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CICY CIENCIAS

( BIOLÓGICAS

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias Biológicas

MEJORAMIENTO DEL PROCESO DE MICROPROPAGACIÓN DE Cocos nucifera,

MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL E IMÁGENES

TERMOGRÁFICAS

Tesis que presenta

GUSTAVO ALBERTO RIVERA SOLÍS ~~ CICY ... ~ .... '1ir"

En opción al título de

UNIDAO DE 1310TECNOLOBIA

MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

Opción: Biotecnología

Mérida, Yucatán, México

enero de 2013

CICY RECONOCIMIENTO

POSGRADO EN

CIENCIAS () BIOLOGICAS

Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis

titulado: "Mejoramiento del proceso de micropropagación de Cocos

nucifera, mediante la utilización de biorreactores de inmersión

temporal e imágenes termográficas" fue realizado en los

laboratorios de la Unidad de Biotecnología del Centro de

Investigación Científica de Yucatán, A.C. bajo la dirección del Dr.

Carlos Mariano Oropeza Salín y del Dr. Manuel Luis Robert Díaz,

dentro de la Opción biotecnología, perteneciente al Programa de

Posgrado en Ciencias Biológicas de este Centro.

Atentamente,

Dr. elipe Vázquez Flota

Coordinador de Docencia

Centro de Investigación Científica de Yucatán, AC.

¡¡

¡¡¡

Mérida, Yucatán , México, enero de 2013

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para

desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación

Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los

servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos

de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial , le pertenece

patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya

manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le

pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C., y en el mismo

tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos

tecnológ icos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley

Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial , en el tenor de lo

expuesto en la presente Declaración .

C\.Q. S$-Firma:-----~---==:.,~~-~~~-~'-------Nombre: Gustavo Alberto Rivera Solís

iv

AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Investigación Científica de Yucatán , por el apoyo para realizar mis estudios

de Maestría, así como por el préstamo del conocimiento de su personal y de la

infraestructura para realizar este trabajo.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por el apoyo al proyecto "Escalamiento del

proceso de micropropagación de diferentes genotipos de cocotero resistentes al

amarillamiento letal" con clave interna 60212. Así como por la beca de manutención para

el estudiante.

A mis asesores, Dr. Carlos Mariano Oropeza Salín y Dr. Manuel Luis Robert Díaz por su

dirección y apoyo durante el desarrollo de este trabajo.

Al comité tutorial , integrado por Dr. Carlos Mariano Oropeza Salín, Dr, Manuel Luis

Robert Díaz, Dr. Luis Alfonso Sáenz Carbonell y Dr. Alfonso Azpeitia Morales, por sus

valiosos comentarios , siempre constructivos, para mejorar este trabajo y mi formación

académica.

Al comité revisor de la tesis , Dr. Carlos Mariano Oropeza Salín , Dr. Manuel Luis Robert

Díaz, Dr. Luis Alfonso Sáenz Carbonell , Dr. Gregario Godoy Hernández y Dr. José Carlos

Cervera Herrera por las observaciones y recomendaciones emitidas para mejorar y

enriquecer este documento.

Al Dr. José Carlos Cervera Herrera, por la colaboración , préstamo de equipo , orientación

e incluso trabajo hombro a hombro durante parte importante de este proyecto.

A lng. José Lu is Chan Rodríguez e lng. Ramón Guillermo Rodríguez Martínez por el

entrenamiento, supervisión y colaboráción en el Laboratorio de Micropropagación Clonal.

Al personal del laboratorio de cocotero por su colaboración en aspectos técnicos y

logísticos que permitieron que desarrollara este trabajo.

A los compañeros y amigos del laboratorio (Ana, Candy, Carlos, Carmen, Celso, Damaris,

Gaby, Germán, Goretty, lván, Manuel, Mary, Nallely, Rafael y Yajima) por su los buenos

momentos compartidos y los consejos recibidos.

A Gabriela Sandoval Cancino y Carlos lván Cruz Cárdenas por su apoyo y largas pero

agradables y siempre productivas horas de discusión sobre este trabajo.

vi

DEDICATORIA

A la más ancestral forma de vida, que sin restricciones filosóficas, nos hace a todos hermanos.

A mis amigos, a aquellos que me han acompañado gran parte de mi vida, a los que han marchado lejos y al maravilloso y tan diverso grupo de personas que he conocido durante esta etapa de la vida.

A mi familia, que me ha moldeado como la persona que soy, y que ha conformado la más impenetrable de las fortalezas y el más cálido de los hogares.

A ti que llegaste a mi vida para hacerme crecer, a brindarme las más grandes alegrías con tu sonrisa y las más aterradoras preocupaciones con tus lágrimas, a enseñarme a vivir la vida como viene, a impulsarme a retar mis límites. A ti que día a día me enseñas una nueva lección, tal como lo haces ahora, que abrazado a mi cuello y dormido en mi pecho me explicas que, a pesar de lo que diga Newton, eres tú quien descansando tus 10 kilogramos sobre mis hombros, ejerce la fuerza necesaria para mantenerme en pie ... sé pronto podremos despegar.

Leonardo Alberto: Te amo.

A lo que venga ...

viii

Índice

ÍNDICE

Resumen .......... .... ...... ......... ..... .. ... ........................ ..... .. ... ..... ........................... .... .... ... ... ... . 1

Abstract ........ ... ..... ... .... .. ..... ...... ..................... ....... ....... ..... ... ............... ... .. ...... .. ... ....... .. ...... 3

Introducción ........................ .... ........... ..... .... .. ............ ......................................................... 5

Capítulo 1 ......... .......... ......... .. ......... .. ................ .. .. ... ....... ....... ... ... .............. .. .... .. ................. 7

1.1 ANTECEDENTES GENERALES ......... .... .................... .. ............ .. ..................... 7

1.1.1 Especie de estudio ..... .... ........ .... ... ... .... ...... .. .. ....... .. .. .. ........ ..... .......... 7

1.1.2 Importancia del cocotero ...... ... ............................. .. ... ... .. .................... 7

1.1.3 Problemática del cocotero ......... .. ... ... ... ......................... .. .. ... ........ ..... . 9

1 .1.4 Estado de la micropropagación del cocotero .. .. .. .............................. 11

1.1.5 Biorreactores de inmersión temporal .... ............. ..... .................... .. .. .. 13

1.1 .6 Imágenes termográficas ........ .. ...... ..... .... ... ..... ........... ... ........ ... .. .... ... 16

1.2 Hipótesis ............................... ... .. ... .. ........ ........................ ..... .................. ..... .... 19

1.3 Objetivos ..... .... .... ... ... ........ .. ... .. .... ... .. ....... ... ... ... .... .. ....................................... 20

1.3.1 Objetivo general ... .. ...... .. .... ... .... .. ..... ....... ...... .... .. ...... ........... .... ..... ... 20

1.3.2 Objetivos particulares ... ............................. ... .... ... .... .. .. .. ................... 20

1.4 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL .......... .. ....... .... ..... ... .. .... ... ...... ...................... 21

1.4.1 Evaluación del uso de biorreactores de inmersión temporal para

promover la eficiencia de la obtención y germinación de embriones

somáticos, así como del desarrollo de plántulas de C. nucífera, a partir de

callos embriogénicos obtenidos in vitro .. ....... .. .......................................... 21

1.4.2 Evaluación del uso de imágenes termográficas para la selección de

plantas de C. nucifera, obtenidas in vitro , que posean mayor potencial de

productividad ........ .... .. ..... ... .. .... .... ..... ....... ... ... .. .. ..... .. .. .. .... ..... ... .. ..... ..... ... . 23

X

Índice

1.5 REFERENCIAS ... .. ............................. ... .............. ...... .. .. ..... .. ..... ............. .... .... 24

CAPÍTULO 11 .. .. .. ..... ...... .. ...... ...... .... ..................... ................. .... .. ....... .... .................. .... 29

2.1 INTRODUCCIÓN .... .. .... ....... .. ............. ....... ....... ............... :·· ··· ······· ··· ······ ········· 29

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ................. .. ......... .. ........................ ... ... ..... ..... ... .. 30

2.2.1 Obtención de callo embriogénico ........... ...... ........... ............... .. ........ 30

2.2.2 Obtención de plántulas ... ......... ...... ... ...... .... .... .. ... ... .... ... .... .... ........ ... 32

2.2.3 Diseño de biorreactores ........ ................ ................. .. .......... ........ ...... 33

2.2.3.1 Biorreactor para embriones somáticos ._. ..... ..... ... .. ... ..... ...... 34

2.2.3.2 Biorreactor para plántulas ............ .... ...... .... ...... ............ ...... 35

2.2.4 Montaje experimental ........... ....... .. .. ..... ... ............................ .... ........ . 36

2.2.4.1 Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis

somática ....... ..... ........ ..... ..... .... .... ........... ....... ......... .... ...... ... .. ........ 36

2.2.4.2 Efecto de la inmersión temporal sobre el crecimiento y

desarrollo de plántulas ............................ ...... ...... ....... .. ..... ...... ....... 37

2.3 RESULTADOS ......... ... .. ... ............ .. .. ... ..... ......... ...... .. ... ..... ...... .... ................. .. 37

2.3.1 Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis somática .. . 37

2.3.2 Efecto de la inmersión temporal sobre el crecimiento y desarrollo de

plántulas ........ ............... ...... ........ .. ...... ........... ....... .. ... .. ............... .. ..... ..... .. 38

2.4 DISCUSIÓN ................................................. ... ... .. ..... ........ .......... ..... ......... ..... 42

2.4.1 Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis somática ... 42


plántulas ..... ......... ... .......... .... ....................... .. ... ....................... .... .... .. ... .... 45

2.5 CONCLUSIONES .. .... ....... ...... .... ... ... ............ ... ............ ........ ............... ..... ....... 48

2.5.1 Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis somática ... 48

xi

Índice


brotes ........................................................................................................ 48

2.6 REFERENCIAS ... .............. .............. ... .............. ... .... ..... .................................. 49

CAPÍTULO 111 ......... ... ...... .... ................... .... .. .... ............. ...... .. ...... .................... ................. 53

3.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 53

3.2 MATERIALES Y MÉTODOS .......................... ........................................................ 55

3.3 RESULTADOS .............................................................................................. ... ..... . 55

3.4 DISCUSIÓN .. ........... ....... .. .. ............ .. ... ................. ................. .. ... ...... .. ....... ............ 60

3.5 CONCLUSIONES ...... .................. .......... ... .................... ......................................... . 62

3.6 REFERENCIAS ... ......... .......... ... ............ .. ... ... ... .............. ... ............. ... ............... ... ... 63

CAPÍTULO IV .................................................................................................................. 65

4.1 DISCUSIÓN GENERAL .......................... .... .......................................... .. ............... 65

4.2 CONCLUSIONES GENERALES ........ .......................................... ............ ............ .. 70

4.3 PERSPECTIVAS ...... .... ..... ... ....... ........... ...... ........... ..... .. ......... .. .... ..... ...... ..... ......... 72

4.4 REFERENCIAS ...................................................................................................... 73

xii

Índice

xiii

LISTADO DE ABREVIATURAS

IRGA

AL

pH

RITA

BioMINT

SyB

ANOVA

NaCIO

2,4-D

6-BAP

PPFD

LSD

Trmmol

WUE

Listado de abreviaturas

lnfrared Gas Exchange Analyzer

Amarillamiento Letal

Potencial de Hidrógeno

Récipient a lmmersion Temporaire Automatique

Biorreactor Modular de Inmersión Temporal.

Sube y Baja

Análisis de Varianzas

Hipoclorito de Sodio

ácido 2,4 Diclorofenoxiacético.

6-Bencilaminopurina

Photosynthetic Photon Flux Density

Least Significant Difference

Transpiración

Water Use Efficiency

xiv

Listado de abreviaturas

XV

Índice de figuras

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1.- Distribución actual del Amarillamiento Letal en las costas de América ...... ... 11

Figura 1.2.- Esquema general de la estrategia experimental para la evaluación del efecto de la inmersión temporal sobre el protocolo de micropropagación de C. nucifera .. ...... .... 22

Figura 1.3.- Esquema general de la estrategia experimental para evaluar la utilidad de la termografía como herramienta para la selección de individuos con mayor potencial de productividad ....... .. ... .. ....... ... .. .. .... ... .. ... ................................................... ............... ........ . 23

Figura 2.1.- Esquema generalizado del protocolo de micropropagación de C. nucifera (Grupo de coco ©) ............ ...... ........ ... .... ...... .......... .. ... .... .... ...... ..... .... .. .. ... ............ .......... . 30

Figura 2.2.- Esquema general del proceso para la germinación in vitre de embriones cigóticos .... ............. ..... ........ .. .... ........... .. .... ........ ... .... ..... .. .... ........................ ........ ...... ...... 32

Figura 2.3.- Vista del Biorreactor MINI y sus componentes. a) Recipiente hermético de 330 mi Good & Good. b) Piezas de pol icarbonato diseñadas para el interior del recipiente. e) Piezas de policarbonato ensambladas formando una cruceta. d) Vista general del reactor ... .. .............. ...... ................. .............. ......... ..... ..... .. ....... ............... ... ... ... ................ . 34

Figura 2.4.- Vista del Biorreactor casero para el crecimiento de plántulas y sus componentes. a) Recipiente hermético de 4700 mi Good & Good. b) Perforación en la tapa para promover el intercambio gaseoso. e) Rejilla Magenta recortada para obtener los compartimientos para el material biológico. d) Vista general del reactor ........ .. .... ........... . 35

Figura 2.5.- Filtros evaluados para mantener la esterilidad del interior del biorreactor: a) filtro swinex 0.221-JM, b) filtro de algodón en el interior de adaptador de cobre tipo "cola de rata", e) Membrana millipore con poro de 0.45 1-JM , d) membrana de polipropileno de 35 1-1M de espesor . .... ... .. .... ... .. ........ ... .. .... ................................. ................ .... ... ... .. .. ....... .... .. 36

Figura 2.6.- Examen visual de los callos embriogénicos expuestos a tratamientos de inmersión temporal. TO representa al testigo ..... ..... ...... .. .... .. ... .. .. .... .......... ...... .. .... .... ...... 38

Figura 2.7.- Se presenta el estado general de plantas sometidas a diferentes tratamientos de inmersión temporal. M.L.= Medio líquido estacionario; S.S. Medio semisólido; T20 '= Inmersión temporal cada 20 minutos; T40 '= Inmersión temporal cada 40 minutos; T60 '= Inmersión temporal cada 60 minutos; T100 '= Inmersión temporal cada 100 minutos; T120 '= Inmersión temporal cada 120 minutos ......... ........................ ..... ... ... .. .. ... .. .... ...... .. 40

Figura 2.8.- Se presenta el efecto que han tenido los diferentes tratamientos de inmersión temporal sobre el crecimiento y desarrollo de plantas de C. nucífera. En el recuadro a se presentan los criterios tomados para colectar los datos. En b, e, d, e y f se representa gráficamente el efecto que han tenido los tratamientos experimentales sobre las diferentes variables medidas. . ...... ... ..... ...... ........ ........... ....... ... .... .. ........ ... ... ..... ....... ..... ... .... .. .. ... .... . 41

xvi

Índice de figuras

Figura 3.1.- Vista panorámica de la muestra experimental. Se puede observar que el área ocupada en la imagen por las estructuras foliares, es mucho mejor que la ocupada por el suelo, es por ello que no es posible trazar una línea que genere un dato único que promedie con certeza la temperatura foliar de cada línea .... .... .. ..... .... ........ ..... ... .. ..... .. .. . 55

Figura 3.2.- Ejemplo de la colecta individual de datos con la cámara termográfica. La colecta de datos se realizó hoja por hoja, como se puede apreciar con las líneas denominadas 1, 2, 3 y 4 ...... ... ..... ..... ....... ....... .... .... ... ...... ....... .. ..... ..... ........ ..... .. ...... ....... .. 55

xvii

Índice de cuadros

INDICE DE CUADROS

Cuadro 1.1.- Valor por tonelada de los principales productos obtenidos a partir de C. nucifera. Asían and Pacific Coconut Community, 2012 ............... .. ....... ..... ... ............ .. ........ 8

Cuadro 1.2.- Contenido nutricional del agua de coco, una bebida deportiva comercial y de una mezcla de aguas de coco proveniente de diversos puntos del mundo .. .. .................... 9

Cuadro 2.1.- Resumen del análisis estadístico LSD, realizado con el paquete estadístico SAS 9.0 . .... ... ........ ..... ...... .. ... ... ... .. .. ..... .... ..... .......... ................. .. .. .... ............................... 39

Cuadro 2.2.- Desglose detallado del costo de la preparación del medio semisólido para la generación y germinación de embriones somáticos ......................................................... 44

Cuadro 2.3.- Desglose detallado del costo de la preparación del medio semisólido para la elongación y enraizamiento de brotes ... .. ......................................................................... 46

Cuadro 3.1.- Resumen de los resultados del análisis estadístico LSD realizado por líneas con los datos obtenidos durante el primer muestreo de la evaluación de la utilidad de la termografía para detectar diferencias en el potencial de productividad . .... ........... .. ...... .... 56

Cuadro 3.2.- Resumen de los resultados del análisis estadístico LSD realizado por individuos con los datos obtenidos durante el primer muestreo de la evaluación de la utilidad de la termografía para detectar diferencias en el potencial de productividad ....... 57

Cuadro 3.3.- Resumen de los resultados del análisis estadístico LSD realizado por líneas con los datos obtenidos durante el segundo muestreo de la evaluación de la utilidad de la termografía para detectar diferencias en el potencial de productividad .. .. .... ..... ... .. .. ... ... .. 58

Cuadro 3.4.- Resumen de los resultados del análisis estadístico LSD realizado por individuos con los datos obtenidos durante el segundo muestreo de la evaluación de la utilidad de la termografía para detectar diferencias en el potencial de productividad ....... 59

xviii

Índice de cuadros

xix

Resumen

RESUMEN

Durante el desarrollo de este trabajo, se evaluó el efecto de 6 tratamientos de inmersión

temporal , los cuales consistieron en dos minutos de inmersión en todos los casos y 20,

40, 60, 80, 100 y 120 minutos de aireación para los diferentes tratamientos, sobre la

inducción de la embriogénesis somática y el crecimiento de plántulas obtenidas de la

germinación in vitro de embriones cigóticos de Cocos nucifera . En ambos casos se

mantuvieron testigos en medio líquido estacionario y en medio semisólido.

