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Universidad Autónoma de Chiapas Facultad de Ciencias Químicas Campus IV TESIS “Estudio de expresión de la actividad xilanol ítica de Penicillium sp. CGECOCR en bagazo de caña de azúcar y pulpa de café” REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACOBIOLOGO PRESENTA P.QFB. OBED ALONSO AGUILAR NAJARRO Directora de Tesis Dra. MARÍA DE LOS ÁNGELES CALIXTO ROMO Asesor de tesis ABRAHAM GÓMEZ CHOEL Tapachula Chiapas, Diciembre 2017
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Universidad Autónoma de Chiapas
Facultad de Ciencias Químicas
Campus IV
TESIS
“Estudio de expresión de la actividad xilanolítica
de Penicillium sp. CGECOCR en bagazo de caña de
azúcar y pulpa de café”
REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO
FARMACOBIOLOGO
PRESENTA
P.QFB. OBED ALONSO AGUILAR NAJARRO
Directora de Tesis
Dra. MARÍA DE LOS ÁNGELES CALIXTO ROMO
Asesor de tesis
ABRAHAM GÓMEZ CHOEL
Tapachula Chiapas, Diciembre 2017
Agradecimientos
Agradezco a la Universidad Autónoma de Chiapas y a la Facultad de Ciencias
Químicas Campus IV por permitirme realizar mis estudios y formación como
Químico Fármaco Biólogo.
Agradezco al programa de Ciencia Básica SEP/CONACyT por la beca otorgada
para la realización de mi tesis de licenciatura, la cual formó parte del proyecto
denominado Estudio enzimático y molecular de las celulasas y/o xilanasas
expresadas en la microbiota del tracto digestivo de Eisenia foetida y la composta
de desechos del café con número 180501. Fungiendo como responsable técnico
del proyecto la Dra. María de los Angeles Calixto Romo
Agradezco a El Colegio de la Frontera Sur que me dio la oportunidad de realizar
mi tesis de licenciatura en sus instalaciones
Agradezco a LABTA por permitirme hacer uso de todos los equipos que fueron
usados para realizar este trabajo.
Agradezco a la Dra. Ángeles por siempre estar apoyándome con sus enseñanzas
y su tutela, y por haberme permitido conocer la investigación al recibirme como
alumno de servicio social hasta el día de hoy.
Agradezco a la Dra. Miriam por haberme enseñado a ser un buen alumno, a ser
exigente conmigo mismo, a mantenerme siempre actualizado con todo, y por su
paciencia que ha tenido conmigo durante todo tiempo que estuvo en el laboratorio.
Agradezco a la M.C. Lupita por apoyarme durante este proceso, así como
haberme enseñado todo tipo de técnicas, metodologías y por su paciencia en el
tiempo de realización de la tesis.
Agradezco a mis amigos por estar apoyándome siempre, a motivarme y a
demostrar que siempre puedo contar con ellos ante todo tiempo de situaciones.
Dedicatoria
A mi madre por su perseverancia y apoyo, al animarme en los momentos difíciles
y por recordarme que jamás hay que rendirse, no importa el reto.
A mi padre por apoyarme y confiar en mí durante todo este tiempo.
A mis abuelos que siempre estuvieron ahí, que me apoyaron cuando los necesité
y por confiar siempre en mí.
Índice RESUMEN ................................................................................................................................................ 8
1. Introducción .................................................................................................................................... 9
2. Marco teórico ................................................................................................................................ 12
2.1 Enzimas hidrolíticas ........................................................................................................... 12
2.2 Xilanasas ............................................................................................................................... 13
2.3 Fermentación en estado solido ....................................................................................... 13
2.4 Pre-tratamiento alcalino .................................................................................................... 14
2.5 Penicillium ............................................................................................................................. 14
3. Antecedentes ................................................................................................................................ 16
4. Hipótesis ........................................................................................................................................ 18
5. Objetivos ........................................................................................................................................ 18
5.1 Objetivo General .................................................................................................................. 18
5.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 18
6. Metodología ................................................................................................................................... 18
6.1 Procesamiento de los residuos agroindustriales ....................................................... 18
6.2 Pretratamiento alcalino ...................................................................................................... 19
6.3 Obtención y conteo de esporas. ..................................................................................... 19
6.4 Fermentación en estado sólido (SSF)............................................................................ 19
6.4.1 Toma de muestra ........................................................................................................ 20
6.5 Determinación de variables de respuesta .................................................................... 20
6.5.1 Determinación de azúcares reductores ................................................................ 20
6.5.2 Determinación de actividad enzimática ................................................................ 21
6.5.3 Determinación de proteínas ..................................................................................... 21
6.6 Análisis de la expresión de proteínas ............................................................................ 21
6.6.1 Zimogramas .................................................................................................................. 22
6.6.2 Tinción de plata ........................................................................................................... 22
6.7 Identificación del hongo .................................................................................................... 22
6.7.1 Técnica de micro cultivo ........................................................................................... 22
6.7.2 Determinación de fenoles ......................................................................................... 23
6.8 Análisis estadístico ............................................................................................................ 23
7. Resultados y discusiones.......................................................................................................... 24
7.1 Cuantificación de proteína ................................................................................................ 24
7.2 Azúcares reductores .......................................................................................................... 25
7.3 Actividad enzimática .......................................................................................................... 27
7.4 Determinación de fenoles ................................................................................................. 35
7.5 Identificación del hongo .................................................................................................... 37
7.6 Determinación estadística ................................................................................................ 39
8. Conclusiones ................................................................................................................................ 40
9. Bibliografía .................................................................................................................................... 41
10. Anexos ....................................................................................................................................... 45
8
RESUMEN
En este trabajo se evaluó la expresión de actividad xilanolítica de la cepa
Penicillium citrinum CGECOCR, en fermentación en estado sólido usando
desechos agroindustriales crudos de pulpa de café y bagazo de caña de azúcar,
con pre-tratamiento alcalino y en ausencia del mismo para evaluar su eficiencia en
la expresión de la actividad xilanolítica por parte de la cepa.
Los cultivos de Penicillium citrinum CGECOCR sobre cada sustrato se
incubaron a 28 °C por 12 días. Para cada uno se evaluó la concentración de
proteína, azúcares reductores y la actividad xilanolítica en los extractos
enzimáticos obtenidos, también se realizaron zimogramas y geles de SDS-PAGE
con tinción de plata, además se realizó una determinación de fenoles presentes en
los sustratos para evaluar la efectividad del pre-tratamiento alcalino y las
condiciones en las cuales estarían los extractos enzimáticos empleados durante
este trabajo.
Al comparar los resultados de los sustratos, el que presentó mayor actividad
xilanolítica fue el bagazo de caña de azúcar con pre-tratamiento alcalino con 6.711
U/ml de actividad xilanolítica, con una diferencia poco distante de 5.01 U/ml de
actividad xilanolítica por parte de la pulpa de café con pretratamiento alcalino.
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1. Introducción
La hemicelulosa se compone de combinaciones de pentosas (xilosa y
arabinosa) y/o hexosas (manosa, galactosa y glucosa) y su concentración varía
entre una planta y otra (Hu, 2012). De estos polímeros el de mayor presencia en la
pared celular de las plantas es la xilana, la cual es un heteroglicano compuesto de
una cadena lineal de residuos de xilopiranosa unidas por enlaces β (1→4), con
una variedad de sustituyentes vinculado a la cadena principal por enlaces tipo
éster o glicosídicos (Kavanagh, 2011). Para aprovechar este sustrato se necesitan
de enzimas especializadas para su aprovechamiento, las cuales son generadas
por muchos microorganismos como las bacterias y hongos filamentosos, estas
enzimas son las xilanasas, las cuales actúan en un grupo de acción conformado
por enzimas accesorias, las cuales ayudarán al microorganismos a acceder a la
xilana y enzimas principales, la endoxilanasa y la β-xilosidasa debido a que estas
son las encargadas de degradar la cadena principal la xilana y convertirla en D-
xilosa para ser aprovechada por el microorganismo (Beg et al., 2001; Juturu et al,
2012).
La importancia de estas enzimas radica en su diversa aplicación a nivel
industrial como: en la alimentaria mejorando la calidad de los productos
horneados; en la industria de las bebidas, clarificando los vinos y los zumos de
jugos; en la industria avícola se emplean para aumentar la eficiencia de la
alimentación y mejorar el valor nutricional del ensilaje de los alimentos; igualmente
se han empleado xilanasas para la producción de xilitol, donde las enzimas se
encuentran inmovilizadas y son empleadas en reactores enzimáticos para lograr la
formación del alcohol (Juturu et al, 2011; Kavanagh, 2011), aunque el área que ha
demandado de las xilanasas es la industria papelera en el proceso de
blanqueamiento del papel, donde se ha disminuido o eliminado la necesidad de
cloro, así como el gas cloro, igualmente permite el reciclado de fibras lo cual causa
una disminución en la demanda de materia prima y permiten el aumento en la
velocidad de blanqueamiento (Bajpai, 2015).
