T E S I S -...

HIBRIDACÍÓN EN NOCHEBUENA DE SOL (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch)

CON LA VARIEDAD PRESTIGE EARLY Y SU VALIDACIÓN CON MARCADORES MORFOLÓGICOS Y MOLECULARES

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Y DESARROLLO RURAL

P R E S E N T A:

ELIO CAMPOS BRAVO

DIRECTORA DE TESIS:

Dra. María Andrade Rodríguez

Cuernavaca, Morelos, Diciembre 2013

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

DEDICATORIA

Primeramente a Dios por guiarme, darme la fortaleza y entendimiento para concluir este reto en

mi paso por esta vida.

A mis hijos Juan de Dios, Adrián y Elías, porque son mi motor y mi aliento para cumplir todos

y cada uno de mis objetivos.

A mi fiel compañera Anallely Mejía Montejo, que me alienta a que cada día sea una

oportunidad más para dar lo mejor de mí.

A mi familia porque siempre están presentes en cada etapa de mi vida.

A la Dra. Andrade, por su paciencia y apoyo al enseñarme cosas nuevas y poder compartir sus

conocimientos conmigo.

Al Dr. Canul, porque hizo de esta investigación un yacimiento de conocimientos y aprendizajes

para mi persona.

Y todos los que pudieron compartir su conocimiento conmigo, de corazón un enorme

agradecimiento por su apoyo.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por su apoyo a través

de la beca otorgada para mi manutención y su apoyo para la realización de los

estudios de maestría.

A la Facultad de Ciencias Agropecuarias, por las facilidades dadas para la

realización del presente trabajo y la oportunidad de poder realizar mis estudios de

posgrado.

A la Dra. María Andrade Rodríguez, por su apoyo, esfuerzo y paciencia en la

realización de esta investigación.

Al Dr. Jaime Canul Ku, por su apoyo, consejos y esfuerzo para la realización de

esta investigación.

Al Dr. Irán Alia Tejacal, por su apoyo en el proceso de esta investigación.

Al PhD. Antonio Castillo Gutiérrez, por su intervención para la realización de esta

investigación.

Al MC. Jesús Vargas Araujo, por su apoyo e interés para la realización de esta

investigación.

i

INDICE GENERAL

Página

ÍNDICE GENERAL………………………………………………………………… i

ÍNDICE DE CUADROS……………………………………………………………. iii

ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………... v

RESUMEN GENERAL…………………………………………………………….. 1

SUMMARY…………………………………………………………………………. 3

CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN GENERAL……………………………………. 4

1.1.- Objetivos………………………………………………………………………. 7

1.2.- Hipótesis………………………………………………………………………. 7

CAPITULO II. HIBRIDACIÓN EN GERMOPLASMA DE NOCHEBUENA NATIVA COMO ESTRATEGIA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO………….

8

2.1.-Resumen………………………………………………………………………. 8

2.2.- Summary……………………………………………………………………… 9

2.3.- Introducción…………………………………………………………………… 10

2.4.- Materiales y métodos………………………………………………………… 12

2.4.1.- Localización………………………………………………………………… 12

2.4.2.- Material vegetal…………………………………………………………….. 12

2.4.3.- Receptividad estigmática y viabilidad de polen………………………… 13

2.4.4.- Hibridación………………………………………………………………….. 13

2.4.4.1.- Factores de estudio……………………………………………………… 13

2.5.- Resultados y discusión……………………………………………………… 15

2.6.- Conclusiones…………………………………………………………………. 24

2.7.- Agradecimientos……………………………………………………………… 24

2.8.- Literatura citada………………………………………………………………. 25

CAPITULO lll. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS EN NOCHEBUENA (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) MEDIANTE MARCADORES MORFOLÓGICOS…………………………………………………………………. 27 3.1.- Resumen……………………………………………………………………… 27

3.2.- Summary……………………………………………………………………… 28

3.3.- Introducción…………………………………………………………………… 28

MATERIALES Y METODOS……………………………………………………… 30

ii

3.4.1.- Ubicación del experimento………………………………………………... 30

3.4.2.- Material de estudio………………………………………………………… 30

3.5.3.- Caracteres evaluados…………………………………………………….. 31

3.6.4.- Análisis estadístico………………………………………………………… 32

3.4.- Resultados y discusión………………………………………………………. 32

3.5.- Conclusiones…………………………………………………………………. 48



CAPITULO IV. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS F1 DE NOCHEBUENA MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES RAPD…………

52

4.1.- Resumen……………………………………………………………………… 52

4.2.- Summary……………………………………………………………………… 53

4.3.- Introducción…………………………………………………………………… 54

4.4.- Materiales y métodos………………………………………………………… 56

4.4.1.- Localización………………………………………………………………… 56

4.4.2.- Material vegetal…………………………………………………………….. 56

4.4.3.- Extracción de ADN genómico…………………………………………….. 57

4.4.4.- Evaluación de la calidad de ADN………………………………………… 58

4.4.5.- Concentración de ADN……………………………………………………. 58

4.4.6.- Amplificación de ADN con RAPD………………………………………… 58

4.4.7.- Análisis de datos moleculares……………………………………………. 60

4.5.- Resultados y discusión………………………………………………………. 60

4.6.- Conclusiones…………………………………………………………………. 66



CONCLUSIONES GENERALES………………………………………………… 69

LITERATURA CITADA……………………………………………………………. 71

iii

ÍNDICE DE CUADROS

Página Cuadro 1. Cuadrados medios y nivel de significancia del análisis de varianza para frutos y semillas cosechadas…………………………………………………………………………… 18

Cuadro 2. Frutos y semillas cosechadas por genotipo, tipo de emasculación y hora de polinización en nochebuena nativa por ‘Prestige early’……………………………………………………………………..……………. 20

Cuadro 3. Número de flores polinizadas, frutos y semillas cosechadas de los cruzamientos de nochebuena nativa con ‘Prestige early’….…………….…………………………………………………………………. 22

Cuadro 4. Número de semillas generadas por cada uno de los cruzamientos y usadas para la identificación de híbridos mediante marcadores morfológicos……………………………………………………………………... 31

Cuadro 5. Cuadrados medios (CM) y coeficiente de variación (CV) de los caracteres cuantitativos evaluados en la progenie F1 y sus progenitor femenino (Morelos)………………………………………………………………….. 33

Cuadro 6. Valores promedios de los caracteres de tallo, hoja, bráctea e inflorescencia en plantas de nochebuena obtenidas a partir del cruzamiento del genotipo de Morelos por ‘Prestige early’…………………………………………………………………..………….. 35

Cuadro 7. Cuadrados medios del análisis de varianza y coeficiente de variación de las variables de la progenie F1 y su progenitor femenino (Oaxaca)………………………………………………………………….…………… 36

Cuadro 8. Variables promedio de los caracteres de tallo, hoja, bráctea en plantas de nochebuena obtenidas a partir del cruzamiento del genotipo de Oaxaca por ‘Prestige early’…………………………………………..………………………………………. 37

Cuadro 9. Proporción de la varianza global, vectores y valores propios del análisis de componentes principales (CP) en la progenie F1 de nochebuena…………………………………………………………………………... 39

Cuadro 10. Caracteres morfológicos cualitativos de las familias obtenidas del cruzamiento del genotipo de Morelos por ‘Prestige early’, así como de los progenitores………………………………………………………………………….. 42

Cuadro 11. Caracteres morfológicos cualitativos de las familias obtenidas del cruzamiento del genotipo de Oaxaca por ‘Prestige early’, así como de los progenitores…………………………………………….……………………………. 44

iv

Cuadro 12. Valores de la composición de la inercia y Chi-cuadrada del análisis de correspondencia simple en familias F1 de nochebuena………………….…………………………………………………....... 45

Cuadro 13. Contribuciones relativas (CR) y absolutas (CA) asociadas con los tres primeros ejes principales del análisis de correspondencia simple en familias F1 de nochebuena…………………………….………………………………………......... 46

Cuadro 14. Iniciadores utilizados en la reacción de amplificación de ADN para la identificación de híbridos de nochebuena………………………………………………………………………….. 59

Cuadro 15. Bandas totales, polimórficas y porcentaje de polimorfismo para la identificación de plantas híbridas de nochebuena mediante RAPD……………………………………………………………………………......... 61

Cuadro 16. Bandas similares al progenitor macho para la identificación de híbridos de nochebuena mediante RAPD…………………….……………………………………………………………. 64

v

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Proceso de hibridación. a) Emasculación completa, b) Emasculación parcial, c) Polinización manual, d) Prendimiento de frutos.. 15

Figura 2. Desarrollo de la flor femenina……………………………………………………………. 16

Figura 3. Receptividad del estigma y viabilidad de polen en flores de nochebuena nativa. a) Estigma no receptivo, b) Estigma receptivo, c) Tinción de granos de pole con acetocarmin al 1 %..................................... 16

Figura 4. Temperatura y humedad relativa durante los meses en que se efectuaron las hibridaciones en nochebuena nativa y ‘Prestige early’……………………………………………………………………….…….. 23

Figura 5. Progenitores y su progenie F1: a: progenitor femenino, b: híbrido F1, c: progenitor masculino……………………………………………. 34

Figura 6. Distribución de ocho familias de medios hermanos y sus progenitores femeninos en función del primero y segundo componente principal…………………………………………………………… 40

Figura 7. Características de: diámetro de brácteas, color de tallo, forma de bráctea y forma de hoja de progenitores y su progenie F1, en nochebuena……………………………………………………………………… 41

Figura 8. Dispersión de ocho familias F1 y sus progenitores de acuerdo a sus características cualitativas………………………………………………… 48

Figura 9. Amplificaciones de ADN de las familias 1 y 7 obtenidas con el iniciador 2 (5’CAA TCG CCG 3’), kb escalera molecular, M: progenitor femenino, P: progenitor masculino, F1: familia 1, F7: familia 7. Las flechas indican las bandas que comparten las familias con el progenitor masculino..................................................................................................... 62

Figura 10. Agrupamiento entre familias de medios hermanos de nochebuena utilizando el análisis de agrupamiento UPGMA basado en el estimador de Dace tomando como referencia 101 fragmentos RAPD……………………………………………….……………………..…….. 65

1

RESUMEN GENERAL

México es centro de origen de la nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex

Klotzsch), ésta se encuentra en estado silvestre distribuida principalmente por el

litoral del Océano Pacifico, donde se encuentra la mayor diversidad genética y

representa un recurso fitogenético de importancia para mejoramiento genético de

la especie. Sin embargo, el mejoramiento genético lo han realizado y realizan

otros países como Estados Unidos, Holanda y China entre otros. En México, la

investigación para hacer mejoramiento genético y generar materiales mejorados

con fines de introducirlos en el mercado con patente mexicana es incipiente. Bajo

este contexto, el objetivo del presente estudio fue generar las bases

metodológicas para hacer hibridación como un método de mejoramiento genético

en nochebuena, así como identificar la progenie F1 hibrida mediante marcadores

morfológicos y moleculares. Para realizar la hibridación se utilizó un diseño

completamente al azar con arreglo factorial 2x2x3, se utilizaron dos accesiones de

nochebuena silvestre (Morelos y Oaxaca) como progenitores femeninos, en las

cuales se probaron dos técnicas de emasculación de anteras (completa y gradual)

y tres horarios (10:00, 11:00 y 12:00 horas) para realizar las polinizaciones con la

variedad ‘Prestige early,’ como progenitor masculino. Se evaluó número de frutos

y semillas cosechadas. La hora más adecuada para realizar la polinización fue a

las 11:00 am con remoción gradual de las anteras. De las semillas hibridas F1

obtenidas se generaron ocho familias, las cuales se pusieron a germinar, al igual

que semillas de las dos accesiones como testigos. Para la identificación de

híbridos mediante marcadores morfológicos, se evaluaron 18 caracteres

cuantitativos y 8 cualitativos, con los datos generados se realizó análisis de

varianza (P≤0.05), y en las variables donde mostraron deferencias estadísticas se

realizó una comparación de medias mediante Tukey utilizando el programa SAS

9.0 y se complementó con análisis de componentes principales y de

correspondencia simple. De las ocho familias, cinco presentaron similitud

morfológica con el progenitor macho en diferentes variables. En la identificación

de híbridos F1 mediante marcadores moleculares RAPD, se realizó una selección

de aquellas plantas que presentaron características similares al progenitor macho,

se les realizó extracción de ADN para ser amplificado con diez iniciadores RAPD.

2

La evaluación de los híbridos se realizó comparando los patrones de bandeo

como presencia (1) y ausencia (0) de los progenitores y la progenie F1, con la

información se construyó una matriz de similitud empleando el coeficiente

desarrollado por Dice (1945). Con el método UPGMA del programa NTSYS se

construyo el dendrograma. Las familias 1 y 7 presentaron mayor similitud genética

con el progenitor macho a una distancia de 0.35.

