Proyecto Bioinsectisida Taller Parte1a

TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORESDE ECATEPEC

Ingeniería Bioquímica

Método de Elaboración de un Bioinsecticida

A base de Bauveria bassiana

Equipo No. 5

De la Cruz Angeles Diana Carolina.Guerrero Chávez Arturo.Grupo:3551Fecha de entrega:08/04/2013

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Gobierno del Estado de México.Tecnológico de Estudios Superiores de EcatepecIngeniera Bioquímica.Taller de Investigación II Elaboración de Bioinsecticida

INDICE

RESUMEN…………………………………………………..pág. 3

PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA………………….….pág. 4

DESCRIPCION DE PROYECTO……………………….…pág. 4

JUSTIFICACION………………………………..……….….pág. 5

OBJETIVO GENERAL………………………….…………pág. 6

OBJETIVOS ESPESIFICOS……………………..………..pág. 6

INTRODUCCION……………………………………….…..pág. 8

MARCO TEORIOCO……………………………….……….pág. 11

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Vo.Bo.Dr. Hugo Minor Pérez

Div. Ingeniería Química y Bioquímica


BIBLIOGRAFÍA………………………………………………pág. 44

RESUMEN

En los últimos años, varios sistemas agrícolas han sido seriamente afectados por

plagas insectívoras que de ser, en general, una especie de importancia secundaria,

se ha convertido en un problema agrícola principal presente en todos los

continentes..

Aunque es difícil cuantificar su impacto sobre la producción, las pérdidas

ocasionadas por las plagas de esta especie, equivalen a decenas, y quizás cientos

de millones de dólares. Además, a las perdidas per se debe sumarse el aumento en

los costes de producción debidos sobre todo al uso de insecticidas. Varias especies

de parasitoides, depredadores y hongos entomopatógenos han sido estudiadas para

este fin. Los hongos entomopatógenos tienen la particularidad de invadir a sus

hospedantes a través del tegumento por lo que se consideran de gran utilidad para el

control de las poblaciones de insectos chupadores. Varios autores han apuntado la

posibilidad de empleo, en programas de control integrado de moscas blancas, de

hongos como Paecilomyces fumosoroseus Aschersonia aleyrodis, Verticillium lecanii,

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. Estos agentes pueden ser aplicados

de forma inundativa, con medios convencionales, dado que se multiplican con

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facilidad y son susceptibles de posterior manejo para la elaboración de formulados

insecticidas, donde la eficacia de un producto de estas características reside en la

correcta selección de la cepa que formará el ingrediente activo.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El uso excesivo de plaguicidas provoca efectos negativos en el suelo, el agua y el

ambiente. Además ha contribuido a aumentar los problemas de plagas debido al

desarrollo de resistencia y a la destrucción de los enemigos naturales. Muchos

plaguicidas también afectan la salud de las personas.

Para reducir estos efectos se procura la implementación de sistemas agrícolas

sostenibles, basados en el conocimiento de las relaciones entre los cultivos, el

ambiente y los organismos presentes en el campo.

Una de las alternativas es el uso de organismos entomopatogenos, los cuales tienen

la capacidad de reducir las poblaciones de plagas. Existen varios tipos de

organismos entomopatogenos, tales como virus, hongos, bacterias y nematodos.

Actualmente, se han identificado y estudiado diversas especies de hongos que

afectan plagas de cultivos de importancia económica; muchos de ellos son utilizados

exitosamente en programas de control biológico. Algunos de estos entomopatogenos

son reproducidos masivamente y se venden comercialmente.

DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO

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Montaje de una planta productora de plaguicidas biológicos, en donde el producto

principal sea esporas, que son producidas por un hongo entomopatógeno llamado

Beauveria bassiana.

JUSTIFICACIÓN

Debido a la ingestación de insectos sobre distintos cultivos en el país se generan

cuantiosas pérdidas económicas, obligado a los agricultores a buscar medidas para

eliminar a estos insectos y dándoles la posibilidad de exportar sus productos a

mercados donde se pagan mejor por sus productos como Estados Unidos de

Norteamérica y Asia. En estos las medidas de sanidad son más rigurosas que en

nuestro país por lo que los productores deben cuidar aspectos que eviten residuos

tóxicos sobre sus cultivos. Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno

específico para algunos insectos que atacan cultivos de algodón, aguacate, café,

chile, cítricos, flores, frambuesas, fresas, fríjol, papa, plátano, tomate, jitomate,

tabaco, soya y zarzamora. Este se puede aplicar como medida preventiva al ataque

de plagas, evitando aspectos desagradables sobre frutos, o aplicarse directamente

en cultivos siniestrados e inclusive en el producto cosechado con plaga.

Las plagas agrícolas han sido controladas durante años mediante el empleo de

plaguicidas químicos de fuerte impacto negativo sobre los organismos benéficos

presentes en el ambiente. Con el objetivo de promover y acelerar el uso de hongos

en el control de plagas en los cultivos es necesario el desarrollo de formulaciones

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eficaces y estables que permitan su manejo y aplicación en el campo. En este trabajo

se presentan consideraciones que se deben tener en cuenta para el desarrollo de

productos de origen fungoso, los tipos de formulaciones en que pueden ser

presentados y los logros obtenidos en este tema considerando que la forma

granulado y polvo humedecible son las más usada hasta estos momentos en la

presentación de este tipo de producto.

OBJETIVOS

Objetivo general

Desarrollo de una nueva tecnología para la producción de un insecticida biológico,

por medio de fermentación sólida, orientado a la producción de productos de

exportación en México.

Objetivo específicos

• Adaptar tecnología limpia.

• Mercado de Bioinsecticida.

• Estudio de la biodinámica poblacional de la plaga.

Técnica: La técnica usada para que el microorganismo produzca esporas, consiste

en una fermentación sólida utilizando una cepa mejorada originaria de México.

Económica:

• Retorno de capital

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• Generación de empleo

• Evitar tratamientos contra plagas de alto costo

• Ahorros de costos a largo plazo para el manejo integrado de la broca

• Inversión en la calidad del producto

Social:

Las armas de la industria química como lo son los plaguicidas que se ofrecen para el

combate de las plagas, como insecticidas, herbicidas y fungicidas; los cuales

provocan el envenenamiento a corto y largo plazo de la naturaleza, los trabajadores,

las comunidades rurales y los consumidores. Los secretarios de salud de los países

de Centroamérica estiman en casi 400 000 los envenenamientos causados por los

plaguicidas cada año. En Brasil se estiman 300 000; en México, las autoridades

registraron 2 800 casos en el 2002, en Chile se registraron 1 000; pero en la mayoría

de los países de mayor parte de las intoxicaciones no se reportan a las autoridades.

