https://www.facebook.com/tato762

ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO

CARRERA INGENIERÍA AGROPECUARIA

SANTO DOMINGO

Asignatura: Microbiología

Estudiante: Renato Andrade Cevallos

Fecha: Miércoles 22 de mayo del 2013

Práctica No.8

1. TEMA

Tinción de Gram.

2. OBJETIVO GENERAL

Conocer las técnicas de preparación y observación microscópica de bacterias.

3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Aprender a desarrollar de manera adecuada la tinción de Gram

Observar y diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Estudiar las características morfológicas de diferentes géneros de bacterias

Determinar la reacción Gram negativa y positiva de bacterias.

4. REVISIÓN DE LITERATURA

La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX. La

Tinción de Gram (o método de Gram) es un método para diferenciar especies

bacterianas en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-negativas). El nombre

proviene de su inventor, Hans Christian Gram.

Tinción de Gram diferencia las bacterias por las propiedades químicas y físicas de sus

paredes celulares mediante la detección de peptidoglicano, que está presente en una

capa espesa en las bacterias Gram positivas. Los resultados Gram positivos se denotan

por un color púrpura / azul, mientras que las gram negativas son rosa / rojo.

La tinción de Gram es casi siempre el primer paso en la identificación de un organismo

bacteriano. Mientras que la tinción de Gram es una herramienta de diagnóstico valiosa,

tanto en entornos de investigación clínica, no todas las bacterias pueden ser clasificadas

definitivamente por esta técnica. Esto da lugar a grupos de Gram-variables y Gram-

indeterminado. (Forbes, 2009)

La Tinción de Gram es una técnica de laboratorio bacteriológico se utiliza para

diferenciar especies bacterianas en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-

negativas) sobre la base de las propiedades físicas de sus paredes celulares. La Tinción

de Gram no se utiliza para clasificar las arqueas, anteriormente arqueobacterias, ya que

estos microorganismos producen muy diversas respuestas que no siguen sus grupos

filogenéticos. (Cavallini, 2005 )

La tinción de Gram no es una herramienta infalible para el diagnóstico, identificación, o

filogenia, y es de uso muy limitado en la microbiología ambiental. Se ha sustituido en

gran medida por las técnicas moleculares, incluso en el laboratorio de microbiología

médica. Algunos organismos Gram son variables (que significa, que pueden manchar ya

sea negativo o positivo); algunos organismos no son susceptibles a la mancha ya sea

utilizado por la técnica de Gram. En un moderno laboratorio del medio ambiente o la

microbiología molecular, la mayoría identificación se realiza utilizando secuencias

genéticas y otras técnicas moleculares, que son mucho más específico e informativo que

la tinción diferencial. (Cavallini, 2005 )

Las bacterias Gram-positivas tienen generalmente una sola membrana rodeada por una

gruesa capa de peptidoglicano. Esta regla es seguida de dos filos-Firmicutes (a

excepción de las clases de Mollicutes y Negativicutes) y Actinobacteria. Por el

contrario, los miembros de la Chloroflexi (bacterias verdes no del azufre) son

monodermas pero poseen una capa delgada de peptidoglicano y pueden manchar

negativo, positivo o indeterminado. Los miembros del grupo Deinococcus-Thermus,

tiñen positivamente. (Forbes, 2009)

Las bacterias Gram-negativas poseen generalmente una fina capa de peptidoglicano

entre dos membranas (didermas). La mayoría son phyla bacteriana Gram-negativas,

incluyendo las cianobacterias, espiroquetas y bacterias verdes del azufre, y la mayoría

de Proteobacteria. (EUNED, 2004)

5. EQUIPOS:

Microscopio estereoscopio

Microscopio compuesto

Estufa de incubación

Estufa de esterilización

Cámara de flujo laminar

Autoclave

Cocineta eléctrica

6. MATERIALES:

Cultivos bacterianos

Placas porta objeto

Laminas cubre objeto

Vasos de precipitados

Kit de disección

Mechero de alcohol

Platos petri conteniendo medio de cultivo

Sacabocado

Asas de inoculación

Goteros

7. REACTIVOS E INSUMOS:

Alcohol antiséptico

Agua destilada

Cristal violeta

Alcohol cetona

Yoduro de potasio

Safranina

Aceite de inmersión

8. PROCEDIMIENTO:

Tinción simple

Se limpió bien las placas portaobjeto, eliminando la grasa y pelusas. Las grasas serán

eliminadas con xilol y las pelusas haciendo una o dos pasadas de la placa por sobre la

columna de calor del mechero,

- Frotis. Consiste en extender o repartir la suspensión de bacterias sobre la placa

portaobjeto, una vez que ha sido depositada la gota de agua-bacteria, éste extensión se

hará con la ayuda de un asa o placa portaobjeto limpia, lo que permitirá realizar una

mejor observación

- Fijación. Fije las bacterias a la placa haciendo pasar tres veces el portaobjeto en la

llama del mechero de alcohol a una altura prudencial, para no deformar las agrupaciones

bacterianas que pudieran existir.

- Tinción. emplee un solo colorante como el azul de metileno, fuscina, rojo congo,

tiñe la placa completamente y deje actuar el colorante por un minuto.

- Retire el colorante, enjuague y luego séquela a la columna del mechero de alcohol o

por simple exposición al aire con movimientos horizontales

- Agregue una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observe las bacterias al

microscopio, utilizando el lente húmedo o de inmersión.

Tinción Compuesta

- Se colocó el colorante A (violeta de genciana) por espacio de medio minuto.,

elimine el exceso.

- Se agregó el colorante B (solución de yodo) por un minuto. Elimine el exceso con

leves sacudimientos de la placa o con la pisceta.

- Añada la solución C (safranina) por 30 segundos.

- Se lavó la placa con agua corriente y luego séquela a la columna del mechero de

alcohol, o por simple exposición al aires con movimientos horizontales.

- Se agregó una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observe las bacterias al

microscopio, utilizando el lente húmedo o de inmersión.

9. RESULTADOS

10. CONCLUSIONES

11. CUESTIONARIO.

¿Qué es una tinción diferencial?

Defina cual es el rol de los colorantes utilizados en la Tinción compuesta

Es en la que se usa mas de un colorante, son tinciones usadas para diferenciar

estructuras bacterianas, como Schaefer-fulton para endosporas, como la tinción de Gram

para gram - y gram+.

12. BIBLIOGRAFÍA

Cavallini, E. R. (2005 ). Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio.

Costa Rica: Universidad de Costa Rica.

EUNED. (2004). Introducción a la microbiología. Reverte.

Forbes, B. A. (2009). Diagnostico Microbiologico. Médica Panamericana.