3

SUMMARY

Mexico is the center of origin of poinsettia (Euphorbia pulcherrima Willd. ex

Klotzsch), it is mainly distributed in the wild along the littoral of the Pacific Ocean,

where is the greatest genetic diversity and represents an important plant resource

in breeding genetic of the species. However, breeding genetic have made other

countries like USA, Netherlands and China among others. In Mexico, research for

breeding purposes to introduce them into the market with Mexican patent is

incipient. In this context, the objective of this study was to generate the

methodological bases for hybridization as a method of breeding on poinsettia, as

well as identify progeny F1 hybrid using morphological and molecular markers. To

hybridization was used a completely randomized design with a 2x2x3 factorial

arrangement, two accessions of wild poinsettia (Morelos and Oaxaca) were used

as female parents, were tested two techniques emasculation of anthers (full and

incremental) and three times (10:00, 11:00 and 12:00 hours) for pollinations with

variety 'Prestige early,' as male parent were tested. Number of harvested fruits

and seeds were evaluated. The best time for pollination was at 11:00 am with

gradual removal of the anthers. Of F1 hybrid seeds eight families were generated,

which were germinated, like seeds of the two accessions were witnesses. For the

identification of hybrid was performed using morphological markers, were

evaluated 18 characters qualitative and 8 quantitative, with the data generated

was performed analysis of variance (P ≤ 0.05), and the variables which showed

statistical difference performed comparison of means was using Tukey using the

SAS 9.0 program and supplemented with principal component analysis and simple

correspondence. Of the eight families, five showed morphological similarity to the

male parent in different variables. In the identification of F1 hybrids using RAPD

molecular markers, a selection of plants that had similar characteristics to the male

parent was performed; they did DNA extraction with amplified RAPD primers ten.

Evaluation of hybrids was performed comparing banding patterns as presence (1)

and absence (0) of the parents and F1 progeny, with information is constructed

similarity matrix using the Dice coefficient (1945). UPGMA method with the

program NTSYS dendrograma was constructed. Families 1 and 7 showed greater

genetic similarity to the male parent at a distance of 0.35.

4

CAPÍTULO I. INTRODUCCION GENERAL

La Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch, conocida comúnmente como

Cuetlaxóchitl, poinsettia, flor de pascua, o nochebuena es nativa de México (Lee,

2000; Ecke et al., 2004). Se encuentra ampliamente distribuida por las zonas

tropicales de México (Lee, 2000), desde el nivel del mar hasta los 2,000 m,

alcanzando su diversidad y abundancia en los bosques tropicales caducifolios

(Steinmann, 2002); es común encontrarla de manera natural, semicultivada y

cultivada en varios estados del país, por ejemplo en los estados de Morelos,

Guerrero, México, Puebla, Michoacán, Nayarit y Oaxaca, entre otros; así como, el

Distrito Federal; se distingue por su vistosidad, diversidad en color, tamaño, forma

de hoja y bráctea. En la actualidad, las especies ornamentales de mayor

importancia en México son la nochebuena, crisantemo (Dendranthema spp), rosa

(Rosa spp), clavel (Dianthus caryophyllus), entre otros (Mejía et al., 2006).

Esta especie fue introducida a Estados Unidos en el año de 1825, por Joel Robert

Poinset, cuando en una visita a México se encontró con plantas vistosas

creciendo de forma natural, las mandó hacia su país para su cultivo y a partir de

ahí se dispersó a otros países del mundo. Sin embargo, fue hasta 1909 cuando se

comercializaron las primeras plantas, antes del híbrido interespecifico ‘Dulce

Rosa’.

El mejoramiento genético se inició a mediados de los 50´s (Ecke et al., 2004). Sin

embargo, los primeros cultivares comerciales fueron producidos hasta 1963

(Parks y Moyer, 2004), todos a partir de Euphorbia pulcherrima (Ecke et al.,

2004).

El mejoramiento genético en nochebuena se ha realizado y se realiza en países

como Estados Unidos, China, Corea del norte, entre otros. En México no existen

variedades mejoradas de nochebuena; hasta el momento se han registrado 5

variedades que son de sol, como: ‘Juan Pablo’, ‘Amanecer Navideño’, ‘Rehilete’,

‘Belén’ y ‘Valenciana’ (Galindo et al., 2012). Por lo anterior, es necesario generar

conocimientos que permitan establecer las bases metodológicas para realizar

mejoramiento genético con el fin de generar variedades adaptadas a las

condiciones ambientales de México, con las características que exige el mercado

5

como porte bajo, color rojo intenso en las brácteas, para cultivarlas en maceta a

nivel masivo.

El mejoramiento genético se define como los cambios dirigidos por la actividad del

hombre orientados para la generación de nuevos cultivares, y se realiza por varios

métodos. Los métodos de mejoramiento que se pueden aplicar en especies de

plantas ornamentales son muy variados, van desde los métodos tradicionales de

selección e hibridación, pasando por la biotecnología moderna, hasta llegar a la

ingeniería genética. La hibridación es uno de los métodos de mejoramiento

genético que aprovecha la generación F1 proveniente del cruzamiento entre dos

parentales P1 y P2 (Márquez, 1985), donde el conocimiento de la biología floral es

muy importante para programar la fecha exacta para realizar los cruzamientos

necesarios y dirigidos. Los estadíos óptimos para efectuar los cruzamientos son

primordialmente flor abierta, aunque también prevalece la necesidad de polinizar

en estadío de botón, y para una exitosa hibridación es importante seleccionar

progenitores fértiles (Huang y Chu, 2008).

La biología floral es un proceso complejo y por tanto la polinización puede tomar

lugar solamente cuando los progenitores con características deseables florecen

simultáneamente; por lo general, los órganos masculinos (estambres) maduran

antes que los femeninos (pistilo) y el estigma alcanza su madurez

aproximádamente a los dos o tres días después de la apertura de las flores

(Erwin, 2007). La nochebuena presenta una flor poco común, la inflorescencia

denominada ciatio produce en primera instancia estambres y polen seguido por

los pistilos. El ovario emerge del centro de la flor y crece hacia los lados conforme

se desarrolla la semilla (Ecke et al., 2004).

Por lo general, en un cruzamiento entre dos progenitores se hereda material

genético de ambos, es decir, el híbrido combina caracteres de ambos

progenitores, los cuales segregarían en la progenie (Bai y Lindhout, 2007). En

mejoramiento genético es importante conocer si se dió una verdadera hibridación,

esto se puede valorar mediante marcadores morfológicos y moleculares. Los

marcadores morfológicos se basan en caracteres cualitativos y cuantitativos de la

especie en estudio; estos son afectados por el ambiente. Los marcadores

6

moleculares son pequeños fragmentos de ácido desoxirribonucleico (ADN), que

reconoce partes del genoma a través de una secuencia complemento (Collard et

al., 2005). Los más comunes son los marcadores SSR, RFLP y AFLP (Edmeades

et al., 2004; Francia et al., 2005).

Son varias las técnicas moleculares que pueden utilizarse para valorar la

hibridación, los marcadores moleculares sirven para distinguir genotipos dentro de

poblaciones (Terzopoulos y Bebeli, 2008), cada una de ellas con sus ventajas y

desventajas. Los marcadores RFLP (polimorfismo de la longitud de los

fragmentos de restricción) son laboriosos y consumidores de tiempo para

aplicaciones rutinarias; las SSR (secuencias simples repetidas) son altamente

polimórficas y se basan en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), pero

implican alto costo y la necesidad de conocimiento previo de la secuencia de

algunas regiones del genoma; los AFLP (polimorfismo en la longitud de

fragmentos amplificados) pueden producir gran número de marcadores en corto

tiempo, y se basan en la amplificación selectiva de PCR de fragmentos de

restricción, pero también implican alto costo (Staub et al., 1996); los RAPD

(polimorfismo en el ADN amplificado al azar) son de menor costo y fáciles de

efectuar, no es necesario el conocimiento previo de la secuencia del genoma y

consumen poco tiempo (Williams et al., 1990).

Dentro de toda esta gama de marcadores, los RAPD han llegado a ser usados

para diferenciar algunos genotipos dentro de especie principalmente en plantas

alógamas por ser dominantes y de alta reproducibilidad; en nochebuena fueron

usados por Ling et al. (1997) para identificar cultivares de nochebuena.

Con base en todo lo antes expuesto, es necesario conocer las características de

la biología reproductiva, técnicas de emasculación y polinización para hacer la

hibridación, usar las características morfológicas y técnicas moleculares para

identificar híbridos. Para subsanar la necesidad antes mencionada, se desarrolló

la presente investigación cuyos objetivos e hipótesis se presentan a continuación.

7

Objetivo general

Determinar la metodología para realizar hibridación en genotipos de nochebuena

de sol, colectados en los estados de Morelos y Oaxaca con la variedad mejorada

‘Prestige early’, así como evaluar la generación (F1) de los cruzamientos mediante

marcadores morfológicos y moleculares.

Objetivos específicos

Conocer la fenología floral, viabilidad de polen, receptividad del estigma y método

de emasculación para efectuar la hibridación.

Identificar los híbridos de la progenie F1 de los cruzamientos de nochebuena de

sol por la variedad mejorada ‘Prestige early’, mediante marcadores morfológicos.

Verificar el origen híbrido de plantas F1, obtenidas de los cruzamientos entre

nochebuena de sol y la variedad mejorada ‘Prestige early’, mediante marcadores

moleculares RAPD.

Hipótesis

La viabilidad de polen, receptividad del estigma y método de emasculación son

importantes para obtener amarre de fruto y desarrollo de semillas híbridas de

nochebuena.

Los caracteres morfológicos permitirán identificar híbridos F1 producto de los

cruzamientos de nochebuena de sol por la variedad mejorada ‛Prestige early’.

Los marcadores RAPD serán de utilidad para identificar las plantas de origen

híbrido obtenidas de los cruzamientos de nochebuena de sol por la variedad

mejorada ‛Prestige early’.

Para cumplir el objetivo general planteado, la investigación se organizó de

acuerdo a los tres objetivos específicos. Los resultados obtenidos se presentan en

tres artículos, mismos que se incluyen a continuación.

8

CAPITULO II. HIBRIDACIÓN EN GERMOPLASMA DE NOCHEBUENA NATIVA COMO ESTRATEGIA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO

Elio Campos Bravo1, Jaime Canul Ku2, María Andrade Rodríguez1*, Iran Alia

Tejacal1, Antonio Castillo Gutiérrez3, Jesús Vargas Araujo1

1Posgrado en Ciencias Agropecuarias y Desarrollo Rural, Facultad de Ciencias

Agropecuarias, 62209, Col. Chamilpa, Cuernavaca Mor. Tel. y Fax. 01(777)

3297046.

2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias,

3 Instituto Profesional de la Región Oriente. Universidad Autónoma del Estado de

Morelos.

*Autor responsable: [email protected], [email protected]

RESUMEN

En México, la nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) aún tiene

ejemplares en estado silvestre, con amplia variabilidad genética y es un reservorio

de genes para realizar mejoramiento genético. La hibridación es el método más

utilizado para generar nuevos individuos con diferente composición genética y

para realizarla es necesario conocer la viabilidad de polen, receptividad del

estigma, así como la forma adecuada de emascular y polinizar. El objetivo de este

estudio fue conocer la biología reproductiva, la mejor estrategia para realizar la

emasculación y determinar el momento oportuno para efectuar la polinización

para establecer las bases metodológicas y científicas para realizar la hibridación

entre nochebuena nativa con la variedad comercial ‘Prestige early’. Se usaron

plantas de nochebuena nativa procedentes de Morelos y Oaxaca, así como la

mailto:[email protected]

9

variedad ‘Prestige early’. Se realizaron pruebas de receptividad del estigma

mediante el método de Osborn et al. (1988) y viabilidad de polen por el método de

Dempsey (1993). De igual forma se evaluó el método de emasculación (completa

y gradual) en combinaciones con la hora de polinización (10:00, 11:00 y 12:00

horas del día) en un diseño completamente al azar con arreglo factorial de

tratamientos (2x2x3). Se determinó que el estigma estuvo receptivo uno o dos

días después de que ocurre la trifurcación y aún no ha emergido el ovario del

receptáculo floral. El mayor porcentaje de fruto amarrado fue de 82.75% con

emasculación gradual y polinizadas a las 11:00 de la mañana. El mayor número

de semillas cosechadas fue de 88, cuyas flores fueron emasculadas

gradualmente y polinizadas a las 11:00 horas. El análisis de varianza mostró

diferencias estadísticas altamente significativas para tipo de emasculación y hora

de polinización para frutos y semillas cosechadas (P<0.01), así como interacción

entre tipo de emasculación y hora de polinización. La hora adecuada para realizar

hibridación fue a las 11:00 de la mañana con emasculación gradual según el

análisis de varianza y la prueba de comparación de medias con Tukey (P ≤ 0.05).

Palabras clave: Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch, emasculación,

población nativa, semilla.

SUMMARY

In Mexico, the poinsettia (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) still has

specimen wild, with wide genetic variability and is a reservoir of genes for genetic

improvement. Hybridization is used to generate new individuals with different

genetic composition and to realize it is necessary to know the pollen viability,

stigma receptivity and the proper way to emasculate and pollinate. The aim of this

study was to know the reproductive biology, the best strategy for emasculation and

determine the appropriate time to effect pollination to lay the foundations

methodological and scientific to hybridization between native poinsettia with the

commercial variety ‘Prestige early’. Native poinsettia plants from Morelos and

Oaxaca and the variety ‘Prestige early’ were used. Were performed Stigma

receptivity tests using the method of Osborn et al. (1988) and viability pollen

method Dempsey (1993). Similarly the was assessed method of emasculation (full

10

and gradual) in combination with the time of pollination (10:00, 11:00 and 12:00

hours on the day) in a completely randomized design with factorial arrangement of

treatments (2x2x3 ). It was determined that the stigma was receptive one or two

days after the trifurcation occurs and has not yet emerged from the ovary floral

receptacle. The highest percentage of fruit moored was 82.75% with gradual

emasculation and pollinated at 11:00 am. The highest number of seeds harvested

was 88, whose flowers were emasculated gradually and pollinated at 11:00 hrs.

Analysis of variance showed highly significant differences for type of emasculation

and time of pollination for fruits and seeds harvested (P <0.01), as well as

interaction between type of emasculation and time of pollination. The time

adequate for hybridization was at 11:00 am with gradual emasculation according

to analysis of variance and comparison mean test with Tukey (P ≤ 0.05).