Ambiental:

• Entorno favorable para el caficultor

• Uso de productos que preserven el ambiente

• Contribución a la calidad de vida de la fauna

• Proliferación de ecosistemas benéficos

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INTRODUCCIÓN

”El desarrollo y aplicación de agentes de control biológico de plagas adquiere una

importancia relevante como una alternativa en el desarrollo de una agricultura

sostenible que preserve los recursos naturales y el medio ambiente para las futuras

generaciones. La aplicación controlada en agroecosistemas de organismos vivos o

sus metabolitos para el control de plagas y enfermedades, implica el mejoramiento

de los cultivos, al proteger las plantas del deterioro producido por agentes

fitopatógenos”

En la naturaleza, los hongos entomopatógenos pueden eliminar o mantener las

plagas en niveles que no ocasionan daños económicos a los cultivos

Estos hongos se encuentran en rastrojos de cultivos, estiércol, en el suelo, las

plantas; logrando un buen desarrollo en lugares frescos, húmedos y con poco sol.

Constituyen, además, el grupo de mayor importancia en el control biológico de

insectos plagas. Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las

enfermedades causadas por hongos

Se conocen aproximadamente 100 géneros y 700 especies de hongos

entomopatógenos. Entre los géneros más importantes están: Metarhizium,

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Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erilla, Eryniopsis,

Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium

Para utilizar hongos entomopatógenos como insecticidas deben producirse

cantidades masivas del hongo, el cual debe mantener su capacidad infectiva por un

período de tiempo considerable. Los hongos se han reproducido para su uso como

agentes biológicos de plagas desde hace 100 años, para lo cual se ha utilizado

diferentes métodos de reproducción. Entre ellos, el uso de sustratos como arroz, trigo

y medios líquidos mediante técnicas más sofisticadas

La explotación de los hongos para el control de plagas implica una amplia

investigación donde se involucran disciplinas como la patología, ecología, genética,

fisiología, producción masiva, formulación y estrategias de aplicación

Una buena formulación es la base para el éxito de un bioplaguicida de origen

microbiano; la posibilidad de obtener productos adecuados depende de las propias

características del microorganismo y su relación con los componentes de la

formulación (excipientes) y el ambiente de almacenamiento

Para el desarrollo de nuevos productos de origen biológico se deben tener en cuenta

diferentes aspectos: primero definir un medio de cultivo óptimo y el mejor sistema

para la obtención masiva de inóculo que permita una buena relación costo -

rendimiento en la producción; establecer ensayos de producción a pequeña escala;

garantizar la estabilidad del producto y determinar las condiciones de

almacenamiento; poder utilizar la maquinaria standard de cualquier explotación

agrícola para su aplicación, y ser efectivo a unas dosis parecidas a las utilizadas para

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los agroquímicos así como bioensayos de laboratorio, invernadero y campo que

confirmen la efectividad del producto una vez formulado

El objetivo de una formulación de hongos entomopatógeno es aumentar la

estabilidad durante el almacenamiento y después de la aplicación. Las propiedades

físicas y biológicas de la formulación deben permanecer estables por un tiempo

mínimo de 12 meses, pero es recomendable que se mantengan durante 18 meses

para permitir su comercialización. Además de mejorar la adhesión a la cutícula del

insecto; aumentar o mantener la virulencia y permitir su aplicación con equipos de

volumen ultrabajo

En condiciones de laboratorio es difícil mantener la viabilidad de hongos

entomopatógeno por mucho tiempo. De esta manera, formular un entomopatógeno

consiste en adicionarle determinados compuestos que mejoran su desempeño en el

campo, facilitando su manejo, aplicación y permita su almacenamiento en

condiciones que disminuyen el costo, con una pérdida mínima de las cualidades del

producto

Para ser formulado, la viabilidad del hongo no debe ser menor de 95 % y el

contenido de humedad entre 4 - 6 %.

Los materiales utilizados en la formulación no deben tener actividad biológica; ni

afectar la actividad del hongo, deben ser inocuos al ambiente, presentar

características físicas adecuadas para mezclarse con los conidios; facilitar la

aplicación del producto y ser económicamente rentables

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Existen varios tipos de formulaciones, el que una sustancia activa dada se presente

de una forma u otra dependerá básicamente de sus propiedades fisicoquímicas

(solubilidad, tamaño de partícula, densidad, fluidez), de la maquinaria de que

dispone, el aplicador y de factores económicos.

Marco Teórico.

La apreciación que tiene el hombre acerca de los hongos que atacan insectos no

está limitada al concepto moderno de su utilización para el control biológico de

plagas. Dos milenios atrás los chinos estaban conscientes de la momificación de

gusanos de seda por especies de Cordyceps e Isaria. Colocaban efiges de estos

gusanos elaboradas en piedras preciosas y semipreciosas en la boca de sus bocas,

para conferirles el mismo grado de inmortalidad. Las orugas infectadas por

Cordyceps se utilizan en la medicina tradicional china, por lo menos desde hace mil

años, para el tratamiento de la adicción al opio hasta su consumo como tónicos y aun

como afrodisíacos

Hasta en la década de los noventas la mayor cantidad de investigaciones enfocadas

al control biológico se realizaban con bacterias y virus, aunque los hongos

representan el grupo más amplio de patógenos a insectos. Al parecer existía cierto

rechazo a utilizar hongos entomopatógenos como biocontroladores.

Debido a los factores ambientales que no favorecían el empleo exitoso y a las

dificultades que se presentaban para su producción a gran escala, junto con su

formulación adecuada como bioinsecticida. No obstante los hongos se han utilizado

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para el control de melazas desde 1950. Siendo producidos los primeros

micoherbicidas a principios de la década de los ochenta en USA (Auld, 1991).

Agostino Bassi (citado por Roberts y Humber, 1981) estableció la teoría de los

gérmenes que provocaban en animales a mediados de la década de 1830, con sus

estudios sobre las infecciones de Bauveria bassiana en larvas del gusano de seda.

Bauveria bassiana es un candidato interesante para emplearse como bioinsecticida

pues tiene ventajas con respecto a otros microorganismos como Bacillus

thuringiensis (Bt.) y los virus: las cepas aisladas tiene un rango de hospederos

amplio e infectan por invasión a través de la cutícula, de tal forma que pueden atacar

áfidos, larvas de lepidópteros y coleópteros, y otros insectos masticadores

Este hongo se ha producido por fermentación sólida en Rusia, la república popular

China y en el Brasil. La producción de esporas de Beauveria bassiana por

fermentación en medio sólido (FMS) representa una alternativa interesante para la

obtención de bioinsecticida económicamente efectivo.

Los medios de cultivo utilizados son sencillos, consisten en residuos o productos

agrícolas que pueden contener todo tipo de nutrientes necesarios para el desarrollo

de los microorganismos, y pueden obtenerse a bajo costo cerca de las áreas de

aplicación. Requieren pretratamientos simples frecuentemente es necesario molerlos

para reducir el tamaño de partícula.