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De los microorganismos que generalmente son empleados para la
producción de enzimas xilanolíticas, destacan los hongos filamentosos, los cuales
presentan mayores niveles de producción de xilanasas, liberándolas en el medio
que los contiene, además son comercialmente ideales a diferencia de las
levaduras y las bacterias (Polizeli et al., 2005). Dentro de la diversidad de hongos
filamentosos se encuentra el género Penicillium que tiene una variedad de
especies generadoras de xilanasas, por mencionar algunas Biverticillium (que se
encuentra en productos vegetales relacionados de madera, papel y textiles) y
furcatum (presente en suelos de pradera), donde las cepas del primer género han
presentado una concentración mayor de β-xylosidasa y ambas demostraron igual
cantidad en producción de endoxilanasas, además de que el género Penicillium ha
sido encontrado en diferentes tipos de ambientes lo cual propicia la adaptabilidad
ante distintos tipos de sustratos para su estudio (Chávez et al, 2006).
Debido a las características de Penicillium se pretende cultivarlo en
residuos agroindustriales presentes en Chiapas para la producción de xilanasas,
debido a que se generan anualmente 187, 649 toneladas de pulpa de café y 732,
839 toneladas de bagazo de caña de azúcar (Cuevas, et al., 2015), los cuales
generalmente contienen 36.87% de lignina, 43.28% de celulosa y 13.48% de
hemicelulosa para pulpa de café (Aguilar, 2014), mientras que el bagazo de caña
de azúcar, consiste principalmente en un 48.75% de celulosa, 46.41% de
hemicelulosa y 2.78% de lignina (Motaung, 2015). La presencia de lignina dentro
de los componentes de estas fuentes de carbono, es benéfico para las plantas
debido a que le confiere resistencia física y química a la pared celular de estas
plantas (Saini, 2016), sin embargo, representa un problema debido a que dificulta
el acceso de las xilanasas a la hemicelulosa. La lignina puede ser removida
mediante el empleo de diversos pre-tratamientos como: dilución ácida, extracción
alcalina, explosión de vapor, extracción de la fibra de amoníaco, oxidación
húmeda, solventes orgánicos, extracción de agua caliente, (Da silva, 2016), uso
de ozono, gamma irradiación y enzimático (Nigam, 2009). En este trabajo se
empleó el pre-tratamiento alcalino debido a su facilidad para conservar las
fracciones de hemicelulosa casi intactas, además de que permite un aumento de
11
la porosidad manteniendo un ambiente libre de fenoles, de inhibidores de la
fermentación y de ácidos fuertes (Maitan, 2015), además, que tiene ventaja sobre
los otros tratamientos al mantener su estabilidad ante diferentes temperaturas y
presiones (Yan, 2015). Por lo tanto, ¿existirá una diferencia en la expresión
xilanolítica de Penicillium sp. CGETCR empleando pulpa de café y bagazo de
caña de azúcar con y sin pretratamiento alcalino?.
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2. Marco teórico
2.1 Enzimas hidrolíticas Las enzimas hidrolíticas son proteínas que tienen como función degradar
diferentes tipos de fuentes de carbono, funcionan de manera diferente, algunas no
requieren de otros agentes químicos para actuar, otras necesitan de un
componente químico adicional para realizar su función llamado cofactor (Zn, Mg,
Fe o Mn) que puede ser una molécula orgánica o un metal, formando un complejo
denominado co-enzima, las cuales actúan como transportadores transitorios de
grupos funcionales específicos. Para que una reacción enzimática se lleve a cabo
se necesita de la siguiente reacción:
𝐸 + 𝑆 ↔ 𝐸𝑆 ↔ 𝐸𝑃 ↔ 𝐸 + 𝑃
Siendo:
o E: la enzima que actuara en la reacción
o S: el sustrato a elección donde la enzima tendrá su acción
o P: el producto obtenido de la reacción generalmente un azúcar más simple
o ES: el complejo enzima-sustrato
o EP: el complejo enzima-producto
A esta reacción se le llama catálisis enzimática, la cual proporciona un
ambiente propicio para aumentar la velocidad de diferentes reacciones necesarias
para las células de cualquier organismo vivo, como ejemplo se pueden mencionar
las reacciones para la digestión de los alimentos, enviar señales nerviosas,
contraer un músculo, entre otras.
Para que una enzima pueda actuar requiere de un sitio activo, que es el lugar
específico donde se llevan a cabo las diferentes reacciones enzimáticas, en este
sitio activo debe unirse la molécula que será modificada, llamada sustrato. Para
que una reacción enzimática se lleve a cabo, debe de pasar por el estado de
transición, este estado puede definirse en términos de la energía necesaria para
que una reacción se lleve a cabo, llamada energía de activación la cual es menor
cuando la reacción química es llevada a cabo mediante procesos enzimáticos en
lugar de procesos químicos sintéticos como se demuestra en la Figura 1 (Nelson,
et al, 2009).
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Figura 1. Proceso de actividad enzimática. Fuente: NELSON David, et al, 2009
Al finalizar las enzimas son inactivadas para poder liberar los productos de
la reacción.
2.2 Xilanasas Las enzimas se clasifican según el tipo reacción química que van a realizar
(Nelson, et al, 2009). En este trabajo se busca degradar la xilana la cual como se
mencionó anteriormente forma parte de la hemicelulosa, por lo tanto será
necesario el uso de xilanasas las cuales son las encargadas de llevar a cabo
reacciones de hidrólisis de la xilana mediante la endoxilanasa y la β-xilosidasa. La
xilana se encuentra unida a diferentes polisacáridos, para los cuales intervienen
otros tipos de enzimas y los separan de la cadena central de xilana, las cuales son
denominadas enzimas accesorias estas enzimas son α-glucuronidasa, α-
arabinofuranosidasa, acetil esterasa, feruloil esterasa y coumaroil esterasa (Juturu
et al, 2011; Beg et al, 2001).
2.3 Fermentación en estado solido Se ha demostrado que el hábitat original de la cepa es importante con el fin de
llegar a un perfil enzimático específico, es decir, si un hongo crece en un ambiente
con gran cantidad de materia orgánica rica en lignina, tendrá la capacidad de
llegar a sus azúcares dentro de dichos materiales haciendo uso de enzimas con
14
dicha capacidad, a diferencia de otro que creciera en materia orgánica sin lignina
(Andersen, et al, 2016). La producción de enzimas es eficiente porque se genera
una cantidad y concentración necesaria para poder obtener el sustrato de la pared
celular de las plantas empleadas, realizando los procesos de fermentación
necesarios para obtener la enzima de manera natural, a partir de nuestros
sustratos de interés, pulpa de café y bagazos de caña de azúcar.
El proceso de fermentación en estado sólido, se caracteriza por ser un soporte
sólido que tiene un bajo contenido de humedad (límite inferior al 12%), produce
una alta concentración de producto como pueden ser enzimas, alcoholes como el
xilitol y el metanol, se requiere baja necesidad energética, además, presenta una
mayor efectividad en contra de los método de cultivos sumergidos o en líquido,
permitiendo un desarrollo óptimo del micelio del hongo gracias a una distribución
apropiada de oxígeno y un buen desempeño sobre una superficie sólida, que al
contrario de la fermentación sumergida no se da por la viscosidad del medio
líquido; por otra parte se presenta la ventaja del uso de fermentadores que trae
como consecuencia un menor esfuerzo en los métodos de separación y finalmente
las cepas nativas o silvestres tienen mejores comportamientos sobre fermentación
de estado sólido (Robinson et al, 2001).
2.4 Pre-tratamiento alcalino La lignina en la pared celular de las plantas representa un problema para este
trabajo debido a que dificulta la acción de las xilanasas para acceder a la xilana
para ello se ha optado por realizar pre-tratamientos a los bagazos con la finalidad
de hacer más fácil la acción enzimática, para el experimento es ideal el empleo del
pre-tratamiento alcalino, debido a que a diferencia de otros pre-tratamientos
permite que una gran fracción de celulosa y hemicelulosa permanezcan intactos,
además, produce un ambiente libre de ácidos fuertes e inhibidores de la
fermentación al eliminar la lignina, promoviendo un aumento de la porosidad de la
biomasa (Maitan-Alfenas, 2015).
