UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · Fernando de Magallanes. A mis padres...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “COMPARACIÓN DE DOS PROTOCOLOS DE SUPEROVULACION UTILIZANDO DIFERENTES DOSIS DE GONADOTROPINA CORIÓNICA EQUINA (eCG) EN LA PRODUCCIÓN DE EMBRIONES OVINOS” Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR: María Belén Morales Gordón TUTOR: Dr. Richard Roberto Salazar Silva Quito, Marzo 2017
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“COMPARACIÓN DE DOS PROTOCOLOS DE SUPEROVULACION
UTILIZANDO DIFERENTES DOSIS DE GONADOTROPINA CORIÓNICA
EQUINA (eCG) EN LA PRODUCCIÓN DE EMBRIONES OVINOS”
Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el Título de
Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR:
María Belén Morales Gordón
TUTOR:
Dr. Richard Roberto Salazar Silva
Quito, Marzo 2017
ii
DEDICATORIA
“El mar es peligroso y sus tormentas terribles. Pero estos obstáculos
nunca han sido razón suficiente para quedarse en tierra”
Fernando de Magallanes.
A mis padres Patricio y Juanita, que con su ejemplo me enseñaron a
esforzarme por todo aquello que uno desea en la vida, este fue un sueño
que lo construimos juntos y gracias a su apoyo incondicional ahora es
realidad, gracias por guiarme a lo largo de mi vida, todo lo que soy ahora
es fruto de sus innumerables esfuerzos.
A mis familiares y amigos que me brindaron siempre su apoyo y aliento en
los momentos más difíciles.
Con cariño Mabe.
iii
AGRADECIMIENTOS
A mis padres que siempre confiaron en mí y me impulsaron a cumplir mis
metas y objetivos, gracias por su apoyo incondicional sin ustedes nada de
esto hubiese sido posible.
A la Hacienda Zuleta y Anexas Cía. Ltda. por poner a disposición el uso de
sus instalaciones y animales en la realización de este proyecto, a la
Empresa IMPVET Cía. Ltda. por su aporte con productos usados en este
proyecto.
A Bernard y Telio Nicolalde, por abrirme no solo las puertas de su hogar,
sino las de su corazón, y por su apoyo incondicional para que este proyecto
sea posible.
A mi tutor Dr. Richard Salazar, por brindarme su apoyo incondicional en la
realización de este proyecto, por su guía, sus consejos y su amistad.
A mis maestros y amigos: Dr. Juan Vargas, Dr. Richard Mancheno, Dr.
Fabián Mancheno, Dra. Pamela Martínez, MVZ. Pamela Martínez Estévez,
MVZ. Gabriela Ortega, Ing. Daysi Páez, MVZ. Orominavi Tisalema, MVZ
Xavier Villacís, quienes colaboraron en este proyecto.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
v
INFORME DEL TUTOR
vi
CALIFICACIÓN DEL TRABAJO ESCRITO FINAL
vii
viii
ix
ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO pág.
DEDICATORIA .......................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS ............................................................................... iii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL .................................. iv
INFORME DEL TUTOR ............................................................................. v
CALIFICACIÓN DEL TRABAJO ESCRITO FINAL .................................... vi
ÍNDICE GENERAL ................................................................................... ix
ÍNDICE DE TABLAS O CUADROS ........................................................ xiii
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................. xiv
INDICE DE ANEXOS ............................................................................... xv
RESUMEN.............................................................................................. xvi
ABSTRACT ........................................................................................... xvii
CAPITULO I ...............................................................................................1
INTRODUCCIÓN .......................................................................................1
x
OBJETIVOS ..............................................................................................3
OBJETIVO GENERAL ...........................................................................3
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: .................................................................3
HIPÓTESIS ............................................................................................3
CAPITULO II ..............................................................................................4
MARCO TEORICO ....................................................................................4
CICLO ESTRAL DE LA OVEJA .............................................................4
FASE FOLICULAR .................................................................................4
Proestro .................................................................................................4
Estro ......................................................................................................5
FASE LUTEAL .......................................................................................6
Metaestro: ..............................................................................................6
Diestro ...................................................................................................6
DESARROLLO DE ONDAS FOLICULARES ..........................................7
FACTORES QUE REGULAN EL CICLO ESTRAL.....................................8
Fotoperiodo ............................................................................................8
Nutrición .................................................................................................8
Efecto macho .........................................................................................8
MÉTODOS DE SINCRONIZACIÓN DEL ESTRO ..................................9
xi
Sincronización utilizando progestágenos ...............................................9
Sincronización utilizando PGF-2α ..........................................................9
MÉTODOS DE SUPEROVULACIÓN .....................................................9
Tratamiento con gonadotropina coriónica equina (eCG) ......................10
Tratamiento con FSH ...........................................................................10
