“Superación de las barreras al desarrollo de cultivo de...

“Superación de las barreras al desarrollo de cultivo de microalgas con

fines bioenergéticos”

« Surmonter les verrous au développement de culture de micro algues à

des fins bioénergétiques »

Departamento de Biotecnología de Neiker TecnaliaS. SUAREZ, Z.IKARAN y S. CASTAÑÓN

ACCIÓN 1. GENERACIÓN DE CULTIVOS

DESARROLLAR UNA ESTRATEGIA DE CULTIVO QUE PERMITA MEJORAR LA CALIDAD ENERGÉTICA DE LABIOMASA COMO FUENTE DE BIODIESEL.

- IDENTIFICAR FACTORES QUE CONDICIONEN LA ACUMULACIÓN DE LÍPIDOS DE RESERVA

- OPTIMIZAR LAS CONDICIONES DE CULTIVO PARA MEJORAR EL CONTENIDO DE TGAs

- ANALISIS DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES IMPLICADOS EN LA SÍNTESIS DE LIPIDOS

CHLORELLA ES UNA ESPECIE FÁCIL DE CULTIVAR, Y DE CRECIMIENTO RÁPIDO.SU CONTENIDO DE LÍPIDOS RESPECTO AL PESO SECO RONDA EL 20% Y CON UNCONTENIDO EN FAMES DEL 3% BAJO CONDICIONES GENERALES DECRECIMIENTO.


DESARROLLAR UNA ESTRATEGIA DE CULTIVO QUE PERMITA MEJORAR LA CALIDAD ENERGÉTICA DE LABIOMASA COMO FUENTE DE BIODIESEL.

SCNEDESMUS ES UNA ESPECIE DE CRECIMIENTO RÁPIDO, AMPLIA TOLERANCIA ACAMBIOS AMBIENTALES Y RESISTENTE A CONTAMINACIONES CON OTRASESPECIES. SU CONTENIDO EN LÍPIDOS RESPECTO AL PESO SECO RONDA EL 25%Y CON UN CONTENIDO EN FAMES DEL 10% BAJO CONDICIONES GENERALES DECRECIMIENTO.

� LA COMPOSICIÓN PROXIMAL INCLUYE PROTEÍNAS, CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS Y FIBRA ENPROPORCIONES VARIABLES, HACIENDO DE SU BIOMASA UNA MATERIA PRIMA VERSATIL

� DIFERENTES FACTORES NUTRICIONALES Y AMBIENTALES APLICADOS DURANTE LOSCULTIVOS PUEDEN MODIFICAR RADICALMENTE SU COMPOSICIÓN Y POR TANTO SU VALORENERGÉTICO


LuzRestricción Nutricional

CO2Balance N:P:Fe

Productividad TGAS

Composición BiomasaCremiento + =



� LIMITACIÓN DE NITROGENO

0

1

2

3

4

3 mM 6mM 9mM

Bio

mas

s (g

DW

L-1

)

0

4

8

12

16

3 mM 6mM 9mM

TA

Gs

(% D

W )

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

3 mM 6mM 9mM

Yie

ld (

g T

AG

s L

-1d

-1)

Chlorella vulgaris

Crecimiento

Nitrógeno disponible Deficiencia N

Síntesis Compuestos ReservaCrecimiento


Síntesis Compuestos Reserva

► EN CONDICIONES DE LIMITACIÓN, UNA DOSIS INICIAL DE N DE 6 mM DA LUGAR A LA MAYOR PRODUCTIVIDAD



0

2

4

6

8

10

12

14

48 72 96 120 144 168

Time (Hours)

TA

Gs

(%D

W)

N-starved

N-replete

0

2

4

6

0 48 96 144 192

Bio

mas

s (g

PS

L-1

) Serie1

Serie1N-repleteN-limited

0

3

6

9

12

0 48 96 144 192

Time (H)

Neu

tral

Lip

id (

%P

S)

N ( + )

48 h 96 h 144 h

196 h

0

5

10

15

20

25

30

48 72 96 120 144 168

Time (Hours)

(LIP

%D

W)

N-starved

N-replete

► LA LIMITACIÓN DE LA DISPONIBILIDAD DE N PROVOCA EL ALMACENAMIENTO DE LÍPIDOS DE RESERVA, EN TGAs




Scenedesmus sp.

10

20

30

40

3 6 9 12

KNO3 (mM)

FA

ME

S (

% D

W)

0

1

2

3

4

5

6

3 6 9 12

Bio

mas

a (g

PS

L-1)

KNO3 (mM)

► EN CULTIVOS LIMITADOS SE INCREMENTA EL CONTENIDO D E FAMES RESPECTO AL VALOR DE REFERENCIA INDEPENDIENTE MENTE DE LA DOSIS INICIAL DE N

0

5

10

15

20

25

30

Limitados No Limitados

FA

ME

S (

% P

S)

Crecimiento







� APORTE DE CO2, INTENSIDAD LUMINICA

Scenedesmus sp.