2.5 Penicillium Los hongos filamentosos, como Penicillium., se han destacado sobre otros
microrganismos al expresar mayor cantidad de enzimas xilanolíticas, para lograrlo
necesitan del aporte nutricional necesario para su desarrollo y tener una actividad
enzimática eficiente como: fuente de carbono, oxígeno, nitrógeno, magnesio, zinc,
potasio, calcio, hierro, fosforo, sulfuro, cobre, manganeso, níquel y molibdeno
(Kavanagh, 2011), los cuales deben de estar presentes para que puedan sustentar
el crecimiento y expresión enzimática deseada, para ello al evaluar la composición
de los sustratos a emplear resaltan los siguientes: en pulpa de café está reportado
la presencia de nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, calcio, cobre, hierro,
manganeso y zinc (Blandón, 1999), mientras que en el bagazo de caña de azúcar
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están presentes nitrógeno, fósforo, oxígeno, magnesio, calcio, hierro y manganeso
(Carrier et al, 2012), de los antes mencionados, los que permiten una actividad
enzimática es el manganeso, potasio y magnesio.
En cuanto a la expresión de enzimas está reportado que en Penicillium
participan las siguientes enzimas extracelulares:
Endoxilanasa (E.C. 3.2.1.8): Hidroliza al azar la cadena principal de xilana,
produciendo una mezcla de xilooligosacáridos.
Β-xilanosidasa (E.C. 3.2.1.37): Libera xilosa a partir de oligosacáridos
cortos.
α-L-arabinofuranosidasa (E.C.3.2.1.55): Elimina las cadenas laterales de L-
arabinofuranosa
α-D-glucuronidasa (E.C.3.2.1.139): Hidroliza los residuos de metil
glucuronato.
Xilano acetil esterasa (E.C. 3.1.1.72): Hidroliza los grupos acetato a partir
de la cadena principal
Feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73) y coumaroil esterasa (E.C. 3.1.1.-):
Hidroliza los respectivos ácidos aromáticos ligados a los residuos de
arabinofuranósido.
En la Figura 2 se muestra los puntos de acción de la xilanasa en la
hemicelulosa dependiendo del tipo de enzima que esté actuando (Chávez et al,
2006)
Figura 2. 1) Endoxilanasas; 2) α-l-arabinofuranosidasa; 3) α-D-Glucuronidasa;
4) Feruloil esterasa y coumaroil esterasa; 5) acetil xilana esterasas. Fuente: R.
Chávez et al., 2006.
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3. Antecedentes
Luciana A. Oliveira et al. (2006) evaluaron cinco desechos agrícolas en
fermentación sumergida para la obtención de enzimas xilanolíticas por Penicillium
janthinellum, donde hidrolizaron los desechos agrícolas en un medio ácido (H2SO4
0.25% a pH 5.5). Los desechos utilizados fueron cáscara de yuca, mazorca de
maíz, hoja de maíz, cascarilla de avena, caña de azúcar, el cultivo tuvo una
duración de 298 hr, en donde la caña de azúcar presentó 23 U/ml de actividad
enzimática y 0.50 g/L de proteína.
Yin Li et al. (2007) realizaron experimentos con una cepa de Penicillium
oxalicum ZH-30 que fue cultivada mediante fermentación sumergida de 168 h, en
salvado de trigo y xilana de avena donde se obtuvieron 13.3 U/ml y 5.3 U/ml de
actividad xilanolítica, respectivamente.
Gianni Panagiotou et al. (2007) Identificaron -l-Arabinofuranosidasa,
feruloil esterasas y xilanasas producida por el hongo Penicillium brasilianum sobre
diferentes fuentes de carbono obteniendo las siguientes actividades enzimáticas
(U/ml): grano gastado de cerveza (13), pulpa de remolacha azucarera (1.5), xilana
de abedul (12), xilana de avena (17), cáscara de guisantes (11), granos
cerveceros fraccionados gastados (12).
Camassola y Dillon (2007) presentaron un trabajo en el cual emplearon
fermentación en estado sólido sobre bagazo de caña de azúcar y salvado de trigo
que se sometieron a un pre-tratamiento alcalino con la cepa Penicillium
echinulatum sobre bagazo de caña de azúcar obteniendo valores de 4 U/g en
medio seco y cuando usaron ambos sustratos obtuvieron 10 U/g de xilanasas.
Muthezhin et al. (2007) optimizaron una enzima xilanolítica termoestable
haciendo uso de Penicillium oxalicum mediante una fermentación en estado
sólido sobre salvado de trigo, salvado de arroz, pasta de arroz, pastel de aceite de
sésamo entre otros, obteniendo como mejor resultado 3.89 U/ml de actividad
xilanolítica en salvado de trigo.
Camassola y Dillon (2009) realizaron un estudio comparativo para la
expresión de enzimas xilanolíticas y celulolíticas de Penicillium echinulatum en
bagazo de caña de azúcar con pre-tratamiento enzimático y sin el mismo, los
resultados obtenidos fueron una actividad xilanolítica de 1.46 U/ml con el pre-
tratamiento y 1.49 U/ml al sustrato crudo.
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Jian-Min Song y Dong-Zhi Wei (2010) emplearon un cultivo de
Cellulosimicrobium cellulans en fermentación líquida haciendo una combinación de
los sustratos bagazo de caña de azúcar pre tratado con un medio de cultivo M9; el
bagazo de la caña de azúcar permitió una actividad de xilanasas (0.7 IU/ml).
Pushpa S. Murthy y M. Madhava Nalda (2012) llevaron a cabo una
fermentación en estado sólido con diferentes productos del café en el cual se
inoculó una cepa de Penicillium sp. para la expresión de enzimas xilanolíticas
obteniendo diferentes valores de actividad dependiendo del sustrato empleado:
pulpa de café (9.475 U/gr), cáscara de cereza de café (5480 U/gr), piel plateada
(4317 U/gr), cáscara de pergamino de café (NA) y desecho del café gastado
(1.542 U/gr), demostrando una mayor producción enzimática en la pulpa de café
como sustrato empleado.
Pallavi Dwivedi et al. (2011) evaluaron la expresión de xilanasas realizando
un co-cultivo con las cepas Penicillium oxalicum y Pleurotus ostreatus en cultivos
de fermentación en estado sólido sobre distintos sustratos lignocelulósicos: Caña
de azúcar, algodón casco, salvado de arroz, salvado de trigo, aserrín, Parthenium
hysterophorus (escoba amargo), cáscara de frijol negro y rojo, donde la caña de
azúcar destacó entre los demás por alcanzar 6837.33 ±37.46 IU/g de actividad.
Gabriela P. Maitan-Alfenas et al. (2015) demostraron la diferencia entre los
pre-tratamientos realizados a los bagazos de caña de azúcar en los cuales se
suministró un pre-tratamiento alcalino y uno ácido, como se presenta en la Tabla
1, demostrando la efectividad del pre-tratamiento alcalino para eliminar la lignina
sin perder hemicelulosa.
Tabla 1. Diferencia entre pre-tratamiento alcalino y ácido sobre bagazo de caña
de azúcar
Sustratos Original
(%)
Pre-tratamiento
alcalino (%)
Pre-tratamiento
ácido (%)
Hemicelulosa 22.71 25.47 8.69
Lignina 30.07 18.52 38.91
Gabriela P. Maitan-Alfenas et al., 2015
El empleo de la pulpa de café para la producción de xilanasas se ha
realizado con anterioridad por Mata Gerardo et al. (2016), donde evaluaron la
degradación del sustrato con el hongo Lentinula eclodes; obteniendo una actividad
xilanolítica de 2.35 mU/g.
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4. Hipótesis
El uso de la pulpa de café y el bagazo de caña de azúcar con y sin
pretratamiento alcalino permitirá una expresión diferencial de xilanasas
realizada por Penicillium sp. CGETCR.
5. Objetivos
5.1 Objetivo General
Evaluar la expresión xilanolítica en condiciones de Fermentación en Estado
Sólido del hongo Penicillium sp. CGECOCR en bagazo de caña de azúcar
y pulpa de café sometidos a pretratamiento alcalino.
5.2 Objetivos específicos
Evaluar la expresión xilanolítica durante la cinética de crecimiento del
hongo Penicillium sp CGECOCR en fermentación en estado sólido en
bagazo de pulpa de café y bagazo de caña de azúcar
Identificar al hongo Penicillium sp CGECOCR haciendo uso de técnicas de
micro cultivo y microscopía electrónica de barrido
6. Metodología
Para la elaboración de este trabajo se planteó un trabajo cuantitativo,
prospectivo, experimental, para evaluar la expresión xilanolítica del hongo
Penicillium sp. CGECOCR (aislado previamente de lombricomposta de pulpa de
café con excreta de ganado vacuno (Coutiño, 2014), en los bagazos de caña de
azúcar y bagazo de pulpa de café con y sin pretratamiento alcalino.