Los tratamientos de inmersión temporal probados para inducir la embriogénesis somática,

no fueron exitosos. Después de 30 días, se observó una pérdida generalizada del

potencial embriogénico de los callos sometidos a estos tratamientos y se considera que

para trabajos posteriores es necesario establecer nuevos experimentos donde se evalúen

tiempos de inmersión menores a los probados en este trabajo.

En el caso del crecimiento de las vitroplantas, para todas las variables medidas, con

excepción de la proporción entre la longitud de la raíz y la longitud aérea, el testigo

mantenido en medio semisólido tuvo los valores promedio más elevados. Sin embargo, en

el análisis estadístico, no se detectan diferencias significativas entre los tratamientos

TOSS (testigo en medio semisólido), T60 ', T100 ' y T120 ' (inmersión de 2'cada 60', 100'y

120' respectivamente) en la totalidad de las variables, con lo cual podemos afirmar que,

en general, las plántulas sometidas a tratamientos de inmersión temporal presentaron

mayores tasas de crecimiento que las del testigo mantenido en medio líquido, por lo cual

se puede afirmar que los biorreactores de inmersión temporal pueden ser implementados

como una estrategia viable para incrementar la rentabilidad del proceso sin disminuir su

eficiencia.

Durante este trabajo también se evaluó la util idad de las imágenes termográficas como

herramienta de selección de individuos con elevado potencial productivo, para ello se

utilizaron como referencia parámetros fis iológicos medidos con un analizador infrarrojo de

intercambio gaseoso. Los resultados exhibieron la existencia de diferencias entre las

líneas que se incluyeron en este trabajo, sin embargo, información complementaria sobre

el desempeño de dichas líneas bajo condiciones de campo es requerida para corroborar

la utilidad de las imágenes termográficas como herramienta de selección .

1

Resumen

2

Abstract

ABSTRACT

During the course of this work, the effect of 6 treatments of temporary immersion was

evaluated. These treatments consisted of two minutes of immersion in all cases and 20,

40, 60, 80, 100 and 120 minutes of aeration in each case. Temporary immersion

treatments were applied on the induction of somatic embryogenesis phase and on the

growth phase of plantlets obtained by in vitro germination of zygotic embryos of Cocos

nucifera. In both cases, controls were maintained in stationary liquid medium and

semisolid medium.

Temporary immersion treatments proven to induce somatic embryogenesis were

unsuccessfu l. After 30 days, there was a general loss of embryogenic potential of callus

undergoing these treatments. Based on these results , further work is necessary to

establish new experiments that consider immersion times lower than those tested in this

work.

For the growth phase of vitro-plantlets, in all variables measured, except for the ratio

between the length of the root and aerial length, the control group maintained in semisolid

medium had the highest average values. However, statistical analysis, showed no

significant differences between treatments TOSS (control group in semisolid medium),

T60' , T100', and T120 '(immersion for 2' each 60', 100'y 120 'respectively) for any of the

variables measured. Also, in general terms, those seedlings subjected to temporary

immersion treatments had higher growth rates than the control maintained in liquid

stationary medium, so it can be concluded that the temporary immersion bioreactors can

be implemented as a viable strategy to increase profitability of the process without

reducing its efficiency.

During this work we also evaluated the usefulness of thermographic images as a tool for

selecting individuals with high productive potential , to achieve this goal we used

physiological parameters measured with an infrared gas exchange analyzer (IRGA) as

reference. The results obtained showed the existence of differences between lines in this

study, however, information on the performance of these lines under field conditions is

required to confirm the usefulness of thermal imaging as a screening tool.

3

Abstract

4

Introducción

INTRODUCCIÓN

En 2009, la producción nacional de coco fue valuada en 1,994.4 millones de pesos. Sin

embargo, el área cultivada ha disminuido gravemente a causa de problemas fitosanitarios

y del envejecimiento de las poblaciones. En consecuencia se ha desarrollado un protocolo

para la micropropagación de cocotero, cuya productividad actual es de 98,000 embriones

somáticos por plúmula, no obstante, la tasa de conversión embrión-planta (20%) y las

fases de elongación y enraizamiento aún pueden mejorarse para incrementar la

rentabilidad y eficacia del protocolo. En este sentido, se han reportado mejoras en el

crecimiento y desarrollo de Agave tequi/ana, Capsicum chinense y Cedrela odorata,

aplicando tratamientos de inmersión temporal 3 y además, se considera que

aproximadamente el 65-70% del costo total de la preparación de medio de cultivo,

corresponde a la adición de gelificantes.

Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial del cultivo en medio

líquido, utilizando biorreactores de inmersión temporal, para producir plántulas obtenidas

a partir de brotes de origen cigótico que presenten tasas de crecimiento iguales o mejores

que aquellas obtenidas en medio semisólido, incrementando así, la rentabilidad del

proceso de micropropagación de Cocos nucifera.

Además, resulta de gran importancia asegurarnos de que el material que está siendo

micropropagado, ya sea para restablecer las poblaciones que se han perdido o para

incrementar la cantidad de campos de cultivo destinados a la siembra de palma de coco,

presente características deseables como son la resistencia o tolerancia a estrés biótico y

abiótico, pero también en términos de productividad , la cual debe ser alta, precoz y

estable. Para ello se ha reportado la existencia de relaciones estrechas entre algunos

parámetros fisiológicos como la tasa fotosintética, la conductancia estomática y la

eficiencia del uso de agua, y la productividad , así como también entre la temperatura foliar

y dichos parámetros fisiológicos. Es por ello que en este trabajo, se probó la utilidad de

imágenes termográficas como una herramienta de selección de individuos de C. nucifera,

con elevado potencial productivo.

S

Introducción

6

Capítulo 1

CAPÍTULO 1

1.1 ANTECEDENTES GENERALES

1.1.1 Especie de estudio

El cocotero (Cocos nucifera L.) es una monocotiledónea perenne leñosa, y no es

considerado como un árbol , ya que carece de corteza, no tiene ramificaciones y tampoco

cambium secundario que a su vez pueda generar crecimiento secundario (Ohler, 1999).

Pertenece a la familia arecaceae, subfamilia Arecoideae, tribu Cocoideae, subtribu

Butinae, y es la única especie del género Cocos (Uhl y Dransfield , 1987), presenta una

distribución pantropical ya que puede ser encontrado a lo largo de la costa de casi todos

los países ubicados entre los trópicos de Cáncer y Capricornio (Ohler, 1999) y alcanza

los 20-22 metros de altura y 8-9 metros de diámetro en el follaje cuando son adultos, el

tallo es columnar, recto y puede llegar a medir de 20.3 a 60.9 centímetros de diámetro, las

hojas se encuentran agrupadas densamente en el ápice y en cada axila de las mismas,

existen inflorescencias y racimos de coco en diferentes fases de desarrollo (Woodrof,

1979). El cocotero es comúnmente llamado "el árbol de la vida", debido a que la biomasa

que genera es aprovechable casi en su totalidad y de él se obtienen diversos beneficios

de importancia ecológica, económica y cultural.

1.1.2 Importancia del cocotero

Una producción anual de 594,212,273 toneladas colocan a la nuez de coco como el

vigésimo primer producto agrícola en importancia mundial (FAOSTAT, 2010). Existen más

de 100 productos obtenidos del cocotero, siendo de los más importantes: la copra, el

aceite de coco, la fibra de coco, el carbón virgen y activado, así como la harina y la leche

de coco. Además se obtienen químicos como metil-ésteres, combustible de origen

vegetal , glicerina, y el fruto para el consumo en fresco (CONACOCO, 2008).

El mercado del coco se basa en un aprovechamiento integral y muy rentable, por ejemplo,

en abril de 2012, los precios de algunos de los principales productos provenientes del

coco, de acuerdo a la Comunidad del Coco de Asia y el Pacífico, fueron los siguientes:

7

Cuadro 1.1.- Valor por tonelada de los principales productos obtenidos a partir de C. nucifera. Asian and Pacific Coconut Community, 2012.

Producto

Aceite de coco

Carbón

Coco deshidratado

Copra

Fibra de coco

Nuez de coco

Valor 1 Tonelada (USO)

$2110.00

$390.00

$ 1590.00

$ 822.00

$ 159.00 - $ 641 .00

$271 .00

Capítulo 1

Es importante señalar que este mercado ha experimentado un notable retroceso en los

precios, como resultado de la cris is económica mundial desatada en 2008 y atraviesa por

un período de recuperación (CONACOCO, 2009).

Además, se ha previsto que el agua de coco podría competir en el mercado de 10,000

millones de USO de las bebidas deportivas, debido a su alto contenido en carbohidratos,

calcio, fósforo, sodio, potasio y magnesio (Cuadro 2). En consecuencia , las dos empresas

multinacionales que dominan el mercado de las bebidas embotelladas han realizado

inversiones en este producto. PepsiCo ha comprado la empresa brasileña Amacoco y sus

populares marcas Kero Coco y Trap Coco, que controlan la mayor parte de las ventas de

esta bebida embotellada en Brasil. Por su parte, Coca-Cola Co. adquirió el 1 de

septiembre de 2009 el 20% de las acciones de la empresa embotelladora de agua de

coco ZICO, por aproximadamente 15 millones de USO.

Por otra parte, se ha sugerido que la ingesta de ácido láurico (que es el precursor de la

monolaurina y representa aproximadamente el 50% del contenido del aceite del coco y

algunos otros productos derivados del coco), podría incrementar la producción endógena

de la monolaurina, la cual posee efectos bactericidas, antifúngicos y virucidas, incluso

contra el VIH, (Oayrit, 2000; Lieberman, 2006).

En México las principales regiones productoras de cocotero se localizan en dos grandes

regiones: La del Golfo y el Caribe: en Tabasco, Veracruz, Campeche, Yucatán y Quintana

8

Capítulo 1

Roo y la del Pacífico: en Guerrero, Colima, Oaxaca, Michoacán , Sinaloa, Jalisco y

Chiapas. El área cultivada en el país suma 80 mil hectáreas y se estima que el valor de la

producción cerró en mil 300 millones de pesos en 2007, habiendo superado los 1,150

millones de pesos en 2006. De ese territorio, sólo el 30% (24 mil hectáreas) se destina a

la producción del fruto , que es de donde se desprentlen la fibra, y el polvillo de la

cáscara, que ofrecen importantes oportunidades de negocio (CONACOCO, 2008).

Cuadro 1.2.- Contenido nutricional del agua de coco, una bebida deportiva comercial y de una mezcla de aguas de coco proveniente de diversos puntos del mundo

Contenido nutricional del agua de coco vs bebida deportiva por cada 100 mi

Agua de coco Bebida deportiva

25 Kcal

Mezcla de aguas de coco

Energía 18 Kcal

Proteínas 0.3 g

Carbohidratos 4.54 g

Lípidos 0.0 g

Sodio 18.18mg

Potasio 203 mg

Calcio 12.12mg

Fósforo 5.15 mg

Magnesio 7.57 mg

Fuente (ZICO, 2011)

1.1.3 Problemática del cocotero

0.0 g

6.25 g

0.0 g

45.83 mg

13.33 mg

(Gatorade, 2011)

18 Kcal

0.0 g

3.93 g

0.0 g

48.48 mg

172,42 mg

8.18 mg

9.09 mg

10.60 mg

(ZICO, 2011)

Las plantaciones de cocotero enfrentan una compleja problemática ya que promedian una

edad avanzada y además se enfrentan a un conjunto de problemas fitosanitarios como el

picudo del cocotero, el anillo rojo y el amarillamiento letal , con lo cual se ha reducido la

productividad en aproximadamente 50% y además aminora su potencial de propagación.

El picudo (Rhynchophorus palmarum), es un coleóptero que durante su etapa larval

excava túneles en las palmas de coco para alimentarse, causando un daño mecánico

directo, sin embargo, el daño más grave lo causa de manera indirecta al fungir como

vector del nemátodo Rhadinaphelenchus cocophilus, causante de la enfermedad del anillo

rojo, la cual provoca, en primera instancia, la caída prematura de los frutos y el

9

Capítulo 1

amarillamiento de las hojas inferiores, las cuales posteriormente se tornan color café

marrón , iniciando en las puntas de las hojas viejas y en algunos casos la corona de las

hojas se desprende; sin embargo, el síntoma característico de esta enfermedad, es la

aparición de un anillo color anaranjado-rojizo de aproximadamente 3-5 cm de ancho,

localizado a 4-6 cm de la periferia del tronco. En algunos casos, la decoloración se

observa en los pecíolos de las hojas (Hagley, 1963; Salas, 1980; Oehlschlager, et al.,

2002).

El amarillamiento letal, es la más importante de las enfermedades en Cocos nucifera. Es

causado por el fitoplasma 16SriV-A, que se encuentra exclusivamente en el floema de

varias especies de palmas, entre las que se incluye a la palma datilera (Phoenix

dactylifera) y al cocotero (Cocos nucifera) , se transmite utilizando como vector al

homóptero Myndus crudus y es capaz de causar la muerte de la planta infectada en un

período de 3 a 6 meses. Los síntomas del Amarillamiento Letal (AL) se presentan como

una serie de eventos progresivos que incluyen: la caída prematura de los frutos y

necrosis, decoloración del follaje y muerte del meristemo apical. Actualmente la

enfermedad se distribuye (Ver Figura 1.1) en las islas del Mar Caribe (Cuba, Jamaica,

Haití/Republica Dominicana), en la costa caribeña de América Central y la Península de

Yucatán, a lo largo del Golfo de México, desde Yucatán hasta Veracruz, en Florida y en la

costa mexicana del Atlántico (Oropeza, datos sin publicar) y es la principal causa, aunada

al envejecimiento de las plantaciones, de la pérdida de más del 50% del área cultivada en

México entre 1993 y 2008 (CONACOCO, 2008). Se estima que el AL ha acabado con

cerca de 20,000 hectáreas de cocotero en México en la Península de Yucatán y en la

costa del Golfo de México, así como también en otros países en América Central y el

Caribe. (McCoy, et al., 1983; Maust, et al. , 2003; Harrison y Elliot, 2009).

10

Capítulo 1

" .,

Figura 1.1.- Distribución actual del Amarillamiento Letal en las costas de América.

1.1.4 Estado de la micropropagación del cocotero

Ante la situación descrita previamente, se ha identificado la necesidad de replantar los

cultivares con individuos sobresalientes en términos de tolerancia y/o resistencia a

enfermedades, así como también en términos de precocidad y productividad elevada y

estable. Ya que C. nucifera no se puede propagar por medio de semilla a la velocidad

requerida, se considera que la micropropagación es la mejor alternativa, debido a que

ofrece la posibilidad de obtener una multiplicación clonal de los individuos con

características deseables, así como la simplificación de los procesos y la reducción de

sus costos. La técnica más eficiente de multiplicación in vitro de Cocos nucifera en la

actualidad, se basa en la embriogénesis somática, la cual ofrece la posibilidad , teórica,

de producir copias de individuos élite en cantidades ilimitadas en un período de tiempo

corto con poca mano de obra (Berthouly & Etienne, 2005).

En el Centro de Investigación Científica de Yucatán, se ha trabajado en la

micropropagación del cocotero y se cuenta con un protocolo para inducir la embriogénesis

somática indirecta que parte de la utilización de explantes de plúmula y resulta altamente

eficiente y confiable, sin embargo la tasa de conversión embrión-planta (20%) aún puede

mejorarse y con ello incrementar la eficacia del protocolo. Además, la utilización de

gelificantes representa aproximadamente el 60% del costo de la preparación del medio de

11

Capítulo 1

cultivo, por lo cual se considera que la posibilidad de prescindir de ellos, incrementaría de

manera importante la rentabilidad de dicho protocolo.