Key words: Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch , emasculation, native

population, seed.

INTRODUCCIÓN

En México, la nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch), conocida

comúnmente como Cuetlaxóchil, se encuentra en estado silvestre y se distribuye

desde cero metros hasta 2,000 msnm aproximádamente (Steinmann, 2002). Es

un arbusto perenne con abundante látex lechoso, mide de 1 a 4 m de altura, con

hojas sencillas, membranáceas, elípticas, con márgenes denticulados o

lobulados, alternas y a veces opuestas en la región superior, de 10 a 20 cm de

largo y 3 a 5 de cm ancho, pecíolo largo, con brácteas vistosas de color roja,

rosada o blanca.

La nochebuena presenta flores unisexuales reunidas en inflorescencias

compuestas. La inflorescencia está constituida por flores pequeñas llamadas

ciatios de color verde que tienen glándulas que secretan néctar como estrategia

para atraer a los polinizadores como abejas (Apis mellifera), hormigas (Lasius

11

spp), mariposas (Lepidópteros) y abejorros (Bombus Terrestris), entre otros. Las

anteras son biloculares dehiscentes en forma longitudinal; mientras que, el

estigma tiene tres estilos unidos, óvulos de 1 a 2 en cada cavidad (Sánchez,

1986). Su fruto es capsular dehiscente, de 1.5 cm de diámetro aproximádamente

(Hoyos, 1985).

La nochebuena nativa es un recurso fitogenético con potencial para realizar

mejoramiento genético y generar nuevos cultivares con características como las

que demanda el mercado nacional e internacional.

Los métodos de mejoramiento genético que se pueden aplicar en especies de

plantas ornamentales de interés comercial son muy variados, van desde los

métodos tradicionales de selección e hibridación, pasando por la biotecnología

moderna, hasta llegar a la ingeniería genética. En especies ornamentales el

método que ha dado excelentes resultados es la hibridación, pero hay que

considerar que la variabilidad genética es un aspecto esencial para cualquier

programa de mejoramiento genético (Clarke, 2008), donde el conocimiento de la

biología reproductiva de los genotipos facilita la selección apropiada de

progenitores; además, permite diseñar y planear los cruzamientos entre ellos

(Ariyarathana et al., 2011).

La hibridación es uno de los métodos de mejoramiento genético que aprovecha la

generación F1 proveniente del cruzamiento entre dos poblaciones parentales P1 y

P2 (Márquez, 1985). Por lo general, en un cruzamiento entre dos individuos se

hereda material genético; es decir, el híbrido combina caracteres de ambos

progenitores, los cuales se manifiestan en la progenie (Bai y Lindhout, 2007). En

la hibridación es indispensable un sistema de control eficiente en la polinización

para evitar la autopolinización, lo cual es una labor intensiva.

Para que la hibridación ocurra deben conjuntarse la receptividad de la flor

hembra, así como la viabilidad del polen de las flores masculinas. La receptividad

estigmática es un parámetro floral que determina el tiempo en el que los estigmas

mantienen la capacidad de generar un ambiente propicio para la germinación de

los granos de polen (Lozada y Herrero, 2006).

12

La nochebuena es una especie alógama, durante su desarrollo emite primero solo

flores masculinas y posteriormente flores femeninas. Esta condición hace

necesario el control de la polinización para conocer cuáles son los parentales que

intervinieron. El mejoramiento genético de esta especie se ha realizado fuera de

México; por lo general, lo realizan empresas privadas, en el país es incipiente

(Canul et al., 2010a, b); por lo que, se necesita establecer las bases

metodológicas para llevarlo a cabo.

Bajo este contexto, el objetivo de este estudio fue conocer la biología

reproductiva, la mejor estrategia para realizar la emasculación, determinar el

momento oportuno de efectuar la polinización, para establecer las bases

metodológicas para realizar hibridación entre nochebuena nativa con la variedad

comercial ‘Prestige early’.

MATERIALES Y MÉTODOS

Localización

El estudio se realizó de junio del 2011 a marzo del 2012 en el Campo

Experimental “Zacatepec” del INIFAP, ubicado a los 18° 39´ 16´´ Latitud Norte y

99° 11´ 54.7´´ Longitud Oeste, a una altitud de 911.8 m, el clima de este lugar es

cálido subhúmedo (Aw0), con lluvias en verano, precipitación promedio anual de

800 mm y temperatura promedio anual de 24 °C (García, 1981).

Material vegetal

Se utilizaron dos procedencias de nochebuena nativa, del estado de Morelos y de

Oaxaca. Las accesiones de Morelos se recolectaron a una altura de 1522 a 1857

msnm, 18°56”15” a 18°56”82” longitud Oeste y 99°09”41” a 98°47”23” longitud

Norte, y las de Oaxaca fueron colectadas a 1963 msnm, 19°30”30” longitud Oeste

y 100°22”24” longitud Norte. Las plantas fueron puestas en un contenedor de 16

L-1 con una mezcla de sustrato a base de tierra de hoja, ocochal y polvillo de coco

13

(60-20-20 v/v, respectivamente) y colocadas bajo una malla luminizada al 80% de

luz.

Receptividad estigmática y viabilidad de polen

Para determinar en qué momento es receptivo el estigma se seleccionaron

botones florales con el estilo recién emergido, aproximadamente de dos mm de

longitud y se consideró como el día uno. Se siguió el desarrollo del estigma por

doce días. Se evaluó la receptividad estigmática por el método de Osborn et al.

(1988), el cual consiste en la aplicación de una gota de peróxido de hidrogeno al

3% sobre la superficie del estigma y se consideró como receptivo cuando

presentó una reacción de burbujeo.

Se realizó la prueba de viabilidad de polen por el método de Dempsey (1993), que

consiste en aplicar una gota de acetocarmin al 1% a los granos de polen. Se

recolectaron anteras antes de que estas emergieran del la flor y antes de la

liberación de polen (antesis), se colocaron en un porta objetos y con un bisturí se

realizó un corte longitudinal y se aplastó suavemente para liberar los granos de

polen, a los cuales se aplicó el acetocarmin al 1%. Con la ayuda de un

microscopio compuesto se observó a 40x el cambio de color de los granos de

polen y se consideraron viables aquellos que se tiñeron de color rojo y no viable

los que presentaron un color rosado.

Hibridación

Factores de estudio

Genotipo. Se usaron 45 plantas procedentes del estado de Morelos y 45 plantas

del estado de Oaxaca.

Tipo de emasculación. Para la emasculación, se realizó una selección de 3 a 4

botones florales por inflorescencia con un mismo desarrollo fenológico del

estigma, eliminando el resto de las flores. En los botones seleccionados se

aplicaron dos técnicas de emasculación (eliminación de anteras), emasculación

completa, que consistió en eliminar completamente las anteras antes que

emergieran del botón floral, dejando el ovario expuesto totalmente, esto se realizó

14

con la ayuda de una pinza de punta fina y con lupa realizando un corte por todo el

perímetro del botón floral sin tocar el ovario (Figura 1a); la segunda técnica fue la

emasculación gradual, que consistió en la remoción de anteras conforme

emergieron del botón floral, pero antes que liberaran el polen (antesis) (Figura

1b). Los botones emasculados se cubrieron con bolsa de glassine para su

protección hasta antes de la polinización manual.

Hora de polinización. Para definir la hora adecuada para realizar los

cruzamientos, la polinización se realizó en tres momentos: 10:00, 11:00 y 12:00

horas del día. Durante este periodo de tiempo se registró la temperatura y

humedad relativa mediante un data logguer Hobo.

La hibridación se realizó en el periodo otoño-invierno 2011, de cada inflorescencia

se seleccionaron de 3 a 4 botones florales en un mismo estadió de desarrollo, los

cuales se emascularon y se cubrieron con una bolsa de glassine. Cuando estuvo

receptivo el estigma se retiró la bolsa para realizar la polinización manual, el polen

se tomó de las anteras del progenitor masculino ‘Prestige early’, mismas que se

retiraron del botón floral con la ayuda de una pinza de punta fina y lupa, la antera

se frotó directamente en el estigma (Figura 1c). Se colocó una etiqueta con la

fecha, hora de polinización y número de flores polinizadas (Figura 1d). Después

se cubrió nuevamente con la bolsa para evitar la contaminación por polen de otras

plantas y otros polinizadores. La bolsa se retiró hasta la cosecha de semilla.

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial

2x2x3 donde la unidad experimental fue una planta en un contenedor de 16 L-1

con cinco repeticiones. Los factores fueron; genotipo, dos procedencias de

nochebuena nativa (Morelos y Oaxaca); tipo de emasculación, en dos niveles

completa y gradual; y hora de polinización, en tres niveles: 10:00, 11:00 y 12:00

horas del día para realizar la polinización. Se evaluó el número de frutos

cosechados y número de semillas cosechadas. Se realizó análisis de varianza y

prueba de comparación de medias Tukey (P ≤ 0.05).

15

Figura 1. Proceso de hibridación. a) Emasculación completa, b) Eliminación gradual de anteras, c) Polinización manual, d) Prendimiento de frutos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Receptividad estigmática y viabilidad de polen

El desarrollo fenológico del estigma mostró que en el día siete se empezó a

trifurcar (Figura 2) y al aplicar el peróxido de hidrógeno al 3% no se observó

cambio alguno (Figura 3a). En los días ocho y nueve (Figura 2) se aplicó de

nuevo el peróxido, la respuesta fue una reacción de burbujeo en el estigma al

entrar en contacto con la sustancia en ambos días (Figura 3b), esto indicó que el

estigma estaba receptivo, y permaneció en ese estado durante aproximádamente

48 horas. Lo anterior indica que la polinización debe efectuarse durante el día

ocho y nueve cuando los estigmas de los tres pistilos están completamente

expuestos, además de observarse turgentes. Cuando el ovario ha emergido del

receptáculo floral el estigma ya no es receptivo (Figura 2).

a b

c d

16

Figura 2. Desarrollo de la flor femenina.

Figura 3. Receptividad del estigma y viabilidad de polen en flores de nochebuena nativa. a) Estigma no receptivo, b) Estigma receptivo, c) Tinción de granos de polen con acetocarmin al 1%.

Con respecto a la viabilidad de polen, se observaron los cambios que ocurren en

los granos de polen al aplicar una gota de acetocarmin al 1%, cuando se tiñeron

de color rojo evidenciaron que fueron viables y cuando fueron de color rosado

fueron infértiles (Figura 3c). Huang y Chu (2008) señalan que durante el amarre

de frutos de cualquier genotipo, la viabilidad del polen es lo primero que debe ser

revisado antes de realizar la polinización; ya en la polinización manual, la

17

capacidad del polen para germinar es un aspecto primordial (Mihalte y Sestras,

2011).

Los resultados obtenidos para receptividad del estigma y viabilidad de polen

indicaron que no existen barreras para que ocurra la fertilización durante el

proceso de hibridación. La no fertilización puede ocurrir debido a las condiciones

del medio ambiente como alta temperatura y humedad relativa baja; la técnica de

emasculación empleada y el manejo de las estructuras reproductivas por parte del

mejorador. Horsley et al. (2010), mencionan que en Eucalyptus se aplicaron tres

técnicas de polinización controlada para probar la efectividad de producción de

semilla y nivel de contaminación genética, los resultados demostraron que un

corte del estilo en la parte superior antes de la antesis sin emascular y sin

aislamiento mediante bolsas produjo la mayor cantidad de semillas y tuvo la

mayor contaminación por autopolinización y a través de polen extraño; mientras

que, el método convencional fue intermedio. Ariyarathana et al. (2011) mencionan

que el conocimiento de la biología reproductiva de los genotipos facilita la

selección apropiada de progenitores en los programas de mejoramiento genético.

Además, permite diseñar y planear los cruzamientos entre los progenitores.

Hibridación

El análisis de varianza mostró diferencias estadísticas altamente significativas por

efecto del tipo de emasculación y la hora de polinización para frutos y semillas

cosechadas; mientras que, no hubo diferencias estadísticas en esos caracteres

por efecto de los genotipos. Asimismo, se presentó interacción altamente

significativa del tipo de emasculación con la hora de polinización para frutos y

semillas cosechadas, e interacción significativa de genotipos por tipo de

emasculación para semilla cosechada (Cuadro 1).

18

Cuadro 1. Cuadrados medios y nivel de significancia del análisis de varianza para frutos y semillas cosechadas.

Fuentes de variación Frutos cosechados

por planta

Número de semillas

cosechadas por fruto

Genotipo (G) 0.26ns 0.52ns

Tipo de emasculación (TE) 12.02** 25.99**

Hora de polinización (HP) 2.90** 16.09**

G x TE 1.61ns 4.14*

TE x HP 2.17** 8.60**

G x HP 0.03ns 0.32ns

G x TE x HP 0.89ns 0.27ns

C.V. (%) 43.58 51.99

C.V.= Coeficiente de variación, ns= no significativo, *= significativo,**= altamente significativo (P ≤ 0.05).

Los cruzamientos realizados entre las accesiones procedentes del estado de

Morelos con ‘Prestige early’ y los realizados con las de Oaxaca, estadísticamente

produjeron similar número de frutos y número de semillas cosechadas; lo anterior

indica que la procedencia de las plantas no tuvo efecto en el éxito de la

hibridación. Tanto el número de frutos como semillas cosechadas fueron bajos

(Cuadro 2), Trejo et al. (2012) mencionan que los haplotipos nucleares de

cultivares contemporáneos están presentes en las poblaciones silvestres; es por

eso que la procedencia de las plantas no afectó la hibridación entre nochebuena

nativa y la variedad ‘Prestige early’ ya que comparten información genética. Esto

indica que los genotipos mexicanos de nochebuena dieron origen a las

variedades comerciales.