La elaboración de este trabajo se llevó a cabo en la ciudad de Tapachula
Chiapas, México, en las instalaciones de El Colegio de la Frontera Sur, el
procedimiento que se realizó a lo largo del trabajo se detalla en los siguientes
apartados.
6.1 Procesamiento de los residuos agroindustriales La pulpa de café fue proporcionada por la finca “La Alianza” y caña de
azúcar, proporcionada por “Ingenio de Huixtla del grupo Porres”, una vez obtenida
los sustratos, se procedió a lavarlos para remover las impurezas, después se
secaron a temperatura ambiente con exposición al sol durante 4 días, una vez
seco se procedió a triturar y tamizar hasta obtener un tamaño de partícula de 1000
19
micras y se almacenó en bolsas de plástico selladas, conservándolas a
temperatura ambiente hasta su uso posterior.
6.2 Pretratamiento alcalino Se pesaron 100 g de pulpa de café o bagazo de caña de azúcar, los
bagazos se colocaron en frascos kimax kimble de dos litros y se pre-trataron con
NaOH al 2% con un volumen de 1 litro, posteriormente se sometieron a
tratamiento térmico a 120 °C durante 30 minutos en autoclave (Kaur et al, 2012).
Finalmente se lavó cada residuo con agua destilada, hasta alcanzar un pH 7 y se
secó a 55 °C durante 24 h.
6.3 Obtención y conteo de esporas. Para obtener las esporas se prepararon 20 matraces de 250 ml con agar
dextrosa papa, los cuales fueron inoculados con la cepa Penicillium sp.
CGECOCR e incubados a 28 °C durante 6 días, una vez completado el cultivo se
recuperaron las esporas en una solución de NaCl al 0.9%, se centrifugó la
solución de esporas a 3,000 rpm durante 10 minutos, y se almacenaron en viales
estériles de 2 ml a 4°C.
Se realizó el conteo de esporas en microscopio, Zeiss Axio imager A1,
empleando una cámara de neubauer mediante la siguiente fórmula
𝑃𝑎𝑟𝑡𝑖𝑐𝑢𝑙𝑎/𝑚𝑙 = [Particulas contadas
[superficie contada (𝑚𝑚2)][profundidad (mm)]] [𝐷𝑖𝑙𝑢𝑠𝑖ó𝑛]
Para este trabajo se obtuvieron un total de cinco viales con esporas de los
cuales se empleó 1 con una cantidad de 2.66 x 109 esporas.
6.4 Fermentación en estado sólido (SSF) Se pesaron 5 g de cada residuo pretratado y se colocaron en matraces de
125 ml, a los que se le adicionaron 8.11 ml de medio de impregnación (Urea 0.5%,
K2HPO4 2 g/L, MgSO4*7H2O 0.3 g/L) para mantener una humedad del 61.9%, y se
esterilizaron los matraces a 120 °C durante 15 minutos. Cada sustrato se inoculó
agregando 4 µl de solución de esporas (2.66x109) a cada matraz, se incubaron a
una temperatura de 28 °C sin agitación en la incubadora JEIO TECH IL-21.
El cultivo se llevó a cabo durante 12 días realizando una toma de muestra
cada dos días en los cultivos sin pre-tratamiento alcalino comenzando por el día
cero; en los cultivos con pre-tratamiento alcalino se realizaron muestreos a 12 y 24
h de cultivo y se continuó la toma de muestra cada 2 días respectivamente.
Este procedimiento se elaboró tanto para el bagazo de caña de azúcar
como para la pulpa de café y cada cultivo se realizó por triplicado igualmente se
elaboró un blanco para cada día de estudio el cual no fue inoculado. Cabe
20
mencionar que los análisis llevados a cabo se realizaron de forma destructiva, es
decir, se inocularon matraces para cada tiempo de muestreo como se indica en la
Tabla 2 y 3.
Tabla 2. Pulpa de café o Bagazo de caña de azúcar natural
Tiempo
(Días)
0 2 4 6 8 10 12
Replicas R-1-0
R-2-0
R-3-0
R-2-0
R-2-0
R-2-0
R-4-0
R-4-0
R-4-0
R-6-0
R-6-0
R-6-0
R-8-0
R-8-0
R-8-0
R-10-0
R-10-0
R-10-0
R-12-0
R-12-0
R-12-0
Control C-0 C-2 C-4 C-6 C-8 C-10 C-12
Tabla 3. Pulpa de café o Bagazo de caña de azúcar con pretratamiento
Tiempo
(Días)
0 0.5 1 2 4 6 8 10 12
Replicas R-1-0
R-2-0
R-3-0
R-0.5-0
R-0.5-0
R-0.5-0
R-1-0
R-1-0
R-1-0
R-2-0
R-2-0
R-2-0
R-4-0
R-4-0
R-4-0
R-6-0
R-6-0
R-6-0
R-8-0
R-8-0
R-8-0
R-10-0
R-10-0
R-10-0
R-12-0
R-12-0
R-12-0
Control C-0 C-0.5 C-1 C-2 C-4 C-6 C-8 C-10 C-12
6.4.1 Toma de muestra Para la toma de muestra se preparó un buffer de acetato de sodio 0.1 M a
un pH de 5.5, se agregó un volumen de 30 ml en los matraces con la muestra,
después se vertió el contenido del matraz a una bolsa de poli papel de 1 kg y se
obtuvo el extracto enzimático, se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos
recuperando el sobrenadante y se almacenaron a una temperatura de 4°C.
6.5 Determinación de variables de respuesta Las siguientes determinaciones se realizaron al momento de obtener el
extracto enzimático con sus triplicados correspondientes.
6.5.1 Determinación de azúcares reductores Se determinaron azúcares reductores empleando la metodología de Miller
(1959), en la cual se colocó 200 µl de extracto enzimático en un vial de 2 ml, con
200 µl de reactivo de DNS (Anexo 1), se calentó en baño maría en ebullición por 5
minutos y se enfriaron a 4°C colocándolos en agua con hielo, a continuación se
agregó 1 ml de agua destilada y se realizaron lecturas en el espectrofotómetro de
luz visible, UV-pharmaspec1700 Shimadzu, a una densidad óptica de 540 nm,
este procedimiento se repitió para todas las muestras del día de estudio. Se
elaboró una curva de calibración empleando xilosa como azúcar reductor (Anexo
2).
21
6.5.2 Determinación de actividad enzimática Se realizó la metodología descrita por Miller (1959) con la modificación
realizada por Ghose (1987) en un tubo eppendorf se colocó, un volumen de
reacción de 200 µl de muestra con buffer de xilana al 1% de acetato de sodio 0.1
M, pH 5.5 los cuáles se llevaron a una incubación de 50 °C durante 10 minutos,
inmediatamente después se adicionan 200 µl de reactivo de DNS y se calientan en
baño maría en ebullición por 5 minutos, al finalizar se enfriaron a 4°C y se adicionó
1 ml de agua destilada, se homogeneizó en vortex por 5 segundos y se leyó la
absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.
El tiempo y la cantidad de extracto enzimático necesario para tener la
mayor expresión de actividad, se determinó realizando mezclas de reacción a
diferentes concentraciones de extracto enzimático en un buffer de xilana al 1% de
acetato de sodio 0.1 M pH 5.5 la absorbancia en cada condición se midió a una
longitud de onda a 540 nm, donde se demostró que la concentración con mejor
expresión enzimática fue de 160 µl de xilana al 1%, contenido buffer de acetato de
sodio 0.1 M pH 5.5 con 40 µl de extracto enzimático, en cuanto al tiempo optimo
se colocaron 160 µl de xilana al 1%, contenido buffer de acetato de sodio 0.1 M pH
5.5 con 40 µl de extracto enzimático a diferentes tiempos de incubación a una
temperatura de 50 °C, donde el tiempo que presentó mejor actividad enzimática
fue de 10 minutos, una vez determinados estos parámetros se emplearon en la
técnica antes mencionada. Entendiendo unidad internacional como micromoles de
azúcares reductores liberados por minuto (U). La actividad volumétrica está dada
por las unidades de actividad por ml (U/ml).
6.5.3 Determinación de proteínas Las proteínas en los extractos enzimáticos se cuantificaron mediante la
técnica de Bradford (1976) en la cual se colocaron 700 µl de reactivo de Bradford
con 100 µl de extracto enzimático, se realizó la lectura por espectrofotometría a
595 nm. Para realizar esta técnica se elaboró el reactivo de Bradford (Anexo 3) y
su correspondiente curva de calibración (Anexo 4).
