Tecnicas inmunoserologicas (2)

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Reactivos para la determinación de grupos sanguíneosABO

Anti-A, Anti-B o Anti-ABmonoclonal

SIGNIFICACION CLINICAA comienzo del siglo pasado, Landsteiner descubrió que losindividuos podían ser agrupados en A, B, AB u O de acuerdoa la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) deantígenos fuertemente inmunogénicos en la superficie de losglóbulos rojos. También demostró la existencia de anticuer-pos (aglutininas) dirigidos contra los antígenos A y B y que elsuero de un individuo no contiene anticuerpos para el antíge-no presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra losque no posee. Actualmente se han identificado subgrupos delos grupos A y B.Todas estas observaciones revelaron la importancia de la com-patibilidad ABO en la práctica transfusional.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa determinación de grupos sanguíneos del sistema ABO seefectúa enfrentando los glóbulos rojos del paciente con anti-cuerpos monoclonales Anti-A, Anti-B o Anti-AB. La aglutina-ción o no de los hematíes ensayados frente a cada uno de losreactivos indica la presencia o ausencia de los correspon-dientes antígenos.

REACTIVOS PROVISTOSAnti-A, Anti-B o Anti-AB monoclonal: reactivos preparadosa partir de anticuerpos monoclonales de clase IgM secreta-dos por líneas celulares de hibridoma de ratón en una solu-ción tamponada conteniendo 1 g/l de azida sódica como con-servante. Los clones involucrados y la coloración de cadaproducto se detallan en la siguiente tabla:

Nombre del Línea(s) Celular(es) ColorProducto

Anti-A BIRMA-1 AzulAnti-B LB-2 Amarillo

Anti-AB BIRMA-1/ES-4/ES-15 Incoloro

Estos antisueros se caracterizan por su alta potencia, avidezy especificidad.Al no ser de origen humano, no existen riesgos de infecciónpor HIV, HBV o HCV.

REACTIVOS NO PROVISTOSDe acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicio-nalmente:- Solución fisiológica- Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS) pH

7,0 ± 0,2- Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS)

INSTRUCCIONES PARA SU USOLos reactivos se proveen listos para usar. No deben diluirse.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.Períodos prolongados de almacenamiento a temperaturas fuerade este rango pueden acelerar la pérdida de la actividad delos reactivos.Evitar los cambios térmicos repetidos y limitar a lo estricta-mente necesario la exposición de los reactivos a temperaturaambiente.En estas condiciones de uso y conservación, los reactivos,después de su apertura, son estables hasta la fecha de expi-ración indicada en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOSREACTIVOSDesechar los reactivos cuando se observe contaminación delos mismos. Si bien la azida de sodio se adiciona como bacte-riostático, se recomienda inspeccionar los reactivos visualmenteantes de usarlo. No deben utilizarse si presentan turbidez.Los reactivos no deben utilizarse si presentan precipitados opartículas.

MUESTRAGlóbulos rojos o sangre enteraa) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente,con o sin anticoagulante.Puede analizarse sangre obtenida por punción digital para latécnica en placa. Para evitar la coagulación de la sangre alutilizar esta técnica, se la debe mezclar rápidamente con elreactivo a ensayar.Para los ensayos con sangre de cordón, los glóbulos rojosdeberán lavarse previamente con solución fisiológica.b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA,heparina, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato,fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa,adenina). Puede utilizarse Anticoagulante W de Wiener lab.c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras quepresentan hemólisis o contaminación microbiana, no debenser analizadas.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: unavez obtenidas, las muestras deben ser analizadas lo antesposible. Si el análisis no se realiza inmediatamente, conser-var las mismas entre 2-10oC. Si se utilizó heparina o EDTA, latipificación debe llevarse a cabo dentro de las 48 horas de

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extraídas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1pueden ser ensayadas hasta los 35 días a partir de su extrac-ción. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipifica-ción dentro de los 7 días de obtenida la muestra.La sangre de donantes puede ser analizada hasta su fechade vencimiento.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Centrífuga- Tubos de hemólisis- Placas- Palillos mezcladores descartables

PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro" y está estric-tamente reservado para uso profesional por personal califica-do con comprobada competencia en inmunohematología.No utilizar los reactivos fuera de la fecha de vencimiento.La azida sódica es tóxica. R22: nocivo por ingestión.La azida puede reaccionar con las cañerías de plomo o cobregenerando compuestos explosivos. Al eliminar el reactivo, sedebe dejar correr grandes cantidades de agua.Utilizar los reactivos guardando las precauciones habitualesde trabajo en el laboratorio de química clínica.Todos los reactivos y las muestras deben descartarse deacuerdo a la normativa local vigente.

PROCEDIMIENTOEstos reactivos han sido estandarizados según los proce-dimientos detallados a continuación; su desempeño en eluso mediante otras técnicas no puede ser garantizado.La suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser pre-parada con solución fisiológica, PBS o LISS.

I- TECNICA EN PLACAPreparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Comoalternativa puede emplearse una suspensión al 35-45%en plasma del mismo paciente o sangre entera.1) Colocar en una placa limpia y rotulada, una gota deReactivo Anti-A, Anti-B o Anti-AB monoclonal y agregaral lado 1 gota de suspensión de glóbulos rojos.El gotero provisto dispensa un volumen de 50 ± 5 ul. Esimportante que se mantenga la relación reactivo:célulasen todos los sistemas de ensayo.2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo des-cartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetroy balancear la placa continuamente durante 2 minutos.Observar aglutinación visible macroscópicamente has-ta los 2 minutos. La observación puede facilitarse si seemplea una fuente de luz difusa. No debe emplearsemicroscopio.La prueba debe ser interpretada dentro de los 2 minutospara evitar que el reactivo se seque por evaporación.Cuando se observa aglutinación débil debe repetirse laprueba utilizando la técnica en tubo (por centrifugación).Pueden agregarse 2 volúmenes de reactivo a 1 volumende muestra para resaltar la aglutinación, sin riesgos defalsos positivos.

II- TECNICA EN TUBO (por centrifugación)1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-AB mo-noclonal colocada en un tubo de hemólisis rotulado, agre-gar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 1000 g.3) Agitar el tubo para despegar las células y examinarmacroscópicamente la presencia o ausencia de agluti-nación. La observación puede facilitarse si se empleauna fuente de luz difusa.

III- TECNICA EN TUBO (por sedimentación)1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-AB mo-noclonal colocada en un tubo de hemólisis rotulado, agre-gar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperaturaambiente.3) Agitar el tubo para resuspender las células y exami-nar macroscópicamente la aglutinación. La observaciónpuede facilitarse si se emplea una fuente de luz difusa.Las reacciones en tubo deben ser leídas inmediatamentee interpretar los resultados sin demora.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSTécnica en placaReacción positiva: los hematíes aglutinan en segundos y per-manecen aglutinados al balancear la placa. Indica la presen-cia del antígeno eritrocitario correspondiente.Reacción negativa: no se observa aglutinación a los 2 minu-tos, indicando ausencia del antígeno correspondiente.

Técnica en tuboLectura: golpear suavemente el tubo para desprender el sedi-mento y examinar macroscópicamente la presencia o ausen-cia de aglutinación.Reacción negativa: no se observa aglutinación a los 2 minu-tos, indicando ausencia del antígeno corespondiente. La re-suspensión de los glóbulos rojos es homogénea.Reacción positiva: los hematíes aglutinan en segundos y per-manecen aglutinados una vez resuspendidos. Indica la pre-sencia del antígeno eritrocitario correspondiente.En casos dudosos se recomienda esperar 2 minutos.Todos los resultados obtenidos en las pruebas de glóbulosrojos (directas), excepto las realizadas sobre muestras desangre de infantes, deben ser confirmadas por una pruebasobre suero (inversa), usando eritrocitos tipificados A1, A2, By O. En la siguiente tabla se muestran los perfiles esperados:

Prueba directa Prueba inversa(Glóbulos rojos) (Suero) Grupo

Anti-A Anti-B Anti-AB Cél. A1 Cél. A2 Cél. B Cél. O

- - - + + + - O+ - + - - + - A- + + + + - - B+ + + - - - - AB

Cualquier discrepancia entre las pruebas directa e inversa debeser investigada y resuelta antes de informar el grupo sanguí-neo.

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METODO DE CONTROL DE CALIDADEl control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulosrojos tipificados. Debe realizarse un control de los reactivos alcomienzo de cada jornada de trabajo con glóbulos rojos A1,A2, B y O.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOPueden obtenerse resultados erróneos debido a:- Contaminación de los materiales empleados en la prueba.- Temperatura incorrecta de incubación.- Reducción del tiempo de incubación recomendado.- Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente

expresados en el recién nacido. Por esta razón deben extre-marse los cuidados, sobre todo en los prematuros.

- La reactividad Anti-A y Anti-B puede verse reducida y even-tualmente estar ausente del suero o plasma de pacientesmuy jóvenes, adultos mayores o inmunosuprimidos.

- Leucemias u otros desórdenes malignos.- Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sus-

tanciales de sangre de grupo no idéntico, pueden mostraruna reacción serológica de campo mixto.

- Reacciones falsas positivas: se han observado problemasocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABOdebido a anticuerpos que reaccionan con drogas, coloran-tes, compuestos químicos o con partículas de sílica coloi-dal liberadas de vidrios de mala calidad.

- Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías, el lavadode los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica, re-sulta generalmente suficiente para obtener células aptas parala tipificación. En muy raras ocasiones se requiere un calen-tamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavadosmencionados. Como control, se coloca una gota de estascélulas con 2 gotas de solución fisiológica. No debe produ-cirse aglutinación.

- Las pruebas en lámina no están recomendadas para la de-terminación de subgrupos débiles.

- Si se emplea la técnica en tubo, una agitación excesivapuede disgregar las aglutinaciones débiles y producir resul-tados falso-negativos.

- Es importante emplear la fuerza g recomendada durante lacentrifugación, ya que una excesiva centrifugación puede con-ducir a dificultades para resuspender el botón celular, mien-tras que una centrifugación insuficiente puede resultar enaglutinaciones que se disgregan con demasiada facilidad.

- La expresión de algunos antígenos eritrocitarios puede dis-minuir en intensidad durante el almacenamiento, especial-mente en aquellas muestras coaguladas o extraídas conEDTA. Los mejores resultados se obtienen con muestrasfrescas.

PRESENTACIONAnti-A monoclonal: frasco x 10 ml (Cód. 1443152).Anti-B monoclonal: frasco x 10 ml (Cód. 1443154).Anti-AB monoclonal: frasco x 10 ml (Cód. 1443153).

BIBLIOGRAFIA- Wiener AS. - Blood Groups and Transfusion - Charles C.

Thomas 1943.

- Moore, S. et al. - “Int. Symp. on Monoclonal Antibodies:Standardization of their Characterization and use” - París,France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59.

- Widmann F.K. ed Technical Manual 10th Ed Washington DC,American Association of Blood Banks 1990, Chapter 11.

- Race R. R and Sanger R. - Blood Groups in Man, 6th EditionOxford Blackwell Scientific Publishers 1975:178.

- Issitt P.D. Applied Blood Group Serology 3rd Edition,Montgomery Scientific Publications, Miami, Florida, USA,1985, Chapter 10.

- Issit, P.D and Anstee, D.JApplied Blood Group Serology -4th Ed. Montgomery Scientific Publications, 1998.

- Pittiglio DH, Baldwin AJ, Sohmer PR. - Modern blood bankingand transfusion practices - Philadelphia: FA. Davis, 1987,c.1983.

- Walker Rh, ed. Technical manual. 11th edition. Bethesda:American Association of Blood Banks, 1993.

- Garraty G, Postoway N. et al. - Spontaneous agglutination ofred cells with a positive direct antiglobulin test in variousmedia. - Transfusion 24:214-217, 1984.

- Voak D., et al. - Monoclonal anti-A and anti-B developmentas cost effective reagents. - Med. Lab. Sci. 39, 109-122,1982.

- Rouger Ph. et Salmon Ch. La pratique des groupes sanguinset groupes érythrocytaires, 1981.

- Mollison P.L ,Blood Transfusion - 10ème édition BlackwellScience Ed., 1997.

- Moore S. et al. - A Mouse Monoclonal Antibody with Anti-A(B) Specificity Which Agglutinates AXCells. - Vox Sang, Vol.47, pp. 427-434, 1984.

-Technical Manual of the American Association of Blood Banks.10th edition 1990.

2000 Rosario - Argentina

Wiener lab.

Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Autorizado A.N.M.A.T.Disp. Nº: 1076/89 (Anti-A)Disp. Nº: 1073/89 (Anti-B)Disp. Nº: 1071/89 (Anti-A,B)

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SIGNIFICACION CLINICALas Salmonellas se consideran patógenos entéricos obliga-dos. Los alimentos y el agua contaminados son los mecanis-mos de transmisión. La enfermedad puede presentarse comogastroenteritis, septicemia con lesiones en diversos órganoso fiebre tifoidea.La Brucelosis se presenta en la mayoría de los casos conanorexia, fiebre, decaimiento y escalofríos, pudiendo apare-cer luego complicaciones importantes como son las óseas yneuropsíquicas.A pesar de que el método definitivo para establecer la etiolo-gía de estas enfermedades es a través del aislamiento delagente patógeno, esto resulta difícil debido a que la investiga-ción se realiza frecuentemente en períodos tardíos de la en-fermedad y luego de una terapia antibiótica. Por este motivoes de gran importancia diagnóstica la detección de losanticuerpos específicos producidos en el curso de cada unade estas patologías. Una prueba aislada es de escaso valor,siendo necesarias 2 o más pruebas seriadas a fin de poneren evidencia cambios en el título de anticuerpos.

FUNDAMENTOS DEL METODOEl suero del paciente se pone en contacto con antígenos es-pecíficos. En este caso se utilizan suspensiones de Salmo-nellas o Brucellas muertos. Si la muestra contiene los anti-cuerpos correspondientes se producirá una aglutinación visi-ble macroscópicamente.

REACTIVOS PROVISTOSAntígenos Febriles Salmonella: suspensión en soluciónsalina con conservantes apropiados, conteniendo los siguien-tes antígenos bacterianos:- Antígenos Paratyphoid A (Salmonella, antígeno flagelar a).- Antígenos Paratyphoid B (Salmonella, antígeno flagelar b).- Antígenos Typhoid H (Salmonella, antígeno flagelar d).- Antígenos Typhoid O (Salmonella, antígeno somático D).Antígenos Febriles Brucella: suspensión de antígenos bac-terianos (Brucella abortus, cepa 1119-3) en solución fisiológi-ca con conservantes apropiados. La concentración celular delos antígenos se encuentra entre el 4 y el 6%. Las bacteriasutilizadas se encuentran en fase lisa.Antígenos Febriles Controles:- Control Positivo: dilución de suero inactivado positivo.- Control Negativo: dilución de suero negativo.

REACTIVOS NO PROVISTOSSolución fisiológica.

Antígenos FebrilesReactivos para la determinación de anticuerpos especí-ficos contra Salmonella y Brucella

INSTRUCCIONES PARA SU USOLos reactivos se proveen listos para usar. Llevar a temperaturaambiente y agitar vigorosamente antes de su empleo.

PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".Los controles han sido examinados para HIV y HBV encon-trándose no reactivos. No obstante, deben ser empleadoscomo si se tratara de material infectivo.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOReactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hastala fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOSREACTIVOSCualquier contaminación bacteriana de los reactivos produci-da durante el uso puede ser causa de deterioro. En tal casodesechar.

MUESTRASueroa) Recolección: debe obtenerse suero límpido en forma es-téril. No inactivar ni calentar ya que los anticuerpos sontermolábiles.b) Aditivos: no se requieren.c) Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis visibley los quilomicrones pueden dar reacciones inespecíficas.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lasmuestras pueden conservarse 7 días en refrigerador (2-10oC).

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Placa de vidrio- Micropipetas- Tubos de hemólisis- Varilla- Reloj o timer

PROCEDIMIENTO

I- TECNICA RAPIDA EN PLACAColocar en una placa una gota (50 ul) de suero y agre-gar una gota (50 ul) de suspensión de Antígeno. Mez-clar y agitar la placa en forma circular durante 2 minutos.Observar la presencia o ausencia de aglutinación utili-zando una luz indirecta sobre fondo oscuro.

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II- TITULACION RAPIDA EN PLACA1) Dividir una placa de vidrio en sectores de 4 cm2 aproxi-madamente.2) Empleando las micropipetas apropiadas colocar enestos sectores 80 ul, 40 ul, 20 ul, 10 ul y 5 ul de suerolímpido. Repetir el procedimiento para un control ne-gativo y uno positivo.3) Colocar 1 gota de Antígeno previamente agitadosobre cada gota de suero.4) Mezclar el suero y el Antígeno utilizando una varillaabarcando un área de 2 cm de diámetro aproximada-mente. Debe emplearse una varilla distinta para cadadilución de suero o la misma varilla mezclando a partirde la muestra más diluida.5) Agitar la placa durante 2 minutos en forma circular.6) Observar la aglutinación utilizando luz indirectasobre fondo oscuro.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS4+: todos los microorganismos aglutinan.3+: aglutinan aproximadamente el 75%.2+: aglutinan aproximadamente el 50%.1+: aglutinan aproximadamente el 25%.Negativo: no aparece aglutinación.

Técnica I: se indica solamente positivo o negativo.Técnica II: el título se considerará la última dilución que daaglutinación del 50% (++).Los resultados obtenidos en la titulación en placa se aproxi-man a los de la prueba en tubo descripta en Bennett, C.W(ver Bibliografía), considerando las diluciones como se mues-tra a continuación:

Volumen de Suero Dilución aproximada en(ml) la prueba en tubo0,08 1:200,04 1:400,02 1:800,01 1:1600,005 1:320

METODO DE CONTROL DE CALIDADAntígenos Febriles Controles.

VALORES DE REFERENCIAGeneralmente títulos de 1:40 ó 1:80 son sospechosos de en-fermedad. Sólo títulos mayores de 1:80 pueden considerarseprobatorios de diagnóstico de enfermedad cuando estén acom-pañados de la sintomatología clínica. Títulos mayores de 1:320,son concluyentes.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Títulos significativos pueden obtenerse en individuos inmuni-zados por vacunas tifoideas. Pueden observarse reaccionesinespecíficas con antígenos de Salmonella O grupo D en sue-ro de pacientes con influenza.

También se encontraron reacciones inespecíficas en pacien-tes con enfermedad hepática crónica activa y consumidoresde narcóticos.Los antígenos de Brucella pueden dar reacciones cruza-das en individuos vacunados contra cólera.

PERFORMANCEAntígenos Febriles Salmonella: en un estudio realiza-do sobre 191 muestras, comparando con otro método desimilar fundamento tomado como referencia, se obtuvieronlos siguientes resultados:

Salmonella Paratyphoid A:Sensibilidad: 94,1%Especificidad: 98,8%

Salmonella Paratyphoid B:Sensibilidad: 89,3%Especificidad: 100%

Salmonella Typhoid H:Sensibilidad: 86,2%Especificidad: 99,3%

Salmonella Typhoid O:Sensibilidad: 95%Especificidad: 99,1%

Antígenos Febriles Brucella: en un estudio realizadosobre 203 muestras comparando con otro método de simi-lar fundamento tomado como referencia, se obtuvieron lossiguientes resultados:Sensibilidad: 100%Especificidad: 100%

Debe tenerse en cuenta que debido a las limitaciones deeste tipo de reacciones serológicas, el método no sustituyeel aislamiento e identificación del agente etiológico.

PRESENTACIONSalmonella (Cód. 1863151)Paratyphoid A: 1 x 5 mlParatyphoid B: 1 x 5 mlTyphoid H: 1 x 5 mlTyphoid O: 1 x 5 ml

Brucella (Cód. 1503151)Brucella abortus: 1 x 5 ml

Controles (Cód. 1933151)Control Positivo: 1 x 2 mlControl Negativo: 1 x 2 ml

BIBLIOGRAFIA- Widal, F. - Bull. Soc. Med. Hop. de Paris 13 (1896).- Bennett, C.W. Clinical Serology, pág. 145, Charles Thomas

Co. (1964).- Huddleson, J.B. - J. Infect. Dis. 42:242 (1928).