En este sentido, se han reportado protocolos exitosos para la micropropagación en medio

líquido de algunas especies como las que se presentan a continuación:

• Coffea arabusta (café) (Afreen , et al., 2002)

• Eucalyptus sp. (eucaliptos) (McAiister, et al., 2002)

• Phaleanopsis sp. (orquídeas) (Kee-Yoeup, 2002).

• Allium sativum (ajo) (Kee-Yoeup, 2002).

• Lilium sp. (lirios) (Kee-Yoeup, 2002).

• Malus domestica (manzano) (Kee-Yoeup, 2002).

• Vitis sp. (uvas) (Kee-Yoeup, 2002).

• Solanum tuberosum (papa) (Jiménez-González, 2002).

• Chrysanthemum sp. (crisantemos) (Kee-Yoeup, 2002).

• Panax ginseng (ginseng)

• Agave tequilana (agave azul)

Además, para cumplir con el objetivo final de un sistema integral de micropropagación

(Robert, 2007), resulta de primera importancia, no solo producir una gran cantidad de

plantas, sino tener la certeza de que el producto que se obtiene al final de la cadena

puede ser considerado material de élite. Para ello es fundamental contar con una

caracterización ecofisiológica del material con que se cuenta en el laboratorio, así como

contar con metodologías prácticas y eficientes para seleccionar el material que

posteriormente podría ser introducido al sistema.

La caracterización ecofisiológica de los organismos vegetales se puede llevar a cabo con

el apoyo de diversas herramientas, entre los cuales sobresalen, por su versatilidad y

relativa simplicidad , los analizadores infrarrojos de intercambio gaseoso (IRGA, por sus

siglas en inglés). Sin embargo, cuando se planea trabajar con una gran cantidad de

individuos, el esfuerzo de trabajo (hora/hombre) resulta un serio inconveniente.

La utilización de imágenes termográficas ha resultado ventajosa en diferentes

aplicaciones en el campo de la ingeniería, farmacéutica, medicina, producción animal y

agricultura. Recientemente se reportó una metodología que permite diferenciar variedades

de Oryza sativa (arroz), en términos de productividad (Takai, et al. , 201 0).

12

Capítulo 1

Es por esta razón , que el mejoramiento del proceso de micropropagación de cocotero

cobra importancia. En el presente trabajo se pretende lograr dicho objetivo mediante la

util ización de biorreactores de inmersión temporal e imágenes termográficas.

1.1.5 Biorreactores de inmersión temporal

Reportes previos, señalan que la utilización de sistemas de inmersión temporal,

disminuyen el tiempo de cultivo requerido e incrementan la calidad del producto final

(Teisson, 1996; Robert-Díaz, et. al., 2004; Hernández-Carvajal & Obledo-Vázquez, 2007)

La producción a gran escala de plantas, a través de los cultivos de tejidos celulares

resulta una estrategia muy prometedora para la propagación industrial de especies

vegetales (Kee-Yoeup, 2002) y por lo tanto se aplica actualmente a un gran número de

especies de importancia agrícola y forestal (Meira , 2005). Sin embargo, la propagación vía

cultivo de tejidos es más costosa que la propagación convencional , lo cual ,

frecuentemente limita su aplicación comercial , esto se debe a que el costo de la mano de

obra equivale al 60% del costo total de la producción , ya que debe ser especializada e

intensiva (Gupta, 2002; Meira, 2005), por lo tanto, la automatización de algunos pasos de

la micropropagación vía embriogénesis somática podría reducir los costos de propagación

de genotipos superiores (Gupta, 2002). A este respecto, Kee-Yoeup, 2002, señala que

varios autores han reportado avances en la automatización de la micropropagación con la

utilización de biorreactores de inmersión temporal , con el fin de reducir los costos de la

micropropagación.

Un biorreactor de inmersión temporal es usualmente descrito en un contexto bioquímico

como un ambiente estéril auto-contenido que se capitaliza con una solución de nutrientes

y/o un flujo bidireccional de líquido y/o aire, el cual es diseñado para el cultivo intensivo y

que maximiza las posibilidades de controlar las condiciones microambientales del sistema

(Kee-Yoeup, 2002), especialmente las condiciones de cultivo como pH, aireación,

concentración de oxígeno, etileno y dióxido de carbono (lbaraki y Kurata, 2001; Etienne,

et al., 2006), el contacto directo del tejido vegetal con el medio y el abastecimiento óptimo

de nutrientes y reguladores del crecimiento (Meira, 2005) Además, los biorreactores son

compatibles con la automatización de los procesos de micropropagación (lbaraki y Kurata ,

2001; Etienne, et al., 2006). Por lo tanto el uso de biorreactores de inmersión temporal

13

Capítulo 1

parece ser el camino más prometedor para lograr el escalamiento de los procesos de

micropropagación, particularmente para la embriogénesis somática, siempre y cuando sea

posible trabajar en contenedores grandes (lbaraki y Kurata, 2001 ; Etienne, et al., 2006).

Los sistemas de inmersión temporal se han utilizado para incrementar la aireación y

reducir la hiperhidricidad. Esta última representa la mayor problemática que se reportada

para el uso de los biorreactores, aunque también se presentan otros inconvenientes

importantes como las malformaciones morfogénicas de raíz y tallo por la inmersión del

tejido en el medio (Meira, 2005).

En el Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C. (CICY) se ha llevado a cabo

investigación en respuesta a estas expectativas creadas en torno a el cultivo in vitro

utilizando como modelo a algunas especies tropicales de interés agroindustrial , entre las

cuales encontramos al cocotero, la papaya y el agave. Estas investigaciones han arrojado

resultados interesantes para el trabajo a desarrollar.

La investigación para el desarrollo de protocolos de micropropagación de plantas de

cocotero, inició en los años 70 (Eeuwens, 1976; Eeuwens, 1978; Eeuwens and Blake,

1977). Los estudios sobre el desarrollo de protocolos para la micropropagación clona! de

cocotero, a través de la embriogénesis somática, han utilizado mayormente explantes de

inflorescencia, obteniendo bajas tasas de reproductividad y eficiencia.

Hace poco más de una década, se desarrolló un protocolo para la regeneración de

cocotero, utilizando plúmulas de embriones cigóticos maduros como explantes y con la

adición de los reguladores de crecimiento sintéticos como el ácido 2,4-

diclorofenoxiacetico y la 6-bencilaminopurina. Los rendimientos obtenidos, fueron del

doble para callos y más de diez veces para callos embriogénicos, que los descritos

previamente con inflorescencias explantes (Chan et al. , 1998), posteriormente, se logró

una mejora en la eficiencia del protocolo, mediante la inclusión de embriogénesis

somática secundaria y la multiplicación de callos embriogénicos, es decir, los embriones

somáticos primarios obtenidos de plúmula se utilizaron como explantes para formar tanto

callos embriogénicos como embriones somáticos secundarios. Los callos embriogénicos

obtenidos después de tres ciclos de multiplicación son capaces de producir embriones

somáticos, con lo cual la productividad total calculada de una plúmula es de 98, 000

embriones, comparando esto, con la productividad del protocolo original , se observa un

incremento de 27,000 - 50,000 veces, además, al compararlo con los tratamientos con

14

Capítulo 1

brasinólidos, resulta en un incremento de 1 O, 000 veces en la productividad (Pérez-Núñez

et al. , 2006), sin embargo, la tasa de conversión embrión-planta, que se mantiene en 20%

(Oropeza, datos no publicados), aún puede mejorarse y con ello incrementar la

rentabilidad y eficacia del protocolo.

Si bien, la utilización de explantes de plúmula ha demostrado incrementar la

reproductibilidad y la eficiencia de la micropropagación in vitro, también se considera que

un protocolo basado en la utilización de este tipo de explantes no se puede utilizar para la

micropropagación de genotipos de élite, debido a la posible existencia de heterogeneidad

genética (Chan, et al., 1998; Sáenz, et. al., 2006), sin embargo, se reconoce que la

utilización de explantes de plúmula es potencialmente útil cuando se obtienen de padres

seleccionados con un desempeño sobresaliente y que las mejoras hechas en este

sistema, pueden ser aplicables a tejidos con diferentes orígenes (Chan, et al., 1998).

Resultados satisfactorios para la propagación de varias especies han sido reportados

utilizando biorreactores basados en el principio de la inmersión temporal. El sistema de

Reactor de Inmersión Temporal Automatizado (RITA), que ha sido utilizado mayormente

para el cultivo de embriones somáticos, consta de un compresor de aire que desplaza el

medio líquido desde un contenedor más bajo hacia uno que contiene el tejido vegetal. A

pesar de que este sistema funciona adecuadamente, presenta desventajas que le restan

viabilidad para la propagación de todas las especies. Por ejemplo, el biorreactor RITA es

pequeño para la propagación de vitroplantas grandes como el cocotero y la esponja que

le da soporte a las plantas, mantiene demasiada humedad, lo que induce un cierto grado

de vitrificación (Robert, et al. , 2006). Además, los biorreactores RITA requieren

complicados sistemas de tubos y filtros que conectan los vasos con máquinas que se

encargan de movimiento del medio entre los vasos y que deben ser conectados a un

sistema maestro computarizado que los regula (Robert, et al. , 2006). Por otro lado, el

precio unitario de los biorreactores RITA, si se compran más de 20 unidades, es de

$2,861 .00 MXN (Sigma-Aidrich, 2012).

En el CICY se ha desarrollado un sistema de micropropagación que incorpora un buen

número de características diseñadas especialmente para simplificar la operación y reducir

costos. La unidad BioMINT es un biorreactor de talla mediana (1 ,2 L) , que opera bajo el

principio de la inmersión temporal y está construido en polipropileno y es translúcido,

esterilizable en autoclave y reutilizable. El BioMINT está conformado por dos vasos, uno

destinado a albergar el tejido vegetal y el otro para el medio de cultivo líquido. Estos

15

Capítulo 1

vasos son acoplados por medio de una pieza adaptadora cribada que permite el flujo del

medio de un vaso a otro. Este flujo es responsivo a la gravedad en un sistema de sube y

baja (SyB), que consiste en plataformas dotadas con un motor eléctrico que les permite

cambiar de posición (Robert, et al., 2006). El precio unitario aproximado por cada

BioMINT es de $134. 50 MXN (Robert, 2011, comunicación personal) y además, la

simplicidad estructural y la naturaleza modular e independiente de los biorreactores,

facilitan su operación y reducen la cantidad de labor manual requerida y por lo tanto se

reducen los costos de proceso de micropropagación (Robert, et al. , 2006). Sin embargo,

el BioMint atraviesa por un proceso de rediseño y no se contó con la disponibilidad de

esta unidad para iniciar con los experimentos programados para este trabajo.

En consecuencia , resultó necesario diseñar biorreactores de inmersión temporal que

pudieran ser manufacturados en el laboratorio y que aproveche el sistema de Sube y Baja

(SyB) desarrollado para el BioMint e incorporando nuevas características que puedan

resultar ventajosas para el proceso de micropropagación de C. nucifera, por ejemplo: un

tamaño adecuado ( 15cm de altura) y un sistema de compartamentalización que permite

mantener la identidad experimental de cada individuo para el desarrollo de las vitroplantas

(ver Figura 2.4), así como un tamaño adecuado (3cm de altura) y sin delimitaciones

físicas que puedan interferir con el crecimiento, para el desarrollo de los callos

embriogénicos (ver Figura 2.3) a este último prototipo se le denominará de aquí en

adelante como MINI.

Se han realizado trabajos preliminares con la unidad BioMint para evaluar el efecto de la

inmersión temporal sobre la producción de embriones somáticos y sobre el desarrollo y

enraizamiento de vitroplantas de Cocos nucifera. Los resultados de dicho trabajo

sugieren que puede existir una respuesta positiva en la embriogénesis somática y en el

proceso de enraizamiento y desarrollo de brotes (Andrade-Torres, 2011 ).

1.1.6 Imágenes termográficas

Por su parte, la termografía ha mostrado tener ventajas particulares para el análisis

cuantitativo de la información fisiológica tanto dinámica como espacial (Jones, 2004). En

la agricultura, se reporta (Manickavasagan, et al. , 2005) la utilización de imágenes

térmicas como auxiliares en actividades importantes como:

16

Capítulo 1

• Control de enfermedades.

• Calendarización del riego.

• Cálculos del momento ideal para la cosecha.

• Diseño de invernaderos.

• Control de plagas.

• Mantenimiento de la maquinaria.

• Evaluación de madurez.

• Detección de heridas.

• Detección de sustancias ajenas al producto.

• Secado de maderas.

• Cálculos del rendimiento.

Desde finales de los años 90 's se ha venido trabajando con imágenes termográficas para

realizar estudios cuantitativos de la variación tiempo-espacial de la conductancia

estomática (Jones, 1999), lo cual se estudió bajo condiciones de campo en viñedos

(Jones, et al., 2002) posteriormente para estudiar las relaciones hídricas de cultivos de

importancia económica como las alubias y la vid (Jones y Leinonen , 2003), también se ha

utilizado de manera conjunta con fotografías convencionales para identificar plantas bajo

estrés hídrico (Leinonen y Jones, 2004) se ha evaluado su utilidad, junto con termometría

infrarroja en estudios de fisiología y ecofisiología vegetal (Jones,2004) lo que ha derivado

en la optimización de la técnica para detectar el cierre estomático como respuesta al

estrés hídrico, bajo condiciones de invernadero (Grant, et al., 2006). Sin embargo, esta

técnica ha presentado complicaciones prácticas, inicialmente se debió vencer la barrera

tecnológica de las cámaras termográficas que tendían a detectar el calentamiento

derivado de su propio funcionamiento influyendo de manera importante sobre la

confiabilidad de los datos obtenidos; una vez que esta limitante fue superada, se requería

de un complejo grupo de referencias térmicas (secas y húmedas) y finalmente , la

variabilidad de las condiciones ambientales afecta de manera importante la temperatura

de la superficie foliar de los individuos, por lo que la técnica del grupo de trabajo liderado

por H. G. Jones fue solamente optimizada bajo condiciones de invernadero (Grant, et al. ,

2006). En este sentido, en 201 O se reportó una metodología que permite utilizar la

termografía para detectar diferencias en la productividad de distintas variedades de Oryza

sativa. Esta técnica se basa en la medición de las diferencias en la temperatura foliar y la

17

Capítulo 1

temperatura del aire, dicha diferencia funciona como un indicador indirecto del las

diferencias en el potencial productivo de las variedades estudiadas (Takai , et al. , 201 0).

Con base en lo anterior, se espera que la termografía resulte de gran utilidad en la

detección de vitroplantas de cocotero con un potencial de productividad sobresaliente y de

esta manera tener un sistema de selección temprana, que incremente la eficiencia del

protocolo de micropropagación de C. nucifera, así como la calidad del producto final.

18

Capítulo 1

1.2 HIPÓTESIS

1. Se ha reportado que la aplicación tratamientos de inmersión temporal favorece el

desarrollo y el crecimiento de distintas especies de interés comercial, por lo tanto,

es posible que los tratamientos de tratamientos de inmersión temporal ,

incrementen la eficiencia de la embriogénesis somática de C. nucifera en términos

de obtención y germinación de embriones somáticos y además, podría mejorar las

características de las plántulas obtenidas a partir del cultivo de tejidos.

2. Se ha reportado la existencia de relaciones entre parámetros fis iológicos como la

tasa fotosintética , la conductancia estomática y la eficiencia en el uso del agua con

la productividad y además, la temperatura foliar depende en gran medida del

estado fisiológico de la planta, principalmente, del comportamiento estomático. Por

lo tanto, la utilización de imágenes termográficas, podría facilitar la detección de

individuos con mayor potencial de productividad.

19

Capítulo 1

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo general

Evaluar el uso de biorreactores de inmersión temporal e imágenes termográficas como

promotores de la eficiencia de la obtención de plantas de Cocos nucifera, con mayor

potencial de productividad, a partir de callos embriogénicos.

1.3.2 Objetivos particulares

1 Evaluar el uso de biorreactores de inmersión temporal para promover la eficiencia de

la obtención y germinación de embriones somáticos de C. nucífera, a partir de callos

embriogénicos obtenidos in vitro.

2 Evaluar el uso de biorreactores de inmersión temporal como promotores del

desarrollo de vitroplantas de C. nucifera.

3 Evaluar el uso de imágenes termográficas para la selección de plantas de C.

nucífera, obtenidas in vitro, que posean mayor potencial de productividad.

20

Capítulo 1

1.4 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

1.4.1 Evaluación del uso de biorreactores de inmersión temporal para promover la eficiencia de la obtención y germinación de embriones somáticos, así como del desarrollo de plántulas de C. nucífera, a partir de callos embriogénicos obtenidos in vitro.

La evaluación del efecto de la inmersión temporal se realizará en dos etapas del

desarrollo del cultivo (callo embriogénico y brotes) y se utilizará como variable la

frecuencia de la inmersión, ya que se ha reportado que el tiempo de inmersión es el factor

con mayor influencia en la eficiencia del proceso (Berthouly y Etienne, 2005). Por lo tanto,

el diseño experimental se propone de la siguiente manera:

• El grupo control se mantendrá en frascos Gerber con medio Y3 semisól ido y

carbón activado.

