Revista Asebir junio 2008

Jun

io 2

008

Vol

.14

· N

º1

REVISTA

ACTUALIDAD

A propósito de los cambioslegislativos en Europa y España

ARTICULOS

Criterios de ValoraciónMorfológicos de Oocitos,

Preembriones tempranosy Blastocistos Humanos

Incidencia de multinucleaciónen FIV-ICSI

DEBATES

Criterios de valoración morfológicaASEBIR. Nuestra experiencia

FORMACIÓN CONTINUADA

Los glucocorticoidesy la reproducción femenina

NOTICIAS

AGENDA

BOLETÍN DE INSCRIPCIÓN

ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN

af.cubierta:Maquetaci n 1 07/07/2008 10:12 PÆgina 3

SUMARIO

Í N D I C E

EDITAAsociación para el Estudio de la Biología

de la Reproducción (ASEBIR).

JUNTA DIRECTIVAPresidente: Mark Grossmann i Camps.

Vicepresidenta: Mª Victoria Hurtado

de Mendoza.

Secretaría: Nieves Cremades Fernández

Tesorero: Manuel Ardoy Vilches

Vocalía de Docencia y Formación: Jorge

Martín Cuadros Fernández, Montserrat

Boada Palá.

Vocalía del Sitio Web: Jorge Ten Morro,

Fernando Marina Rugero.

Vocalía de Publicaciones: María Bonada

Sanjaume, Antonio Urries López.

Vocalía de Congresos: Mª José de los

Santos Molina, Begoña Arán Corbella,

Nieves Cremades Fernández.

Vocalía de Relaciones Públicas: Fernando

Marina Rugero, Jorge Ten Morro.

COORDINACIÓNMaría Bonada Sanjaume,

Antonio Urries López.

PUBLICIDAD YCOLABORACIONESSecretaría ASEBIR

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ISSN: 1136-4424

Soporte válido: 78-R-CM

EDITORIAL 1Mark Grossmann i Camps y M. Victoria Hurtado de Mendozay Acosta.

ACTUALIDAD 4A propósito de los cambios legislativos en Europa y España.Mark Grossmann i Camps y M. Victoria Hurtado de Mendozay Acosta.

ARTÍCULOS 6Criterios de Valoración Morfológicos de Oocitos,Preembriones tempranos y Blastocistos Humanos.José Luis Cortés*, Gertrudis Ligero, Laura Sánchez, Ana Nieto,Clara Bueno, Rosa Montes, Pablo Menéndez.

Incidencia de multinucleación en FIV-ICSI.Brossa M., Blanch X., Antich M.

DEBATE 24Criterios de valoración morfológica ASEBIR. Nuestra experienciaMariona Hugas, Maria Fernández, Joan Sarquella.

Criterios de valoración morfológica de embriones ASEBIR.Pepi Ferrando Conceptum. Institut de Fertilitat i ReproduccióHumana. Reus.

Evaluación de los criterios de valoración morfológicos de ovocitos,preembriones tempranos y blastocistos humanos propuestos porASEBIRJosé Luis Cortés, Pablo Menéndez Banco Andaluz de Células Madre.Centro de Investigación Biomédica. Universidad de Granada.Campus de la Salud.Granada

¿Con cuál nos quedamos? Marta Brossa, Marta Antich, XèniaBlanch. Laboratorio Fertilab. Barcelona.

¿Seria conveniente generalizar la evaluación morfológicaembrionaria de “ASEBIR”?Miren Mandiola. Hospital Quirón Donostia – Quirón Bilbao.

FORMACIÓN CONTINUADA 29Los glucocorticoides y la reproducción femeninaRaquel González, Montserrat Gomendio y Eduardo R. S. Roldan.

NOTICIAS 38Nueva Junta Directiva de Asebir

AGENDA 41BOLETÍN DE INSCRIPCIÓN 26

Junio 2008 Vol. 14 · Nº1

SUMARIO Pág.

af.interior:Maquetaci n 1 07/07/2008 10:13 PÆgina 1

E D I T O R I A L

Junio 2008 Vol. 14 · Nº 1

Como bien sabéis, la revista de ASEBIR tiene una periodicidad semestral y para cuando se publique este número tan sólo habrántranscurrido escasos días desde la celebración de la Asamblea Ordinaria: muy poco tiempo como para tener novedades respecto alo que se trató en la Asamblea. Aún así, queremos utilizar el espacio de Editorial como la página oficial de la Asociación, dóndeexponer nuestras intenciones y nuestros temores, nuestras alegrías y nuestras penas.

Como bien sabéis, en el pasado congreso de Bilbao se produjo el relevo natural en la Junta Directiva después de las elecciones.Debido al cambio de estatutos esta Junta tiene una vida muy corta (dos años) y ya hace seis meses que presidimos nuestraasociación, que ahora ya tiene casi 550 miembros. Pero lo más destacable de ASEBIR es la red que formamos, ya que a través de lossocios y las socias de ASEBIR estamos presentes en casi todos los centros de reproducción humana asistida españoles y también encasi todos los centros de investigación y docencia en reproducción asistida. Éste es un activo privilegiado que debemos mimar, y paradar una información ágil usaremos más y más las facilidades que la tecnología digital (vía boletín informativo) nos permita, demanera que os pedimos que mantengáis actualizadas vuestras direcciones de correo electrónico. En esta línea renovaremoscompletamente la página web (aspecto y contenidos) para que no sólo nos sea útil a nosotros, los “asebires”, sino que sea unareferencia también para el público en general.

Aunque los medios digitales ganen presencia debido a la inmediatez que proporcionan, mantendremos la publicación semestral dela revista así como la edición de los Cuadernos de Embriología. La revista, como bien sabéis, es de todos y depende de nuestrasaportaciones tanto en artículos como en opiniones para la sección de “debates”. Por favor hagamos un esfuerzo y consideremos quétrabajos podemos enviar a la revista.

Respecto a los Cuadernos, que están impulsados por la Junta Directiva a través de las comisiones que los redactan y revisan, ya vamosa por el tercero y en breve tendremos publicados o expuestos en la web las actualizaciones de los dos primeros.

Siguiendo el trabajo ya desarrollado por las Juntas Directivas anteriores hemos culminado la reforma de los Estatutos de nuestraasociación para adaptarlos a las necesidades actuales. Asimismo, continuamos batallando por el reconocimiento de la especialidaden embriología clínica se ha revisado a fondo el programa de formación en embriología y mantenemos contactos con el Consejo deColegios Oficiales de Biólogos para aunar esfuerzos frente a la Administración. No sabemos hasta dónde podremos llegar, perohasta que no se nos hayan cerrado todas las puertas trabajaremos para obtener el reconocimiento que creemos merecer.

De hecho, en este tema de la especialidad como en muchos otros aspectos nosotros continuamos el esfuerzo y asumimos los logrosde la anterior Junta Directiva presidida por Antonio González-Utor y Carmen Ochoa Marieta. Desde estas páginas queremosagradecerles una vez más la enorme labor realizada a lo largo de muchos años de incansable dedicación a ASEBIR. No hay espaciopara describir sus aportaciones, pero sus éxitos hablan por si solos y sabemos que continuamos contando con su valiosa experiencia¡Muchas gracias!

Tradicionalmente nos hemos relacionado con las organizaciones y estamentos que nos son propios, como las organizacionesprofesionales afines a través de la Federación de Asociaciones, como la Comisión Nacional de Reproducción Asistida o como ESHRE.Esta Junta ha puesto su empeño en potenciar la presencia de ASEBIR, queremos poner las bases para que ASEBIR tenga entidadpropia en los medios de comunicación, que sea conocida entre las organizaciones de usuarios y colabore en las reuniones científicaslocales. Para nosotros será importante redefinir qué actividades auspiciamos y cómo participar más, a través de los Grupos deInterés, en actividades científico-formativas más allá de nuestro congreso.

Evidentemente cada dos años tenemos un momento estelar con la celebración del congreso ASEBIR. El próximo congreso, como biensabéis todos, se celebrará en Noviembre de 2009 en Valencia. Vale la pena que ya desde hoy reservemos un espacio en nuestrasagendas para poder encontrarnos allí de nuevo.

Estos son los objetivos fijados para este corto periodo de Junta Directiva. Por nuestra parte y por la de todos los miembros de Juntapondremos muchas ganas, mucho tiempo y muchas energías para trabajar en pro de ASEBIR.

Mark Grossmann i Camps | Presidente M. Victoria Hurtado de Mendoza y Acosta | Vice-presidenta

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A C T U A L I D A D

DIRECTIVA DE LA UNIÓN EUROPEA (UE)

La Directiva Europea sobre Tejidos yCélulas (EC/2004/23) cubre ladonación de todos los tejidos y célulasrealizados en el ámbito de la UE,con la excepción de la sangre yhemoderivados. Por tanto, losgametos, los embriones y las técnicasde reproducción humana asistida estánafectados por esta directiva.

Contrariamente a lo que inicialmente sepueda pensar al ver un documento tanlargo, hay puntos muy positivos tanto en elcontrol de calidad como en la identificaciónde riesgos porque lo que esta directivapretende no es tanto aumentar elrendimiento de las técnicas sino aumentarla seguridad en la manipulación de tejidos ycélulas, minimizar el riesgo de latransmisión de enfermedades infecciosas yprevenir la confusión en la identificación degametos y embriones (para másinformación léanse los comentarios de A. Veiga y JA. García Velasco en esta misma sección en Junio de 2006 o bienel documento ESHRE position paper on theEU Tissues and Cells Directive EC/ 2004/23en la web de ESHRE). Esto requiere formarpersonal adecuado y certificado,documentar adecuadamente cada proceso,y formular los procedimientos estándar, consus controles de calidad, en todas lasunidades de Reproducción humana asistida.

La directiva europea prevé que, desde elmes de Mayo, se podrían realizar ya las inspecciones para comprobar que loscentros de Reproducción Humana Asistidase han adaptado a esta normativa.

Para ayudar en la implementación de esta directiva, se creó un consorcioentre ESHRE- HFEA y formado por 3 representantes de cada país miembro de la UE (un representante deembriología, uno de medicina, y otrode la administración).

Desgraciadamente, aunque España fue uno de los primeros países en hacer la transposición de la directiva

(Real Decreto 1301/2006) aún no hadesignado un representante de laautoridad competente, de manera quemientras que otros países ya estánincluso formando a los primerosauditores, en España aún no disponemosde una guía para la correctainterpretación de la directiva y sucumplimiento (para más información véase(http://www.eshre.com/emc.asp?pageId=678).

Las sociedades científicas agrupadas en laFEDERACIÓN DE ASOCIACIONES PARA ELESTUDIO DE LA REPRODUCCIÓN (SEF,ASESA, SEC y ASEBIR) hemos firmado unacarta conjunta instando al Ministerio deSanidad y Consumo a designar elrepresentante español cuanto antesmejor, para que no nos quedemosdescolgados de este importante proceso.

Pero mientras tanto todos los centrosde Reproducción humana asistidadeben dedicarse a la lectura atenta delReal Decreto 1301/2006 y adoptar lasmedidas que consideren oportunaspara implementarlo.

CERTIFICACIÓN ESHRE EN EMBRIOLOGÍA

La primera fase de este ambiciosoproyecto consistió en la certificación,por vía extraordinaria, de losprofesionales jefes de laboratorio conformación y experiencia. Se recibieronmás de 400 solicitudes (80 procedentesde España) de las que se aceptaron másde 335. Inicialmente se pensó enpublicar inmediatamente el listado deprofesionales acreditados, pero comoaún queda algún expediente porresolver, el Comité Ejecutivo de ESHREacordó no publicar la lista hastadespués del congreso ESHRE deBarcelona (Julio 2008) cuando estalista ya sea definitiva. Otro acuerdo delcomité ejecutivo de ESHRE fue exigirser miembro de ESHRE para conseguirla certif icación en embriología. Esterequisito se basa en la idea que elproceso de certif icación es, hoy porhoy, voluntario: ESHRE lo organiza

como una iniciativa privada a la queuno puede unirse o no, y por tanto larestringe a sus afiliados.

La segunda fase del proceso decertif icación, aún dentro del períodoextraordinario de puesta en marcha,cerró la recepción de candidaturas el31 de Marzo pasado y tendrá su puntoálgido en los exámenes previstos enJulio de 2008, durante el congreso deBarcelona. Con ellos culminará laprimera quinta de certif icación enSenior Clinical Embryologist.

A partir de Febrero de 2009 se abrirá lafase regular para obtener lacertificación en Clinical Embryologist.

Sabemos que la puesta en marcha de esteproceso ESHRE de certificación hagenerado dudas, incluso enfados y quehubo retrasos en los plazos previstos(algunos de ellos relacionados con la grandemanda que superó las previsiones).

ASEBIR, que ha dado y sigue dandopleno apoyo a esta iniciativa ESHRE,lamenta y pide disculpas por losinconvenientes. Consideramos de granrelevancia para regularizar la situaciónde la embriología clínica tanto enEspaña como en Europa que se lleve abuen puerto este proceso decertif icación e insta a todos losestudiantes y profesionales de laembriología a que se inscriban.

ASEBIR EN LA COMISIÓN NACIONAL DEREPRODUCCIÓN HUMANA ASISTIDA

El Real Decreto 906/2007 modificó lacomposición de la Comisión Nacional deReproducción Humana Asistida y nos diovoz y voto. Además se establece, dentrode la Comisión Nacional, una ComisiónTécnica Permanente compuesta losrepresentantes de la Sociedad Españolade Fertilidad, de la Asociación para elEstudio de la Biología de laReproducción, y de la AsociaciónEspañola de Genética Humana, y dosrepresentantes de la Administración

A PROPÓSITO DE LOS CAMBIOS LEGISLATIVOSEN EUROPA Y ESPAÑA

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En esta ocasión, más que hacer una puesta al día de un tema concreto, hemos considerado oportunocomentar diferentes aspectos que creemos destacados y la participación de ASEBIR en dichos eventos.


A C T U A L I D A D


General del Estado, para estudiar,analizar y elevar al Pleno propuesta deinforme en los supuestos previstos en elartículo 4.12.

Aunque las elecciones generaleslegislativas españolas han supuesto laparalización de las actividades de estetipo de comisiones, se pudo celebraruna reunión plenaria en el mes deNoviembre y ya se han valorado dosproyectos de investigación y varias

solicitudes de autorización paratratamientos experimentales.

Estamos muy satisfechos de lainclusión de ASEBIR en la propiaComisión Nacional y más en la ComisiónTécnica Permanente y recordamos atodos que la Ley 14/2006 contemplaque la Comisión Nacional deReproducción Humana Asistida recibaconsultas sobre la aplicación de lastécnicas (artículo 20º-3 Los centros y

servicios sanitarios en los que seapliquen las técnicas de reproducciónasistida podrán igualmente solicitar elinforme de la Comisión Nacional sobrecuestiones relacionadas con dichaaplicación. En este caso, el informedeberá solicitarse a través de laautoridad sanitaria que hayaautorizado la aplicación de las técnicasde reproducción asistida por el centro oservicio correspondiente).

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Mark Grossmann i Camps| Presidente |

M. Victoria Hurtado de Mendoza y Acosta| Vice-presidenta |


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José Luis Cortés et al. Criterios de Valoración Morfológica.

