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PRCTICAS ABD: Alumnos convocados el da 23 de Febrero de 2009 Para realizar las prcticas deben: -Estar matriculados. -Haber presentado ficha al profesor de la asignatura o en su defecto presentarla en el momento de iniciarse la primera prctica. -Traer todos los das, desde el primer da de prcticas, la Gua Prctica de Parasitologa de venta en la fotocopiadora. Si usted la tiene por haber realizado las prcticas de Parasitologa de segundo curso, puede utilizar la misma. -Traer, todos los das de prcticas, bata de laboratorio blanca. -El da del examen de prcticas (el viernes 27) deben presentarse al mismo con la Gua que deber ser supervisada por el profesor. En este archivo se encuentra la planificacin de las prcticas. Es muy recomendable que lo lean antes del primer da de prcticas. La primera prctica no se encuentra desarrollada en la Gua, pero s en este archivo, por lo que deber imprimirse y adjuntarse a la Gua. PRCTICA 1. - Anlisis coprolgico: Artefactos y digestin. No viene en cuaderno de prcticas. Descarga de la presentacin en pgina web: http://www.ugr.es/~parasito/javier%20adroher.html Anlisis: coprolgico (leer pgs. 102-109 de la Gua Prctica de Parasitologa) Muestra: heces. Los restos macroscpicos y microscpicos que vamos a encontrar en las heces dependen de lo que se haya ingerido (accidental o voluntariamente) y de la actividad digestiva del paciente (productos generados por el propio organismo). En ocasiones los hallazgos estn relacionados con situaciones patolgicas. Aunque estos restos pueden ser de forma, tamao y naturaleza muy variada, vamos a observar los ms comunes de tamao microscpico.

a) Residuos de origen vegetal a. Pelos o tricomas. Semejan larvas de nematodos. Se observa su morfologa para

diferenciarlos de las larvas. En los pelos no se observan estructuras como la boca o el digestivo. Los pelos son refringentes. Si tienen un ensanchamiento en uno de sus extremos a modo de bulbo, son pelos urticantes.

b. Vasos o haces vasculares formados por vasos helicoidales, reticulados, laticferos,

i. Laticferos. Helicoidales. Ver a ms aumentos para no confundir, cuando son compactos, con cestodos.

ii. Anillo aislado de vaso laticfero. Puede recordar un quiste de protozoo o un huevo de helminto.

c. Clulas i. Ptreas: membrana endurecida, estratificada y con canalculos

ramificados. Las clulas ptreas (o esclereidas) suelen aparecer en las duras capas exteriores de las semillas y frutos, as como en la corteza y regiones del periciclo de tallos leosos. Se presentan aisladas o en grupos.

ii. Lignificadas: cubierta con lignina.

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iii. Amilceas ms o menos digeridas: contiene granos de almidn que con lugol (solucin de yodo) toman un color que va del negro al azul, pasando por los violetas. A veces la cubierta celular impide el paso del lugol, por lo que el almidn no se tie. Otras veces la cubierta se rompe y se pueden ver los granos de almidn sueltos.

iv. Los granos de almidn estn formados por amilosa y amilopectina. La primera reacciona con el yodo dando un color azul intenso. Cuando la amilasa pancretica va degradando la amilosa, forma dextrinas de distintos pesos moleculares, siendo la reaccin con el yodo menos intensa, dando as colores ms suaves (rojos, rosados, amarillos) hasta llegar a los tonos plidos de la acrodextrina.

d. Plenes i. Ciprs

ii. Pino iii. Olivo

b) Residuos de origen animal

a. Fibras musculares ms o menos digeridas i. Si estn, en general, poco digeridas (se observan estras) es signo de

trnsito intestinal rpido (patolgico o fisiolgico- mucha fibra-) o insuficiente produccin de jugos digestivos.

b. Grasas (posible presencia de grasa vegetal) i. Si hay mucha grasa (esteatorrea) puede ser signo de una giardiasis. La

grasa se presenta en gotitas esfricas (salvo que las heces estn fras, entonces en masas amorfas). Se tien de naranja a rojo con Sudn III.

c) Otros residuos

a. Cristales i. Charcot-Leyden: proceden de la destruccin de los eosinfilos, por lo

que su presencia est asociada a alergias y/o helmintiasis. ii. Oxalato clcico: proceden generalmente de la savia o de determinadas

clulas de las plantas. Puede cristalizar en diversas formas, la ms frecuente es la bipirmide tetragonal.

iii. cidos grasos. Proceden de la digestin de las grasas. cuando hay dficit de sales biliares, cristalizan generalmente en largas agujas.

d) Burbujas de aire

a. Esfricas. Incoloras. Contorno negro a refringente al mover el enfoque con el micromtrico. Tamao extraordinariamente variable.