6.6 Análisis de la expresión de proteínas Los extractos crudos proteicos se prepararon con un buffer de corrida
(Anexo 5) y se analizaron por electroforesis en geles de poliacrilamida con un
buffer de corrida para geles de poliacrilamida nativos (Trizma base 25 mM, Glicina
192 mM) y otro para geles desnaturalizantes (Trizma base 25 mM, Glicina 192
mM, SDS PAGE 1%), los geles se elaboraron al 12%, tanto nativos como
desnaturalizantes, de acuerdo a lo mencionado en la Tabla 4. La electroforesis de
cada condición se realizó en cámaras de electroforesis Mini protean treta Cell 4-
Gel sistem de BioRad, a 110 voltios.
22
Tabla 4. Geles de poliacrilamida al 12% (Acrilamida/Bis anexo 6)
Geles nativos Geles desnaturalizantes
Soluciones Gel
separador Gel
apilador Gel separador
Gel apilador
Agua des ionizada (ml) 3.2 2.975 3.2 2.975
Acrilamida/Bis (ml) 4 0.67 4 0.67
Tris 1.5 M pH 8.8 (ml) 2.6 - 2.6 -
Tris 0.5 M pH 6.8 (ml) - 1.25 - 1.25
APS 10% (µl) 100 50 100 50
SDS 10% (µl) - - 100 50
Temed (µl) 10 5 10 5
Volumen total (ml) 10 5 10.01 5.01
Xilana 0.5% - - -
6.6.1 Zimogramas Los zimogramas se elaboraron con 20 µl de muestra de extracto
enzimático, a los cuales se les adicionó buffer de carga de muestra (Anexo 7), en
una relación 1:1, después de la electroforesis se procedió a realizar tres lavados
de 15 minutos con agua destilada, después se incubaron con un buffer de acetato
de sodio 0.1 M, pH 5.5 durante 12 h en agitación suave, al retirar el buffer se lavó
el gel con agua destilada, colocándolo en una solución de tinción de Rojo Congo al
1% por 20 minutos, se realizó un enjuagado con agua destilada y se añadió la
solución de desteñido de cloruro de sodio 1 Molar.
6.6.2 Tinción de plata La tinción de plata se llevó a cabo con 20 µl de extracto enzimático con
buffer de carga (anexo 8) en una relación 1:1. Al término de la electroforesis se
realizó un lavado del gel con una solución de isopropanol al 20%, y dos lavados
con agua destilada de 15 minutos. Una vez finalizados los lavados se colocan los
geles en las soluciones según lo indicado en el kit de tinción de plata de BioRad
(Cat 161-0480).
6.7 Identificación del hongo
6.7.1 Técnica de micro cultivo La identificación del hongo se realizó por la técnica de Ridell, para lo cual se
emplearon cajas Petri de vidrio, barras de vidrios en forma de “V”, porta objetos,
cubre objetos, asa en punta, incubadora, bisturí, pipeta, microscopio, espátula,
pinzas, medio de cultivo con agar dextrosa papa, glicerol al 10% y formaldehído al
10%.
23
Se cortaron cuadros de 1 cm por lado por 3 mm de espesor en el medio de
cultivo agar dextrosa papa (PDA) con un bisturí estéril, se colocó el cuadro de
PDA en un portaobjetos sobre la varilla de vidrio en forma de “V” en una caja Petri
(previamente esterilizada), el hongo se tomó con el asa y se inoculó por picadura a
cada uno de las caras laterales del agar, al finalizar se colocó sobre el agar un
cubre objetos, se presionó ligeramente para adherirlo al medio, se adicionaron 5
ml de glicerol al 10% en la caja Petri para incubarlos a 28 °C durante 72 h, al
finalizar la incubación se retira el glicerol con una pipeta Pasteur y en su lugar se
adicionó 5 ml de formaldehído para inactivar el hongo por 15 min. Se desprende
con cuidado el cubre objetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y se
coloca sobre un portaobjetos para observar en microscopio.
El agar se observó en el microscopio óptico AXIO ZEISS Imager.A1 a una
resolución de 10X y 40X; y en el microscopio de barrido SM_510 Scanning
electron microscope TEPCON, a una resolución de 400X, 1000X, 2000X y 6000X,
tomando las anotaciones y fotografías necesarias.
6.7.2 Determinación de fenoles La concentración de fenoles se cuantificó empleando la propuesta de
Singleton et al. (1999) con la modificación realizada por Zuorro (2012), donde se
colocó 0.1 g de los sustratos a emplear en un tubo cónico de 5 ml, a cada residuo
se le añadieron 2 ml de metanol al 80% y se dejaron en reposo durante 24 h.
Posteriormente se colocaron 5 ml de HCl 0.1 M en un tubo cónico de 15 ml, 195 µl
de reactivo de Folin Ciocalteu, 200 µl de la muestra y 4.605 ml de Na2CO3 al 20%,
hasta aforar a un volumen final de 10 ml, se mantuvo a temperatura ambiente y
obscuridad por un lapso de 1 h, al finalizar este tiempo se realizó la lectura de
cada muestra por espectrofotometría a 525 nm, usando Fenol al 5% como
estándar para la curva de calibración (Anexo 9).
6.8 Análisis estadístico Para realizar el análisis de los datos se empleó un modelo estadístico no
paramétrico del tipo loess, para realizar una comparación de la expresión
xilanolítica de cada sustrato, además de las proteínas y azúcares reductores
generados. Las variables que se usaron fueron pulpa de café y bagazo de caña de
azúcar, crudos y con pretratamiento alcalino.
24
7. Resultados y discusiones
7.1 Cuantificación de proteína En la Figura 3 y 4, se aprecia la diferencia entre los sustratos crudos y los
sometidos a un pretratamiento alcalino, demostrando que hay un aumento en la
cantidad de proteínas extracelulares presentes cuando no se presenta un
pretratamiento, y eso puede deberse a la necesidad del hongo de degradar la
lignina presente en los sustratos empleados, algunas de las enzimas provenientes
de hongos filamentosos que se encargan de degradar la lignina son: feruloil
esterasas, coumaroil esterasas, lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa,
lacasas, quienes cumplirán su función de romper los enlaces de compuestos
benzoicos de la cadena de hemicelulosa, y así expresar las enzimas xilanolíticas
principales, β-xilosidasa y endoxilanasas; en el caso de los sustratos pretratados
la necesidad de una concentración de enzimas accesorias para liberar la lignina
de la hemicelulosa es menor para darle acceso a las enzimas principales y puedan
realizar su labor.
Figura 3. Cuantificación de proteínas expresadas por Penicillium sp. CGETCR
usando como inductor pulpa de café crudo y con pre-tratamiento alcalino con
NaOH 2%
25
Figura 4. Cuantificación de proteínas expresadas por Penicillium sp. CGETCR
usando como inductor bagazo de caña de azúcar crudo y con pre-tratamiento
alcalino con NaOH 2%
El bagazo de caña de azúcar sin pretratamiento fue mejor al obtener 0.1 g/L de
proteína en comparación de los otros pretratamientos
7.2 Azúcares reductores En las Figuras 5 y 6, se presentan los azúcares reductores de los sustratos
empleados con y sin pretratamiento alcalino mediante la fermentación en estado
sólido (SSF), en los cuáles se demuestra su eficiencia en relación a los 5 gr de
sustratos empleados. La pulpa de café con pre-tratamiento alcalino mostró una
mayor producción de azúcares reductores (con 36.48 µmoles/g) comparada con
bagazo de caña de azúcar cuyo valor máximo fue de 11.36 µmoles/g en el día 8
de la SSF.
Por otro lado, los sustratos sin pre-tratamiento alcalino presentaron
concentraciones menores, además de haber obtenido sus máximas
concentraciones de azúcares reductores en el día 2 del cultivo por SSF, siendo
para pulpa de café 9.96 µmoles/g y para bagazo de caña de azúcar 9.32
µmoles/g. Dichos resultados pueden deberse a la presencia de lignina en los
sustratos y a la eficiencia de las enzimas accesorias necesarias para atravesar
estas barreras naturales, y a todo esto se le sumaria la cantidad de hemicelulosa
presente en los sustratos la cual varía entre uno y otro.
26
Fig. 5. Azúcares reductores liberados durante la SSF de Penicillium sp. CGECOCR en pulpa de café.
Fig. 6. Azúcares reductores liberados durante la SSF Penicillium sp. CGECOCR en bagazo de caña de azúcar.