El tipo de emasculación afectó al número de frutos y semillas cosechadas

(P<0.01). La eliminación de las anteras conforme fueron apareciendo

19

(emasculación gradual) fue mejor, ya que el número de frutos y semillas fueron

mayores en comparación a los obtenidos con la remoción total de las anteras

(emasculación completa) (Cuadro 2). Lo anterior pudo deberse a que la

emasculación completa implicó mayor daño a la flores, lo que condujo a la

abscisión de las mismas. Esto concuerda con lo reportado por Polverente et al.

(2005) quienes reportan que la manipulación de las flores y la polinización manual

en berenjena afectaron negativamente los órganos femeninos al reducir la

producción de semillas y afectar la calidad de estas. De manera similar, Datson et

al. (2006) mencionan que la eliminación total de anteras no permitió la generación

de semillas en 13 especies de Nemesia.

El momento de la polinización fue determinante para la producción de frutos y

semillas, los resultados indicaron que a las 11:00 am es la hora más apropiada;

sin embargo, es posible iniciar esta actividad desde las 10:00 (Cuadro 2); a las

12:00 del día fue la hora menos conveniente para hacer los cruzamientos porque

se tuvo menor amarre de fruto y menos semillas por fruto. Lo anterior se debió

probablemente a que a esa hora se tuvo mayor temperatura y menor humedad

relativa, mismos que aunados a la manipulación de las flores contribuyeron a la

deshidratación del estigma y granos de polen. En mejoramiento genético el

periodo de polinización debe ser amplio, ya que es conveniente realizar la mayor

cantidad de polinizaciones puesto que la recombinación es aleatoria y esto

permitirá aumentar la posibilidad de obtener caracteres de interés.

20

Cuadro 2. Frutos y semillas cosechadas por genotipo, tipo de emasculación y hora de polinización en nochebuena nativa por ‘Prestige early’.

Fuente de variación

Frutos cosechados por planta

Número de semillas cosechadas por fruto

Genotipo ( G ) Morelos x Prestige early 1.38 az 1,66 az Oaxaca x Prestige early 1.5 a 1.47 a DMSH 0.32 0.42

Tipo de emasculación Completa 1.0 b 0.91 b Gradual 1.9 a 2.22 a DMSH 0.32 0.42

Hora de polinización 10:00 a.m. 1.40 ab 1.30 b 11:00 a.m. 1.85 a 2.56 a 12:00 p.m. 1.10 b 0.83 b DMSH 0.48 0.62

z: Letras iguales en el sentido de las columnas dentro de cada factor indican similitud estadística de acuerdo a la prueba Tukey (P ≤ 0.05).

La polinización artificial es un factor que determina la fertilización del ovario para

generar embriones que alcancen su madurez fisiológica. Lo que concuerda con

Chun et al., (2011) quienes indicaron que la fertilización fue una barrera para la

hibridación entre Crisantemo grandiflorum 'Yuhuaxingchen' y C. nankingense.

Se polinizó un total de 374 flores, de las cuales 171 se emascularon

completamente y 203 parcialmente. Las flores emasculadas se polinizaron en tres

horarios: 10:00 y 11:00 am, y 12:00 pm. Con la emasculación completa, el mayor

número de frutos cosechados se obtuvo al polinizar a las 11:00 am, esto

representó el 11.59% de prendimiento; mientras que, a las 12:00 no hubo amarre

de frutos. Cuando se realizó emasculación gradual, el mayor número de flores

fertilizadas se logró a las 11:00 con 82.75%, seguido de las flores polinizadas a

las 10:00 con 42.30%, en tanto que la polinización a las 12:00 solo generó 7.81%

de ovarios fecundados (Cuadro 3).

21

La eliminación de las anteras conforme fueron emergiendo generó mejores

resultados de frutos cosechados por planta y semillas por fruto. El tipo de

emasculación determinó de forma significativa el porcentaje de ovarios

fertilizados. Estos convertidos ya en embriones se desarrollaron normalmente a

los 10 días después de la polinización artificial; mientras que, los no fertilizados se

empiezan a degenerar y a iniciar la abscisión.

De las flores que se emascularon de forma gradual y se polinizaron a las 11:00

am, de Morelos por ‘Prestige early’ fue donde se cosechó el mayor número de

frutos; mientras que, en las flores emasculadas de forma completa la cosecha fue

casi nula. En el otro cruzamiento, Oaxaca por ‘Prestige early’, las flores con

emasculación gradual y polinizada a las 11:00 produjeron la mayor cantidad de

frutos, seguido de aquellas con emasculación completa y polinizada a la misma

hora; en cambio, las de emasculación completa y parcial, ambas polinizadas a las

10:00 dieron similar número de frutos (Cuadro 3).

La emasculación gradual de anteras generó mayor cantidad de semillas por hora

de polinización en comparación con la emasculación completa. Asimismo, la

polinización realizada a las 11:00 en ambas formas de emasculación fue donde se

cosechó mayor cantidad de semillas (Cuadro 3). En un trabajo sobre fertilidad de

variedades comerciales de nochebuena Huang y Chu (2008) señalan que el

cuajado de fruto y producción de semilla aumentaron de 23.3 a 40% y de 56 a

73%, respectivamente cuando los progenitores provienen de cultivo de tejidos en

comparación con los que se obtuvieron por esquejes.

22

Cuadro 3. Número de flores polinizadas, frutos y semillas cosechados de los cruzamientos de nochebuena nativa con ‘Prestige early’.

Número flores

polinizadas

Número de flores no

fecundadas

Frutos cosechados

Semillas cosechadas

MxPE OxPE MxPE OxPE % de

amarre de fruto

Emasculación completa

10:00 am 52 48 0 e 4 c 0 9 7.69

11:00 am 69 61 1 d 7 b 1 14 11.59

12:00 pm 50 0 0 e 0 d 0 0 0

Emasculación gradual

10:00 am 52 30 18 b 4 c 25 12 42.30

11:00 am 87 15 38 a 34 a 88 79 82.75

12:00 pm 64 59 5 c 0 d 8 0 7.81

Total 374 213 29.67

M= Morelos, O= Oaxaca, PE= ‘Prestige early’

En los cruzamientos donde no se generó fruto pudo deberse en gran medida a las

condiciones ambientales adversas, las cuales pueden causar la no funcionalidad

polínica. En la Figura 4 se muestra el comportamiento de la temperatura durante

el periodo de polinizaciones y es evidente que a partir del 24 de octubre de 2012

la diferencia en temperatura en las horas desde las 10:00 hasta las 12:00 del día

está muy marcada. La temperatura intermedia ocurrió a las 11:00 am y es cuando

se lograron los mejores resultados de la polinización en frutos y semillas

cosechadas.

La humedad relativa muestra un comportamiento similar, a las 10:00 se observa

que es mayor y disminuye conforme transcurre el tiempo. El ambiente es más

seco a las 12:00 pm; por lo tanto a las 11:00 am se obtuvieron las mejores

condiciones para la fecundación (Figura 4)

23

Figura 4. Temperatura y humedad relativa durante los meses en que se efectuaron las hibridaciones en nochebuena nativa y ‘Prestige early’.

24

CONCLUSIONES

Se determinó que el estigma es receptivo cuando los tres pistilos están expuestos

completamente, y aun no emerge el ovario del receptáculo floral.

La producción de semilla por hibridación artificial, se vió afectada por la hora de

polinización, la mejor hora para depositar el polen en el estigma fue las 11 de la

mañana, ya que produjo la mayor cantidad de frutos y semillas. En ese horario se

tuvieron condiciones de temperatura y humedad relativa más favorables.

Los cruzamientos que generaron el mayor número de semillas fueron de la

procedencia de Morelos por ‘Prestige early’ con remoción gradual de anteras y

polinizadas a las 11:00 am.

AGRADECIMIENTOS

El primer autor, agradece al CONACYT el apoyo otorgado mediante la beca

261446 para la realización de estudios de maestría en ciencias.

25

LITERATURA CITADA

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gained and what can we gain in future. Annals of botany 100: 1085-1094.

Canul K J, F Garcia, S Ramírez, F Osuna (2010) Programa de mejoramiento genético

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y Pecuarias, Campo Experimental Zacatepec. Publicación Especial Núm 49. 34 p.

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Mihalte L, R E Sestras (2011) The plant size and the spine characteristics of the

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26

Osborn M, P Kevan, A Meredith (1998) Pollination biology of Opuntia polyacantha

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Polverente M R, D Carneiro, A I Cardoso (2005) Produção e qualidade de

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pulcherrima L. International Journal of AgriScience Vol. 1 303-310.

27

CAPITULO lll. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS EN NOCHEBUENA (Euphorbia

pulcherrima Willd. ex Klotzsch) MEDIANTE MARCADORES MORFOLÓGICOS

Elio Campos Bravo1, Jaime Canul Ku2, María Andrade Rodríguez1*, Iran Alia

Tejacal1, Antonio Castillo Gutiérrez3, Jesús Vargas Araujo1


Agropecuarias, 62209, Col. Chamilpa, Cuernavaca Mor. Tel. y Fax. 01(777)

3297046.


3 Instituto Profesional de la Región Oriente. Universidad Autónoma del Estado de

Morelos.


RESUMEN

En México se encuentra la mayor diversidad de nochebuena en estado silvestre,

por lo que se tiene disponibilidad de gran variabilidad genética para realizar

mejoramiento genético. La hibridación es un método por el cual se pueden

incorporar características deseadas de una planta a otra que no las tiene; sin

embargo, después de la hibridación es importante identificar los híbridos para

darles el manejo adecuado. El objetivo de este estudio fue identificar híbridos en

ocho familias F1 obtenidas de la cruza de nochebuena silvestre y la variedad

‘Prestige early’; mediante marcadores morfológicos. Se sembraron semillas de

ocho familias F1. En las plantas obtenidas, así como en los progenitores se

evaluaron 18 caracteres cuantitativos y 8 cualitativos; la evaluación se hizo en

diferentes etapas fenológicas del desarrollo. Se observó que los caracteres


28

morfológicos fueron de utilidad para identificar las diferencias y similitudes de las

ocho familias con sus progenitores, así como entre familias. Se obtuvo progenie

híbrida con características similares al progenitor masculino, variedad ‘Prestige

early’ en cinco de las ocho familias de nochebuena estudiadas.

Palabras clave: mejoramiento, híbridos, marcador morfológico, caracteres

cualitativos, caracteres cuantitativos.

SUMMARY

In Mexico there is the highest diversity of poinsettia wild, so it has high genetic

variability for breeding test. Hybridization is a method using for incorporated

desired characteristics in a plant; however, after hybridization is important to

identify the hybrids for proper handling. The objective of this study was to identify

hybrids in eight families F1 obtained from crosses with wild poinsettia variety

‘Pretige early’, using morphological markers. The seeds of the eight families were

sown. 19 quantitative and 8 qualitative characters the plants obtained and parents

were evaluated in different phenological stages. It was observed that the

morphological characters were useful to identify differences and similarities of the

eight families with parents and between families. Hybrid progeny was obtained

with characteristics similar to parent male var. “Prestige early” in five of the eight

families studied.

Key words: Improvement, hybrids, morphological marker, qualitative characters,

quantitative characters.

INTRODUCCIÓN

La nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) forma parte del grupo

de plantas de la familia Euphorbiaceae que cuenta con 782 especies reconocidas,

mismas que están ubicadas en 43 géneros; la mayoría de ellas son endémicas

(Steinmann, 2002). Pertenece a una de las familias botánicas más grandes y

29

diversas del mundo (Taylor et al., 2011); se encuentra distribuida por toda la

franja del Pacifico y Centro del país.

La nochebuena es conocida comúnmente como Cuetlaxóchil, flor de navidad o

poinsettia; es símbolo de las fiestas de navidad debido a su belleza, pero además

se usa como flor de corte, en jardines, tumbas en panteones, entre otros (García

et al., 2013), es nativa de México y constituye un recurso fitogenético con

potencial para realizar mejoramiento genético a través de hibridación para generar

nuevos cultivares con características como las que exige el mercado nacional.

Por lo general, en un cruzamiento entre dos progenitores se heredan genes de

ambos progenitores, es decir, el híbrido combina caracteres de ambos

progenitores (Bai y Lindhout, 2007). Después de la hibridación es necesaria la

identificación de híbridos por medio de marcadores que ayuden a detectar las

características de similitud o diferencias de la progenie con respecto a sus

progenitores. Existen varios tipos de marcadores, la elección de alguno de ellos

depende de los objetivos, la exactitud y grado de confiabilidad que se desea

lograr, de la facilidad y de los costos que implique su utilización.

Los marcadores de tipo morfológico han sido utilizados tradicionalmente para

distinguir variedades (Tapia et al., 2005; Adugna et al., 2006), identificar

especies, familias, géneros de plantas e híbridos, por lo que se pueden estimar

diferentes niveles de variabilidad. Estos tipos de caracteres son usualmente

recesivos, codominantes o dominantes. En plantas cultivadas, los órganos más

importantes para la caracterización morfológica son los menos afectados por el

ambiente.

El conocimiento de la variación genética generada como resultado del

cruzamiento entre dos genotipos diferentes, indica que por lo general se obtendrá

variación morfológica, fisiológica, así como en la estructura genética de los

descendientes (Wen y Hsiao, 2001); la variación fenotípica puede deberse

también a diversos factores como el altitudinal, por lo que es común encontrar

diferentes fenotipos de una misma especie, en poblaciones desarrolladas a

diferentes altitudes (Ohsawa y Ide, 2007).