INTRODUCCIÓN

Los estudios sobre células madreconstituyen en la actualidad uno de loscampos con más expectativas de labiomedicina. Cuando en noviembre de1998, el grupo estadounidense lideradopor James Thomson publicó los datossobre la derivación de una línea decélulas madre embrionarias humana(hESCs, siglas inglesas de humanembryonic stem cells) a partir de unblastocisto en fase de preimplantación,se abrió una nueva puerta de esperanzapara la curación de enfermedades hasta

ahora incurables (Thomson y cols.,1998). Estas células suponen unaherramienta de enorme valor para el“screening” de nuevos fármacos, asícomo un modelo para estudiar laetiología de las enfermedades quetienen su origen durante la etapaembrionaria, o como fuente futura decélulas en medicina regenerativa(Menendez et al., 2006).

La legislación en España respecto al usode preembriones humanos sobrantes deciclos de fecundación “in vitro” (FIV)está actualmente regulada por la Ley

14/2006, sobre técnicas de reproducciónasistida, por el Real Decreto 1301/2006,sobre células y tejidos humanos, y por laLey 14/2007, sobre investigaciónbiomédica. En nuestra interpretación deestas leyes, la pareja sometida a un cicloFIV puede dar un destino final a aquellospreembriones sobrantes que seencuentren crioconservados ennitrógeno líquido, independientementedel tiempo de congelación, siempre bajoconsentimiento informado de la pareja.Los diferentes destinos posibles quepueden darse a los preembrionessobrantes crioconservados son:

Criterios de Valoración Morfológicos de Oocitos, Preembrionestempranos y Blastocistos Humanos propuestos por ASEBIRMorphological Assessment of Human Oocytes, early Embryos and Blastocystsproposed by ASEBIR

José Luis Cortés*, Gertrudis Ligero, Laura Sánchez, Ana Nieto, Clara Bueno, Rosa Montes, Pablo Menéndez.Banco Andaluz de Células Madre. Centro de Investigación Biomédica. Universidad de Granada. Campus de la Salud. Granada.*Correspondencia: [email protected]

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RESUMEN

ASEBIR ha publicado en sus Cuadernos de Embriología Clínica los Criterios de Valoración Morfológicos de Oocitos, Preembrionestempranos y Blastocistos Humanos, buscando poder consensuar los criterios de calidad entre todas las clínicas de reproducciónasistida españolas. Sin embargo, estos criterios no sólo deben ser útiles para los embriólogos clínicos, sino que pueden servir alos embriólogos pertenecientes a centros de investigación como ayuda para facilitar la derivación de líneas celulares embrionariashumanas así como para estudios moleculares y genéticos básicos de embriología humana. El objetivo de este trabajo es mostrarsi los criterios publicados por ASEBIR son extrapolables a preembriones congelados donados a investigación con células madre,utilizando para ello los preembriones autorizados para un proyecto de investigación del Banco Andaluz de Células Madre.

Palabras clave: Calidad blastocitaria, Calidad embrionaria, célula madre embrionaria humana, masa celular interna, preembrióncongelado.

SUMMARY

ASEBIR proposed in its Clinical Embryology Notebooks the Morphological Assessment for Human Oocytes, early Embryos andBlastocysts, aiming at reaching an agreement on the quality criteria between all Spanish assisted reproduction clinics.Nevertheless, these proposed criteria not only will be useful to clinical embryologists, but can also be useful to embryologistsmoving into basic research to help facilitate the derivation of human embryonic stem cells and further basic molecular andgenetic studies on human embryo development. The aim of this work is to discuss if the criteria published by ASEBIR are usefuland can be extrapolated to cryopreserved embryos which are donated to stem cell research using the authorized embryos foran ethically and scientifically approved research project to be carried out at the Andalusian Stem Cell Bank.

Key words: Blastocyst quality, embryonic quality, human embryonic stem cell, inner cell mass, cryopreserved embryo

Aplicabilidad en preembriones crioconservados donados para investigación con células madre.Applicability in cryopreseved embryos donated to stem cell research.


A R T I C U L O I

> Su utilización por la propia mujero cónyuge.

> La donación con fines reproductivos.> La donación con fines de investigación.> El cese de su conservación sin otra

utilización.

Respecto a la utilización de preembrionescon fines de investigación, sólo seautorizará si se atiene a varios requisitos:

> Posesión del consentimiento informado.> Que el preembrión no se haya

desarrollado in vitro más allá de 14 días después de la fecundación.

> Que la investigación se realice en centros autorizados.

> Que la investigación se realiceen base a un proyecto debidamente presentado y autorizado por las autoridades competentes

> Que se especifiquen las posibles relaciones de interés entre centros.

Esta legislación deja a España en untérmino medio de permisividad,englobándola en el grupo de paísesdonde está permitido investigar conpreembriones sobrantes de ciclos de FIVpara derivar hESC (Canadá, Holanda,Australia, Suecia), lejos del grupo depaíses donde está prohibido utilizarpreembriones para investigación conhESC (Irlanda, Austria, Noruega),aunque un peldaño por debajo del grupode países donde se pueden generarpreembriones con fines únicos deinvestigación (Reino Unido, Bélgica,Israel, Singapur).

Para la evaluación de la calidadembrionaria de aquellos preembrionescrioconservados que han sido donados ainvestigación, el Centro de ReproducciónAsistida facilita al Banco Andaluz deCélulas Madre (BACM) toda lainformación referente a cadapreembrión; desde la calidad que poseíaprevio a la congelación, el método decongelación utilizado, así como eltiempo que llevan los preembrionescongelados, entre otros datos.

ASEBIR, dentro de la Colección deCuadernos de Embriología Clínica, hapublicado los Criterios de ValoraciónMorfológicos de Oocitos, EmbrionesTempranos y Blastocistos Humanos. Estapropuesta ha sido diseñada debido a lafalta de consenso en este aspecto clave

de la embriología clínica y que conllevaproblemas tan comunes como laimposibilidad de generar estudiosmulticéntricos con valoraciones decalidad embrionaria común, deinterpretar informes clínicos delaboratorios ajenos, o de comparardatos bibliográficos.

Desde el BACM hemos querido sumarnosa esta propuesta, para ver si estoscriterios de valoración morfológicos sonextrapolables a los preembrionescrioconservados que son donados anuestro proyecto de investigación paraderivación de hESC.

MATERIAL Y MÉTODOS

Para poder disponer de materialbiológico para nuestras investigaciones,el BACM ha realizado durante los años2006 y 2007 una campaña derecuperación de preembrionessobrantes, tanto en hospitales públicosandaluces como en clínicas privadas(Cortes y cols., 2007). Estospreembriones han pasado los Comitésnecesarios (Comité de Investigación conPreembriones Humanos de Andalucía yla Comisión de Seguimiento y Control dela Donación del Instituto de Salud CarlosIII), que han dado la autorizaciónpertinente para su uso en investigacióna nuestro proyecto de investigación.

A nivel de infraestructura y organizacióndel espacio, disponemos de un completolaboratorio de embriología, dentro desalas GMP (siglas inglesas de GoodManufacturing Practice), conequipamiento y personal cualificadopara realizar la manipulación de estospreembriones y su posterior derivación ahESCs (Cortes y cols., 2006a, b).

Para la configuración del laboratorio deembriología evaluamos las guíaspropuestas por distintas asociaciones dereproducción asistida, observando queel único enfoque fue el reproductivo,haciéndose necesaria una actualizaciónde dichas guías, debido a la existenciade laboratorios de embriología que nose dedican a realizar técnicas dereproducción (Cortes y cols., 2006b).

Los Centros de Reproducción Asistida dedonde proceden los preembrionesdonados a investigación han facilitado al

BACM toda la información referente a cadapreembrión, desde la calidad que poseíaprevio a la congelación, el método decongelación utilizado, así como el tiempoque llevan los preembriones congelados,entre otros datos. Los preembrionesfueron congelados en estadio de divisióntemprana (Día +2/+3), y fueronclasificados cualitativamente por lasClínicas de Reproducción de origensiguiendo los sistemas de evaluación de lacalidad embrionaria tradicionales(Calderón y cols., 2002). Para lospreembriones que llegaron al estadio deblastocisto utilizamos como criterio declasificación tradicional el propuesto porGardner (Gardner y cols., 1998).

Según los criterios propuestos porASEBIR, la valoración morfológica enestos estadios ha constituidotradicionalmente la base de ladeterminación de la calidadembrionaria. Sin embargo, aunque haycierto consenso entre la definición de unpreembrión de buena o mala calidad, noexiste consenso entre laboratorioscuando se trata de valorar preembrionesde calidades intermedias. El objetivo deASEBIR ha sido poder consensuar loscriterios de calidad, creando una nuevatabla de clasificación embrionaria,cuando se trata del estadio de oocitos,preembriones tempranos, o cuando setrata de blastocistos. Nosotros nosvamos a centrar en los dos últimosestadios.

La calidad embrionaria fue evaluada porun embriólogo del BACMinmediatamente después del proceso dedescongelación, y en los días sucesivoshasta su evolución a blastocisto, aunquesólo mostramos en este trabajo lasituación inicial postdescongelación(Tabla 1) y la calidad de aquellospreembriones que llegaron al estadio deblastocisto (Tabla 2).

Una vez descongelados lospreembriones fueron lavados en medioG-MOPS (Vitrolife, Suecia) y colocadosen medio de cultivo (G-1 y G-2 V.5 plus,Vitrolife, Suecia). A continuación seevaluó la calidad embrionaria en base alos criterios de evaluación tradicionalesy también en base a los nuevos criteriosASEBIR, y además se compararon con lacalidad embrionaria precongelación,según los datos facilitados por los

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Centros de Reproducción de procedencia(Tabla 1).

Los 52 preembriones que hemosutilizado para este estudio fueroncongelados mediante dos métodosdistintos de crioconservación. Por unaparte, se utilizó el protocolo decongelación denominado decongelación ultrarrápida (Trounson ycols., 1988), y que consiste en lainmersión directa de los preembriones,

incluidos en dimetil sulfóxido (DMSO),en nitrógeno líquido. Por otra parte seutilizó el protocolo de congelación lenta(Freeze-kit1, Vitrolife, Suecia), queconsiste en el tratamiento de lospreembriones con un crioprotector queocupa el lugar del agua que hay en lascélulas mediante procesos osmóticos,seguido de un programa de congelaciónllevado a cabo por un congeladorprogramable (Nicool plus, Air Liquide,España).

El objetivo de nuestro proyecto deinvestigación es poder derivar hESC apartir de estos preembriones. Estaderivación consiste en el desarrollo delos preembriones hasta estadio deblastocisto, la liberación de la zonapelucida mediante el uso de ácido Tyrode(Irvine Scientific, CA, USA), la posteriorcolocación del blastocisto desnudosobre una superficie de células desoporte (feeders), y el posterioraislamiento mecánico de la masa celular

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Tabla 1: Tabla de asignación de calidad preembrionaria según los diferentes criterios en función de las variables consideradas.


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interna (MCI), donde se encuentran lashESCs.

RESULTADOS

Día de desarrollo embrionario de lospreembriones utilizados y métodos decongelación/descongelación utilizados

Para realizar nuestros experimentoshemos utilizado 52 preembrionesquefueron congelados en estadio de divisióntemprana (D+2 y D+3). Diecisietepreembriones fueron congelados en Día +2 (32,7%), mientras que 35 fueroncongelados en Día +3 (67,3%). En todoslos casos se utilizó para descongelarel protocolo de descongelacióncomplementario al utilizado para lacongelación.

Cinco preembriones (Preembriones 1-5)fueron congelados por el método decongelación ultrarrápida (9,6%). Lospreembriones restantes (Preembriones6-52) fueron congelados por el métodode congelación lenta (90,4%).

Calidad embrionaria de los preembrionespre- y post-descongelación siguiendo losdiferentes criterios de clasificación.

Para poder derivar nuevas hESC,partimos de 9 preembriones que poseíanantes de la congelación calidad I(17,3%), 32 preembriones que poseían

calidad II (61,5%) y 11 preembrionesque poseían calidad III (21,2%). Tras elproceso de descongelación, nuestraevaluación con criterios tradicionales diolos siguientes resultados: 5 preembrionescon calidad I (9,6%), 23 preembrionescon calidad II (44,2%), 9 preembrionescon calidad III (17,3%), 10 preembrionescon calidad IV (19,3%), y tuvimos 5preembriones que se lisaron por completoy que no pudieron ser evaluados (9,6%).Según los nuevos criterios propuestos porASEBIR y tras la descongelación de lospreembriones obtuvimos los siguientesresultados: 2 preembriones de categoríaA (3,8%), 4 preembriones con categoría B(7,7%), 11 preembriones con categoría C(21,1%), y 30 preembriones con categoríaD (57,8%) (Tabla 1). Queremos destacarque en 19 preembriones (36,5%)observamos la lisis de alguna blastómeraque no comprometió la supervivencia delos preembriones, pero que se tuvo encuenta a la hora de reclasificar su calidad.

Fase experimental de descongelación yestablecimiento de hESCs: datospreliminares.

De los 52 preembriones descongelados,12 preembriones llegaron al estadio deblastocisto (23,1%), siendo en todos loscasos preembriones descongelados conel método de descongelación lenta y endía +3 de desarrollo. Estos blastocistosprocedían de preembriones de categoría

A en dos ocasiones (16,7%), depreembriones de categoría C en 3ocasiones (25,0%) y de preembriones decategoría D en 7 ocasiones (58,3%). Enninguna ocasión el blastocisto seoriginó a partir de un preembrión decategoría B.

Respecto a la calidad blastocitariaevaluada con los criterios de Gardner,obtuvimos 2 blastocistos con calidad4AA (16,7%), 2 blastocistos con calidad4BB (16,7%), 3 blastocistos con calidad3BB (25,0%), 4 blastocistos con calidad3CC (33,3%), y un blastocisto concalidad 2BB (8,3%). Atendiendo a lanueva clasificación de ASEBIR obtuvimosun solo blastocisto con categoría A(8,3%), un solo blastocisto concategoría C (8,3%), y 10 blastocistos concategoría D (83,4%). Ninguno de losblastocistos se evaluó con categoría B(Tabla 2).

Los 12 blastocistos fueron liberados dela zona pelucida utilizando ácido Tyrodey puestos sobre “feeders” para procedera la derivación de hESCs. En 7 de losblastocistos (58,3%) se pudo aislar lamasa celular interna. En el momento deescribir este trabajo, pequeñas coloniascon morfología similar a hESCs seguíanen cultivo y desarrollo buscando elestablecimiento de la línea celular,correspondiendo al preembrión número24 y al preembrión número 27.

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Tabla 2: Tabla de asignación de calidad del blastocisto según los diferentes criterios en función de las variables consideradas.