27
7.3 Actividad enzimática En la figura 7, se presentan las concentraciones de actividad volumétrica
que presentó la cepa Penicillium sp. CGECOCR, en los sustratos empleados
donde se demostró la efectividad del pre-tratamiento alcalino para la actividad
enzimática, es necesario tener en cuenta que la actividad enzimática presentada
corresponde a 25 ml de extracto enzimático, el sustrato con pre-tratamiento
alcalino que presentó mayor actividad volumétrica fue el bagazo de caña de
azúcar con 6.711 U/ml de actividad xilanolítica en el día 10 de cultivo, mientras
que en pulpa de café fue de 5.01 U/ml de actividad xilanolítica al día 6. Ambos
sustratos con pretratamiento mejoraron la actividad xilanolítica así como también
la expresión de xilanasas, como se observa en la gráfica de actividad xilanolítica
(figura 7) y en los zimogramas donde se aprecia que la inducción de xilanasas,
cuando se emplea pulpa de café pretratado, la inducción se inicia desde el primer
día de la SSF (figura 10b) y cuando se usa como sustrato bagazo de caña de
azúcar pretratado la inducción inicia en el día 4 (figura 11b).
Figura 7. Determinación de la actividad xilanolítica durante la SSF en pulpa de café y bagazo de caña de azúcar, Buffer de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.5 a 50 °C.
28
En los sustratos sin pre-tratamiento alcalino, el mejor sustrato con actividad
volumétricas de xilanasas fue el bagazo de caña de azúcar con 2.17 U/ml a
diferencia de 1.34 U/ml de la pulpa de café ambos correspondientes al segundo
día de cultivo. La actividad xilanolítica registrada en este experimento se puede
comparar con los registrados por otros autores que emplearon diferentes sustratos
para obtener xilanasas así como otros tipos de fermentación y pre-tratamientos
como se demuestra en la tabla 5.
El aumento de actividad xilanolítica en presencia del pre-tratamiento alcalino se
debe a la accesibilidad de la enzima con la xilana, esto se explica gracias a que el
pre-tratamiento alcalino conserva el porcentaje de hemicelulosa, removiendo la
lignina y un porcentaje de celulosa en las fibras de la planta, con esto se
promueve el empleo mayoritario de hemicelulasas (Mood, S. H et al., 2013) dentro
de las cuales están las xilanasas, como la enzima principal para la obtención de
azúcares (monómeros de xilosa). Mientras que, en el caso de los sustratos que no
presentaron dicho pre-tratamiento el empleo de enzimas para llegar al azúcar es
diverso.
Tabla 5. Comparación de actividad xilanolítica de diferentes cepas de Penicillium sp. ante diferentes sustratos y pre-tratamientos, S/P: sin pretratamiento. Hongo Fermentación Pre-
tratamiento alcalino
Sustrato empleado
Actividad volumétrica de xilanasa (U/ml)
Autor
NaOH (%)
Con pre-tratamiento
Sin pre- tratamiento
Penicillium citrinum. CGECOCR
En estado sólido
2 - Bagazo de caña de azúcar - Pulpa de café
6.711 5.01
2.17 1.34
Este trabajo
Penicillium pinophilum
En estado solido
1.5 -Bagazo de caña de azúcar
22.77 Visser, 2013
Penicillium echinulatum 9A0231
Sumergida 16 -Caña de azúcar 0.984 Camassola, 2014
Penicillium oxalicum ZH-30
Sumergida S/P -Salvado de trigo 13.11 Li, 2007
Penicillium brasilianum TBT20888
En estado solido
S/P -Grano gastado de cerveza -Pulpa de remolacha azucarera -Xilana de madera de abedul -Xilana de hojuela de avena -Cascara de guisantes -Fracciones de grano gastado de cerveza
13 1.5 12 17 11 12
Panagiotou, 2007
29
Penicillium janczewski
Sumergida S/P -Bagazo de caña de azúcar -Salvado de avena -Salvado de trigo -Cereal gastado de cerveza -Mazorca de maíz -Paja de Arroz -Desechos de naranja -Cascara de yuca
3.05 5.77 15.38 4.87 5.28 0.56 0.25 0.31
Fanchini, 2008
Para comprender el comportamiento de la cepa Penicillium sp. CGECOCR,
sobre los sustratos empleados se debe de tener en cuenta todas las variables por
lo que en la figura 8 se presentan los resultados de los cultivos con pre-
tratamiento alcalino. A partir del día 6 se observa una disminución de proteínas
así como también la actividad xilanolítica disminuye, esta disminución podría
deberse a la autolisis celular donde uno de los procesos es llevado a cabo por las
proteasas que actúan degradando las proteínas que se encuentran dentro y fuera
de la célula y por este motivo la concentración de proteínas. Además, se logró
observar que a partir del día 6 la SSF comienza a formar esporas en el medio, las
cuales son células reproductivas que aseguran la preservación de la especie, su
aparición coincide con la disminución de proteínas así como también con la
disminución de la actividad xilanolítica. Con el bagazo de caña de azúcar la
actividad xilanolítica junto con la concentración de proteína aumenta pero
disminuye la cantidad de azúcares reductores (xilosa), esto se puede atribuir al
consumo celular de la xilosa, incorporándola al ciclo de las pentosas para entrar al
ciclo de la glicólisis participando después en el ciclo de Krebs.
30
Figura 8. Rendimiento de azúcares reductores y concentración de proteína en sustratos con pre-tratamiento alcalino.
Por otro lado, los sustratos sin pre-tratamiento (sustratos crudos) tuvieron
un comportamiento diferente a los sustratos con pre-tratamiento alcalino, cabe
mencionar que los sustratos crudos contienen monosacáridos o azúcares
reductores, lo cual puede explicar la cantidad de azúcares reductores observada
en el día 2 del experimento, ya que a partir de ese día se inició la medición de
cada parámetro evaluado (fig. 9).
La actividad enzimática observada en cada extracto enzimático de ambos
sustratos sin pretratamiento alcalino, no aumentó como en los experimentos
previos, y esto puede deberse a la presencia de monosacáridos que podrían estar
realizando una represión catabólica, es decir con estos sustratos no se pudo llevar
a cabo la inducción de la expresión enzimática (xilanolítica), la única actividad
presente en esta SSF se debe a las enzimas expresadas de forma basal. Por esta
razón, a partir del día 4 se observa que la cantidad de proteína aumenta la cual se
puede deber a que el hongo Penicillium sp. CGETCR utilizó los monosacáridos
para incrementar su biomasa.
Figura 9. Rendimiento de azúcares reductores y concentración de proteína Sustratos sin pre-tratamiento alcalino.
31
A partir de las muestras observadas en los tiempos graficados, se
realizaron zimogramas con la finalidad de corroborar la presencia de enzimas
xilanolíticas expresadas por el hongo Penicillium sp. CGECOCR dentro de las
muestras y geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes teñidos con
plata, para evaluar el perfil proteínico de la SSF.
a)
b)
Figura 10. Geles al 12% para Zimograma de pulpa de café con tinción de rojo Congo, a) sin pre-tratamiento alcalino, b) con pre-tratamiento alcalino
En la Figura 10, se puede observar que el comportamiento de la actividad
xilanolítica presente en pulpa de café, y se aprecia que existe una, concentración
de actividad volumétrica es diferente, esto se puede deber a las características
que se presentó al sustrato después del pretratamiento alcalino ya que el acceso
al sustrato es más sencillo, por lo cual se observa que en la parte superior en la
Figura 10b, no se presentan las bandas en los días 10 y 12, las cuales se podrían
tratar de enzimas con la cualidad de separar la lignina y la hemicelulosa como es
la feruloil esterasa.
Por otra parte, la intensidad de las bandas observadas es diferente entre un
sustrato y otro, lo cual se debe como se mencionó anteriormente, a las
condiciones de la pulpa de café con pretratamiento, no es necesarios que todas
las enzimas actúen para dejar libre la cadena principal de xilana, por lo tanto la
intensidad de las bandas centrales se podría deber a la acción de la Endoxilanasa
y la β-xilanosidasa, las que se encargan de sintetizar la cadena principal de este
polímero.
Además, en los dos geles se presentó un segundo grupo de bandas en la
parte inferior, se puede deducir que son enzimas necesarias en la degradación de
la xilana, como endoxilanasa y β-xilanosidasa, mientras que las bandas superiores
podrían representar a las enzimas xilanolíticas accesorias puesto que están
presentes durante todo el tratamiento, otra diferencia apreciable es la presencia de
las bandas inferiores de los sustratos sin pre-tratamiento, las cuales se pierden
desde el día 10 lo cual no sucede con el sustrato con pre-tratamiento.