• Los tratamientos de inmersión temporal se aplicarán en posición horizontal y con

un ángulo de inclinación de los biorreactores de 30°.

• La inmersión tendrá una duración de 2 minutos para todos los tratamientos de

inmersión temporal.

Para evaluar el efecto de la inmersión temporal en la respuesta embriogénica de callos ,

se utilizará un prototipo biorreactor MINI (Ver Figura 2.3) y se aplicarán 6 tratamientos, a

20 individuos cada uno, cambiando la frecuencia de la inmersión:

• Tratamiento 20 ': inmersión* cada 20 minutos.

• Tratamiento 40 ' : inmersión cada 40 minutos.

• Tratamiento 60 ' : inmersión cada 60 minutos.

• Tratamiento 80 ': inmersión cada 80 minutos.

• Tratamiento1 oo· : inmersión cada 100 minutos.

• Tratamiento 120' : inmersión cada 120 minutos.

*La duración de la inmersión fue de 2 ' en todos los casos.

Para evaluar el efecto de la inmersión temporal sobre el desarrollo y enraizamiento de

plántulas, se utilizarán los biorreactores diseñados para dicho fin (Ver Figura 2.4) y se

aplicarán 6 tratamientos con 12 individuos cada uno, cambiando la frecuencia de la

inmersión temporal :

21

Capítulo 1

• Tratamiento 20': inmersión* cada 20 minutos.

• Tratamiento 40': inmersión cada 40 minutos.


• Tratamiento 80': inmersión cada 80 minutos

• Tratamiento 100 ·: inmersión cada 100 minutos


*La duración de la inmersión fue de 2 ' en todos los casos.

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embriogénico

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Medio

•Carbón ac.t· a do

(2.5g/l)

·~(3g/l)

•2,4-0 (0.54- M)

Medio 11

•Carbón ac.tivado

(2.5g/l)

-Ge · e (3.g/l)

•2,4-0 (6 M}

*68AP (300

Figura 1.2.- Esquema general de la estrategia experimental para la evaluación del efecto de la inmersión temporal sobre el protocolo de micropropagación de C. nucifera .

Los datos obtenidos se examinarán mediante un análisis de varianzas (ANOVA) a través

del paquete estadístico SAS 9.0 y serán presentados en gráficas realizadas en Sigma

Plot.

22

Capítulo 1

1.4.2. Evaluación del uso de imágenes termográficas para la selección de

plantas de C. nucífera, obtenidas ín vitro, que posean mayor potencial de

productividad.

Los datos serán recabados a partir de brotes obtenidos in vitro, para este fin se utilizará

un analizador infrarrojo de intercambio de gases (LI-COR, Ll6400) y una cámara

termográfica (ICI, Prodigy 640), con el objetivo de comparar el desempeño de estos

equipos para identificar el material biológico con alto potencial productivo, de acuerdo a la

metodología establecida por Takai et al. (201 0).

Vitroplantas

Transferencia ex vitro

Aclimatación

Cámara termográfica Colecta de datos

•Temperatura foliar

Correlaciones

Selección

IRGA

•Tasa fotosintética •Conductancia estomática •Temperatura foliar •Temperatura ambiental

Figura 1.3.- Esquema general de la estrategia experimental para evaluar la utilidad de la termografía como herramienta para la selección de individuos con mayor potencial de

productividad

Los datos obtenidos a partir de ambos equipos se analizarán por separado mediante un

análisis de varianzas (ANOVA). Por su parte, la evaluación de la asociación de los datos

obtenidos con los diferentes equipos se realizará mediante análisis de correlación.

23

Capítulo 1

1.5 REFERENCIAS

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28

Capítulo 11

CAPÍTULO 11

Evaluación del uso de biorreactores de inmersión temporal para promover la eficiencia de

la obtención y germinación de embriones somáticos, así como del desarrollo de plántulas

de C. nucífera, a partir de callos embriogénicos obtenidos in vitro.

2.1 INTRODUCCIÓN

La micropropagación es una forma vegetativa de propagación de diferentes especies de

plantas, por medio del cultivo de tejidos, para lo cual se requiere de laboratorios bien

estructurados y personal calificado (Teixeira, 2002). La producción a gran escala de

plantas por medio de esta técnica, resulta altamente demandante en términos de mano de

obra, alcanzando a representar el 60% o más del costo total de la producción (Gupta,

2002).

En este contexto, resulta importante hablar de los biorreactores de inmersión temporal ,

los cuales pueden ser definidos como ambientes estériles auto-contenidos con una

solución de nutrientes y un flujo bidireccional de medio líquido y aire , que presentan como

principales ventajas el permitir el contacto directo entre el medio de cultivo y el tejido

vegetal , así como la compatilibilidad con la automatización; es por ello que se considera

que son altamente prometedores para el escalamiento de los procesos de

micropropagación (Kee-Yoeup, 2002; lbaraki y Kurata, 2001; Etienne, et al. , 2006; Meira,

2005).

En la literatura científica se ha reportado ampliamente que los sistemas de inmersión

temporal favorecen , en diversas especies, al crecimiento y al desarrollo de las plantas

cultivadas in vitro, y que además incrementan la calidad de la vitroplanta obtenida

(Teisson, 1996; Robert-Díaz et al., 2004; Hernández-Carvajal y Obledo-Vázquez, 2007).

Además, existen reportes que señalan que los sistemas de inmersión temporal , también

pueden estimular la producción de embriones somáticos, así como mejorar la calidad de

los mismos, tal es el caso de cultivos embriogénicos de café (Albarrán , 2005).

Siendo Cocos nucifera una especie de importancia para la cual existen las bases de un

protocolo de micropropagación (Chan , e t. al., 1998; Pérez-Núñez, et. al., 2006) que

resulta necesario mejorar en términos eficiencia y rentabilidad , en este trabajo se evaluó

hla viabilidad de aplicar tratamientos de inmersión temporal para su cultivo in vitro.

29

Capítulo 11

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo se basa en el proceso de micropropagación de cocotero que se utiliza

actualmente en el Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY) (Chan, et al. ,

1998; Pérez-Núñez, et al. , 2006), por lo que las condiciones generales del mismo se

presentan a continuación .

2.2.1 Obtención de callo embriogénico

Material vegetal

El material biológico utilizado para este trabajo es parte de la colección mantenida en el

laboratorio de micropropagación clonal del CICY. Este material fue obtenido de acuerdo a

la metodología reportada por Pérez-Núñez, et al. (2006).

Embrión cigólico

Multiplicación

Callo con embriones

E. Somática secundaria

Germinación Planta formada

Figura 2.1.- Esquema generalizado del protocolo de micropropagación de C. nucifera (Grupo de coco ©)

30

Capítulo 11

Obtención de explantes de plúmula

Para obtener los explantes requeridos , se colectaron frutos, los cuales fueron cortados

transversalmente con un machete, exponiendo así, los embriones rodeados por

endospermo sólido. Los embriones fueron extraídos de las nueces abiertas utilizando un

saca-bocados (1.6 cm de diámetro) y colocados en agua destilada. A continuación se

realizó una limpieza en campo, sumergiendo el material en etanol al 70% por 3 minutos y

enjuagado 3 veces con agua destilada estéril , se minutos en una solución de NaCIO al 6%

y enjuagado 3 veces con agua destilada estéril. Una vez finalizado este proceso, el

material fue almacenado en frío para ser trasladado al laboratorio.

Posteriormente, bajo condiciones asépticas, el endospermo que rodea al embrión fue

lavado en etanol al 70% por 3 minutos y enjuagado 3 veces con agua destilada estéril ,

lavado por 20 minutos en una solución de NaCIO al 6% y enjuagado 3 veces con agua

destilada estéril. Los embriones fueron separados del endospermo y lavados en una

solución de NaCIO al 0.6% por un periodo de 1 O minutos y fueron enjuagados 3 veces

con agua destilada estéril. A continuación , los explantes de plúmulas fueron extraídos de

estos embriones bajo un microscopio estereoscópico y colocados directamente en medio

nutritivo Y3 (Eeuwens, 1976).

Medio y condiciones de cultivo

Para inducir la formación de callo, cada explante es cultivado en viales de 35 mi, que

contienen 1 Oml de medio Y3, al cual se le añaden 3 g/1 de gelrite y 2.5 g/1 de carbón

activado. Además, las concentraciones de reguladores de crecimiento utilizadas son 0.1

mM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-0) para el medio 1 y 1 mM 2,4-0 y 50 mM 6-

bencilaminopurina (6-BAP) para el medio 11. El pH del medio es ajustado a 5.75 antes de

esterilizar en autoclave por 20 minutos a 120°C. Los cultivos son incubados en medio 1

bajo condiciones de oscuridad durante 6 meses a 27±2°C sin ser subcultivados y

posteriormente son transferidos a medio 11 bajo condiciones de fotoperíodo (45-60 mmol

m-2 s-1 PPFO) a 27±2°C, realizando subcultivos cada 3 meses.

31

Capítulo JI

Embriogénesis somática

La embriogénesis somática será inducida mediante la exposición de los callos obtenidos

previamente, a una nueva inducción hormonal (Ver medio 11 , en Figura 1 ).

En esta etapa se realizará la primera evaluación experimental , sometiendo 5 grupos a 4

tratamientos diferentes de inmersión temporal y el restante será el grupo control , por lo

que será tratado siguiendo el protocolo de micropropagación actual.

2.2.2 Obtención de plántulas

Las plántulas utilizadas para evaluar el efecto de la inmersión temporal sobre el desarrollo

y crecimiento de las mismas, fueron obtenidas mediante la germinación de embriones

cigóticos provenientes de una plantación experimental establecida en el Ejido de San

Crisanto, Yucatán, México.

Figura 2.2.· Esquema general del proceso para la germinación in vitro de embriones cigóticos.

Colecta de embriones cigóticos:

Para obtener los embriones cigóticos requeridos , se colectaron frutos, los cuales fueron

cortados transversalmente con un machete, exponiendo así, los embriones rodeados por

endospermo sólido. Los embriones fueron extraídos de las nueces abiertas utilizando un

saca-bocados (1.6 cm de diámetro) y colocados en agua destilada. A continuación se

realizó una limpieza en campo, sumergiendo el material en etanol al 70% por 3 minutos y

enjuagado 3 veces con agua destilada estéril , se minutos en una solución de NaCIO al 6%

y enjuagado 3 veces con agua destilada estéril. Una vez finalizado este proceso, el

material fue almacenado en frío para ser trasladado al laboratorio.

32

Capítulo 11

Posteriormente, bajo condiciones asépticas, el endospermo que rodea al embrión fue

lavado en etanol al 70% por 3 minutos y enjuagado 3 veces con agua destilada estéril ,

lavado por 20 minutos en una solución de NaCIO al 6% y enjuagado 3 veces con agua

destilada estéril. Los embriones fueron separados del endospermo y lavados en una

solución de NaCIO al 0.6% por un periodo de 1 O minutos y fueron enjuagados 3 veces

con agua destilada estéril.

Germinación de embriones cigóticos

Para germinar in vitro los embriones cigóticos, fueron colocados, de acuerdo a lo

propuesto por Pech y Aké et al. (2004 ), con el micrópilo orientado hacia arriba bajo

cond iciones de oscuridad, en frascos viales de 35 mi , que contienen 1 O mi de medio Y3,

al cual se le añaden 3 g/ 1 de gelrite y 2.5 g/ 1 de carbón activado. En este caso, el medio

de cultivo permaneció libre de reguladores de crecimiento.

2.2.3 Diseño de biorreactores

Para diseñar los biorreactores requeridos para llevar a cabo este trabajo, se tomaron en

cuenta las siguientes características deseables: .

1.- Un tamaño adecuado para el tipo de material cultivado en las diferentes etapas

del proceso.

2.- construcción en un material esterilizable en autoclave.

3.- Fácil manejo en campana.

4.- Cierre hermético.

5.- La posibilidad de optimizar el uso de la superficie destinada a los cuartos de

cultivo.

6.- Limitar el libre movimiento del material el cultivo como respuesta a la rotación

de las plataformas del sistema SyB.

7.- Mantener, en la medida de lo posible, la identidad experimental de cada uno de

los individuos.

33

Capítulo 11

2.2.3.1 Biorreactor para embriones somáticos

Para este propósito se decidió utilizar recipientes de polipropileno (temperatura de

fusión=173°C) con tapa de cierre hermético, con un volumen de 300 mi, marca Good &

Good , modelo DG-11 O, los cuales se compartimentaron con piezas de policarbonato

(temperatura de fusión==250°C), de manera que se obtengan 4 compartimentos que

permiten mantener el medio nutritivo y el material biológico durante la fase de aireación

(Ver Figura 2.3)

Figura 2.3.- Vista del Biorreactor MINI y sus componentes. a) Recipiente hermético de 330 mi Good & Good. b) Piezas de policarbonato diseñadas para el interior del recipiente . e) Piezas de

policarbonato ensambladas formando una cruceta . d) Vista general del reactor.

Manufactura de bíorreactores:

Debido que los recipientes Good & Good DG-110, poseen características útiles de

volumen y hermetismo, para este trabajo , no fueron modificados. Por otro lado, para

elaborar las piezas de policarbonato se util izó una placa de dicho material , a partir de la

cual se cortaron, con una sierra de cinta, 3 piezas para cada reactor (Ver Figura 2.3),

dichas piezas son ensamblables a manera de cruceta y del lado en el cual se almacenará

el medio se coloca la tercera pieza a manera de travesaño, con el objetivo de mantener

las piezas unidas con ángulos de 90° en las intersecciones.

Los cortes de las piezas de policarbonato se realizaron en las instalaciones y con ayuda

del personal del Departamento de Instrumentación del Centro de Investigación Científica

de Yucatán A. C.

34

Capítulo 11

2.2.3.2 Biorreactor para plántulas

Para este propósito se decidió utilizar recipientes de polipropileno (temperatura de

fusión=176°C) con tapa de cierre hermético, con un volumen de 4700 mi, marca Good &

Good, modelo DG-125, los cuales se compartamentalizaron utilizando bandejas Magenta

7 -way, construidas en polipropileno (temperatura de fusión=176°C) modificadas para

ajustarse a las dimensiones del recipiente, de manera que se obtuvieron 20

compartimentos para colocar brotes y una zona que no se ocupa con material biológico,

en la que se almacena el medio nutritivo durante la fase de aireación.

Figura 2.4.- Vista del Biorreactor casero para el crecimiento de plántulas y sus componentes. a) Recipiente hermético de 4700 mi Good & Good. b) Perforación en la tapa para promover el intercambio gaseoso. e) Rejilla Magenta recortada para obtener los compartimientos para el material biológico. d) Vista general del reactor.

Manufactura de biorreactores:

Los recipientes Good & Good poseen características de volumen y hermetismo útiles para

este trabajo , sin embargo, se les realizó una perforación en la parte central de la tapa para

promover el intercambio gaseoso. Esta perforación se realizó con una broca helocoidal de

8 mm de diámetro a alta velocidad para evitar un acabado poroso. A esta perforación se

pueden adaptar distintos filtros para evitar la contaminación con microorganismos y

promover el intercambio gaseoso, los filtros probados para promover el intercambio

gaseoso sin comprometer la esterilidad del interior del contenedor se muestran a

continuación:

35

Capítulo 11

a)

Figura 2.5: Filtros evaluados para mantener la esterilidad del interior del biorreactor: a) filtro swinex 0.221-JM, b) filtro de algodón en el interior de adaptador de cobre tipo "cola de rata", e) Membrana millipore con poro de 0.45 IJM, d) membrana de polipropileno de 35 IJM de espesor.

Los filtros que se seleccionaron , por su eficiencia y costo , para mantener el interior del

reactor libre de contaminación fueron las membranas de polipropileno con un espesor de

35 IJm, las cuales se adhirieron al recipiente por medio de una capa de silicón (SISTA F-

150).

Las bandejas Magenta 7-Way fueron recortadas a la medida adecuada para ser

colocadas dentro del recipiente, por medio de la utilización de una sierra de mano

(MotoTool) y posteriormente fueron lijadas y pulidas con fieltro para obtener el acabado

más liso posible.

2.2.4 Montaje experimental

2.2.4.1 Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis somática

El montaje de este experimento se realizó bajo condiciones de esterilidad en una

campana de flujo laminar horizontal. Los callos embriogénicos que se seleccionaron para

este experimento se cultivaron en frascos Gerber, los cuales contienen 25 mi de medio

Y3, al cual se le añade carbón activado (2 .5 g/1), gelrite (3 g/1), la auxina 2,4-D (61JM) y la

citocinina 6-BAP (300 IJM). El material fue mantenido bajo condiciones de oscuridad a 27

± 2°C.