Clasificación taxonómica del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana

NOMBRE Beauveria bassiana Vuillemin

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Reino Fungí

División Micota

Subdivisión Eumicotina

Clase Deuterimicetes

Orden Moniliales

Familia Moniliaceae

Género Beauveria

Especie Bassiana

El hongo Beauveria, es uno de los patógenos más importantes que afectan insectos,

ha sido recuperado de muchos insectos del orden coleóptero, lepidóptera y

homóptera y probablemente ataca a todos los artrópodos. De acuerdo a la literatura

existen dos especies: Beauveria bassiana y B.brogniartii.

La primera ha sido la más estudiada. En la actualidad Beauveria bassiana se

encuentra en los mercados de algunos países europeos como Rusia, en forma

comercial con el nombre de Beauverin o Boverin

Beauveria bassiana es un hongo filamentoso que produce micelio de color blanco o

ligeramente colorado dentro del sustrato o aéreo. Forma conideoforos constituidos

por fiálides simples, en manojos o en ramilletes esféricos de simpódulos que crecen

en forma de cuellos ramificados. Las conidias son unicelulares y transparentes,

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crecen en los plegamientos de los cuellos de los simpódulos, y pueden tener formas

diferentes: globosas, ovales o elipsoidales.

Las colonias crecidas sobre medio PDA son de color blanco, aspecto lanoso y

alcanzan una altura de 1-2mm. Durante la esporulación intensa adquieren forma

circular (con aspecto de algodón con polvo), de color blanco o cremoso. El reverso

de las colonias es incoloro (Fassatiová, 1986).

Características del proceso de infección de B. bassiana

Usualmente invade a través de la cutícula (exoesqueleto quitinoso) del insecto.

Las unidades infecciosas casi siempre son esporas, que se unen a la superficie del

integumento, germinan y penetran la cutícula. En algunos casos penetra a través del

tracto digestivo (Debach y Rosen, 1991). En el interior del insecto, B. bassiana se

propaga y coloniza el hemolinfo. Roberts y Humber (1981) dividieron el proceso de

infección en diez pasos: unión de las conidias a la cutícula del insecto, germinación

de las conidias en el insecto, penetración de la cutícula, crecimiento del hongo en el

hemolinfo, producción de toxinas, muerte del hospedero, crecimiento micelar e

invasión de todos los órganos del hospedero, salida de la hifas a través de la

cutícula, producción de esporas, y dispersión de las esporas por el entorno

La unión de las conidias a la cutícula de los insectos es el evento inicial en el

establecimiento de la micosis. Cuando se produce el contacto las esporas se unen

fuertemente a la epicutícula (superficie externa de la cutícula) mediante interacciones

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hidrófobas no específicas que juegan un papel fundamental en la adhesión (Boucias

et al., 1988).

La superficie exterior de la pared de las esporas y la epicutícula contienen los

elementos determinantes para la unión. La superficie de las conidias de B. bassiana

está cubierta de una capa bien organizada de haces entretejidos de fibras,

compuestas fundamentalmente por carbohidratos que le confieren resistencia contra

la deshidratación, su hidrofobicidad característica, y facilitan su dispersión en el aire

(Boucias et al., 1988).

Los carbohidratos como α-D-manosa α-D-glucosa y β-galactosamina y glicoproteínas

como las lecitinas, presentas en la pared de las conidias, están implicados en

procesos de quimiotaxis, adhesión e infección (Hegedus et al.

1992). Es probable que la formación de estos carbohidratos pueda ser facilitada con

la correcta formulación del medio de cultivo utilizado en la producción de esporas

(Lane et al., 1991).

En la fase de crecimiento micelar y producción de esporas, el hongo invade

prácticamente todos los órganos del insecto provocando su muerte. Si las

condiciones de humedad y temperatura ambientales no son las adecuadas, el hongo

permanece dentro del cadáver que sirve como su reservorio. Cuando se restablecen

las condiciones apropiadas el hongo emerge a través de la cutícula y produce

esporas (conidias), que se dispersan con las corrientes de aire o agua. En esta fase

B. bassiana puede restablecer relaciones endofíticas con diferentes plantas,

colonizarlas sin dañarlas o interactuar de forma específica con estas, pues no es un

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hongo fitopatógeno. Se ha demostrado que este hongo puede colonizar plantas de

maíz a nivel de los verticilos, moverse por su sistema vascular de forma pasiva, y

persistir en su interior por largos períodos. Esta capacidad puede aprovecharse para

su utilización en el control de plagas.

La producción de toxinas es una característica de la gran mayoría de las especies de

hongos entomopatógenos. Estas sustancias pueden, en muchos casos, originar la

muerte del insecto debido a sus propiedades biocidas; además actúan como

inhibidores de las reacciones de defensa del hospedante por alteraciones en los

hemocitos y retraso en la agregación de las células de la hemolinfa (Vey yGötz,

1986). Las toxinas que producen los hongos entomopatógenos pueden ser

macromoléculas proteicas o moléculas de tamaño medio a pequeño con bajo peso

molecular (Roberts, 1981; Vey et al. 2001). Entre las toxinas producidas por

hongosentomopatógenos destacan las destruxinas producidas por M. anisopliae

como las más estudiadas. Otros compuestos tóxicos producidos por otras especies

son listados en

La muerte del insecto puede resultar de una combinación de factores incluyendo

agotamiento de nutrientes, obstrucción física o invasión de órganos y Toxinas

producidas por algunas especies de Hifomicetos entomopatógenos.

MORFOLOGIA.

Beauveria bassiana (Bálsamo) Vuillemin: colonias en PDA o MEA con aspecto

aterciopelado a polvoriento, raras veces formando sinemas; blancas en los bordes

que se vuelven amarillo-pálidas, algunas veces rojizas, incoloras al reverso, amarillas

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o rojizas. Conidióforos abundantes, que se levantan a partir de las hifas vegetativas

sosteniendo grupos de células conidiógenas que se pueden ramificar para originar

más células conidiógenas, globosas a forma de botella, con un raquis bien

desarrollado Conidios hialinos, lisos, globosos a ligeramente elipsoidales,

Clamidosporas ausentes. Difiere de B. brongniartii en que tiene las células

conidiógenas más agrupadas y los conidios globosos.

Existen, además, las bolsas hidrosolubles que más que una formulación es un modo

de presentación de una WP o SP mediante la cual se eliminan los riesgos de malas

dosificaciones, se elimina el manipuleo y se minimizan los riesgos por la toxicidad de

los productos. Estos envases predosificados se dejan caer en el agua del tanque del

equipo de aplicación y allí la envoltura plástica se disuelve rápidamente, se libera la

formulación y se mezcla uniformemente con el agua. No hay riesgos de contacto,

inhalación ni salpicadura. Una vez lograda la mezcla de aplicación, ésta no es más ni

menos segura que cualquier otra formulación similar de igual principio activo.

