PRACTICA 9: ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

UNFV/FIIS ANÁ LISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

PRACTICA N° 9

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

I.INTRODUCCIÓN

Alteraciones en la manipulación almacenamiento de mariscos

1.1 Cambios bioquímicas

Las modificaciones sufridas por el marisco desde su captura hasta que

llega al consumidor tienen aspectos similares a las del pescado, pero

difieren notablemente en otras. El envejecimiento y el deterioro de los

tejidos ocurren de modo parecido al del pescado, y se ve influido por

idénticos factores. La escasa cantidad de glúcidos en los crustáceos y la

riqueza en enzimas proteoliicos determinan una leve caída del pH y una

rápida alterabilidad, con liberación de compuestos nitrogena dos

volátiles. Algunos enzimas oxidan pigmentos, que dan lugar a un

ennegrecimiento de la cabeza conocido como melanosis. En los

moluscos, la cifra de glúcidos permite un mantenimiento mas prolongado

de su buen estado.

1.2 Derivados de los mariscos

Los productos derivados de los mariscos que recoge el Código

Alimentario Español son: semiconservas, conservas, sopas de mariscos

y bullabesas y platos cocinados.

Tienen características parecidas a las de los derivados del pescado,

pero lógicamente la base la constituyen los crustáceos y los moluscos.

GUIA DE LABORATORIO Biol. Ms. C. Alicia Decheco EgusquizaMICROBIOLOGIA II

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Semiconservas.-Son productos a base de crustáceos y de

moluscos sometidos a un tratamiento apropiado y mantenidos en

recipientes impermeables al agua a presión normal. Las

semiconservas deben almacenarse en frigorífico y su conservación

es limitada en el tiempo. Pueden darse como mariscos enteros o

troceados y suelen llevar un líquido de cobertura, que puede ser

aceite vegetal, vinagre o la mezcla de ambos en diferentes

proporciones y con distintos condimentos.

Conservas.- Son aquellos productos hechos (OR moluscos o

crustáceos, con o sin adición de sustancias autorizadas, contenidos

en envases herméticamente cerrados y tratados exclusivamente por

el vapor, para asegurar su conservación.

1.3 Alteraciones en e almacenamiento

El marisco congelado almacenado sufre, al igual que el pescado,

procesos que cambian su composición lipidia. Las grasas modificadas

con las proteínas, dando lugar a complejos lipoproteicos y a compuestos

de molécula pequeña. Aparecen pigmentos castaño-rojizos, equivalentes

a la lipofucsina, que se utilizan para determinar la edad de los

crustáceos marinos. La interacción lipídico-proteica retarda la oxidación

de las grasas durante e almacenamiento.

En los mariscos enlatados y sometidos a la acción del calor se precisa

realizar una serie de tareas. Las gambas y otros crustáceos, después

de descongeladas, se lavan, separado los ejemplares rotos, decolorados

o alterados y los residuos extraños. Más tarde, se les quita la cabeza y

se pelan; posteriormente, se escaldan en salmuera hirviente. Estas

gambas precocidas se lavan de nuevo, se revisan, se categorizan y se

envasan a mano o a máquina.


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Por último, se añade salmuera, aceite o salsa y se cierran los envases.

En cuanto a las almejas y otros moluscos, en primer lugar se lavan para

que desaparezca la arena y el barro; luego, se precuecen al vapor. Mas

tarde, se extraen de las conchas a mano o a maquina y se cortan por un

lado para eliminar completamente la arena o el barro que pudiera

quedar. Tras un nuevo lavado se extirpan el sifón, las paredes laterales

del cuerpo y el estómago, procediendo, por último, al envasado y a la

adición de agua, salmuera, aceite, jugo o salsa.

Como ocurre en el pescado, tras someter a gambas, langostas y

cangrejos a la acción del calor, pueden aparecer manchas negras en la

superficie por el depósito de sulfuro de hierro.

2. Microbiología de los mariscos

2.1 Características microbiológicas

La presente de bacterias en la superficie de los crustáceos es similar a la

del pescado. En el caso (de los moluscos, la contaminación se reduce

ostensiblemente cuando se someten a depuración en tanques con agua

marina limpia circulante. La posible existencia de gérmenes patógenos

se corresponde con el lugar donde viven y con la forma de alimentarse,

caracterizada, en los moluscos bivalvos, por la filtración de muchos litros

de agua cada día. Los microorganismos más ubicuos son Salmonella,

Shigella, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Clostridium perfringens y

virus.


