un solo germen (o de un acumulo de grmenes de un solo tipo).Esta forma de aislamiento fue un aporte fundamental a la tcnica bacteriolgica y se debe a Roberto Koch. Tambin se puede utilizar medios lquidos para cultivos primarios, sobre todo cuando se trate de aislar anaerobios, debiendo anotarse que en este ltimo caso, no siempre es posible conseguir un cultivo puro. La prctica pretende dar al estudiante la manualidad necesaria para sembrar muestras en diversos medios y comprender que la meta del trabajo es el aislamiento de los grmenes.

MODALIDADES DE SIEMBRAS: Para la diseminacin de los microorganismos es necesaria una amplia superficie de medio nutritivo, sta se logra en las placas de Petri y en menor medida en el agar inclinado. La tcnica de la siembra en si, consiste en pasar sobre toda la superficie del medio, el instrumento portador del inculo; en esta modalidad es recomendada evitar daar la superficie del medio. Los tubos y placas petri donde se har la siembre, se marcan con un lpiz para vidrio poniendo nombre o numero de registro, fecha u otro dato importante. Siempre debe trabajarse cerca del mechero para flamear la boca del tubo o la placa Petri con el medio, antes y despus de sembrar para evitar contaminaciones.

INCUBACIN: Despus de la siembra, las placas Petri deben quedar en la incubadora con la tapa hacia abajo, para que el agua de condensacin (Desprendida por el calor de la estufa) no malogre la siembra.

LECTURA DE LA SIEMBRA: Esta se realiza entre las 12 y 24 horas tiempo en que aparecen por lo comn las primeras colonias y es cuando comienzan la observacin del cultivo. En las colonias se estudia la forma, tamao, contorno, coloracin, emulsionabilidad, grado de opacidad, superficie y consistencia.

En los medios lquidos se observa el grado de turbidez o la formacin de una pelcula sobre el medio. Uno de los caracteres fundamentales en una colonia es el referente a su contorno y superficie. Las colonias de contorno regular y superficie lisa, se llaman colonias S (de la palabra inglesa Smooth que significa suave - liso). Las de contorno y superficie irregulares, se llaman colonias R (de Rouge que significa rugoso). Estos aspectos tienen relacin con la virulencia de algunos grmenes.

TRANSPLANTE O RESIEMBRA:El estudio macroscpico de las colonias se completa con un estudio microscpico que se realiza emulsionando una fraccin de la colonia en una pequea gota de suero fisiolgico cuidando que la extensin sobre la lmina sea fina. Se fija, se colorea y se observa con aceite inmersin. Luego se proceder al trasplante o resiembra que consiste en tomar con el asa la fraccin de la colonia elegida (repicaje de colonias) y llevar este inculo a otro medio liquido o slido en el que se obtendr el desarrollo de una sola especie de grmenes, lo cual constituye la fase final del proceso de aislamiento. El germen aislado en estado de pureza constituye una cepa, Los procedimientos de siembra en los trasplantes varan segn el medio que se va a usar.Si el medio es liquido, bastar tocar la superficie de este con el inoculo. Si el medio es slido varia la forma de siembra siendo en unos casos por estra, o sea pasando el inculo en zig-zag sobre la superficie del medio inclinado, y en otros por puncin o picadura, que consiste en introducir la aguja hasta el fondo o a poca profundidad segn la naturaleza del medio. El asa se esteriliza al rojo antes y despus de su empleo.

II. COMPETENCIAS: Al trmino de la practica el alumno debe: Adquirir la manualidad y destreza en la siembra de microorganismos que le permitan la obtencin de cultivos puros. Obtiene cultivos puros mediante trasplante en caldo, Agar inclinado y agar por picadura.