TIPOS DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL .............................................11
IA Vaginal.............................................................................................11
IA cervical ............................................................................................11
IA intrauterina .......................................................................................11
COLECTA DE EMBRIONES ................................................................12
CALIFICACIÓN EMBRIONARIA ..........................................................12
CAPITULO III ...........................................................................................14
MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................14
CARACTERÍSTICAS DE LA ZONA DE ESTUDIO. ..............................14
MATERIALES ......................................................................................14
Materiales químicos y biológicos ..........................................................14
Equipos ................................................................................................15
Insumos médicos .................................................................................15
Unidades Experimentales ....................................................................16
xii
Tipo de investigación ...........................................................................16
METODOLOGÍA ......................................................................................17
TRATAMIENTOS .................................................................................17
PROTOCOLO TRATAMIENTO 1. ........................................................17
PROTOCOLO TRATAMIENTO 2. ........................................................18
Procedimiento para colocación de esponja intravaginal .......................19
Técnica de inseminación artificial cervical ............................................20
Técnica de lavado y recuperación de embriones..................................20
Búsqueda y clasificación de embriones ................................................21
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ....................................................................21
Tamaño de la muestra .........................................................................21
CAPÍTULO IV ..........................................................................................23
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................23
CAPÍTULO V ...........................................................................................30
CONCLUSIONES ....................................................................................30
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................31
ANEXOS .................................................................................................35
xiii
ÍNDICE DE TABLAS O CUADROS
TABLA pág.
Tabla 1. Valoración del estadio de desarrollo embrionario .......................12
Tabla 2. Valoración de la calidad embrionaria .........................................13
Tabla 3. Numero de cuerpos lúteos observados mediante laparotomía. ..23
Tabla 4. Embriones obtenidos mediante lavado uterino, y clasificación a
través del esteromicroscopio. ..................................................................26
Tabla 5. Costos parciales de producción de embriones ovinos por
tratamiento y por donadora ......................................................................28
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA pág.
Figura 1. Evolución de los niveles plasmáticos de esteroides ováricos y de
gonadotropinas hipofisarias durante el ciclo estral de la oveja ...................7
Figura 2. Ubicación geográfica Hacienda Zuleta y Anexas S.A. ..............14
Figura 3. Esquema del Protocolo de superovulación y transferencia de
embriones. ...............................................................................................19
xv
INDICE DE ANEXOS
ANEXO pág.
ANEXO 1. REGISTRO DE PROTOCOLO DONADORAS .......................36
ANEXO 2. REGISTRO DE COLECTA DE EMBRIONES .........................38
ANEXO 3. ANÁLISIS DE COSTO PARCIALES TRATAMIENTO 1 ..........39
ANEXO 4. ANÁLISIS DE COSTO PARCIALES TRATAMIENTO 2 ..........41
ANEXO 5. RESULTADOS ANALISIS DE LABORATORIO ......................43
ANEXO 6. FOTOGRAFÍAS ......................................................................47
xvi
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“COMPARACIÓN DE DOS PROTOCOLOS DE SUPEROVULACION
UTILIZANDO DIFERENTES DOSIS DE GONADOTROPINA CORIONICA
EQUINA (eCG) EN LA PRODUCCIÓN DE EMBRIONES OVINOS”
Autor: María Belén Morales Gordón
Tutor: Richard Salazar Silva
Fecha: 15 de Marzo, 2017
RESUMEN
El efecto de un tratamiento de superovulación y transferencia de embriones realizado en ovejas Poll Dorset (n= 16) estimuladas en los meses de septiembre-octubre, en la Hacienda Zuleta y Anexas S.A. a una altitud de 2885msnm, el día 0 se colocó una esponja intravaginal Chronogest® CR durante 9 días, en el día 7 se administró Tratamiento I (1000 UI eCG Folligon ®) Tratamiento II (1500 UI de eCG Folligon ®), día 9 se administró un análogo de la prostaglandina F2α (Lutalyse® 10mg) conjuntamente con el retiro de la esponja , y al momento del celo se aplicó un análogo de GnRH (Conceptal ® 8µg), se realizó la inseminación artificial cervical 48 horas post retiro de esponja intravaginal. La recuperación embrionaria se realizó 6 días posteriores por laparotomía. El número de cuerpos lúteos obtenidos en el tratamiento I (5,40±3,02) tratamiento II (9,8±5,20) demostró (P <0,05) y que existe una diferencia significativa en la respuesta superovulatoria entre tratamientos. El número de embriones obtenidos tratamiento I (0,63±1,41) tratamiento II (2,13±2,30) donde (P>0,05) sin mostrar una diferencia significativa entre los tratamientos. Se concluyó que el Tratamiento II (1500 UI de eCG Folligon ®) mostro una mejor respuesta a la superovulación y a la producción de embriones frente al Tratamiento I (1000 UI eCG Folligon ®).