Chlorella vulgaris

0

5

10

15

(+) CO2 (-) CO2

TA

Gs

(% P

S)

0

5

10

15

20

250 450µmol photons m -2 s-1

TA

Gs

(% P

S)

► EN CHLORELLA LA ACUMULACIÓN DE LÍPIDOS EN CULTIVOS LIMITADO S POR N, ESTÁ FAVORECIDA POR ELSUMINISTRO DE CO2 Y POR EL AUMENTO DE LA LUZ, MIENTRAS QUE EN SC ENEDESMUS ESTÁ FAVORECIDA PORLA LUZ

0

1

2

3

4

Bio

mas

a (g

PS

L-1

)

(+) CO2 (-) CO20

10

20

30

40

FA

ME

S (

%P

S)

(+) CO2 (-) CO2

- LA LIMITACIÓN PROGRESIVA DE N, PERMITE MEJORAR EL CONTENID O FAMES PROVOCANDO UNINCREMENTO DE LA PRODUCTIVIDAD, A PESAR DEL DESCENSO EN LA PR ODUCCIÓN DE BIOMASA BAJOESTAS CONDICIONES DE CULTIVO.

SCENEDESMUS MOSTRÓ UNA PRODUCTIVIDAD DE FAMES 1.5 VECES SUP ERIOR A LA CHLORELLAEMPLEANDO ESTA ESTRATEGIA DE CULTIVO

0

200

400

600

800


PB

(m

gL-1

d-1)

ScenedesmusChlorella

0

50

100

150


PF

AM

ES

(mgL

-1d-

1)

ScenedesmusChlorella


LOS AVANCES EN LA TECNOLOGÍA DE CULTIVO SON UN PUNTO FUNDAMENTAL PARA ALCANZAR LA REDUCCIÓNDE COSTES Y MEJORAR LA RENTABILIDAD DE TODA LA CADENA DE VALOR DEL CULTIVO DE MICROALGAS



ESPECIE / FAMEs Cámara Invernadero Planta Piloto

1. C.vulgaris 16-19 11-13 9 - 13

2. Secenedesmus 30 22 10

15

20

25

30

35

40

Te

mp

era

tura

(ºC

)

1 7 14

(días)

► DESCENTO EN LA CANTIDAD DE FAMES EN FUNCIÓN DEL ESCALADO, COM O POSIBLE CAUSA LAS CONDICIONESDE LUZ Y TEMPERATURA


� PROCESO DE ESCALADO



� EFECTO DE LOS FACTORES DE CULTIVO EN LA COMPOSICIÓN DE LA BIOMASA

Nitrógeno Disponible

Chlorella vulgaris Scenedesmus sp.

CenizasFAMEs

Lipidos Polares

Carbohidratos

Proteinas

Proteinas

Carbohidratos

Otos Lip

FAMEsCenizas

No determinados

► LA LIMITACIÓN DE NITRÓGENO CONDUJO A UN AUMENTO DE LOS FAMES Y LOS CARBOHIDRATOS CONTENIDOS ENLA BIOMASA. EL AUMENTO DEL AMBOS COMPUESTOS SUPONE UNA MEJOR A EN EL VALOR ENERGÉTICO DE LABIOMASA

Proteinas

Carbohidratos

Lipidos Polares

FAMEsCenizas

Cenizas

No determinados

Proteinas

FAMEs

Otos Lip

Carbohidratos

Nitrógeno Limitante

Crecimiento






� ANALISIS DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES IMPLICADOS EN LA SÍNTESIS DE LIPIDOS

Chlorella vulgaris

Crecimiento







Chlorella vulgaris

0 24 48 72 96 120 144 168

RNAm

cDNA

IDENTIFICAR SECUENCIAS DE GENES

EXPRESIÓN DIFERENCIAL RT-PCR

RNA cDNA

M m1 m2 m1 M m2

CEBADORES DEGENERADOSESPECIFICOS (Chlorella variabilis)