Artefactos procedentes de la ingestin: Posible confusin con:

Pelos vegetales o tricomas Larvas de nematodos

Vasos o haces vasculares de origen vegetal

Cestodos

Anillo de vaso vegetal Quistes de protozoos Huevos de helmintos

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Clulas vegetales, sobre todo amilceas

Huevos de helmintos

Grnulos de almidn Quistes de protozoos

Plenes Huevos de helmintos Quistes de protozoos

Fibras de pltano Cestodos

Esporas de hongos Huevos de helmintos Quistes de protozoos

Gotas de grasa Quistes de protozoos

PRCTICA 2.- Tcnicas en coprologa parasitaria. Tcnicas de concentracin de quistes de protozoos y huevos de helmintos por mtodos fsicos: flotacin, flotacin-centrifugacin y centrifugacin. Observacin de huevos y larvas de helmintos en muestras biolgicas. a. Tcnicas en coprologa parasitaria. Fundamento y protocolo de la tcnica descrita en la Gua prctica de Parasitologa, pgs. 108-109. Mtodo de concentracin por flotacin Previamente hemos homogenizado la muestra de heces en solucin salina y el homogenizado lo filtramos para eliminar los elementos groseros. Ahora seguimos la tcnica desde el punto 3. 3.- Poner 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo, aadir 1 ml de solucin saturada de ClNa y volver a homogeneizar. 4.- Completar el tubo de ensayo con la solucin saturado de ClNa, hasta que se forme un menisco convexo en la superficie. 5.- Colocar un portaobjetos desengrasado en contacto con el menisco. 6.- A los 20-25 min retirar el portaobjetos rpidamente, taparlo con un cubreobjetos. 7.- Observar al microscopio (ver Figura 1 en la pg. 108 de la Gua). Tcnica de concentracin por centrifugacin de Telemann Previamente hemos homogenizado la muestra de heces en solucin salina y el homogenizado lo filtramos para eliminar los elementos groseros. Ahora seguimos la tcnica desde el punto 3. 3.- En un tubo de centrfuga se coloca 1 ml del filtrado de la muestra fecal y se le aade igual volumen de ter etlico. 4.- Tapar el tubo con un tapn de goma. Agitar varias veces, destapando de vez en cuando para eliminar los gases del ter. Cuidado con el ter y sus gases, son muy inflamables! 5.- Centrifugar durante 10 min a 1500 rpm. 6.- En el tubo se separan dos capas, una acuosa y otra etrea, y entre ellas existe un anillo (ver Figura 2 en la pg. 109 de la Gua). 7.- Mediante una fina varilla, se despega el anillo de las paredes del tubo y se decanta rpidamente el sobrenadante.

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8.- El botn se diluye con el lquido que resbala por las paredes del tubo y se toma con la pipeta para colocar dos muestras del mismo, una con lugol y otra sin lugol, entre portaobjetos y cubreobjetos. 9.- Observar al microscopio (ver Figura 1 en la pg. 108 de la Gua).

b) Observacin de formas parasitarias de helmintos: b. Larvas

i. Strongyloides stercoralis, larva en heces. ii. Dirofilaria inmitis, microfilaria en sangre.

c. Huevos: i. Schistosoma mansoni, en heces.

ii. Schistosoma japonicum, en heces. iii. Schistosoma haematobium, en muestras de orina. iv. Clonorchis sinensis, en heces. v. Trichuris trichiura, en heces.

vi. Enterobius vermicularis: mtodo de Graham (pg. 110 de la Gua).

PRCTICA 3.-

a) Tcnicas de diagnstico inmunolgico: inmunofluorescencia indirecta para el diagnstico de Leishmania.