Palabras clave: sincronización, ovulación múltiple, inseminación artificial,
cuerpo lúteo, calidad embrionaria.
xvii
"COMPARISON OF TWO SUPEROVULATION PROTOCOLS USING
DIFFERENT DOSES OF EQUINE CHORIONIC GONADOTROPHIN
(eCG) IN THE PRODUCTION OF SHEEP EMBRYOS"
Author: María Belén Morales Gordón
Tutor: Richard Salazar Silva
Date: March 15th, 2017
ABSTRACT
The effect of a superovulation and embryo transfer treatment on Dorset Poll sheep (n = 16) stimulated in the months of September-October, at Hacienda Zuleta and Anexas S.A. At an altitude of 2885 meters above sea level, on day 0 an intravaginal sponge Chronogest® CR was placed for 9 days, on day 7 Treatment I (1000 IU eGG Folligon ®) Treatment II (1500 IU eCG Folligon ®) was administered, day 9 Administered a prostaglandin F2α analogue (Lutalyse® 10mg) in conjunction with the removal of the sponge, and at the time of estrus a GnRH analogue (Conceptal ® 8μg) was applied, cervical artificial insemination was performed 48 hours post intravaginal sponge removal . Embryonic recovery was performed 6 days later by laparotomy. The number of luteal bodies obtained in treatment I (5.40 ± 3.02) treatment II (9.8 ± 5.20) showed (P <0.05) and that there was a significant difference in the superovulatory response between treatments. The number of embryos obtained treatment I (0.63 ± 1.41) treatment II (2.13 ± 2.30) where (P> 0.05) did not show a significant difference between the treatments. In conclusion the Treatment II (1500 IU of Folligon ® eCG) showed a better response to superovulation and to the production of embryos compared to Treatment I (1000 IU Folligon ® eCG).
Keywords: synchronization, multiple ovulation, artificial insemination,
corpora lutea, embryo quality.
1
CAPITULO I
INTRODUCCIÓN
La población ovina en el Ecuador es de 674.395 animales, representa el
3,64% de la población pecuaria total (Instituto Nacional Estadísticas y
Censos, 2015), comparando con datos de años anteriores se observa una
notable disminución, por lo que establecer biotecnologías reproductivas
tendría un efecto a mediano y largo plazo para revertir este proceso e
incrementar la producción ovina con calidad genética en el país.
La capacidad de reproducción bajo sistemas tradicionales en las diferentes
especies y razas es un factor limitante para acelerar el progreso genético.
En condiciones normales la crianza de ovinos, se obtiene durante toda la
vida productiva de una oveja entre 6 a 8 crías; la transferencia de embriones
permite incrementar el potencial reproductivo de las hembras de alto valor
genético mediante un mayor aprovechamiento de la reserva de ovocitos
que se encuentran en el ovario que mediante estimulación hormonal
desencadena una ovulación múltiple (OM) pudiéndose obtener un número
considerable de embriones en un corto período de tiempo (Gibbons &
Cueto, 2013).