A R T I C U L O I


DISCUSIÓN

En este estudio hemos intentadocomparar la calidad embrionaria de lospreembriones antes y después de lacongelación, siguiendo los criteriostradicionales, con la clasificación quetendrían estos preembriones utilizandolos nuevos criterios de ASEBIR, con el finde observar si esta nueva clasificaciónes extrapolable a los criterios de calidadembrionaria que se deducen seríannecesarios para derivar una línea dehESCs. Para poder realizar estacomparación hemos tenido que obviar ytransformar algunos términos que sóloson aplicables al campo reproductivo:

i) Derivación de hESCs en vez de capacidad de implantación

ii) Día de descongelación en lugar de díade transferencia

Además, hemos observado que enlos nuevos criterios de valoración deASEBIR no se contempla informaciónsobre los preembriones congelados, noatendiéndose por tanto a la posibilidadde que alguna blastómera resulte lisadadurante el proceso de descongelación.Cuando este hecho ha ocurrido ennuestro laboratorio, lo hemos tenido en

cuenta a la hora de determinar la calidaddel preembrión (Tabla 1). De estamanera y según el sistema de graduaciónde ASEBIR, la categoría A sería para elpreembrión de óptima calidad conmáxima capacidad de derivar a hESCs, lacategoría B de buena calidad conelevada capacidad de derivar a hESCs, lacategoría C de calidad regular con unaprobabilidad de derivar a hESCsmedia/baja, y la categoría D para elpreembrión de mala calidad con unaprobabilidad de derivar a hESCsbaja/nula. Este hecho nos hacesospechar que algunos preembrionesque hubieran podido tener categoría A óB previo a la congelación, pasaron apreembriones de categoría C ó D al serdescongelados, como el preembriónnúmero 28, que habiendo sufrido lisis dedos de sus blastómeras (5morfológicamente normales+2 lisadas)(Figura 1A), con la consecuente bajadaen el criterio de valoración ASEBIR decategoría B a categoría D (Tabla 1), llegóal estadio de blastocisto (CategoríaASEBIR D), aunque después no fuimoscapaces de aislar la MCI (Tabla 2).Además, somos conscientes que lapresencia de estos restos de lisis celularpueden dificultar, aún más que lapresencia de fragmentos citoplasmáticos,

la formación de blastocistos de buenacalidad (Figura 1B).

Con respecto a los parámetrosmorfológicos a evaluar por ASEBIR enel estadio de D+2 y D+3, vimosconcordancia entre los diferentescriterios de valoración en todas lasvariables consideradas, excepto en laque se refiere a número celular y ritmode división. Aunque la hora de lacongelación no es un dato que noshayan facilitado los Centros deReproducción, obviamos que estuvo entodos los casos dentro de los intervalosde observación recomendados porASEBIR, siendo en D+2: 44-47 horaspost-inseminación, y en D+3: 67-71horas post-inseminación. En nuestraexperiencia tuvimos el claro ejemplodel preembrión 27, que teniendocalidad 5CI por los criteriostradicionales, se clasificó con categoríaD según ASEBIR debido a un ritmo dedivisión algo más lento (Tabla 1), llegóal estadio de blastocisto, y tuvimoséxito en el aislamiento de la MCI para intentar la derivación de hESCs(Tabla 2).

Nos ocurrió lo mismo a la hora decomparar los distintos criterios de

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Figura 1 Ejemplos representativos de preembriones descongelados en el BACM. 1A: Preembrión en día +3 inmediatamentedespués de ser descongelado, y que pasó deser 7CII a 5CIII, con lo que bajó según loscriterios de ASEBIR de categoría B acategoría D.

1B: Ejemplo representativo de unpreembrión en día +5 donde se observa quelos restos de células lisadas están impidiendoque el blastocele pueda ocupar todo elvolumen del preembrión. La flecha blancaindica los restos de la célula lisada.

1C: Preembrión en día +3 inmediatamentedespués de ser descongelado, y que poseíacalidad tipo II debido a la forma elíptica de lazona pelucida. Según los criterios de ASEBIRse trata de un preembrión con categoría D,debido al bajo número de células.

1D: Preembrión en día +6, donde se observóla evolución a un blastocisto de calidad 4AAsegún Gardner, y que debido a que no llegó aorganizarse en blastocisto en día +5 pasó atener calidad C según los criterios de ASEBIR.


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valoración de la calidad cuandoobservamos el estadio de blastocisto.Mientras que vimos concordancia a lahora de evaluar las variablesconsideradas por ASEBIR como elaspecto de la zona pelucida, aspecto ytamaño de la MCI y del trofoectodermo,y el grado de expansión, cuandoevaluamos el día de organización delblastocisto pudimos comprobar quealgún preembrión que alcanza unacalidad blastocitaria óptima respecto alas demás variables, pasó a sercategoría C solamente porque seorganizó en blastocisto en D+6, enlugar de en D+5. Esto le ha ocurrido ennuestro trabajo al preembrión 13(Tabla 2). Teniendo en cuenta queprocedía de un preembrión yacatalogado como categoría D cuandoestaba en D+3, es lógico pensar que ibaa llevar acumulado este retardo en sudesarrollo (Figura 1C, D). Por tanto lavariable de número celular y ritmo de división es para nosotros

independiente de la calidadmorfológica que se consiga, ya que alpreembrión 13 también pudimosaislarle la MCI. Además, el hecho de quetodos los preembriones que llegaron ablastocisto fueran congelados en día +3corrobora los estudios reproductivos enlos que mantener en cultivo lospreembriones un día más antes de lacrioconservación (Día+2 vs. Día+3)permite seleccionar mejor la calidad deestos (Sifer et al., 2006). Esto puedetener implicaciones importantes para laselección de preembriones congeladosdestinados a derivar hESCs.

La tasa de éxito en la derivación dehESCs sigue siendo baja actualmente,necesitándose un gran número depreembriones para poder derivar unnúmero bajo de líneas establecidas ycaracterizadas, sobre todo cuando lospreembriones a los que se puede optarson los sobrantes de las técnicas dereproducción asistida, y que, por tanto,

no fueron prioritarios a la hora derealizar la transferencia. Este hecho ha dado lugar a que muchos grupos de investigación inmersos en laderivación de hESCs utilizando tanto preembriones frescos comocongelados, comiencen a tener encuenta la calidad embrionaria de estospreembriones (Zhang et al., 2006;Lerou et al., 2008). En nuestraexperiencia, las colonias que tenemosactualmente han procedido de unpreembrión de categoría A, y queevolucionó a un blastocisto decategoría D, en el caso del preembrión24 (Figura 2), y de un preembrión decalidad D, que evolucionó a unblastocisto de categoría D, en el casodel preembrión 27 (Figura 3), lo quenos hace ver una vez más que el númerocelular y el ritmo de división en nuestraexperiencia puede no ser un factorlimitante sobre la posibilidad de éxitoen derivación.

Figura 2 Evolución a blastocisto y aislamiento de la MCI del preembrión 24.

1A: Preembrión 24 en día +3 inmediatamente después de ser descongelado, y que pasó de ser 8CI a 7CII, aunque mantuvo la categoría Asegún los criterios de ASEBIR.

1B: Preembrión 24 en día +4, donde observamos la compactación en mórula.

1C: Preembrión 24 en día +6 donde ha alcanzado el estadio de blastocisto con una calidad 4BB según Gardner, y que debido a que no llegó aorganizarse en blastocisto en día +5 pasó a tener calidad D según los criterios de ASEBIR.

1D: Colonia primaria del preembrión 24 en día +9, una vez liberado de la zona pelucida y colocado en “feeders”. La flecha negra indica dondeestaría situada la MCI.

1E: Colonias con morfología similar a hESCs del preembrión 24 tras pase a “feeders” frescos una vez aislada la MCI.


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José Luis Cortés et al. Criterios de Valoración Morfológica.12

Desde el BACM opinamos que lapropuesta de ASEBIR para estandarizarlos criterios de valoración morfológicosde oocitos, embriones tempranos yblastocistos humanos es muy positiva y extrapolable en su mayor parte a la manipulación de estas células parapropósitos diferentes de lareproducción, aunque creemos que esnecesario publicar un anexo que serefiera concretamente a lospreembriones congelados, y que no seatan exigente con la variable de númerode células y ritmo de división. Esteanexo específico para estospreembriones sería útil tanto para elpropósito de derivación de hESCs,donde la evolución de los preembrionesal estadio de blastocisto es necesaria,como para los programas decriotransferencia que se realicen dentrode los Centros de ReproducciónAsistida.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por laConsejería de Salud de la Junta deAndalucía (Proyecto 0030/2006 TC yMR). Queremos agradecer al ServicioAndaluz de Salud, a la FundaciónProgreso y Salud, a ANACER y al Institutode Salud Carlos III su continuacolaboración.

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Figura 3 Evolución a blastocisto y aislamiento de la MCI del preembrión 27.

1A: Preembrión 27 en día +3 inmediatamente después de ser descongelado, y que conservó una calidad de 5CI. Según los criterios de ASEBIRse trata de un preembrión con categoría D, debido al bajo número de células.

1B: Preembrión 27 en día +4, donde observamos división celular.

1C: Preembrión 27 en día +6 donde ha alcanzado el estadio de blastocisto con una calidad 3BB según Gardner, y que debido a que no llegó aorganizarse en blastocisto en día +5 pasó a tener calidad D según los criterios de ASEBIR .

1D: Colonia primaria del preembrión 27 en día +8, una vez liberado de la zona pelucida y colocado en “feeders”. La flecha negra indica dondeestaría situada la MCI.

1E: Colonias con morfología similar a hESCs del preembrión 27 tras pase a “feeders” frescos una vez aislada la MCI.


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Brossa M. et al. Incidencia de multinucleación en FIV-ICSI.

INTRODUCCIÓN

Es mucha la bibliografía que se haescrito describiendo qué parámetros sonlos adecuados en la valoración de losembriones para intentar encontrarcuáles de ellos son los que tienen unamayor probabilidad de implantación. Enla transferencia de embriones en estadíocelular (D+2 ó D+3), la valoración delnúmero de células, la simetría entreblastómeras, el grado de fragmentacióny la presencia de multinucleación (MNC)suelen ser los principales parámetros atener en cuenta para decidir quéembrión o embriones son los óptimospara transferir. La multinucleación es unfenómeno habitual en los laboratoriosde FIV y se ha relacionado con lapresencia de alteraciones genéticas enlos embriones en los que se observa, asícomo con una menor tasa deimplantación, a pesar de que, en cultivo,a menudo los embriones que presentanMNC son capaces de desarrollarse hastaestadío de blastocisto.

Hay cierta variabilidad en lo que aincidencia de MNC se refiere en la

bibliografía, tanto cuando se valora pornúmero de ciclos como cuando se valoraen relación al número de embriones conMNC. En cualquier caso y, debido a lamenor tasa de implantación que llevaasociada, la MNC es un fenómeno aevitar, por lo que resulta importantesaber cuáles son las razones quefavorecen su aparición para así poderevitarlas.

A partir del estudio realizado por EricVan Royen et al. (Human Reproduction18, 1062-1069) hemos realizado ennuestro centro un análisis retrospectivoy descriptivo de la incidencia demultinucleación (MNC) en D+2 enembriones de FIV-ICSI en relación a:número de ovocitos obtenidos por ciclo,dosis de FSH utilizada en laestimulación, técnica de inseminación(FIV o ICSI) y grado de fragmentaciónembrionaria.

MATERIAL Y MÉTODOS

Hemos analizado 3224 embrionesobtenidos en 460 ciclos realizados ennuestro centro entre el 31 de enero de

2005 y el 31 de diciembre de 2006 (350ciclos correspondían a pacientes y 110 acasos de donación de ovocitos; elpromedio de edad era, respectivamente,34.7 y 26.1 años).

Para la preparación de las muestras desemen, se utilizó el protocolo estándarde centrifugación en gradientes dedensidad (75% - 90%) (Puresperm 100,Nidacon) y dilución del pelletrecuperado en medio IVF (IVF Medicult).

Tras la recuperación de los complejoscúmulo-corona-ovocito (CCO) bajo lupaen el laboratorio, estos se mantuvieronen placas de 4 pocillos con G-Fert(Vitrolife) en incubador a 37 ºC, 6% CO2.En los casos de FIV convencional, secambiaron los CCO a pocillos de 0,5 ml deIVF (IVF Medicult) a razón de entre 3 – 5CCO por pocillo, mientras que losovocitos destinados a ICSI, se colocaronen gotas de 35 μl de Hyasa (COOK)durante 30 segundos para, acto seguido,denudarlos mecánicamente por pipeteocon pipetas de diámetro decreciente engotas de 30 l de MOPS (Vitrolife). Unavez denudados los ovocitos, estos eran

INCIDENCIA DE MULTINUCLEACIÓN EN IVF-ICSIMULTINUCLEATION INCIDENCE IN IVF-ICSI

Brossa M., Blanch X., Antich M.FertiLAB, Institut Català de Fertilitat, Barcelona, España.

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A R T I C U L O I I

RESUMENLa multinucleación (MNC), definida como la presencia de al menos una célula con dos o más núcleos, es un fenómeno habitualen los laboratorios de FIV y se ha correlacionado negativamente con las tasas de implantación. El objetivo de este estudio fueevaluar la incidencia de multinucleación en día 2 en los embriones procedentes de ciclos de FIV – ICSI realizados en nuestrocentro entre el 31 de enero de 2005 y el 31 de diciembre de 2006, valorando si se observaba alguna relación con el número deovocitos obtenidos por ciclo, la dosis de FSH utilizada en la estimulación, la técnica de inseminación (FIV o ICSI) y el grado defragmentación embrionaria.

Palabras clave: multinucleación/ número de ovocitos/ FSH/ FIV/ ICSI/ fragmentación embrionaria.

SUMMARYMultinucleation, defined as the presence of at least one cell with two or more nuclei, is a usual phenomenon in IVF laboratoriesand it has been negatively correlated with implantation rate. The objective of this study was to evaluate the incidence ofmultinucleation in day 2 embryos proceeding from IVF-ICSI cycles realized in our laboratory between January 31th of 2005 andDecember 31th of 2006, evaluating if some relation was observed with the number of oocytes retrieved per cycle, the total doseof FSH used during stimulation, the insemination technique (IVF or ICSI) and the fragmentation grade of the embryos.

Key words: multinucleation/ oocytes number/ FSH/ IVF/ ICSI/ embryo fragmentation.


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Junio 2008 Vol. 14 · Nº 1 17

incubados en un pocillo limpio de G-Ferthasta el momento de la microinyección.

En los ciclos de fecundación medianteFIV convencional, para la co-incubaciónentre los CCO y los espermatozoides seutilizó medio IVF (IVF, Medicult) a 37 ºC,6% CO2 durante un tiempo deinseminación de entre 3 – 5 horas,pasadas las cuáles se cultivaban los CCOde forma individualizada en microgotasde 30 l de G1 hasta la valoración depronúcleos.

Se realizó ICSI en todos los ovocitosmaduros en los casos en que la muestraera indicada para ello y en al menos lamitad de los ovocitos en la prácticatotalidad de los ciclos con recuperaciónespermática suficiente para la FIVconvencional, para evitar posibles fallos de fecundación en FIV con laconsiguiente imposibilidad detransferencia embrionaria.

El cultivo de los ovocitos se realizó enplacas Falcon embriotestadas, bajoaceite (COOK Oil) en gotas de G1 de 30 l,en un incubador (Labotect IncubatorC200) a 37 ºC y al 6% CO2.

La valoración de los pronúcleos (a las18h + 2) así como la divisiónembrionaria (a las 42h + 2) se realizó enmicroscopio invertido Nikon EclipseTE200 a 400X y girando el embrión si eranecesario para la observación de losnúcleos en las distintas células.

Para la valoración de los resultados, apartir de la tasa de MNC general denuestro laboratorio (ver apartadoResultados), se establecieron dosgrupos según presentaran una tasa deMNC por caso comprendida dentro de losvalores normales o una tasa de MNC porcaso más elevada de lo esperado. Paracada uno de estos grupos se valoró latasa de MNC según la dosis de FSHutilizada y la recuperación ovocitaria eldía de la punción conjuntamente.