Gen Cebadores Tamaño (pb) EM 1 ME-S1AF / ME-S2CR 226

EM 2 S2AECFor / S3BEMR 356

ACL ACLsubB-For / ACLsubB-Rev 188

ACC ACC-For2 / ACC-Rev2 400

G6PD G6PDH-For 3 / G6PDH-Rev 3 387

DGAT DGAT For3 / DGAT Rev3 270

NITRATO REDUCTASA (NR) NR For /NR Rev 289

ACTINA (ACT) ACT For 3 / ACT Rev 3 638

RUBISCO (RB) RUB-For / RUB Rev 207



► IDENTIFICACIÓN DE LAS SECUENCIAS DE LOS GENES QUE CODIFICAN ENZIMAS CLAVE EN EL PROCESO


FIJACIÓN DE CARBONO

ASIMILACIÓN DE NITROGENO

NRNO3 NO2 NH4

NiR

Crecimiento





0

10

20

30

40

50

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Culture Time (hours)

TA

G (

%LI

PID

)

0

1

2

3

4

5

Chl

oro

phyl

l (%

DW

)

0

1

2

3

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Culture Time (hours)

Bio

mas

ss (

gDW

L-1

)

0

2

4

6

NO

3 m

M

-A LAS 48 H DE CULTIVO NO HAY NO3 NI NO2 EN EL MEDIO-EL ENZIMA SIGUE FUNCIONANDO Y PODRÍA PARTICIPAR ENALGÚN OTRO PROCESO DE MOVILIZACIÓN-OTRO ENZIMA PERMITE LA ASIMILACIÓN DE N DESDE LASPROTEÍNAS.


ACIDOS GRASOS

TGAs

PRECURSORES LIPIDOS

ACETIL CoA

NADPH

ACL

EM/G6PDH

COOH

C

O

O

ACC

DGAT

SINTESIS DE NOVO

LIPIDOS POLARES

PDAT

Los lípidos totales se mantienenmientras que los TGA aumentan

-LOS TGAs PROVIENEN DE LA MOVILIZACIÓN DELOS LÍPIDOS POLARES, Y SÓLO UNA PEQUEÑAPARTE SON SINTETIZADOS DE NOVO-El ACETIL CoA PROVIENE DE OTRA RUTA


ACIDOS GRASOS

TGAs

LIPIDOS POLARES

PROTEINAS

PRECURSORES LIPIDOS

ACETIL CoA

NADPH

ACL

EM/G6PDH

COOH

C

O

O

ACC

DGAT

SINTESIS DE NOVO

PDAT

Los lípidos totales se mantienenmientras que los TGA aumentan

PEP PIRUVATO

OAA

PEPC

En condiciones de limitaciónlas proteínas se reducen

CARBOHIDRATOS

SINTESIS

DEGRADACIÓN

AGPasa

SP

En condiciones de limitaciónlos CH se acumulan

-El ACETIL CoA PRODRÍA PROVENIR DELA RUTA DEL PEP

-AUMENTA LA DEGRADACIÓN DE CARBOHIDRATOS

LA ACUMULACIÓN DE LÍPIDOS EN CULTIVOS LIMITADOS POR N, ESTÁ FAVORECIDA POR EL SUMINISTRO DE CO2 Y POR

EL AUMENTO DE LA LUZ

EL EMPLEO DE LOS GASES PROCEDENTES DE FUENTES DE COMBUSTIÓN INDUSTRIAL COMO SUMINISTRO DE CO2SUPONE UN BENEFICIO MEDIOAMBIENTAL Y UN BENEFICIO ECONÓMICO, AUMENTANDO LA RENTABILIDAD ECONÓMICA AESCALA INDUSTRIAL

LA LIMITACIÓN DE NITRÓGENO CONDUCE A UN AUMENTO DE LOS CARBOHIDRATOS CONTENIDOS EN LA

BIOMASA Y UN DESCENSO DE LAS PROTEÍNASEL AUMENTO DE FAMES Y CH SUPONE UNA MEJORA EN EL VALOR ENERGÉTICO DE LA BIOMASA

SERA NECESARIO MODIFICAR LAS CONDICIONES O LA SITUACIÓN DEL ESCALADO PARA GARANTIZAR CONDICIONESADECUADAS PARA LA PRODUCCIÓN DE LA BIOMASA

LA LIMITACIÓN PROGRESIVA DE N PERMITIE MEJORAR EL CONTENIDO FAMES, PROVOCANDO UN INCREMENTO DE LA PRODUCTIVIDAD A PESAR DEL DESCENSO EN LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA.

SCENEDESMUS MOSTRÓ UNA PRODUCTIVIDAD DE FAMES 1.5 VECES SUPERIOR A LA CHLORELLA EMPLEANDO ESTA ESTRATEGIA DE CULTIVO

CONCLUSIONES

LA LIMITACIÓN EN NITRÓGENO DESENCADENA FLUJOS EN LAS VÍAS METABÓLICAS, Y SU CONOCIMIENTO ES

FUNDAMENTAL PARA LA COMPRENSIÓN DE LOS MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA BIOSÍNTESIS DEÁCIDOS GRASOS EN LAS ALGAS VERDES

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