TEMA 1.- INTRODUCCIÓN A LA BIOCATÁLISIS APLICADA Y A LAS BIOTRANSFORMACIONES. LA BIOCATÁLISIS DENTRO DEL MARCO DE LA BIOTECNOLOGÍA. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA BIOCATÁLISIS. DISEÑO DEL BIOCATALIZADOR.GENERALIDADES.

BIOTRANSFORMACIONES:

BIOCATÁLISIS APLICADA

ORÍGENES: DESDE LA NOCHE DE LOS TIEMPOS.

Empleo de un Biocatalizador (enzimas o células, libres o inmovilizadas) para logra una Biotransformación bajo condiciones adecuadas, con el objetivo de btener un producto de una utilidad aplicada concreta.

• HOMERO describe la producción de queso agitando la leche con un palo proveniente de una higuera (se libera una proteasa, ficina, que coagula la leche).

• La leche se almacenaba en bolsas hechas con estómagos de terneras recién sacrificadas, y se convertía en una sustancia semisólida, cuya compresión originaba un material más seco y más conveniente de almacenar = queso.

Procesos en los que se emplean Biocatalizadores para la transformación de sustratos no naturales para dicho Biocatalizador

ESTO NO ES PROPIAMENTE CIENCIA; ES ARTE.

PRIMEROS PASOS INDUSTRIALES:

• En 1875, en Copenhague, Christian Hansen crea una compañía que fue la primera en usar industrialmente para la preparación del queso una preparación enzimática estandarizada llamada RENNET, que es una mezcla de quimosina (o renina) y pepsina, obtenida (hoy día también) con una extracción con sal de la cuarta cavidad estomacal de terneras lactantes.

• En 1913, Otto Röhm (fundador de Röhm and Haas) patentó un detergente con tripsina.

• En los años 30 se empezaron a usar pectinasas en las industrias de zumos.

• Primer proceso realmente industrial, en 1955 con la comercialización de glucoamilasa.

¿CUAL ES EL VERDADERO PUNTO DE PARTIDA DE LAS BIOTRANSFORMACIONES?

Tradicionalmente se asocia el comienzo de las Biotransformaciones con los trabajos de A. Zaks y A. Klibanov a mediados de los años 80, donde se demostraba que ciertas enzimas (lipasas) podían trabajar de manera eficiente en disolventes orgánicos inmiscibles con el agua.

Zaks, A. and Klibanov, A. M. (1984) Science 224, 1249–1251.Zaks, A. and Klibanov, A. M. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3192–3196

¡No obstante, estos hechos ya se conocían con anterioridad!

En efecto, ya en los años 30 un bioquímico polaco (Ernest Aleksander Sym) describióprocesos de síntesis orgánica catalizada por lipasas en medios orgánicos.

Sym, E.A. (1933) Über die esterasewirkung III. Biochem. Z. 258, 304–324Sym, E.A. (1933) Über die esterasewirkung IV. Biochem. Z. 262, 406–425Sym, E.A. (1936) Eine methode der enzymatischen estersynthesen. Enzymologia 1, 156–160

¿POR QUÉ ESTE HECHO FUE DECISIVO?Porque eliminó las reticencias que el uso de biocatalizadores suponía para los Químicos Orgánicos.EXCUSAS MÁS HABITUALES PARA NO USAR BIOCATALIZADORES

1.- Las enzimas son muy caras.

•A primera vista, parece irrefutable.•Los precios oscilan entre $100,000/kg para una enzima de diagnóstico (láctico deshidrogenasa) hasta $100/kg para las preparaciones crudas de amilasasa.•Para las enzimas más útiles en Biotransformaciones, los precios oscilan entre $500 hasta $20,000/kg, dependiendo de la pureza.

•No obstante, no debe considerarse tanto el precio en sí cuanto su contribución al precio final del producto.•Ejemplos:

• Transaminasa ($20-30/kg) para la producción de p-fluoro-L-fenilamina ($500/kg).• El costo final de la penicilinacilasa en la producción de Penicilina G es de aproximadamente $1/kg.• El costo final de la aspartasa en la producción de ácido L-aspártico es menor de aproximadamente $0.1/kg.

•Finalmente, si comparamos con los precios de los catalizadores químicos, veremos que no existe mucha diferencia!