La implementación de la transferencia de embriones (TE) permite disminuir
el intervalo entre generaciones y aumenta la tasa reproductiva de las
hembras en forma similar al rol de la inseminación artificial en los machos
(Palma, 2001), tomando en cuenta que la importación de un animal con alto
valor genético puede ser un proceso largo y costoso; la transferencia de
embriones es más sencilla, con la ventaja de obtener animales de excelente
2
calidad genética, con un adecuado manejo sanitario, logrando evitar la
transmisión de enfermedades, y permitiendo transportar el material
genético a través de grandes distancias (Abecia & Forcada, 2010)
La inmunidad que transmiten las receptoras a las crias es importante pues
reciben anticuerpos especificos para los patógenos de la región, resultando
una ventaja frente a los animales introducidos a mayor edad (Palma, 2001).
La ovulación múltiple y transferencia de embriones (MOET) traducido del
inglés multiple ovulation and embryo transfer permitirá crear programas de
producción más eficientes y con alta rentabilidad, utilizando una menor
inversión inicial, y en los programas de producción existentes permitirá
mejorar la genética a un menor costo (Gibbons & Cueto, 2013).
Dentro de los protocolos MOET el uso eCG presenta ventajas al ser un
tratamiento económico, se administra en una sola dosis lo que evita el
manejo excesivo que resulta ser un factor estresante para los animales
criados en condiciones extensas como los del presente estudio, y dicho
estrés resulta ser perjudicial para el rendimiento reproductivo (Simonetti et
al., 2008).
El objetivo de esta investigación es generar protocolos prácticos probados
aplicables a nuestra realidad nacional, y sentar datos de base para futuras
investigaciones que permitan generar biotecnologías eficientes.
3
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Comparar dos protocolos de superovulación utilizando diferentes dosis de
gonadotropina coriónica equina (eCG) en la producción de embriones
ovinos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Evaluar el efecto de la dosis de 1000 UI y 1500 UI de eCG mediante el
conteo de cuerpos lúteos por laparotomía.
Determinar el número de embriones obtenidos mediante conteo directo por
observación a través del estereomicroscopio.
Analizar los costos parciales de producción de los embriones.
HIPÓTESIS
Hipótesis nula (H0). Los animales tratado con la dosis de 1000 UI de eCG
tienen la misma respuesta ovulatoria que los animales tratados con una
dosis de 1500 UI de eCG.
Hipótesis alternativa (H1). Los animales tratados con una dosis de 1000
UI de eCG tienen diferente respuesta ovulatoria que los animales tratados
con una dosis de 1500 UI de eCG.
4
CAPITULO II
MARCO TEORICO
CICLO ESTRAL DE LA OVEJA
Según varios autores tiene una duración promedio de 17 días, y posee dos
fases una fase folicular considerada desde el día 14 al día 1 y una luteal
más extensa que va del día 2 al día 13, considerando el inicio del estro el
día 0 de este ciclo (Pugh & Baird, 2012).
Este ciclo está controlado totalmente por las hormonas, lo que ha generado
una constante investigación, creando un mejor entendimiento de los
mecanismos de acción fisiológicos en busca de estrategias que puedan
mejorar los resultados y eficiencia de los tratamientos con hormonas
exógenas, incluyendo tratamientos como: sincronización de celos,
inseminación artificial (IA), MOET, aumentando el número de embriones
recuperados y reduciendo la mortalidad embrionaria (Phillips & Jahnke,
2016).
FASE FOLICULAR
Esta fase se extiende desde la luteólisis hasta la ovulación consta de dos
etapas, proestro y estro.
Proestro
Al caer los niveles de progesterona (P4) por debajo de 1ng/ml da lugar a la
lisis del cuerpo lúteo (CL) inducida por la secreción de oxitocina por parte
5
del CL provocando en el endometrio la descarga de PGF2α la cual actúa
reduciendo el flujo sanguíneo al CL y uniéndose a receptores para reducir
la síntesis de P4 inhibiendo el transporte intracelular y dando lugar a una
apoptosis (Aisen, 2004; Gibbons & Cueto, 2013).