RESULTADOS

En el artículo publicado por Eric VanRoyen et al. estudiaron, entre otrosparámetros, la incidencia demultinucleación (definida como lapresencia de al menos una célula con doso más núcleos – ver figuras A, B y figuras

1, 2 –) en relación al número de ovocitosrecuperados, la dosis de FSH totalutilizada en la estimulación y la técnicade inseminación (FIV convencional vs.ICSI). Encontraron diferenciassignificativas en los casos en que serecuperaron 10 o más ovocitos porpunción, así como las estimulacionescon dosis mayores o iguales a 2400 UI deFSH y en aquellos embriones confragmentación mayor al 10%. Laproporción de multinucleación en ICSIversus FIV fue de 1.06.

A partir de estos valores, tomándoloscomo punto de corte, analizamos laincidencia de MNC en nuestro centro,obteniendo los resultados presentados enla Tabla 1.

De un total de 3224 embriones obtenidosen 460 ciclos de FIV-ICSI realizados,observamos MNC en 376 embriones(11.7%), en 184 de los ciclos con uno omás embriones multinucleados (40.0%).

A partir del valor obtenido, establecimoscomo límite de normalidad para MNC en nuestro laboratorio los casos conmenos de un 15% de embriones

Figuras A y B. Embriones en D+2 con presencia deblastómeras multinucleadas.

(Fotografías: Hanna Balakier & Ken Cadesky)

Figura 1. Embrión en D+2 procedente de ICSI conMNC en una de las blastómeras.Figura 2. Embrión en D+2 procedente de FIVclásica con una blastómera trinucleada.(Fotografías de embriones de nuestro centro)

Tabla1: Resultados de MNC en relación a la dosis deFSH utilizada y del número de ovocitos recuperadosen punción.


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Brossa M. et al. Incidencia de multinucleación en FIV-ICSI.

multinucleados. Observamos entoncespara cada uno de los dos grupos (conmayor y con menor tasa de MNC de laesperada) la incidencia según la dosis deFSH utilizada durante la estimulación y,dentro de estos subgrupos, la incidenciaen función del número de ovocitosrecuperados. Según esto, no parecióobservarse mayor MNC teniendo encuenta sólo la dosis de FSH utilizada,pero sí se observó que la incidencia deMNC aumentó más de lo esperado enaquellos ciclos en que, usando una dosis> 2400 UI de FSH, se recuperaron más de9 ovocitos (75.9% comparado con un46.7% esperado) (ver Tabla 1).

De un total de 1736 embriones con <10% de fragmentación, 198 presentaronMNC (11.4%), mientras que de los 1488embriones con > 10% de fragmentación,178 presentaron MNC (12.0%), noapreciándose diferencias importantesentre los dos grupos.

Para las transferencias embrionarias,cuando era posible, se elegían aquellosembriones que más se aproximaban a losparámetros ideales de división: 4 célulasen Día 2, grado de fragmentación < 10%,con blastómeras simétricas y regulares yen los que no se hubiera observado MNC.

Así pues, cuando fue posible, no seeligieron embriones que hubieranpresentado MNC dada su reducida tasa deimplantación. A pesar de ello, enocasiones se realizaron transferenciasmixtas (embriones en los que no seobservó MNC y embriones con MNC) dadoque eran transferencias no selectivas (nohabía otros embriones para seleccionar).

De un total de 40 embriones con MNCtransferidos correspondientes a 36transferencias, se ha observado embarazocon saco en 13 ocasiones. En 12 de loscasos, se trató de transferencias mixtas deembriones con y sin MNC; de estos 12casos, 3 terminaron en aborto. En un caso,la transferencia fue de un solo embrión, elcuál presentaba MNC; dio embarazo peroacabó en aborto de primer trimestre. Hubodos casos de transferencias mixtas conembarazo bioquímico.

DISCUSIÓN

La MNC es un fenómeno habitual en los laboratorios de FIV y se ha

correlacionado negativamente con lastasas de implantación, debiéndose teneren cuenta a la hora de decidir quéembriones transferir.

A partir de las observaciones realizadasen nuestro centro vemos que, en loscasos en que es necesaria unaestimulación con dosis elevadas de FSH(dosis mayores a 2400 UI perorecuperaciones ovocitarias de menos de10 ovocitos), la incidencia demultinucleación no parece aumentar,pero sí parece hacerlo en casos en que,con dosis elevadas, la recuperaciónovocitaria es también elevada. A partirde esta observación, valoramos quesería conveniente ajustar bien las dosisen la estimulación, de manera que enbuenas respondedoras no se dieran altasdosis, ya que la recuperación ovocitaria,si bien fuera algo menor, sería suficientepara asegurar un buen ciclo de FIV en elque, probablemente, hubiera menorincidencia de multinucleación.

Es muy probable que la mayor incidenciade MNC en estos ciclos se deba a que muchos de los ovocitos recuperadosno han tenido tiempo de madurarcorrecta y completamente durante elreclutamiento folicular, a pesar de queen muchos casos se puede observar lapresencia de corpúsculo polar.

En lo que a tasas de gestación se refiere,no podemos sacar ninguna conclusiónbasándonos en nuestra experiencia, dadoque sólo hemos realizado unatransferencia con la totalidad de losembriones multinucleados (transferenciano selectiva de un solo embrión) o, enaquellas ocasiones en que se hanrealizado transferencias mixtas deembriones multinucleados junto conembriones sin MNC y se ha observadogestación, el número de sacos siempre hasido inferior al número de embrionestransferidos. Sólo hemos observadogestación evolutiva en dos de los casoscorrespondientes a transferencias mixtas,correspondientes a transferencias de tresembriones y embarazos gemelares. Endichos casos, no es posible asegurar cualde los tres embriones no implantó, perodada la baja tasa de embarazo descrita enembriones multinucleados, no es ilógicopensar que los embriones quepresentaron MNC no fueron capaces deimplantar, si bien no afectaron a la

capacidad de implantación de losembriones que se transfirieron con ellos.

A la vista de los estudios presentados portantos centros con respecto a la MNC y pornuestra propia experiencia, seguiremosconsiderando la presencia de MNC comoun parámetro muy importante a la horade decidir qué embriones son los másadecuados para la transferencia. Y, en lamedida de lo posible, consideramostambién muy importante ajustar losprotocolos de estimulación a cada casoconcreto para evitar su mayor incidencia.

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A U L A J O V E N

Martín M. et al. Consecuencias de la rotura sin salto de la membrana de los ovocitos.

INTRODUCCIÓN

Entre las técnicas de reproducción asistida,la microinyección intracitoplasmática deespermatozoide (ICSI) es la técnica defecundación asistida ampliamente utilizadadesde que fue probada como la máseficiente en casos de esterilidad de causamasculina (Palermo et al., 1992).

Para una adecuada realización de latécnica, primero se deben elegir ypreparar correctamente los gametos. Elovocito a microinyectar debe ser un

ovocito maduro (MII), es decir, que hayaextruido el primer corpúsculo polar. Parapoder observarlo, se le deben retirar lascélulas del cúmulo que rodean la zonapelúcida. Este procedimiento recibe elnombre de decumulación. Por otraparte, el espermatozoide debe seractivado mecánicamente, rompiendo elflagelo con ayuda de la micropipeta. Asíse estimulará la reacción entre losdiferentes componentes citoplasmáticosde ambos gametos.

Con el ICSI se consigue microinyectar un

único espermatozoide con buenamorfología y movilidad en la mejor zonadel citoplasma del ovocito. De estamanera se superan los pasospreliminares de la fecundación in vivo,como la reacción acrosómica y la fusiónde membranas de los gametos.

La microinyección espermática estáindicada en aquellos casos donde hay unfactor masculino relacionado con bajaconcentración espermática, movilidady/o morfología alterada que impide unabuena fecundación mediante la

CONSECUENCIAS DE LA ROTURA SIN SALTO (SS) DE LA MEMBRANADE LOS OVOCITOS TRAS EL ICSI.Consequences of a sudden breakage (SS) of oocyte membrane after ICSI

Martín M., Florensa M., Esbert M., Riqueros., M., Calderón A., Múgica A., Ballesteros A., Calderón, G.IVI-Barcelona, Ronda General Mitre 14, 08017. Barcelona. Correspondencia: [email protected]

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RESUMENEl objetivo de este estudio es evaluar de manera retrospectiva las consecuencias de la rotura, tipo Sin Salto (SS), de lamembrana citoplasmática del ovocito durante la microinyección citoplasmática de espermatozoide (ICSI).

Se han incluido 226 ciclos de ICSI realizados desde octubre del 2004 hasta diciembre 2006 en el IVI-Barcelona. Se han divididoen dos grupos: grupo A (n = 111 ciclos, 1291 ovocitos, 225 ovocitos con rotura SS) en el que hay al menos un ovocito dentro dela cohorte con rotura SS y grupo B (n = 155 ciclos, 1348 ovocitos,) en el que no ha habido ningún ovocito con rotura SS en lacohorte. De los dos grupos se han calculado y comparado la tasa de degeneración ovocitaria y la tasa de fecundación. Una vezcomprobada la fecundación se ha evaluado la evolución de los embriones en día 2 y día 3, siendo en este día cuando se realizala transferencia embrionaria y, en caso de tener embriones sobrantes de suficiente calidad, se ha procedido a su congelación.

Se ha observado un aumento significativo (p<0.05) en la degeneración de ovocitos del grupo A. Un 10% de los ovocitos conrotura tipo SS degeneran vs un 4% de los ovocitos que degeneran sin haber sufrido este tipo de rotura. Del mismo modo, seobserva una diferencia significativa (p<0.05) en la tasa de fecundación. Se encuentra una fecundación del 69% en los ovocitosque han tenido rotura SS vs un 75% de fecundación en los ovocitos del grupo B. Los resultados muestran que, una vezconseguida la fecundación, la probabilidad que un embrión sea transferido es independiente del tipo de rotura de la membranaovocitaria, (28.2% en grupo A vs. 33.6% en grupo B).

En conclusión, según este estudio, la rotura del oolema de tipo SS no compromete al desarrollo ni a la calidad embrionaria, unavez superada la fecundación.

SUMMARYThe aim of this study was to asses the consequences of a sudden breakage (SS) of oocyte membrane while performing anintracytoplasmic sperm injection (ICSI).

A retrospective analysis was performed on 226 cycles of ICSI in a 2 year period in our clinic. We categorized them in 2 groups:group A in which at least one oocyte presents SS breakage (n = 111 cycles, 1291 oocytes, 225 SS membrane breakage oocytes)and group B in which no oocytes present SS breakage (n = 1555 cycles, 1348 oocytes). We evaluate degeneration and fertilityrate of each group. Once fertilization was assessed, embryo quality was evaluated in Day2 and D3. In this day, we performedthe embryo transfer and in case of having a surplus of good quality embryos we proceed to freeze them.

Degeneration rate was significantly higher (p<0.05) in group A compared with group B (10% vs 4% respectively). Fertilityrate followed an exactly inverse pattern, being significantly lower (p<0.05) in group A compared with group B (69% vs 75%respectively). Our data showed that, once fertilization was achieved, the probability of one specific embryo to reach thetransfer does not depend on the kind of oocyte membrane breakage (28.2% Group A vs. 33.6% in Group B).

Thus, these data indicate that SS type of breakage do not jeopardize neither embryo development nor quality once fertilization is reached.


A U L A J O V E N

inseminación convencional (FIV). Delmismo modo el ICSI se utiliza en casos defallo de fecundación por FIV, de nogestación en diferentes intentos deinseminación artificial homóloga oheteróloga (IAH o IAD) y en casos dediagnóstico genético pre-implantacionalpor PCR. En estos casos, ni las células delcúmulo, ni los espermatozoides adheridosa la zona pelúcida deben interferir en elresultado.

Esta técnica se lleva a cabo con la ayudade un micromanipulador que dirige elmovimiento de las dos micropipetasresponsables del ICSI. Una de ellas(conocida como holding), mediantesucción, sujeta el ovocito en la posicióndeseada para realizar el ICSI. Así, elovocito se posiciona de manera que lazona del citoplasma adyacente al primercorpúsculo polar, donde teóricamente seencuentra el huso meiótico, quedaalejada de la zona de microinyecciónevitando la posible desestructuración dela placa metafásica. La segundamicropipeta (la de inyección) perfora sinproblemas la zona pelúcida y lamembrana citoplasmática u oolema,para depositar el espermatozoide en elooplasma (Remohí et al 2002).

El oolema suele presentar unaelasticidad y resistencia determinadafrente a la pipeta de inyección, y aunquese deben reducir al máximo los dañosocasionados al ovocito durante la rotura,no siempre es posible. Dependiendo dela calidad ovocitaria, del grado demaduración del citoplasma y de lapropia membrana citoplasmática, larotura de ésta se realizará de maneramás o menos agresiva. En general, unacierta elasticidad en la membranacitoplasmática está relacionada con unabuena calidad ovocitaria.

La categorización de los diferentes tiposde rotura de la membrana difiere entrelos diferentes laboratorios de FIV. En1995 se describieron 5 tipos de roturadiferentes: Tipo A, el oolema se rompedurante el proceso de introducción de lapipeta sin aplicar ningún tipo deaspiración del citoplasma; Tipo B, eloolema se rompe como consecuencia deuna leve aspiración; Tipo C, el oolema serompe aspirando muy fuerte,sobrepasando la zona pelúcida; Tipo D,el oolema se rompe después de la

reintroducción de la pipeta en otra área,aspirando poco citoplasma; Tipo E, eloolema se rompe debido a una fuerteaspiración después de la reintroducción dela pipeta en otra área (Nagy et al., 1995).Posteriormente, en 1996 se describieron 3tipos de rotura diferentes: normal, rápiday difícil. La rotura normal se define comoaquella en la que el oolema presenta ciertaresistencia y se rompe al aplicar un poco depresión; una rotura rápida es aquella en laque el oolema se rompe durante el procesode introducción de la pipeta sin presentarresistencia alguna; y finalmente unarotura difícil, aquella en la que se debereintroducir la pipeta en otra área y enocasiones aspirar citoplasma (Palermo etal., 1996).

En la actualidad, en el laboratorio de FIVde IVI Barcelona para describir losdiferentes tipos de rotura no se excluyeninguna de las anteriores, y de estamanera se identifican 7 tipos de roturadiferentes: SS, A1, A2, A3, STA1, STA2,STA3. Rotura SS o Sin Salto, el oolema serompe durante la introducción de lapipeta sin ningún tipo de resistencia;Rotura A1, el oolema se rompe alintroducir la pipeta observándosepreviamente una invaginación en lamembrana siendo esto síntoma de unacierta elasticidad. Rotura A2, cuando noes posible una rotura A1, el oolema serompe como consecuencia de una leveaspiración del citoplasma. Rotura A3, eloolema se rompe después de unaaspiración citoplasmática importante alpresentar una mayor resistencia a larotura. Rotura STA1 o Stirring, el oolemase rompe al reintroducir la pipeta en otraárea aplicando una cierta presión.Rotura STA2, el oolema se rompedespués de la reintroducción de la pipetay una leve aspiración. Rotura STA3, eloolema se rompe después de lareintroducción de la pipeta y unaimportante aspiración.