30

El objetivo de este trabajo fue obtener la evidencia fenotípica de que ocurrió la

hibridación entre nochebuena silvestre y la variedad ‛Prestige early’, mediante el

estudio de caracteres morfológicos de tallo hoja y bráctea.


Ubicación del experimento

La presente investigación se realizó en el Instituto Nacional de Investigaciones

Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), de Zacatepec Morelos, el cual se

encuentra a 915 msnm y ubicado a los 18° 39´ 16´´ LN y 99° 11´ 54´´ LW; el lugar

presenta clima cálido subhúmedo (Aw0), con lluvias en verano, precipitación

promedio anual de 800 mm y temperatura promedio anual de 24 °C (García,

1981).

Material de estudio

A partir de la hibridación entre nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige early’

se obtuvieron ocho familias de medios hermanos con diferente número de

semillas por cada una (Cuadro 3). Las semillas se pusieron a germinar en

macetas de tres pulgadas con sustrato “Sunshine mix #3. Mezcla especial” y

como testigos se pusieron a germinar veinte semillas por cada uno de los

genotipos silvestres (Morelos y Oaxaca).

Las plántulas fueron trasplantadas a los 15 días después de la emergencia y se

establecieron en macetas de 3 L con sustrato a base de tierra de hoja, ocochal y

polvillo de coco (60-20-20 v/v, respectivamente), las cuales se colocaron en un

diseño experimental completamente al azar con cuatro repeticiones, bajo malla

luminizada (80% de luz). Las plantas no se podaron para que estas expresaran su

potencial genético en altura.

31

Cuadro 4. Semillas generadas por cada uno de los cruzamientos, y usadas para

la identificación de híbridos mediante marcadores morfológicos.

Familias

Progenitor

femenino

Progenitor

masculino

Tipo de

emasculación

Hora de

polinización

Semillas

utilizadas

Familia 1 Morelos ‘Prestige early’ Gradual 10:00 25

Familia 2 Oaxaca ‘Prestige early’ Gradual 10:00 12


Familia 4 Oaxaca ‘Prestige early’ Gradual 11:00 79

Familia 5 Oaxaca ‘Prestige early’ Completa 11:00 14

Familia 6 Morelos ‘Prestige early’ Completa 11:00 1


Familia 8 Oaxaca ‘Prestige early’ Completa 11:00 9

Caracteres evaluados

Los caracteres cualitativos y cuantitativos se evaluaron tomando como referencia

el Manual Gráfico para la Descripción Varietal de Nochebuena (Mejía et al., 2006).

Se consideraron 26 caracteres morfológicos como los más representativos para

determinar la diferencia o similitud de la progenie con sus progenitores, los cuales

se dividieron en cuantitativos (continuos) y cualitativos (de doble estado y

multiestado). Se consideraron 18 caracteres cuantitativos como, altura de planta

(AP), distancia de entre nudos (DEN), número de nudos (NN), diámetro de

inflorescencia (DDI), longitud de pedúnculo floral (LPF), longitud de peciolo en

hoja (LPH), longitud de lámina de hoja (LLH), anchura de lámina en hoja (ALH),

luminosidad en hoja (L*H), cromaticidad en hoja (C*H), matiz de hoja (M*H),

longitud de peciolo en bráctea (LPB), longitud de lámina en bráctea (LLB),

anchura de lámina en bráctea (ALB), número de brácteas (NB), luminosidad en

bráctea (L*B), cromaticidad de bráctea (C*B) y matiz en bráctea (M*B).

Se evaluaron ocho caracteres morfológicos discretos como forma de hoja (FH),

forma de la base de la hoja (FBH), color de haz de peciolo en hoja (CHPH), color

32

de envés en peciolo de hoja (CEPH), presencia de lóbulos en hojas (PLH), color

de tallo (CT), forma de bráctea (FB) y ángulo de inserción de las brácteas (AIB).

La toma de datos de realizó en diferentes etapas fenológicas del desarrollo de la

planta. La toma de datos cuantitativos de tallo, hoja y brácteas se tomaron a los

165 días después de la emergencia de planta cuando estaban en floración. El

color de hoja y brácteas se determinó con un espectrofotómetro (X- Rite® Mod.

SP 64) y los parámetros fueron luminosidad, cromaticidad y matiz, colocando las

muestras sobre una superficie de color blanco.

Análisis estadístico

Con la información generada de las variables continuas se realizó análisis de

varianza (P≤0.05) y cuando este mostró diferencias estadísticas se llevó a cabo la

comparación de medias por el método de Tukey utilizando el programa SAS (9.0).

Con base en los promedios de las variables continuas se realizó análisis de

componentes principales (ACP), con el procedimiento PRINCOMP (SAS 9.0). En

base a las modas de las variables discretas de cada una de las familias se hizo

análisis de correspondencia simple mediante el procedimiento PRINCORRESP

(SAS 9.0).


En el análisis de varianza se detectaron diferencias estadísticas significativas

(P≤0.05) en la mayoría de las variables registradas, las únicas que no mostraron

diferencia estadística fueron número de nudos, longitud de lámina de hoja y matiz

de bráctea. El coeficiente de variación fue de 4.48 hasta 20%, lo cual indica las

diferencias en respuesta por cada tipo de carácter (Cuadro 5).

33

Cuadro 5. Cuadrados medios (C.M). y coeficiente de variación (C.V.) de los caracteres cuantitativos evaluados en la progenie F1 y su progenitor femenino (Morelos).

Variable C. M C. V. (%) Altura de planta (cm) 5344.59** 20.98

Distancia entre nudos (cm) 8.57** 32.65

Número de nudos 130.38ns 19.71

Diámetro de inflorescencia (cm) 121.91* 23.40

Longitud de pedúnculo floral (cm) 20.41** 69.97

Longitud de peciolo en hoja (cm) 5.02* 29.06

Longitud de lámina en hoja (cm) 5.55ns 14.84

Ancho de lámina en hoja (cm) 24.72** 20.19

Luminosidad de hoja 166.32** 10.47

Cromaticidad de hoja 315.15** 21.12

Matiz de hoja 86.83* 4.48

Longitud de peciolo en bráctea (cm) 2.55* 36.94

Longitud de lamina en bráctea (cm) 16.94* 24.18

Anchura de lamina en bráctea (cm) 15.31** 32.86

Número de brácteas 3792.60** 40.04

Luminosidad en bráctea 131.40** 8.84

Cromaticidad en bráctea 187.73** 9.39

Matiz en bráctea 7.87ns 10.54 *: Significativo, **: Altamente significativo, ns: no significativo, (P≤0.05).

Las plantas obtenidas de los genotipos de Morelos presentaron la mayor altura y

distancia de entrenudos comparado con las plantas F1 de las familias obtenidas

de ellas (Figura 5); en contraste, la familia 1 tuvo la menor altura y distancia de

entrenudos (Cuadro 6); para nochebuena de interior se requieren plantas de porte

compacto, por lo que la familia 1 podría ser una opción para seleccionarse,

clonarse y propagarse como nueva variedad.

Las características de luminosidad y cromaticidad de la hoja del genotipo de

Morelos mostraron valores altos de 42.77 y 31.45, respectivamente; en cambio,

valores menores fueron para la familia 7, esto significa que las hojas de familia 7

fueron de color verde obscuro. Para matiz los valores más altos los presentaron

34

las familias 6 y 7. En las variables longitud de peciolo en bráctea, longitud de

bráctea, anchura de bráctea y número de brácteas, la familia 7 presento los

valores más altos. Para las variables longitud de peciolo en bráctea, longitud de

bráctea y anchura de bráctea los valores más bajos los tuvo la familia 6. Sin

embargo, en número de brácteas el genotipo Morelos fue el que presentó el valor

más bajo respecto a las familias obtenidas de las cruzas. En cuanto a la

luminosidad y cromaticidad en bráctea, la familia 6 presentó los valores más altos

(40.05 y 60.76, respectivamente), lo que significa que son plantas con brácteas de

color rojo fuerte (Cuadro 6).

Figura 5. Progenitores y su progenie F1: a: progenitor femenino, b: híbrido F1, c: progenitor masculino.

35

Cuadro 6. Valores promedios de los caracteres de tallo, hoja, bráctea e inflorescencia en plantas de nochebuena obtenidas a partir del cruzamiento del genotipo de Morelos por ‘Prestige early’.

Familia AP

(cm)

DEN

(cm)

AH

(cm)

L*H C*H M*H LPB

(cm)

LB

(cm)

AB

(cm)

NB L*B C*B

1 112.44b 2.04c 9.05b 40.44ab 27.25a 113.39ab 2.88ab 10.22ab 2.97ab 43.50bc 37.42ab 54.11b

3 128.21ab 2.48bc 9.05b 40.90ab 27.89a 113.39b 3.23ab 10.25ab 3.70a 52.37abc 33.75c 52.18b

6 138ab 3.5ª 12.0a 38.25b 26.06a 117.80a 2.6b 9.0b 2.50b 59.0ab 40.05a 60.76a

7 120.14ab 2.55bc 10.64ab 33.75c 19.23b 118.31a 3.7a 12.57a 4.0a 66.71a 35.89b 53.68b

Morelos 147.54a 3.27ab 8.89b 42.77a 31.45a 113.31b 2.9ab 9.63b 2.14b 33.72c 36.02bc 54.82b

DMSH 28.38 0.88 1.87 4.10 5.73 4.89 1.14 2.44 1.05 18.89 3.06 4.96

*Letras iguales en el sentido de las hileras significa similitud estadística. AP: altura de planta, DEN: distancia de entre nudos, AH: anchura de hoja, L*H: luminosidad de hoja, C*H:cromaticidad de hoja, M*H: matiz en hoja, LPB: longitud de peciolo en bráctea, LB: longitud de bráctea, AB: anchura de bráctea, NB: número de brácteas, L*B: luminosidad de bráctea, C*B: cromaticidad de bráctea. DMSH: desviación mínima significativa.

36

En las familias derivadas del cruzamiento de la accesión de Oaxaca con ‘Prestige

early’ se obtuvieron diferencias altamente significativas (P≤0.01) en altura de planta,

longitud de nudos, luminosidad de hoja, cromaticidad de hoja y anchura de bráctea,

así como diferencias significativas en matiz de hoja, longitud de peciolo de hoja y

número de brácteas por planta. La mitad de los caracteres estudiados no mostraron

diferencias significativas. El intervalo de variación fue mayor que el obtenido en las

familias provenientes del cruzamiento de la accesión de Morelos con el mismo

Progenitor ‘Prestige early’ (Cuadro 7).

Cuadro 7. Cuadrados medios del análisis de varianza y coeficiente de variación de las variables de la progenie F1 y su progenitor femenino (Oaxaca).

Variable

Cuadrados

medios

Coeficiente de

variación (%)

Altura de planta (cm) 12825.55** 21.05

Distancia entre nudos (cm) 4.52** 27.16

Número de nudos 99.55 ns 17.52

Diámetro de inflorescencia (cm) 42.62ns 25.72

Longitud de pedúnculo floral (cm) 4.31ns 75.26

Longitud de peciolo en hoja (cm) 2.39ns 30.34

Longitud de lámina en hoja (cm) 7.76ns 15.54

Ancho de lámina en hoja (cm) 6.87ns 21.61

Luminosidad de hoja 166.22** 13.17

Cromaticidad de hoja 200.78** 20.72

Matiz de hoja 43.38* 3.30

Longitud de peciolo en bráctea (cm) 2.08* 26.91

Longitud de lámina en bráctea (cm) 8.06ns 23.34

Anchura de lámina en bráctea (cm) 17.39** 30.15

Número de brácteas 1318.40** 39.23

Luminosidad en bráctea 47.53ns 22.22

Cromaticidad en bráctea 33.01ns 12.63

Matiz en bráctea 13.34ns 15.15

*Significativo ** Altamente significativo, ns=no significativo (P≤0.05).

37

La mayor altura de planta y la distancia de entre nudos la presentó el genotipo de

Oaxaca respecto a las familias. En tanto que, la familia 2 tuvo los valores más bajos

(Cuadro 8). Para el mercado es importante tener plantas de porte bajo y con un

peciolo corto, por lo que la familia 4 reúne las características antes mencionadas y

es candidata a ser seleccionada.

En cuanto a luminosidad y cromaticidad de la hoja la familia 8 presentó los valores

más bajos lo que indica que son plantas de un color de hoja verde obscuro; mientras

que, el genotipo de Oaxaca presentó los valores más altos, por lo anterior se puede

decir que esas plantas son de un color verde pálido. En la longitud de peciolo en

bráctea, la familia 8 tuvo la máxima longitud; mientras que, la familia 2 tuvo el valor

mínimo con respecto a las demás familias. En cuanto a ancho de bráctea, la familia

2 presentó brácteas más anchas; en tanto que, el genotipo de Oaxaca tuvo menos

anchura de este órgano con respecto a las familias (Cuadro 8).

Cuadro 8. Variables promedio de los caracteres de tallo, hoja, bráctea en plantas de nochebuena obtenidas a partir del cruzamiento del genotipo de Oaxaca por ‘Prestige early’.

Familia AP

(cm)

DEN

(cm)

L*H C*H M*H LPB

(cm)

AB

(cm)

2 122.43b 2.14b 42.09ab 31.55a 111.85b 2.57b 4.85a

4 115.63b 2.48ab 40.0ab 27.77ab 113.96ab 2.76ab 3.63b

5 122b 3.02a 42.18ab 29.59ab 112.96ab 3.06ab 3.43bc

8 128.39ab 2.57ab 36.23b 23.74b 116.40a 3.72a 4.05ab

Oaxaca 158.41a 3.20a 42.96a 31.94a 112.32ab 2.93ab 2.33c

DMSH 31.27 0.84 2.67 6.80 4.19 0.87 1.12

*Letras iguales en el sentido de las hileras significa similitud estadística. AP: altura de planta, LN: longitud entre nudos, LH: longitud de hoja, C*H: cromaticidad de hoja, M*H: matiz en hoja, LPB: longitud de peciolo en bráctea, AB: anchura de bráctea, NB: número de brácteas. DMSH: desviación mínima significativa.