Wiener lab.2000 Rosario - Argentina

Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 1889/89 - 4957/00-153/05

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Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección deanticuerpos contra el Trypanosoma cruzi

SIGNIFICACION CLINICALa enfermedad de Chagas es una infección parasitaria produ-cida por el Trypanosoma cruzi. El diagnóstico de laboratoriodepende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad.Durante la fase aguda, el diagnóstico se efectúa directamen-te mediante la comprobación de los parásitos en sangre o pormétodos inmunológicos que detecten IgM. Durante la fasecrónica, se pueden usar métodos inmunológicos como la re-acción de fijación de complemento de Machado y Guerreiro oaglutinación de látex, floculación, hemaglutinación, aglutina-ción directa, inmunofluorescencia y últimamente ELISA.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa muestra se diluye en el soporte en el que se encuentrainmovilizado el antígeno. Si la misma contiene los anticuer-pos específicos, éstos formarán un complejo con los antíge-nos y permanecerán unidos al soporte. La fracción no unidase elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos anti-inmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa. Si seprodujo la reacción en la primera etapa del proceso, se uniráel conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustratoenzimático. En los casos en que se haya unido el conjugadohabrá aparición de color celeste. La reacción se detiene conácido sulfúrico, con lo que el color celeste vira al amarillo.

REACTIVOS PROVISTOSPolicubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles conpocillos que contienen antígenos citoplasmáticos y de mem-brana de Tripanosoma cruzi inmovilizados.Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conju-gadas con peroxidasa.Revelador A: peróxido de hidrógeno 60 mmol/l en buffer ci-trato 50 mmol/l pH 3,2.Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/l en ácidoclorhídrico 0,1 N.Stopper: ácido sulfúrico 2 N.Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/len buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no iónico 0,1 g/l.Diluyente de Muestras: albúmina bovina en solución fisioló-gica tamponada con buffer fosfatos pH 7,2.Control Positivo: dilución de suero inactivado conteniendoanticuerpos contra el Tripanosoma cruzi.Control Negativo: dilución de suero no reactivo, inactivado.

INSTRUCCIONES PARA SU USOBuffer de Lavado: para usar diluir 1+4 con agua destilada (1parte de Buffer de Lavado concentrado + 4 partes de aguadestilada). A baja temperatura los componentes del reactivopueden precipitar. En tal caso, colocar en baño de agua a

37oC unos minutos, mezclando luego por inversión.Policubeta sensibilizada: lista para usar.Conjugado: listo para usar.Revelador A: listo para usar.Revelador B: listo para usar.Stopper: listo para usar.Diluyente de Muestras: listo para usar. El color del Diluyen-te de Muestras puede variar de lote a lote sin que se afecte lacapacidad reaccional del mismo.Control Positivo y Control Negativo: listos para usar.

PRECAUCIONES- Todas las muestras de pacientes deben manipularse como

si fueran capaces de transmitir infección. Los controles seencuentran inactivados. Sin embargo, deben emplearsecomo si se tratara de material infectivo.

- Los sueros controles han sido examinados para antígeno desuperficie de hepatitis B (HBsAg) y virus de inmunodeficien-cia humana (HIV) encontrándose no reactivos.

- Todos los materiales empleados en el ensayo deben serdestruidos a fin de asegurar la inactivación de agentes pató-genos. El método recomendado para este procedimientoes autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los líquidos de dese-cho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (con-centración final 5%) durante por lo menos 60 minutos.

- No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes.- No emplear reactivos de otro origen.- Las policubetas deben incubarse en estufa. No usar baño

de agua. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso.- Evitar que los vapores de hipoclorito provenientes de los

recipientes para desechos biológicos entren en contactocon la policubeta, ya que el hipoclorito afecta la reacción.

- Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".- Evitar el contacto del ácido sulfúrico con la piel y mucosas.- Evitar el derrame de líquidos y formación de aerosoles.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOReactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hastala fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.Buffer de Lavado: estable 3 meses a temperatura ambiente.Policubeta sensibilizada: las tiras de pocillos con antígenoinmovilizado se proveen cerradas al vacío y con desecante.No abrir el envoltorio hasta el momento de usar, ni antes quehaya tomado temperatura ambiente, de lo contrario se favore-cerá la humectación del contenido. Las tiras de pocillos noutilizadas deben conservarse dentro del sobre con el dese-cante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Las tirasconservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas dentro

ChagatestELISA

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de los 5 meses posteriores mientras no se supere la fecha devencimiento del equipo.

MUESTRASuero o plasmaa) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. Nodeben usarse muestras inactivadas por calor. Ver LIMITACIO-NES DEL PROCEDIMIENTO.b) Aditivos: no se requieren para suero. Si se emplea plasmapuede utilizarse cualquier anticoagulante de uso corriente enla práctica transfusional.c) Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis, hiper-lipemia y otras causas de turbiedad pueden provocar resul-tados erróneos. Estas muestras deben ser clarificadas porcentrifugación.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lasmuestras no diluidas pueden conservarse durante 7 días a 2-10oC. Para conservación por períodos más prolongados, de-ben ser congeladas a -20oC o menos. Evitar los congelamien-tos y descongelamientos reiterados. Existen evidencias quemuestran que los congelamientos sucesivos pueden ser cau-sas de resultados erróneos.Si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuer-do a las especificaciones legales relativas al envío de mate-riales infecciosos.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados.- Reloj alarma o cronómetro.- Estufa a 37oC- Espectrofotómetro para lectura de policubetas (opcional).

CONDICIONES DE REACCION- Longitud de onda primaria: 450 nm- Longitud de onda secundaria (bicromática): 620-650 nm- Calibración del instrumental: llevar a cero el espectrofotóme-

tro con Blanco de Reactivos procesándolo de la misma formaque una determinación pero omitiendo colocar Muestra.

- Tiempo de reacción: 90 minutos- Temperatura de reacción: 37oC y temperatura ambiente- Volumen de muestra: 10 ul

PROCEDIMIENTOLlevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues-tras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el procedi-miento debe completarse sin interrupción.Procesar simultáneamente 2 Controles Positivos (CP) 3Negativos (CN) y los Desconocidos (D). Al depositar lamuestra y/o Controles sobre el Diluyente de Muestras,debe asegurarse de colocar los mismos en el seno dellíquido y no sobre las paredes o el fondo del pocillo. Enjua-gar la pipeta con el Diluyente dispensado en el pocillo paraasegurar la correcta homogeneización.En los pocillos a utilizar de la policubeta colocar:

D CP CN

Diluyente de Muestras 200 ul 200 ul 200 ul

Control Positivo - 10 ul -

Control Negativo - - 10 ul

Muestra 10 ul - -

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos una vez cargadas lasmuestras en cada tira. Para evitar la evaporación, cubrir laplaca e incubar en estufa 30 minutos a 37oC. Luego aspirarcuidadosamente el líquido de cada pocillo recibiéndolo enun recipiente para desechos biológicos que contenga 5%de hipoclorito sódico. A continuación, lavar 5 veces con Bu-ffer de Lavado empleando aproximadamente 300 ul/vez/po-cillo. Después de cada lavado, el líquido se descartará tam-bién en el recipiente con hipoclorito. Opcionalmente, em-plear lavador automático. Al finalizar el último lavado, eli-minar por completo el líquido residual, invirtiendo la policu-beta y golpeándola varias veces sobre papel absorbente,ejerciendo una leve presión con la mano sobre los latera-les mayores del soporte, para evitar la caída de las tirasde pocillos. Luego agregar en cada pocillo:

Conjugado 1 gota 1 gota 1 gota

En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 60 ul.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Para evitar la evapora-ción, cubrir la placa e incubar durante 30 minutos en estu-fa a 37oC. Luego aspirar el líquido de los pocillos, recibién-dolo en el recipiente con hipoclorito y lavar según se indi-có más arriba. Al finalizar el último lavado, eliminar porcompleto el líquido residual, invirtiendo la policubeta y gol-peándola varias veces sobre papel absorbente, ejerciendouna leve presión con la mano sobre los laterales mayoresdel soporte, para evitar la caída de las tiras de pocillos.Luego agregar en cada pocillo:

Revelador A 1 gota 1 gota 1 gota

Revelador B 1 gota 1 gota 1 gota

En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Incubar 30 minutos a tem-peratura ambiente y luego agregar:

Stopper 1 gota 1 gota 1 gota

En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos.Leer en espectrofotómetro a 450 nm o bicromática a 450/620-650 nm o evaluar el resultado a simple vista por com-paración con los Controles Positivos y Negativos.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINALEl color de la reacción es estable durante 30 minutos, por loque los resultados deben observarse durante ese lapso.

CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDALa corrida se considera válida si se cumplen simultáneamen-te las siguientes condiciones:a) Las lecturas de al menos 2 de los 3 Controles Negativos

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corregidas contra el Blanco de Reactivos deben ser menoreso iguales a 0,150 D.O.b) La lectura media de los Controles Positivos corregida debeser mayor o igual a 0,600 D.O.Si una o ambas condiciones no se cumple, repetir la corrida.Para ambos casos recordar que las lecturas obtenidas de-penderán de la sensibilidad del aparato empleado.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSa) Con instrumental óptico:La presencia o ausencia de anticuerpos anti-T. cruzi se deter-mina relacionando la absorbancia de la muestra respecto alvalor Cut-off.Cut-off = CN + 0,200 D.O.donde CN: promedio de las lecturas del Control NegativoZona de indeterminación: Cut-off ± 10%

Muestras No Reactivas: se consideran aquellas con absor-bancias menores que el límite inferior de la zona de indeter-minación.Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorbanciasmayores que el límite superior de la zona de indeterminación.Muestras Indeterminadas: se consideran aquellas con ab-sorbancias que caen dentro de la zona de indeterminación.Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.

b) Interpretación visual:Si se opta por este tipo de interpretación debe considerarseNo Reactiva toda muestra que no presente una coloraciónmayor que la de los Controles Negativos. Por el contrario,una muestra netamente amarilla se considera Reactiva. Co-lores tenues mayores que el del Control Negativo, requierenla interpretación instrumental.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.- Constituyen causas de resultados erróneos:

Lavado incorrecto de los pocillos de reacción.Contaminación cruzada de muestras No Reactivas con an-ticuerpos procedentes de una muestra Reactiva.Contaminación de la solución cromogénica con agentes oxi-dantes (cloro, etc.).Contaminación del Stopper.Conservación inadecuada de tiras de pocillos no utilizadas.Utilizar baño de agua para la incubación.Contaminación del Buffer de Lavado diluido. Se recomiendaverificar la limpieza de los recipientes donde se prepara yalmacena. Si se observa aparición de turbidez o precipitadoal prepararlo, debe desecharse.

- Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposi-ción o infección por T. cruzi.

- Ocasionalmente, al efectuar lecturas bicromáticas, puedenobtenerse absorbancias negativas que no invalidan la deter-minación. Esto se debe a que algunas muestras dan lectu-ras inferiores al Blanco de Reactivos.

- No utilizar muestras inactivadas por calor ya que puedenocasionar resultados falsos positivos.

- Verifique que el sistema lavador que está usando (WIENERWASHER u otro) aspire totalmente el contenido y que elvolumen de la solución lavadora dispensada sea pareja.

PERFORMANCEa) Sensibilidad: sobre un panel de 94 muestras con serolo-gía positiva coincidente por dos métodos de referencia (he-maglutinación indirecta e inmunofluorescencia indirecta), lasensibilidad es del 100%.b) Especificidad: sobre un panel de 348 muestras con sero-logía negativa coincidente por dos métodos de referencia (he-maglutinación indirecta e inmunofluorescencia indirecta), laespecificidad es de 99,6%.c) Estudio poblacional: en una población general que inclu-ye individuos sanos, donantes, chagásicos y con otras pato-logías, la correlación con respecto a métodos confirmatorios,fue del 99,7%.

No obstante la sensibilidad del método, sus resultados, aligual que los de cualquier método serológico, sólo constitu-yen un dato auxiliar para el diagnóstico. Es por esta razónque los informes deben ser considerados en términos de pro-babilidad. En este caso, mayor o menor probabilidad de para-sitosis por T. cruzi.Cualquier resultado Reactivo debe ser verificado por otra téc-nica. Recordar el criterio recomendado por el Instituto FatalaChaben, según el cual el inmunodiagnóstico de la infeccióndeberá hacerse con un mínimo de 2 de los siguientes méto-dos: inmunofluorescencia indirecta, hemaglutinación indirec-ta, ELISA, aglutinación de partículas (látex), debidamente va-lidados por el Centro Nacional de Referencia.

PRESENTACIONEquipo para 96 determinaciones (Cód. 1293251).Equipo para 192 determinaciones (Cód. 1293252).

BIBLIOGRAFIA- Engvall, E. and Perlmann, P. - Immunochem. 8:871-74 (1971).- Berning, H. - Dtsch. Med. Wscho 108/3:106 (1984.)- Rojkín, L.F.; Knecher, L.M.; Capriotti, G.A.; Lorenzo, L.E. -

Proceedings of the 5th. National Forum on AIDS, Hepatitisand Other blood-borne diseases, pág. 89 - Atlanta, Georgia.29 marzo-1 abril, 1992.

- Lorenzo, L.; Capriotti, G.; Rojkín, F. - Rev. Arg. de Transfu-sión XVII/1:51 (1991).

- Knecher, L.M.; Rojkín, L.F.; Capriotti, G.A.; Lorenzo, L.E.-Int. J. Parasitol. 24/2: 207-211 (1994).

- Knecher, L.M.; Capriotti: G.A.; Rojkín, L.F.; Lorenzo, L.E. -Rev. Asoc. Bioq. Arg. 58/3:125, 1994.

- Schujman, L.; Suita, G.; Acebal, S.; Albrecht, A. - Acta Bioq.Clin. Latinoam. XXIX/4:517, 1995.

- Ministerio de Salud y Acción Social, Instituto Nacional deParasitología "Doctor Mario Fatala Chabén" - Normas parael diagnóstico de la infección chagásica - Resolución minis-terial 523/97, 1998.

UR010816

Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: R489/92 - 5972/96Cert. Nº: 42/92

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Hepatitis B (anti-HBc)ELISA

Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección deanticuerpos contra el antígeno core del virus de la he-patitis B (anti-HBc)

SIGNIFICACION CLINICALa hepatitis B es una enfermedad viral caracterizada por unperíodo prolongado de incubación (45-160 días). El virus cau-sante de esta patología (HBV) es una partícula compuestapor una región interior o "core" donde se encuentra el DNA yuna envoltura exterior antigénica conocida como antígeno desuperficie (HBsAg). Su presencia en suero indica enfermedadactiva.El antígeno “core” (HBcAg) normalmente no se detecta ensuero, pero su anticuerpo (anti-HBc) se presenta entre los 10y 25 días posteriores a la aparición del HBsAg, persistiendoaún después de la desaparición de este último antígeno yantes de la aparición de su anticuerpo (anti-HBs). Por lo tantoen ausencia de HBsAg y anti-HBs, anti-HBc es el único mar-cador serológico de infección reciente por el virus de la hepa-titis B. Por otra parte, dado que este anticuerpo permanecedetectable en suero por largo tiempo luego de la infección,puede detectar una infección pasada.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa muestra se pone en contacto con el antígeno HBcAg in-movilizado sobre el soporte sólido en presencia de anticuerpoanti-HBc conjugado con peroxidasa.Si la muestra contiene anticuerpos específicos, éstos com-petirán con el conjugado por el antígeno presente en el sopor-te.Luego de incubar y lavar para eliminar la fracción no unida, seagrega el sustrato enzimático.A mayor cantidad de anti-HBc presente en la muestra, menorserá el desarrollo de color.

REACTIVOS PROVISTOSPolicubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles conpocillos que contienen HBcAg recombinante inmovilizado.Conjugado: anticuerpo anti-HBc conjugado con peroxidasa.Revelador A: peróxido de hidrógeno 60 mmol/l en buffer ci-trato 50 mmol/l pH 3,2.Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/l en ácidoclorhídrico 0,1 N.Stopper: ácido sulfúrico 2 N.Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/l enbuffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no iónico 0,1 g/l.Control Positivo: dilución de suero reactivo para anticuerposanti-HBc, inactivado.Control Negativo: dilución de suero no reactivo, inactivado.

INSTRUCCIONES PARA SU USOBuffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del

reactivo pueden precipitar. En tal caso, antes de diluir, colo-car en baño de agua a 37oC unos minutos, mezclando luegopor inversión. Para usar diluir 1+4 con agua destilada (1 partede Buffer de Lavado concentrado + 4 partes de agua destila-da).Policubeta sensibilizada: lista para usar.Conjugado: listo para usar.Revelador A: listo para usar.Revelador B: listo para usar.Stopper: listo para usar.Control Positivo y Control Negativo: listos para usar.



- Los sueros controles han sido examinados para HIV encon-trándose negativos.

- Todos los materiales empleados en el ensayo deben serdestruidos a fin de asegurar la inactivación de agentes pa-tógenos. El método recomendado para este procedimientoes autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los líquidos de dese-cho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (con-centración final 5%) durante por lo menos 60 minutos.



recipientes para desechos biológicos entren en contactocon la policubeta, ya que el hipoclorito afecta la reacción.


ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No conge-lar.Buffer de Lavado : estable 3 meses a temperatura ambien-te.Policubeta sensibilizada: las tiras de pocillos con antíge-no inmovilizado se proveen cerradas al vacío y con desecan-te. No abrir el envoltorio hasta el momento de usar, ni antesque haya tomado temperatura ambiente, de lo contrario sefavorecerá la humectación del contenido. Las tiras de poci-

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llos no utilizadas deben conservarse dentro del sobre con eldesecante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Lastiras conservadas en estas condiciones pueden ser utiliza-das dentro de los 5 meses posteriores mientras no se superela fecha de vencimiento del equipo.

MUESTRASuero o plasmaa) Recolección: obtener la muestra de la manera usual.b) Aditivos: si se emplea plasma puede utilizarse cualquieranticoagulante de uso corriente en la práctica transfusional.c) Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis, hiper-lipemia y otras causas de turbiedad pueden provocar resulta-dos erróneos. Estas muestras deben ser clarificadas por cen-trifugación.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lasmuestras pueden conservarse durante 7 días a 2-10oC. Paraconservación por períodos más prolongados deben ser con-geladas a -20oC o menos. Evitar los congelamientos y des-congelamientos reiterados. Existen evidencias que muestranque los congelamientos sucesivos pueden ser causa de re-sultados erróneos.Si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuer-do a las especificaciones legales relativas al envío de mate-riales infecciosos.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados en

el PROCEDIMIENTO.- Reloj alarma o cronómetro.- Estufa a 37oC.- Material volumétrico adecuado.- Espectrofotómetro para lectura de policubetas.

CONDICIONES DE REACCION- Longitud de onda: 450 nm- Longitud de onda secundaria (bicromática): 620-650 nm- Calibración del instrumental: llevar a cero el espectofotómetro

con Blanco de Reactivos procesándolo de la misma formaque una determinación pero omitiendo colocar Muestra y Con-jugado, es decir, sólo Revelador A, Revelador B y Stopper.

- Volumen de muestra: 100 ul- Tiempo de reacción: 2 horas 30 minutos- Temperatura de reacción: 37oC y temperatura ambiente.

PROCEDIMIENTOLlevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues-tras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el procedi-miento debe completarse sin interrupción.Procesar simultáneamente 2 Controles Positivos (CP), 3Negativos (CN) y los Desconocidos (D). En los pocillos autilizar de la policubeta colocar:

D CP CN

Muestra 100 ul - -




En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 60 ul.Debido a la alta densidad del Conjugado es importante mez-clar homogeneizando perfectamente mediante suaves gol-pes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos.Para evitar la evaporación, cubrir la placa con una cintaautoadhesiva e incubar 2 horas en estufa a 37oC. Luegoaspirar cuidadosamente el líquido de cada pocillo recibién-dolo en un recipiente para desechos biológicos que conten-ga 5% de hipoclorito sódico. A continuación, lavar 5 vecescon Buffer de Lavado empleando aproximadamente 300 ul/vez/pocillo. Después de cada lavado, el líquido se descar-tará también en el recipiente con hipoclorito. Opcionalmente,emplear lavador automático. Al finalizar el último lavado,eliminar por completo el líquido residual invirtiendo la poli-cubeta y golpeándola varias veces sobre papel absorben-te, ejerciendo una leve presión con la mano sobre los late-rales mayores del soporte, para evitar la caída de las tirasde pocillos. Luego agregar en cada pocillo:



En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la po-licubeta durante 10 segundos. Incubar 30 minutos a tem-peratura ambiente y luego agregar:


En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la po-licubeta durante 10 segundos.Leer en espectrofotómetro a 450 nm o bicromática a 450/620-650 nm o evaluar el resultado a simple vista por com-paración con los Controles Positivos y Negativos.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINALEl color de la reacción es estable durante 30 minutos por loque los resultados deben observarse dentro de ese lapso.

CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDALa corrida se considera válida si se cumplen simultáneamen-te las siguientes condiciones:a) La lectura media de los Controles Negativos, corregida con-tra el Blanco de Reactivos, debe ser mayor o igual a 0,600 D.O.b) La lectura media de los Controles Positivos, corregida contrael Blanco de Reactivos, debe ser menor o igual a 0,200 D.O.Si alguna de estas condiciones no se cumple, repetir la corri-da. Recordar que las lecturas obtenidas dependerán de la sen-sibilidad del aparato empleado.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLa reactividad de la muestra se determina relacionando la ab-sorbancia de la muestra respecto al valor cut-off.

Cut-off = 0,4 CN + 0,6 CP

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donde:CN: promedio de las lecturas de los Controles Negativos.CP: promedio de las lecturas de los Controles Positivos.

Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorban-cias menores o iguales al valor cut-off. Estas muestras debenser ensayadas nuevamente.Muestras no Reactivas: se consideran aquellas con absor-bancias mayores al valor cut-off.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Constituyen causas de resultados erróneos:- Lavado incorrecto de los pocillos de reacción.- Contaminación cruzada de Muestras no Reactivas con anti-

cuerpos procedentes de una Muestra Reactiva.- Contaminación de la solución cromogénica con agentes oxi-

dantes (cloro, etc.)- Contaminación del Stopper.- Falta de homogeneización de las muestras con el Conjugado.- Conservación inadecuada de las tiras de pocillos no utilizadas.- Contaminación del Buffer de Lavado diluido. Se recomienda

verificar la limpieza de los recipientes donde se prepara yalmacena. Si se observa aparición de turbidez o precipitadoal prepararlo, debe desecharse.

No utilizar baño de agua para la incubación.Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposicióno infección por HBV.Ocasionalmente, al efectuar lecturas bicromáticas, puedenobtenerse absorbancias negativas que no invalidan la deter-minación. Esto se debe a que algunas muestras dan lecturasinferiores al Blanco de Reactivos.Verifique que el sistema lavador que Ud. está usando (WIENERWASHER u otro), aspire totalmente el contenido de los poci-llos y que el volumen de la solución lavadora sea pareja.

PERFORMANCEa) Sensibilidad: la sensibilidad basada en la prevalencia asu-mida del 100% de anticuerpos anti-HBc en individuos conhepatitis B, se estima en 98,7%.b) Especificidad: la especificidad basada en la prevalenciaasumida del 0% de anticuerpos anti-HBc en individuos sa-nos, se estima en 99,4%.c) Estudio poblacional: en una población general que inclu-ye individuos sanos, donantes, con hepatitis B y otras patolo-gías, la correlación con respecto a métodos de referencia, fuedel 98,7%.

PRESENTACIONEquipo para 96 determinaciones (Cód. 1483255).

BIBLIOGRAFIA- Wisdon, G.B. - Clin. Chem. 22/8:1243, 1976.- Engvall, E. - Methods Enzymol. 70:419, 1980.- Gerety, R.J. - “Hepatitis B” - Academic Press, Inc., USA, 1985.- Chang, Y. - Diagnostic Medicine 6/5:28, 1983.- Argeri, N. et al. - Qualitas 1/2:118, 1982.- Katchaki; J. et al. - Vox Sang. 37:9, 1979.- García Solís - Análisis Clínicos 24/6:199, 1988.


Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 1676/93 - 6222/00Cert. Nº: 216/93

UR010703

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SIGNIFICACION CLINICALa mononucleosis infecciosa es una enfermedad benigna pro-ducida por el virus de Epstein-Barr (EBV) que se caracterizaen su aspecto clínico por la aparición de fiebre irregular du-rante una o dos semanas, dolor e hinchazón de los ganglioscervicales e irritación faríngea; con un cuadro hematológicobastante característico debido a la gran proliferación de célu-las linfoides atípicas.Paul y Bunnell observaron que el suero de estos pacientes ge-neralmente contiene un alto título de anticuerpos heterófilos,capaces de aglutinar glóbulos rojos de carnero o de caballo.Estos anticuerpos no son privativos de la mononucleosis, yaque en el suero de individuos sanos pueden existir aglutininasanti-carnero con títulos de 1/28 y hasta 1/56, observándosetítulos de 1/112 o más en diversas infecciones y luego deestimulaciones antigénicas como transfusiones sanguíneas.Tales hechos indican que la evidencia de altos títulos de an-ticuerpos heterófilos sólo tiene valor presuntivo en el diagnós-tico de esta enfermedad.Davidsohn introdujo la adsorción diferencial con extracto deriñón de cobayo (capaz de adsorber los anticuerpos heterófi-los no-mononucleosis infecciosa o anticuerpos de Forssman),aumentando así la sensibilidad y especificidad de la prueba ypermitiendo confirmar los resultados de la Paul-Bunnell, quepor su rapidez y practicidad siguió empleándose como prue-ba de screening o selección.No obstante, existe cierto porcentaje de pacientes (aproxi-madamente el 10%) con mononucleosis infecciosa que po-seen bajos títulos de anticuerpos heterófilos, razón por lacual los resultados de estas pruebas únicamente son consi-derados significativos, desde el punto de vista diagnóstico,cuando se relacionan con los datos hematológicos y las ma-nifestaciones clínicas del paciente.

FUNDAMENTOS DEL METODOLos anticuerpos heterófilos asociados a la mononucleosisinfecciosa se detectan por su capacidad de aglutinar los eri-trocitos de caballo, neutralizándose simultáneamente los an-ticuerpos no asociados a mononucleosis (anticuerpos Forss-man) con extracto de riñón de cobayo. La aglutinación sevisualiza macroscópicamente.

REACTIVOS PROVISTOSReactivo: suspensión de eritrocitos de caballo y extracto deriñón de cobayo.Control Positivo: dilución de suero positivo, inactivado. Equi-valente a 2-3 (+).Control Negativo: dilución de suero negativo, inactivado.

REACTIVO NO PROVISTOSolución fisiológica.

INSTRUCCIONES PARA SU USOReactivo: vaciar la pipeta del gotero y agitar vigorosamenteantes de usar, verificando que no queden eritrocitos adheri-dos al fondo del frasco.Controles Positivo y Negativo: listos para usar.

PRECAUCIONESLos reactivos son para uso "in vitro". Los controles han sido exami-nados para HIV y HBV encontrándose no reactivos. No obstante,deben ser empleados como si se tratara de material infectivo.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOReactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10°C) hastala fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.

MUESTRASueroa) Recolección: obtener suero de la manera usual.b) Aditivos: no se requieren.c) Sustancias interferentes conocidas: se ha descripto uninhibidor termolábil de la reacción que produce resultados fal-sos negativos. Para eliminar esta interferencia es necesarioinactivar el suero. Además, la hemólisis también interfiere.Inactivación: colocar el suero a 56°C durante 15 minutos, in-mediatamente antes de usar.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el sue-ro debe ser preferentemente fresco. En caso de no procesarseen el momento puede conservarse en refrigerador (2-10°C)hasta 48 horas o en congelador durante 3 meses, a partir delmomento de su recolección.

MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- Placa de vidrio

2- No provisto- Palillo o varilla de vidrio- Cronómetro- Material volumétrico adecuado- Lámpara o fuente de luz horizontal

PROCEDIMIENTOLlevar los reactivos y las muestras a temperatura ambien-te antes de usar.

MonoslidePrueba de aglutinación en placa, con neutralizaciónsegún Davidsohn, para el diagnóstico de mononucleo-sis infecciosa

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BIBLIOGRAFIA- Wintrobe, M. M. - "Hematología Clínica" - Pág. 924 (Ed.

1969) - Intermédica.- Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Slaby, R. - Am. J. Clin. Path. 49/

1:3 (1968).- Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Panczyszyn, O. - Am. J. Clin.

Path. 49/1:12 (1968).- Sinay, H. S.; Schoen, I.; Miyahira, T. - Am. J. Clin. Path. 50/

1:75 (1968).- Hoagland. R. J. - "Infectious mononucleosis" - Ed. 1967 -

Grune-Stratton.- Marletta, J.; Cravero, J.; Fay, O.; Rey. J. - Paraná (1977).

I) PRUEBA CUALITATIVAColocar una gota (50 ul) de Muestra inactivada en unode los círculos de la placa limpia y seca. Agregar unagota (50 ul) de Reactivo homogeneizado. Mezclar conpalillo de madera hasta obtener una suspensión unifor-me en toda la superficie del círculo.Inmediatamente, disparar un cronómetro y observar ma-croscópicamente el resultado dentro de los dos minu-tos.Para una correcta visualización de los resultados, debemantenerse la placa sobre un fondo negro y ligeramen-te por encima de un haz luminoso horizontal (ej.: lám-para de microscopía).

II) PRUEBA CUANTITATIVALos sueros positivos, según la prueba anterior, puedentitularse efectuando diluciones seriadas:1) Colocar en una serie de tubos 200 ul de soluciónfisiológica.2) Agregar al primer tubo 200 ul de la Muestra inactiva-da y mezclar. Transferir 200 ul de esta dilución al se-gundo tubo y mezclar, continuando de esta forma lasdiluciones hasta el último tubo.Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:2; 1:4; 1:8;1:16, etc.3) Tomar una gota de cada dilución y ensayar según I).

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSNegativo: suspensión homogénea.Positivo: aglutinación que aparece dentro de los dos minu-tos. Se califica de 1 a 4 (+).Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos he-terófilos asociados a la mononucleosis infecciosa.Título: se expresa como la inversa de la máxima dilución ala que se produce aglutinación visible macroscópicamente.

METODO DE CONTROL DE CALIDADComo punto de referencia de las reacciones positivas y ne-gativas de Monoslide, es conveniente procesar simultánea-mente el Control Positivo y Control Negativo provistos, quese utilizan de la misma manera que la muestra.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.

PERFORMANCESensibilidad: en la técnica original de Davidsohn se em-plean eritrocitos frescos (nativos) que dan lugar a reaccionesinespecíficas, por lo que la hemaglutinación sólo se conside-ra como reacción positiva para mononucleosis infecciosa endiluciones mayores de 1/14.La sensibilidad de los eritrocitos estabilizados que proveeMonoslide ha sido regulada para proporcionar igual reactivi-dad con suero inactivado sin diluir.


Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 1287/77 - 3389/95

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SIGNIFICACION CLINICALa sífilis es una enfermedad venérea causada por el Tre-ponema pallidum, que invade las mucosas intactas o lapiel en áreas de abrasiones. El contacto sexual es la formamás común de transmisión.La detección y tratamiento de la enfermedad en sus estadiostempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones gra-ves como sífilis cardiovascular, neurosífilis y sífilis congénita.El diagnóstico de esta enfermedad sufre la carencia de unmétodo para cultivar el microorganismo en medios de labo-ratorio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enfer-medad en los que no se observan lesiones epidérmicas.Sin embargo, desde el comienzo de la infección aparecenen el suero del individuo infectado ciertas sustancias de-nominadas "reaginas", que reaccionan con antígenos decardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a lossignos clínicos son por lo tanto los procedimientos másrápidos y útiles disponibles para diagnóstico de sífilis.

FUNDAMENTOS DEL METODOLas "reaginas", presentes en individuos infectados por T.pallidum se detectan en suero por la reacción con un an-tígeno cardiolipínico purificado y estabilizado. Si la muestracontiene reagina, ésta se unirá al antígeno produciendouna floculación visible en microscopio. Las reacciones ines-pecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamentepurificado y el agregado de cloruro de colina característicade la técnica USR (Unheated Serum Reagin) en la que noes necesario inactivar la muestra.

REACTIVOS PROVISTOSAntígeno: suspensión acuosa de antígeno de cardiolipinay lecitina purificados, en buffer fosfatos con cloruro decolina y EDTA de acuerdo a las indicaciones de la O.M.S.

REACTIVOS NO PROVISTOS- Solución fisiológica (para la prueba semicuantitativa).- Solución de cloruro de sodio 10 g/dl (para la técnica en

líquido cefalorraquídeo).

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOAntígeno: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fechade vencimiento indicada en la caja. No congelar.

INSTRUCCIONES PARA SU USOAntígeno: listo para usar. Agitar previo a la ejecución de laprueba.

PRECAUCIONESEl Reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".

MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- 1 gotero

2- No Provisto- Agitador rotativo ajustable a 180 rpm.- Placa de vidrio transparente con sectores de 14 mm de

diámetro cada uno.- Micropipetas para medir los volúmenes indicados.- Microscopio

MUESTRASuero, plasma o líquido cefalorraquídeo (LCR)a) Recolección: obtener de la manera usual. No inactivar.b) Aditivos: no se requieren para suero o LCR. Si la pruebase realiza con plasma, éste puede obtenerse empleandoheparina, EDTA u oxalato de sodio como anticoagulantes.c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis o hi-perlipemia pueden ocasionar resultados erróneos.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:en caso de no procesarse de inmediato los sueros puedenconservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC).El plasma puede emplearse hasta 24 horas luego de la ex-tracción.

PROCEDIMIENTOTanto los reactivos como la muestra deben estar a tem-peratura ambiente antes de realizar la prueba.

I- PRUEBA CUALITATIVA EN SUERO O PLASMAEn cada uno de los sectores delimitados de la placacolocar:

Muestra 50 ul

Con gotero provisto colocar:

Antígeno 1 gota

Agitar horizontalmente la placa a 180 rpm durante 4minutos. Observar inmediatamente en microscopio conpoco aumento (60 a 100 X).

II- PRUEBA SEMICUANTITATIVA EN SUERO O PLASMAPreparar diluciones de la muestra 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y1:32 con solución fisiológica y realizar para cada dilu-ción la prueba como se describe en I.

Suspensión antigénica estabilizada para realizar laprueba VDRL modificada (USR) de detección de sífilis

V.D.R.L. test

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III- PRUEBA CUALITATIVA PARA LCRDiluir el Antígeno 1:2 con solución de cloruro de sodio10 g/dl. Emplear dentro de las 2 horas de prepara-ción.En cada sector delimitado de la placa colocar:

Muestra 50 ul

Con aguja calibre 6 agregar:

Antígeno diluido 1 gota (10 ul)

Mezclar bien y agitar horizontalmente la placa duran-te 8 minutos a 180 rpm. Leer los resultados en mi-croscopio con poco aumento (60 a 100 X).

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSReactivo: presencia de floculación.No reactivo: ausencia completa de floculación.Prueba semicuantitativa: el título estará dado por la in-versa de la última dilución que se observe reactiva. Leeratentamente las LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO.

METODO DE CONTROL DE CALIDADPara controlar la calidad del sistema procesar un ControlPositivo (suero seguramente reactivo) y un Control Nega-tivo (suero seguramente no reactivo) utilizándolos de lamisma forma que las muestras.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Resultados falsamente positivos pueden ser observadosen individuos con cuadros patológicos diversos como he-patitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma, tuber-culosis, cáncer, diabetes y enfermedades autoinmunes.Estos casos no son muy comunes y generalmente presen-tan reacciones con títulos bajos y una historia clínica queno coincide con las características de sífilis.Es imprescindible por estos motivos ante toda prueba cua-litativa reactiva realizar la prueba semicuantitativa.Resultados falsamente negativos pueden observarse cuan-do se presenta el fenómeno de prozona. Por este motivose recomienda repetir la prueba en suero diluido 1:5 consolución fisiológica para verificar el resultado. Si en estascondiciones se observa floculación la muestra es reactiva.A pesar de las ventajas de este método, sus resultados aligual que los de cualquier prueba serológica, sólo constitu-yen un dato auxiliar de diagnóstico que debe corroborarsecon la historia clínica del paciente.

PERFORMANCESobre 2140 muestras de un servicio hospitalario, ensayadasusando V.D.R.L. test e inmunofluorescencia como método dereferencia, se observó una concordancia superior al 96%.

PRESENTACIONEquipo para 250 determinaciones (Cód 1853151).

Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 1068/91 - 7585/97 - 6895/00 2000 Rosario - Argentina

Wiener lab.

BIBLIOGRAFIA- Zinsser Microbiología, Joklik W., Willett H. y Amos D., 17o

edición Editorial Médica Panamericana, 1983.- Manual of Tests for Syphilis, cap. 8 - American Public

Health Association, Washington, D.C 20005, 1990.- Podestá, D.; Svetaz. M.J.; Ricomi, R.; Capriotti, G.; Rojkín, L.;

Lorenzo, L.; "Evaluación de tres reactivos para detecciónde sífilis" - VIII Congreso Argentino de Bioquímica, 54ºTriduo Bioquímico Científico Anual 1990 - Revista A.B.A.54/3, 1990.

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Prueba de látex para la determinación de antiestrepto-lisina O en suero

SIGNIFICACION CLINICAEl anticuerpo antiestreptolisina O se encuentra presente encasi todas las personas en títulos bajos, debido a que lasinfecciones estreptocócicas son comunes. Sin embargo untítulo alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una in-fección reciente producida por un estreptococo beta hemolíticode grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal,erisipela.

FUNDAMENTOS DEL METODOLos anticuerpos antiestreptolisina O se detectan en sueropor su reacción con la estreptolisina O adsorbida sobre so-porte inerte de látex. Los anticuerpos antiestreptolisina reac-cionan con la estreptolisina produciendo una aglutinación vi-sible macroscópicamente.

REACTIVOS PROVISTOSReactivo de Látex: suspensión de partículas de látex poli-estireno recubiertas con estreptolisina O.Control Negativo: suero no reactivo con el Reactivo de Lá-tex.Control Positivo: suero humano conteniendo antiestreptoli-sina O en concentración superior a 250 UI/ml.

REACTIVOS NO PROVISTOSSolución fisiológica (para la técnica semicuantitativa).

INSTRUCCIONES PARA SU USOReactivo de Látex: homogeneizar por agitación intensa yluego cambiar la tapa ciega por la tapa gotero suministradaadicionalmente.Controles (Positivo y Negativo): listos para usar.

PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".Los Controles Positivo y Negativo han sido examinados paraantígeno de superficie del virus de hepatitis B y anticuerposcontra HIV 1/2, encontrándose no reactivos.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOSREACTIVOSLa autoaglutinación del Reactivo de Látex es indicio de dete-rioro del mismo. En tal caso desechar.

MUESTRASueroa) Recolección: obtener suero de la manera usual.b) Aditivos: no se requieren.c) Sustancias interferentes conocidas: los sueros marca-damente lipémicos o contaminados pueden dar resultadosfalsamente positivos.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la an-tiestreptolisina en suero es estable 24 horas refrigerada (2-10oC) o congelada por períodos prolongados.

MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- 1 placa de vidrio- 1 tapa gotero

2- No provisto- goteros o pipetas para dispensar los volúmenes indicados.- palillos mezcladores descartables- cronómetro- lámpara o fuente de luz- tubos de Kahn

PROCEDIMIENTOLlevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente.Agitar el Reactivo de Látex antes de usar, vaciando previa-mente la pipeta del gotero.

I- TECNICA CUALITATIVAEn uno de los sectores delimitados de la placa de vidrioadjunta al equipo colocar:

Reactivo de Látex 1 gota (50 ul)

Muestra 1 gota (50 ul)

Mezclar con palillo descartable (uno para cada mues-tra) hasta obtener una suspensión uniforme en la super-ficie delimitada de la placa. Inmediatamente disparar uncronómetro, balancear suavemente la placa y observarmacroscópicamente el resultado dentro de los 2 minu-tos.

II- TECNICA SEMICUANTITATIVA (Titulación)Los sueros positivos pueden titularse efectuando dilu-ciones seriadas en tubos de Kahn.a) Colocar 0,5 ml de solución fisiológica en cada uno delos tubos.b) Agregar 0,5 ml de suero al tubo No 1 y mezclar.

ASOlátex

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Transferir 0,5 ml de esta dilución al tubo No 2 y mezclar,continuando así las diluciones hasta el último tubo. Lasdiluciones así obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16,etc.c) Ensayar cada dilución según técnica I.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSNegativo: suspensión homogénea.Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos.Se califica de 1 a 4 +.Título: inversa de la máxima dilución a la que se produceaglutinación visible macroscópicamente.El nivel aproximado de antiestreptolisina O en la muestra,puede ser calculada por la fórmula siguiente:

ASO (UI/ml) = Título x Sensibilidad de la reacción (200 UI/ml)

Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:2. El nivel de ASOes de 2 x 200 = 400 UI/ml

METODO DE CONTROL DE CALIDADEs conveniente procesar simultáneamente el Control Positivoy el Control Negativo provistos, empleando una gota del Con-trol correspondiente en lugar de la muestra y una gota delReactivo de Látex según la técnica cualitativa.

VALORES DE REFERENCIAHasta 200 UI/ml.

Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propiosvalores de referencia.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.- Tiempos de reacción mayores de 2 minutos pueden produ-

cir reacciones falsamente positivas por efecto del secadode los reactivos.

- Se pueden producir falsos negativos en niños mayores de 6meses y menores de 6 años o en infección reciente.

- Debe tenerse en cuenta que en este tipo de infecciones, unresultado aislado sólo constituye un dato auxiliar, por lo quese recomienda efectuar determinaciones seriadas cada 15-20 días durante 4 ó 6 semanas.

PERFORMANCEa) Sensibilidad: 200 UI/ml.b) Especificidad: en una población adulta sana se obtienentítulos de antiestreptolisina O menores o iguales a 200 Ul/mlen el 95% de los casos. En una población infantil ( mayoresde 2 años) se pueden tener títulos de hasta 300 UI/ml.


BIBLIOGRAFIA- Sonnenwirth A.C.; Jarret L. - Gradwohl Métodos y Diagnós-

ticos del Laboratorio Clínico - Editorial Panamericana - 8o

Edición (1983).

Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 2011/95 - 7737/98Cert. Nº: 993/95

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SIGNIFICACION CLINICALa enfermedad de Chagas es una infección parasitaria produ-cida por el Trypanosoma cruzi. El diagnóstico de laboratoriodepende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad.Durante la fase aguda, el diagnóstico se efectúa directamen-te mediante la comprobación de los parásitos en sangre o pormétodos inmunológicos que detecten anticuerpos específi-cos.Durante la fase crónica, se pueden usar métodos inmunológi-cos como la reacción de aglutinación de látex, hemaglutina-ción, aglutinación directa, inmunofluorescencia y últimamen-te ELISA.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa hemaglutinación indirecta (HAI), también llamada hema-glutinación reversa pasiva, se basa en la propiedad que tie-nen los anticuerpos (que en este caso son anti-T. cruzi) deproducir aglutinación específica en presencia de glóbulos ro-jos sensibilizados con los correspondientes antígenos.En el suero existen anticuerpos inespecíficos (heterófilos) queson capaces de aglutinar glóbulos rojos de distintas espe-cies. Su presencia se investiga enfrentando el suero con GRno sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminanmediante tratamiento con 2-mercaptoetanol.

REACTIVOS PROVISTOSReconstituyente HAI: solución fisiológica tamponada a pH 7.Antígeno HAI: liofilizado de glóbulos rojos de carnero sensi-bilizados con antígenos citoplasmáticos de T. cruzi.GR no sensibilizados: suspensión al 1% de eritrocitos decarnero no sensibilizados, para control de heterofilia.Buffer HAI: solución fisiológica tamponada con fosfatos a pH7,5, con colorante inerte.Solución Proteica: solución de albúmina bovina al 10%.2-Mercaptoetanol: ampolla con 2-mercaptoetanol (2-ME).Control Positivo: suero inactivado conteniendo anticuerposcontra Tripanosoma cruzi.Control Negativo: suero no reactivo, inactivado.


INSTRUCCIONES PARA SU USOAntígeno HAI: preparar con 6,1 ml de Reconstituyente HAI.Esperar una hora antes de usar mezclando cada 20 minutospara permitir una correcta rehidratación del reactivo. Cada vezque se emplee, homogeneizar mediante agitación evitando laformación de espuma.

ChagatestPrueba de hemaglutinación indirecta para la detecciónde anticuerpos contra el Trypanosoma cruzi

HAI

GR no sensibilizados: homogeneizar mediante agitaciónantes de usar, evitando la formación de espuma.Diluyente de Sueros HAI: agregar 0,2 ml de Solución Pro-teica cada 10 ml de Buffer HAI. Mezclar, rotular y fechar.2-Mercaptoetanol: una vez abierta la ampolla, trasvasar elcontenido al frasco vacío provisto, el que se deberá tapar in-mediatamente después de usar.2-Mercaptoetanol al 1%: con el 2-ME provisto, preparar unadilución 1/100 con solución fisiológica en cantidad suficientede acuerdo al número de pocillos que se utilicen. Ejemplo:para 96 pocillos: 25 ul de 2-ME en 2,5 ml de solución fisioló-gica.Controles Positivo y Negativo: listos para usar.

PRECAUCIONES- Los Reactivos Provistos son para uso diagnóstico "in vitro".- Las muestras deben manipularse como si fueran capaces

de transmitir la infección.- Los sueros controles han sido examinados para antígeno de

superficie de hepatitis B (HBsAg) y virus de inmunodeficien-cia humana (HIV) encontrándose no reactivos. Sin embargodeben emplearse como si se tratara de material infectivo.

- Todos los materiales empleados en el ensayo deben serdestruidos a fin de asegurar la inactivación de agentes pató-genos. El método recomendado por este procedimiento esautoclavar durante 1 hora a 121oC. Los líquidos de desechopueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concen-tración final 5%) durante por lo menos 60 minutos.

- No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.Diluyente de Sueros HAI: es estable en refrigerador (2-10oC)5 días a partir de la fecha de su preparación.2-Mercaptoetanol al 1%: usar inmediatamente después depreparado.Antígeno HAI: una vez reconstituido es estable durante 2meses conservado en refrigerador (2-10oC). No congelar.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOSREACTIVOS- Cuando todas las diluciones de sueros son reactivas, pue-

de ser indicio de autoaglutinación del Antígeno HAI. Verifi-car destinando un pocillo de la policubeta para mezclarAntígeno HAI y Diluyente de Sueros HAI, sin la Muestra.Si aún en este caso se observa aglutinación, el reactivo

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estará deteriorado. Desechar.- La ausencia de reactividad en todas las diluciones de sue-

ros, puede ser indicio de deterioro de los reactivos. Proce-sar Muestra con positividad conocida.

MUESTRASueroa) Recolección: el paciente debe estar preferentemente enayunas. Obtener suero de la manera usual. No usar plasma.b) Aditivos: no se requieren. No agregar conservadores.c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis o hiperli-pemia (con quilomicronemia) producen resultados erróneos.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el sue-ro debe ser preferentemente fresco. En caso de no procesar-se en el momento, puede conservarse en el refrigerador (2-10oC) durante no más de 72 hs contadas a partir del momentode la extracción. Para períodos más prolongados de conserva-ción, congelar (a -20oC), evitando reiterar tal procedimiento.Los sueros envejecidos tienden a gelificarse al contacto conel 2-ME, provocando resultados falsos positivos.

MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- 1 frasco vacío (para trasvasar el 2-ME de la ampolla)- 5 policubetas con 96 pocillos de fondo en U- Accesorios

2- No provisto- microdilutores (25 ul) o micropipetas automáticas (25 ul)- microgoteros (25 ul)- tubos de ensayo y material volumétrico adecuado- cinta adhesiva- papel de filtro

RECOMENDACIONES PREVIASMicrodilutores- Acondicionamiento previo: antes de usar los microdilutores,

sumergirlos en un recipiente con agua destilada y apoyar-los sobre papel de filtro para asegurar una correcta toma dela muestra.

- Lavado: antes de tomar una nueva muestra con los microdi-lutores, descargar el volumen residual sobre papel de filtro.Luego pasarlos sucesivamente por dos recipientes con aguadestilada y apoyarlos sobre papel de filtro.

PolicubetaPara eliminar la carga electrostática es necesario pasar untrapo húmedo por la base de la misma.

PROCEDIMIENTOSeleccionar una policubeta con pocillos sin usar de fondoen U.

I- TITULACION SIN 2-ME1- Con microgotero de 25 ul, colocar una gota de Dilu-yente de Sueros HAI en todos los pocillos a usar de lapolicubeta.2- Tomar una alícuota de cada suero a ensayar con mi-crodilutores de 25 ul (uno para cada muestra). Colocar

cada microdilutor en el primer pocillo y rotarlo por lomenos 10 veces para asegurar una correcta dilución dela muestra.3- Realizar diluciones seriadas a partir del primer poci-llo (dilución 1/2), pasando los microdilutores al pocillosiguiente (dilución 1/4) y así sucesivamente hasta ladilución que se desea investigar (por ejemplo: 1/8, 1/16,1/32), rotando en cada paso el microdilutor por lo me-nos 10 veces para asegurar una correcta dilución de lamuestra. Si se emplea una micropipeta automática de25 ul para la toma y/o dilución de la muestra, homoge-neizar por carga y descarga. Transferir 25 ul de pocillo apocillo hasta la dilución que se desee investigar. Des-cartar los últimos 25 ul.4- Colocar en los pocillos conteniendo las diluciones 1/2y 1/4, una gota (25 ul) de GR no sensibilizados para con-trol de heterofilia.5- En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul)de Antígeno HAI.6- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales dela policubeta.7- Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones, durante90 minutos.8- Leer a partir de los 90 minutos.Se puede aumentar la nitidez de la apreciación, leyen-do sobre un espejo, iluminando la placa desde arriba einterponiendo un papel blanco y traslúcido entre la poli-cubeta y la fuente de luz.

II- TITULACION CON 2-ME1- Colocar una gota de suero en el primer pocillo em-pleando goteros plásticos descartables, manteniéndo-los en posición vertical (uno por cada suero).2- Diluir al 1/2 agregando una gota de 2-Mercaptoetanolal 1% a los mismos pocillos (utilizar un único goterodescartable).3- Sellar estos pocillos con cinta adhesiva y mezclar apli-cando suaves golpes en los laterales de la policubeta.4- Incubar 30-60 minutos a 37oC o 90 minutos a tempe-ratura ambiente.5- Retirar la cinta adhesiva, pasar un trapo húmedo porla base de la policubeta y, con microgotero de 25 ul,colocar una gota de Diluyente de Sueros HAI en losrestantes pocillos a utilizar hasta la dilución deseada.6- Realizar los pasos 3 a 8 descriptos en la Titulación I.

III- ABSORCION CON GLOBULOS ROJOSNO SENSIBILIZADOSEn sueros que presenten heterofilia los anticuerpos he-terófilos pueden adsorberse sobre GR no sensibiliza-dos de la siguiente forma: en un tubo de hemólisis colo-car 50 ul de GR no sensibilizados provistos + 50 ul desuero en ensayo. Tapar para evitar la evaporación. Dejarla suspensión durante 30 minutos a 37oC agitando ex-temporáneamente. Luego centrifugar a 2000 rpm duran-te 5 minutos. Del sobrenadante se toman 50 ul y seemplea como dilución 1/2, colocándola en el primer po-cillo. Si se emplea en titulación con 2-ME este pocillocorresponde a dilución 1/4.

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IMAGEN POSITIVA IMAGEN NEGATIVA

IMAGEN DUDOSA

VALORES DE REFERENCIADentro de las técnicas inmunológicas, la HAI es consideradaun método confiable para la determinación de anticuerpos es-pecíficos. No obstante sus resultados, al igual que los de cual-quier método serológico, sólo constituyen un dato auxiliar parael diagnóstico. Es por esta razón que los informes deben serconsiderados en términos de probabilidad. En este caso, ma-yor o menor probabilidad de parasitosis por T. cruzi.Cualquier resultado Reactivo debe ser verificado por otra téc-nica. Recordar el criterio recomendado por el Instituto FatalaChaben, según el cual el inmunodiagnóstico de la infeccióndeberá hacerse con un mínimo de dos de los siguientes mé-todos: inmunofluorescencia indirecta, hemaglutinación indirec-ta, ELISA, aglutinación de partículas (látex), debidamente va-lidados por el Centro Nacional de Referencia.

Procedimiento de titulaciónSueros con títulos mayores o iguales a 1/16, se consideranreactivos para anticuerpos anti-T. cruzi.Cuando se observan resultados positivos (sueros reactivos) yademás se presenta manto en los pocillos destinados a con-trol de heterofilia (diluciones 1/2 y 1/4), debe realizarse otratitulación con los sueros correspondientes pero previamentetratados con 2-ME o adsorbidos con GR no sensibilizados. Elpropósito de estos tratamientos es eliminar la reacción ines-pecífica. En el primer caso el agente reductor (2-ME) eliminala capacidad aglutinante de los anticuerpos heterófilos, mien-tras que los GR no sensibilizados los elimina por adsorción.

Técnica de screening o descarte por 1 títuloEn las condiciones del ensayo, sueros con títulos mayores oiguales a 1/12, se consideran reactivos para anticuerpos anti-T.cruzi. La imagen que presenta un suero reactivo es de pelí-cula o manto en el fondo del pocillo.

CONTROL DE CALIDADComo punto de referencia de la reacción, pueden procesarsesimultáneamente un Control Positivo y un Control Negativoutilizándolos de la misma manera que la muestra.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Otras causas de resultados erróneos son:- Falta de acondicionamiento de la policubeta y los microdilu-

tores (Ver RECOMENDACIONES PREVIAS).- Policubetas rayadas por uso reiterado. No se aconseja reuti-

lizar pocillos.- Falta de homogeneización de los reactivos antes de su uso.- Deficiencias de mezclado.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSNo reactivo: presencia de un sedimento en forma de botóno pequeño anillo de bordes regulares.Reactivo: formación de una película o manto que cubre el50% o más del fondo de los pocillos. Si no se usan microdi-lutores, la imagen del manto puede ser más pequeña.

(1) Manto.(2) Punto final (50%).

TECNICA SCREENING O DESCARTE POR 1 TITULO

PROCEDIMIENTO1- Con microgotero de 25 ul, colocar una gota de Diluyen-te de Sueros HAI en todos los pocillos a utilizar de lapolicubeta (un pocillo por cada muestra).2- Sumergir un ansa limpia (provista) en la muestra.3- Colocar el ansa cargada en el pocillo que contiene elDiluyente de Sueros HAI, rotando la misma para obtenerun buen mezclado y distribuir la gota sobre todo el fondodel pocillo. Retirar el ansa y secarla con papel de filtro,lavar en dos recipientes con agua destilada. Secar nueva-mente con papel de filtro. Proceder de la misma manerapara cada nueva muestra.4- Agregar con microgotero de 25 ul, una gota de Antíge-no HAI reconstituido y homogeneizado a cada pocillo.5- Agitar la policubeta golpeando con los dedos en lasparedes laterales, durante 30 segundos por lo menos, paraasegurar un buen mezclado.6- Dejar reposar, al resguardo de vibraciones durante 2horas.7- Efectuar la lectura. En caso de que la lectura de losresultados se efectúe en un plazo mayor de 2 horas, lapolicubeta deberá taparse con una cinta adhesiva trans-parente para evitar evaporaciones.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSNo reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón.Reactivo: formación de una película o manto en el fondo delos pocillos. En caso de observar la presencia de un pequeñoanillo de bordes regulares, la muestra se considerará dudosay deberá ser ensayada por otro método.

(1) (2)

IMAGEN NEGATIVA

IMAGEN POSITIVA

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- Vibraciones accidentales durante el reposo necesario parael desarrollo de la reacción.

- Sueros envejecidos o congelados y descongelados repeti-damente.

- Contaminaciones accidentales de los reactivos o del mate-rial empleado en el ensayo.

- Exceso o defecto de Diluyente de Sueros HAI en los poci-llos de la policubeta.

- Diluyente de Sueros HAI que tenga más de 5 días de prepa-ración.

- No respetar los tiempos y temperaturas de incubación en eltratamiento con 2-ME al 1%.

- 2-Mercaptoetanol al 1% no preparado en el momento.

PERFORMANCETrabajos experimentales realizados sobre muestras poblacio-nales endémicas y no endémicas, mostraron que:1) En poblaciones endémicas, empleando el método de HAI,el 98% de los títulos menores a 1/8 y el 95% de los títulosmayores o iguales a 1/8 fueron confirmados por los métodostomados como referencia.2) En poblaciones no endémicas, el 100% de los individuossanos presentó títulos menores a 1/8 determinados por HAI.3) En el 100% de los individuos con serología positiva confir-mada por los métodos tomados como referencia y con para-sitosis demostrada por xenodiagnóstico y/o hemocultivo, seobservaron títulos mayores o iguales a 1/32 determinados conChagatest HAI.

PRESENTACIONEquipo para 96 determinaciones de 5 títulos o 480 de un título(Cód. 1293205).

BIBLIOGRAFIA- Mazza, S. - VI Congreso Nacional de Medicina (Córdoba),

pág. 155 (1938).- Cerisola, J.A. - La Prensa Médica Argentina 49/34:1761

(1962).- Fontenla S., Moretti, E. y González, G. - 50° Triduo de la

ABA, Huerta Grande (Córdoba), 1985.- Basso, A. y col. - 50° Triduo de la ABA. Huerta Grande

(Córdoba), 1985.- Lorenzo , L.; Capriotti, G.; Rojkín, F. - Rev. Arg. Transf. XVII/

1: 51, 1991.- Ministerio de Salud y Acción Social, Instituto Nacional de

Parasitología "Doctor Mario Fatala Chabén" - Normas parael diagnóstico de la infección chagásica - Resolución minis-terial 523/97, 1998.