•SI SE INMOVILIZAN, PUEDEN REUTILIZARSE, CON LO QUE EL COSTO GLOBAL VA A VERSE DISMINUIDO

2 .- Las enzimas son muy sensibles y fáciles de desactivar.

•En efecto, muchas enzimas se desnaturalizan en condiciones de alta temperatura o valores extremos de pH. Inclusive las disoluciones enzimáticas con el tiempo pierden actividad a temperatura ambiente.•¿Y eso implica inestabilidad?.

•Lo verdaderamente importante por considerar es la ESTABILIDAD OPERACIONAL en las condiciones de trabajo.•Existen muchos ejemplos industriales donde las enzimas exhiben excelentes condiciones de estabilidad, especialmente si están inmovilizadas.

•También se pueden usar enzimas de organismos termófilos.

•Se pueden introducir modificaciones en la enzima para aumentar su estabilidad (DIRECTED EVOLUTION).

3.-Las enzimas son activas solamente sobre sus sustratos naturales

•Algunas (las más especializadas) pero otras muchas no.•Las hidrolasas, proteasas, esterasas y especialmente lipasas, son capaces de aceptar sustratos muy distintos de los suyos naturales.

•Proceso one pot de LONZA en un biorreactor de 15m3

•Amidasa de Comomonas acidovorans expresada en E. Coli.•El enantiómero no reconocido del ácido se recicla.•El producto es un inhibidor de la beta-galactosidasa.

•Proceso de SEARLE, USA•La enzima se emplea inmovilizada.•El producto se usa para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

4.-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muy bajas de sustrato, por lo que la productividad del proceso biocatalizado es baja.

•Veamos algunos casos donde no es cierto.

•Proceso de Glaxo Wellcome•La enzima es una proteasa alacalina, alcalasa.•El medio de reacción es THF/agua.•Resultados:50 % de conversion, ee > 99% •La concentración de sustrato es 100 g/l

ABACAVIR, anti HIVZiagen TM

100 g/l

•Proceso de Chirotech•Planta piloto en Shasun Chemicals, India•La concentración de sustrato es 150 g/l

150 g/l

5.-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas.

6.-Las enzimas solamente funcionan en medios acuosos, donde los sustratos mas interesantes para un químico orgánico son insolubles.

Ya veremos más adelante que esto no es cierto para algunas enzimas

¿CUÁLES SON LAS VENTAJAS DE LA BIOCATÁLISIS?

1.- Las enzimas son catalizadores muy eficientes:•aceleración de velocidad del orden de 8 a 12 factores de magnitud•se usan a concentraciones del 0.001 al 0.0001%, frente a los catalizadores

químicos (0.1-1%).

•Si consideramos las condiciones de su uso (T, presión) su eficacia es aun mayor

•Se puede usar la enzima inmovilizada, o bien las célula enteras también inmovilizadas. Es uno de los procesos biocatalizados de mayor productividad.

1 kg

10.000 a100.000 kg

3$/kg

2.- Las enzimas no producen contaminación medioambiental

•Las enzimas son proteínas y, por tanto, biodegradables.

•Si se usan soportes inertes (sílice, barro de diatomeas), el derivado inmovilizado sigue

siendo inocuo para el medio ambiente.

•Además, las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo energético , y por

tanto poco costo y emisión de gases poco contaminantes, por lo que no se incrementa el

efecto invernadero.

3.- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH, temperatura y presión

•Este es una de las ventajas más importantes.•Generalmente las enzimas funcionan a T ambiente, presión atmosférica y pH neutro o cercano a la neutralidad.•Por ello se minimiza la generación de subproductos por reacciones colaterales, lo que conlleva un aumento de la conversión y facilita los procesos de recuperación de productos (down stream)•Uno de los ejemplos mas claros: producción de acrilamida por Nitto Chemical, Japón.

•La escala de producción es aproximadamente 20.000 toneladas métricas al año.•El proceso químico opera a temperaturas de 80-140ºC y siempre se produce ácido acrílico como subproducto. Además usa un catalizador de Cu que genera subproductos tóxicos (HCN entre ellos)•El proceso enzimático opera a 10ºC para generar un 100% de acrilamida

4.- Las enzimas no están limitadas a su papel natural-alta tolerancia por distintos sustratos-pueden trabajar en medios orgánicos

5.- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reacciones

¡POR TANTO, LA BIOCATÁLISIS ES EXCELENTE!

•HIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES, AMIDAS, LACTONAS, ANHIDRIDOS, EPOXIDOS y NITRILOS•OXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS, ALQUENOS, COMPUESTOS AROMÁTICOS, ALCOHOLES, ALDEHIDOS y CETONAS, SULFUROS Y SULFOXIDOS.•ADICION-ELIMINACION DE AGUA, AMONIACO, ACIDO CIANHIDRICO.•HALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES, ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES, ISOMERIZACIONES, CONDENSACIONES ALDOLICAS, ACILOINICA, ADICIONES DE MICHAEL.•TRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN.•CICLOADICIONES DIELS-ALDER

CONSECUENCIA:LA “FIEBRE DEL ORO”

¡¡ Se llegó a predecir que la Biocatálisis llegaría a sustituir por completo a la Síntesis Orgánica. !!.

Hoy día ya se acepta que la Biocatálisis no pretende sustituir, sino complementar.

A B C D EBiocat.

¿CUÁLES SON LAS DESVENTAJAS DE LA BIOCATÁLISIS?

1.- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un sólo enantiómero

no existen "imágenes especulares" de las enzimas formadas por D-aminoácidosse debe hacer un "screening" si se quiere la otra enantioselectividad

2.- Las enzimas requieren parámetros operacionales muy estrechos

3.- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuosos

productos orgánicos poco solubles en agua

4.- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibición

por sustrato: mantener baja la concentración inicialpor producto final: hay que retirar el producto a medida que se forma

ESTADO ACTUAL DE LAS BIOTRANSFORMACIONESLa mayoría de los Químicos Orgánicos la han aceptado como una herramienta más dentro del arsenal sintético.

0

50

100

150

200

250

Nú

me

ro d

e

pu

bli

ca

cio

ne

s

82 84 86 88 90 92 94 96 98 00 02 4

Año

BIOCATAL! ORGANIC SYNTHESIS and ENZYM!

www.sciencedirect.com

LIBROS DE TEXTO

LIBROS DE TEXTO

LIBROS DE TEXTO

¡Sinceramente, me da igualsaber cómo transcurre la

biotransformación, siempre que obtenga el resultado

buscado!

DOS TIPOS DE APROXIMACIONES

¡Yo sí quiero saber elmecanismo del proceso

biocatalizado!

DOS TIPOS DE APROXIMACIONES

ENZIMA CLASIFICADAS DISPONIBLES TIPO DE REACCION UTILIDAD

1.- OXIDORREDUCTASAS 650 90oxidación de enlaces C-H, C-C, C=C, C=O;

adición o eliminación de H

3 (25%)

2.- TRANSFERASAS 720 90transferencia de grupos aldehido, cetona, acilo, azúcar, fosforilo, metilo

2 (<5%)

3.- HIDROLASAS 636 125hidrólisis-formacion de

esteres, amidas, epóxidos, nitrilos,

anhidridos4 (65%)

4.- LIASAS 255 35adición-eliminación de pequeñas moléculas sobre enlaces C=C,

C=O, C=N2 (<5%)

5.- ISOMERASAS 120 6isomerizaciones: racemizaciones, epimerizaciones

1 (<5%)

6.- LIGASAS 80 5formación-ruptura de

enlaces C-O, C-S, C-N, C-C

1 (<5%)

CLASIFICACION DE ENZIMAS

Período 1987-99

1. OXIDORREDUCTASAS

2. TRANSFERASAS

3.- HIDROLASAS

4. LIASAS

5. ISOMERASAS

Enzimas aisladasCélulas aisladas

Liasas, transferasase isomerasas

¿QUÉ BUSCA UN QUÍMICO ORGÁNICO CUANDO USA UNA ENZIMA?

•APROVECHARSE DE LA PRECISIÓN QUÍMICA DE LAS MISMAS.