36

Capítulo 11

2.2.4.2 Efecto de la inmersión temporal sobre el crecimiento y desarrollo de

plántulas

El montaje experimental se realizó, bajo condiciones de esterilidad en una campana de

flujo laminar horizontal y se utilizaron embriones cigóticos obtenidos a partir de 300

semillas obtenidas de una plantación ubicada en el ejido de San Crisanto, Yucatán , los

cuales fueron germinados en frascos Gerber, con 25 mi de medio Y3, bajo condiciones de

oscuridad a 27 ± 2°C. Posteriormente, individuos que medían entre 2.5 y 3.0 mm, fueron

transferidos a los biorreactores para ser sometidos a los tratamientos de inmersión

temporal.

2.3 RESULTADOS

2.3.1 Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis somática

Se realizaron observaciones utilizando un estereoscopio (Carl Zeiss, SV11 ) a los 15, 30 y

60 días después del establecimiento del experimento y los resultados obtenidos, se

pueden observar en la Figura 2.6.

Después de 15 días transcurridos se pudo observar, que bajo todas las condiciones de

inmersión temporal establecidas se presenta, de manera generalizada, cambios en la

coloración , translucidez y textura de los callos al compararlos con el testigo, lo que revela

la pérdida del potencial embriogénico de los callos durante dicho período de tiempo. Sin

embargo, durante los días siguientes y hasta cumplirse los 60 días, también se pudo

observar un incremento en la talla similar en todos los tratamientos.

Además, cabe señalar que cuando el material sometido a tratamientos de inmersión

temporal fue extraído de los biorreactores para su observación , siempre se encontró

cubierto por una delgada capa de medio de cultivo y también se pudo apreciar la

acumulación de una cantidad importante de carbón activado en su superficie,

principalmente entre los pliegues formados por la intersección de las estructuras que

pudieron tener previamente potencial embriogénico.

El experimento se repitió, para corroborar los resultados , los cuales no fueron diferentes a

los anteriores.

37

Capítulo 11

Figura 2.6.- Examen visual de los callos embriogénicos expuestos a tratamientos de inmersión temporal durante 15, 30 y 60 días. TO representa al grupo testigo, el cual fue mantenido en

medio semisólido.


plántulas

Posterior a la fecha del montaje experimental, se ha realizado un monitoreo constante

cada 15 días, mientras que cada 30 se ha cambiado el medio de cultivo. Los resultados

obtenidos hasta los 165 días, se presentan en la Figura 2.7 y 2.8.

En todas las variables medidas, con excepción de la proporción entre la longitud de la raíz

y la longitud aérea, el testigo mantenido en medio semisólido tuvo los valores promedio

más elevados. Del análisis estadístico se puede inferir que no existen diferencias

significativas de la longitud de la parte aérea entre los tratamientos S.S., T100"y T120" ; en

términos de la longitud radicular, el tratamiento S.S. es significativamente distinto

exclusivamente a T1 oo·; para la longitud total , no existen diferencias significativas entre el

tratamiento S.S. y el T120 "; en cuanto al número de raíces secundarias se observa que

38

Capítulo 11

todos los tratamientos son estadísticamente equivalentes; para el número de hojas se

encuentran equivalencias estadísticas entre el tratamiento S.S. , T20', T100 ' y T120 ',

finalmente, en lo que refiere a la longitud proporcional de la raíz con respecto a la longitud

de la parte aérea, el tratamiento que alcanzó el valor más alto fue T60 ' y no presentó

diferencias significativas con los tratamientos S.S., M.L. y T20' (Ver Cuadro 2.1)

Cuadro 2.1.- Resumen del análisis estadístico LSD, realizado con el paquete estadístico SAS 9.0.

Tratamiento L. A. L. R. rL #R. S. #Hojas L. R./ L. A. s.s. 7.19 a* 3.40 a 11.38 a 0.67 a 1.08 a 0.48 ab M.L. 4.29 e 2.20 ab 6.52 b 0.33 a 0.08 e 0.57 ab T20' 4.75 be 2.43 ab 7.18 b 0.58 a 0.58 abe 0.53 ab T40' 3.73 e 3.02 a 6.89 b 0.67 a 0.25 be 0.43 b TGO' 4.96 be 3.11 a 8.26 b 0.58 a 0.33 be 0.80 a

T100' 6.19 ab 1.41 b 7.84 b 0.33 a 0.75 ab 0.23 b T120' 6.46 ab 2.72 ab 9.28 ab 0.33 a 0.92 a 0.35 b c.v. 22.65 27.25 22.25 20.21 20.29 14.05

*Valores proseguidos por la misma letra dentro de cada columna son iguales de acuerdo a la prueba LSD con una P:S0 .05. Coeficiente de variación determinado después de la transformación de los datos con f(X + 1) Abreviaciones: S.S.= medio semisólido; M.L. = medio líquido estacionario; T20'= inmersión* cada 20 minutos; T40 '= inmersión* cada 40 minutos; T60 '= inmersión* cada 60 minutos; T100'= inmersión* cada 100 minutos; T120' = inmersión* cada 120 minutos; L.A. = longitud de la parte aérea; L.R. = longitud de la raíz; r L. = longitud total; # R. S. = número de raíces secundarias; # hojas = número de hojas; L.R./L.A.= longitud proporcional de la raíz con respecto a la parte aérea. *inmersión durante 2 minutos

Es importante señalar que en todos los casos, el testigo mantenido en medio líquido ha

sido superado por los tratamientos de inmersión temporal y por el testigo en medio

semisólido

Además, durante el transcurso del experimento se pudo observar que a los 105 días, en

el caso de la parte aérea, los tratamientos T40' , T120' , T60 'y T20' habían mostrado un

mayor crecimiento que el testigo en medio semisólido; en crecimiento de la raíz, T60' y

T120' alcanzaban una mayor longitud que el testigo en medio semisólido; en lo que

refiere al crecimiento total, T40 ', T120 'y T60'presentaban plantas más grandes que el

testigo en medio semisólido; por su parte, los tratamientos T20' y T40 ' habían inducido la

producción de un mayor número de raíces secundarias que el grupo testigo mantenido en

medio semisólido; por último, los individuos sometidos a los tratamientos T120'y T40 'son

los que habían producido un mayor número de hojas que el testigo en medio semisól ido.

39

Capítulo JI

I§ .... M.L. s.s. T20" T40 " T60' T100 ' T120 '

Figura 2.7. Se presenta el estado general de plantas sometidas a diferentes tratamientos de inmersión temporal. M.L.= Medio líquido estacionario; S.S. Medio semisólido; T20 '= Inmersión temporal cada 20 minutos; T40 "= Inmersión temporal cada 40 minutos; T60 "= Inmersión temporal cada 60 minutos; T100'= Inmersión temporal cada 100 minutos; T120 "= Inmersión temporal cada 120 minutos.

Por otro lado, el tratamiento Tao· se perdió a los 80 días por la proliferación de

contaminación fúngica en uno de los individuos, el cual fue separado del grupo, sin

embargo el resto del tratamiento mostró signos de contaminación en los días siguientes,

por lo que el tratamiento completo fue marginado de los análisis estadísticos.

40

Variables medidas para evaluar el efecto de los tratamientos de I.T.

Longitud total

:[5 a 4 ·¡;, e: .3 3

Capítulo 11

Efecto de los tratamientos de l. T. sobre el crecimiento de la parte aérea .

o TOSS

---+--- T120 o

- --+- - T100 -- ......... - - T20 ---- T60 - -c.-----o--

Figura 2.8. Se presenta el efecto que han tenido los diferentes tratamientos de inmersión temporal sobre el crecimiento y desarrollo de plantas de C. nucífera. En el recuadro a se presentan los criterios tomados para colectar los datos. En b, e, d, e y f se representa gráficamente el efecto que han tenido los tratamientos experimentales sobre las diferentes variables medidas.

41

Capítulo 11

2.4 DISCUSIÓN

2.4.1 Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis somática

La respuesta observada durante el desarrollo de este experimento, consistió en la pérdida

de la conformación característica del callo embriogénico, sin embargo, se pudo observar

crecimiento a una tasa similar a la observada en el grupo testigo.

En este sentido, la interpretación moderna del crecimiento es que la presión del agua al

interior de la célula (presión de turgencia), provoca el crecimiento obligando a la pared y a

las membranas a expandirse. La rapidez de la entrada del agua a la célula depende del

gradiente del potencial hídrico y de la permeabilidad de la membrana al agua (Salisbury y

Ross, 2000);

Por otro lado, se define al desarrollo o morfogénesis como la sumatoria del crecimiento y

la especialización celular para dar lugar a la formación de tejidos, órganos y organismos

(Salisbury y Ross, 2000). Por lo tanto, el crecimiento observado era de esperarse debido

a un incremento en las diferencias del potencial hídrico entre el tejido en cultivo y el medio

nutritivo, sin embargo, esto no necesariamente conlleva un efecto positivo sobre el

proceso de diferenciación y especialización celular y en consecuencia sobre el desarrollo

o la morfogénesis.

En trabajos previos se ha reportado que el cultivo in vítro utilizando biorreactores de

inmersión temporal , puede generar condiciones estresantes para el explante, diferentes a

los que se presentan en sistemas tradicionales. En callos de Hevea brasílíensis, se

observe que durante la fase de inmersión , la tasa de respiración fue similar en

tratamientos de inmersión de (1 min , 1 hr, 12hr y 24hr de inmersión/ día) y en medio

semisólido, sin embargo, durante la fase de aireación, la respiración incrementó 140-

164% en los tratamientos de 12 horas de inmersión y de inmersión continua. Por otro

lado, la concentración total de la adenilato cinasa y la proporción de ATP/ADP se

mantuvieron constantes. Mientras que la actividad de la superóxido dismutasa, así como

la peroxidación de lípidos incrementaron junto con la duración de la fase de inmersión,

siendo en los tratamientos de 12 horas de inmersión y de inmersión continua,

significativamente mayores que lo observado en el testigo en medio semisólido, sin

embargo, después de 24 horas en aireación , no se presenta peroxidación de lípidos, sin

importar la duración de la inmersión a la que fue sometida el material, lo cual sugiere que

42

Capítulo 11

la etapa de inmersión induce un estrés oxidativo sustancial que no está asociado a la

inmersión del callo per se (Martre, et al., 2001 ).

Además, en cultivos embriogénicos de café, se ha demostrado que incrementar la

frecuencia de inmersiones breves ( 1 m in cada 24, 12 y 4 horas), estimula la producción de

embriones (480, 2,094 y 3,081 embriones/L) y mejora la calidad (60, 79 y 85% de los

embriones alcanzan la etapa de torpedo). Mientras que por otro lado, un incremento en la

duración de la inmersión (1 , 5 y 15 min) inhibe la regeneración de embriones (de 2,094 a

428 embriones/L) y afecta negativamente la calidad (de 79 a 49% de embriones con

forma de torpedo), así como a la conversión embrión-planta (de 70 a 33%) (Aibarran et

al., 2005).

Entonces, se puede COI}siderar que la relación entre condiciones de crecimiento favorable

durante la etapa de aireación y tiempos cortos estrés por la inmersión, es determinante

para obtener resultados exitosos en la inducción de la embriogénesis somática utilizando

sistemas de inmersión temporal. Es por ello que resulta necesario realizar pruebas con

períodos de inmersión más breves que los utilizados para el desarrollo de este trabajo (2

min) y en caso de ser necesario incrementar la frecuencia de los eventos de inmersión.

Además, resulta importante señalar que el potencial hídrico es la magnitud más empleada

para medir y expresar el estado de energía libre del agua y que está fundamentalmente

determinado por el efecto osmótico, asociado a la presencia de solutos, por las fuerzas

mátricas que adsorben o retienen agua en las matrices sól idas o coloidales, por el efecto

de la altura y por presiones negativas o positivas presentes en sistemas cerrados (Graff,

2011 ). Entonces, es posible que la diferencia en el potencial mátrico del medio líquido, en

comparación con el medio semisólido, pueda ser compensado por medio de la

disminución del potencial osmótico, mediante la adición de una sal neutra en el medio de

cultivo.

Asimismo se pudieron observar ligeras diferencias en la respuesta a los tratamientos de

inmersión temporal entre líneas genéticas, por lo tanto es posible que algunas de las

líneas incluidas en este experimento presenten características que les permitas

sobrellevar el estrés causado por un ambiente altamente húmedo. Sin embargo, se

observa una fuerte tendencia hacia la pérdida del potencial embriogénico. Por ello se

propone diseñar un nuevo experimento en el cual se modifiquen las condiciones

microclimáticas que afectan al material en cultivo.

43

Capítulo 11

Por otro lado, se calculó que el costo total del litro de medio basal de cultivo durante esta

etapa del proceso de micropropagación asciende a los $124. 68, de los cuales, $21 .39

corresponden al costo del gel ificante que se adiciona, lo que representa el 17.16% del

costo total. Sin embargo, al analizar detalladamente el costo desglosado de producción,

encontramos que un ahorro mucho mayor (==70%) se puede alcanzar sustituyendo la

sacarosa grado reactivo por azúcar refinada (Ver Cuadro 2.2).

Cuadro 2.2.- Desglose detallado del costo de la preparación del medio semisólido para la generación y germinación de embriones somáticos. Costos proporcionados por Sigma

Airlrir.h .

Reactivo Precio ($)/1 L medio Reactivo Precio ($)/1 L medio

KN03 3.1979 Na2 EDTA 0.1315

NH4CI 0.648 FeS04 0.0237

KCI 1.6441 L-glutamina 0.749

NaH2P04-H20 0.6232 L-arginina 0.4776

H3803 0.0034 L- asparagina 0.7957

MgS04-7H20 0.3162 Myo-lnositol 0.6285

MnS04-H20 0.0176 Tiamina HCI (Vit 81) 0.0135 Kl 0.0433 Piridoxina HCI (Vit 86) 0.024

ZnS04-7H20 0.0132 Ac. Nicotínico 0.0038

CuS04-5H20 0.0006 Agua destilada 3

CoCI2-2H20 0.0021 Carbón activado 3.205

Na2Mo04-2H20 0.002 Sacarosa 87.3 NiCI2-6H20 0.0001 Gelrite 21.39

CaCI2-2H20 0.4237 Costo total 124.68

44

Capítulo 11


plántulas

Los resultados obtenidos en este experimento confirman lo reportado por Andrade-Torres

et al. (2011) sobre el hecho de que los tratamientos de inmersión temporal durante 2

minutos a intervalos de 1 y 2 horas, tienen un efecto positivo sobre el desarrollo y

crecimiento de plántulas de C. nucifera, particularmente en términos de crecimiento de la

parte aérea, crecimiento de la raíz, crecimiento total, emisión de raíces secundarias y

emisión de hojas nuevas.

De manera similar, se han reportado mejoras al utilizar medio líquido en términos de

crecimiento radicular y emisión de hojas en diferentes cultivares de papa (Mbiyu, et al. ,

2012).También existen reportes de un incremento de talla y peso fresco similar por parte

de plantas que han sobrevivido a la etapa de aclimatación en tres especies del genero

Rhodophiala, sin importar si fueron cultivadas in vitro con medio líquido o adicionado con

gelificante (Muñoz, et al. , 2009).

Por otro lado, se ha reportado que la aplicación de tratamientos de inmersión temporal

incrementa el área foliar y la generación de biomasa en cultivos de piña, utilizando el

sistema de los vasos gemelos comunicantes (Escalona, et al., 2003), mientras que con el

sistema BioMint, se reporta un crecimiento 3.5 veces mayor de la parte aérea y raíces 4.0

veces más largas en cedro rojo, en comparación con el cultivo en medio semisólido

(Peña-Ramírez, et al., 201 O) y una mayor elongación de brotes de chile habanero (Bello

Bello et al., 2010).

Entonces, cobra relevancia continuar monitoreando el desarrollo y crecimiento de los

individuos sometidos a las condiciones experimentales de este trabajo para evaluar su

desempeño bajo condiciones de invernadero e incluso en campo.

Sin embargo, en el presente trabajo también se observa que el incremento en el

número de hojas se ve favorecido de manera temprana (1 05 días) por tiempos largos de

aireación (120.) , mientras que el incremento en el número de raíces secundarias se ve

favorecido (a los 105 días) por tiempos cortos de aireación (20'). Entonces, los resultados

obtenidos sugieren que un tratamiento de dos fases durante el cultivo en biorreactores de

inmersión temporal podría mejorar los resultados, promoviendo el desarrollo temprano de

la parte aérea, por medio de la aplicación de tratamientos similares a T120', y

45

Capítulo 11

posteriormente incrementar la frecuencia de inmersión , mediante la aplicación de

tratamientos similares a T20 ', con el objetivo de fomentar un incremento de la velocidad

de producción de raíces secundarias.

Además, el costo total del litro de medio basal de cultivo durante esta etapa del

proceso de micropropagación asciende a los $38.37, de los cuales, $21. 39 corresponden al

costo del gelificante que se adiciona, lo que representa el 55.75% del costo total (Ver

Cuadro 2.3).

Cuadro 2.3.- Desglose detallado del costo de la preparación del medio semisólido para la elongación y enraizamiento de brotes. Costos proporcionados por Sigma-Aidrich.