38

Los cuatro primeros componentes principales explicaron el 82% de la variabilidad

morfológica observada. El CP1 con un valor propio de 6.61 explicó el 36.75% de

variación, donde las variables de mayor contribución fueron luminosidad de hoja,

cromaticidad de hoja, matiz de hoja y número de nudos. Como se demuestra, este

componente estuvo formado por los caracteres que determinan el color de las hojas.

El CP2 explicó el 26.14% de la variación total, las variables luminosidad en bráctea,

cromaticidad en bráctea, longitud de bráctea y distancia de entre nudos fueron los

caracteres que influyeron en mayor proporción para determinar el componente. De la

misma forma, el CP3 contribuyó con el 10.75% de la variación y su relación es

principalmente con anchura de lamina en hoja. El CP4 fue determinado

principalmente por la altura de la planta (Cuadro 9). Estos resultados fueron

similares a lo reportados por Nieto et al. (2008), al caracterizar poblaciones nativas

de pasto banderita (Bouteloua curtipendula Michx.) quienes encontraron que los tres

primeros componentes explicaron el 63% de la variación total entre los diferentes

ecotipos de pasto banderita.

39

Cuadro 9. Proporción de la varianza global, vectores y valores propios del análisis de componentes principales (CP) en la progenie F1 de nochebuena.

Variables CP1 CP2 CP3 CP4

AP -0.176 0.219 -0.126 0.502

DEN -0.089 0.362 -0.043 0.159

NN -0.109 -0.315 0.175 0.367

DDI 0.253 0.015 -0.074 -0.110

LPF 0.185 0.099 -0.294 0.335

LPH 0.235 0.003 0.397 0.400

LLH -0.284 -0.166 -0.109 0.011

ALH 0.221 0.176 0.426 0.258

L*H -0.371 -0.062 0.081 0.017

C*H -0.369 -0.044 0.151 0.089

M*H 0.335 0.213 -0.011 -0.035

LPB 0.238 -0.131 -0.461 0.073

LDB -0.092 0.383 -0.009 -0.180

AB 0.170 -0.337 0.205 0.012

NB 0.364 0.111 -0.066 0.067

L*B -0.092 0.383 -0.009 -0.180

C*B -0.064 0.352 0.371 -0.133

M*B -0.202 0.207 -0.287 0.367

Valores propios 6.61 4.70 1.93 1.67

Varianza explicada (%) 36.75 26.14 10.75 09.32

Varianza acumulada (%) 36.75 62.90 73.64 82.96

AP: Altura de planta; DEN; Distancian entre nudos; NN: Número de nudos; DDI: Diámetro de inflorescencia; LPF: Longitud del pedúnculo floral; LPH: Longitud de peciolo en hoja; LLH: Longitud en lámina de hoja; ALH: Anchura de lámina en hoja; L*H: Luminosidad en hoja; C*H: Cromaticidad en hoja; M*H: Matiz en hoja; LPB: Longitud de peciolo en bráctea; LDB: Longitud de bráctea; AB: Anchura de bráctea; L*B: Luminosidad en bráctea; C*B: Cromaticidad en bráctea; M*B: Matiz en bráctea.

Con base en CP1 y CP2 se construyó la Figura 6, donde se observa la distribución

de las ocho familias con sus respectivos progenitores femeninos. Las familias 3, 7 y

8 comparten similitud en longitud del peciolo de bráctea y fueron las que tuvieron el

mayor número de brácteas. Las familias 1, 2 y 5 presentan similar longitud de

pedúnculo floral y poseen los valores más bajos respecto a las otras familias, lo que

40

quiere decir, que tienen una inflorescencia compacta. La familia 6, presenta los

valores más altos en características como; distancia entre nudos, luminosidad y

cromaticidad en bráctea; sin embargo, en longitud de bráctea tuvo el valor más bajo

con respecto a las demás familias.

Figura 6. Distribución de ocho familias de medios hermanos y sus progenitores femeninos en función del primero y segundo componente principal.

La forma de hoja que presentan las familias 6 y 7 es triangular y difiere de la forma

de hoja de ambos progenitores, lo que permite señalar que son plantas híbridas. En

la forma de la base de hoja, la familia 3 mostró similar forma que su progenitor

masculino, esto indica que la tendencia o carga genética fue hacia la nochebuena

mejorada. En color del haz del peciolo de hoja todas las familias fueron parecidas al

progenitor masculino; mientras que, en el color del envés de peciolo en hoja solo la

familia 1 presentó similitud con el progenitor masculino. En lóbulo de hoja y color de

tallo las familias fueron completamente distintas a sus parentales (Figura 7), por lo

que se puede decir que el tipo de herencia posiblemente es intermedia. En forma de

bráctea e inserción de brácteas las familias 3, 6 y 7 presentaron similitud con el

progenitor masculino y la familia 1 con el progenitor femenino, la tendencia fue a

tener mayor parecido con el progenitor masculino (Cuadro 10).

41

Figura 7. Características de: diámetro de brácteas, color de tallo, forma de bráctea y forma de hoja en progenitores y su progenie F1 en nochebuena. a: progenitor femenino, b: hibrido F1, c: progenitor masculino.

42

Cuadro 10. Caracteres morfológicos cualitativos de las familias obtenidas del cruzamiento del genotipo Morelos por ‘Prestige early’, así como de los progenitores.

Familia FH FBH CHPH CEPH PL CT FB AIB

1 Elíptica Cuneiforme Rojo intenso Rojo medio Fuerte Verde medio Elíptica Agudo

3 Ovalada Circular Rojo intenso Rojo bajo Fuerte Verde medio Ovalada Llano

6 Triangular Cuneiforme Rojo intenso Rojo bajo Fuerte Verde medio Ovalada Llano

7 Triangular Cuneiforme Rojo intenso Rojo bajo Fuerte Rojo medio Ovalada Llano

Morelos Elíptica Cuneiforme Rojo medio Rojo bajo Medio Verde bajo Ovalada Agudo

Prestige

Early Ovalada Circular Rojo intenso Rojo medio Ausente Rojo bajo Elíptica Llano

FH: forma de hoja, FBH: forma de la base de la hoja, CHPH: color del haz del peciolo de hoja, CEPH: color de envés de peciolo de hoja, PL: presencia de lóbulos en hoja, CT: color de tallo, FB: forma de bráctea y AIB: ángulo de inserción de bráctea.

43

La forma de hoja que tienen las familias 2, 4 y 8 es triangular, que es diferente a la

forma de hoja de los progenitores, lo que permite decir, que el tipo de herencia para

ese carácter fue intermedio. La forma de base de hoja de las familias 2 y 8 es similar

con el progenitor masculino. Mientras que, las familias 4 y 5 comparten forma de

hoja con el progenitor femenino. Para el color de haz de peciolo en hoja, todas las

familias comparten el mismo color con el progenitor masculino. Lo que permite saber

que para ese carácter el progenitor masculino fue dominante. En el color del envés

de peciolo la familia 2 fue totalmente diferente a los progenitores, esto indica que

son plantas hibridas. En la presencia de lóbulos en hojas las familias 2, 4 y 8 fueron

diferentes a sus progenitores. El color de tallo de la F1 fue más parecido al progenitor

de Oaxaca. Sin embargo, para inserción de brácteas las familias tendieron a ser

similares al progenitor masculino ‘Prestige early’ (Cuadro 11).

44

Cuadro 11. Caracteres morfológicos cualitativos de las familias obtenidas del cruzamiento del genotipo Oaxaca por ‘Prestige early’, así como de los progenitores.

Familia FH FBH CHPH CEPH PL CT FB AIB

2 Triangular Circular Rojo intenso Verde bajo Fuerte Verde bajo Ovalada Llano

4 Triangular Cuneiforme Rojo intenso Rojo bajo Fuerte Verde bajo Ovalada Llano

5 Elíptica Cuneiforme Rojo intenso Rojo bajo Ausente Verde bajo Ovalada Agudo

8 Triangular Circular Rojo intenso Rojo medio Fuerte Rojo bajo Ovalada Llano

Oaxaca Elíptica Cuneiforme Rojo medio Rojo bajo Medio Verde bajo Ovalada Agudo

‘Prestige

early’ Ovalada Circular Rojo intenso Rojo medio Ausente Rojo bajo Ovalada Llano

FH: forma de hoja, FBH: forma de la base de la hoja, CHPH: color del haz del peciolo de hoja, CEPH: color de envés de peciolo de hoja, PL: presencia de lóbulos en hoja, CT: color de tallo, FB: forma de bráctea y AIB: ángulo de inserción de bráctea.

45

El análisis de correspondencia simple indica que el valor singular (0.27312) 1ג explicó

el 54.19% de la variabilidad; el valor singular (0.20786) 2ג contribuyó con el 31.39%;

ambos ejes aportan el 85.59% de la variación global. Los primeros cuatro ejes

explican el 96.97% de la varianza total (Cuadro 12).

Cuadro 12. Valores de la composición de la inercia y Chi-cuadrada del análisis de correspondencia simple en familias F1 de nochebuena.

Eje principal Valor singular

Inercia

principal Chi-cuadrada Porcentaje

Porcentaje

acumulado

54.19 54.19 30.8829 0.0746 0.27312 1ג

85.58 31.39 17.8869 0.0432 0.20786 2ג

92.76 7.19 4.0957 0.00989 0.09946 3ג

96.97 4.21 2.3983 0.00579 0.07611 4ג

98.49 1.52 0.8682 0.0021 0.0458 5ג

99.45 0.96 0.545 0.00132 0.03628 6ג

99.84 0.39 0.2228 0.00054 0.0232 7ג

100 0.16 0.0906 0.00022 0.01479 8ג

En la integración del primer eje la mayor contribución estuvo dada por color de tallo y

color del envés en peciolo de hoja; el segundo eje fue definido por la forma de hoja y

el tercer eje por la intensidad de color en tallo (Cuadro 13).

46

Cuadro 13. Contribuciones relativas (CR) y absolutas (CA) asociadas con los tres primeros ejes principales del análisis de correspondencia simple en familias F1 de nochebuena.

Variable CR1 CA1 CR2 CA2 CR3 CA3

FH 0.0367 0.0151 0.9388 0.6676 0.0198 0.0616

FBH 0.1489 0.0122 0.603 0.0851 0.0403 0.0249

CHP 0.1401 0.0025 0.6312 0.0198 0.0872 0.0119

ICHP 0.1847 0.0054 0.2926 0.0148 0.0435 0.0096

CEP 0.8416 0.0614 0.0465 0.0059 0.0783 0.0431

ICEP 0.0975 0.0079 0.3625 0.0508 0.2417 0.1479

PL 0.7065 0.1516 0.0067 0.0025 0.2215 0.3584

CT 0.9727 0.7187 0.0105 0.0134 0.0141 0.0786

ICT 0.0203 0.0023 0.3096 0.0602 0.3015 0.2561

FB 0.3398 0.0205 0.4974 0.0518 0.0097 0.0044

AIB 0.1001 0.0024 0.687 0.0282 0.0195 0.0035

FH : Forma de hoja; FBH: Forma de la base en hoja; CHP: Color del haz en peciolo de hoja; ICHP: Intensidad de color en el haz de peciolo de hoja; CEP: Color del envés en peciolo de hoja; ICEP: Intensidad de color en envés de peciolo de hoja; PL: Presencia de lóbulos en hoja; CT: Color de tallo; ICT: Intensidad de color en tallo; FB: Forma de bráctea; AIB: Angulo de inserción de bráctea.

47

La agrupación de las familias con base en los ejes 1 y 2 fue la formación de tres

grupos.

En el cuadrante I se localiza solamente la familia 5 que se caracteriza por tener

forma de hoja elíptica, base de hoja cuneiforme, color rojo intenso del haz de peciolo,

color rojo bajo en el envés de peciolo, lóbulos de hoja ausente, color verde bajo en

tallo, forma de la bráctea ovalada y ángulo de inserción de brácteas agudo (Figura 8).

En el cuadrante II se localizó solo el progenitor masculino ‘Prestige early’

caracterizado por tener forma de hoja ovalada, base de hoja circular, color rojo

intenso del haz de peciolo, color rojo medio en el envés de peciolo, lóbulos de hoja

ausente, color rojo bajo en tallo, forma de la bráctea ovalada y ángulo de inserción de

brácteas llano.

En el cuadrante lll se ubicaron cinco de las ocho familias evaluadas, las cuales

comparten el color rojo intenso en el haz del peciolo en hoja, presencia fuerte de

lóbulos en las hojas, forma de brácteas ovalada y ángulo de inserción de las brácteas

llano (recto), esto indica que son plantas hibridas principalmente por el color rojo

intenso del peciolo y la presencia fuerte de lóbulos en las hojas.

En el lV cuadrante se encuentran localizados los progenitores y la familia 1 que

comparten la forma elíptica de hoja, forma cuneiforme en base de hoja, color rojo

medio en envés de peciolo, forma elíptica de bráctea y el ángulo de inserción agudo

en brácteas. Esto permite ver que en la hibridación los caracteres que expresó la

familia 1 fueron más similares al progenitor femenino (Figura 8). Esto indica que los

marcadores morfológicos son útiles para determinar similitud y diferencias de la

progenie con sus progenitores. Lo que concuerda con lo reportado por Puga et al.

(2011), al caracterizar el Lirio Azteca mediante marcadores morfológicos, donde

estos permitieron diferenciar las cuatro variedades de Sprekelia formosissima.