Varios productores de biocontroles han elegido a polvos humedecibles, entre las

formulaciones secas, debido a su larga vida de estante, buena miscibilidad en agua,

y fácil aplicación con un equipo de atomización convencional ya que sus propiedades

físicas le proporcionan la habilidad al producto de mezclarse con agua y formar una

suspensión homogénea atomizable

Formulaciones Desarrolladas

En el mundo numerosos grupos de investigadores y empresas productoras se

concentran en el desarrollo de productos comerciales a partir de hongos en forma de

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gránulos o polvo humedecible entre los que se citan Biofox C (F. oxysporium y F.

moniliforme SIAPA, Italia), Mycotal (V. lecanii, Koppert, Holanda), Mycotrol GH (B.

bassiana, Mycotech, USA), Green Muscle (M. flavoviride, CABI Bioscience, UK),

DiTera (M. verrucaria, Valent (Sumitomo), USA, Japón) (Burges, 1998;Butt y

Copping, 2000).

Algunas formulaciones granuladas muy sencillas son las del hongo en arroz o arroz

molido obtenidas mediante el proceso de producción masiva del hongo.

Otras como las de gránulos de aceite hidrogenado son utilizadas para conidios deB.

Bassiana (Carballo, 1998).

Se han evaluado formulaciones en gránulos de alginato usando agentes

aumentadores como cáscara de naranja seca molida. Existen, además,

procedimientos para la preparación de formulaciones de micelio o conidios en

gránulos de alginato (Carballo, 1998).

La temperatura y la humedad son las principales limitaciones para la eficacia de

hongos. Varios adyuvantes mejoran la germinación de las esporas, como es el caso

del aceite de maíz sin refinar, que mejora la actividad de Colletotrichum truncatum

(Schwein) Andrus y Morre y reduce los requerimientos de humedad necesarios para

su germinación. Surfactantes como Tween 20 permiten a las lantas a reducir la

tensión superficial y mejoran la dispersión de las esporas en las gotas. Hay que tener

en cuenta la posible acción inhibitoria / estimuladora del surfactante en la

germinación de las esporas, infección y desarrollo (Fernández y Juncosa, 2002) B.

bassiana, fue registrada en 1999 como "Mycotrol" por la Enviromental Protección

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Agencia en Estados Unidos, que es utilizado en campo para el control de

saltamontes, mosca blanca, áfidos y muchos otros plagas de insectos.

Este producto es estable por más de 12 meses almacenado a 25° C. (Wraight,

Jackson, Kock, 2001) Existen otros dos formulados a partir de B. bassiana

comercializados como "BotanicGard" que es recomendado para el uso en casas de

cultivos y "Mycotrol O" que contiene ingredientes en la formulación que permite su

uso por agricultores en Estados.

La producción y el uso de los entomopatógenos se han expandido rápidamente y

Cuba ha desarrollado capacidades únicas en esta área. Se han elaborado muchas

técnicas mejoradas de producción, cosecha, formulación, aplicación y control de

calidad para numerosas bacterias y hongos.

Los bioplaguicidas basándose en hongos producidos en los CREE, de amplio uso,

son:

Beauveria bassiana, usada para el control de plagas de coleópteros, como los

gorgojos que atacan a la batata (camote) y al plátano común; Verticillium lecanii, para

controlar la mosca blanca (Bemisia tabaci), un vector de enfermedades virosas en

tabaco, tomate, fríjol y otros cultivos; Metarhizium anisopliae, para varias plagas de

insectos; y Trichoderma spp, usado como antagonista de los patógenos del suelo en

plántulas de tabaco. Entre los bioplaguicidas en proceso de desarrollo a gran escala

están Nomuraea rileyei e Hirsutella thonsomii (Rosset y Moore, 1998).

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El desarrollo de hongos entomopatógenos como micoinsecticidas ha tenido

obstáculos principalmente relacionados a la producción masiva y la estabilidad para

el almacenamiento y formulación (Gray, y Markham, 1997; Pell, Eilenberg, Hajek,

Steinkraus, 2001; Wraight, Jackson, Kock, 2001). Investigación limitada en varias

especies de Entomopatógenos pueden haber superado algunos de estos problemas

(Pell, Barker, Clarck, Wilding y Anderson, 1998; Shah, Aebi, Tuor, 1998, 2000,2002)

pero hay barreras significativas que involucran la producción a gran escala así como

la formulación apropiada y la tecnología de aplicación. Estos problemas requerirían

significante inversión financiera en investigación y desarrollo que necesite unirse

fuertemente con la identificación de mercados apropiados para cualquier producto

eventual basado en un hongo entomopatógeno (Shah y Pell, 2003).En general estos

hongos estos hongos no forman cuerpos fructíferos, tienen alta producción de

esporas, son relativamente fáciles de cultivar fuera del hospedante.

Los hongos entomopatógenos actúan principalmente por contacto, cuando el hongo

es capaz de penetrar el insecto e invadirlo, provocándole la muerte por micosis.

La mayoría de los autores aborda ampliamente el ciclo infectivo de estos hongos

dividiéndolo en dos fases: una parasítica y otra saprofítica. La primera incluye la

adhesión del conidio a la cutícula del insecto, la germinación (estimulada por los

lípidos cuticulares del hospedante en calidad y proporción), penetración (complejos

multienzimáticos con enzimas secretadas como lipasas, quitinasas y proteasas

activadas secuencialmente) y multiplicación del hongo (por blastosporas

fundamentalmente) con la consiguiente producción o no de toxinas, en dependencia

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de la cepa presente, que finaliza con la muerte del insecto. La segunda fase se

caracteriza por una colonización total con melanización y momificación del individuo,

emergencia del hongo y su esporulación, cuando la humedad relativa microambiental

sea alta. Estos conidios pueden diseminarse mediante el viento, el agua, otros

organismos y el hombre, para así iniciar un nuevo ciclo infectivo.

En el caso de los hongos antagonistas para el control de plagas (patógenos de

plantas) se encuentran, dentro de los más empleados, especies del género

Trichoderma. Este hongo tiene la capacidad de parasitar a otros hongos lo que se

conoce como hiperparasitismo o micoparasitismo, hacia diferentes patógenos de

plantas. Su modo de acción es complejo donde están incluidos el quimiotaxismo, la

antibiosis y el parasitismo. La interacción inicial entre el parásito y el hospedero

parece ser del tipo quimiotrófico. La hifa del micoparásito crece directamente hacia el

hospedero en respuesta a las lectinas secretadas por este, las que se unen a los

residuos de galactosa en la pared celular de Trichoderma siendo la señal que

permite dirigir el crecimiento hacia esa zona. Trichoderma secreta enzimas que

actúan como un complejo con acción sinérgica sobre el patógeno debilitando la

pared y permitiendo la difusión de los antibióticos hacia este. Después del contacto

físico microscópicamente se observa la presencia de haustorios, enrollamiento de la

hifa del biocontrol sobre la del patógeno, vacuolización, formación de gránulos,

desintegración del citoplasma y lisis celular. Este género actualmente se estudia a

profundidad por la respuesta sistémica inducida al ataque de otros patógenos y por

ser fuente de genes que codifican para proteínas (enzimas como glucanasas,

proteasas)) y metabolitos (fitohormonas) con acción estimuladora y defensiva en la

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planta, los que se están usando en protocolos de transgénesis en especies de

plantas de importancia económica con resultados muy alentadores

Caracterización de aislados fúngicos para el Biocontrol

El mero hecho de identificar al microorganismo taxonómicamente hasta especie

implica datos que tienen importancia en la caracterización del aislado. Sus

características morfométricas y culturales son importantes y básicos para estudios

posteriores y más reproducibles. Estos deben incluir estudios bioquímicos (actividad

exoenzimática, perfiles isoenzimáticos específicos como patrón de esterasas,

lipasas, fosfatasa alcalina. etc.). Los análisis isoenzimáticos pueden tener como

desventaja que los perfiles estudiados no sean suficientemente diferentes y/o las

isoenzimas expresadas no aparezcan en un aislado determinado por cuestiones

fisiológicas.