2000 Rosario - Argentina

Wiener lab.UR020123


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SIGNIFICACION CLINICALa hepatitis B es una enfermedad viral caracterizada por unperíodo prolongado de incubación (45-160 días). El virus cau-sante de esta patología (HBV) es una partícula compuestapor una región interior o "core" donde se encuentra el DNA yuna envoltura exterior antigénica conocida como antígeno desuperficie (HBsAg). Su presencia en el suero indica enferme-dad activa. El antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg)y su correspondiente anticuerpo son específicos para infec-ciones por virus B. El antígeno puede ser detectado en elsuero y secreciones de pacientes en período agudo o en in-fecciones crónicas por HBV.El HBsAg es generalmente la primera evidencia de infecciónpor HBV, que puede preceder en semanas o meses a cual-quier otra manifestación de laboratorio o a los síntomas ysignos clínicos de la enfermedad. Puede ser en algunos ca-sos el único indicador de portadores asintomáticos en indivi-duos con hepatitis B crónica.La detección del HBsAg es importante por lo tanto, no sólopara el diagnóstico de la enfermedad aguda, sino para el con-trol de portadores en bancos de sangre, unidades de diálisisy áreas hospitalarias donde exista la posibilidad de transmi-sión de la infección.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa muestra se pone en contacto con un anticuerpo monoclo-nal anti-HBs inmovilizado sobre el soporte sólido. Si la mis-ma contiene antígeno HBsAg, éste formará un complejo conlos anticuerpos y permanecerá unido al soporte. La fracciónno unida se elimina por lavado tras lo que se agrega otroanticuerpo monoclonal anti-HBs conjugado con peroxidasa.Si se produjo la reacción en la primera etapa del proceso, seunirá el conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega elsustrato enzimático. En los casos en que el HBsAg estépresente en la muestra, habrá desarrollo de color celeste. Lareacción se detiene con el agregado de ácido sulfúrico, conlo que el color celeste vira al amarillo.

REACTIVOS PROVISTOSPolicubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles conpocillos que contienen anticuerpo monoclonal anti-HBs in-movilizado.Conjugado concentrado: anticuerpo monoclonal anti-HBsconjugado con peroxidasa.Diluyente de Conjugado: buffer Tris conteniendo aditivos yconservantes.Revelador A: peróxido de hidrógeno 60 mmol/l en buffer ci-trato 50 mmol/l.

Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/l en ácidoclorhídrico 0,1 N.Stopper: ácido sulfúrico 2 N.Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/len buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no iónico 0,1 g/l.Control Positivo: dilución de suero inactivado, reactivo paraHBsAg.Control Negativo: dilución de suero inactivado, no reactivo.

INSTRUCCIONES PARA SU USOBuffer de Lavado: a baja temperatura los componentes delreactivo pueden cristalizar. En tal caso, antes de diluir, colocaren baño de agua a 37oC unos minutos, mezclando luego porinversión. Para usar diluir 1+4 con agua destilada (1 parte deBuffer de Lavado concentrado + 4 partes de agua destilada).Policubeta sensibilizada: lista para usar.Conjugado: antes de diluir, para optimizar el aprovechamientodel reactivo, es conveniente centrifugar suavemente el Conju-gado concentrado para arrastrar lo que pudiera quedar reteni-do en las paredes del tubo. Preparar diluyendo 1 parte deConjugado concentrado + 50 partes de Diluyente de Conju-gado (ej.: para una tira colocar 20 ul Conjugado concentrado+ 1 ml Diluyente de Conjugado o cantidades equivalentes).Revelador A y B: listos para usar.Stopper: listo para usar.Control Positivo y Negativo: listos para usar.


si fueran capaces de transmitir infección. Los controlesse encuentran inactivados. Sin embargo, deben emplear-se como si se tratara de material infectivo.

- Los sueros controles han sido examinados para HIV en-contrándose negativos.

- Todos los materiales empleados en el ensayo deben serdestruidos a fin de asegurar la inactivación de agentespatógenos. El método recomendado para este procedi-miento es autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los líquidosde desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de so-dio (concentración final 5%) durante por lo menos 60 minutos.



recipientes para desechos biológicos u otras fuentes entrenen contacto con la policubeta, ya que éste afecta la reacción.

- Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

Hepatitis B (HBsAg)Ensayo inmunoenzimático (ELISA) de 3a generación parala detección del antígeno de superficie del virus de lahepatitis B (HBsAg)

ELISA

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- Evitar el contacto del ácido sulfúrico con la piel y mucosas.- Evitar el derrame de líquidos y formación de aerosoles.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.Buffer de Lavado: estable 3 meses a temperatura ambiente.Policubeta sensibilizada: las tiras de pocillos con anticuer-po inmovilizado se proveen cerradas al vacío y con desecan-te. No abrir el envoltorio hasta el momento de usar, ni antesque haya tomado temperatura ambiente, de lo contrario sefavorecerá la humectación del contenido. Las tiras de pocillosno utilizadas deben conservarse dentro del sobre con el de-secante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Las tirasconservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas dentrode los 5 meses posteriores mientras no se supere la fecha devencimiento del equipo.Conjugado: estable 24 horas en refrigerador (2-10oC).

MUESTRASuero o plasmaa) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. Nopueden usarse muestras inactivadas por calor.b) Aditivos: si se emplea plasma puede utilizarse cualquieranticoagulante de uso corriente en la práctica transfusional.c) Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis, hiper-lipemia y otras causas de turbiedad pueden provocar resulta-dos erróneos. Estas muestras deben ser clarificadas por cen-trifugación.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lasmuestras pueden conservarse durante 7 días a 2-10oC. Paraconservación por períodos más prolongados deben ser con-geladas a -20oC o menos. Evitar los congelamientos y des-congelamientos reiterados. Existen evidencias que muestranque los congelamientos sucesivos pueden ser causa de re-sultados erróneos.Si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuer-do a las especificaciones legales relativas al envío de mate-riales infecciosos.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados en

el PROCEDIMIENTO.- Reloj alarma o cronómetro.- Estufa a 37oC.- Material volumétrico adecuado.- Espectrofotómetro para lectura de policubetas (opcional).

CONDICIONES DE REACCION- Longitud de onda primaria: 450 nm- Longitud de onda secundaria (bicromática): 620-650 nm- Calibración del instrumental: llevar a cero el espectrofotó-

metro con Blanco de Reactivos procesándolo de la mismaforma que una determinación pero omitiendo colocar Mues-tra y Conjugado, es decir sólo Revelador A, Revelador B yStopper.

- Tiempo total de reacción: 2 horas 30 minutos.- Temperatura de reacción: 37oC y temperatura ambiente.- Volumen de muestra: 100 ul

PROCEDIMIENTONota: una vez iniciado el procedimiento debe completarsesin interrupción.Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues-tras antes de iniciar la prueba. Procesar simultáneamente2 Controles Positivos (CP), 3 Controles Negativos (CN) ylos Desconocidos (D). En los pocillos a utilizar de lapolicubeta colocar:

D CP CN

Muestra 100 ul - -



Para evitar la evaporación, cubrir la placa con una cintaautoadhesiva e incubar en estufa 60 minutos a 37oC. Lue-go aspirar cuidadosamente el líquido de cada pocillo reci-biéndolo en un recipiente para desechos biológicos quecontenga 5% de hipoclorito sódico. A continuación, lavar 5veces con Buffer de Lavado empleando aproximadamente350 ul/vez/pocillo. Después de cada lavado, el líquido sedescartará también en el recipiente con hipoclorito, opcio-nalmente emplear lavador automático. Al finalizar el últimolavado, eliminar por completo el líquido residual, invirtien-do la policubeta y golpeándola varias veces sobre papelabsorbente, ejerciendo una leve presión con la mano so-bre los laterales mayores del soporte, para evitar la caí-da de las tiras de pocillos. Luego agregar en cada poci-llo:

Conjugado 100 ul 100 ul 100 ul

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Para evitar la evapora-ción, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubardurante 60 minutos en estufa a 37oC. Luego eliminar ellíquido de los pocillos, recibiéndolo en el recipiente conhipoclorito y lavar según se indicó más arriba. Al finalizarel último lavado, eliminar por completo el líquido residual,invirtiendo la policubeta y golpeándola varias veces sobrepapel absorbente, ejerciendo una leve presión con la manosobre los laterales mayores del soporte, para evitar la caí-da de las tiras de pocillos. Luego agregar:



En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Incubar 30 minutos a tem-peratura ambiente y luego agregar:


En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos.Leer en espectrofotómetro a 450 nm o bicromática a 450/620-650 nm o evaluar el resultado a simple vista por com-paración con los Controles Positivos y Negativos.

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obtenerse absorbancias negativas que no invalidan la deter-minación. Esto se debe a que algunas muestras dan lecturasinferiores al Blanco de Reactivos.Verifique que el sistema lavador que está usando (WIENERWASHER u otro), aspire totalmente el contenido de los poci-llos y que el volumen de la solución lavadora sea pareja.

PERFORMANCEa) Sensibilidad: utilizando el International Standard for He-patitis B Surface Antigen (subtype ad) NIBSC (cód. 80/549)diluido en PBS-BSA 5%, azida sódica 0,1% se detectan can-tidades de antígeno de 0,5 UI/ml. De acuerdo al informe delWHO Working Group on International Reference Preparations,1 UI equivale a 0,58 unidades PEI (Paul Ehrlich Institut) o1,93 French "ng" o 5,59 Abbott "ng".b) Especificidad: se realizaron diferentes estudios sobre unapoblación de individuos hospitalizados y ambulatorios, prove-nientes de centros de salud de la ciudad de Rosario, Argenti-na. En los mismos se comparó la especificidad del métodocon otros de similar principio de reacción, obteniéndose lossiguientes resultados:- Estudio Nº 1: se analizaron 85 individuos obteniéndose una

especificidad de 100%.- Estudio Nº 2: se analizaron 76 individuos, obteniéndose una

especificidad de 98,7%.- Estudio Nº 3: se analizaron 127 individuos, obteniéndose

una especificidad de 100%.c) Estudio poblacional: en una población general que inclu-ye individuos sanos y donantes, la correlación con respectoa otros ensayos disponibles en el mercado, fue del 99,8%.

PRESENTACION- Equipo para 96 determinaciones (Cód. 1483253).- Equipo para 192 determinaciones (Cód. 1483256).

BIBLIOGRAFIA- Wisdom, G.B. - Clin. Chem. 22/8:1243, 1976.- Engvall, E. - Methods Enzymol. 70:419, 1980.- Gerety, R.J. - "Hepatitis B" - Academic Press, Inc., USA,

1985.- García Solís - Análisis Clínicos 24/6:199, 1981.- Toplikar, E.; Carlomagno, A.; Capriotti, G.; Rojkín, F.; Loren-

zo, L. - Rev. Arg. de Transfusión XVII/4:239, 1991.- Rojkín, F.; Gariglio, R.; Toplikar, E.; Carlomagno, A.; Loren-

zo, L. - Proceedings, 5th National Forum on AIDS, Hepatitisand other Blood-Borne Diseases, Atlanta, Georgia, USA,pág. 89, 1992.

- Toplikar, E.; Carlomagno, A.; Rojkín, F.; Gariglio, R.; Loren-zo, L. - J. Clin. Lab. Anal. 7/6:324, 1993.

- Barbara, J. - Vox Sang. 65:249-250, 1993.- WHO Working Group on International Reference Preparations

for Testing Diagnostic Kits used in the Detection of HBsAgand anti-HCV Antibodies. Geneva, SW 6-7 October 2003.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINALEl color de la reacción es estable durante 30 minutos por loque los resultados deben observarse dentro de ese lapso.

CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDALa corrida se considera válida si se cumplen simultáneamen-te las siguientes condiciones:a) Las lecturas de al menos 2 de los 3 Controles Negativoscorregidas contra el Blanco de Reactivos deben ser menoreso iguales a 0,150 D.O.b) La lectura media de los Controles Positivos corregida debeser mayor o igual a 0,600 D.O.Si alguna de estas condiciones no se cumple, repetir la corri-da. Para ambos casos recordar que las lecturas obtenidasdependerán de la sensibilidad del aparato empleado.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSa) Con instrumental ópticoLa reactividad de la muestra se determina relacionando laabsorbancia de la muestra respecto al valor cut-off.

Cut-off = CN + 0,060 D.O.

donde CN = promedio de las lecturas del Control Negativo.Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorban-cias mayores o iguales al valor cut-off.Las muestras inicialmente reactivas deben analizarse nueva-mente por duplicado con el mismo método antes de su inter-pretación definitiva. Si uno o ambos duplicados resultaranreactivos la muestra debe considerarse repetidamentereactiva.Muestras no Reactivas: se consideran aquellas con absor-bancias menores que el valor cut-off.

b) Interpretación visualSi se opta por este tipo de interpretación, debe considerarseno reactiva toda muestra que no presente una coloración ma-yor que la de los Controles Negativos. Por el contrario, unamuestra netamente amarilla se considera reactiva. Colorestenues mayores que el del Control Negativo, requieren la in-terpretación instrumental.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Constituyen causas de resultados erróneos:- Lavado incorrecto de los pocillos de reacción.- Contaminación cruzada de Muestras no Reactivas con antí-

geno procedente de una Muestra Reactiva.- Contaminación de la solución cromogénica con agentes oxi-

dantes (cloro, etc.).- Contaminación del Stopper.- Conservación inadecuada de las tiras de pocillos no utiliza-

das.- Uso de baño de agua en lugar de estufa para la incubación.- Contaminación del Buffer de Lavado diluido. Se recomienda

verificar la limpieza de los recipientes donde se prepara yalmacena. Si se observa aparición de turbidez o precipitadoal prepararlo, debe desecharse.

Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposi-ción o infección por HBV.Ocasionalmente, al efectuar lecturas bicromáticas, pueden

Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 180/01Cert. Nº: 4189/01

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Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección deanticuerpos contra el Treponema pallidum

SífilisELISA recombinante

SIGNIFICACION CLINICALa sífilis es una enfermedad venérea causada por una bacte-ria denominada Treponema pallidum, que invade las mucosasintactas o la piel en áreas de abrasiones. El contacto sexuales la forma más común de transmisión. Sin embargo, puedetransmitirse a través de la barrera placentaria de la madre alfeto, o mediante transfusión sanguínea.La detección y tratamiento de la enfermedad en sus estadiostempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones gra-ves como sífilis cardiovascular, neurosífilis y sífilis congénita.El diagnóstico de esta enfermedad sufre la carencia de unmétodo para cultivar el microorganismo en medios de labora-torio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enferme-dad en los que no se observan lesiones directas. El mismopuede realizarse:- a través de métodos de detección de anticuerpos no-espe-

cíficos (que utilizan antígenos no-treponémicos) cuya inter-pretación es visual;

- por métodos inmunoenzimáticos (ELISA) que detectan lapresencia de anticuerpos específicos contra el Treponemapallidum en muestras de pacientes que se encuentran endiferentes estadios de la enfermedad.

El método ELISA es adecuado para la automatización debidoal empleo de una reacción colorimétrica para la interpreta-ción de los resultados. Además, el uso de antígenos recom-binantes resulta en un incremento de la sensibilidad y la es-pecificidad.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa muestra se diluye en el soporte en el que se encuentraninmovilizados antígenos recombinantes de Treponema palli-dum. Si la misma contiene los anticuerpos específicos, és-tos formarán un complejo con los antígenos y permaneceránunidos al soporte. La fracción no unida se elimina por lavadotras lo que se agregan anticuerpos anti-inmunoglobulina hu-mana conjugados con peroxidasa. Si se produjo la reacciónen la primera etapa del proceso, se unirá el conjugado. Luegode un nuevo lavado se agrega el sustrato enzimático. En loscasos en que se haya unido el conjugado habrá aparición decolor celeste. La reacción se detiene con ácido sulfúrico, conlo que el color celeste vira al amarillo.

REACTIVOS PROVISTOSPolicubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles conpocillos que contienen antígenos recombinantes del Trepo-nema pallidum inmovilizados.Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conju-gadas con peroxidasa.

Revelador A: peróxido de hidrógeno 60 mmol/l en buffer citrato50 mmol/l pH 3,2.Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/l en ácidoclorhídrico 0,1 N.Stopper: ácido sulfúrico 2 N.Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/len buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no iónico 0,1 g/l.Diluyente de Muestras: albúmina bovina en solución fisioló-gica tamponada con buffer fosfatos pH 7,2.Control Positivo: dilución de suero inactivado conteniendoanticuerpos contra el Treponema pallidum.Control Negativo: dilución de suero no reactivo, inactivado.

INSTRUCCIONES PARA SU USOBuffer de Lavado: para usar diluir 1+4 con agua destilada (1parte de Buffer de Lavado concentrado + 4 partes de aguadestilada). A baja temperatura los componentes del reactivopueden precipitar. En tal caso, colocar en baño de agua a37oC unos minutos, mezclando luego por inversión.Policubeta sensibilizada: lista para usar.Conjugado: listo para usar.Reveladores A y B: listos para usar en la Técnica con Reve-ladores Separados. En la Técnica con Reveladores premez-clados, preparar una mezcla de partes iguales de Revelador Ay Revelador B, por lo menos 20 minutos antes de ser utiliza-da.Stopper: listo para usar.Diluyente de Muestras: listo para usar. El color del Diluyen-te de Muestras puede variar de lote a lote sin que se afecte lacapacidad reaccional del mismo.Control Positivo y Control Negativo: listos para usar.



- Los sueros controles han sido examinados para antígeno desuperficie de hepatitis B (HBsAg), y virus de inmunodefi-ciencia humana (HIV) encontrándose no reactivos.


- No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes.- No emplear reactivos de otro origen.

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- Las policubetas deben incubarse en estufa. No usar baño deagua. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso.

- Evitar que los vapores de hipoclorito provenientes de los re-cipientes para desechos biológicos entren en contacto conla policubeta, ya que el hipoclorito afecta la reacción.

- Los reactivos son para uso “in vitro”.- Evitar el contacto del ácido sulfúrico con la piel y mucosas.- Evitar el derrame de líquidos y formación de aerosoles.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.Buffer de Lavado: estable 3 meses a temperatura ambiente.Policubeta sensibilizada: las tiras de pocillos con antígenoinmovilizado se proveen cerradas al vacío y con desecante.No abrir el envoltorio hasta el momento de usar, ni antes quehaya tomado temperatura ambiente, de lo contrario se favore-cerá la humectación del contenido. Las tiras de pocillos noutilizadas deben conservarse dentro del sobre con eldesecante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Lastiras conservadas en estas condiciones pueden ser utilizadasdentro de los 3 meses posteriores mientras no se supere lafecha de vencimiento del equipo.

MUESTRASuero o plasmaa) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. Nodeben usarse muestras inactivadas por calor. Ver LIMITACIO-NES DEL PROCEDIMIENTO.b) Aditivos: no se requieren para suero. Si se emplea plasmapuede utilizarse cualquier anticoagulante de uso corriente enla práctica transfusional.c) Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis, hiper-lipemia y otras causas de turbiedad pueden provocar resulta-dos erróneos. Estas muestras deben ser clarificadas por cen-trifugación.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lasmuestras no diluidas pueden conservarse durante 7 días a 2-10oC. Para conservación por períodos más prolongados, de-ben ser congeladas a -20oC o menos. Evitar los congelamien-tos y descongelamientos reiterados. Existen evidencias quemuestran que los congelamientos sucesivos pueden ser cau-sa de resultados erróneos.Si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuer-do a las especificaciones legales relativas al envío de mate-riales infecciosos.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados.- Reloj alarma o cronómetro.- Estufa a 37oC.- Espectrofotómetro para lectura de policubetas.- Papel absorbente.

CONDICIONES DE REACCION- Longitud de onda primaria: 450 nm- Longitud de onda secundaria (bicromática): 620 nm

- Calibración del instrumental: llevar a cero el espectrofotóme-tro con Blanco de Reactivos procesándolo de la misma for-ma que una determinación pero omitiendo colocar Muestra.

- Tiempo de reacción: variable, según el procedimiento selec-cionado.

- Temperatura de reacción: 37 ± 2oC y temperatura ambiente(18-25oC).