Reactivo Precio ($)/1 L medio Reactivo Precio ($)/1 L medio

KN03 3.1979 Na2 EDTA 0.1315 NH4CI 0.648 FeS04 0.0237

KCI 1.6441 L-glutamina 0.749

NaH2P04-H20 0.6232 L-arginina 0.4776

H3803 0.0034 L- asparagina 0.7957

MgS04-7H20 0.3162 Myo-lnositol 0.6285

MnS04-H20 0.0176 Tiamina HCI (Vit 81) 0.0135

Kl 0.0433 Piridoxina HCI (Vit 86) 0.024

ZnS04-7H20 0.0132 Ac. Nicotínico 0.0038

CuS04-5H20 0.0006 Agua destilada 3

CoCI2-2H20 0.0021 Carbón activado 3.205

Na2Mo04-2H20 0.002 Azúcar refinada 1

NiCI2-6H20 0.0001 Gelrite 21.39

CaCI2-2H20 0.4237 Costo total 38.37

De los datos presentados en el párrafo anterior podemos calcular el ahorro

potencial de la siguiente manera:

Actualmente el costo del medio para producir 1,000,000 de plantas se calcula así:

1 frasco cajetero 5 plantas 1 50 mi de medio

1 planta 1 O mi de medio por planta

1 ,000,000 de plantas 10,000 L de medio

6 resiembras 1 año 60,000 L de medio/ año

60,000 L de medio 1 año $ 2,302,200.uu 1 año

46

Capítulo JI

Por lo tanto, podemos calcular el ahorro esperado al prescindir de la adición de gelificante de la siguiente manera:

1 litro de medio basal 3 gr. de gel rite

3 gr de gel rite $21 .;j~

60,000 L de medio basal/año 180,000 gr de gel rite/año

180,000 gr de gel rite/año $1 ,283,400.uu¡año

Si consideramos que la utilización de biorreactores disminuye la cantidad de

medio requerida por planta en cultivo el ahorro incrementa de la siguiente manera:

Frascos cajeteros Biorreactor de inmersión temporal

50 mi de medio 90 mi de medio 1 frasco cajetero 1 biorreactor

5 plantas 12 plantas

1 planta 1 O mi de medio 1 planta 7.5 mi de medio

1,000,000 de plantas 10,000 L de medio 1,000,000 de plantas 7,500 L de medio

6 resiembras por año 60,000 L de medio/año 6 resiembras por año 45,000 L de medio/año

Ahorro esperado: 15,000 L de medio/año= $575,550.uu¡año

Entonces, si consideramos que el costo por litro de medio se ve reducido de $38. 37

a $16.98 y que además la cantidad requerida de medio por año pasa de 60,000 litros a

45,000 litros, entonces el costo anual de la producción de medio para producir un millón

de plantas sería el siguiente:

45,000 Lx $16.98= $764,100.00

Mientras que el ahorro total esperado sería de:

$2,302,200.00-$764,100.00 = $1 ,538,100.00

Los cuales pueden ser desglosados de la siguiente manera:

15,000 L de medio $575,550.uu

3 gr de gel rite * 45,000 L de medio $962,550.uv

Ahorro total esperado $1,538,100.uu

47

Capítulo 11

2.5 CONCLUSIONES

Con los datos obtenidos durante el desarrollo de este trabajo, se puede concluir lo

siguiente:

2.5.1 Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis somática.

1. Los tratamientos de inmersión temporal establecidos para este experimento

generaron la pérdida del potencial embriogénico de los callos utilizados.

2. Se debe probar una mayor cantidad de tratamientos, en los que se evalúen

tiempos de inmersión menores a los probados en este trabajo, ya que se ha

descrito previamente que la reducción del tiempo de inmersión y el incremento

de la frecuencia de la misma, disminuye el daño celular ocasionado y por lo

tanto, favorece la conservación del potencial embriogénico.

3. La sustitución de la sacarosa grado reactivo por azúcar refinada, como fuente

de carbono, podría ser un paso importante para incrementar la rentabilidad del

protocolo de micropropagación, como parte del proceso de escalamiento.

2.5.2 Efecto de l. T. sobre el crecimiento y desarrollo de brotes.

1. El cultivo en medio semisólido es mejor para el desarrollo y crecimiento de los

brotes cultivados in vitro , que el cultivo en medio líquido estacionario.

2. Los tratamientos de inmersión temporal favorecen el incremento en la tasa de

crecimiento de brotes cultivados in vitre, en comparación con los brotes

cultivados en medio líquido estacionario.

3. La ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre las tasas de

crecimiento del material sometido a los tratamientos TOS.S., T120' , indican que

para es posible prescindir del gelificante sin reducir la eficiencia del protocolo

de micropropagación, lo cual , a su vez, acarrea un incremento importante en la

rentabilidad del mismo.

48

Capítulo 11

2.6 REFERENCIAS

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Capítulo 11

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51

Capítulo 11

52

Capítulo 111

CAPÍTULO 111

Evaluación del uso de imágenes termográficas para la selección de plantas de C.

nucífera, obtenidas in vitro, que posean mayor potencial de productividad.

3.1 INTRODUCCIÓN

La termografía ha demostrado ser una herramienta muy ventajosa en campos como la

ingeniería, la medicina y la farmacología , además, en la agricultura se utiliza como

herramienta auxiliar en el control de enfermedades, calendarización del riego, cálculos del

momento ideal para la cosecha, diseño de invernaderos, control de plagas, evaluación de

madurez, detección de heridas, secado de maderas y cálculos del rendimiento

(Manickavasagan, et al., 2005). También se han utilizado imágenes termográficas para

realizar estudios cuantitativos de la variación tiempo-espacial de la conductancia

estomática (Jones, 1999), lo cual se estudió bajo condiciones de campo en viñedos

(Jones, et al. , 2002) posteriormente para estudiar las relaciones hídricas de cultivos de

importancia económica como las alubias y la vid (Jones y Leinonen, 2003), también se ha

util izado de manera conjunta con fotografías convencionales para identificar plantas bajo

estrés hídrico (Leinonen y Jones, 2004) se ha evaluado su utilidad, junto con termometría

infrarroja en estudios de fis iología y ecofisiología vegetal (Jones,2004) lo que ha derivado

en la optimización de la técnica para detectar el cierre estomático como respuesta al

estrés hídrico, bajo condiciones de invernadero (Grant, et al. , 2006). Sin embargo, no es

sino hasta 201 O que se reportó una metodología que permite utilizar la termografía para

detectar diferencias en la productividad de distintas variedades de Oryza sativa, sin

importar las condiciones cl imáticas (Takai, et al., 201 0).

Uno de los objetivos del Laboratorio de Cocotero del CICY, es proveer las herramientas

necesarias para restablecer las plantaciones de cocotero, para lo cual se requiere que el

material biológico que se propaga, sea resistente al AL y también presente una

productividad elevada, precoz y estable. Actualmente se cuenta con una estrategia de

selección en términos de resistencia a AL y resulta de relevancia generar una estrategia

para seleccionar el material que cumpla con las características de productividad

requeridas, es por ello que en este trabajo se evaluó la utilidad de la termografía para

detectar individuos de Cocos nucifera con elevado potencial de productividad .

53

Capítulo 111

3.2 MATERIALES Y MÉTODOS

Para probar la utilidad de la termografía como herramienta de selección, en términos de

productividad , se utilizará la metodología propuesta por Takai , et al. (2010), en la cual se

considera como la variable a medir, la diferencia que existe entre la temperatura foliar y la

temperatura del aire que rodea a la hoja; de esta manera, se elimina la necesidad de

poseer una complicada serie de referencias (seca, húmeda y de tamaño de poro

conocido) requeridas por el método de Jones (2004).

Para obtener las imágenes termográficas, se utilizó una cámara infrarroja ICI Prodigy 640

y los datos generados por las imágenes termográficas, fueron comparados con los datos

obtenidos mediante la utilización de un analizador infrarrojo de intercambio gaseosos,

IRGA por sus siglas en inglés, marca LI-COR, modelo Ll-6400 con fuente de dióxido de

carbono.

Material Biológico:

146 individuos, pertenecientes al ecotipo "alto del pacífico" y producidos in vitro por la vía

de la embriogénesis somática, fueron transferidos a condiciones de invernadero, donde

cumplieron con el proceso de aclimatación, y 30 días después, se inició la colecta de

datos, tanto con el IRGA como con la cámara termográfica.

Colecta de Datos:

De los 146 individuos, se seleccionaron aleatoriamente 9 individuos de cada línea (54

individuos en total) para tomar imágenes termográficas y fotografías convencionales. De

estos 54 individuos, se seleccionaron, nuevamente al azar, 3 individuos por línea (18

individuos en total) para realizar las mediciones con el Analizador Infrarrojo de

Intercambio Gaseoso (IRGA).

Además, se seleccionaron parejas de individuos contrastantes, en función del crecimiento

exhibido bajo condiciones de invernadero, para realizar la colecta de datos tanto con la

cámara termográfica como con el IRGA.

Los datos obtenidos fueron analizados con el paquete estadístico SAS 9.0 para Windows.

54

Capítulo 111

3.3 RESUL lADOS

Después de 30 días a partir de la transferencia a condiciones ex vitro, se realizó la

primera colecta de datos y se pudieron detectar diferencias significativas entre algunas de

las líneas incluidas en el estudio.

Durante este muestreo, se pudo observar que el número y el tamaño de las hojas con las

que se cuenta no permiten obtener un dato general y preciso de la temperatura foliar de

las líneas (Ver Figura 3.1 ), por lo que colectaron los datos de manera individual (Ver

Figura 3.2), para calcular posteriormente la temperatura foliar promedio de cada una de

las líneas.

Figura 3.1. Vista panorámica de la muestra experimental. Se puede observar que el área ocupada en la imagen por las estructuras foliares, es mucho menor que la ocupada por el suelo, es por ello que no es posible trazar una línea que genere un dato único que promedie con certeza la temperatura foliar de cada línea. Ver ejemplos a) y b).

Figura 3.2. Ejemplo de la colecta individual de datos con la cámara termográfica . La colecta de datos se realizó hoja por hoja, como se puede apreciar con las líneas denominadas 1, 2, 3 y 4.

55

Capítulo 111

Durante el primer muestreo, se pudo observar que las líneas con las tasas fotosintéticas

más elevadas fueron la M1-125(13) y la C1-9(7); las tasas de conductancia más elevada

correspondió a C1-79(16), C1-29(15) y M1-125(1 3); en términos de transpiración , los

valores más altos correspondieron a C1-79(16), M1-125(13), C1-29(15) y M1-192(19); las

líneas que presentaron mayor eficiencia en el uso de agua fueron C1-9(7) y M1 -150(19);

por otro lado, las diferencias más negativas entre la temperatura del aire circundante a la

hoja y la hoja, correspondieron a M1-192(19), C1-29(15), M1-125(13) y C1-79(16). En la

Cuadro 3.1 se presentan los resultados del análisis estadístico ANOVA correspondiente.

Cuadro 3.1 .- Resumen de los resultados del análisis estadístico LSD realizado por líneas con los datos obtenidos durante el primer muestreo de la evaluación de la utilidad de la

termografía para detectar diferencias en el potencial de productividad.

Línea Foto Cond Trmmol WUE Taire Tfoliar ~Termo

C1-9(7) 1.30 a 0.01 cd 0.17 b 8.02 a 27.99 f 22.95 e -5.04 a M1-150(19) 0.69 e 0.01 d 0.1 2 b 6.75 ab 29.24 e 24.30 ab -4.95 a C1-79(16) 0.89 be 0.02 a 0.46 a 2.01 d 30.49 d 23.73 be -6.76 b C1-29(15) 1.24 ab 0.02 ab 0.36 a 4.45 be 31.37 e 24.19 ab -7.18 b

M1-125(13) 1.56 a 0.02 ab 0.42 a 3.66 cd 31.86 b 24.92 a -6.95 b M1-192(19} 0.73 e 0.01 be 0.33 a 2.52 cd 32.51 a 24.78 a -7.73 b

c.v. 31.30 40.37 39.24 47.80 0.69 3.42 -14.27 Rz 0.49 0.47 0.52 0.51 0.98 0.41 0.59

*Valores proseguidos por la misma letra dentro de cada columna son iguales de acuerdo a la prueba ANOVA con una P:50.05 . Abreviaciones: Foto = tasa fotosintética ; Cond= conductancia; Trmmol = transpiración; WUE = eficiencia del uso de agua; Taire = temperatura del aire que rodea a la hoja; Tfoliar = temperatura de la superficie foliar; ll.termo =diferencia entre la tem~eratura fol iar 'L la tem~eratura del aire circundante a la hoja.

Al analizar los datos provenientes de cada individuo, se obtuvieron diferencias

significativas entre individuos al interior de la mayoría de las líneas, sin embargo se

pueden observar tendencias en la distribución de individuos sobresalientes: aquellos que

presentan mayores tasas fotosintéticas se presentan en las líneas M1-125(13), C1-9(7) y

C1-29(15); aquellos que presentan altos valores para la conductancia en C1-79(16) y M1-

125(13), sin embargo el valor más sobresaliente se encuentra en la línea C1-29(15); en

términos de transpiración , los valores más altos se encuentran en las líneas C1-29(15),

M1-125(13) y en C1-79(16); también se observa que los sujetos más eficientes en el uso

del agua corresponden a M1-150(19), C1-9(7) y C1-29(15); finalmente las diferencias más

negativas corresponden a M1-192(19), M1-125(13) y C1-29(15) (Ver Cuadro 3.2).

56

Capítulo 111

Cuadro 3.2.- Resumen de los resultados del análisis estadístico LSD realizado por individuos con los datos obtenidos durante el primer muestreo de la evaluación de la IJtilirl~rl rlP. 1~ tP.rmnnr~fí~ n~r~ rlP.tP.r.t~r rlifP.rP.nr.i~!'-; P.n P.l nntP.nr.i~l rlP. nrnrl1Jdivirl~rl .

Línea lnd Foto Cond Trmmol WUE Taire Thoja .llTermo

E 1.04 de 0.01 9 0.19 hi 5.51 d 27.75 r 24.22 h -3 .53 a

~ 2 1.60 b 0.01 9 0.20 9h 7.86 e 28.00 q 23.62 m -4.38 e .... (.) 3 1.28 e 0.01 ij 0.12 j 10.70 b 28.22 p 21 .00 p -7 .22 n

e;;- 4 0.54 h 0.01 0.12 4 .50 de 28.92 o 25.17 e -3.75 b ..... 5 0.91 def9 0.00 k 0.08 k 12.17 29.07 24.02 -5.05 d .-~ a n ::¡¡o ..., 6 0.61 h 0.01 h 0.17 3.58 ef 29.74 23.71 -6.03 .... m e

7 0.95 def 0.02 e 0.45 d 2.11 gh 30.28 23.82 -6.46 f ,ID ........ 8 0.84 fg 0.03 b 0.55 e 1.52 h 30.50 k 23.59 n -6.91 k U(ñ ..... 9 0.88 efg 0.02 e 0.87 e 2.41 gh 30.67 23.78 k -6.89

- 10 1.34 e 0.04 a 0.64 a 2.11 gh 31.18 24.56 f -6.62 ,..., 11 1.07 d 0.01 0.28 f ........ 9 3.84 ef 31.39 h 24.22 h -7 .17 m

U(ñ N 12 1.30 e 0.01 0.18 7.39 e 31 .53 g 23.78 k -7 .75 q

¡;;- 13 1.41 e 0.02 e 0.43 d 3.25 f9 31 .77 f 24.44 9 -7.33 o ..... 14 2.49 0.03 b 0.61 b 4.05 ef 31 .82 25.34 b -6.48 .-~ a e 9 :::!:"" N 15 0.78 0.01 h 0.21 3.66 ef 32 .00 d 24.97 -7.03 .... g 9 e

,Oi' 16 0.79 fg 0.01 hi 0.20 9 3.87 ef 32.29 e 23.32 o -8.97

.... :=. 17 0.59 h 0.02 e 0.43 d 1.37 h 32.54 b 25.98 a -6 .56 h ::¡¡N en

18 0.82 fg 0.01 0.35 2.32 9h 32 .70 25.04 d -7 .66 .... e a p

c.v. 6.81 2.85 2.68 11.17 0.01 0.00 -0 .07 R2 0.98 1.00 1.00 0.98 1.00 1.00 1.00

*Valores proseguidos por la misma letra dentro de cada columna son iguales de acuerdo a la prueba ANOVA con una p:::;o.05. Abreviaciones : Foto= tasa fotosintética ; Cond= conductancia ; Trmmol ""transpiración ; WUE = eficiencia del uso de agua; Taire =temperatura del aire que rodea a la hoja; Tfoliar =temperatura de la superficie fol iar; Lltermo = diferencia entre la temperatura foliar y la temperatura del aire circundante a la hoja.