•ESTA PRECISIÓN SE PUEDE ABORDAR DESDE 2 PUNTOS DE VISTA:

•MECANÍSTICO•CINÉTICO

ASPECTOS MECANÍSTICOS

PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA

MODELO ENCAJE INDUCIDO

KOSHLAND, D.E. Y NEET, K.E.Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 1974, 37, 359

ASPECTOS CINÉTICOS

E

+ A [EA]

[EB]

E + P

E + Q+B

ΔΔG# = ΔΔH# - TΔΔS# = -RTln (VA/VB)ΔΔG# = ΔΔH# - TΔΔS# = -RTln (VA/VB)

ΔΔG#(kcal/mol) VA/ VB ee (%)0.118 1.2 10 0.651 3 50 1.74 19 90 2.17 39 95 3.14 199 99 4.50 1999 99.9

¿POR QUÉ SE DISMINUYE LA ENERGÍA DE ACTIVACIÓN?Existen 5 factores que se pueden considerar:

1.- FACTOR PROXIMIDAD y ORIENTACIÓN

MeN

Me Me+

O

O

NO2

HO

NO2

O-

O MeN

MeMe

H+ +

ON

MeMe

O

NO2O

-NMeMe

O

H

+

HO

NO2+

k = 4.3 mol-1 l min-1

k = 21500 mol-1 l min-1

2.- CATÁLISIS ÁCIDO BASEPuede ser:• Específica, si intervienen contribuciones de H+ y

OH- en la reacción.• General, si intervienen contribuciones de H+ y de

otras especies que donan o aceptan H+ , como el CH3CO2H, por ejemplo. Esta es la única que se observa en la catálisis enzimática

3.- CATÁLISIS COVALENTE• Las reacciones pueden catalizarse por la formación

de intermedios covalentes SI ESTOS SE FORMAN Y SE ROMPEN RAPIDAMENTE.

MECANISMO DE LAS SERIN HIDROLASAS

Asp

His

SerON N(R)

(R)

H HO

O(Glu)

NH

(S)

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O C O

R1

R2O

C O

R1

R2O

Asp

His

SerO

C

R1

N N(R)

(R)

O(Glu)

NH(S)

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

OO

O

O H

H

R2O O-INTERMEDIO

TETRAÉDRICO #1

Asp

His

SerO

C O(E)

R1

N N(R)

(R)

H

O

O(Glu)

NH(S)

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

ENZIMA ACILADA

R2OH

OH

H

H2O

Asp

His

SerO

C

R1

N N(R)

(R)

O(Glu)

NH(S)

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

O H

H

HO O-

INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2

C O

R1

HO

4.- DISTORSIÓN DEL SUSTRATO• Al entrar al centro activo, el sustrato debe

distorsionarse.• Eso hace que tenga una geometría y una distribución

electrónica más cercana a la del estado de transición.

5.- FACTOR MICROENTORNO• Las reacciones química se ven afectadas por los

disolventes.• La existencia de microentornos hace que las

microconstantes dieléctricas sean diferentes.

•LA PRECISIÓN SE TRADUCE EN:

•SELECTIVIDAD DE SUSTRATO•SELECTIVIDAD DE GRUPO FUNCIONAL•REGIOSELECTIVIDAD•ESTEROSELECTIVIDAD

•SELECTIVIDAD DE SUSTRATO•Incluso conociendo la estructura 3D de una enzima, a veces es difícil entender por qué una enzima reconoce un tipo de sustratos, mientras que otros similares no son transformados, lo que puede ser muy útil.•Por ejemplo, la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoácidos usando ácido L-glutámico o L-Aspártico como donador del grupo amino.

•SELECTIVIDAD DE GRUPO FUNCIONAL

•Es la capacidad de las enzimas para actuar sobre un grupo funcional determinado en una molécula en la cual existe otro grupo funcional más reactivo en condiciones químicas.

•REGIOSELECTIVIDAD•Es la capacidad de las enzimas para actuar sobre un grupo funcional determinado en una molécula en la cual existe otro grupo funcional similar o idéntico en reactividad.

O

R2 O O

OCH3R1

(R,S)

lipasa deGeotrichum candidum

medio acuosoOH O

OCH3R1

esteres de ácidos grasos consustituyentes aciloxi en beta

+O

R2 O O

OCH3R1

(S)