Una vez completada la luteólisis la inhibición de la GnRH cesa permitiendo
su síntesis en el hipotálamo basal medio y con los bajos niveles de estradiol
circulante incapaces de inhibir la secreción pulsátil de GnRH hacia el
sistema porta-hipofisario actuando en células de la hipófisis anterior para
una posterior liberación de LH (hormona luteínizante) y FSH (folículo
estimulante) (Galina, 2008; Hafez, E. & Hafez, 2002). Dichas hormonas son
sintetizadas y almacenadas como gránulos secretorios en las células
basófilas de la hipófisis anterior (gonadotropos) para luego ser secretadas
a través de exocitósis, y tienen como tejidos diana las células ováricas
(Gordon, 2004; Universidad Nacional Autónoma De México, 2008)
El aumento de la FSH y LH facilita la maduración de los folículos ováricos
(foliculogénesis), dando lugar al aumento de estradiol circulante cesando la
producción de gonadotrofinas hipofisarias facilitando la presentación del
estro y una consiguiente ovulación (A. Abecia & Forcada, 2010; Aisen,
2004).
Estro
Este debe ser entendido como el momento en que la hembra se muestra
receptiva al macho teniendo una duración de 24-40 horas, siendo más
duradero en hembras prolíficas y adultas. El pico preovulatorio de LH se da
2-6 horas después de iniciado el celo y la ovulación de 24-32 horas del
inicio del mismo (Abecia & Forcada, 2010).
La ovulación se da tras un incremento del estradiol plasmático que produce
un exagerado aumento de la concentración de LH hasta la ovulación donde
el folículo maduro elabora la hormona inhibina cuya función es inhibir la
6
liberación de FSH impidiendo el crecimiento folicular adicional (Aisen,
2004).
FASE LUTEAL
Se extiende desde la ovulación hasta la luteólisis presenta dos etapas el
metaestro y el diestro.
Metaestro:
Empieza luego de la ovulación cuando el folículo de Graff se convierte en
cuerpo hemorrágico, a consecuencia de la secreción preovulatoria de LH,
las células de la granulosa se transforman en células luteínicas y secretan
P4 (Aisen, 2004).
Diestro
Durante esta fase los niveles plasmáticos de P4 aumentan
progresivamente alcanzando valores entre 1-5 ng/ml, durante esta fase se
observan ondas de desarrollo folicular, las 2 primeras terminaran en atresia
folicular y la tercera dará un folículo ovulatorio. Durante esta etapa la
progesterona ejerce una retroalimentación negativa, limitando la liberación
de GnRH y LH la secreción constante de P4 actúa en el endometrio
incrementando el almacenamiento de fosfolípidos y actividad enzimática
para la posterior conversión del ácido araquidónico a PGF2α, para que se
dé a cabo la luteólisis si no hay implantación (A. Abecia & Forcada, 2010;
Pugh & Baird, 2012).
Al inicio de la gestación la P4 es muy importante, pero la suplementación
de P4, puede generar altos niveles exógenos inhibiendo la producción
endógena por retroalimentación negativa (Gordon, 2004).
Una hormona que posiblemente tenga una acción antiluteolítica indirecta
es la GnRH que actúa suprimiendo la secreción de estradiol 17β y PGF2α
foliculares, mejorando en yeguas las tasas de gestación, administrada de
7
8-11 días luego de la ovulación y la IA. y en ovinos estudios indican que
puede mejorar la supervivencia embrionaria al día 12 de la gestación
(Gordon, 2004).
Figura 1. Evolución de los niveles plasmáticos de esteroides ováricos y
de gonadotropinas hipofisarias durante el ciclo estral de la oveja
(Tomado de Abecia & Forcada 2010)
DESARROLLO DE ONDAS FOLICULARES
El número de ondas foliculares en un ciclo puede variar en caprinos entre
2-5 ondas, pero en los ovinos acontecen 3 o 4 pero con mayor frecuencia
se desarrollan 3 ondas (Aisen, 2004; Seekallu et al., 2010). La regulación
de la dinámica folicular está dada por las gonadotrofinas, en interacción con
la P4, niveles superiores a los normales durante la fase lútea favorecen el
recambio folicular afectando, evitando la dominancia folicular (Alfonso
Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004).