Los estudios más altamente reproducibles son los que se realizan a nivel de ADN

(moleculares). Actualmente para que un aislado sea reconocido como

apropiadamente caracterizado requiere de al menos un método molecular que lo

identifique como tal y en la fase de registro de un producto internacionalmente esta

condición es exigida en países líderes en Biocontrol.

Los estudios moleculares más usados en hongos para la caracterización son los

RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) en los cuales se generan cortes

por enzimas de restricción en el ADN dando lugar a fragmentos de diversas tallas,

los que son puestos en contacto con sondas específicas marcadas con un

cromógeno o con un isótopo radiactivo, que pueden o no acoplarse al o los

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fragmentos producidos por complementariedad de bases (hibridización) y luego de

una electroforesis en gel de agarosa se genera un patrón de bandas en dependencia

de la sonda de hibridización, el aislado y la enzima empleada en el corte del ADN, lo

cual logra discriminar aislados aparentemente iguales como diferentes cepas.

Otro análisis molecular mucho más barato pero menos reproducible entre laboratorio

son los análisis genéticos del tipo PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction- Random

Amplified Polymorphic DNA) los que consisten en un PCR clásico donde los

"primers" (por ejemplo cebadores universales) suministrados para la amplificación

son conocidos como buenos para detectar variabilidad entre poblaciones (razas,

cepas, etc.). En el método se necesita ADN aislado del hongo mediante un proceso

de purificación clásico (el método de extracción debe ser suave para no

desnaturalizar el ADN). Este ADN se lleva junto al "primer" a varios ciclos de

amplificación donde se tiene una ADN polimerasa resistente al calor y los nucleótidos

para la polimerización además de cofactores y soluciones buffer. Se realiza una

electroforesis y los fragmentos de ADN amplificados se visualizan en el gel. Los

patrones de bandas para cada "primer" probado pueden ser iguales o diferentes. Se

pueden probar tantos "primers" como se dispongan. La mayor desventaja del PCR-

RAPD es que no tiene muy buena reproducibilidad entre laboratorios aunque sí tiene

el mismo poder de resolución entre laboratorios cuando se trabaja con las mismas

poblaciones, o sea, los patrones de bandas son los que pueden cambiar.

Métodos de aislamiento

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Los métodos para aislamiento que se usan más ampliamente son métodos clásicos.

Para hongos antagonistas se usan raíces jóvenes, por ejemplo, de plantas libre de

síntomas tomadas de una zona donde pueda existir algún síntoma de una

enfermedad fúngica. Las raíces se lavan abundantemente y se desinfectan muy

ligeramente, se trituran y se siembra en medios generales para hongos con

antibacterianos añadidos. Se trata de obtener colonias únicas y por observación al

estereoscopio y microscopio óptico se seleccionan las posibles especies

controladoras. También se procesa suelo de estas zonas donde se encuentran

sorpresivamente plantas sanas o de zonas donde no se observan síntomas de

enfermedades producidas por hongos lo cual resulte aparentemente inexplicable. Se

realizan diluciones decimales en placa (siembra para obtener unidades formadoras

de colonia). Se incuban entre 23-28 grados C y se evalúan a partir de las 48 horas).

Estos métodos precisan de experiencia (Anexo 8).

Para el caso de los entomopatógenos se traen del campo insectos micosados o

sospechosos de micosis (insectos melanizados y/o momificados). Se realizan

siembras en medios para hongos (PDA, SDA) con antibióticos y se incuban a 23-27

grados C revisando el material luego de 72 horas y hasta 14 días posterior a las

siembras. Igualmente se procesan ootecas o quistes de nemátodos. En todos los

casos se desinfectan suavemente en etanol 70% o hipoclorito sódico por 1 minuto al

0.5% y/o alcohol 70%.

Las muestras de suelo también son interesantes para aislar entomopatógenos con

insectos”trampeadores”, o sea, especies altamente susceptibles a los hongos

24


entomopatógenos como es el caso de larvas de lepidópteros. Ejemplo de ello

tenemos en Cuba el aislamiento de hongos entomopatógenos con larvas de Galleria

mellonella o Corcyra cephalonica procedentes de crías certificadas de laboratorio, los

que rutinariamente se usan para enriquecer las colecciones de cultivos

Es importante destacar que los estudios no deben realizarse en zonas donde se

hayan aplicado o se apliquen microorganismos de las especies que estamos tratando

de aislar y siempre debe obtenerse un aislado monospórico para lograr mayor

homogeneidad genética.

Métodos de conservación

El objetivo de la conservación es mantener el aislado con las características

genéticas y fenotípicas originales. Siempre debe conservarse por 2 métodos

diferentes y uno de ellos a largo plazo. Los protocolos de conservación son muy

regulares y se pueden obtener fácilmente desde libros clásicos de Microbiología o

desde INTERNET.

A largo plazo tenemos la liofilización que se basa en la desecación extrema al vacío

del cultivo del hongo por congelación profunda de forma que el agua pase

rápidamente de sólido al estado gaseoso. También se cuenta con conservación en

Nitrógeno líquido pero este método es engorroso pues precisa de tanques metálicos

para el N que alcanzará 196 grados C bajo cero. Siempre en los métodos de

congelación se usan agentes crioprotectores (DMSO, leche descremada, glicerol,

etc.).

25


Métodos como conservación en suelo previamente esterilizado y luego inoculado y

desecado son útiles así como la conservación en sílica gel no indicadora (sin cobre)

inoculada previamente con una suspensión del cultivo en leche descremada 5% y

luego desecada. Ambos son baratos y de fácil ejecución. También el aceite mineral

sobre cultivos previamente esporulados es un método muy efectivo a mediano plazo.

El método más usado a corto plazo es el de cultivos sobre cuñas de medio

agarizados nutritivo.

En Cuba se han optimizado medios para producir masivamente las esporas

(conidios, clamidosporas, etc) en alta concentración en el cultivo según los

requerimientos de cada aislado, el que luego será llevado a uno de los métodos

explicados anteriormente para su conservación.

Tecnologías para producciones de hongos.