Cada tipo de rotura tiene unarepercusión sobre el ovocito y suposterior desarrollo. En los estudiosrealizados por Nagy et al. en 1995 yPalermo et al. en 1996, se encuentra unamayor tasa de degenerados y una menortasa de fecundación cuando la rotura esde tipo A o rápida (según lacategorización del IVI Barcelona unarotura de tipo SS) debido a unainmadurez del ooplasma y del oolema.

A las 17-20 horas posteriores a lamicroinyección, se comprueba lafecundación de los zigotos. Un zigotocorrectamente fecundado debe tener 2pronúcleos (el masculino y el femenino)y dos corpúsculos polares extruidos (elprimario y el secundario). Se consideraque la fecundación es anómala cuandoen lugar de 2 pronúcleos, el zigotopresenta cualquier variación en númerode éstos. (Remohí et al., 2000).

El desarrollo y la calidad de losembriones es valorado en día 2 y en día3. El día de la transferencia seseleccionarán los embriones (1 o 2) demejor morfología entre todos los de lacohorte embrionaria.

OBJETIVO

El objetivo de este estudio es averiguarsi, diez años más tarde, con elperfeccionamiento de la técnica y con laexperiencia de los biólogos, una roturasin salto (SS) sigue teniendo las mismasrepercusiones.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se ha realizado un estudio retrospectivoen el que se han incluido 266 ciclos deFecundación in Vitro realizados ennuestro centro desde octubre de 2004hasta diciembre de 2006. Se trata deciclos realizado con ovocitos propios enlos cuales la técnica indicada para lainseminación es el ICSI. Se han divididolos ciclos en dos grupos: grupo A (n = 111ciclos, 1291 ovocitos) en el que hay al menos un ovocito dentro de la cohortecon rotura SS y grupo B (n = 155 ciclos, 1348 ovocitos) en los que no ha

Junio 2008 Vol. 14 · Nº 1 21

Fig1.Caracterización Roturas. IVI Barcelona


A U L A J O V E N

Martín M. et al. Consecuencias de la rotura sin salto de la membrana de los ovocitos.

habido ningún ovocito con rotura SS en la cohorte. De cada grupo se havalorado las tasas de degeneración,correcta fecundación y fecundaciónanómala. Por otro lado, se ha comparadoel porcentaje de embriones transferidoso congelados según el tipo de rotura quese ha dado en el momento de lamicroinyección espermática.

RESULTADOS

Este estudio consta de dos grupos de pacientes: A y B, correspondientes a pacientes que han tenido algúnovocito con rotura SS durante lamicroinyección en su cohorte, y apacientes que no han tenido ningúnovocito con rotura SS en su cohorteovocitaria respectivamente.

Ambos grupos son comparables entratamiento, edad media, número deovocitos totales y número de ovocitosmaduros.

a) Chi cuadrado de Pearson: p=0.001Diferencia degeneración entre Grupo A yGrupo B

b) Chi cuadrado de Pearson: p=0.01Diferencia de fecundación entre Grupo A

y Grupo B

c) Chi cuadrado de Pearson: p=0.002Diferencia fecundación anómala entreGrupo A y Grupo B

d) Chi cuadrado de Pearson p>0.5Diferencia de transferencia entre GrupoA y Grupo B

f) Chi cuadrado de Pearson: p=0.02Diferencia de tasa de congelados entreGrupo A y Grupo B

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en este estudioretrospectivo revelan que el tipo derotura SS aumenta la probabilidad dedegeneración y disminuye la tasa defecundación de manera significativa, delmismo modo que reflejaban los estudiosde Nagy et al. y de Palermo et al. unadécada atrás.

El aumento significativo de la tasa defecundación anómala, como afirmanPalermo et al. (1996) es debido a lafragilidad o inmadurez de la membranaplasmática, que dificulta la extrusión del

segundo corpúsculo polar (CP), el cual descondensa en el citoplasma,formándose un tercer pronúcleo.

La comparación del número medio deembriones transferidos y el porcentajede embriones congelados en los gruposA y B, no muestra ninguna diferenciasignificativa. Se puede concluir que unarotura SS no compromete el desarrollo nila calidad embrionaria de los ovocitoscorrectamente fecundados.

Una rotura SS provoca la disminución delnúmero de embriones que forman lacohorte embrionaria de una paciente.Por lo tanto, para que existan másposibilidades de selección en elmomento de escoger el mejor o losmejores embriones para la transferenciaembrionaria, se debe intentar evitar almáximo una rotura SS.

BIBLIOGRAFÍA

Nagy ZP, Liu J, Joris G, Bocken G, Desmet B,van Ranst A, Vankelecom A, Devroey P, vanSteirteghem AC. The influence of the site ofsperm deposition and mode of oolemmabreakage at intracytoplasmic sperminjection on fertilization and embryodevelopment rates. Human reproduction1995; 10(12): 3171-3177.

Palermo G, Alikani M, Bertoli M, ColomberoLT, Moy F, Cohen J, Rosenwaks Z. Oolemmacharacteristics in relation to survival andfertilization patterns of oocytes treated byintracytoplasmic sperm injection. HumanReproduction 1996; 11(1): 172-176.

Remohí J, Romero JL, Pellicer A, Simón C,Navarro J. Manual práctico de la esterilidady reproducción humana. Madrid, McGraw-Hill. Interamericana. 2000; p.392-401.

Remohí J, Pellicer A, Simón C, Navarro J,Reproducción Humana. Madrid, McGraw-Hill. Interamericana. 2002; p.443-453.

Trounson AO, Gardner DK. In VitroFertilization. Boca Raton, Florida, CRC.2000.

Veeck LL. An Atlas of Human Gametes andConceptuses. Londres, Parthenon Publishing.1999; p. 32-39.

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Tabla 1.Características de los dos grupos incluidos.

Tabla2. Efecto de la rotura SS, comparándolo con la rotura no SS

A continuación se presentan, en la tabla 2, los resultados obtenidos en los diferentesgrupos.


D E B A T E

Mariona Hugas et al. Criterios de valoración morfológica ASEBIR.

O grado I ó II ó 7 puntos ó 8 ó 9... Anuestros embriones, con los quecompartimos tantas horas en ellaboratorio, siempre hemos tenido la“mala” costumbre de ponerles nota. Yclaro, con la diversidad de la vida, siellos son distintos, ¿que no será denuestra forma de puntuarlos?

Es importante poder tener el mayorconsenso a la hora de valorar la calidadembrionaria, no sólo para servir deayuda para determinar los embrionescon mejor calidad y potencial dedesarrollo. Si no también para tenertodos los mismos patrones, hablar elmismo idioma, utilizar el mismo baremoy así poder entendernos para realizarestudios multicéntricos o compararbibliografía.

La Comisión de Trabajo de ASEBIR parala “Definición de criterios devaloración morfológica y sucategorización, de Oocito aBlastocisto” ha realizado un inmensotrabajo. Por un lado la revisiónexhaustiva de más de 60 artículos. Deellos ha realizado una recopilación yordenación de todos los datos,características y variables queinfluyen, de forma demostrada ysignificativa, sobre la tasa degestación. Y por otro, ha establecidouna gradación y unas clavesesquemáticas claras y concisas, muyútiles para el trabajo diario dellaboratorio y aplicables de formarápida y sencilla por los embriólogos

para establecer las 4 categorías decalidad propuestas tanto paratransferencias en D+2 como en D+3.

Es importante considerar que elProtocolo es abierto para que, cuandolas evidencias científicas así lopermitan, poder incluir la valoración delos ovocitos y zigotos.

En el Laboratorio de FIV de nuestraUnidad empezamos a trabajar con estaspautas hace un año. Primero realizamosel estudio a fondo del “Librito azul” portodos conocido. Determinamos que porel momento, valoraríamos los embrionessegún nuestro “score” particular y a lavez con los Criterios ASEBIR.

En nuestra experiencia básicamente sepractica la transferencia en el D+3. Yhemos transferido siempre que ha sidoposible embriones de tipo A.

Después de este periodo de tiempohemos detectado:

Un periodo de familiarización con losCriterios ASEBIR muy corto (pocos días).Estos días la valoración se realizabasiempre que era posible entre dospersonas.

Mayor consenso entre los 3 embriólogosque valoramos los embriones en nuestrolaboratorio.

Mayor consideración de la “historia” decada embrión para la valoración del

grado de calidad. Si prescindimos deesta “historia”, en algunos casos laclasificación de los embriones habríasido más benévola. Además hemos vistoque hay que ser muy estrictos enrespetar el “timing” de observación delos embriones.

Facilidad y claridad en la aplicaciónestas Pautas.

Aún no hemos realizado un estudio paraver posibles cambios en las tasas deembarazo y de supervivencia post-descongelación desde que aplicamos losCriterios. Vamos, sin duda, a seguirutilizando el sistema.

Felicitar sinceramente a todos los quehan hecho posible la determinación delos Criterios ASEBIR. Muchas gracias. Yfinalmente animar a todos a utilizarlos.

BIBLIOGRAFÍA:

Criterios de Valoración Morfológicos deOòcitos, Embriones Tempranos yBlastocistos Humanos. Cuadernos DeEmbriología Clínica. Publicaciones Asebir2007.

INTRODUCCIÓN A DEBATE

CRITERIOS DE VALORACIÓN MORFOLÓGICA ASEBIR.NUESTRA EXPERIENCIA.

Mariona Hugas, Maria Fernández, Joan Sarquella. Unitat de Reproducció Humana i Diagnòstic Genètic. Clínica Girona

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En este número se debate acerca de losCriterios de Clasificación MorfológicaEmbrionaria propuestos en el segundocuadernillo ASEBIR de EmbriologíaClínica.

Para el siguiente os invitamos aparticipar en un tema de máximaactualidad en estos momentos y queestá generando un amplio debate entretodos nosotros:

¿Cuál es vuestra opinión acerca delproceso, criterios y sistema deacreditación puesto en marcha por laESHRE para Embriólogos Clínicos? Osinvitamos a plasmar vuestras opinionessobre este proceso.


D E B A T E


Tras el congreso de ASEBIR en Bilbaodecidí poner en marcha los criteriosASEBIR de valoración morfológica deembriones. Aunque todo cambioproduce respeto creo que ha merecido lapena. Aquellos embriones que durantetantos años los había llamado 1, 2, 3 y 4ahora se llaman A, B, C, D. Muchos de losembriones A son los que ya erananteriormente de calidad 1 y los Dcalidad 4; creo por tanto que son losembriones de calidades intermedias losque se benefician de esta nueva

clasificación al tener los criterios másdefinidos. Para mí, la ventaja principalde la nueva nomenclatura está en laimportancia que se le da a la trayectoriadel embrión (ahora más estricta queantes). El hecho de que un embrión en D+2 con 2 células (en lugar de 4) de igualtamaño, no binucleadas y sinfragmentación sea de calidad B nosimpide que en D +3 con 8 célulassimétricas, no binucleadas y con un 5%de fragmentación podamos llamarle decalidad A.

Aunque es pronto para evaluar losresultados, creo que la nueva valoraciónsigue un buen criterio para elegir 2embriones óptimos a transferir ytambién seleccionar mejor los que se vana criopreservar. Aunque todo esmejorable y evidentemente el ojo delembriólogo tiene mucho que decir, creoque vale la pena el esfuerzo de unificarcriterios entre centros.

Ya ha transcurrido un tiempo suficientepara poder llevar a cabo una autocríticasobre los nuevos criterios de valoraciónmorfológicos propuestos por ASEBIR.Hemos tenido oportunidad de i) recibiry estudiar el ejemplar impreso, ii)atender las explicaciones de los autoresde tan buen trabajo en distintos foros, yiii) aplicarlos en nuestros propioslaboratorios. El objetivo principal deestos criterios ha sido poderestandarizar unas nociones que aunqueen la mayoría de los casos coincidían,sobre todo para los preembriones debuena y mala calidad, sí que podíandiferir en preembriones de calidadintermedia. Estas diferencias no sólopodían ser observadas entreembriólogos de distintas clínicas de FIV,sino que también podían darse entredistintos profesionales del mismolaboratorio. La falta de consenso en esteaspecto tan importante de laembriología ha impedido durantemuchos años generar estudiosmulticéntricos, interpretar informesclínicos de laboratorios ajenos, ocomparar datos bibliográficos. Es más,en nuestro centro esta nueva propuestanos ha sido muy útil, ya que la estamos

utilizando como control interno, eincluso “externo” de la calidadembrionaria de preembrionesprocedentes de distintos centros dereproducción. Aunque nuestro uso de losnuevos criterios de clasificaciónembrionaria está enfocado a laderivación de líneas celularesembrionarias humanas, y no a latransferencia de preembriones para unfin reproductivo, conocer la buena omala calidad de un preembrión nos haservido para entender qué preembrionesllegan a blastocistos en laboratoriosdonde se cultivan sobre un cocultivo defibroblastos, además de para decidir elmétodo de derivación más adecuado,según la calidad de los blastocistos, parapoder obtener células madreembrionarias humanas. En base a estehecho podemos decir que tenemospruebas reales de la heterogeneidadentre distintos laboratorios a la hora declasificar la calidad embrionaria,utilizando los sistemas de clasificacióntradicionales.

Aunque no hemos tenido problemasimportantes, al extrapolar los nuevoscriterios de calidad en la manipulación

de preembriones para investigación, noshemos encontrado un problemalogístico. Esta guía está enfocada aevaluar preembriones frescos y nocongelados, precisamente los únicospreembriones que podemos utilizaractualmente en España parainvestigación con células madre.Pensamos que este aspecto es uno de losque se debería de tratar en una futuraactualización de estos criterios. Además,hemos observado un mayor grado derestricción en los parámetros de calidadóptima del preembrión y el blastocistoatendiendo al ritmo de división, lo cualen nuestros experimentos no fue muyaplicable, al intentar llevar a losblastocistos más allá del día 6 dedesarrollo.

Esperamos ansiosamente que iniciativascomo la que ha propuesto ASEBIR, acercade nuevos criterios de valoraciónmorfológicos de ovocitos, preembrionesy blastocistos no quede en el olvido y seadiscutida y actualizada a medida quevayamos adquiriendo un mejorconocimiento del desarrollo embrionariohumano temprano.

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CRITERIOS DE VALORACIÓN MORFOLÓGICA DE EMBRIONES ASEBIR.Pepi Ferrando Conceptum. Institut de Fertilitat i Reproducció Humana. Reus.

EVALUACIÓN DE LOS CRITERIOS DE VALORACIÓN MORFOLÓGICOSDE OVOCITOS, PREEMBRIONES TEMPRANOS Y BLASTOCISTOSHUMANOS PROPUESTOS POR ASEBIR

José Luis Cortés, Pablo Menéndez Banco Andaluz de Células Madre. Centro de Investigación Biomédica. Universidad de Granada. Campus de laSalud.Granada


D E B A T E

Mariona Hugas et al. Criterios de valoración morfológica ASEBIR.

A raíz del último congreso ASEBIR enBilbao, donde vimos que había graninterés por parte de todos los allí presentes (y los que no pudieronestar, seguramente también) en tener un mismo criterio de clasificaciónembrionaria y, dado que muchoslaboratorios ya estaban aplicando el score propuesto por ASEBIR, decidimosen nuestro centro empezar a usarlo comparándolo con el score quehasta entonces aplicábamos (dondepuntuábamos los embriones del 1 al 10),de modo que, aproximadamente en losúltimos siete meses, hemos estadoclasificando los embriones obtenidos enlos ciclos realizados a través de ambosmétodos simultáneamente. Aún notenemos suficientes casos para realizarun estudio comparativo y decidirnos poruno de los dos criterios de clasificación,pero sí podríamos comentar algunospuntos a favor y algunos puntos en contrade la clasificación ASEBIR, más fruto denuestra visión subjetiva que de razonesderivadas de un estudio estadístico.