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2.2 Cambios microbiológicos

Las alteraciones microbiológicas que sufren los mariscos constituyen,

en muchos casos, graves problemas de salud pública. Los crustáceos se

suelen capturar en regiones alejadas de la costa, por lo que no suelen

portar gérmenes patógenos. No obstante, se ha extendido su cultivo en

viveros de regiones costeras, en las que el peligro de contaminación se

multiplica; de hecho, se han descrito importantes brotes de intoxicación

por Vibrio parahaemolyticus, procedente de residuos terrestres, en

mariscos cocidos y recontaminados con posterioridad.

En los moluscos con alteraciones de detecta un crecimiento de bacterias

Gram negativas proteolíticas: Pseudomonas y Vibrio, y sacarolíticas:

Lactobacillus. Las primeras generan aminas y amoniaco; las segundas

reducen el pH. Tomar ciertos moluscos bivalvos crudos puede ocasionar

toxiinfecciones graves por Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,

Escherichia coli, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens,

Staphylococcus aureus enterotoxigénico, Vibrio parahaemolyticus y

virus. El consumo de otras alteradas puede acarrear cuadros de fiebres

tíficas, paratíficas, hepatitis víricas. Los mejillones crudos, mal cocinados

o recontaminados, pueden ser origen de fiebres tíficas y de

salmonelosis.

Mención aparte merece la contaminación por biotoxinas marinas

fabricadas por los dinoflagelados presentes en el plancton. Algunos

biotoxinas afectan al sistema nervioso las neurotoxinas – y otras, al tubo

digestivo – enterotoxinas -. En determinadas circunstancias favorables,

los dinoflagelados ascienden hacia la superficie marina y se reproducen

rápidamente, dando lugar a coloraciones extrañas, entre las que

predomina el rojo; este fenómeno se conoce como marca roja o purga

de mar. Los moluscos, en especial, los mejillones y las almejas, filtran

cada día grandes cantidades de agua y se alimentan de estos

organismos, y las toxinas se fijan al hepatopáncreas o al sifón. Al ser


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consumidos por el ser humano, sobreviene la intoxicación que, en el

caso de la neurotoxina, puede ocasionar la muerte y en el de la

enterotoxina, provocar trastornos gastrointestinales.

2.3 Control microbiológico de los mariscos

Las muestras de crustáceos con caparazón se consiguen

desinfectando, su superficie con alcohol de 70°C y, luego, se retiran

asépticamente con material estéril. Si carecen de caparazón, la carne se

debe manipular también (le modo aséptico con material estéril).

Si se trata de moluscos se debe tomar un número suficiente (los

individuos para que el volumen de carne y de líquido intervalvar no sea

inferior a 0 ml.

Se deben limpiar concienzudamente a chorro y mediante un cepillo para

retirar todo tipo de sustancias extrañas adheridas a las conchas como

algas, tierra, etc.

Tras un ligero flameado, las valvas se abren y recogen los cuerpos y el

líquido intervalvar sobre pro beta estéril. Se añade diluyente hasta

obtener un dilución 1:10 0; se puede utilizar como diluyente solución

Ringer a 1/4 agua de triptona. Finalmente, la mezcla se tritura y

homogeneiza y se usa como solución madre.

El protocolo de estudio microbiológico en los mariscos es el siguiente:

Recuento de colonias aerobias revivificables.

Investigación y recuento de Escherichia coli.

Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales.

Investigación de Salmonella y Shigella.

Investigación y recuento de Streptococcus aureus

enterotoxigénico.


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Investigación y cuento de Streptococcus D. de Lancefield.

Investigación de Vibrio paraharahaemolyticus

Investigación de biotoxinas marinas hidrosolubles (PSP).

Investigación de biotoxinas marinas liposolubles (DSP).

Investigación de toxinas botulínicas.

Para la investigación de toxinas marinas se puede recurrir a métodos

biológicos, inmunológicos y químicos. El bioensayo en ratón es el

Procedimiento oficial para determinar biotoxinas PSP, y es el mejor

método de que se dispone. Se valora la posibilidad de sustituirlo por

algún otro método, especialmente, fluorométrico o HPLC. Para las

biotoxinas DSP se puede utilizar el bioensayo en ratón o HPLC.

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MARISCOS

Preparación de la muestra

Mariscos con valvas:

1. Recipiente con boca ancha con capacidad de 20 unidades de mariscos

con valvas aprox. 10 gr.