(R)

inalterado

R1 R2 selectividad (E)heptilo propilo 11

undecilo propilo 20pentadecilo propilo 20

5,5-dibutilpentilo propilo 62undecilo clorometilo 3undecilo heptilo 5

•REGIOSELECTIVIDAD

N

S

CH3

CH3

HH

O

NO

HO

N

HH

O

NO

HOS

CH3

CO2H

Acilasa

Acilasa

N

S

CH3

CH3

HH

O

H2N

N

HH

O

H2N S

CH3

CO2H

HON

NN

NNH2

O

Tyr

H

O

Gly

H

O

Gly

H

O

Phe

H

O

R

R= Leu Leu-encefalina

R= Met Met-encefalina

α-quimotripsina

papaina

•REGIOSELECTIVIDAD

OCH3

ClH3CO O

O OCH3

O

H3C

Microsporumcanis

OH

ClH3CO O

O OCH3

O

H3C

OCH3

ClH3CO O

O

O

H3C

HO

Batrylis alii Cercospora melonis

OCH3

ClHO O

O OCH3

O

H3C

Ref.- BOOTHROYD, B. y cols. (1961) Biochem. J. , vol. 80, p. 34

GRISEOFULVINA(antibiótico)

α-quimotripsina

NCH3

O

O

H3C

OH

NCH3

O

O

HO

HO

hidrólisis química delacetato en 6-alfa-

O

O

H3C

O

O

CH3

N

hidrólisis enzimática delester dihidrocinámico en

3-beta

Chapmann, P. J. y cols.-(1965)

.Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 20, p. 104 Lin, Y.Y. y Jones, J. B. (1973)

J. Org. Chem. vol.38, p. 3575

•REGIOSELECTIVIDAD

N

O HO H

O HH

H O

subtilisina

butirato de tricloroetilopiridina

N

O HO H

H

H O

O

O

82 %

lipasa de Chromobacterium viscosum

butirato de tricloroetilo

N

O HH

H O

O

OO

O

72 %

CASTANOSPERMINAinhibidor de glucosidasaagente antineoplásicotratamiento del SIDA

MARGOLIN, A.L. y cols. 1990 J.Am.Chem.Soc ., 112, 2849

•ESTEREOSELECTIVIDAD

•Es la capacidad de las enzimas para reconocer quiralidad o proquiralidad

en un sustrato.

•Es sin duda la propiedad enzimática más empleada en

Biotransformaciones.

•Como la quiralidad es una cuestión de espacio, un sustrato debe ubicarse

de una manera determinada en tres dimensiones para permitir un alto

grado de enantioselectividad.

•Existe una teoría basada en este hecho, como es la llamada REGLA DE

LOS TRES PUNTOS, que permite explicar los tres tipos de

esteroselectividad enzimática.

A. OGSTON, Nature, 1948, 162, 963REGLA DE LA UNIÓN POR TRES PUNTOS

1. DISCRIMINACIÓN ENANTIOMÉRICA

D

CB

A

D

AB

C

(S)(R)

D

CB

A

D

AB

C

D

A BC

D

AB C

CB

A

acción enzimática

CB

A CB

A CB

A

1. DISCRIMINACIÓN ENANTIOMÉRICA.ALGUNAS CONSIDERACIONES

•Todas las reacciones bioquímicas que tienen lugar en los

microorganismos superiores son mediadas por enzimas.

•Es lógico pensar que los distintos enantiómeros de un compuesto

bioactivo (fármaco, agroquímico) puedan causar efectos distintos.

•Así, se consideran ESPECIES DISTINTAS.

•Al isómero de mayor actividad se le llama EUTÓMERO

•Al de menor actividad se le llama DISTÓMERO.

•A la relación entre la actividad del eutómero y a la del distómero se le

llama COCIENTE EUDÍSMICO.

NH2 O

NH2

O

HO

R- AsparaginaDULCE

S- AsparaginaAMARGO

NH2O

H2NO

OH

O

S-(+) CarvonaOLOR A MENTA

R-(-) CarvonaOLOR A ALCARAVEA

O

H2N SH

MeMe

HHO2C

S-penicilaminaANTIARTRÍTICO

NH2HS

MeMe

HCO2H

R-penicilaminaTÓXICA

N

O

ONH

O

O

R-TalidomidaSEDANTE

S-TalidomidaTERATOGÉNICA

N

O

OHN

O

O

CB

A

cara Re

cara Si

CB

A

A

B C

CA

B

A

B C

ataque Siataque Re

REGLA DE LA SECUENCIAA>B>C

DISCRIMINACIÓN ENANTIOTÓPICA

DISCRIMINACIÓN ENANTIOFACIAL

A

CB

A

acción enzimática

pro-R

pro-S

CB

A

A

BC

AC

BA C

BA C

BA

A

CA

B

A

AB

Cpro-R

pro-S pro-S pro-S

pro-R

pro-R