32
En cuanto al sustrato de bagazo de caña de azúcar se le realizaron sus
respectivos zimogramas, en la Figura 11 se presenta el comportamiento de las
enzimas xilanolíticas. el la Figura 11a, se observa la presencia de una banda de
actividad en la parte inferior en el día 2 y del día 4 al 8 se observa actividad en la
parte superior del gel y una banda definida en la parte inferior, pero del día 10 y 12
solo se observa actividad en la parte superior. Observando estos resultados
podemos deducir que las bandas de actividad observadas en la parte inferior
podrían ser endo xilanasas las cuales se encargan de generar los sustratos de las
β-glucosidasas y estas podrían ser las bandas de actividad observadas en la
parte superior de los zimogramas.
Por otra parte en la Figura 11b, que corresponde a los bagazos de caña de
azúcar con pretratamiento se observa que las bandas comienzan a aparecer a
partir del día 4 correspondiendo al comportamiento de expresión enzimática
observada en la Figura 7, otra diferencia en ambos sustratos es en los días 6 y 8
en los que se presentó un tercer grupo de bandas en la parte inferior del gel, en
dichos días fue aumentando la expresión enzimática, sin embargos en el día 10,
día con mayor registro de actividad xilanolítica, no se presentan estas bandas, por
lo tanto podrían estar implicadas en el escalamiento de actividad xilanolítica o la
disminución de la concentración de azúcares reductores, ya que en el día 6 inicio
el descenso de estos, como se observa en la Figura 8.
Para tener una idea del peso molecular de las proteínas presentes en la
actividad xilanolítica se empleó la tinción de plata, la cual fue elegida por la
concentración limitada de proteína presente en los extractos enzimáticos.
a)
b)
Figura 11. Geles al 12% para Zimograma de con tinción de rojo Congo a) bagazo de caña de azúcar sin pretratamiento alcalino, b) bagazo de caña de azúcar con pretratamiento alcalino
33
Figura 12. Geles SDS-PAGE al 12% con tinción de plata de los cultivos de pulpa de café sin pretratamiento alcalino, con un frente de corrida de 6.1 cm.
Figura 13. Geles SDS-PAGE al 12% con tinción de plata de los cultivos de pulpa
de café con pretratamiento alcalino, con un frente de corrida de 6.1 cm.
En las Figura 12 y 13 se presenta los geles de SDS-PAGE con tinción de
plata correspondientes a la pulpa de café, en la cual se aprecian bandas en
formación similar a las observadas en los zimogramas en la Figura 10, además
que las bandas que están presentes en el rango de peso molecular 43990.19 a
31081.48 kD para la pulpa de café sin pretratamiento y 41515.81 a 26126.09 kD
para pulpa de café con pretratamiento (Anexo 10 y 11), son representativas de la
actividad xilanolítica presentes en la Figura 7.
34
En la pulpa de café sin pre-tratamiento alcalino se puede observar que en el
segundo día de cultivo, en el cual se presenta mayor actividad enzimática la banda
de proteínas dentro de dicho rango es poco notable, lo que resalta la eficiencia de
la enzima ante poca concentración de proteína.
Por otra parte en la pulpa café con pre-tratamiento las bandas dentro de
este rango presentan un segundo grupo de bandas inferiores las cuales son poco
apreciables en el anterior cultivo, dichas bandas solo tienen presencia en el cuarto
y sexto día de cultivo, siendo este último en el que pierden intensidad.
a)
b)
Figura 14. Geles SDS-PAGE al 12% con tinción de plata de los cultivos de bagazo
de caña de azúcar, a) Sin pretratamiento alcalino, b) Con pretratamiento alcalino,
con frente de corrida de 6.2 y 6 cm respectivamente.
35
En la Figura 14 se presentan los geles de bagazo de caña de azúcar con y
sin pre-tratamiento alcalino, en los cuales al igual que en pulpa de café, las
bandas dentro del rango 56697.42 a 28634.08 kD para los bagazo de caña de
azúcar sin pretratamiento y 45417.95 a 28354.41 kD para los bagazos con
pretratamiento (Anexo 12 y 13), tienen relación directa con la actividad xilanolítica
presente en la Figura 7, pero a diferencia de los cultivos de pulpa de café,
siempre estuvieron presentes dos grupos de bandas de proteínas dentro de dicho
rango.
En el bagazo de caña de azúcar sin pre-tratamiento alcalino se obtuvo una
característica similar a los cultivos con pulpa de café, puesto que en el carril del
segundo día no se aprecia banda de proteínas, sin embargo, ese día se presentó
mayor actividad xilanolítica en este sustrato. El comportamiento anterior se
presenta nuevamente en el cultivo con pre-tratamiento, ya que la intensidad de las
bandas es poca en comparación a la actividad xilanolítica obtenida. Por otro lado a
diferencia del bagazo de caña de azúcar con pre-tratamiento se presentó una
línea de bandas poco definidas, de peso molecular aproximado de 29 kD en los
días 4,6 y 8 en los cuales se dio inicio de actividad xilanolítica por lo que es muy
probable una relación con el descenso de azúcares reductores que se presentó en
la Figura 8.
7.4 Determinación de fenoles Los fenoles se determinaron por el método de Folin Ciocalteu, de los cuales
se obtuvieron los siguientes resultados.
Figura 15. Concentración de fenoles en todos los sustratos empleados haciendo uso de un blanco y de muestras con doce días de incubación.
36
En la Figura 15 se demuestra el efecto del pre-tratamiento alcalino en los
sustratos empleados y la influencia de la cepa Penicillium sp. sobre los fenoles
presentes, donde en el bagazo de caña de azúcar el pre-tratamiento alcalino logró
eliminar 68.32% de lignina, sin embargo, al intervenir la cepa de Penicillium se dio
un aumento en la concentración de lignina lo cual se presentó en ambos sustratos.
Por otra parte en la pulpa de café con el pre-tratamiento alcalino se logró eliminar
un 58.58% de lignina, pero con la presencia de la cepa se eliminó un 48.72%;
mientras que en los sustratos con pre-tratamiento y la cepa se eliminó 59.66% de
lignina.
Figura 16. Concentración de fenoles en extractos enzimáticos
En la figura 16 se puede observar el comportamiento de Penicillium sp. en
los sustratos, en los cuales se observa una disminución de los compuestos
fenólicos en la pulpa de café, sin embargo en el resto de los sustratos con
pretratamiento y el bagazo de caña de azúcar se observa un ligero aumento en la
concentración de fenoles, pero este comportamiento se puede deber a que se ha
reportado la presencia de lignina peroxidasa y manganeso peroxidasa en las
cepas de Penicillium donde sus temperaturas ideales son de 30 °C, (Govarthanan
et al, 2017; Kumari et al, 2002) por lo cual al momento de que estas enzimas
actúan liberan compuestos fenólicos al exterior y es precisamente esto, lo que
estaríamos observando por parte del microorganismo, puesto que los cultivos se
realizaron a una temperatura de 28 °C, cabe aclarar que al iniciar con poca
concentración de lignina un ligero aumento en los radicales libres por acción de
estas enzimas podrían ser detectados por el método de identificación de fenoles
empleado.
37
Se esperaba que las enzimas accesorias de la cepa eliminaran un mayor
porcentaje de lignina en el sustrato con el pre-tratamiento, sin embargo no fue así,
esto se puede deber a la formación de metabolitos secundarios a partir de la
lignina, lo cual podría explicar dicho aumento de fenoles al intervenir la cepa en el
bagazo de caña de azúcar, pero debido a que los porcentajes de lignina que
presentan estos dos sustratos en su pared celular es muy diferente, siendo mayor
en la pulpa de café por lo tanto un aumento en la concentración de este
compuesto no sería tan representativo como lo es en el bagazo de caña de
azúcar.
7.5 Identificación del hongo Mediante el empleo de la técnica de micro cultivo se realizó la identificación de la
cepa empleada durante este trabajo se determinó que es un Penicillium con
conidióforos diverticilados, lo que lo ubica dentro de la sección Furcatum. Conidios
ligeramente rugosos, esféricos de 2.3-2.5 µm, fiálides de 6.4-7.5 µm, métulas de
14-15 µm de largo. Además de los colores y características macroscópicas, logre
llegar a deducir que se trata de un Penicillium citrinum haciendo uso de las
imágenes de microscopio en diferentes medios de cultivo (Pitt, 2000).
a)
b)
Figura 17. Cepa de P. citrinum. CGECOCR, en Agar Malta en a) microscopia óptica y b) Microscopia de barrido.
38
a)
b)
Figura 18. Cepa de P. citrinum. CGECOCR, en Agar Dextrosa Papa. a) microscopía óptica y b) microscopía de barrido.
a)
b)
Figura 19. Cepa de P. citrinum. CGECOCR, en Agar Czapek en a) microscopia óptica y b) Microscopia de barrido.