48

Figura 8. Dispersión de ocho familias F1 y sus progenitores de acuerdo a sus características cualitativas.

CONCLUSIONES

Los 26 marcadores morfológicos fueron útiles para identificar las diferencias o

similitudes de las familias F1 con respecto a sus progenitores, así como la

variabilidad fenotípica entre las familias F1 de nochebuena.

El análisis de correspondencia simple permitió la formación de cuatro grupos con

integración de los mismos con base a sus características cualitativas.

49

La diversidad en caracteres de distribución cualitativa fue importante para la

selección de materiales con posibilidades de ser introducidos al mercado como

nuevas variedades de origen mexicano.

En cinco de ocho familias F1 de nochebuena se observó progenie híbrida con

características similares al progenitor macho comercial.

AGRADECIMIENTOS

El autor principal agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)

el apoyo otorgado mediante la beca 261446 para la realización de estudios de

Maestría en Ciencias Agropecuarias y Desarrollo Rural.

50

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52

CAPÍTULO IV. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS F1 DE NOCHEBUENA (Euphorbia

pulcherrima Willd. ex Klotsch) MEDIANTE MARCADORES RAPD

Elio Campos Bravo1, María Andrade Rodríguez1*, Jaime Canul Ku2, Iran Alia Tejacal1,

Antonio Castillo Gutiérrez3, Jesús Vargas Araujo1


Agropecuarias, 62209, Col. Chamilpa, Cuernavaca Mor. Tel. y Fax. 01(777) 3297046.


3 Instituto Profesional de la Región Oriente. Universidad Autónoma del Estado de Morelos.


RESUMEN

Aunque la nochebuena es una planta nativa de México, el mejoramiento genético se

ha efectuado en otros países. Sin embargo, en el Instituto de Nacional de

Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias del estado de Morelos se realizó

hibridación entre plantas de nochebuena silvestre con la variedad comercial Prestige

early, se obtuvieron ocho familias F1, en las cuales es necesario comprobar tal

hibridación, al comparar la relación genética que existe entre la progenie y sus

progenitores. El objetivo de este estudio fue verificar el origen híbrido de plantas F1

obtenidas del cruzamiento de nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige early’,

mediante el uso de marcadores moleculares RAPD. Se hizo extracción de ADN puro

de 37 plantas F1; así como, de tres muestras de los progenitores. Se realizaron

amplificaciones de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa con 10

iniciadores RAPD. Los fragmentos generados por los iniciadores mostraron alto


53

polimorfismo (37 a 56%) y permitieron identificar como híbridas a las 37 plantas F1

estudiadas. El iniciador de mayor utilidad fue el 2 cuya secuencia fue 5’ CAA TCG

CCG T 3’. Además, se identificó que las plantas de la familia 1 tuvieron mayor

similitud genética con el progenitor macho ‘Prestige early’.

Palabras clave: Hibridación, similitud genética, fragmentos marcadores

SUMMARY

Although the poinsettia is a native of Mexico, genetic improvement has been made in

other countries. However, in National Institute for Forestry, Agriculture and agriculture

in the state of Morelos hybridization was performed between wild plants poinsettia

with commercial variety ‘Prestige early’ eight families F1 in which it is necessary to

check such hybridization were obtained, comparing genetic relationship between

progeny and their progenitors. The aim of this study was to verify the origin of plants

F1 produced by crossing wild poinsettia by variety ‘Prestige early’ using molecular

markers RAPD. Pure DNA extraction of 37 F1 plants and three samples of the parents

were made. Were performed amplifications DNA using the chain reaction of the

polymerase with primers RAPD. The fragments generated by primers showed high

polymorphism (37-56%) and helped identify as hybrid F1 at 37 plants studied. The

most useful initiator was two whose sequence was 5 'CAA TCG CCG T 3'. In addition,

it was found that plants from family 1 had greater genetic similarity to the male parent

‘Prestige early’.

Key words: Hybridization, genetic similarity, fragments markers.

54

INTRODUCCIÓN

México es el centro de origen de la nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex

Klotzsch), esta especie se distribuye desde el litoral del Océano Pacifico hasta

Guatemala (Steinmann, 2002). La nochebuena fue introducida a los Estados Unidos

por Joel Robert Poinsett en 1825 (Lee et al., 2004). Ecke et al. (2004) reportan que

Robert Buist fue quien la vendió como planta ornamental por primera vez en el año

1834. En México, los principales estados donde se produce planta de nochebuena

son Jalisco, Michoacán, Morelos, Oaxaca y Puebla, así como el Distrito Federal

donde se destinan 252.48 h-1 a la producción, con un valor de $431,315.33 pesos de

la producción. Morelos destina a la producción 97.5 h-1 con un valor de $142,518.85

pesos de la producción (SIAP, 2012).

En los últimos años, los mejoradores han puesto en el mercado variedades

mejoradas con gran diversidad en colores (rosa, variegado, mármol y bicolores) y

tamaños de brácteas, éstas variedades se generaron por diversos métodos de

mejoramiento genético como son hibridación, selección y mutagénesis con rayos X o

rayos gama (Starman, 1999).

Para generar variabilidad en esta planta ornamental se han utilizado diversos

métodos desde el más sencillo, que es la hibridación hasta llegar a la biotecnología,

pero uno de los más importantes y que ha dado buenos resultados es la hibridación.

Después de obtener la progenie por hibridación es necesario identificar si ésta

presenta características de ambos progenitores o de alguno de ellos, principalmente

las de interés para el fitomejorador.

Existen varias formas para identificar a los híbridos entre las que destacan los

marcadores morfológicos y moleculares a nivel de ADN (ácido desoxirribonucleico).

Los marcadores morfológicos son fáciles de realizar y de bajo costo, pero son

afectados por el medio ambiente. Bajo este contexto, los marcadores moleculares

representan una alternativa más confiable, aunque sean costosos y se requiera de

equipo especializado (Hebert et al., 2003).

55

Los marcadores moleculares se han utilizado en estudios de diversidad genética intra

e inter poblacional en especies silvestres, cultivadas o mejoradas, para el desarrollo

de mapas de ligamiento y de las relaciones filogenéticas entre especies (Azofeifa-

Delgado, 2006), hoy en día son la principal herramienta empleada en

microorganismos, animales y plantas para la identificación de genotipos, determinar

la pureza, caracterización de germoplasma, asistir el mejoramiento genético e

identificación de genes específicos para realizar la recombinación genética (Sánchez,

2002).

Las variaciones en los marcadores de ADN no se muestran por sí mismas en el

fenotipo, porque pueden ser diferencias en un solo nucleótido o en un fragmento de

ADN repetitivo. La mayoría de los marcadores moleculares se clasifican en dos

categorías, las técnicas que se basan en la hibridación, o aquellas que emplean la

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR); la introducción de esta tecnología

permitió nuevas posibilidades para la detección del polimorfismo genético. El

polimorfismo se observa debido a que la variación en la secuencia del genoma altera

los sitios de reconocimiento del iniciador, permite la generación de grandes números

de marcadores; su utilización no es técnicamente difícil y solo utiliza mínimas

cantidades de material genético. Los marcadores de PCR emplean iniciadores de

secuencia arbitraria, semiarbitraria o específica (Velasco, 2005). Los marcadores

moleculares son una herramienta útil para analizar directamente el ADN, sin la

influencia del ambiente u otros factores.

La técnica RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar) se emplea para la

identificación de híbridos. Pillay et al. (2000) utilizaron este marcador para la

identificación de genes ligados a los genomas A y B de Musa spp; Göntér et al.

(2002) indican que los RAPD fueron de utilidad para la detención de híbridos

somáticos de trigo con maíz, Cheng et al. (2004) usaron ésta técnica para la

identificación de híbridos somáticos en productos de fusión de trigo con Agropyron

elongatum, Crouch et al. (2000) emplearon los RAPD como una técnica de análisis

de diversidad genética en variedades de Musa spp.

56

Como ya se indicó, aunque la nochebuena es una planta nativa de México el

mejoramiento genético se ha efectuado en otros países. Sin embargo, en el Instituto

de Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias del estado de

Morelos se realizó hibridación entre plantas de nochebuena silvestre con la

variedad comercial ‘Prestige early’, se obtuvieron ocho familias F1, a las cuales es

importante comprobar su origen híbrido.

Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue verificar el origen híbrido de plantas F1

obtenidas del cruzamiento de nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige early’,

mediante el uso de marcadores moleculares RAPD.


Localización

La investigación se realizó en el laboratorio de Producción Agrícola del Campo

Experimental de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma

del Estado de Morelos, con ubicación geográfica de 18° 58’ 54.71’’ LN, 99° 13’

59.14’’ LO y 1876 msnm.

Material vegetal

Se utilizaron ocho familias de plantas F1 provenientes de cruzamientos entre

nochebuena silvestre y la variedad comercial ‘Prestige early’, previamente

seleccionadas de manera visual, ya que presentaron diferencias morfológicas con

relación a sus progenitores o bien fueron similares con el progenitor masculino. En

total se estudiaron 37 plantas F1 más 3 muestras de las plantas progenitoras.

57

Extracción de ADN genómico

Se utilizaron segmentos de hojas jóvenes y sanas, eliminando las nervaduras. Se

pesaron 100 mg en condiciones asépticas, se colocaron en tubos eppendorf de 1.5

mL y se almacenaron a -20 °C en un congelador hasta la extracción de ADN.

La extracción de ADN se basó en el método descrito por Andrade et al. (2005) con

algunas modificaciones. Las hojas se molieron en morteros de porcelana (congelados

y esterilizados) con nitrógeno líquido hasta obtener polvo fino, el cual se colocó en un

tubo eppendorf de 1.5 mL y homogenizado con 900 µL de amortiguador de

extracción de ADN (5% (w/v) CTAB (hexadeciltrimetil-amonio bromuro), 100 mM Tris-

HCI pH 7.5, 10 mM EDTA (ácido ethilenediaminotetracetico, sal disodio, dihidrato-

Na2), 0.7 M NaCl, 5% (w/v) sarcosil, 140 mM 2-mercaptoetanol) y calentado por 30

min a 65 °C. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, después se aplicó

cloroformo: alcohol isoamílico (24:1 v/v) y se centrifugó a 12 000 rpm por 8 min. El

sobrenadante se transfirió a otro tubo eppendorf esterilizado y se realizó una

segunda extracción de ADN con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1

v/v) y centrifugado a 12 000 rpm por 8 min, se realizó una tercera extracción de ADN

con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y se agregó 0.1 volumen de

CTAB [10% (w/v) CTAB, 0.7 M Na Cl].

Para la precipitación del ADN, el sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf

esterilizado, se agregó un volumen de amortiguador de precipitación [1% (w/v)

CTAB, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA] y después se centrifugó a 10 000 rpm

por 5 min. El sobrenadante se desechó y la pastilla o “pellet” obtenida se disolvió en

500 µL de solución TE alto en sales (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 M NaCl)

más 75 µL de cloruro de sodio 5 M calentado a 65 °C. Después de enfriar a

temperatura ambiente, el ADN se precipitó agregando 800 µL de etanol frío y luego

fue centrifugado a 12 000 rpm por 5 min, el sobrenadante fue desechado. El ADN se

lavó con 700 μL de etanol al 70% frío y centrifugando a 12 000 rpm por 5 minutos. El

procedimiento de lavado se repitió con 400 mL etanol puro frío y nuevamente

centrifugado a 12 000 rpm por 5 min, el sobrenadante se eliminó y se dejó que el

58

etanol se evaporara completamente. El ADN resultante fue disuelto en 30 μL de 0.1

TE (1 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA) con 20 ng μL−1 de Ribonucleasa (SIGMA),

incubándose a 37.5 °C por 40 min. El ADN se almacenó a -20 °C.

Evaluación de la calidad de ADN

La integridad de ADN extraído fue determinada mediante separación de fragmentos

por electroforesis en gel agarosa ultrapura (Invitrogen®) al 0.8%, el gel fue teñido con

bromuro de etidio, EDTA] (Andrade et al., 2005). La electroforesis se realizó por 2

horas a 80 volts en cámara de electroforesis (Apollo® Mod. 75-2321) con

amortiguador TAE 1X [0.04 M Tri-Base, 0.1142% (v/v) ácido acético glacial, 1 mM. El

gel se visualizó en un transiluminaror con luz ultra violeta y se fotografió.

Concentración de ADN

La concentración de ADN se estimó con lectura a densidad óptica (DO) de 260 nm,

la relación entre las lecturas de absorción a 260 y 280 nm (DO260/280) permitió

determinar la pureza. La cuantificación se realizó en espectrofotómetro (HACH®

Mod. DR 5000). Para estimar la concentración de ADN genómico (1.8 a 2.0 ng/µL),

se utilizó la fórmula:

Concentración de ADN (µg µL-1)= DO260 X 100 (factor de disolución) X 50 µg/mL

1000

Amplificación de ADN mediante RAPD

Para la identificación de híbridos se seleccionaron diez iniciadores RAPD, con una

secuencia aleatoria de diez oligonucleótido, de acuerdo a los trabajos realizados por

Ling (1997) y Galindo (2010) mismos que se muestran en el Cuadro 14.

59

Cuadro 14. Iniciadores utilizados en la reacción de amplificación de ADN para la identificación de híbridos de nochebuena.