Así pues, como puntos a favor tendríamos:

- Tiene en cuenta el ritmo de divisiónentre día 2 y día 3, mientras que connuestro sistema de puntuación el scoreembrionario venía dado por el estado delembrión sólo en el día de la transferencia

(tanto si era en día 2 como si era en día3). - Penaliza embriones en día 2 connúmero de células impares de forma máscontundente. En nuestra clasificación, enlo que a número de células se refería,recibía la misma puntuación un embriónen 4 células que uno en 5.

- Diferencia las asimetrías “normales” delas “anormales”.

- Valora otros aspectos que hasta entoncesno puntuábamos, como son la presenciade vacuolas, las alteraciones en la ZP…

En cambio, como puntos en contra vemos:

No hay posibilidad de promocionarembriones de día 2 a día 3.

En las alteraciones de ZP, en los casos enlos que se realice AH vemos que elembrión “promociona” (o, al menos, noresulta penalizado), pero ¿por qué tieneque mejorar un embrión oval al que se hahecho AH? ¿o uno con septo? (yasabemos que nos quejamos de que con laclasificación ASEBIR no se promocionanembriones y, cuando se les promociona,también nos quejamos, pero es que¿tenía que ser justo en este aspecto enel que se les valorara positivamente…?).

No se propone clasificación para

embriones descongelados.

Valora la presencia de multinucleación,pero no tiene en cuenta que en elembrión valorado se vean todas lascélulas con núcleo o no. Es decir, nodiferencia un embrión en 4 células contodas las células mononucleadas de unode 4 con dos células mononucleadas y doscélulas a las que no se les vea el núcleo,cuando para nosotras será sin duda mejorel primero. Pero además, ¿cual seríamejor, ese embrión con dos células sinnúcleo o un embrión de 4 células en elque no se vea ningún núcleo?

El uso simultáneo de los dos tipos declasificación en nuestro centro nos estápermitiendo decidir con mayor detallelos embriones óptimos para transferir,así que seguiremos con el uso de ambospara, más adelante y, en vista de losresultados que obtengamos, decidir sioptamos por uno de los dos scores oseguimos con los dos.

Y ya que estamos, desde aquí nosgustaría animar al grupo de interésASEBIR de calidad embrionaria para que,a partir de las recomendaciones en laclasificación de los ovocitos quepresentaron, se propusiera un scoretambién para ellos, para que pudiéramosvalorar la evolución desde el día 0.

Para concluir en “ la necesidad de aunaresfuerzos”, creo que primero deberíamosde hacer un repaso sobre cómo está lasituación en nuestro entorno de trabajo.

En este mundo de globalización en el queen nos movemos, en el que las tecnologíasinformáticas nos permiten conocer hastael más mínimo nuevo movimiento encualquier parte del globo terráqueo,dónde las posibilidades de la estadísticapara tratamiento de datos son infinitas,

en este gran océano, nos encontramosnosotros, “ los embriólogos”.

Como pequeña introducción, megustaría resaltar un hecho, el que lasUnidades de Reproducción Asistida, hanido proliferando como si fueran ”setasen un prado”, y si hace 15 años apenaseran un par de docenas en todo elterritorio del estado español,actualmente están autorizadas por elMinisterio de Sanidad casi 300. Si bien,

todas ellas no poseen el mismo nivel deactuación, es decir que lasautorizaciones de algunas de ellas serestringen a capacitación seminal, osolamente captación ovocitaria……. Asípodemos comprobar que somos unaespecie en expansión, nada más lejos dela “extinción “, pero a la vez somos uncolectivo, diverso, disperso y muy difícilpara aunar esfuerzos y colaboracionesentre nosotros. Incluso, parece que nosinvade el secretismo, no hay más que ver

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¿CON CUÁL NOS QUEDAMOS?Marta Brossa, Marta Antich, Xènia Blanch. Laboratorio Fertilab. Barcelona.

¿SERIA CONVENIENTE GENERALIZAR LA EVALUACIÓN MORFOLÓGICAEMBRIONARIA DE “ASEBIR”?

Miren Mandiola. Hospital Quirón Donostia – Quirón Bilbao.


D E B A T E

Junio 2008 Vol. 14 · Nº 1 27

cómo el número de centroscolaboradores con los registros de la SEF,decae desde esos 300 centros a unospocos más que 100.

Ahora bien, si reflexionamos un pocosobre la formación de los embriólogos,hay que reconocer que al no existir unaformación reglada de base ( TitulaciónUniversitaria o formación de postgradoespecífica), “ cada uno hace lo quepuede”, y tratándose de un mundo en elque el movimiento de dinero, la presiónmediática y asistencial es bastanteimportante, no es raro encontrarse conuna “ Nueva Unidad de Reproducción”que de repente sale de la nada, con unginecólogo y un embriólogo que haestado 2-3 meses de visita en unlaboratorio externo. ( Que sirva dereflexión sobre las exigencias legales quedeberían existir en cuanto a titulación yformación de los profesionales dellaboratorio, previos a la apertura de unanueva Unidad de Reproducción ).Simiramos al mundo médico, se necesitan

entre 3 y 5 años de formación reguladatras examen MIR para especializarse enalgo y poder trabajar.

El número de Unidades no para decrecer, cada uno queremos ser especialesy hacer algo “diferente” del de la Unidadde al lado, y la dipersión y diversidad vaen aumento.

Con este panorama, es con el que nostenemos que manejar, y es aquí dóndeadquieren gran relevancia los grupos deinterés de las Sociedades científicas y suimportancia para aunar criterios quetodos deberíamos asumir.

Hay que felicitar a la Comisión de trabajode ASEBIR, por su esfuerzo en hacer unaexhaustiva revisión del tema “ los criteriosmorfológicos en ovocitos, embrionestempranos y blastocistos” ya que esto nospermite tener consenso sobre los criteriosde calidad embrionaria, nos permitiríaestudios multicéntricos cuyos resultadospodrían tener gran validez científica y

podrían permitirnos una mejora ennuestro servicio a los pacientes, que nodebemos de olvidarnos que “ a ellos nosdebemos” , no a nuestro “ego personal”de ser diferentes.Todo lo que puedasuponer una mejora en resultados ycalidad , debería de ser adoptado, aunconociendo que cualquier modificaciòn delos criterios propios supone un cambio enla rutina asistencial, y siempre es duro ensus inicios.

Para aportar nuestro granito de arena, enlas Unidades de Reproducción de QuirónDonostia (San Sebastián ) y QuirónBilbao, estamos adaptándonos a los“criterios ASEBIR”, que si básicamenteson similares a los nuestros, no sonexactamnente iguales, pensamos que elesfuerzo merecerá la pena para todos. “OS ANIMO A HACERLO”.

Espero que esta primera guía de ASEBIR,no sea la última, y siga en constanteevolución como el mundo en el quevivimos.


F O R M A C I Ó N C O N T I N U A D A

CONCEPTO DE ESTRÉS TRADICIONAL YMODERNO

El concepto de estrés ha adquiridoconsiderable importancia en medicinahumana ya que cada vez es mayor elnúmero de personas que experimentaproblemas, incluidos los de tiporeproductivo. En medicina veterinariaexiste también una preocupacióncreciente (que es compartida por lapoblación en general) por el bienestaranimal que se ha traducido en labúsqueda de estrategias paracontrarrestar los efectos negativos delestrés, tanto en animales domésticos ensistemas de producción, como en faunasilvestre mantenida en cautividad.

No existe un consenso universal en ladefinición de estrés ni tampoco en lasvariables que puedan medirlo de unaforma objetiva. Frecuentemente sedefine como factores estresantes a

todos aquellos que producen unaalteración en la homeostasis. Lacorrespondiente respuesta de defensafrente a esta agresión se conoce comomecanismo de respuesta frente al estrés.Hans Seyle describió la respuestaorgánica común a todos los factores quecausan estrés como un síndrome generalde adaptación en el que se produce unarespuesta primaria o de alerta a travésde la activación del eje simpático-adrenomedular con la liberación decatecolaminas (Ferin 2006).Posteriomente, se produciría unarespuesta secundaria, de resistencia,que incluye la activación del ejehipotálamo-hipofisiario-adrenal y laliberación de corticosteroides de lacorteza adrenal. Aunque algunos de losaspectos de la teoría acuñada por Seylesiguen en vigor en la actualidad, elconcepto de estrés ha ido evolucionando(para más información, ver McEwen yWingfield 2003; Ferin 2006) y

actualmente se acepta que la respuestaorgánica es específica para cada factor yque la respuesta de adaptación al estrésnecesita de la participación ycoordinación de vías neuroendocrinascentrales y periféricas (Ferin 2006). Encondiciones prolongadas de estrés,funciones no esenciales como lareproducción pueden verse alteradas oinhibidas a favor de la supervivencia.

NIVELES EN LOS QUE LA REPRODUCCIÓNPUEDE VERSE AFECTADA POR LOSGLUCOCORTICOIDES

En general, está ampliamente aceptadoque la reproducción se ve negativamenteafectada por los efectos del estréscrónico, pero los efectos que el estrésagudo, o agudo repetitivo, podrían teneren la reproducción aún no están bienesclarecidos (Tilbrook et al. 2000). Loscorticosteroides, la hormona ACTH y elestrés pueden tener efectos inhibitorios

LOS GLUCOCORTICOIDES Y LA REPRODUCCIÓN FEMENINAGlucocorticoids and female reproduction

Raquel González, Montserrat Gomendio y Eduardo R. S. Roldan* Grupo de Ecología y Biología de la Reproducción, Museo Nacional de CienciasNaturales (CSIC), c/José Gutiérrez Abascal 2, 28006 Madrid, Spain. http://www.gebir.csic.es Correspondencia: E.R.S. Roldan,[email protected]

Junio 2008 Vol. 14 · Nº 1 29

RESUMEN

Los glucocorticoides ejercen multitud de funciones en el organismo para mantener la homeostasis, pero en condiciones deestrés, puede producirse la secreción de elevadas cantidades de éstos. Está ampliamente aceptado que los efectos del estréspueden tener consecuencias negativas en la reproducción. Esta acción negativa está mediada principalmente a través de laalteración del eje hipotálamo-hipofisiario-adrenal, aunque existen evidencias que indican que los glucocorticoides tienentambién un efecto directo sobre la esteroidogénesis y la oogénesis. Las acciones encaminadas a reducir los efectos negativosdel estrés durante la aplicación de técnicas de reproducción asistida pueden favorecer el éxito de estas biotecnologías.

Palabras clave: estrés, glucocorticoides, reproducción

SUMMARY

Glucocorticoids exert their actions throughout the body to maintain homeostasis, but in stressful conditions, they can besecreted in high amounts. It is generally accepted that stress can negatively influence reproduction. This deleterious actionis mediated mainly through the alteration of hyphotalamus-pituitary-adrenal axis. However, evidence suggests thatglucocorticoids also have direct effects on steroidogenesis and oogenesis. Actions to reduce the negative effects of stressduring the use of assisted reproductive technologies may enhance the outcome of these techniques.

Key words: stress, glucocorticoids, reproduction



Raquel González et al. Los Glucocorticoides y la reproducción femenina.

o, incluso, facilitatorios en lareproducción (Fig. 1) (Brann y Mahesh1991; Sapolsky et al. 2000; Tilbrook etal. 2000). La reproducción femenina esmás sensible a las alteracionesprovocadas por el estrés que lamasculina, debido a la sincronizaciónque debe existir entre la secreciónhormonal y los cambios morfológicos atodos los niveles del eje hipotálamo-hipofisiario-ovario y útero.

Existe abundante información que indicaque los glucocorticoides afectan al ejehipotálamo-hipofisiario (Breen y Karsch2006; Ferin 2006; Matteri et al. 2000;Vermeulen 2000). La mayoría de losfactores que causan estrés inhiben lapulsatilidad tónica de la secreción de LHcomo resultado de la inhibición delgenerador de pulsos de GnRH o porcambios en la sensibilidad de las célulasgonadotropas a la estimulación por laGnRH (Ferin 2006). Las alteracionesfrecuentemente observadas son laprolongación de la fase folicular, una faselútea inadecuada y un pico preovulatoriode LH prematuro (Ferin 2006). Cuando lascausas del estrés se cronifican oinstauran pueden desarrollarse estadosde hipogonadismo. En la mujer, el estréspsicogénico es el factor etiológico de laamenorrea funcional hipotalámicacrónica, caracterizada por la supresióndel ciclo menstrual e infertilidad yregresión del ovario a un estado similaral anterior a la pubertad. Esta amenorreafuncional hipotalámica está asociada auna secreción de cortisol elevada encomparación a mujeres con menstruaciónnormal u otras causas de anovulación(Berga et al. 1997).

Sin embargo, la función gonadal podríaverse afectada también de forma directaa nivel del ovario, tanto en laesteroidogénesis como en la oogénesis.El ovario es susceptible a la accióndirecta de los glucocorticoides; suacción está mediada por la presencia dereceptores para glucocorticoides en lascélulas ováricas (Schreiber et al. 1982; Tetsuka et al. 1999). Esta acción de los glucocorticoides en elovario se encuentra modulada por laactividad de las 11b-hidroxiesteroide-deshidrogenasas (11b-HSD). Hay dosisoenzimas que regulan la acciónfisiológica de los glucocorticoidescatalizando la interconversión del

cortisol/corticosterona (biológicamenteactivos) a sus respectivos metabolitos inertes (cortisona/11-dehidrocorticosterona). La isozima 11b-HSD 1 actúa predominantemente comouna reductasa para incrementar laconcentración local del cortisol, mientrasque la 11b-HSD 2 actúa exclusivamentecomo una deshidrogenasa con elevadaafinidad inactivando el cortisol (revisiónen Michael et al. 2003).

El cortisol no se sintetiza de novo en elovario (Omura y Morohashi, 1995) sinoque se transporta desde las glándulasadrenales por la circulación sanguínea.La mayor parte del cortisol se transportaunido a proteínas plasmáticas y sólo una pequeña porción es libre ybiológicamente activa. El cortisol se uneprincipalmente a la proteína de unión acortisol (CBP) o transcortina y con bajaafinidad a la albúmina y a la proteína deunión a hormonas sexuales (SHBG)(Andersen 2002; Pugeat et al. 1981). Losniveles de cortisol libre en el fluidofolicular son más elevados que enplasma (Andersen y Hornnes 1994;Harlow et al. 1997). Este incrementopodría deberse al desplazamiento delcortisol de la proteína transportadora,transcortina, por parte de las altasconcentraciones de progesterona y 17-a-OH-progesterona presentes en el fluido folicular de folículospreovulatorios (Andersen 2002).