39
7.6 Determinación estadística Se realizó la determinación estadística no paramétrica de tipo loess debido
a que las muestras presentan una tendencia no lineal, con aleatoriedad e
independencia unos de otros, al analizar las variables se determinó que los
sustratos con mejores resultados son los que presentaron pretratamiento alcalino
como se demuestra en la figura 20, además se aprecia que entre los dos tipos de
sustratos con pre-tratamiento empleados resalta la caña de azúcar por su mayor
expresión de actividad xilanolítica.
a)
b)
Figura 20. Método estadístico no paramétrico de tipo Loess con el programa R Comander a) Ausencia de pre-tratamiento alcalino, b) presencia del pre-tratamiento alcalino
En la figura 20a se presenta la diferencia entre los sustratos sin pretratamiento
alcalino en los cuales el mejor sustrato en la actividad enzimática fue el bagazo de
caña de azúcar, en el resto de los valores no hay diferencia, por otra parte en la
figura 20b se demuestra que con pretratamiento alcalino el mejor sustrato
presente fue el de bagazo de caña de azúcar, pero la cantidad de azúcares
reductores presentes en la pulpa de café fue mayor, lo cual es de gran importancia
para otro tipo de estudios.
40
8. Conclusiones
El hongo P. citrinum. CGECOCR se desarrolló en los sustratos de pulpa de
café y bagazo de caña de azúcar sin presentar impedimento alguno en su
desarrollo.
Se demostró diferencia en los comportamientos de actividad enzimática,
azúcares reductores y proteína producida entre los sustratos empleados y
la presencia o ausencia de un pretratamiento alcalino en los mismos.
Se determinó que el hongo empleado en el experimento es Penicillium
citrinum CGECOCR.
El pre-tratamiento alcalino permite una mayor expresión xilanolítica de
hongo P. citrinum CGECOCR al ser cultivado sobre bagazo de pulpa de
café y caña de azúcar que presenten dicho pre-tratamiento.
La mayor actividad xilanolítica se presentó en el bagazo de caña de azúcar
con pretratamiento alcalino con una cantidad de 6.711 U/ml, con cuál se
demuestra que al usar un pre-tratamiento alcalino aumenta la expresión de
la actividad enzimática.
41
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45
10. Anexos
Anexo 1. Reactivo 3,5-dinitrosalcilico (DNS)
NaOH 10 g/L
Fenol 2 g/L
Sulfito de sodio 0.5 g/L
Tartrato de sodio y potasio 200 g/L
3,5-dinitrosalcilico 10 g/L
Anexo 2.1. Curva de calibración para experimentos con reactivo 3,5-
dinitrosalcilico (DNS) para el sustrato pulpa de café con pre-tratamiento alcalino
46
Anexo 2.2. Curva de calibración para experimentos con reactivo 3,5-
dinitrosalcilico (DNS) para el sustrato bagazo de caña de azúcar con pre-
tratamiento alcalino
Anexo 2.3. Curva de calibración para experimentos con reactivo 3,5-
dinitrosalcilico (DNS) para los sustratos bagazo de caña de azúcar y pulpa de
café sin pre-tratamiento
47
Anexo 3. Reactivo de Bradford
Azul de coomassie G-250 0.01% (w/v)
Etanol 4.7% (w/v)
Ácido fosfórico al 8.5% (w/v)
Anexo 4. Curva de calibración del reactivo de Bradford para la determinación de
proteínas.
Anexo 5. Buffer de corrida de muestras nativas y desnaturalizantes
10% SDS
30% Glicerol
5% β-Mercaptoetanol
0.06% Azul Bromofenol
*En muestras nativas no se adiciona SDS y β-Mercaptoetanol
Anexo 6. Acrilamida/Bis
Relación Acrilamida:Bis acrilamida 37.5:1
Porcentaje 30%
pH 7.0
48
Anexo 7. Buffer de carga de muestras nativas
Tris HCl pH 6.8 250 mM
Glicerol 30%
Azul de Bromofenol 0.06%
Anexo 8. Buffer de carga de muestras desnaturalizantes
Tris HCl pH 6.8 250 mM
SDS 10%
Glicerol 30%
Β-mercaptoetanol 5%
Azul de Bromofenol 0.06%
Anexo 9. Curva de calibración de fenoles por el reactivo de Folin-Ciocalteu
49
Anexo 10. Pesos moleculares del gel SDS-PAGE al 12% con tinción de plata de pulpa de café sin pretratamiento alcalino
PM (Kda) Log PM Distancia (cm) Rf Frente
104834.4696 5.020504102 1.4 0.229508197 6.1
98934.81755 4.995349157 1.5 0.245901639 6.1
88117.95694 4.945064419 1.7 0.278688525 6.1
83161.44653 4.919922035 1.8 0.295081967 6.1
74069.13911 4.869637297 2 0.327868852 6.1
65970.92047 4.819352544 2.2 0.360655738 6.1
62260.15172 4.794210175 2.3 0.37704918 6.1
43990.19936 4.64335593 2.9 0.475409836 6.1
41515.81434 4.618213561 3 0.491803279 6.1
39180.60991 4.593071192 3.1 0.508196721 6.1
34896.86705 4.542786439 3.3 0.540983607 6.1
31081.48076 4.492501701 3.5 0.573770492 6.1
19559.72382 4.291362718 4.3 0.704918033 6.1
Anexo 11. Pesos moleculares del gel SDS-PAGE al 12% con tinción de plata de los cultivos de pulpa de café con pretratamiento alcalino
PM (Kda) Log PM Distancia (cm) Rf Frente
148369.8887 5.171345771 0.8 0.131147541 6.1
104831.4339 5.020491526 1.4 0.229508197 6.1
98934.81755 4.995349157 1.5 0.245901639 6.1
93369.87733 4.970206788 1.6 0.262295082 6.1
78483.73559 4.894779666 1.9 0.31147541 6.1
65970.92047 4.819352544 2.2 0.360655738 6.1
62260.15172 4.794210175 2.3 0.37704918 6.1
41515.81434 4.618213561 3 0.491803279 6.1
36976.75734 4.567928823 3.2 0.524590164 6.1
29333.19247 4.467359332 3.6 0.590163934 6.1
26126.09963 4.417074579 3.8 0.62295082 6.1
50
Anexo 12. Pesos moleculares del gel SDS-PAGE al 12% con tinción de plata de bagazo de caña de azúcar sin pretratamiento alcalino
PM (Kda) Log PM Distancia (cm) Rf Frente
133172.1255 5.124413331 1 0.161290323 6.2
106052.2769 5.025519997 1.4 0.225806452 6.2
100183.6077 5.000796667 1.5 0.241935484 6.2
94639.69284 4.976073322 1.6 0.258064516 6.2
89402.56773 4.951349992 1.7 0.274193548 6.2
79781.70859 4.901903333 1.9 0.306451613 6.2
56697.42349 4.753563324 2.5 0.403225806 6.2
50596.05595 4.704116664 2.7 0.435483871 6.2
42652.71291 4.62994666 3 0.483870968 6.2
35956.43867 4.55577667 3.3 0.532258065 6.2
33966.69763 4.531053325 3.4 0.548387097 6.2
32087.0651 4.506329995 3.5 0.564516129 6.2
28634.08672 4.456883336 3.7 0.596774194 6.2
25552.69205 4.407436661 3.9 0.629032258 6.2
24138.66965 4.382713331 4 0.64516129 6.2
14461.16671 4.160203333 4.9 0.790322581 6.2
Anexo 13. Pesos moleculares del gel SDS-PAGE al 12% con tinción de plata de bagazo de caña de azúcar con pretratamiento alcalino
PM (Kda) Log PM Distancia (cm) Rf Frente
156430.2286 5.19432068 0.7 0.116666667 6
147483.9729 5.168744828 0.8 0.133333333 6
139049.3493 5.143168961 0.9 0.15 6
131097.1028 5.117593094 1 0.166666667 6
116530.9736 5.066441375 1.2 0.2 6
103583.2793 5.015289656 1.4 0.233333333 6
92074.1932 4.964137922 1.6 0.266666667 6
81843.87873 4.912986203 1.8 0.3 6
77163.21889 4.887410336 1.9 0.316666667 6
64667.00541 4.81068275 2.2 0.366666667 6
60968.69487 4.785106898 2.3 0.383333333 6
45417.95527 4.657227578 2.8 0.466666667 6
40371.5905 4.606075859 3 0.5 6
38062.73509 4.580499992 3.1 0.516666667 6
35885.92462 4.554924141 3.2 0.533333333 6
31898.65756 4.503772406 3.4 0.566666667 6
28354.41474 4.452620688 3.6 0.6 6