- Volumen de muestra: 10 ul

PROCEDIMIENTO

I- TECNICA CON REVELADORES SEPARADOSLlevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues-tras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el procedi-miento debe completarse sin interrupción.Procesar simultáneamente 2 Controles Positivos (CP) 3Negativos (CN) y los Desconocidos (D). Al depositar lamuestra y/o Controles sobre el Diluyente de Muestras,debe asegurarse de colocar los mismos en el seno dellíquido y no sobre las paredes o el fondo del pocillo. En-juagar la pipeta con el Diluyente dispensado en el pocillopara asegurar la correcta homogeneización.En los pocillos a utilizar de la policubeta colocar:

D CP CN




Muestra 10 ul - -

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos una vez cargadas lasmuestras en cada tira. En el procedimiento manual, paraevitar la evaporación, cubrir la placa e incubar en estufa 30± 2 minutos a 37 ± 2oC. Luego aspirar cuidadosamente ellíquido de cada pocillo recibiéndolo en un recipiente paradesechos biológicos que contenga 5% de hipocloritosódico. A continuación, lavar 5 veces con Buffer de Lavadoempleando aproximadamente 300 ul/vez/pocillo. Despuésde cada lavado, el líquido se descartará también en el re-cipiente con hipoclorito. Opcionalmente, emplear lavadorautomático. Al finalizar el último lavado, eliminar por com-pleto el líquido residual, invirtiendo la policubeta y golpeán-dola varias veces sobre papel absorbente, ejerciendo unaleve presión con la mano sobre los laterales mayores delsoporte, para evitar la caída de las tiras de pocillos. Luegoagregar en cada pocillo:


Se puede colocar 1 gota utilizando el gotero provisto.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Para evitar la evapora-ción, cubrir la placa e incubar durante 30 ± 2 minutos a 37± 2oC. Luego aspirar el líquido de los pocillos, recibiéndoloen el recipiente con hipoclorito y lavar según se indicómás arriba. Al finalizar el último lavado, eliminar por com-

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pleto el líquido residual, invirtiendo la policubeta y golpeán-dola varias veces sobre papel absorbente, ejerciendo unaleve presión con la mano sobre los laterales mayores delsoporte, para evitar la caída de las tiras de pocillos.Luego agregar en cada pocillo respetando el orden de losreactivos:

Revelador A 50 ul 50 ul 50 ul

Revelador B 50 ul 50 ul 50 ul

Se puede colocar 1 gota de cada Revelador utilizando elgotero provisto.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Incubar 30 ± 2 minutos atemperatura ambiente (18-25oC) y luego agregar:

Stopper 50 ul 50 ul 50 ul

Se puede colocar 1 gota utilizando el gotero provisto.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos.Leer en espectrofotómetro a 450 nm o bicromática a 450/620 nm.

II- TECNICA CON REVELADORES PREMEZCLADOSLlevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues-tras. Previo a iniciar el ensayo, preparar la mezcla de Re-veladores A y B como se indicó en INSTRUCCIONES PARASU USO.Una vez iniciado el procedimiento debe completarse sininterrupción.Procesar simultáneamente 2 Controles Positivos (CP) 3Negativos (CN) y los Desconocidos (D). Al depositar lamuestra y/o Controles sobre el Diluyente de Muestras,debe asegurarse de colocar los mismos en el seno dellíquido y no sobre las paredes o el fondo del pocillo. En-juagar la pipeta con el Diluyente dispensado en el pocillopara asegurar la correcta homogeneización.En los pocillos a utilizar de la policubeta colocar:

D CP CN




Muestra 10 ul - -

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos una vez cargadas lasmuestras en cada tira. En el procedimiento manual, paraevitar la evaporación, cubrir la placa e incubar en estufa30 ± 2 minutos a 37 ± 2oC. Luego aspirar cuidadosamenteel líquido de cada pocillo recibiéndolo en un recipientepara desechos biológicos que contenga 5% de hipocloritosódico. A continuación, lavar 5 veces con Buffer de Lava-do empleando aproximadamente 300 ul/vez/pocillo. Des-pués de cada lavado, el líquido se descartará también enel recipiente con hipoclorito. Opcionalmente, emplearlavador automático. Al finalizar el último lavado, eliminar

por completo el líquido residual, invirtiendo la policubeta ygolpeándola varias veces sobre papel absorbente, ejer-ciendo una leve presión con la mano sobre los lateralesmayores del soporte, para evitar la caída de las tiras depocillos. Luego agregar en cada pocillo:


Se puede colocar 1 gota utilizando el gotero provisto.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Para evitar la evapora-ción, cubrir la placa e incubar durante 20 ± 2 minutos atemperatura ambiente (18-25oC). Ver LIMITACIONES DELPROCEDIMIENTO. Luego aspirar el líquido de los poci-llos, recibiéndolo en el recipiente con hipoclorito y lavarsegún se indicó más arriba. Al finalizar el último lavado,eliminar por completo el líquido residual, invirtiendo la po-licubeta y golpeándola varias veces sobre papel absor-bente, ejerciendo una leve presión con la mano sobre loslaterales mayores del soporte, para evitar la caída de lastiras de pocillos.Luego agregar la mezcla de Revelador A + Revelador B(estable 24 horas):

Reveladores premezclados 100 ul 100 ul 100 ul

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Incubar 20 ± 2 minutos atemperatura ambiente (18-25oC) y luego agregar:

Stopper 50 ul 50 ul 50 ul

Se puede colocar 1 gota utilizando el gotero provisto.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos.Leer en espectrofotómetro a 450 nm o bicromática a 450/620 nm.


CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDALa corrida se considera válida si se cumplen simultáneamen-te las siguientes condiciones:a) Las lecturas de al menos 2 de los 3 Controles Negativoscorregidas contra el Blanco de Reactivos deben ser menoreso iguales a 0,150 D.O.b) La lectura media de los Controles Positivos corregida debeser mayor o igual a 0,600 D.O.Si una o ambas condiciones no se cumple, repetir la corrida.Para ambos casos recordar que las lecturas obtenidas de-penderán de la sensibilidad del aparato empleado.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLa presencia o ausencia de anticuerpos anti-Treponemapallidum se determina relacionando la absorbancia de la mues-tra respecto al valor Cut-off.

Cut-off = CN + 0,250 D.O

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donde CN: promedio de las lecturas del Control NegativoZona de indeterminación: Cut-off ± 10%

Muestras No Reactivas: se consideran aquellas con absor-bancias menores que el límite inferior de la zona de indetermi-nación.Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorban-cias mayores que el límite superior de la zona de indetermi-nación.Muestras Indeterminadas: se consideran aquellas con ab-sorbancias que caen dentro de la zona de indeterminación.Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.

Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por du-plicado. Si una o ambas repeticiones dan reactivas, la mismadebe considerarse reactiva.Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva enlas dos repeticiones. Esto puede deberse a:- Contaminación cruzada de un pocillo no reactivo por una

muestra reactiva.- Contaminación de la muestra durante la dispensación, im-

precisión en el dispensado de muestra, conjugado y/o Re-velador en el pocillo.

- Reutilización de tips.- Contaminación del pocillo con hipoclorito u otros agentes

oxidantes.En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentaruna reacción falsamente reactiva, tanto en el análisis inicialcomo en sus repeticiones. Algunas causas de este fenómenopueden ser:- Contaminación de la muestra durante la extracción, proce-

samiento o conservación.- Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanti-

cuerpos, fármacos, etc.- Dispensación y/o aspirado ineficiente de la solución de lava-

do (sistema obstruido)

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO- Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.- El tiempo y la temperatura de incubación son críticos, ya

que cualquier alteración de los mismos, conduce a resulta-dos erróneos.

- Otras causas de resultados erróneos son:Lavado incorrecto de los pocillos de reacción.Contaminación cruzada de muestras No Reactivas con an-ticuerpos procedentes de una muestra Reactiva.Contaminación de la solución cromogénica con agentesoxidantes (cloro, etc.).Contaminación del Stopper.Conservación inadecuada de las tiras de pocillos no utilizadas.No utilizar baño de agua para la incubación.Contaminación del Buffer de Lavado diluido. Se recomiendaverificar la limpieza de los recipientes donde se prepara yalmacena. Si se observa aparición de turbidez o precipitadoal prepararlo, debe desecharse.

- Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposi-ción o infección por Treponema pallidum.

- Los resultados repetidamente reactivos deben corroborarsepor un método confirmatorio, de acuerdo a la normativa le-gal vigente.

2000 Rosario - ArgentinaWiener lab.

Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Autorizado A.N.M.A.T.Cert. Nº: 4763/03



- Verifique que el sistema lavador que está usando (WIENERWASHER u otro) aspire totalmente el contenido y que elvolumen de la solución lavadora dispensada sea pareja.

PERFORMANCEa) Sensibilidad: en un estudio realizado sobre diferentes Pa-neles comerciales internacionales, se obtuvieron los siguien-tes resultados:- Syphilis mixed Titer Performance Panel (PSS201), Boston

Biomedica, Inc.: fueron detectadas 23 de 23 muestras posi-tivas.

- Panel del Centers for Disease Control (CDC) de diferentesestadios clínicos (sífilis primaria tratada y no tratada, sífilissecundaria tratada y sífilis latente tratada): se detectaron19 de las 20 muestras positivas.

En otro estudio realizado sobre 64 muestras con serologíapositiva confirmada por otros métodos tomados como refe-rencia (aglutinación de partículas y ELISA), fueron detecta-das 63 muestras.

b) Especificidad: en un estudio realizado sobre 38 muestrascon serología negativa confirmadas con otros métodos toma-dos como referencia (aglutinación de partículas y ELISA), seobtuvieron 37 muestras negativas.En un estudio sobre 310 muestras de sueros y plasmas pro-venientes de bancos de sangre y consultorios externos, seobtuvo una especificidad de 98,7%.En un estudio sobre 88 muestras de plasmas provenientesde consultorios externos la especificidad fue de 100%.

PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOSVer las adaptaciones específicas para cada tipo de analiza-dor, que deberán ser solicitadas al departamento Marketingde Wiener lab.

PRESENTACION- Kit para 96 determinaciones (Cód. 1853251).

BIBLIOGRAFIA- Young H., Moyes A., Seagar L. and McMillan A. - J. Clin.

Microbiol. 36/4:913, 1998- Zrein M., Maure I., Boursier F. and Soufflet L. - J. Clin.

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G .and Braviz Lopez M.E. - Acta Bioquímica Clínica Lati-noamericana XXXIII/2:243, 1999.

- Morse S.A. - Current opinion in infectious diseases 14:45,2001.

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IgG/IgMReactivo para la detección de antígeno D (Rho)

monoclonal

Anti-D (Rho)

SIGNIFICACION CLINICALas observaciones de Levine y Stetson en 1939 y deLandsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases parael conocimiento actual de la importancia clínica en la detec-ción de los anticuerpos anti-D.Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca yel 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno Dy son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno,ya sea por transfusión o durante el parto, produciendo anti-D.Algunos individuos presentan una disminución cuantitativa enla expresión de su antígeno D, llamados D débiles (antigua-mente Du). Otros, en cambio, presentan una variación cualita-tiva en la expresión de dicho antígeno, denominados como Dparcial. Dentro de este grupo se encuentra la categoría DVI,caracterizada por poseer una mínima cantidad de epitopes.El antígeno D es altamente inmunogénico siendo responsa-ble de severas reacciones post-transfusionales y de la enfer-medad hemolítica del recién nacido.Existen más de 40 antígenos diferentes identificados dentrodel sistema Rh. Sin embargo, es el antígeno D el que poseemayor importancia en la clínica después del sistema ABO.

FUNDAMENTOS DEL METODOLos glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto consuero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocitoel antígeno correspondiente, se producirá una aglutinaciónvisible macroscópicamente.El componente IgM anti-D del reactivo produce aglutinacióndirecta de los glóbulos rojos portadores del antígeno D nor-mal. En la mayoría de los casos los D débiles no se aglutinandirectamente con este reactivo.El componente IgG anti-D del reactivo puede detectar las va-riantes débiles (detecta DVI) mediante la prueba indirecta conanti-globulina.

REACTIVO PROVISTOAnti-D (Rho): mezcla de anticuerpos monoclonales humani-zados IgM/IgG (Blend) perteneciente a los clones TH-28 (se-cretor de IgM) y MS-26 (secretor de IgG), en una solución tam-ponada conteniendo 1 g/l de azida sódica como conservante.

REACTIVOS NO PROVISTOSDe acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicio-nalmente:- Solución fisiológica.- Suero Anti-humano (poliespecífico) de Wiener lab.- Buffer PBS pH 7,0 ± 0,2.- Solución salina de baja fuerza iónica (LISS).

INSTRUCCIONES PARA SU USOEl reactivo se provee listo para usar. No debe diluirse.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOEl Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hastala fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.Períodos prolongados de almacenamiento a temperaturas fuerade este rango pueden acelerar la pérdida de la actividad delreactivo.Evitar los cambios térmicos repetidos y limitar a lo estricta-mente necesario la exposición a temperatura ambiente delreactivo.En estas condiciones de uso y conservación, el reactivo, des-pués de su apertura, es estable hasta la fecha de expiraciónindicada en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOSREACTIVOSDesechar el reactivo cuando se observe contaminación delmismo. Si bien la azida de sodio se adiciona como bacterios-tático, se recomienda inspeccionar el reactivo visualmenteantes de usarlo. No debe utilizarse si presenta turbidez.El reactivo no debe utilizarse si presenta precipitados o partí-culas.

MUESTRAGlóbulos rojos o sangre enteraa) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con osin anticoagulante.Puede analizarse sangre obtenida por punción digital para latécnica en placa. Para evitar la coagulación de la sangre alutilizar esta técnica, se la debe mezclar rápidamente con elreactivo.b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: hepa-rina, EDTA, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa), CPD (citra-to, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa,adenina). Puede utilizarse Anticoagulante W de Wiener lab.c) Sustancias interferentes conocidas:- Los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o frac-

ciones del complemento pueden dar reacciones falsamentepositivas. Cuando se sospecha esta situación deberá reali-zarse una Prueba de Antiglobulina Directa.

- La hemólisis marcada interfiere.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lasmuestras deberán ser analizadas lo antes posible, evitandode esta manera falsos positivos o negativos derivados de laconservación incorrecta o de contaminación bacteriana. Si el

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análisis no se puede realizar en el momento, las muestras sedeben conservar refrigeradas (2-10oC). Si se utilizó EDTA oheparina para su obtención, la tipificación debe llevarse a cabodentro de las 48 horas. Las muestras obtenidas con ACD,CPD o CPDA-1, pueden ser ensayadas hasta los 35 días deextraída. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipifi-cación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.Si los glóbulos rojos son almacenados por períodos prolonga-dos pueden observarse reacciones débiles.Para los ensayos con sangre de cordón, los glóbulos rojosdeben lavarse previamente con solución fisiológica.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)Dependiendo de la técnica a utilizar, podrán ser necesarios:- Centrífuga- Tubos de hemólisis- Placa de vidrio- Palillos mezcladores descartables

PRECAUCIONESEste reactivo es para uso "in vitro" y está estrictamente re-servado para uso profesional por personal calificado con com-probada competencia en inmunohematología.No utilizar el reactivo fuera de la fecha de vencimiento.La azida sódica es tóxica. R22: nocivo por ingestión.La azida puede reaccionar con las cañerías de plomo o cobregenerando compuestos explosivos. Al eliminar el reactivo, sedebe dejar correr grandes cantidades de agua.Utilizar los reactivos guardando las precauciones habitualesde trabajo en el laboratorio de química clínica.El reactivo y las muestras deben descartarse de acuerdo a lanormativa local vigente.

PROCEDIMIENTOEste reactivo ha sido estandarizado según los procedi-mientos detallados a continuación; su desempeño en eluso mediante otras técnicas no puede ser garantizado.

I- TECNICA EN PLACAPreparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% enplasma/suero autólogos, PBS pH 7,0 ± 0,2 o soluciónfisiológica. También puede emplearse sangre entera.1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa devidrio limpia y rotulada.2) Agregar al lado una gota de la suspensión de glóbu-los rojos a probar. Debe mantenerse la relaciónantisuero:células en todos los ensayos.3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un pali-llo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balan-cear constantemente la placa durante 2 minutos.Observar macroscópicamente la presencia o ausenciade aglutinación. La observación puede facilitarse si seemplea una fuente de luz difusa.Si el período de observación es mayor a 2 minutos, efec-tos de la evaporación del reactivo pueden conducir aresultados equivocados (débilmente positivos).Algunas muestras D débiles o D parcial pueden no aglu-

tinar cuando se utiliza la técnica en placa. Ante resulta-dos indeterminados o negativos deben confirmarse utili-zando la técnica en tubo.Las técnicas en placa no están aconsejadas para ladetección de muestras D débil o D parcial.

II- TECNICA EN TUBOPreparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% enplasma o suero autólogos, PBS pH 7,0 ± 0,2, LISS 1,5-2% o en solución fisiológica.1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de he-mólisis rotulado.2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojosa probar.3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 1.000 g.4) Agitar el tubo para despegar las células y examinarmacroscópicamente la presencia o ausencia de agluti-nación. La observación puede facilitarse si se empleauna fuente de luz difusa.Las reacciones aparentemente negativas deben incu-barse a 37oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar yvolver a leer como se describió en 4). Las muestras queaún en estas condiciones resulten negativas deben serinvestigadas respecto al antígeno D débil.Efectuando la técnica en tubo, en caso de resultadoindeterminado o negativo, se puede continuar con el paso4 de la prueba antiglobulina indirecta para D débil.

III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA D DEBILPreparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos enplasma o suero autólogos, o solución fisiológica.1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de he-mólisis rotulado.2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos.3) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos.4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica oPBS pH 7,0 ± 0,2 descartando perfectamente la solu-ción salina residual o sobrenadante y resuspender lascélulas luego de cada lavado.5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespe-cífico), mezclar y centrifugar 20 segundos a 1000 g.6) Agitar ligeramente el tubo para despegar las célulasy examinar macroscópicamente presencia o ausenciade aglutinación. La observación puede facilitarse si seemplea una fuente de luz difusa.

Nota: las muestras que dan positivo el test de Coombsdirecto no pueden ser analizadas por la prueba antiglobu-lina indirecta.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLa observación de aglutinación (con cualquiera de las técni-cas empleadas) indica presencia del antígeno D; la reacciónes positiva y el individuo será clasificado como Rh positivo.La aglutinación de los glóbulos rojos en estudio con el reacti-vo anti-D por la prueba antiglobulina indirecta para D débil,indica que los glóbulos pertenecen a la variedad D débil (siem-pre que los glóbulos rojos resulten Coombs directo negativo).

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La no aglutinación con el reactivo Anti-D en la prueba antiglo-bulina indirecta para D débil indica ausencia del correspon-diente antígeno; la reacción es negativa y el individuo seráclasificado como Rh negativo.

METODO DE CONTROL DE CALIDADEl control de calidad de los reactivos es esencial y debe reali-zarse al comienzo de cada jornada de trabajo, con cada seriede determinaciones de grupo Rh y con pruebas individuales.Como mínimo deberían emplearse: glóbulos rojos R1r comocontrol positivo y glóbulos rojos rr como control negativo.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.La determinación no puede efectuarse sobre glóbulos rojosque dan lugar a test de Coombs directo positivo.Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualiza-ción precalentando la placa a 45-50oC.Los resultados anormales pueden ser consecuencia de:- Contaminación bacteriana o química de las muestras, de

los reactivos o del material.- Medicación o patología del paciente que provoque reacción

cruzada.- Preparación de los glóbulos rojos diferente a la recomendada.- Agitación insuficiente que provoque una resuspensión in-

completa de los glóbulos rojos.- Agitación demasiado fuerte que disgregue los aglutinados.- Demoras en la lectura.

PRESENTACION- 1 x 10 ml (Cód. 1443155).

BIBLIOGRAFIA- Levine P., Stetson R.E. - "An unusual case of intragroup

agglutination" - J. Amer. Med. Assoc. 113:126-127, 1939.- White WD, Issitt CH, McGuire D. - "Evaluation of the use of

albumin controls in Rh phenotyping" - Transfusion 14:67-71; 1974.- Race , R.R. and Sanger, R. - “Blood Groups in Man” - 6th ed.

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- Issit P.D. Applied Blood Group Serology 3rd ed., MontgomeryScientific Publications, Miami, Florida, USA, Chapter 10, 1985.

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- Widmann F.K. ed Technical Manual 10th ed. WashingtonDC, American Association of Blood Banks, Chapter 11, 1990.