RELACIÓN ENTRE EL METABOLISMO DE LOSGLUCOCORTICOIDES Y LA CONCEPCIÓN ENCICLOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

En la especie humana podría existir unarelación entre el metabolismo delcortisol y la probabilidad de concebir enciclos de fecundación asistida (Michael2003). La tasa cortisol:cortisona reflejala actividad enzimática de las 11b-HSDsmodulando la interconversión de estosglucocorticoides y la concentraciónlocal de los mismos. Varios estudioshan encontrado una asociación entreuna tasa elevada de cortisol:cortisonaintrafolicular (consistente con una bajaactividad ovárica de 11b-HSD) y unamayor probabilidad de éxito en losprotocolos de reproducción asistida(Keay et al. 2002; Lewicka et al. 2003;Thurston et al. 2003). Otros estudios nohan encontrado una relación entre laconcentración en el fluido folicular de

cortisol, cortisona o la proporción entreambos y el potencial de implantaciónde los embriones derivados de lostratamientos de fecundación asistida(Andersen et al. 1999). Sin embargo, en la especie porcina las enzimas 11b-HSDs actúan en el oocito y en lascélulas del cúmulo inactivando losglucocorticoides, mecanismo quepodría ser importante para limitarposibles efectos negativos durante lamaduración del oocitos (Webb yMichael, 2006). Un estudio reciente hademostrado que la inactivación delcortisol por parte de las 11b-HSDs enlas células de la granulosa en el cerdoincrementa a medida que el folículo sedesarrolla y esta inactivación delcortisol está reducida de formasignificativa en los quistes folicularesováricos, implicando al cortisol en elcrecimiento folicular y en el desarrollode quistes (Sunak et al. 2007).

El éxito de los tratamientos dereproducción asistida puede verseafectado por el estrés asociado a laaplicación de estas técnicas. En laespecie humana la fecundación in vitro(FIV) o inyección intracitoplasmáticade espermatozoides (ICSI) sontécnicas que generan ansiedad y susresultados pueden verse afectados.Así, se ha observado que los niveles deadrenalina en el momento de larecuperación de oocitos y lasconcentraciones de adrenalina ynoradrenalina en el momento de latransferencia de embriones fueronmás bajos en mujeres en los que elciclo de FIV/ICSI fue exitoso que en lasque no lo fue (Smeenk et al. 2005). Seha asociado la vulnerabilidad al estréscon la FIV y transferencia deembriones, de tal forma que lasmujeres que se someten atratamientos de FIV y que presentanuna mayor frecuencia cardiaca ypresión arterial en respuesta al estrés,tienen un menor número de oocitosfecundables en comparación a lasmujeres con respuestas menosexacerbadas (Facchinetti et al. 1997).Se ha observado igualmente en ciclosnaturales, que el “distress”psicológico puede ser consideradocomo un factor de riesgo en el éxito dela concepción en mujeres con ciclosmenstruales prolongados (Hjollund etal. 1999).

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EFECTOS DIRECTOS DE LOS GLUCORTICOIDESEN LA ESTEROIDOGÉNESIS

La esteroidogénesis ovárica puede verseafectada por los glucocorticoides, cuyoefecto podría estar mediado por laalteración de la actividad de las enzimasque participan en su biosíntesis (Adashiet al. 1981; Schoonmaker et al. 1983).Estudios in vitro han mostrado que ladexametasona puede alterar laesteroidogénesis mediante la inhibiciónde la secreción de la LH (Huang y Li2001) y que el cortisol inhibe la síntesisde pregnenolona estimulada por la LH(Michael et al. 1993). Ben-Rafael et al.(1988) encontraron un aumento en laproducción de progesterona y estradiolpor parte de las células de la granulosa,estimulada por el cortisol, pero a dosissuprafisiológicas.

EFECTOS DIRECTOS DE LOSGLUCOCORTICOIDES EN LA OOGÉNESIS

No se ha definido cuál es el papel delcortisol en el fluido folicular. Existedurante el pico de LH un incremento delos niveles de cortisol total y libre en elfolículo (Andersen y Hornnes 1994;Harlow et al. 1997). Algunos estudiossugieren que el cortisol podría ejercerfunciones en el desarrollo folicular ymaduración del oocito (Fateh et al.1989; Harlow et al. 1997) o que podríaestar implicado en la respuesta anti-inflamatoria tras la ovulación (Andersen2002). En mujeres a las que se aplicarontratamientos de estimulación ováricacon hormonas se encontraron niveles decortisol más bajos en el fluido folicularde folículos que contenían oocitosinmaduros que en folículos con oocitosmaduros (Fateh et al. 1989). De igualforma, la concentración de cortisol fuesignificativamente superior en losfluidos foliculares de folículos quecontenían oocitos maduros que no sefecundaron que oocitos maduros que sefecundaron y dividieron (Fateh et al.1989).

Podrían existir diferencias especie-específicas en lo que se refiere al efectodirecto de los glucocorticoides y lamaduración del oocito. En peces elcortisol parece estimular la maduracióndel oocito (Greeley et al. 1986). Estudiosrealizados en mamíferos sobre lainfluencia de los glucocorticoides en la

oogénesis son contradictorios. Así, losestudios realizados in vitro en oocitos decerdo han mostrado que la maduración seve inhibida en forma tiempo- y dosis-dependiente (en un rango de 0.1-10μg/ml) cuando los oocitos se exponen a la dexametasona o al cortisol (Yang et al.1999). Sin embargo, la capacidad de los oocitos madurados in vitro de serfecundados no se vio afectada por su exposición previa a la dexametasona(Yang et al. 1999). Este efecto inhibitoriono se produjo cuando se empleó el antagonista de receptores deglucocorticoides RU-486, lo que podríaimplicar al receptor de losglucocorticoides en procesos de reinicio ymaduración del oocito (Yang et al. 1999).

Por otro lado, estudios realizados enratón no mostraron efecto inhibitorio delos glucocorticoides (dexametasona, 1-20 μg/ml y cortisol, 0.1-10 μg/ml) en lamaduración de oocitos in vitro tanto enmaduración espontánea como en lamaduración inducida por FSH enpresencia de hipoxantina (Andersen2003).

El posible mecanismo de acción de losglucocorticoides sobre el oocito no seconoce. El efecto inhibitorio de losglucocorticoides encontrado en elestudio de Yang et al. (1999), ha sidoparcialmente atribuido a la reducidacantidad del complejo p34cdc2-ciclinaB1 (MPF, factor promotor de la meiosis)(Chen et al. 2000), complejo clave en laregulación del ciclo celular en el oocito(Abrieu et al. 2001).

En un estudio reciente en ratón se haevaluado el efecto de la dexametasonaen un bioensayo a nivel folicular,evaluando la foliculogénesis, laproducción de esteroides, la oogénesisy la calidad del oocito. Este trabajoreveló una ausencia de efecto de ladexametasona, cuando se empleó aconcentraciones de hasta 40 μg/ml, enla foliculogénesis y oogénesis. Cuandose empleó una concentración de 80μg/ml la dexametasona impidió ladiferenciación folicular y maduracióndel oocito (Fig. 2). La esteroidogénesisse vio afectada a partir de unaconcentración de 5 μg/ml y eldesarrollo embrionario temprano apartir de 10 μg/ml (Fig. 3) (Van Merriset al. 2007).

Estos estudios sobre el papel directo delos glucocorticoides en la oogénesis hanmostrado que el efecto negativopotencial de los glucocorticoides seobserva a dosis relativamente elevadasfuera del rango fisiológico, al menos invitro, por lo que es probable que esteefecto sea más farmacológico quefisiológico. Sin embargo, es necesarioevaluar el efecto directo de losglucocorticoides sobre la oogénesis invivo. Además, en casos de perturbacióndel eje hipotálamo-hipófisis-adrenalque conlleven una producción elevadade glucocorticoides, se pueden producirdisrupciones en el ciclo reproductivo y lafunción ovárica, alterándose elambiente folicular en el que el oocitomadura. Si el ambiente folicular no esadecuado, la competencia del oocitopuede verse afectada negativamenterepercutiendo en su capacidad posteriorpara generar embriones de calidad.

ESTRÉS Y REPRODUCCIÓN ASISTIDA ENANIMALES SILVESTRES EN PELIGRO DEEXTINCIÓN

En los últimos años se ha producido unaumento en la preocupación por elbienestar animal y por los efectos que lasprácticas de manejo tienen en losanimales domésticos e igualmente porlas condiciones en las que se mantieneny manejan a los animales silvestres encautividad. El estrés de manejo ymiopatía de captura son consecuenciasimportantes y frecuentes en animalessalvajes. Puesto que las situacionesestresantes podrían alterar el correctofuncionamiento de cada componente deleje hipotálamo-hipófisis-ovario, lareproducción puede verse afectada (verDobson y Smith 2000; Dobson et al.2001).

La reproducción natural de animalessalvajes en cautividad se encuentralimitada y el estrés está consideradocomo uno de los factores que contribuyena esta reducida reproducción (Hutchingset al. 1996; Zhang et al. 2004; Swaisgoodet al., 2006).

Las tecnologías reproductivas tienen ungran potencial en su posible aplicaciónen especies de fauna amenazada. Eléxito de las biotecnologíasreproductivas es aún muy limitado enestas especies (Comizzoli et al. 2000;

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Pope 2000; Pukazhenthi and Wildt 2004)por numerosas causas entre las que sepodrían destacar el desconocimientogeneral de la fisiología reproductiva dela mayoría de los animales salvajes, elescaso número de animales disponiblespara la realización de estudios o ladeficiente calidad del material obtenidopara investigación. Además, el estrésderivado de las condiciones decautividad y la mayor susceptibilidad delas especies salvajes al manejo intensivosuponen un factor adicional quecontribuye al reducido éxito obtenido enestas especies.

El estrés inducido durante el manejoasociado a los tratamientos dereproducción asistida en muflones (Ovismusimon) podría contribuir a la reducidarespuesta ovárica obtenida tras lasuperovulación. Además, la altaincidencia de regresión lútea tempranaen hembras de muflón podría estartambién asociada en parte al estrésrepetitivo por la inmovilización de losanimales durante los tratamientos(Ledda et al. 1995). El estrés de manejose ha descrito como limitante en laaplicación de biotecnologíasreproductivas en bisonte americano(Bison bison) (Dorn 1995). En nuestrotrabajo de obtención de oocitosinmaduros mediante “ovum pick-up” porlaparotomía, para su posteriormaduración y fecundación in vitro en lagacela Mohor (Gazella dama mhorr), unade las hembras tuvo que ser retirada delexperimento por estrés de manejodurante las capturas repetidas para laadministración de FSH. Además, larespuesta general de las hembras degacela al tratamiento de superovulacióncon FSH fue en general reducida(Berlinguer et al. 2008). El efecto delestrés asociado a las capturas repetidasdurante el tratamiento hormonal, podríaser una causa que haya contribuido enparte a la limitada respuesta a laestimulación folicular.

El hecho de que el estrés pueda tenerefectos deletéreos en la reproducciónsubrayan la importancia de evitarlo, o almenos minimizarlo en todo lo posible,bien sea para facilitar la reproducciónnatural o para aumentar lasposibilidades de éxito en las ocasionesen que se requiera la aplicación debiotecnologías reproductivas.

La aplicación de tranquilizantes durantelos citados procedimientos podría serútil en la reducción del estrés de manejo,captura y contención en estas especies.Fernández-Arias et al. (2000) describióque el estrés de manejo durante lostratamientos asociados con protocolosde superovulación en cabra montés(Capra pyrenaica) puede conllevar unfallo completo en la tasa defecundación. Estos autores encontraronque el tratamiento con tranquilizantesde acción prolongada permitió lasuperovulación de estos animales y laobtención de embriones con capacidadde desarrollo posterior (Fernández-Ariaset al. 2000). En un estudio en muflones,la administración de decanoato deflufenacina permitió una mejora en larespuesta folicular tras lasuperovulación hormonal, además defacilitar la manipulación de los animales(Ptak et al. 2002). En un estudioreciente realizado por nosotros engacela Mohor el uso de enantato deperfenacina durante la superovulacióncon FSH nos permitió mejorar lascondiciones de manejo ya que losanimales pudieron ser capturados amano por los cuidadores y las hembrasse mantuvieron más tranquilas haciendoque su manejo fuera más fácil y seguro.Además, en las hembras tratadas con eltranquilizante, el cortisol plasmáticopermaneció a niveles inferiores respectoa los controles durante los días demanejo más intenso (Fig. 4). Esimportante señalar que las tasas derecuperación, fecundación y división nosólo no se vieron negativamenteafectadas por la aplicación deltranquilizante de acción prolongada enel grupo de las gacelas donantesrespecto al grupo control, sino que elporcentaje medio de maduración de losoocitos fue significativamente superioren el grupo tratado y la tasa dedesarrollo embrionario fue ligeramentemayor en el grupo con tranquilizante, sibien las diferencias en este últimoparámetro no alcanzaron diferenciassignificativas probablemente porlimitaciones en el número de animalesdisponibles para este estudio (Gonzálezet al. 2008).

CONCLUSIONES

El estrés puede afectar el éxitoreproductivo a distintos niveles. Los

distintos factores que generan estrésafectan a la reproducción de formaindirecta a través de la reducción degonadotropinas actuando a través deleje hipotálamo-hipofisiario, perotambién pueden ejercer efectos directosa nivel del ovario alterando laesteroidogénesis y la oogénesis,pudiendo afectar finalmente a lacompetencia del oocito para suprogresión en la meiosis y durante eldesarrollo embrionario. La reducción delestrés asociado a los tratamientos dereproducción asistida tanto en medicinahumana como en veterinaria puedeconducir a una mejora en los resultadosobtenidos tras la aplicación debiotecnologías reproductivas.

AGRADECIMIENTOS

RG ha disfrutado de una beca delprograma I3P-CSIC. La financiación parael desarrollo de nuestra investigación haprovenido de los proyectos REN 2003-01587, CGL2006-13340/BOS y AccionesIntegradas (HI20030336) del Ministeriode Educación y Ciencia.

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Figura 1: Esquema general de los efectos inhibitorios y estimulatorios de los esteroides adrenales en la reproducción. Modificado de Braan yMahesh (1991).

Figura 2: Efecto de la dexametasona (DEX) en la maduración nuclear de oocitos de ratón: barra gris, presencia de corpúsculo polar; barrablanca, disolución de la vesícula germinal “germinal vesicle breakdown”; barra negra, vesícula germinal (GV). Los datos están representadosen porcentajes medios, n = 60. Los asteriscos marcan diferencias significativas entre grupos (**P < 0.01, ***P < 0.001). Modificado de Van Merriset al. (2007).



Raquel González et al. Los Glucocorticoides y la reproducción femenina.34

Figura 3: Evaluación del efecto de la dexametasona (DEX) en la formación de blastocistos y eclosión el día 6 de cultivo in vitro. Barra blanca,blastocistos no eclosionados. Barra gris: blastocistos parcialmente eclosionados. Barra negra: blastocistos con eclosión completa. El diagramade barras representa el porcentaje medio de blastocistos, expresado como el número de blastocistos el día 6 de cultivo sobre el número deembriones de 2 células en el día 2 de cultivo; n = 60. La tasas medias de blastocistos señaladas con asteriscos representan diferencias estadísticassignificativas (*P < 0.05, ***P < 0.001). Modificado de Van Merris et al. (2007).

Figura 4: Niveles de cortisol plasmático en hembras de gacela Mohor (Gazella dama mhorr) durante la sincronización de celo y superovulacióna las que se administró un tranquilizante de acción prolongada (LAN) o permanecieron sin tratamiento (controles).La sincronización de celos se realizó mediante la aplicación de un dispositivo intravaginal de liberación controlada de hormonas (CIDR)(Controlled internal drug release; 9% progesterona; CHIH Plastic Moulding, Hamilton, Nueva Zelanda) durante 15 días. Día 0: inserción del CIDR; día 10: recambio del CIDR y administración de enantato de perfenacina en el grupo LAN; días 13 y 14:administración de FSH; día 15: “ovum pick-up”. Los resultados son medias ± E.S. Modificada de González et al. (2008).