Tecnologías básicas

En el mundo se realizan desde muy puntuales y pequeñas producciones de agentes

de biocontrol como la tecnología desarrollada sobre medio agarizado para la

producción de Phlebiopsis gigantea, hongo antagonista basidiomiceto del también

basidiomiceto Heterobasidion annosum, que es el agente causal de la enfermedad

que más afecta la raíz de las coníferas en el hemisferio norte, hasta producciones a

escala industrial como las desarrolladas por Mycotech Corporation que pueden llegar

a varias toneladas de Beauveria bassiana anualmente.

26


Los métodos de producción varían considerablemente. Muchos están basados en

fermentaciones sobre sustrato sólido con granos de cereales donde el arroz es el

más universal. Otros usan sustratos no nutritivos como gránulos de arcilla. Algunos

rinden conidios aéreos en la superficie de cultivos líquidos estáticos. Otras

tecnologías se desarrollan en tanques de fermentación para obtener productos a

base de micelio, blastosporas o conidios sumergidos.

Las 4 formas de producción fundamentales para hongos son:

1-cultivos bifásicos, donde se desarrolla el inóculo en cultivo líquido agitado (de

forma rápida) o líquido estático (más lento) y luego se pasa al soporte sólido. En los

sistemas bifásicos siempre se debe optimizar el cultivo de la fase líquida para que

promueva un rápido crecimiento del aislado. Es el más usado a nivel mundial por

obtenerse estructuras infectivas de alta calidad y acortarse el tiempo cuando la fase

líquida se hace por cultivo líquido agitado. Son semiartesanales (Anexo 10).

2-cultivos sobre soporte sólido, siendo una forma de producción donde se requiere

menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene

estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones altas. Son artesanales

3-cultivos líquidos agitados o fermentaciones líquidas con un grado de

automatización del proceso que puede ser muy alto, son muy rápidos, pero tienen

como desventaja el que muchos aislados tienden a crecer como pellets miceliales

discretos y/o forman abundantes blastosporas (esporas formadas propagadas por

gemación a partir de fragmentos de micelio originalmente), propágalos estos que no

son apropiados por la baja estabilidad intrínseca y poseer per se bajó o nulo poder

27


infectivo. En estos sistemas se logra un óptimo aprovechamiento de los nutrientes.

Pueden llegar hasta niveles industriales

4-cultivos líquidos estáticos, los que constituyen una forma de producción donde se

requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se

obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones bajas pues

solamente hay formación de estructuras deseadas en la interface líquido- gaseosa.

Son artesanales

Una forma especial de cultivo sólido con tecnología avanzada lo constituyen las

fermentaciones en estado sólido las que han dado la oportunidad a la industria de

desarrollar producciones de bioplaguicidas en birreactores sellados con un grado alto

de automatización, con principios similares a aquellos de la fermentación líquida, lo

que reduce costos de mano de obra y permite un control eficiente del proceso de

producción donde se logra biomasa de alto valor infectivo y más resistente a

condiciones ambientales adversas. En estos sistemas también se logra un óptimo

aprovechamiento de los nutrientes pero la inversión de capital inicial es muy alta.

Para los países del tercer mundo esta tecnología presenta menos posibilidades de

aplicación debido a las dificultades económicas y el alto costo de capital de estos

procesos automatizados. La presencia de mano de obra barata y un mercado que es

regional y pequeño hace a los sistemas de producción artesanales (baja tecnología)

viables económicamente a pesar de requerir muchas operaciones manuales.

Descripción del proceso productivo artesanal (“baja tecnología”). Parámetros clave

28


29

CULTIVO INICIAL EN VIALES CON MEDIO AGARIZADO

INOCULACION E INCUBACION DE MEDIOSOLIDOO LIQUIDO

(PREINOCULO)

INOCULACION E INCUBACION DE SUSTRATO

SECADO

COSECHA

FORMULACION

ENVASADO

Figura 1


Diagrama de flujo general del proceso de producción de hongos por vía artesanal.

En los sistemas artesanales para la producción de hongos se establecen de manera

general los pasos enunciados en la figura 1.

En toda producción de bioplaguicidas microbianos se parte de un aislado con

características deseadas como agente de biocontrol, el cual es conservado

previamente y subcultivado durante el escalado.

Los preinóculos pueden desarrollarse sobre sustratos sólidos (grano arroz, grano

trigo, cáscara de trigo, cáscara de arroz, harina de maíz, etc ) incluyendo los medios

agarizados de cultivo o por cultivos líquido estático o agitado (compuestos por

combinaciones de materias primas carbonadas y nitrogenadas como melaza de caña

de azúcar, licor de maíz, almidón de maíz, sacarosa, extracto de levadura torula,

extracto de levadura cervecera, etc.) siendo el objetivo fundamental la obtención de

una biomasa homogénea. La relación carbono (C): Nitrógenos (N) es esencial y de

este balance en lo fundamental dependerá el que se logre la formación de los

propágulos deseados. En los hongos, se necesita que la fuente C esté en exceso en

el medio y el contenido de N sea el factor limitante del crecimiento, lo que

desencadena el proceso esporulativo.

Los inóculos se preparan a partir de subcultivos de preinóculos a una concentración

final en el sustrato inoculado de 10(5)-10(7) propágalos/g

30


La elección de los sustratos sobre los que se realizará la inoculación, previa

esterilización, dependerá de la disponibilidad local y costo de estos así como de las

características del aislado a reproducir. Se han usado cereales como agentes

nutritivos (arroz, trigo, cáscara de trigo, cáscara de arroz, maíz etc.) y como agentes

inertes de soporte la vermiculita, gránulos de minerales arcillosos, tela, etc. Con el

uso de sustratos inertes las soluciones nutritivas en los que estos se embeben

pueden ser balanceados cuidadosamente para asegurar una casi completa

utilización de los nutrientes y acá despliegan un papel clave también el balance C:N.

El sustrato puede ser humedecido previa esterilización o previa inoculación

dependiendo del tipo de materia prima o combinación de estas y ajustes realizados.

Un exceso de humedad provocaría baja disponibilidad de oxígeno y por ende pobre

desarrollo del microorganismo. Además compactaría el substrato impidiendo una

colonización total de su superficie. Por otro lado, una baja humedad podría inhibir el

desarrollo del microorganismo al no poner la suficiente cantidad de nutrientes en

solución para ser usado por este además de la poca resistencia a la desecación que

tienen los hongos en el periodo activo de crecimiento micelial.

Durante la incubación se debe regular el régimen luz-oscuridad. La luz es

estimulante en determinadas especies y aislados por lo que este parámetro es

ajustable solamente a través de la experimentación.

Cuando se obtiene la biomasa conidial óptima sobre toda la superficie del sustrato se

pasa al proceso de secado para que los conidios permanezcan viables en

almacenamiento por mayor tiempo. Este proceso se optimiza con deshumidificadores

31


o aires acondicionados o acelerando la ventilación con ventiladores lo que depende

de las condiciones locales.

Posterior al secado y previo al paso final de envasado en el flujo de producción se

realiza la cosecha. Es en este momento que comienza la etapa de formulación donde

se prepara una combinación de ingredientes de forma que el principio activo

(esporas) se mantenga estable, efectivo y fácil de aplicar.