- Walker RH., ed. Technical Manual, 11th ed. Bethesda, MD,American Association of Blood Banks, Chapter 11, 1993.

- Jones J., Scott ML., Voak D. - "Monoclonal anti-D specificityand Rh D structure: criteria for selection of monoclonal anti-D reagents for routine typing of patients and donors" -Transfusion Medicine 5:171-184,1995.

- Vengelen V., ed. Technical manual. 13th ed. Bethesda:American Association of Blood Banks, 1999.


Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Autorizado A.N.M.A.T.Disp. Nº: 1074/89

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DIA (Dot Immuno Assay)HIV 1+2

*

Inmunoensayo sobre soporte sólido para la detecciónde anticuerpos contra los virus de inmunodeficiencia hu-mana HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2

Diluyente de Muestras: listo para usar.Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes delreactivo pueden precipitar. En tal caso, colocar en baño deagua a 37oC unos minutos, mezclando luego por inversión.Diluir 1+7 con agua destilada (1 parte Buffer de Lavado con-centrado + 7 partes de agua destilada). Tener en cuenta queal realizar la técnica el Buffer de Lavado se prepara una solavez y se utiliza en los dos lavados. Luego, debe descartarsela solución agregándole previamente 5 ml de hipoclorito desodio al 5%.Revelador: listo para usar.Control Positivo: listo para usar.Control Negativo: listo para usar.



- Los sueros controles han sido examinados para HBsAg,encontrándose negativos.


- Si los pocillos de la policubeta no se utilizan en su totalidad,descartar el líquido de los pocillos utilizados en un recipien-te para desechos biológicos que contenga 5% de hipoclori-to sódico. Luego golpear la policubeta varias veces sobrepapel absorbente que se descartará como residuo biológicoy lavarla con una solución alcohólica al 50%. Secarla y cu-brir los pocillos empleados en el ensayo con cinta auto-adhesiva para evitar su reutilización.

- No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes.- No emplear reactivos de otro origen.- Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".- El Buffer de Lavado contiene azida sódica.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Buffer de Lavado: preparar en el momento de usar.Antígeno: los peines con antígeno inmovilizado se proveencerrados y con desecante. No abrir el envoltorio hasta el mo-mento de usar ni antes que hayan tomado temperatura am-

SIGNIFICACION CLINICALos virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) cau-santes del SIDA, son transmitidos principalmente por con-tacto sexual o a través de sangre o productos contaminadosderivados de la sangre.En individuos infectados con estos virus aparecen anticuer-pos, como respuesta del sistema inmunitario a la invasiónviral. Estos anticuerpos no son protectores y no confiereninmunidad, pero por ser marcadores tempranos de la infec-ción, su detección constituye la base del estudio de la pato-logía.El presente equipo ha sido desarrollado para detectar con-juntamente la presencia de los anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O y anti-HIV-2.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa muestra diluida se pone en contacto con el soporte sólidoen forma de peine en el cual se encuentran inmovilizadospéptidos sintéticos de transmembrana de HIV-1 y HIV-2. Si lamuestra contiene anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo Oo anti-HIV-2 se formará un inmunocomplejo que quedará uni-do al soporte. Luego de un lavado, se incuba el soporte conun conjugado de proteína A-oro coloidal (Revelador). La pro-teína A se une al fragmento Fc de los anticuerpos. La apari-ción de una mancha rojiza en el lugar donde se encuentrandepositados los péptidos sintéticos es indicativo de que seformó el inmunocomplejo y por lo tanto de la presencia en lamuestra de anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O o anti-HIV-2.

REACTIVOS PROVISTOSAntígeno: soporte sólido en forma de peine, conteniendo in-movilizados en cada “diente” péptidos sintéticos de antígenosde transmembrana de HIV-1 y HIV-2 (parte opaca del peine).Diluyente de Muestras: solución fisiológica con tensioacti-vo no iónico, pH 7,3.Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/len buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no iónico 0,1 g/l.Revelador: proteína A de Staphylococcus aureus conjugadacon oro coloidal.Control Positivo: dilución de suero inactivado, reactivo paraanticuerpos anti-HIV.Control Negativo: dilución de suero inactivado, no reactivo.

INSTRUCCIONES PARA SU USOAntígeno: listo para usar. Al cortar el sobre, tener la precau-ción de no cortar con la tijera los peines o el sobre con dese-cante.

* Elaborado bajo licencia de Concept Foundation

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micropipeta varias veces el contenido de cada pocillo a finde asegurar una correcta homogeneización. En la hilerade pocillos contigua a la utilizada para las muestras colo-car 3 gotas de Revelador por pocillo a utilizar. Preparar elBuffer de Lavado como se explicó en INSTRUCCIONESPARA SU USO. Colocar el Buffer de Lavado en el recipien-te destinado a tal fin, teniendo la precaución de no formarespuma. Este recipiente debe permitir que los dientes delpeine queden completamente sumergidos.

Realización de la prueba:Abrir cuidadosamente el envoltorio y extraer el número depeines necesarios para el ensayo. Conservar los restan-tes como se indicó en ESTABILIDAD E INSTRUCCIONESDE ALMACENAMIENTO. Colocar la identificación de cadamuestra directamente en la parte superior del diente co-rrespondiente.Importante: no tocar en ningún momento las zonas reacti-vas del peine ya que esto puede ocasionar resultados erró-neos.Colocar el peine en los pocillos de la policubeta que con-tienen las diluciones de muestras y controles e incubardurante exactamente 10 minutos a temperatura ambiente.Extraer el peine de los pocillos y escurrir las puntas de losdientes tocando sobre papel absorbente. No tocar el pa-pel con la zona reactiva de los dientes.Manteniendo el peine en posición vertical con los dienteshacia abajo y la zona reactiva de frente al operador sumer-gir el peine en el Buffer de Lavado. El lavado debe realizar-se repitiendo 10 veces un movimiento del peine constan-te, lento y suave de adelante hacia atrás, sin tocar con elmismo las paredes del recipiente. Escurrir nuevamentelas puntas de los dientes como se explicó anteriormente.Insertar el peine en los pocillos que contengan el Revela-dor e incubar a temperatura ambiente durante exactamen-te 10 minutos. Tener en cuenta que la reacción positiva seintensifica si se agita durante el revelado, por ejemplo enun agitador de Kline.Al finalizar la incubación repetir el lavado como se indicómás arriba, empleando el mismo Buffer de Lavado que seusara anteriormente.Colocar el peine sobre una superficie limpia con la zonareactiva hacia arriba y dejar secar completamente antesde observar los resultados. El color del “dot” se intensifica al secarse. Efectuar lalectura de los resultados bajo luz natural o fluorescente.No emplear lámpara incandescente.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINALEl color de la reacción es estable indefinidamente por lo queel soporte puede conservarse para referencias futuras de losresultados.

CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDALa corrida se considera válida si se cumplen simultáneamen-te las siguientes condiciones:

biente, para evitar la humectación del contenido. Los peinesno utilizados deben conservarse dentro del sobre con el de-secante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Los pei-nes conservados en estas condiciones pueden ser utilizadosdentro de los 2 meses posteriores mientras no se supere lafecha de vencimiento del equipo.

MUESTRASuero o plasmaa) Recolección: obtener la muestra de la manera usual.b) Aditivos: si se emplea plasma puede utilizarse cualquieranticoagulante de uso corriente en la práctica transfusional.c) Sustancias interferentes conocidas: la hemólisis puedeser causa de resultados erróneos.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lasmuestras no diluidas pueden conservarse durante no más de4 horas a temperatura ambiente y hasta 7 días refrigeradas(2-10oC). Para conservación por períodos más prolongadosdeben ser congeladas a -20oC o menos. Los congelamientosy descongelamientos reiterados pueden producir falsos posi-tivos y falsos negativos.Si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuer-do a las especificaciones legales relativas al envío de mate-riales infecciosos.

MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- policubetas- recipiente para lavado

2- No provisto- micropipeta de 100 ul- reloj alarma o cronómetro- material volumétrico adecuado

CONDICIONES DE REACCION- Tiempo total de reacción: 20 minutos- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (> 22oC). Si

la temperatura ambiente es menor a 22oC, realizar la reac-ción en estufa a 37oC.

- Volumen de muestra: 100 ul

PROCEDIMIENTOLlevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues-tras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el análisiscompletarlo sin interrupción. Procesar simultáneamente1 Control Positivo (en el “diente” del extremo derecho delpeine) y 1 Control Negativo (en el “diente” del extremo iz-quierdo del peine). Luego proceder de la siguiente forma:

Preparación del material:Colocar 2 gotas de Diluyente de Muestras en cada pocilloa utilizar de la policubeta. En cada uno de estos pocilloscolocar 100 ul de Muestra o Controles. Tener la precau-ción de colocar los mismos en el fondo de los pocillospara asegurarse de no producir salpicaduras que puedancontaminar pocillos vecinos. Mezclar aspirando con la

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a) No debe aparecer color detectable en el diente correspon-diente al Control Negativo.b) El Control Positivo debe ser nítidamente detectable.Si alguna de estas condiciones no se cumple, repetir la corri-da, empleando un nuevo equipo de reactivos.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.- El kit está diseñado para usar con muestras puras. No utili-

zar muestras diluidas debido a que las mismas pueden oca-sionar resultados falsos negativos.

- Debe recordarse que la presencia de anticuerpos anti-HIVen el suero NO es diagnóstico de SIDA. Los resultadosrepetidamente reactivos deben corroborarse por métodosde referencia como Western blot.

- Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposi-ción o infección por HIV.

- Pueden obtenerse resultados falsos positivos en las siguientessituaciones: enfermedades autoinmunes, tuberculosis, lupuseritematoso sistémico, embarazo, vacunación contra hepa-titis B y otras inmunizaciones, hemodiálisis, enfermedadhepática y otras enfermedades.

PERFORMANCE- En un estudio conducido por el Global Program on AIDS

(GPA) perteneciente a la World Health Organization (WHO)se evaluó un panel de 600 sueros humanos y 8 paneles deseroconversión. Los datos obtenidos se compararon conWestern blot como método de referencia, encontrándoseuna sensibilidad del 100%, una especificidad del 99,7% yuna reproducibilidad del 99,4%.

- En un estudio realizado sobre 425 muestras provenientesde pacientes del Instituto de Infectología Emílio Ribas deSan Pablo, se obtuvo una sensibilidad del 99,5%, una es-pecificidad del 96,4% y una eficiencia del 97,8%.

- En un estudio realizado sobre dos muestras de HIV-1 grupoO, B7-2705-0001 y JP8-2707-0001, de Boston BiomedicaInc., fueron detectadas las 2 muestras.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSUna vez finalizada la prueba y cuando el peine se haya seca-do completamente, observar los resultados sobre una super-ficie blanca, a ojo descubierto y con buena iluminación.

Muestra Reactiva: aparición de una mancha coloreada (rosatenue a rojo) en la zona reactiva del peine. Siempre que estecírculo esté presente, aún cuando el color sea de menor in-tensidad que el Control Positivo, indica muestra reactiva.

Muestra No Reactiva: no se observa coloración en la zonareactiva del peine.Toda prueba inicialmente reactiva debe ser ensayada nueva-mente por duplicado. Si uno o ambos de los duplicados sonReactivos, se presume que la muestra contiene anticuerposanti-HIV-1 o anti-HIV-2.Si ambos duplicados resultan No Reactivos se considera elprimer resultado como falsamente positivo, presumiéndoseque la muestra no contiene anti-HIV-1 ni anti-HIV-2.Toda muestra Reactiva debe ensayarse nuevamente emplean-do un método de referencia y realizar la discriminación paraHIV-1/HIV-2.

Esquema de interpretación

Muestra inicial

zona reactiva incolora zona reactiva coloreadaMuestra No Reactiva Muestra Reactiva

Repetir por duplicado

Ambos duplicados Uno o ambos duplicadosNo Reactivos Reactivos

Muestra No Reactiva Confirmar por Western bloty discriminar HIV-1/HIV-2


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Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Cert. Nº: 5181/04

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Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección deanticuerpos contra el virus de la hepatitis C

SIGNIFICACION CLINICAEl virus de la hepatitis C es el causante del 90% de las hepa-titis no-A no-B que se transmiten por vía parenteral, siendolos principales grupos de riesgo los hemofílicos, hemodializa-dos, homosexuales y drogadictos. La principal característicade la enfermedad causada por este virus es que alrededor del50% de los pacientes infectados desarrollan hepatitis cróni-ca.El diagnóstico de la infección se realiza en base a la determi-nación de los anticuerpos anti-HCV. Resulta importante su de-tección no sólo para el diagnóstico de la infección, sino para elcontrol de unidades de donantes en bancos de sangre y paradistinguir de otras hepatitis crónicas de etiología desconocida.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa muestra se diluye en el soporte en el que se encuentrainmovilizada una mezcla de antígenos sintéticos y recombi-nantes conteniendo secuencias de zonas antigénicas de lasproteínas estructurales (core) y no estructurales (NS3, NS4 yNS5) del HCV*. Si las muestras de suero contienen los anti-cuerpos específicos, éstos formarán un complejo con los an-tígenos y permanecerán unidos al soporte. La fracción no unidase elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos anti-inmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa. Si seprodujo la reacción en la primera etapa del proceso, se uniráel conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustratoenzimático y el cromógeno. En los casos en que se hayaunido el conjugado habrá aparición de color celeste. La reac-ción se detiene con ácido sulfúrico, virando el color al amarillo.

REACTIVOS PROVISTOSPolicubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles conpocillos conteniendo antígenos sintéticos y recombinantesde hepatitis C, inmovilizados.Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conju-gadas con peroxidasa.Revelador A: peróxido de hidrógeno 60 mmol/l en buffer ci-trato 50 mmol/l pH 3,2.Revelador B: tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/l en ácidoclorhídrico 0,1 N.Stopper: ácido sulfúrico 2 N.Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/len buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no iónico 0,1 g/l.Diluyente de Muestras: albúmina bovina en solución fisioló-gica tamponada con buffer fosfatos pH 7,2.Control Positivo: dilución de suero inactivado conteniendoanticuerpos contra HCV.Control Negativo: dilución de suero no reactivo inactivado.

INSTRUCCIONES PARA SU USOBuffer de Lavado: para usar diluir 1+4 con agua destilada(una parte de Buffer de Lavado concentrado más cuatro par-tes de agua destilada). A baja temperatura los componentesdel reactivo pueden precipitar. En tal caso, colocar en bañode agua a 37oC unos minutos mezclando luego por inversión.Diluyente de Muestras: listo para usar. El color del Diluyen-te de Muestras puede variar de lote a lote sin que se afecte lacapacidad reaccional del mismo.Policubeta sensibilizada, Conjugado, Revelador A y B,Stopper y Controles Positivo y Negativo: listos para usar.



- Los sueros controles han sido examinados para HBsAg yHIV encontrándose no reactivos.

- La policubeta se encuentra recubierta con antígenos sintéti-cos y recombinantes de HCV. La posibilidad de contamina-ción con la misma puede descartarse con absoluta certeza.



de agua. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso.- Evitar que vapores de hipoclorito provenientes de los reci-

pientes para desechos biológicos u otras fuentes entren encontacto con la policubeta, ya que el hipoclorito afecta lareacción.


ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.Buffer de Lavado: estable 3 meses a temperatura ambiente.Policubeta sensibilizada: las tiras de pocillos con antíge-nos inmovilizados se proveen cerradas al vacío y con dese-cante. No abrir el envoltorio hasta el momento de usar, ni

ELISA

Hepatitis C (anti-HCV)

*Pat. pend.

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antes que haya tomado temperatura ambiente de lo contrariose favorecerá la humectación del contenido. Las tiras de po-cillos no utilizadas deben conservarse dentro del sobre con eldesecante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Lastiras conservadas en estas condiciones pueden ser utiliza-das dentro de los 3 meses posteriores mientras no se superela fecha de vencimiento del equipo.

MUESTRASuero o plasmaa) Recolección: obtener la muestra de la manera usual. Nodeben usarse muestras inactivadas por calor. Ver LIMITACIO-NES DEL PROCEDIMIENTO.b) Aditivos: si se emplea plasma puede utilizarse cualquieranticoagulante de uso corriente en la práctica transfusional.c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis, hiperlipe-mia y otras causas de turbiedad pueden provocar resultadoserróneos. Estas muestras se deben clarificar centrifugándolas.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: lasmuestras no diluidas pueden conservarse durante 7 días a 2-10oC. Para conservación por períodos más prolongados de-ben ser congeladas a -20oC o menos. Evitar los congelamien-tos y descongelamientos reiterados. Existen evidencias quemuestran que los congelamientos sucesivos pueden ser cau-sa de resultados erróneos. Si las muestras deben ser trans-portadas, embalar de acuerdo a las especificaciones legalesrelativas al envío de materiales infecciosos.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados.- Reloj alarma o cronómetro.- Estufa a 37oC.- Espectrofotómetro para lectura de policubetas (opcional).

CONDICIONES DE REACCION- Longitud de onda primaria: 450 nm- Longitud de onda secundaria (bicromática): 620-650 nm- Calibración del instrumental: llevar a cero el espectrofotó-

metro con blanco de reactivos, procesándolo de la mismaforma que una determinación, pero omitiendo colocar Muestra.

- Tiempo de reacción: 90 minutos- Temperatura de reacción: 37oC y temperatura ambiente- Volumen de muestra: 10 ul

PROCEDIMIENTOLlevar a temperatura ambiente los reactivos y las mues-tras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el análisisdebe completarse sin interrupción.Procesar simultáneamente 2 Controles Positivos (CP), 3Negativos (CN) y los Desconocidos (D). Al depositar lamuestra y/o Controles sobre el Diluyente de Muestras,debe asegurarse de colocar los mismos en el seno dellíquido y no sobre las paredes o el fondo del pocillo. En-juagar la pipeta con el Diluyente dispensado en el pocillopara asegurar una correcta homogeneización. En los po-cillos a utilizar de la policubeta colocar:

D CP CN




Muestra 10 ul - -

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos una vez cargadas lasmuestras correspondientes a cada tira.En el procedimiento manual, para evitar la evaporación,cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar en laestufa 30 minutos a 37oC. Luego aspirar cuidadosamenteel líquido de cada pocillo recibiéndolo en un recipiente paradesechos biológicos que contenga 5% de hipoclorito sódico.A continuación, lavar 5 veces con Buffer de Lavado em-pleando aproximadamente 300 ul/vez/pocillo.Después de cada lavado el líquido se descartará tambiénen el recipiente con hipoclorito. Opcionalmente emplearlavador automático. Al finalizar el último lavado, eliminarpor completo el líquido residual, invirtiendo la policubeta ygolpeándola varias veces sobre papel absorbente, ejerciendouna leve presión con la mano sobre los laterales mayoresdel soporte, para evitar la caída de las tiras de pocillos.Luego agregar en cada pocillo:


En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. En el procedimiento ma-nual, para evitar la evaporación, cubrir la placa con unacinta autoadhesiva e incubar durante 30 minutos en estufaa 37oC. Luego aspirar el líquido de los pocillos, recibiéndo-lo en el recipiente con hipoclorito y lavar según se indicómás arriba.Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líqui-do residual, invirtiendo la policubeta y golpeándola variasveces sobre papel absorbente, ejerciendo una leve presióncon la mano sobre los laterales mayores del soporte, paraevitar la caída de las tiras de pocillos. Luego agregar encada pocillo, respetando el orden:



En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar, aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Incubar 30 minutos a tem-peratura ambiente y luego agregar:


En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul.Mezclar, aplicando suaves golpes en los laterales de lapolicubeta durante 10 segundos. Leer en espectrofotóme-tro a 450 nm o bicromática a 450/620-650 nm o evaluar elresultado a simple vista por comparación con los Contro-les Positivos y Negativos.