Fundamento y protocolo de la tcnica descrita en la Gua prctica de Parasitologa, pgs. 150-154.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

1. Resuspender el antgeno particulado del parsito que se quiere diagnosticar y distribuirlo adecuada y uniformemente en todos los pocillos del portaobjetos. Secarlo al aire.

2. Una vez seco el porta, fijar el antgeno en un bao de acetona durante 10 min. Luego, sacar el porta y secarlo al aire.

3. Para llevar a cabo la prueba, colocar sobre un pocillo del porta una gota del suero problema (anticuerpos anti-parsito, si hay) previamente diluido en tampn de fosfatos salino (PBS) pH 7,2 hasta obtener la primera dilucin significativa para la prueba diagnstica ensayada 1/40. En pocillos consecutivos se colocan diluciones dobles seriadas del suero problema realizadas con PBS (una gota en cada pocillo). Todo ello se incuba 30 min a 37C en atmsfera hmeda (no debe secarse el suero).

4. Seguidamente, se procede a realizar dos lavados consecutivos de 5 min cada uno en tampn PBS. Secar al aire tras el segundo lavado.

5. A cada pocillo se aade una gota de conjugado fluorescente (anticuerpos anti-Ig humana marcada con un fluorocromo, en este caso la fluorescena) a la dilucin de trabajo, que lleva incluido el colorante de contraste (azul de Evans). Incubar 30 min a 37C en atmsfera hmeda (no debe secarse el conjugado).

6. Seguidamente, se procede a realizar dos lavados consecutivos de 5 min cada uno en tampn PBS. Secar al aire tras el segundo lavado.

7. Montar la preparacin con glicerina tamponada a pH 7,2 (9 glicerina: 1 PBS).

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8. Observacin al microscopio de fluorescencia. Verde: positivo; rojo: negativo. La ltima dilucin en la que se observa fluorescencia corresponde al ttulo del suero.

Deben realizarse controles de los reactivos empleados en el ensayo:

1. A) Control del conjugado: en lugar de suero problema se aade una gota de PBS en un pocillo.

2. B) Control negativo: en lugar de suero problema se aade, en un pocillo, una gota de un suero negativo contrastado.

3. C) Control positivo: en lugar de suero problema se aade, en un pocillo, una gota de un suero positivo de ttulo conocido.

b) Observacin de artrpodos parsitos:

d. Insectos: i. Pediculus humanus, adultos.

ii. Phthirus pubis, adultos. e. caros:

i. Sarcoptes scabiei, adultos. ii. Demodex folliculorum, adultos.

PRCTICA 4.- Tcnicas para el examen de protozoos.

a) Intestinales: en fresco y tincin con lugol (ver pg. 107 de la Gua) a. Entamoeba coli, quiste. b. Giardia lamblia, quiste y trofozoto.

b) Sanguneos y tisulares (ver pgs. 128 y 129 de la Gua)

a. Frotis y tincin Giemsa. i. Leishmania infantum, promastigotes.

b. Observacin de preparaciones permanentes previamente teidas con Giemsa. i. Trypanosoma cruzi, tripomastigotes.

ii. Trypanosoma brucei, tripomastigotes. iii. Leishmania, amastigotes. iv. Trichomonas vaginalis.

Control del conjugado

Control

Control +

Suero problema

1 dilucin

Suero problema

2 dilucin IFI

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PRCTICA 5.- Examen Se les dar una muestra biolgica (sangre y/o heces) y debern procesarla (empleando alguna de las tcnicas ensayadas en los das anteriores de prcticas) para realizar el diagnstico. Todas las muestras presentarn algn parsito de entre los observados en estas prcticas. Adems, se tendrn que identificar los parsitos en dos preparaciones adicionales. As mismo, en cualquiera de las tres preparaciones (muestra y preparaciones adicionales) deber reconocerse un artefacto. En cada caso hay que indicar en el folio que se les dar: -El tipo de muestra y, describiendo el procesamiento seguido, determinar el parsito, indicando su nombre cientfico, fase del ciclo de vida en que se encuentra y grupo taxonmico al que pertenece (nivel: Phylum-Clase-Subclase). -Igual procedimiento de denominacin del parsito se seguir en el caso de las dos preparaciones adicionales, donde deber indicarse el nmero de cada preparacin. -Asimismo se mencionar el artefacto observado, indicando el nmero de su preparacin.