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Thurston LM, Norgate DP, Jonas KC, Gregory L, Wood PJ, Cooke BA, Michael AE.2003. Ovarian modulators of type 1 11b-hydroxysteroid dehydrogenase(11bHSD) activity and intra-follicularcortisol:cortisone ratios correlate with theclinical outcome of IVF. HumanReproduction 18:1603-1612.

Tilbrook AJ, Turner AI, Clarke IJ. 2000.Effects of stress on reproduction in non-rodent mammals: the role ofglucocorticoids and sex differences. Reviewsof Reproduction 5:105-113.

Van Merris V, Van Wemmel K, Cortvrindt R.2007. In vitro effects of dexamethasone on mouse ovarian function and pre-implantation embryo development.Reproductive Toxicology 23:32-41.

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Webb R and Michael AE. 2006. 11bHSDactivities in porcine oocytes and cumulus-oocyte complexes. Society for Reproductionand Fertility Conference and NationalOvarian Workshop. University of Leeds, 3-5July. NO5 Abstract.

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Zhang GQ, Swaisgood RR, Zhang HM. 2004.Evaluation of behavioral factors influencingreproductive success and failure in captivegiant pandas. Zoo Biology 23:15-31.

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N O T I C I A S

NOTICIAS

RELEVO EN EL COMITÉ ASESOR DE ESHRE

La Dra. Motserrat Boada Palà fuedesignada representante española deembriología en el Advisory Committeede ESHRE en sustitución del Dr. MarkGrossmann i Camps que finalizó su etapa(2002-2007) como miembro asesor.Cada país tiene dos representantes eneste comité y el que corresponde a losclínicos españoles deberá decidirsemediante votación ya que se hanpresentado dos candidatos.

REVISIÓN Y ACTUALIZACIÓN DEL PROGRAMADE FORMACIÓN EN EMBRIOLOGÍA CLÍNICA

Tras un intenso y concienzudo trabajo,los Drs. Carmen Ochoa Marieta, AntonioGonzález Útor y Manuel Ardoy Vilches hafinalizado la revisión del programa deformación en embriología clínica queASEBIR propone. La nueva versiónestará disponible para consulta en lasección restringida de la página web deASEBIR, dicha versión será la quepresentaremos en el Ministerio deSanidad y Consumo en nuestro empeñode conseguir la especialidad enembriología clínica. Desde la JuntaDirectiva queremos agradecerpúblicamente a los tres consocios elenorme esfuerzo realizado y queremosdestacar la consistencia y ambición delos contenidos propuestos.

CARTA DE LA PRESIDENTA DEL IV CONGRESOASEBIR BILBAO 2007

Como todos os acordareis, el IV CongresoNacional de ASEBIR, tuvo lugar en Bilbaodel 21 al 23 de Noviembre de 2007. ElCongreso fue declarado de interéssanitario por la consejería de sanidad delGobierno Vasco / Eusko Jaurlaritza . Ypor primera vez se concedieron 2,2puntos de crédito, para todos losasistentes que cumplieran con losrequisitos establecidos por el comité

evaluador del consejo vasco deformación continuada de las profesionessanitarias. Estos créditos han sido yagestionados por nuestra secretaríatécnica y enviados los diplomasacreditativos a aquellos congresistasque en su momento lo solicitaron.

El programa científico incluyó 19ponencias, con profesores nacionales einternacionales, un aula virtual, unasección de debate, 34 comunicacionesorales y 121 pósteres. Además de dosinteresantes Simposiums satélite,durante los espacios posteriores a losalmuerzos.

La asistencia y participación ha sidoexcelente. Un total de 373 personasacudieron a esta convocatoria y serecibieron 158 resúmenes decomunicaciones, que fueron evaluadaspor el comité científico con grandiligencia.

El congreso ha supuesto un impactomediático en diferentes medios (prensaescrita, hablada, TV, radio…). Durantedos días y medio se habló de laembriología clínica y de ASEBIR. Y seconsiguió, que también se hicieran ecode esto en el Ministerio de Sanidad yConsumo.

La industria ha valorado nuestrocongreso como un evento conimportante poder de convocatoria ennuestro sector, por lo que ha cambiadosu perspectiva y sus deseos decolaboración para futuros eventos.

El apoyo de nuestra sociedad a losinvestigadores básicos de nuestro paísha quedado plasmado con la creación deun nuevo premio ASEBIR-EMB. El premiodotado con 2500 euros y patrocinadopor el grupo EMB fue entregado, porprimera vez, a la mejor comunicación deinvestigación básica, por el presidente

de ASEBIR Sr. Mark Grossman y por el Sr.Sergio Oliveró, director general delgrupo EMB. Manteniéndose, también elpremio a la mejor comunicación enembriología clínica con la misma cuantíay patrocinio.

La calidad científica y el rigor de lostrabajos presentados ha motivado unaexcelente imagen del colectivo deprofesionales que nos dedicamos a laembriología en España, impresión quenos han transmitido los asistentesinternacionales, y que suponen la mejorcarta de presentación de nuestrocolectivo en Europa.

El espíritu crítico y colaborador de todoslos que asistieron nos ha dejado unimportante número de sugerenciastanto en aspectos científicos comoorganizativos. Sugerencias que yahemos transmitido al comitéorganizador del V Congreso y a supresidenta.

Para finalizar felicitaros a todos losasistentes por vuestra participación yconvocaros para el V Congreso Nacionalde ASEBIR, que tendrá lugar en Valenciaen 2009.

Carmen Ochoa

NUEVA JUNTA DIRECTIVA DE ASEBIR

Presidente: Mark Grossmann i Camps.

Vicepresidenta: Mª Victoria Hurtadode Mendoza.

Secretaría: Nieves Cremades FernándezTesorero: Manuel Ardoy Vilches

Vocalía de Docencia y Formación: JorgeMartín Cuadros Fernández, MontserratBoada Palá.

Vocalía del Sitio Web: Jorge Ten Morro,Fernando Marina Rugero.

Vocalía de Publicaciones: María BonadaSanjaume, Antonio Urries López.

Vocalía de Congresos: Mª José de losSantos Molina, Begoña Arán Corbella,Nieves Cremades Fernández.

Vocalía de Relaciones Públicas: FernandoMarina Rugero, Jorge Ten Morro.

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Carmen Ochoa y Mark Grossmann durantela clausura del IV Congreso Nacional ASEBIR


H U M O R

Junio 2008 Vol. 14 · Nº 1 39

(Fotografía cortesía de Joan Sarquella (GiroFiv) extraída de la

representación teatral “El científico loco” en la que nuestro

compañero “clava” su papel)

Senior Clinical Embryologist enproceso de acreditación de la ESHRE

(Esperamos vuestras fotos curiosas, dibujos divertidos, etc para su publicación en esta sección)


Jul 6-9 24Annual Meeting of the ESHRE

http://www.eshre.com/emc.asp?pageId=286

Barcelona Spain

Ag 27-299th International Congress on Reproductive Biomedicineand

4th International Congress on Stem Cells Biotechnology

http://www.royaninstitute.org/congress/

Tehran Iran

Sept 1-5III Workshop de Biopsia Embrionaria y Fijación de Blastómeros. CME

http://www.centromedicinaembrionaria.com/profesionales/cursos.html

Madrid Spain

Sept 11-137th Athens Congress on Women’s Health & Disease - Gynecologic, Obstetrics and

Reproductive Issues

http://www.womenshealth2008.org

Athens Greece

A G E N D A

40HUMOR


A G E N D A


Sept 12-14International Symposium on preventive ART fertility preservation & preimplantation diagnosis

http://www.cretesymposium2008.mdcongress.gr/index_19.asp?

Chania, Crete Greece

Jun 13-16LXXIII Congreso Nacional de Urología.

http://www.aeu.es/aeu_webs/congreso/

Barcelona Spain

Sept 19-20Basic principles in ovarian physiology: Relevance for IVF

ESHRE Campus workshop

Organized under the auspices of the Special Interest Group Reproductive Endocrinology


Lisbon, Portugal

Oct 6-7The menopause and its management: a revisit

ESHRE Campus Meeting

Organised by the ESHRE Special Interest Group Reproductive Endocrinology

and the ESHRE Special Interest Group Endometriosis/Endometrium


Edinburgh UK

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A G E N D A

AGENDA

Oct 20-22The Fertility Society of Australia Annual Scientific Meeting 2008

http://www.fsa.au.com/apps/events/event.php?EventsID=98

Hilton Hotel

Brisbane

Nov 8-1264th Annual Meeting of the ASRM

ttp://www.asrm.org/Professionals/Meetings/annualmeeting.html

San Francisco USA

Nov 14-15Cancer and fertility

ESHRE Campus Meeting

Organised by the ESHRE Task Force on “Fertility preservation in severe diseases”

in co-operation with the National Centre for Tumour Diseases (NCT), Heidelberg


Heidelberg Germany

Nov 20-21International workshop on Infertility and Assisted reproduction

http://gyneco-obstetrique.hug-ge.ch/enseignement.html

Geneva Switzerland

42


A G E N D A

Junio 2008 Vol. 14 · Nº 1 43

Nov 26-285th European Congress of Andrology

http://www.andrology2008.com./

Rome Italy

Nov 26-29Tecnobios Procreazione Symposium 2008 and

3rd International Conference on the Cryopreservation of the Human Oocyte

http://www.tecnobiosprocreazione.it/en/conferences/tecnobios-symposiunm-congress-2008.html

Bologna Italy

Nov 26-2954th Annual Meeting of the Canadian Fertility and Andrology Society

http://cfas.cfwebtools.com/index.cfm?objectid=20444324-F849-D5A7-E2319DB21E8008F1

Calgary Canada

Nov 28-29Curso Internacional Controversias en Ginecología y Reproducción. Hospital La Fe.

Valencia Spain

Nov 27-30Controversies in Obstetrics, Gynecology & Infertility (COGI)

http://www.comtecmed.com/cogi/paris/

Paris France


NORMAS DE PUBLICACIÓN

La revista ASEBIR es una publicación delámbito de la Biología de la Reproducciónabierta a considerar cuantos trabajosafines a esta área de conocimientopuedan adaptarse a uno de lossiguientes apartados: ArtículosOriginales; Temas de Actualización oDebates. Además, la revista ASEBIR dacabida a la actualidad en sus seccionesde Noticias y Agenda.

La revista ASEBIR se publicasemestralmente por lo que esindispensable que los escritos para lassecciones de Debates, Noticias yAgenda sean enviados antes del 30 deAbril para el primer número del año(Junio) y antes del 15 de Noviembrepara el segundo número del año(Diciembre).

Los originales deben enviarse a:

Secretaría de ASEBIR, C/ Cronos 20,Edificio 4, 1º Piso, 6ª. 28037 (Madrid).Se recomienda utilizar sobres queprotejan adecuadamente el contenidoinformático.

Manuscritos: Todos los trabajosremitidos deberán ser inéditos y sepresentarán en un manuscrito originaly dos copias impresas, a doble espacioen hojas din A4, así como también ensoporte informático. Se acompañaránde una carta de presentación en la quese solicite su valoración y se indique lasección donde se desea su publicación.En esta carta debe constar claramenteque el trabajo no ha sido publicadopreviamente y que todos los autoresestán de acuerdo en su contenido yceden los derechos de su publicación aASEBIR. Para la reproducción dematerial ya editado es necesaria laautorización expresa de lospropietarios del copyright.

Para artículos originales y temas deactualización se sugiere una extensiónno superior a las trece hojas din A4 a 30líneas, con no más de seis figuras y seistablas.

En la primera página de todos lostrabajos se indicará, en el siguienteorden: título en castellano; título eninglés; nombre y un apellido de cada unode los autores y nombre completo delcentro, con la dirección paracorrespondencia, incluido correoelectrónico. En la segunda página seincluirá un resumen y las palabras clave(ambos en castellano e inglés). Laestructura de los manuscritospreferentemente deberá organizarse enlos apartados de Introducción, Materialy Métodos, Resultados, Discusión,Agradecimientos, Bibliografía, Tablas yGráficas. Las tablas se numerarán connúmeros romanos y las figuras connúmeros arábigos. Los pies de figura seimprimirán en hoja aparte y cada figurallevará escrito en el dorso sunumeración.

Las citas bibliográficas deben serdirectas, consignándose en el texto elnombre del autor o de los dos autores yel año (Ej.: Smith, 1993 o bien Smith andMichigan, 1997) y si son más de dosautores consignándose el primeroseguido de "et al.," (Ej.: Smith et al.,1998). Para agrupar varias citas seencadenarán con ";" (Ej.: Smith andMichigan, 1997; Smith et al., 1998).

Las referencias bibliográficas sepresentaran en la sección deBibliografía por orden alfabéticosiguiendo las normas del InternationalCommittee of Medical Journal Editors5th edition (dichas normas se puedenconsultar en JAMA 1997; 277:927-934). Los nombres de las revistas seabreviarán de acuerdo con el estilousado en el Index Medicus (que sepuede consultar en la List of JournalsIndexed que se incluye todos los añosen el número de enero). A continuaciónse dan un ejemplo de formato de citasbibliográficas:

A) Artículo de revista con menos de 6autores:

Lewis SE, Moohan JM, Thompson W.Effects of pentoxifylline on humansperm movility in normospermic

individuals using computer-assistedanalysis. Fertil Steril 1993;59:418-423.

B) Artículo de revista con más de 6autores:Marrama P, Baraghini GF, Carani C, Celani MF, Giovenco P, Grandi F, et al.Further studies on the effect ofpentoxifylline on sperm count andsperm movility in patients withidiopathic oligo-asthenozoospermia.Andrologia 1985;17:612-616.

C) Libro completo:Colson JH, Armour WJ. Spermatogénesis.2º ed. Londres: Delmar Publishers;1996.

D) Capítulo de libro:Siracusa G, Felici M, Salustri A.

Meiotic maturation of the mammalianoocyte. En: Ach RH, Balmaceda JP,Johnston I, editors. Gamete Physiology.2º ed. New York: Raven Press; 1990. p.129-144.

E) Comunicación a congreso:Bengston S, Solheim. Hatching assisted.XXII Meeting of European Society ofHuman Reproduction and Embriology;1997 Jun20-23; Roma, Italia. p. 1561-2.

Para la sección de debate se aceptarántextos (de no más de dos hojas din A4 a30 líneas, incluidas un máximo de cincocitas bibliográficas y dos figuras si lashubiere), que reflejen la opinión de

los diferentes firmantes sobre el tema dediscusión que se propondrá en el númerode la revista anterior.

Para las secciones de noticias y agendase aceptarán escritos que informen decongresos u otros eventos relacionadoscon la Biología de la Reproducción o laactividad asociativa de ASEBIR siempreque identifiquen de manera clara losorganizadores de los mismos.

INFORMACIÓN PARA LOS AUTORES - NORMAS DE PUBLICACIÓN

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I N F O R M A C I Ó N P A R A L O S A U T O R E S

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B O L E T Í N D E I N S C R I P C I Ó N

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CENTRO DE TRABAJO:

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¿Desea pertenecer como miembro numerario a la asociación para el estudio de la biología de la reproducción, ASEBIR?

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Revista Asebir junio 2008

Health & Medicine

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