III MATERIAL: Material Biolgico: Muestras de Orina y Heces Asa bacteriolgica en anillo y en punta, Mechero. Tubos con suspensin bacteriana Placas de Agar Nutritivo Placas con Agar Mc Conkey Placas con Agar XLD Placas con Agar SS Tubos con Caldo Nutritivo estril. Tubos con Agar TSI Tubos con Agar LIA Tubos con Agar SIM Tubos con Agar Citrato Tubos con Agar Urea

IV. PROCEDIMIENTOS:a. MTODO DE AISLAMIENTO.- AISLAMIENTO POR DISEMINACIN (mtodo en superficie).Muestra: Orina Esterilizar un asa bacteriolgica y dejar enfriar por 5 seg. Introduzca el asa bacteriolgica y retire una asada de la suspensin bacteriana. Flamear los bordes de una placa de agar Mc Conkey. Levante la tapa de la placa justamente lo necesario para introducir el asa bacteriolgica cuya carga es diseminada por la superficie del agar mediante el proceso de estriacin por agotamiento. Segn esto la primera estriacin contendr ms cultivo que la segunda, esta ms que la tercera y as sucesivamente de modo que en las ltimas estar suficientemente agotado para dar colonias aisladas. Marcar las placas sembradas, con plumn indeleble, a fin de que permitan su identificacin posterior. Incubar las placas en posicin invertida a 37C por 24 hs. Realizar el estudio de las colonias y/o realice el Transplante de las colonias para obtener cultivos puros.

Para sembrar en placa Petri es importante que la superficie del medio este completamente seca, para conseguir esto las placas deben quedar en reposo durante 2 reposo.

AISLAMIENTO POR DISEMINACIN (mtodo en superficie).Muestra: Heces Esterilizar un asa bacteriolgica y dejar enfriar por 5 seg. Introduzca el asa bacteriolgica y retire una asada de la suspensin bacteriana. Flamear los bordes de una placa de agar XLD. Levante la tapa de la placa justamente lo necesario para introducir el asa bacteriolgica cuya carga es diseminada por la superficie del agar mediante el proceso de estriacin por agotamiento. Segn esto la primera estriacin contendr ms cultivo que la segunda, est ms que la tercera y as sucesivamente de modo que en las ltimas estar suficientemente agotado para dar colonias aisladas. Marcar las placas sembradas, con plumn indeleble, a fin de que permitan su identificacin posterior. Incubar las placas en posicin invertida a 37C por 24 hs. Realizar el estudio de las colonias y/o realice el Transplante de las colonias para obtener cultivos puros.

b. MTODOS DE TRANSPLANTE: SIEMBRA POR ESTRAS EN AGAR INCLINADO: Esterilizar una aguja bacteriolgica. Dejar enfriar 5sg. Tomar con la mano izquierda un tubo con suspensin bacteriana en desarrollo, y homogenizar. Tomar un tubo con agar inclinado (citrato): con el dedo meique de la mano derecha quite el tapn de algodn; flamee la boca del tubo; introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la colonia y realice la siembra por estras sobre la superficie del agar inclinado Retire la aguja bacteriolgica, vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapn de algodn. Deje el tubo en la gradilla. Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente. Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 hs. Realice el estudio de las caractersticas del cultivo.

SIEMBRA EN SUPERFICIE Y PICADURA:

El inculo es introducido con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estra ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de la siembra.

SIEMBRA EN AGAR POR PICADURA: El inculo es introducido con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de la siembra Esterilizar una aguja bacteriolgica. Dejar enfriar 5sg. Tomar con la mano izquierda una placa con colonias en desarrollo Coger una asada de la colonia sospechosa con una asa en punta Tomar un tubo con agar no inclinado y con el dedo meique de la mano derecha quite el tapn de algodn; flamee la boca del tubo; introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la colonia y realice la siembra por picadura en el agar profundo. Retire la aguja bacteriolgica; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapn de algodn deje el tubo en la gradilla. Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente. Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 horas. Realice el estudio de las caractersticas del cultivo.

SIEMBRA EN CALDO Esterilizar una aguja bacteriolgica. Dejar enfriar 5 seg. Tomar con la mano izquierda una placa con las colonias en desarrollo, flamee los bordes de la plazca y levante justamente lo necesario para introducir la aguja bacteriolgica y extraer una colonia. Tomar un tubo con caldo nutritivo; con el dedo meique de la mano derecha quite el tapn de algodn, flamee la boca del tubo, introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la colonia y realice la siembra por suspensin en el medio liquido. Retire la aguja bacteriolgica; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de nuevo el tapn de algodn. Deje el tubo en la gradilla. Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente. Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 horas. Realice el estudio de las caractersticas del cultivo. Anotar los resultados

CUESTIONARIO:1. Qu diferencias hay entre siembra por difusin y siembra por diseminacin-Siembra por difusin: primero el inculo (1 ml) en la placa de Petri y luego el agar (a 45 C), homogeneizando.Siembra por diseminacin: el inculo (0,1 ml) se coloca sobre el agar ya solidificado y se disemina con esptula.2. Cul es el objetivo de la siembra de microorganismos

A partir de colocar a los microorganismos en un medio nutritivo adecuado, su objetivo es obtener aislamientos de bacterias, estudiar las caractersticas fisiolgicas, metablicas, morfolgicas, etc.