Iniciador Clave Secuencia de bases

1 7 5’ GAA ACG GG T G 3’

2 11 5’ CAA TCG CCG T 3’

3 12 5’ TCG GCG ATA G 3’

4 26 5’ TGC TCT GCC C 3’

5 27 5’ GGT GAC GCA G 3’

6 30 5’ CTG CTG GGA C 3’

7 31 5’ GTA GAC CCG T 3’

8 46 5’ GAA CGG ACT C 3’

9 49 5’ CTC ACC GTC C 3’

10 53 5’ AAG CCT CGT C 3’

La mezcla de reacción estuvo constituida por 4 µL de ADN molde (20 ng µL-1) y 2 µL

de iniciador (10 pmol mL-1), 10 µL de dNTPs (5 µM de cada dNTPs), 2 µL de

amortiguador de carga (buffer PCR), 1.5 µL de cloruro de magnesio (MgCl, 75 mM),

4.7 µL de agua destilada deionizada estéril, y por último 0.3 µL (1.5 U) de enzima

Taq ADN polimerasa (Thermus aquaticus) por cada muestra. La ampliación del ADN

genómico se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un

termociclador (Techne® Mod. TC-412), la cual comprendió un ciclo de pre-

desnaturalización de ADN a 94 °C por 4 min y 36 ciclos integrados: 1 min a 94 °C

para separar las hélices de ADN, 1 min a 36 °C para alineación del iniciador, 2 min a

72 °C para la polimerización de ADN y un ciclo de extensión final de 10 min a 72 °C.

60

La separación de fragmentos amplificados se hizo por electroforesis en gel de

agarosa al 1.5% (w/v) (Invitrogen®), la cual se disolvió en 250 mL de TAE 1X y se

añadieron 13 µL de bromuro de etidio, se usó una cámara de electroforesis (Apollo®

Mod. 75-2321) con amortiguador TAE 1X [0.04 M Tris-Base, 0.1142% (v/v) ácido

acético glacial, 1 mM EDTA]. La electroforesis se corrió a 80 volts por un periodo de

3.5 horas. En el primer carril se colocó la escalera de ADN (kb ladder plus ADN,

Invitrogen®), la cual se utilizó para estimar el peso de las bandas de ADN de los

productos amplificados. Los geles fueron fotografiados en el fotodocumentador y se

obtuvieron los tamaños de los fragmentos generados por los RAPD, utilizando el

programa Genetools®.

Análisis de datos moleculares

El análisis de datos moleculares para la evaluación de los híbridos se realizó

comparando los patrones de bandeo, como presencia (1) y ausencia (0) de bandas,

de los progenitores y la plantas F1. Con esta información se construyó una matriz de

similitud empleando el coeficiente de similitud desarrollado por Dice (1945). Los

valores de dicho coeficiente se calcularon mediante la expresión: coincidencias

(coincidencias + no coincidencias) entre RAPD. Con estos datos se realizó un

análisis de grupos (clúster) usando el método UPGMA (unweighted pair-group

method arithmetical averages) (Rolf, 1972) del programa de computo NTSYS

(Applied Biostatistic Inc; NY USA). Con los resultados de dicho análisis se construyó

un dendrograma.


Todos los iniciadores utilizados en la amplificación de ADN generaron bandas

monomórficas y polimórficas; en total fueron 101 bandas, de las cuales 49% fueron

polimórficas. El iniciador 5 con la secuencia 5’ GGT GAC GCA G 3’ amplificó el

mayor número de fragmentos de ADN (Figura 9), de la cuales 46% fueron

polimórficas; sin embargo, el iniciador 8 con la secuencia 5’ GAA CGG ACT C 3’ fue

61

el que tuvo el mayor porcentaje de polimorfismo (Cuadro 15). En este estudio el

porcentaje de polimorfismo varió de 37 a 56% y fue mayor a lo reportado por Ling

(1997) en la identificación de nueve cultivares comerciales de nochebuena, ya que

obtuvo 48 bandas en total y polimorfismo de 33%; de igual modo Starman (1999) al

investigar las relaciones estrechas entre 11 cultivares de nochebuena solo obtuvo

31% de bandas polimórficas.

Todas las plantas F1 estudiadas fueron identificadas como híbridas dado que

generaron bandas similares al progenitor macho, mismas que no estuvieron

presentes en el progenitor femenino. Sin embargo, ningún iniciador generó las

bandas necesarias para corroborar el origen de las 37 plantas estudiadas.

Cuadro 15. Bandas totales, polimórficas y porcentaje de polimorfismo para la identificación de plantas hibridas de nochebuena mediante RAPD.

Iniciador-Clave Secuencia de bases Bandas totales

Bandas polimórficas

Porcentaje de polimorfismo

1-7 5’ GAA ACG GG T G 3’ 10 5 50

2-11 5’ CAA TCG CCG T 3’ 11 6 55

3-12 5’ TCG GCG ATA G 3’ 9 4 44

4-16 5’ TGC TCT GCC C 3’ 11 5 45

5-17 5’ GGT GAC GCA G 3’ 13 6 46

6-20 5’ CTG CTG GGA C 3’ 8 3 37

7-21 5’ GTA GAC CCG T 3’ 10 5 50

8-36 5’ GAA CGG ACT C 3’ 9 5 56

9-39 5’ CTC ACC GTC C 3’ 12 6 50

10-43 5’ AAG CCT CGT C 3’ 8 4 50

Total 101 49

62

Figura 9. Amplificaciones de ADN de las familias 1 y 7 obtenidas con el iniciador 2 (5’ CAA TCG CCG T 3’), kb: escalera molecular, M: progenitor femenino, P: progenitor masculino, F1: familia 1, F7: familia 7. Las flechas indican las bandas que comparten las familias con el progenitor masculino.

El tamaño de los fragmentos que fueron útiles para identificar el origen híbrido de las

plantas varió de 300 pb a 2500 pb. El iniciador 2 y 5 fueron los que generaron mayor

número de bandas que permitieron identificar el origen híbrido de las plantas de todas

las familias. También el iniciador 2 junto con el 3 fueron los que identificaron plantas

hibridas en 6 de las 8 familias estudiadas, con al menos 3 fragmentos. Los diez

iniciadores fueron de utilidad para corroborar que las seis plantas de la familia 1 tuvieron

como padre a ‘Prestige early’ (Cuadro 16), los iniciadores 2 y 4 fueron los que

contribuyeron con mayor número de bandas para hacer la identificación.

Como se observa en el Cuadro 3, la familia 1 con seis plantas fue la que presento

mayor número de bandas similares al progenitor macho (40); en tanto que, el menor

número de bandas fue generado por la familia 6 con 16 bandas similares a dicho

progenitor. Esta condición de similitud de bandas con el progenitor macho permitió

63

corroborar que se dió la hibridación entre el genotipo silvestre y la variedad ‘Prestige

early’.

Con el coeficiente de Dice (1945) se construyó el dendrograma, en donde se

formaron 7 grupos a una distancia de 0.35. El grupo uno reunió a las familias 1 y 7,

más el progenitor masculino (‘Prestige early’), esto indica que estas familias tienen

mayor similitud genética con dicho progenitor, dado que generaron 99 y 58 bandas

respectivamente con los diez iniciadores. El segundo y tercer grupo lo conformó la

familia 3, para esta familia el iniciador 9 genero el mayor número de bandas similares

(23) a su progenitor masculino con la secuencia 5’ CTC ACC GTC C 3’. En el cuarto

grupo se integró la familia 4, en el quinto grupo la familia 2, en el sexto grupo la

familia 5 y 4 y en el séptimo grupo las familias 6 y 8 que son las más alejadas del

progenitor masculino debido a que comparten menor número de bandas (Figura 10).

No obstante, que las 37 plantas fueron identificadas como híbridas, los miembros de

la familia1 mostraron mayor similitud genética con ‘Prestige early’, en tanto que las

plantas de las familias 6 y 8 fueron las menos similares.

64

Cuadro 16. Bandas similares al progenitor macho para la identificación de híbridos de nochebuena mediante RAPD.

Número de plantas por familia. F1=6, F2=4, F3=10, F4=7, F5=2, F6=1, F7=4, F8=3

Iniciador y clave Secuencia Banda marcadora (pb)/plantas identificadas por familia

1-7 5’ GAA ACG GG T G 3’

F1 (1000/6, F2 (1400/3, 900/1), F3 (1600/4, 900/7), F4 (700/3), F6 (1700/1),

F7 (1400/1, 700/2), F8 (1600/2,1400/3, 1000/1, 900/1, 700/2).

2-11 5’ CAA TCG CCG T 3’

F1 (2500/5, 1200/5, 800/2, 700/2, 500/6, 300/6) F2 (2100/1, 800/4, 500/1),

F3 (2500/4, 2100/1, 800/2, 700/4, 600/7), F4 (2500/2, 1200/1, 600/5),

F5 (2500/1, 2100/1,600/1), F6 (1200/1, 700/1), F7 (2500/1, 1200/1, 800/1),

F8 (700/2).

3-12 5’ TCG GCG ATA G 3’ F1 (2300/1, 1800/4, 1600/6, 1400/6, 300/4), F2 (1800/1, 1400/3, 400/2),

F3 (2300/3, 1800/3, 1400/7), F4 (1800/2, 1400/4, 400/3), F5 (1800/1, 1400/1),

F6 (1600/1, 1100/1, 400/1), F8 (1600/2, 1400/2, 1100/3, 400/2).

4-26 5’ TGC TCT GCC C 3’ F1 (2300/3, 1900/6, 1500/1, 300/5, 1000/6, 800/6), F2 (1300/4, 800/4, 500/1),

F3 (2300/2, 1500/3), F4 (1900/1), F7 (2300/3, 1900/3).

5-27 5’ GGT GAC GCA G 3’ F1 (1400/5, 1100/5, 1000/2, 400/5), F2 (2500/3, 1300/1, 1000/2, 800/4),

F3 (800/4, 400/8), F4 (2000/2, 1700/2), F5 (1700/2), F6 (1700/1, 1000/1,

700/1), F7 (2500/4, 2000/4, 1300/3, 1000/4, 800/2,400/4), F8 (2000/1,

1700/1, 700/2).

6-30 5’ CTG CTG GGA C 3’ F1 (1800/6, 1600/5, 1100/4, 1000/6), F2 (1400/2, 1000/2), F3 (1400/6,

1200/4), F4 (1400/5, 1200/1), F5 (1400/2, 1200/2), F8 (1800/1).

7-31 5’ GTA GAC CCG T 3’ F1 (2200/6, 1300/2, 1100/4, 900/6), F2 (1500/2, 600/4), F3 (1500/7, 900/1,

600/4), F4 (1500/2, 900/5, 600/6), F5 (1500/1, 900/1, 600/1), F6 (1100/1,

600/1), F8 (1500/1, 1100/1).

8-46 5’ GAA CGG ACT C 3’ F1 (2100/6, 1600/6, 400/6), F2 (1800/1, 1600/1, 1000/4, 500/1), F3 (1000/7),

F4 (900/3), F5 (900/2), F6 (1800/1, 1000/1, 700/1), F7 (2100/4, 1800/4,

1000/4), F8 (1800/3, 1000/3, 700/3).

9-49 5’ CTC ACC GTC C 3’ F1 (1500/1, 1300/1, 1100/1, 400/6), F2 (1100/2, 800/3), F3 (1100/4), F4

(1300/1, 1100/3), F5 (1500/1, 1100/1), F6 (1300/1, 1100/1), F7 (1500/4,

1300/2), F8 (1300/3, 1100/1, 600/3).

10-53 5’ AAG CCT CGT C 3’ F1 (1700/6, 1200/6, 800/3, 500/6, 300/3), F2 (2100/4, 800/4), F3 (2100/4,

800/7), F4 (900/1, 800/4), F5 (1700/1, 900/1), F8 (900/2, 500/1).

65

Figura 10. Agrupamiento entre familias de medios hermanos de nochebuena utilizando el análisis de agrupamiento UPGMA basado en el coeficiente de Dice (1945), tomando como referencia 101 fragmentos RAPD.

66

CONCLUSIONES

Los fragmentos generados por los iniciadores usados permitieron identificar como

híbridas a las 37 plantas F1 estudiadas.

Los diez iniciadores RAPD fueron útiles para identificar que las plantas de la familia 1

tienen mayor similitud genética con el progenitor macho ‘Prestige early’.

AGRADECIMIENTOS

El primer autor, agradece al CONACYT el apoyo otorgado mediante la beca 261446

para la realización de estudios de maestría en ciencias.

67

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69

CONCLUSIONES GENERALES

Se determinaron las bases científicas para realizar hibridación entre genotipos de

nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige early’, mediante la aplicación de

técnicas de emasculación, hora adecuada para realizar las polinizaciones, pruebas

en receptividad de estigma y viabilidad de polen. Se concluye que el tipo de

emasculación con la remoción parcial de las anteras antes de la antesis fue la que

generó mayor cantidad de frutos cosechados y por lo tanto mayor número de

semillas. La hora más adecuada para realizar polinización fue a las 11:00 de la

mañana, donde las condiciones de temperatura y humedad relativa fueron óptimas

(27 °C y 39% HR, respectivamente).

La identificación de híbridos mediante marcadores morfológicos en la progenie F1

resultado de los cruzamientos entre nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige

early’ fueron de utilidad, ya que se determinaron características en la progenie que

son similares a las del progenitor macho, lo que nos indica que se dió la hibridación

entre el genotipo silvestre y la variedad mejorada. Se encontró que cinco de las

familias de medios hermanos comparten mayor similitud con el progenitor macho.

Los diez marcadores moleculares RAPD utilizados en la identificación de híbridos

entre nochebuena silvestre y la variedad comercial ‘Prestige early’, fueron de utilidad,

ya que se encontró que la progenie comparte fragmentos de ADN de diferente peso

molecular con el progenitor masculino, lo que confirma a un nivel más confiable que

existió la recombinación de genes entre el genotipo silvestre y la variedad comercial.

70

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