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CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDALa corrida se considera válida si se cumplen simultáneamen-te las siguientes condiciones:a) Las lecturas de al menos dos de los tres Controles Nega-tivos, corregidas contra el Blanco de reactivos, deben ser me-nores o iguales a 0,150 D.O.b) La lectura media de los Controles Positivos corregida debeser mayor o igual a 0,600 D.O.Si una o ambas condiciones no se cumple, repetir la corrida.Recordar que las lecturas obtenidas dependerán de la sensi-bilidad del aparato empleado.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSa) Con instrumental ópticoLa presencia o ausencia de anticuerpos anti-HCV se determi-na relacionando la absorbancia de la muestra respecto al va-lor Cut-off.

Cut-off = CN + 0,150 D.O.

donde CN: promedio de las lecturas del Control Negativo.

Zona de indeterminación: Cut-off ± 10%

Muestras reactivas: se consideran aquellas con absorbanciassuperiores al límite superior de la zona de indeterminación.Muestras no reactivas: se consideran aquellas con absorban-cias inferiores al límite inferior de la zona de indeterminación.Muestras indeterminadas: se consideran aquellas con ab-sorbancias que caen dentro de la zona de indeterminación.Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.

Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por du-plicado. Si una o ambas repeticiones dan reactivas, la mismadebe considerarse reactiva.Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva enlas dos repeticiones. Esto puede deberse a:- Contaminación cruzada de un pocillo no reactivo por una

muestra reactiva.- Contaminación de la muestra durante la dispensación, im-

precisión en el dispensado de muestra, conjugado y/o Re-velador en el pocillo.

- Reutilización de tips.- Contaminación del pocillo con hipoclorito u otros agentes

oxidantes.En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentaruna reacción falsamente reactiva, tanto en el análisis inicialcomo en sus repeticiones. Algunas causas de este fenómenopueden ser:- Contaminación de la muestra durante la extracción, proce-

samiento o conservación.- Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanti-

cuerpos, fármacos, etc.- Dispensación y/o aspirado ineficiente de la solución de lava-

do (sistema obstruido)

b) Interpretación visualSi se opta por este tipo de interpretación debe considerarse

no reactiva toda muestra que no presente una coloración mayorque la de los Controles Negativos. Por el contrario, una muestranetamente amarilla se considera reactiva. Colores tenuesmayores que el del Control Negativo, requieren la interpreta-ción instrumental.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.- Constituyen causas de resultados erróneos:

Lavado incorrecto de los pocillos de reacción.Contaminación cruzada de muestras no reactivas con anti-cuerpos procedentes de una muestra reactiva.Contaminación de la solución cromogénica con agentes oxi-dantes (cloro, etc.).Contaminación del Stopper.Conservación inadecuada de las tiras de pocillos no utilizadas.Contaminación del Buffer de Lavado diluido. Se recomiendaverificar la limpieza de los recipientes donde se prepara yalmacena. Si se observa aparición de turbidez o precipitadoal prepararlo, debe desecharse.

- No utilizar baño de agua para la incubación.- Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposi-

ción o infección por HCV. La presencia de anticuerpos con-tra el virus C indica infección reciente o pasada por estevirus, pero no permite diferenciar entre una infección aguda,crónica o resuelta. Debido al tiempo prolongado que trans-curre entre la infección y la seroconversión, los niveles deanti-HCV pueden ser indetectables en las fases tempranasde la infección.

- Las muestras repetidamente reactivas deberán analizarsepor técnicas suplementarias o confirmatorias, como Inmu-noblot o PCR, respectivamente.



- Verifique que el sistema lavador que Ud. está usando(WIENER WASHER u otro), aspire totalmente el contenidode los pocillos, y que la altura de la solución lavadora dis-pensada sea pareja.

PERFORMANCEa) Sensibilidad: en un estudio realizado sobre diferentes pa-neles comerciales, se obtuvieron los siguientes resultados:- Anti-HCV Mixed Titer Performance Panel (PHV 205), Boston

Biomedica, Inc.: se detectaron 23 de 23 muestras positivas.- Anti-HCV Low Titer Performance Panel (PHV 103), Boston

Biomedica, Inc.: se detectaron 12 de 14 muestras positivas.- Worldwide HCV Performance Panel (WWHV 301), Boston

Biomedica, Inc.: se detectaron 17 de 18 muestras positivas.- Panel 2 HCV, Q Panel Assessoria & Controle de Qualidade:

se detectaron 7 de 7 muestras positivas.En otro estudio realizado sobre 62 muestras seropositivassegún otros métodos ELISA tomados como referencia, sedetectaron 61 muestras.b) Especificidad: en un estudio realizado sobre 386 muestras

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Elaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Autorizado A.N.M.A.T.Cert. Nº: 193/93

de sueros y plasmas provenientes de bancos de sangre y con-sultorios externos, la especificidad fue estimada en 99,5%.En una población de 108 individuos hospitalizados y ambula-torios, se encontró una especificidad de 98,1%.


BIBLIOGRAFIA- Merrifield, B. - Science 232:341 (1986).- Engvall, E. - Methods in Enzymology 70:419 (1980).- Oubiña, J. - Rev. Arg. de Transf. XVII/1:35 (1991).- Tam, A.W. et. al. - Virology 185:120-131 (1991).- Rodriguez, R.et.al. - Proceedings V Forum on AIDS, Hepati-

tis and other blood-borne diseases - Atlanta (1992) pág.89.- Lorenzo ,L.E.; Rojkín, L.F.; Riezu, R.; García-Granero, M.; Borrás

F.; Berasain, C.; Prieto, J. - Clin Chem. 39/6:1252 (1993).- Berasain, C.; García-Granero, M.; Riezu-Boj, J.; Civeira, M.;

Prieto, J.; Borrás-Cuesta, F. - J. Hepatol. 18:80-84 (1993)- Rojkín, L.F. - Libro de resúmenes del VII Congreso Argentino

de Farmacia y Bioquímica, Buenos Aires, pág. 28, 1996.- Lorenzo, L.E.; Rojkín, L.F.; Carlomagno, A.E.; Gariglio, R.C.

- Clin. Chem. 41/56:S90, 1995.- Rojkín, L.F.; Felcaro, M.V.; Lorenzo, L.E.; Rey, J.; Tomeo,

J.A. - Libro de resúmenes XII Congreso Latinoamericano deBioquímica Clínica - Setiembre 1995, Buenos Aires - Argen-tina, pág.108, Abs, 175.

UR080710

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Prueba de hemaglutinación indirecta (HAI) para la de-tección de anticuerpos contra el Toxoplasma gondii

SIGNIFICACION CLINICALa toxoplasmosis es una enfermedad infecciosa generalmen-te benigna y asintomática del hombre y de los animales, cuyoagente etiológico es el Toxoplasma gondii, parásito intracelu-lar obligado de distribución mundial.Cuando la infección por T. gondii se adquiere durante la ges-tación, existe un alto riesgo de infección en el feto, pudiendoprovocar abortos o lesiones graves que son más severas cuantomás precoz sea la contaminación materna.Las determinaciones serológicas son las más convenientesy certeras para el diagnóstico de la toxoplasmosis y debeestablecerse: a) la seroconversión de negativo a positivo, b)un aumento en el título de anticuerpos y c) la presencia deIgM específica que indicaría infección activa.

FUNDAMENTOS DEL METODOToxotest HAI se basa en la propiedad que tienen los anti-cuerpos anti-T. gondii de producir aglutinación en presenciade glóbulos rojos sensibilizados con antígenos citoplasmáti-cos y de membrana del parásito. El empleo de ambos tiposde antígenos incrementa la sensibilidad del método permi-tiendo la detección precoz de la infección. Tanto la presenciade anticuerpos heterófilos como la aparición de IgM, caracte-rísticas del período agudo de la parasitosis, se investigan em-pleando tratamiento con 2-mercaptoetanol (2-ME) y eritroci-tos no sensibilizados para control y absorción de heterofilia.Los anticuerpos heterófilos se absorben con eritrocitos nosensibilizados. En los sueros de pacientes con infección agu-da tratados con 2-ME, se observa una caída del título en porlo menos dos diluciones comparados con los mismos suerossin tratar con 2-ME.

REACTIVOS PROVISTOSReconstituyente HAI: solución fisiológica tamponada a pH 7.Antígeno HAI: liofilizado de glóbulos rojos de carnero sensi-bilizados con antígenos citoplasmáticos y de superficie de T.gondii.GR no sensibilizados: suspensión al 1% de eritrocitos decarnero no sensibilizados, para control y absorción de hete-rofilia.Buffer HAI: solución fisiológica tamponada con fosfatos a pH7,5, con colorante inerte.Solución Proteica: solución de albúmina bovina.2-Mercaptoetanol: ampolla conteniendo 2-mercaptoetanol (2-ME).Control Positivo: suero inactivado conteniendo anticuerposcontra el Toxoplasma gondii.Control Negativo: suero no reactivo, inactivado.


INSTRUCCIONES PARA SU USOAntígeno HAI: preparar con 5,2 ml de Reconstituyente HAI. Es-perar una hora antes de usar agitando enérgicamente cada 20minutos para permitir una correcta rehidratación del reactivo.Cada vez que se emplea homogeneizar mediante agitación.GR no sensibilizados: homogeneizar mediante agitación an-tes de usar, evitando la formación de espuma.Diluyente de Sueros HAI: agregar 0,2 ml de Solución Pro-teica cada 10 ml de Buffer HAI. Mezclar, rotular y fechar.2-Mercaptoetanol: una vez abierta la ampolla, trasvasar elcontenido al frasco vacío provisto, el que se deberá tapar in-mediatamente después de usar.2-Mercaptoetanol al 1%: con el 2-ME provisto, preparar unadilución 1/100 con solución fisiológica en cantidad suficientede acuerdo al número de pocillos que se utilicen. Ejemplo:para 96 pocillos: 25 ul de 2-ME en 2,5 ml de solución fisioló-gica.Controles Positivo y Negativo: listos para usar.



- Los sueros controles han sido examinados para antígeno desuperficie de hepatitis B (HBsAg) y virus de inmunodeficien-cia humana (HIV) encontrándose no reactivos.


- No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes.- No emplear reactivos de otro origen.- Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC)hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.Diluyente de Sueros HAI: es estable en refrigerador (2-10oC)5 días a partir de la fecha de su preparación.GR no sensibilizados: mantener en posición vertical.2-Mercaptoetanol al 1%: usar inmediatamente después depreparado.

ToxotestHAI

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Antígeno HAI: una vez reconstituido es estable durante 4meses conservado en refrigerador (2-10oC). No congelar. Man-tener en posición vertical.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOSREACTIVOSCuando el Control Negativo y todas las diluciones de suerosson reactivas, puede ser indicio de autoaglutinación del Antí-geno HAI. Verificar destinando un pocillo de la policubeta paramezclar Antígeno HAI y Diluyente de Sueros HAI, sin la mues-tra. Si aún en este caso se observa aglutinación, el reactivoestará deteriorado. Desechar.La ausencia de reactividad en todas las diluciones de suerosy Control Positivo, puede ser indicio de deterioro de los reac-tivos. Procesar una muestra con positividad conocida.

MUESTRASueroa) Recolección: el paciente debe estar preferentemente enayunas. Obtener suero de la manera usual. No usar plasma.b) Aditivos: no se requieren. No agregar conservadores.c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis o hiperlipe-mia (con quilomicronemia) son causa de resultados erróneos.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el sue-ro debe ser preferentemente fresco. En caso de no procesar-se en el momento, puede conservarse en refrigerador (2-10oC)durante no más de 72-96 horas contadas a partir del momen-to de la extracción. Para períodos más prolongados de con-servación, congelar (a -20oC) evitando reiterar descongelamien-tos y congelamientos.Los sueros envejecidos tienden a gelificarse al contacto conel 2-ME, provocando resultados falsos positivos.

MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- 1 frasco vacío (para trasvasar el 2-ME de la ampolla)- 5 policubetas con 96 pocillos de fondo en U (8 hileras y 12

columnas)- espátulas-gotero plásticas descartables

2- No provisto- microdilutores (25 ul)- microgoteros (25 ul)- tubos de ensayo y material volumétrico adecuado- cinta adhesiva

PROCEDIMIENTOSeleccionar una policubeta con pocillos sin usar de fondoen U. Pasar un trapo húmedo por la base de la policubetaantes de usar, colocarla en forma apaisada sobre el trapoy realizar el ensayo manteniéndola en esta posición. VerLIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO.

I- TITULACION SIN 2-ME1) Con microgotero de 25 ul, colocar una gota de Dilu-yente de Sueros HAI en todos los pocillos a usar de lapolicubeta.2) Tomar una alícuota de cada suero o controles a en-

sayar con microdilutores de 25 ul (uno para cada mues-tra) y colocar en los pocillos de la columna 1. Se utiliza-rán tantas hileras horizontales como sueros o controlesdeban procesarse.3) Realizar diluciones a partir de la columna 1 (dilución1/2), pasando los microdilutores a la columna 2 (dilu-ción 1/4) y así sucesivamente hasta la columna 6 (dilu-ción 1/64).Si se procesaran más de 8 sueros, se utilizarán lascolumnas 7 a 12, realizando las diluciones de la mane-ra antes descripta.4) Colocar en las columnas 1 y 2 (diluciones 1/2 y 1/4)una gota (25 ul) de GR no sensibilizados, para controlde heterofilia. Hacer lo mismo en las columnas 7 y 8 encaso de ser empleadas.5) En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul)de Antígeno HAI.6) Agitar la policubeta golpeando con los dedos en lasparedes laterales, durante 30 segundos por lo menos.7) Dejar en reposo, al resguardo de vibraciones, durante90 minutos.8) A partir de los 90 minutos, leer.Se puede aumentar la nitidez de la imagen, leyendosobre un espejo, iluminando la placa desde arriba e in-terponiendo un papel blanco y traslúcido entre la policu-beta y la fuente de luz.

II- TITULACION CON 2-ME1) Colocar una gota de suero o controles en cada unode los pocillos de la columna 1 (y 7 si es necesario),empleando espátulas-gotero descartables (una por cadasuero) en posición vertical.2) Agregar una gota de 2-Mercaptoetanol al 1% a los mis-mos pocillos, utilizando una espátula-gotero descartable.3) Sellar los pocillos con cinta adhesiva y agitar la policu-beta golpeando con los dedos en las paredes laterales.4) Incubar 30-60 minutos a 37oC o 90 minutos a tempe-ratura ambiente.5) Retirar la cinta adhesiva, pasar un trapo húmedo porla base de la policubeta y, con microgotero de 25 ul,colocar una gota de Diluyente de Suero HAI en los poci-llos restantes de las hileras utilizadas.6) Realizar los pasos 3 al 8 descriptos en la Titulación I.

III- TECNICAS ALTERNATIVASCuando se estudian sueros altamente reactivos o encaso de poblaciones con una elevada prevalencia detoxoplasmosis donde habitualmente se encuentran títu-los superiores a 1/32 pueden emplearse algunas de lassiguientes técnicas alternativas:

Técnica alternativa 1:Continuar con las diluciones hasta la columna 12 inclu-sive con lo que se obtiene una dilución final de 1/4.096.

Técnica alternativa 2:Colocar en un tubo “ad-hoc” 50 ul de suero y 350 ul deDiluyente de Sueros HAI (dilución 1/8). Tomar 25 ul deesta dilución y colocarla en la columna 1 de la policube-ta. Proseguir según se describe en I, hasta la columna6. De esta forma se obtiene una dilución final de 1/512.

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(1) (2)

IMAGEN NEGATIVA

IMAGEN POSITIVA

IV- ABSORCION SOBRE GLOBULOS ROJOS NOSENSIBILIZADOSEn sueros que presenten heterofilia los anticuerpos he-terófilos pueden absorberse sobre GR no sensibilizadosde la siguiente forma: en un tubo de hemólisis con tapóncolocar 50 ul de GR no sensibilizados provistos + 50 ulde suero en ensayo. Dejar la suspensión durante 30 mi-nutos a 37oC agitando de tanto en tanto. Luego centrifu-gar a 2.000 r.p.m. durante 5 minutos. Del sobrenadantese toman 50 ul y se emplea como dilución 1/2, colocán-dola en la primera columna. Si se emplea en titulacióncon 2-ME esta columna corresponde a dilución 1/4.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSTitulación sin 2-METítulos ≥ 16 significan mayor probabilidad de infección toxo-plásmica. A fin de determinar una primoinfección reciente de-ben procesarse 2 muestras tomadas con un intervalo de 2-3semanas. Un aumento de título mayor de 2 diluciones entrela 1ra y 2da muestra indican infección recientemente adquirida.

Titulación con 2-MELa aparición de títulos bajos en la titulación sin 2-ME y reacti-vidad con glóbulos rojos no sensibilizados que desaparece alefectuar la titulación con 2-ME y/o absorción con GR no sen-sibilizados, serían indicativos de la existencia de heterofilia.Por el contrario, títulos elevados sin el empleo de 2-ME quedisminuyen considerablemente al utilizar 2-ME indicarían la pre-sencia de IgM, característica de infección aguda. Los contro-les de heterofilia en este caso deben dar reacción negativa enel suero sin tratar o tras absorción con GR no sensibilizados.

(1) Manto.(2) Punto final (50%).

No Reactivo: presencia de un sedimento en forma de botóno pequeño anillo de bordes regulares.Reactivo: formación de una película o manto que cubre el50% o más del fondo de los pocillos.

VALORES DE REFERENCIADentro de las técnicas inmunológicas, la HAI es consideradaun método confiable para la determinación de anticuerpos es-pecíficos. No obstante, sus resultados, al igual que los decualquier método serológico, sólo constituyen un dato auxi-liar para el diagnóstico.


Es por esta razón que los informes deben ser consideradosen términos de probabilidad. En este caso, mayor o menorprobabilidad de parasitosis por T. gondii.Se consideran presumiblemente parasitados aquellos indivi-duos cuyos sueros son reactivos en diluciones mayores oiguales a 1/16.Se debe tener en cuenta que la concentración de anticuerposen suero varía en distintas poblaciones, razón por la cual esposible encontrar sueros reactivos correspondientes a indivi-duos no parasitados. Por esta razón es necesario determinarlos valores de referencia de la población en estudio.

LIMITACIONES DE PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Otras causas de resultados erróneos son:- Falta de acondicionamiento previo de la policubeta. Para

eliminar la carga electrostática es necesario pasar un trapohúmedo por la base (ver PROCEDIMIENTO).

- Falta de homogeneización de los reactivos antes de su uso.- Deficiencias de mezclado.- Vibraciones accidentales durante el reposo necesario para

el desarrollo de la reacción.- Sueros envejecidos o congelados y descongelados repeti-

damente.- Contaminaciones accidentales de los reactivos o del mate-

rial empleado en el ensayo.- Policubetas rayadas por uso reiterado. No se aconseja re-

utilizar pocillos.- Diluyente de Sueros HAI conservado más de 5 días.- Exceso o defecto de Diluyente de Sueros HAI en los poci-

llos de la policubetas.- No respetar los tiempos y temperaturas de incubación en el

tratamiento con 2-ME al 1%.- 2-Mercaptoetanol al 1% no preparado en el momento. Debe

tenerse en cuenta que en este tipo de infecciones las titula-ciones aisladas proveen escasa información por lo que seprefiere efectuar determinaciones seriadas cada 15-20 díasque permitan observar las variaciones en los títulos. Paraeste procedimiento es conveniente conservar congeladasalícuotas de las muestras de distintos días y procesarlassimultáneamente con los mismos reactivos y el mismo ope-rador.

Recordar que cada componente de Toxotest HAI forma unequipo completo que debe considerarse como unidad. Poreste motivo no deben intercambiarse los componentes de dis-tintos equipos.


BIBLIOGRAFIA- Gomez Lus, R. y Benito Ruesca, R. - Medicine 33-2a serie -

pág. 1.459 (1984).- Jacobs, L.; Linde, M.N. - J. Parasitol. 43:308, (1957).


Tecnicas inmunoserologicas (2)

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