Y tambin en las colonias se estudiara la forma, tamao, contorno, coloracin, emulsionabilidad, grado de opacidad, superficie y consistencia.

3. Qu mtodos utilizara para cultivar y aislar microorganismos anaerobios

Recipientes de cierre hermtico, reemplazando el aire de su interior por una mezcla de gases inertes. Estos gases se pueden generar utilizando sobres generadores de anaerobiosis, que con el agregado de agua generan hidrgeno y dixido de carbono (H: 80%, CO2: 20%). El oxgeno residual se convierte en agua gracias a un catlizador (paladio).

Se debe colocar un indicador de reduccin (p.e. azul de metileno) que se decolorar cuando la atmsfera se encuentre en un estado reducido indicando anaerobiosis.

4. A qu se llama unidad formadora de colonia

Se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula viva y aislada que se encuentra en un substrato y en condiciones ambientales adecuadas y produce una colonia en un breve lapso de tiempo. Una UFC tambin puede corresponder a ms de una clula cuando stas forman parte de grupos unidos fuertemente (estreptococos o diplococos, por ejemplo) ya que cada grupo formar una sola colonia.

5. DEFINIR: SIEMBRA BACTERIANA

Sembrar o inocular bacterias es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen: Que se efecten aspticamente Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados Que se realicen solo los manipuleos indispensables Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

6. Cules son los requerimientos indispensables para el desarrollo in vitro de los microorganismos

En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibitico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones teraputicas individuales.El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infeccin a uno o varios antibiticos.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiolgico, a escala de un servicio, un centro de atencin mdica, una regin o un pas, es como puede adaptarse la antibioterapia emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos de los antibiticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevencin en los hospitales.7. Esquematice y explique la curva de crecimiento bacteriano

En un cultivo bacteriano en medio lquido, se pueden diferenciar cuatro fases en laevolucinde los parmetros que miden el crecimiento microbiano:

Fase lag o de adaptacin: Durante la que los microorganismos adaptan sumetabolismoa las nuevas condiciones ambientales (de abundancia de nutrientes) para poder iniciar el crecimiento exponencial. Fase exponencial o logartmica: en ella lavelocidadde crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen los nutrientes del medio a velocidad mxima. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica con elmodelomatemtico descrito anteriormente. Esta fase corresponde a la de infeccin y multiplicacin dentro del organismo del agente infeccioso. Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase de exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia en el curso de las infecciones o intoxicaciones producidas por bacterias. Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo.

III. CONCLUSIONES

Por medio de esta prctica se logr utilizar las tcnicas aprendidas durante el transcurso del curso. Se logr aprender a realizar algunos de los mtodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus caractersticas tanto macroscpicas como microscpicas e interpretacin de las mismas, con lo que se observ que para cada bacteria existen caractersticas diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observacin para anlisis posteriores o simplemente para la identificacin de una bacteria en algn medio u organismo

IV. BIBLIOGRAFA

http://www.oocities.org/ar/vetterworld/microbiologia/cuest_u5.htm. VISTO EL 06 DE MARZO DEL 2015. http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/tema%2002.pdf. VISTO EL 06 DE MARZO DEL 2015. http://www.monografias.com/trabajos27/crecimiento-bacteriano/crecimiento-bacteriano.shtml. VISTO EL 06 DE MARZO DEL 2015. http://www.medicina.unal.edu.co/Departamentos/microbiologia/Docs/W_IDENTIFICACION_BACTERIANA%20I%2014.pdf. VISTO EL 06 DE MARZO DEL 2015. http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf. VISTO EL 06 DE MARZO DEL 2015.