Durante todo el proceso la regulación de la temperatura ambiental es esencial la que

debe ser lo más próxima posible a la temperatura óptima de desarrollo del

microorganismo.

Control de calidad en la producción de microorganismos fúngicos para el control

biológico. Principales ensayos.

Panorámica general

Un requisito esencial para la producción de cualquier agente de control microbiano

es un sistema de control de la calidad efectivo.

La calidad se define como el conjunto de propiedades y características de un

producto o servicio que lo hacen apto para satisfacer las necesidades a las cuales va

dirigida. Las normas y procedimientos para el control de calidad de los productos y

procesos conjuntamente con los registros, constituyen la garantía para la validación

de las producciones de bioplaguicidas.

32


Un producto con especificaciones bien definidas y con los consiguientes

procedimientos de control de calidad asegura su buen funcionamiento y su

seguridad, promueve la estandarización de los costos de producción y garantiza su

estabilidad en el mercado lo que conlleva a la ganancia de confianza en el

consumidor. En el caso de los productos a base de hongos su funcionamiento no

confiable por falta de calidad ha limitado su éxito en países en desarrollo donde estos

requerimientos son mínimos o no existen.

Una producción con un sistema de calidad establecido tiene un control estricto sobre

la salida de su producto al poder analizar la calidad en cada punto crítico implicado

en la elaboración de este.

En 1992, en la Reunión del Grupo Activo de Control de Calidad de la Organización

Internacional de Control Biológico, se estableció llevar un control de las producciones

que implique el seguimiento de la ejecución de todas las operaciones,

procedimientos, equipos y condiciones ambientales de estas con el objetivo de

mantener el rendimiento.

También se planteó controlar el proceso de forma que se le dé seguimiento a la

calidad del producto no terminado, incluido la detección de contaminantes, además

de un sistema que controle la calidad del producto final. Esto es muy significativo

para el caso de los agentes microbianos fúngicos de control ya que para que sean

efectivos precisan de que culminen exitosamente un complejo proceso de infección.

Comparados con los agroquímicos, los sistemas de calidad para la producción de

bioplaguicidas microbianos deben ser más exhaustivos y especializados.

33


Aún no existen protocolos estandarizados internacionalmente lo que ha traído como

consecuencia que los productores o países desarrollen sus propios procedimientos

de Control de calidad.

Puntos críticos de controles de calidad

El primer punto donde se controla la calidad en cualquier sistema de producción es

en el subcultivo de la cepa del hongo del cual se parte. Esto incluye los subcultivos

de trabajo y los de conservación. En ambos casos se tienen que establecer métodos

de conservación y mantenimiento que garanticen la estabilidad genética y fenotípica

del aislado los que deben ser verificables a través de pruebas bioquímicas y

moleculares. Las transferencias sucesivas en medios agarizados deben evitarse. Se

debe verificar la pureza del cultivo y la actividad biológica con la frecuencia

necesaria.

En el control del proceso de producción se requiere una descripción completa de

este con los correspondientes controles de calidad y monitoreo de cada paso. El

registro de todos los parámetros como temperatura, contenido de humedad del

sustrato, pH y monitoreo de la contaminación debe tenerse por lote de producción

para facilitar el examen de todos los pasos críticos de la producción desde el

producto final hasta el inicio del proceso (trazabilidad).

En la preparación de inóculos se debe tener en cuenta su concentración y pureza.

Todos los medios de cultivo deben ser verificados para su esterilidad segura antes y

después de la inoculación.

34


En el caso de los sustratos desafortunadamente no siempre se tienen materias

primas certificadas por lo que cada nuevo lote de materia prima debe ser sometido a

un análisis físico-químico y a un chequeo del nivel de esterilidad pre y post

inoculación. Para que la esporulación sea máxima se necesita una buena área

superficial en relación al volumen.

Las partículas del sustrato individuales deben estar separadas después de la

hidratación y esterilización porque las que quedan pegadas reducen el área

superficial con respecto al volumen cuando se adiciona el agua, limitando el espacio

efectivo en que ocurrirá la esporulación.

El contenido de humedad del sustrato debe ser ajustado para el crecimiento micelial

y la conidiogénesis teniendo en cuenta cada combinación sustrato-aislado y su

optimización puede ser compleja. El rango de humedad 35-60% v/p es usualmente

usado. Incrementos en el contenido de humedad del sustrato tienden a disminuir la

disponibilidad de oxígeno lo que se puede agravar en el escalado debido a la

compactación de grandes masas de este.

La aeración en la producción es otro parámetro que determina la calidad de las

producciones partiendo de que todos los hongos mitospóricos (mixomicetos) son

aerobios y requieren oxígeno para el crecimiento y la conidiación. En los sistemas de

producción artesanales es difícil determinar el requerimiento de oxígeno de un

determinado hongo y la evaluación se hace muy cualitativamente. La mayoría de los

sistemas de producción de América Latina, China y del programa internacional

35


LUBILOSA, están basados en el intercambio del aire entre la cámara de crecimiento

y el ambiente externo.

Otro factor crítico es la temperatura de incubación, la que varía según el tipo de

crecimiento requerido no solo entre especies sino también para el aislado en

cuestión. Este parámetro debe ser monitoreado cuidadosamente en el escalado,

debido a que el calor que se produce durante el metabolismo puede provocar áreas

con temperaturas por encima de la óptima en el cultivo.

También se debe tener en cuenta el régimen luz-oscuridad cuando se selecciona el

sistema de producción.

En la etapa de post-cosecha, previo envasado, se precisan métodos para extraer y/o

formular los propágalos (conidios generalmente). Por ejemplo, si se necesitan

conidios para aplicación a volúmenes ultra bajos se requiere de un fino polvo con

partículas uniformes por lo que la extracción debe ser eficiente y selectiva para los

conidios garantizando su viabilidad.

Con respecto al monitoreo de la contaminación del proceso se sabe que todas las

producciones microbianas tienen el riesgo de contaminarse y en las artesanales esto

puede ocurrir con más frecuencia si no se cumplen las buenas prácticas de

producción debido al gran número de operaciones manuales. Las contaminaciones

pueden conducir a una pérdida de eficacia del ingrediente activo por la dilución con

los microorganismos que han competido, además del posible efecto inhibitorio de los

metabolitos secundarios producidos por los contaminantes donde el reconocimiento y

la cuantificación del grado de contaminación son importantes para determinar

36


cualquier posible riesgo a la salud humana y demostrar que no haya entrada de

patógenos humanos. Por ello se deben registrar todos los pasos críticos del sistema

de producción y el resultado de los análisis de contaminantes para identificar la

fuente y tomar medidas preventivas. Esto incluye el subcultivo del que se parta para

preparar los pre-inóculos, los inóculos, el sustrato antes y después de esterilizado y

el producto final.