Para el segundo muestreo realizado (18 semanas después del primero), se pudo observar

que las tasas fotosintéticas más elevadas correspondieron a los individuos de las líneas

C1-29(15) y M1-125(13) y que las diferencias existentes entre ellas son estadísticamente

despreciables; además en términos de la eficiencia del uso de agua, el máximo valor ha

correspondido a la línea C1-29(15); por otro lado, se aprecia que el valor más negativo de

la diferencia entre la temperatura foliar y la del aire que circunda a la hoja, corresponde a

los individuos de la línea M1-125(13), el cual es estad ísticamente equivalente al valor

correspondiente obtenido de los individuos de la línea C1-29(15) (Ver Cuadro 3.3).

57

Capítulo 111

Cuadro 3.3.- Resumen de los resultados del análisis estadístico LSD realizado por líneas con los datos obtenidos durante el segundo muestreo de la evaluación de la utilidad de la

termografía para detectar diferencias en el potencial de productividad.

Línea Foto Cond Trmmol WUE Taire Tfoliar ~Termo

C1-9(7) 2.57 b 0.11 a 1.61 a 1.59 d 32.17 f 39.21 a 7.04 a M1-150(19) 3.18 b 0.09 b 1.46 a 2.22 cd 32.43 e 33.70 b 1.27 b C1-79(16) 3.09 b 0.09 b 1.51 a 2.11 cd 32.62 d 31 .91 e -0.71 e C1·29(15) 4.44 a 0.07 e 1.16 b 3.92 a 32.76 e 29.57 e -3.19 de

M1·125(13) 3.91 a 0.09 b 1.57 a 2.49 e 32.98 b 29.35 e -3.63 e M1-192{19} 2.97 b 0.06 e 1.06 b 3. 18 b 33.22 a 30.36 d -2.85 d

c.v. 24.09 17.03 16.11 32.55 0.1 8 2.32 -205.42 R2 0.38 0.57 0.47 0.46 0.97 0.96 0.97

*Valores proseguidos por la misma letra dentro de cada columna son iguales de acuerdo a la prueba ANOVA con una PS0.05. Abreviaciones: Foto = tasa fotosintética ; Cond= conductancia; Trmmol = transpiración; WUE = eficiencia del uso de agua; Taire = temperatura del aire que rodea a la hoja; Tfoliar = temperatura de la superficie foliar; Lltermo = diferencia entre la tem~eratura foliar i: la tem~eratura del aire circundante a la hoja.

En el correspondiente análisis de datos realizados tomando en cuenta a cada uno de los

individuos, se puede observar que existen diferencias significativas entre individuos para

todas las variables, incluso cuando pertenezcan a la misma línea, sin embargo se puede

observar una tendencia hacia la homogeneidad de los valores obtenidos para la diferencia

de temperaturas hacia el interior de las diferentes líneas. En términos de la tasa

fotosintética , los individuos con las tasas más elevadas se encuentran en las líneas C1-

29(15), M1-125(13) y en C1-79(16); el individuo con la mayor tasa de conductancia se

encontró en la línea C1-79(16) y los que no presentan diferencias significativas se

acumulan en la línea C1-9(7); las plantas que más transpiran se encontraron en las líneas

C1-79(16), M1-125(13), C1-9(7) y M1-150(19); por otro lado, los que resultaron más

eficientes en el uso de agua se encontraron en la línea C1-29(15), M1-192(19) y uno más

en la línea M1-150(19); finalmente, las diferencias más negativas entre la temperatura del

aire que circunda a la hoja y la de la superficie de la hoja, se encontraron en las líneas

M1-125(13), C1-29(15) y en la M1-192(19). (Ver Cuadro 3.4).

58

Capítulo 111

Cuadro 3.4.- Resumen de los resultados del análisis estadístico LSD realizado por individuos con los datos obtenidos durante el segundo muestreo de la evaluación de la

utilidad de la termografía para detectar diferencias en el potencial de productividad.

Línea lnd Foto Cond WUE Taire Thoja .tlTermo

E 2.62 gh 0.11 abe 1.62 fg 32.07 r 37.91 e 5.84 e

<ll 2 2.82 efgh 0.11 abe 1.78 defg 32.17 q 38.12 b 5.95 b .... (.) 3 2.88 defgh 0.11 ab 1.75 efg 32.26 p 41.60 a 9.34 a

Cñ 4 3.67 e de 0.1 0 bcd 2.35 edef 32.38 o 33.21 0.83

' ..... 5 3.45 edefg 0.08 ef 2.78 32.43 33.80 1.37 ..... o e n e e :E ll) ..... 6 2.51 h 0.10 ed 1.67 fg 32.49 m 34.09 d 1.60 d

7 2.45 h 0.12 a 1.34 g 32.59 31.41 -1.18

' íi)

8 4.04 be 0.09 d 2.65 ede 32.62 k 32.29 -0.33 ..... ..... g g (.) O)

...... 9 2.75 fgh 0.07 g 2.40 edef 32.65 32 .02 h -0.63 h

10 4.18 be 0.06 g 4.06 b 32.69 29.42 p -3.27 o

' íñ 11 5.79 0.07 fg 5.1 0 32.76 h 29.69 -3.07 ..... ..... a a m

(.) O) N 12 3.58 edef 0.07 efg 2.90 e 32.83 g 29.60 n -3.23 n

M' 13 3.42 edefg 0.08 e 2.54 cdef 32.90 29.23 r -3.67 q

' ..... 14 4 .57 b 0.10 bcd 2.71 ed 32.97 29.24 -3.73 ..... ¡¡;- e q r :E N ..... 15 3.74 bed 0.10 ed 2.29 edef 33.05 d 29.57 o -3.48 p

16 3.58 edef 0.07 g 3.00 e 33.16 e 30.02 -3.14 m Cñ

' ..... 17 2.56 gh 0.08 1.81 defg 33.21 b 30.42 k -2.79 k ..... Ñ e

:E en 18 2.57 gh 0.03 . h 4.48 ab 33.28 30.64 j -2.64 j a

c.v. 14.75 6.84 20.32 0.01 0.00 -1.33

Rz 0.77 0.94 0.80 1.00 1.00 1.00

59

Capítulo 111

3.4 DISCUSIÓN

De acuerdo a los resultados obtenidos con la utilización de imágenes termográficas y la

metodología reportada por Takai et al. (201 0), que señalan que son las que poseen

mayores tasas de fotosíntesis y de transpiración se puede inferir que las líneas para las

cuales se puede predecir una mayor productividad después de 30 días de la transferencia

a condiciones ex vitro, son la C1-79(16), C1-29(15), M1-125(13) y la M1-192(19) y

además no existen diferencias significativas entre los valores obtenidos para todas ellas ,

en términos de la diferencia existente entre la temperatura del aire que circunda a la hoja

y la temperatura de la superficie foliar.

Anteriormente se ha reportado la existencia de una correlación entre la tasa fotosintética y

la productividad (Rajendudru , et al., 1987), en este sentido, se esperaría que la línea M1-

125(13) presente el mayor potencial de productividad, debido a que en ambos muestreos

tuvo las tasas fotosintéticas más elevadas; además, las líneas C1-9(7) y C1-29(15) no

presentaron diferencias sign ificativas con la línea M1-125(13) en el primer y segundo

muestreo respectivamente. Sin embargo, también se ha señalado que una elevada tasa

fotosintética no puede garantizar altos rendimientos, ya que para que esta premisa se

cumpla sería necesario que todos los fotosintatos que la planta obtiene se destinaran a la

construcción rápida de biomasa estructural (Hansen, et al. , 1998), lo cual se ve reflejado

en el hecho de que tasas fotosintéticas elevadas no garanticen una elevada eficiencia en

el uso del agua, tal cual se observa en la línea M1-125(13) ya que en ambos muestreos

presentó elevadas tasas fotosintéticas y baja eficiencia en el uso de agua, por su parte, la

línea M1-150(19) durante el primer muestreo y en la línea M1-192(19) durante el segundo,

exhibieron las tasas de eficiencia de uso de agua más elevadas sin ser sobresalientes en

términos de la tasa fotosintética , en este sentido, Condon, et al. (2004) señala que existen

correlaciones entre una elevada eficiencia del uso de agua y producción de biomasa. Sin

embargo, también se ha reportado que valores elevados para la conductancia se

correlacionan con elevadas tasas fotosintéticas y por ende con el potencial de producción

de biomasa bajo condiciones de riego (Lu , et al., 1997) y de acuerdo a esto, las líneas de

las que se podría predecir un elevado potencial productivo son, durante ambos muestreos

la C1-29(15) y la M1-125(13). Finalmente, considerando lo propuesto por Takai et al. ,

(201 0), deberíamos señalar que las líneas potencialmente más productivas son la C1-

79(16), C1-29(15), M1-125(13) y M1-192(19) durante el primer muestreo; así como M1-

125(13) y C1-29(15) durante el segundo muestreo.

60 .

Capítulo 111

Cabe señalar que las líneas C1-29(15) y M1-125(13), además de ser constantemente

señaladas con un potencial de productividad elevado de acuerdo a lo propuesto por Takai

(201 0), también cumplen con las condiciones propuestas por otros autores como son la

elevada tasa fotosintética, conductancia y transpiración durante el primer muestreo; sin

embargo, para el segundo muestreo, la línea C1-29(15) exhibe una ganancia en términos

de eficiencia del uso de agua, derivada del mantenimiento de una elevada tasa

fotosintética y la disminución de la conductancia y la transpiración.

Los resultados generados indican que las dos líneas con mayor potencial de productividad

son la C1-29(15) y la M1-125(13), siempre que no se presenten a una presión selectiva

como la escasez de agua. Por su parte, la línea C1-29(15) podría comportarse de mejor

manera con menor disponibilidad de agua.

En este sentido, recientemente se ha reportado, que para superar la dificultad que

representan las tendencias de los individuos con baja conductancia estomática a poseer

altas tasas de eficiencia del uso de agua bajo condiciones de sequía, y la de aquellos con

bajas tasas de conductancia estomática sometidos a condiciones óptimas a ser poco

vigorosos, se puede recurrir a la determinación de isótopos de carbono-13 en conjunto

con las imágenes termográficas, como una estrategia para seleccionar aquellos individuos

que presenten simultáneamente altas tasas de conductancia estomática y de eficiencia de

uso de agua (Grant, et al. , 2012), por lo cual podría resultar benéfico realizar trabajos

similares con cocotero para evaluar la utilidad de dicha estrategia.

61

Capítulo 111

3.5 CONCLUSIONES

De los datos realizados durante este trabajo, se puede inferir que:

1.- Las imágenes termográficas han permitido detectar diferencias entre líneas e

individuos de Cocos nucifera que se incluyeron en este trabajo.

2.- Ya que la diferencia entre la temperatura del aire circundante a la hoja y la temperatura

foliar parece ser un indicador del estado fisiológico de los individuos de Cocos nucifera,

podemos señalar que la termografía es una técnica con que podría facilitar la detección

de líneas e individuos sobresalientes en términos de potencial de productividad .

3.- Para identificar las características clave de dichos individuos que les permitirían

sobresalir bajo condiciones de cultivo particulares, se requiere de información fisiológica

más detallada, como la tasa fotosintética, y la transpiración para poder calcular la

eficiencia del uso de agua. Lo cual cobra particular importancia al tomar en consideración

que cada campo de cultivo presenta condiciones medio ambientales diferentes y que

éstas pueden representar una limitante para garantizar el desempeño del material

propagado.

4.- Resulta de particular importancia realizar un seguimiento de este trabajo para

caracterizar a la totalidad de las líneas que conforman la colección de germoplasma de

Cocos nucifera mantenidas en el Laboratorio de Propagación Clonal del Centro de

Investigación Científica de Yucatán, en términos de su potencial de productividad.

5.- La continuidad de este trabajo permitiría corroborar bajo condiciones de campo y con

individuos en edad reproductiva , que dicho potencial de productividad se vea reflejado en

caracteres de importancia agronómica.

1

62

Capítulo 111

3.6 REFERENCIAS

Condon , A. G., R. A. Richards, G. B. Rebetzke, G. D. Farquhar. 2004. Breeding for high

water-use efficiency. Journal of Experimental Botany. Vol. 55. No. 407. Water-Saving

Agriculture Speciallssue, pp. 2447-2460.

Grant, O. M. , M. M. Chaves, H. G. Jones. (2006). Optimizing thermal imaging technique

for detecting stomatal closure induced by drought stress under greenhouse conditions.

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Grant, O. M. , M. J. Davies, C. M. James, A. W. Johnson, l. Leinonen , D. Simpson. (2012).

Thermal imaging and carbon isotope composition indicate variation amongst strawberry

(Fragaria x ananassa) cultivars in stomatal conductance and water use efficiency.

Environmental and Experimental Botany. 76: 7-15.

Hansen, L. D. , B. N. Smith , R. S. Criddle. (1998). Calorimetry of plant metabolism: A

means to rapidly increase agricultura! biomass production. Pure & Applied Chemistry.

70(3): 687-694.

Jones, H. G. (1999). Use of thermography for quantitative studies of spatial and temporal

variation of stomatal conductance over leaf surfaces. Plant Cell and Environment. 22:

1043-1055.

Jones, H. G. , M. Stoll, T. Santos, C. de Sousa, M. M. Chaves, O. M. Grant. (2002). Use of

infrared thermography for monitoring stomatal closure in the field: application to gravepine.

Journal of Experimental Botany. 53(378): 2249-2260.

Jones, H. G. , l. Leinonen. (2003). Thermal imaging for the study of plant water relations .

Journal of Agricultura! Meteorology. 59(3):205-217.

Jones, H. G. 2004. Application of thermal imaging and infrared sensing in plant physiology

and ecophysiology. Advances in Botanical Research. 41 : 107-163.

Leinonen, 1. , H. G. Jones. (2004). Combining thermal and visible imagery for estimating

canopy temperature and identifying plant stresses. Journal of Experimental Botany.

55(401 ): 1423-1431

63

Capítulo 111

Lu , Z., R. G. Percy, C. O. Qualset, E. Zeiger. 1998. Stomatal conductance predicts yields

in irrigated Pima cotton and bread wheat grown at high temperatures. Journal of

Experimental Botany, Vol. 49, Special lssue, pp. 453-460

Manickavasagan, A. , D. S. Jayas, N. D.G. White, J. Paliwal. 2005. Applications of thermal

imaging in agriculture - A review. Written for presentation at the CSAE/SCGR 2005

meeting. Winnipeg , Manitoba.

Rajendudru , G. , J. M. Rama Prassad, V. S. Rama Das. (1987). Correlation between the

foliar dark respiration and net photosynthesis in some tropical dicot weeds. Weed science.

35: 141-144.

SAS lnstitute lnc. (2002). The SAS system for Windows 9.0. Cary, NC, USA.

Takai, T., M. Yano, T. Yamamoto. (2010). Canopy temperatura on clear and cloudy days

can be used to estímate varietal differences in stomatal conductance in rice . Field crops

research: 115: 165-170.

64

Capítulo IV

CAPÍTULO IV

4.1 DISCUSIÓN GENERAL

En el año 2012, la población mundial alcanzó los 7 billones de personas y existen

predicciones sobre la llegada de la población mundial a los 9.1 billones de seres humanos

para el año 2050, por lo que se considera que la producción agrícola a nivel mundial se

debe incrementar en 70% para satisfacer la demanda alimentaria y de biocombustibles;

además se considera que en países en vías de desarrollo, el 80% del incremento

requerido puede provenir de las mejoras en el rendimiento y la intensidad de la

agricultura, mientras que solamente el 20% del incremento de la cantidad de tierra

cultivada (FAO, 2012). En consecuencia , resulta de primera importancia utilizar el

conocimiento generado y acumulado por la ciencia para desarrollar tecnologías y

productos sostenibles que permitan cubrir la demanda mundial por bienes de origen

agrícola y es por esta razón, que en el Laboratorio de Cocotero del Centro de

Investigación Científica de Yucatán, se persigue la meta de escalar el proceso de

micropropagación de uno de los cultivos agrícolas más importantes e integralmente

aprovechables a nivel mundial. Es por ello, que el presente trabajo se realiza esfuerzo por

incrementar la eficiencia y la rentabilidad del protocolo actual de micropropagación de

Cocos nucifera (Pérez-Núñez, et al., 2006) sin dejar de lado la importancia de obtener

mayores rendimientos agrícolas.

Bajo las condiciones experimentales para evaluar la utilidad de los biorreactores de

inmersión temporal para promover la eficiencia de la obtención y germinación de

embriones somáticos a partir de callos embriogénicos obtenidos in vitro, establecidas para

este trabajo, no se pudieron generar embriones somáticos y la totalidad del callo

embriogénico utilizado perdió el perfil morfológico característico de un callo con potencial

embriogénico. Fisiológicamente se puede distinguir entre el crecimiento y el desarrollo, el

primero se presenta cuando la presión del agua al interior de la célula (presión de

turgencia), provoca el incremento de talla obligando a la pared y a las membranas a

expandirse, dicho fenómeno depende de la rapidez de la entrada del agua a la célula, la

cual depende a su vez del gradiente del potencial hídrico y de la permeabilidad de la

membrana al agua (Salisbury y Ross, 2000); por otro lado, se define al desarrollo o

morfogénesis como la sumatoria del crecimiento y la especialización celular para dar lugar

a la formación de tejidos, órganos y organismos (Salisbury y Ross, 2000). Por lo tanto, el

crecimiento observado era de esperarse debido a un incremento en las diferencias del

65

Capítulo IV

potencial hídrico entre el tejido en cultivo y el medio nutritivo, sin embargo, esto no

necesariamente conlleva un efecto positivo sobre el proceso de diferenciación y

especialización celular y en consecuencia sobre el desarrollo o la morfogénesis.