2. Recipiente con escurridero de agua.

3. Vaso de precipitación con 500 ml. de capacidad.

4. Vaso de licuadora estéril.

5. Escobilla dura.

6. Cuchillo estéril

7. Cuchara estéril

8. Servilleta estéril.

9. Balanza de capacidad no inferior a 2500 gr. y una sensibilidad de 0.1 gr.


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10.Licuadora de 2 velocidades.

11.Alcohol etílico de 70%.

12.Solución buffer de fosfato o agua de peptona el 01%.

13.Mechero.

14.Asa de siembra.

15.Tubo con cultivo puro.

16.Tubo con TSI.

17.Tubo con SIM.

18.Tubo con LIA.

19.Tubo con citrato.

PROCEDIMIENTO

1. Colocar 20 unidades de mariscos valvados en un recipiente de boca

ancha. Cepillar cada uno de ellos bajo el chorro de agua potable, con

especial atención a las grietas y uniones de las valvas.

2. Colocar las muestras limpias en un recipiente con calador y dejar

escurrir el agua.

3. Lavar y desinfectar las manos con alcohol de 70%.

4. Colocar la muestra en la mano sobre una servilleta de papel limpia, de

tal forma que una de las partes convexos, descanse sobre la palma de la

mano.

5. Insertar el cuchillo en el punto de unión de las valvas. Cortar el músculo

de la valva superior, palanquear las valvas y dejar que el líquido caiga

sobre el vaso de precipitados previamente tapados. Retirar la bañada

superior y transferir la carne al vaso contenido el líquido valvar.


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6. Pesar el vaso con la muestra extraída.

7. Transferir la muestra al vaso de la licuadora.

8. Adicionar una cantidad igual al peso de la muestra de solución buffer de

fosfato o agua peptonada al 0.1%.

9. Homogenizar tomando las precauciones indicadas en preparación y

dilución de las muestras de alientos ( 2 ml de este, homogenizado

contienen 1 gr. de mariscos).

En caso de que el homogenizado resulte de consistencia pesada y difícil de

pipetear, adicionar 3 partes de diluyentes en peso de la muestra (4 ml., de

esta muestra contiene 1 gr de las muestras en examen). Corregir las

proporciones a ser tomadas para la siembra.

MEDIOS UTILIZADOS

CALDO AZIDA – GLUCOSA

Art. Num 1590

Para ensayo previo orientativo de enterecocos y para enriquecimiento selectivo

de los mismos.

Este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de los

Estándar Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975).


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Forma de preparación

La sodio-asida presenta en una concentración que respeta al máximo a

los enterococos e inhibe notablemente a la flora gram-negativa que les puede

acompañar.

La utilización de sodio-azida como sustancia inhibidora selectiva de

bacterias gramnegativas se remonta a los trabajos de EDWARS (1933 – 1938)

y HARTMANN (1936) sobre el aislamiento del Str. Agalactiae, Ulteriormente,

MALLMANN (1940) y SNYDER aislamiento de enterococos a partir de aguas.

La demostración de enterococos (Streptococcus faecalis, S. bovis y S.

Equinus) sirve como un indicador de contaminantes fecales, especialmente de

corrientes de agua, aguas residuales que contengan cloro y baños Yodo, en

todos los cuales pueden estar ya extinguidas en el momento de la

investigación las bacterias coliformes menos resistentes, inclusive E. Coli.

Composición (g/litro)

Peptona de caseína 15.0; extracto de carne 4.8; D (+)-Glucosa 7.5;

Sodio cloruro 7.5; Sodio azida 0.2.

Preparación

Disolver 35 g o 70 g por litro, distribuir y esterilizar autoclave. No recalentar.


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Empleo e interpretación

Si la cantidad de producto a ensayar es pequeña (hasta 1 ml, se incorpora en

el caldo de concentración sencilla (35 g/litro) que queda así diluido a la

concentración habitual.

Incubación : desde 254 hasta 48 horas, a 37°C.

La producción de enturbamiento durante la incubación (crecimiento)

permite sospechar la presencia de enterecocos. En este caso, y para su

confirmación, se resiembra en Calco-purpura de bromocresol – axida (MERCK,

Art. Num 30332). Si no se presenta turbidez alguna, puede desecharse con

seguridad la presencia de enterococos.

Agar ENDO-C

(Agar-fucsina-lactosa seg. ENDO, tipo)

ENDO-C Agar

Art. Num 4044

Medio de cultivo selectivo, para demostración y aislamiento de E. Coli fecal y

coliformes en los más diversos materiales.