Las especificaciones para el nivel permisible de contaminantes en el producto final

dependerán de los métodos de producción y el procesamiento del producto en la

cosecha, post-cosecha y la formulación, etapas últimas que se realizan en ambientes

no estériles. Por tanto se debe establecer un nivel base de entrada de contaminantes

a través de un estudio bien controlado, chequeando los controles en las primeras

etapas del proceso para demostrar que el nivel de contaminantes del producto final

es debido inevitablemente a las últimas fases.

Principales ensayos

En general, el control de calidad del producto final es el punto más importante que

garantiza el funcionamiento de éste y su aceptación a largo plazo. Si el producto

tiene una viabilidad alta al igual que una adecuada virulencia, se maximiza la

probabilidad de que actúe bien en el campo. De ahí que las pruebas de más amplia

aceptación para los productos bioplaguicidas a base de hongos sean:

1- la prueba de viabilidad, donde se evalúa si la célula está o no viva. Esto puede

hacerse a través de una prueba de germinación conidial a un tiempo y temperatura

37


determinados en medios nutritivos agarizados o líquidos o por conteo de viables en

placa (ufc/g o ml de producto)

2- los bioensayos donde se comprueba la estabilidad de la patogenicidad y la

virulencia del aislado producido masivamente. Se usan individuos de la especie

plaga hacia la cual va dirigida el producto. En nuestro caso, el insecto para los

entomopatógenos o el hongo fitopatógeno para el caso de los hongos antagonistas

como Trichoderma.

3- la determinación del nivel de contaminantes (pureza) que se realiza tomando

determinada cantidad del producto y realizándose conteo de viables posteriores a la

siembra en medios nutritivos generales para hongos y bacterias

4- la concentración de unidades infectivas que se determina por conteo directo en

cámara de Neubauer o por conteo de viables en medios agarizados

5- la determinación de la estabilidad del producto en almacenaje lo que constituye un

factor crítico considerando la no necesidad de refrigeración o algún tratamiento

especial. Los métodos de secado y cosecha, la formulación y el embalaje deben

tenerse en cuenta para preservar la calidad del conidio.

DIAGRAMA DE BLOQUES DESCRIPCIÓN DEL DIAGRAMA REMOJADO

38


Debido a que nuestra materia prima tiene una estructura muy rígida, ésta debe

remojarse por 24 hrs. para que los carbohidratos estén disponibles y sean fácilmente

asimilables por el hongo.

ESTERILIZACIÓN

Nuestro sustrato es arroz quebrado el cual costará $3.5/Kg, nos da un rendimiento

de 2.5 X 1010 esporas/Kg de sustrato, para poder comenzar con nuestro proceso

debemos cerciorarnos de que nuestro proceso no será blanco de contaminación ya

que podría disminuir el rendimiento, se llevará a cabo en una autoclave por 15 min.,

a 15 psi.

FERMENTACIÓN

Una vez que se tiene listo el sustrato se inocula la charola y las condiciones a las que

debe estar son: 28°C, con humedad de 75%, pH 5-6 durante 5 días. Esterilización de

materia prima

39


DETERMINACIONES ANALÍTICAS

Conteo de esporas. El número de esporas se determinó por conteo directo en

cámara de Neubauer de 16 cuadros por cuadricula, se contaron 9 cuadriculas de las

25 de la cámara, utilizando la dilución adecuada. Estas determinaciones también se

llevan a cabo después del tamizado, para su efectividad.

40


Viabilidad

La viabilidad de las esporas se determinó haciendo diluciones sucesivas en agua

destilada estéril, hasta obtener concentraciones de esporas de 10, 100 y

1000/mL Estas tres diluciones se sembraron por triplicado, en cajas de Petri que

contenían 20mL de PDA y se contaron las esporas germinadas a las 72 horas de

incubación a una temperatura de 28°C.

Mediciones de pH

La medición de pH se realizó directamente en la suspensión obtenida de las

muestras de las fermentaciones sólidas. Para realizar las mediciones se utilizó un

potenciómetro; este se calibró con soluciones amortiguadoras de pH 4.0 y 7.0.

SECADO

Se realiza en cuartos de temperatura controlada con un suministro de aire de

0.75 vkgm (litro de aire/Kg de medio húmedo por minuto) para quitar el agua que ya

no es requerida ya que podría contaminarse nuestro producto además de que facilita

el manejo de éste,

MOLIDO

Aquí se hace otro molido con la finalidad de mezclar y homogeneizar el sustrato no

consumido con las esporas pues será nuestro vehículo, utilizando un molino de

pistón.

41


TAMIZADO

Esta operación tiene como objetivo homogeneizar el producto ya que los aspersores

se tapan muy fácilmente, por eso debemos tener un tamaño de partícula

considerablemente pequeño, se utiliza un tamiz de malla 10.

PRUEBAS DE CONTROL DE CALIDAD

La comercialización de controles biológicos basados en hongos entomopatógenos

requieren de un control adecuado de las propiedades biológicas, físicas y químicas

realizadas por el departamento de Control de la

Calidad de la firma productora que asegure al usuario un producto de máxima

eficacia en condiciones de campo (Vélez, 1997; Carballo, 1998; Monzón, 2001).

Algunas pruebas microbiológicas recomendadas son:

• Concentración de esporas: Establece la dosificación del producto.

• Germinación de esporas: Determina la viabilidad del hongo en la formulación.

• Pureza: Revela la proporción del agente biológico en la formulación e identifica los

microorganismos contaminantes con el objetivo de mejorar el proceso de producción

y formulación de los entomopatógenos.

Además, es necesario realizar algunas pruebas físicas de acuerdo al tipo de

formulación. (Vélez, 1997; Carballo, 1998) Por ejemplo los polvos humedecibles es

necesario realizar pruebas de suspendibilidad, humectabilidad, contenido de

humedad y tamaño de partícula (Aroonrat, Manop y Uthai, 2003).

42


EMPACADO

Las esporas se empacarán (llenadora envasadora automática) en bolsas de

polipropileno con una capacidad de 240g., enseguida se pondrán en cajas de cartón

para evitar el contacto con la luz UV ya que afecta considerablemente el producto.

ALMACENAMIENTO

Se debe almacenar a una temperatura de 10°C evitando el contacto con la radiación

UV, ya que puede perder su viabilidad y por último se distribuye.

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BIBLIOGRAFÍA

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EVALUACIÓN DE CEPAS DE BEAUVERIA BASSIANA CONTRADESCORTEZADORES (COLEOPTERA: SCOLYTIDAE) DEL GÉNERO IPS ENPLANTACIONES DE PINOS (PINUS CARIBAEA MORELET).Autores: René Alberto López Castilla1, Enrique de Zayas 2, Antonio Fernández Vera3 yNatividad Triguero Isasi1.

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USO DE BIOINSECTICIDAS PARA EL CONTROL DE PLAGAS DE HORTALIZAS ENCOMUNIDADES RURALES/Cipriano García Gutiérrez y María Berenice González Maldonado/Ra Ximhai, enero-abril,

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Proyecto Bioinsectisida Taller Parte1a

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