En trabajos previos se ha reportado que el cultivo in vitro utilizando biorreactores de

inmersión temporal , puede generar condiciones estresantes para el explante, diferentes a

los que se presentan en sistemas tradicionales. En callos de Hevea brasiliensis, se

observe que durante la fase de inmersión, la tasa de respiración fue similar en

tratamientos de inmersión de (1 min, 1 hr, 12hr y 24hr de inmersión/ día) y en medio

semisólido, sin embargo, durante la fase de aireación, la respiración incrementó 140-

164% en los tratamientos de 12 horas de inmersión y de inmersión continua. Por otro

lado, la concentración total de la adenilato cinasa y la proporción de ATP/ADP se

mantuvieron constantes. Mientras que la actividad de la superóxido dismutasa, así como

la peroxidación de lípidos incrementaron junto con la duración de la fase de inmersión,

siendo en los tratamientos de 12 horas de inmersión y de inmersión continua,

significativamente mayores que lo observado en el testigo en medio semisólido, sin

embargo, después de 24 horas en aireación, no se presenta peroxidación de lípidos, sin

importar la duración de la inmersión a la que fue sometida el material, lo cual sugiere que

la etapa de inmersión induce un estrés oxidativo sustancial que no está asociado a la

inmersión del callo per se (Martre, et al., 2001 ).

Además, en cultivos embriogénicos de café, se ha demostrado que incrementar la

frecuencia de inmersiones breves (1 min cada 24, 12 y 4 horas), estimula la producción de

embriones (480, 2,094 y 3,081 embriones/L) y mejora la calidad (60, 79 y 85% de los

embriones alcanzan la etapa de torpedo). Mientras que por otro lado, un incremento en la

duración de la inmersión (1 , 5 y 15 min) inhibe la regeneración de embriones (de 2,094 a

428 embriones/L) y afecta negativamente la calidad (de 79 a 49% de embriones con

forma de torpedo), así como a la conversión embrión-planta (de 70 a 33%) (Aibarran et

al., 2005).

Entonces, se puede considerar que la relación entre condiciones de crecimiento favorable

durante la etapa de aireación y tiempos cortos estrés por la inmersión, es determinante

para obtener resultados exitosos en la inducción de la embriogénesis somática utilizando

sistemas de inmersión temporal. Es por ello que resulta necesario realizar pruebas con

períodos de inmersión más breves que los utilizados para el desarrollo de este trabajo (2

min) y en caso de ser necesario incrementar la frecuencia de los eventos de inmersión.

66

Capítulo IV

Además, resulta importante señalar que el potencial hídrico es la magnitud más empleada

para medir y expresar el estado de energía libre del agua y que está fundamentalmente

determinado por el efecto osmótico, asociado a la presencia de solutos, por las fuerzas

mátricas que adsorben o retienen agua en las matrices sólidas o coloidales, por el efecto

de la altura y por presiones negativas o positivas presentes en sistemas cerrados (Graff,

2011 ). Entonces, es posible que la diferencia en el potencial mátrico del medio líquido, en

comparación con el medio semisólido, pueda ser compensado por medio de la

disminución del potencial osmótico, mediante la adición de una sal neutra en el medio de

cultivo.

Asimismo, se calculó que el costo total del litro de medio basal de cultivo (Sigma-Aidrich,

2012) durante esta etapa del proceso de micropropagación asciende a los $124. 68, de los

cuales, $21 .39 corresponden al costo del gelificante que se adiciona, lo que representa el

17.16% del costo total. Además, al analizar detalladamente el costo desglosado de

producción , encontramos que un ahorro mucho mayor (==70%) se puede alcanzar

sustituyendo la sacarosa grado reactivo por azúcar refinada, por lo que se propone probar

la viabilidad de realizar dicha sustitución en trabajos posteriores.

En lo que respecta a la evaluación del uso de biorreactores de inmersión temporal como

promotores del desarrollo de vitroplantas de C. nucifera, los resultados confirman lo

reportado por Andrade-Torres et al. (2011) sobre el hecho de que los tratamientos de

inmersión temporal durante 2 minutos a intervalos de 1 y 2 horas, tienen un efecto positivo

sobre el desarrollo y crecimiento de plántulas de C. nucifera, particularmente en términos

de crecimiento de la parte aérea, crecimiento de la raíz, crecimiento total, emisión de

raíces secundarias y emisión de hojas nuevas. De manera similar, se han reportado

mejoras al utilizar medio líquido en términos de crecimiento radicular y emisión de hojas

en diferentes cultivares de papa (Mbiyu , et al. , 2012). También existen reportes de un

incremento de talla y peso fresco similar por parte de plantas que han sobrevivido a la

etapa de aclimatación en tres especies del genero Rhodophiala, sin importar si fueron

cultivadas in vitro con medio líquido o adicionado con gelificante (Muñoz, et al. , 2009). Por

otro lado, se ha reportado que la aplicación de tratamientos de inmersión temporal

incrementa el área foliar y la generación de biomasa en cultivos de piña, utilizando el

sistema de los vasos gemelos comunicantes (Escalona, et al. , 2003), mientras que con el

sistema BioMint, se reporta un crecimiento 3.5 veces mayor de la parte aérea y raíces 4.0

veces más largas en cedro rojo, en comparación con el cultivo en medio semisólido

67

Capítulo IV

(Peña-Ramírez, et a/. , 2010) y una mayor elongación de brotes de chile habanero (Bello

Bello et a/., 201 0). En este sentido, cobra relevancia continuar monitoreando el desarrollo

y crecimiento de los individuos sometidos a las condiciones experimentales de este

trabajo.

Sin embargo, en el presente trabajo también se observó que el incremento en el número

de hojas se ve favorecido de manera temprana (1 05 días) por tiempos largos de aireación

(120'), mientras que el incremento en el número de raíces secundarias se ve favorecido

(a los 105 días) por tiempos cortos de aireación (20'). Entonces, los resultados obtenidos

sugieren que un tratamiento de dos fases durante el cultivo en biorreactores de inmersión

temporal podría mejorar los resultados, promoviendo el desarrollo temprano de la parte

aérea, por medio de la aplicación de tratamientos similares a T120' , y posteriormente

incrementar la frecuencia de inmersión, mediante la aplicación de tratamientos similares a

T20 ' , con el objetivo de fomentar un incremento de la velocidad de producción de raíces

secundarias.

Además, se calculó que el costo total del litro de medio basal de cultivo (Sigma-Aidrich,

2012) durante esta etapa del proceso de micropropagación asciende a los $38.37, de los

cuales, $21. 39 corresponden al costo del gelificante que se adiciona , lo que representa el

55.75% del costo total. Con base en estos cálculos podemos estimar que el ahorro neto

esperado por este concepto sobre la producción de 1 ,000,000 de plantas podría alcanzar

el valor de $1 ,283,400.00 por año. Si además consideramos que la cantidad de medio de

cultivo requerida por planta se ve reducida con la utilización de los biorreactores, la cifra

aumenta hasta alcanzar un total de $1 ,538,1 00.00•

Finalmente, el trabajo realizado para evaluar el uso de imágenes termográficas para la

selección de plantas de C. nucifera, obtenidas in vitro, que posean mayor potencial de

productividad , arrojó que de acuerdo a la metodología reportada por Takai et al. (2010),

se puede inferir que las líneas para las cuales se puede predecir una mayor productividad

después de 30 días de la transferencia a condiciones ex vitro, son la C1-79(16), C1-

29(15), M1-125(13) y la M1-192(19) y no existen diferencias significativas entre los

valores obtenidos para todas ellas, en términos de la diferencia existente entre la

temperatura del aire que circunda a la hoja y la temperatura de la superficie foliar.

Anteriormente se ha reportado la existencia de una correlación entre la tasa fotosintética y

la productividad (Rajendudru , et a/., 1987), en este sentido, se esperaría que la línea M1-

125(13) presente el mayor potencial de productividad , debido a que en ambos muestreos

68

Capítulo IV

tuvo las tasas fotosintéticas más elevadas; además, las líneas C1-9(7) y C1-29(15) no

presentaron diferencias significativas con la línea M1-125(13) en el primer y segundo

muestreo respectivamente. Sin embargo, también se ha señalado que una elevada tasa

fotosintética no puede garantizar altos rendimientos, ya que para que esta premisa se

cumpla sería necesario que todos los fotosintatos que la planta obtiene se destinaran a la

construcción rápida de biomasa estructural (Hansen , et al. , 1998), lo cual se ve reflejado

en el hecho de que tasas fotosintéticas elevadas no garanticen una elevada eficiencia en

el uso del agua, tal cual se observa en la línea M1-125(13) ya que en ambos muestreos

presentó elevadas tasas fotosintéticas y baja eficiencia en el uso de agua, por su parte, la

línea M1-150(19) durante el primer muestreo y en la línea M1-192(19) durante el segundo,

exhibieron las tasas de eficiencia de uso de agua más elevadas sin ser sobresalientes en

términos de la tasa fotosintética , en este sentido, Condon , et al. (2004) señala que existen

correlaciones entre una elevada eficiencia del uso de agua y producción de biomasa. Sin

embargo, también se ha reportado que valores elevados para la conductancia se

correlacionan con elevadas tasas fotosintéticas y por ende con el potencial de producción

de biomasa bajo condiciones de riego (Lu, et al. , 1997) y de acuerdo a esto, las líneas de

las que se podría predecir un elevado potencial productivo son, durante ambos muestreos

la C1-29(15) y la M1-125(13). Finalmente, considerando lo propuesto por Takai et al. ,

(201 0), deberíamos señalar que las líneas potencialmente más productivas son la C1-

79(16), C1-29(15), M1-125(13) y M1-192(19) durante el primer muestreo; así como M1-

125(13) y C1-29(15) durante el segundo muestreo.

Cabe señalar que las líneas C1-29(15) y M1-125(13), además de ser constantemente

señaladas con un potencial de productividad elevado de acuerdo a lo propuesto por Takai

(201 0), también cumplen con las condiciones propuestas por otros autores como son la

elevada tasa fotosintética , conductancia y transpiración durante el primer muestreo; sin

embargo, para el segundo muestreo, la línea C1-29(15) exhibe una ganancia en términos

de eficiencia del uso de agua, derivada del mantenimiento de una elevada tasa

fotosintética y la disminución de la conductancia y la transpiración.

Los resultados generados indican que las dos líneas con mayor potencial de productividad

son la C1-29(15) y la M1-125(13), siempre que no se presenten a una presión selectiva

como la escasez de agua. Por su parte, la línea C1-29(15) podría comportarse de mejor

manera con menor disponibilidad de agua.

69

Capítulo IV

4.2 CONCLUSIONES GENERALES

Efecto de la inmersión temporal sobre la embriogénesis somática.

Durante este trabajo , se probaron 6 tratamientos de inmersión temporal entre los cuales

variaba la frecuencia de la inmersión, mientras que la duración de la inmersión fue igual

en todos los tratamientos y para ello se utilizó un tiempo relativamente corto (2'). Sin

embargo, todos los tratamientos de inmersión temporal establecidos para este

experimento generaron la pérdida del potencial embriogénico de los callos utilizados. Ya

que se ha reportado ya que se ha descrito previamente que la reducción del tiempo de

inmersión y el incremento de la frecuencia de la misma, disminuye el daño celular

ocasionado y por lo tanto, favorece la conservación del potencial embriogénico, es

necesario probar una mayor cantidad de tratamientos, en los que se evalúen tiempos de

inmersión menores al probado en este trabajo.

Además, se realizó un análisis detallado de los costos de la preparación del medio de

cultivo utilizado durante la inducción de la embriogénesis somática de C. nucifera, el cual

arrojó como resultado que si bien , prescindir de la utilización de gelificantes representa un

ahorro importante (17%), se puede obtener un ahorro aún mayor (70%) al sustituir la

sacarosa grado reactivo por azúcar refinada como fuente de carbono.

Efecto de I.T. sobre el crecimiento y desarrollo de brotes.

Las pruebas realizadas para evaluar el efecto de los tratamientos de inmersión temporal

sobre el crecimiento y desarrollo de brotes obtenidos a partir de embriones cigóticos de

cocotero arrojaron que los tratamientos de inmersión temporal favorecen el incremento en

la tasa de crecimiento de brotes cultivados in vitro, en comparación con los brotes

cultivados en medio líquido estacionario. Si se toma en consideración que se demostró

que cultivo en medio semisólido es mejor para el desarrollo y crecimiento de los brotes

cultivados in vitro , que el cultivo en medio líquido estacionario y que el análisis estadístico

no arrojó estadísticamente significativas entre las tasas de crecimiento del material

sometido a los tratamientos TOS.S (medio semisólido) y T120 ' (1nmersión 2' cada 120'),

se puede afirmar que es posible prescindir del gelificante sin reducir la eficiencia del

protocolo de micropropagación de cocotero, lo cual , a su vez, acarrea un incremento

importante en la rentabilidad del mismo.

70

Capítulo IV

Utilidad de la termografía como herramienta de selección de plantas con elevado

potencial productivo

A partir de los resultados del trabajo realizado utilizando imágenes termográficas y el

analizador infrarrojo de intercambio gaseoso (IRGA), se pudieron validar algunos de los

aspectos requeridos para utilizar las imágenes termográficas como una herramienta de

selección de material con elevado potencial productivo.

Ya que las imágenes termográficas permitieron detectar diferencias entre líneas e

individuos de Cocos nucifera que se incluyeron en este trabajo y en trabajos previos se ha

señalado que la diferencia entre la temperatura del aire circundante a la hoja y la

temperatura foliar parece ser un indicador del estado fisiológico de las plantas bajo

condiciones de campo, podemos señalar que la termografía es una técnicas que podría

facilitar la detección de líneas e individuos sobresalientes en términos de potencial de

productividad.

Sin embargo, para identificar las características clave de dichos individuos que les

permitirían sobresalir bajo condiciones de cultivo particulares, se requiere de información

fisiológica más detallada, como la tasa fotosintética , y la transpiración para poder calcular

la eficiencia del uso de agua. Lo cual cobra particular importancia al tomar en

consideración que cada campo de cultivo presenta condiciones medio ambientales

diferentes y que éstas pueden representar una limitante para garantizar el desempeño del

material propagado.

En este sentido, resulta de particular importancia realizar un seguimiento de este trabajo

para caracterizar a la totalidad de las líneas que conforman la colección de germoplasma

de Cocos nucifera mantenidas en el Laboratorio de Propagación Clonal del Centro de

Investigación Científica de Yucatán, en términos de su potencial de productividad.

Además, es necesario dar continuidad a este trabajo para corroborar bajo condiciones de

campo y con individuos en edad reproductiva , que dicho potencial de productividad se vea

reflejado en caracteres de importancia agronómica.

Además, recientemente se reportó que la utilización de la termografía junto con la

determinación de isótopos de C-13 en diferentes órganos es de utilidad para seleccionar

individuos que presenten mayor potencial productivo bajo diferentes condiciones

climáticas, por lo que para trabajos futuros se podría considerar dicha estrategia

71

Capítulo IV

4.3 PERSPECTIVAS

Con la finalidad de dar continuidad al presente trabajo para ampliar y profundizar el

alcance de los resultados obtenidos, se propone lo siguiente:

1. Evaluar la posibilidad de sustituir la sacarosa grado reactivo por azúcar

refinada de la formulación del medio de cultivo utilizado para inducir la

generación de embriones somáticos y su germinación, con la finalidad de abrir

la posibilidad de ahorrar hasta el 70% del costo de la preparación del mismo.

2. Modificar las condiciones de cultivo generadas por los biorreactores para la

generación y germinación de embriones somáticos. Para ello es necesario

evaluar el efecto de tratamientos de inmersión temporal con períodos de

inmersión más breves que dos minutos y/o rediseñar el biorreactor que se

utilizó para esta etapa del trabajo, con el fin de prescindir de la adición de

gelificante durante esta etapa del cu ltivo.

3. Evaluar el efecto de la modificación de la duración de la fase de inmersión

cuando se utilizan tratamientos de inmersión temporal para cultivar plántulas

de C. nucifera.

4. Monitorear el comportamiento de las plantas que fueron sometidas a

condiciones experimentales de este trabajo , bajo condiciones ex vitro .

5. Realizar la caracterización de la productividad y del rendimiento de productos

de interés de las líneas utilizadas como material experimental durante la

evaluación de la utilidad de la termografía como herramienta de selección de

material con elevado potencial productivo.

72

Capítulo IV

4.4 REFERENCIAS

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