Este medio de cultivo corresponde a lo prescrito en los Estándar

Methods for the Examination of Dairy Products (1967) y en los Estándar

Methods for the Examination odf Water and Wastewater (1975).


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Forma de actuación

El sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias gram positivas E. Coli

y coliformes utilizan lactosa con formación de aldehído y ácido. Por otra parte,

el aldehído libera fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, lo cual da

lugar a la coloración roja de las colonias. En el caso de E. Coli, esta reacción

es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar y por este motivo, confiere a

dichas colonias un brillo metálico estable, de reflejo verde (típico de la fucsina

cristalizada).

Composición (g/litro)

Peptona de carne 10.0; di-Potadio hidrogenofosfato 3.5; Lactosa 10.0

Sodio sulfito, anhidro 2.5; Fucsina 0.4; Agar – agar 12.5.

Preparación

Disolver 39 g/litro, esterilizar al autoclave y verter en placas. Si el medio

de cultivo muestra, tras la solidificación, un tono rojo demasiado intenso puede

eliminarse dicho exceso de color añadiendo algunas gotas (hasta 1 ml/litro,

como máximo) de una solución, anhídrido, MERCK, Art. Num 6657, e hirviendo

el conjunto a continuación.

Ph 7.4 0.2

Por efecto del oxigeno atmosférico y debido a la consiguiente oxidación

del sulfito, el medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y

por lo tanto, inservible. Incluso conservado en la oscuridad y a la temperatura

de nevera, solo es utilizable durante pocos días.


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Empleo e interpretación

Sembrar las placas en estría por agotamiento

Incubación: 24 horas, a 37°C.

Colonias Microorganismos

Rojas

Rojas con brillo metálico

Estable

Rojas hasta rojizas, semi-esféricas

mucosas

Lactosa – positivos

E. coli

Enterobacter aerogenes,

Klesbsiella y tros.

Incoloras, claras Lactosa – (-)


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ANÁLISIS DE LA MUESTRA:

1. Preparar las diluciones decimales, siguiendo una de las técnicas

descritas en preparación y dilución de las muestras de alimentos, hasta la

dilución 10-4 o 10-5 si es necesario.

2. Efectuar las determinaciones microbiológicas de acuerdo al esquema de

trabajo y a la metodología descrita.

3. Reportar los resultados por gramo de muestra.

Pruebas Bioquímicas

La lectura en placa no es suficiente para poder identificar al (los)

microorganismos (s) en estudio, para ello emplearemos las pruebas

bioquímicas con las cuales podemos llegar a identificar el nombre del

espécimen cultivado.

Los medios de diferenciación más empleados en el laboratorio de

microbiología para la identificación de bacterias son: el agar citrato de

Simmons, el medio de SIM, el agar hierro tres azucares (TSI) y el medio de

LIA.

Luego se procederá de la siguiente manera:

1. Flamear el asa de siembra

2. Tomar una muestra del cultivo puro y sembrar en estría y por picadura en

los tubos con medios TSI, LIA y citrato. En el medio de SIM sembrar

únicamente por picadura.


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3. Incubar los tubos y hacer la lectura de los mismos a las 24 horas después

de la siembra.

4. Realizar la prueba de indol añadiendo unas gotas de

dimetilaminobenzaldehido.

5. Realizar la prueba de la catalasa para lo cual añadir unas gotas de peróxido

de hidrógeno sobre las colonias.


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CUESTIONARIOCUESTIONARIO

1. Explique la importancia de evitar contaminación por Vibrio vulnigicus y

Salmonella en mariscos y pescados.

2. Parásitos que puedan ser transmitidos por alimentos marinos.

3. Explique como se realiza el recuento de mohos y levaduras en muestras de

alimentos marinos.

4. Explique la toma de muestras, preparación de muestras y análisis

microbiológicos de los alimentos marinos.

5. Que microorganismos se pueden encontrar en el agua de mar, en las

lagunas y ríos.

6. Busque en alguno recuento o Internet algún proyecto o trabajo de

investigación relacionable a productos hidrobiologicos.

7. Cual es la finalidad del uso del medio TSI, que tipos de azucares participan

en este medio y a que microorganismos permite reconocer.

8. Cual es la finalidad del uso del medio de LIA, que reacciones nos permite

evaluar y que microorganismos nos permite identificar.

9. Que pruebas se pueden realizar en el medio citrato y que microorganismos

se pueden diferenciar con este medio.

10.Para que se emplea el medio de SIM, que microorganismos se pueden

reconocer con éste y como.


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11.Con que finalidad se realiza la prueba de la catalasa y la prueba del indol.


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