En la fase folicular la tasa ovulatoria está determinada por los niveles de
FSH que controla el número de folículos que maduraran otros factores que
también intervienes son: genéticos, nutricionales, relación endócrinas entre
folículos. La secreción de FSH es regulada por retroalimentación de
hormonas foliculares que son los estrógenos y la inhibina, existe correlación
8
negativa entre concentraciones de estradiol y FSH. (Aisen, 2004; Seekallu
et al., 2010)
FACTORES QUE REGULAN EL CICLO ESTRAL
Fotoperiodo
Los ovinos son animales poliéstricos estacionales, su actividad
reproductiva va a desarrollarse en función de la cantidad de horas luz
(fotoperiodo), en el hemisferio norte, en zonas cercanas a la línea ecuatorial
los cambios del fotoperiodo son menos marcados, siendo la época de
reproducción influenciada por otros factores como temperatura,
precipitación y disponibilidad de alimento (Aisen, 2004; Galina, 2008).
Nutrición
La administración de una alimentación suplementaria con altos niveles
energéticos generalmente con granos con raciones que van de 140- 450 g.
denominado “flushing”, entre 2 a 3 semanas previas al empadre, induciendo
a un aumento en la condición corporal con el fin de aumentar la tasa de
ovulación y sobrevivencia embrionaria (Pugh & Baird, 2012; Universidad
Nacional Autónoma De México, 2008).
Efecto macho
Es un factor social que juega un papel importante en la fisiología
reproductiva, en ovejas previamente aisladas del macho en un lapso de 3
a 4 semanas, el mecanismo de acción es mediante la presencia del macho
induce un estímulo capaz de alterar la secreción pulsátil de LH a tal punto
de ser capaz de estimular la ovulación dentro de los 6 días siguientes, dicho
evento se favorecido con el inicio del celo en varias ovejas, induciendo al
celo a otras ovejas del grupo (A. Abecia & Forcada, 2010; Pugh & Baird,
2012).
9
MÉTODOS DE SINCRONIZACIÓN DEL ESTRO
Tiene como objetivo agrupar los estros, para realizar inseminación artificial,
transferencia de embriones o sincronizar partos mediante la aplicación de
tratamientos hormonales.
Sincronización utilizando progestágenos
El mecanismo de acción de los progestágenos sintéticos utilizados para
sincronizar el estro, es inhibir la secreción de LH de la Hipófisis, evitando la
foliculogénesis (Hafez, E. & Hafez, 2002).
Consiste en la aplicación de un dispositivo que puede ser una esponja o
un implante denominado CIDR impregnado con una fuente de
progesterona, y es aplicada por vía vaginal, imitando la fase luteal del ciclo
estral y al final del proceso se aplica una gonadotropina capaz de favorecer
la respuesta ovulatoria (A Abecia, Forcada, & González-Bulnes, 2012).
Sincronización utilizando PGF-2α
Se realiza mediante la aplicación de un análogo de la PGF-2α induciendo
una regresión temprana del CL, interrumpiendo la fase luteal y
desencadenando una nueva fase folicular, este método no es efectivo si no
existe la presencia de un CL funcional (Universidad Nacional Autónoma
De México, 2008). Consiste en una primera aplicación de la hormona que
provocara luteólisis solo en las hembras que presenten un CL, 9 a 11 días
posteriores se aplica una segunda dosis donde las hembras que no
respondieron a la primera aplicación tendrá ya un CL funcional, y las que
respondieron tendrán un CL a mitad del ciclo y también tendrán respuesta
(A Abecia et al., 2012).
MÉTODOS DE SUPEROVULACIÓN
Pese a los intensivos trabajos de investigación realizados por años la
respuesta ovulatoria es variable y poco predecible, lo que sigue
10
representando el factor limitante en este tipo de biotecnología reproductiva
(Busch & Waberski, 2007). Esta idea coincide con otros autores que
mencionan que existen otros factores que pueden afectar la respuesta
ovulatoria, tales como: hormonales, ambientales, intrínsecos de cada
animal.
Tratamiento con gonadotropina coriónica equina (eCG)
Una de las primeras hormonas usadas comercialmente para la
superovulación, es una glucoproteína con subunidades alfa y beta,
similares a la FSH Y LH, es secretada por las copas endometriales en el
útero equino como una gonadotropina placentaria, entre los días 41 al 85
de gestación (Hafez, E. & Hafez, 2002) tiene acciones bilógicas similares a
la actividad FSH (80%) y LH (20%) y tiene una larga vida media de 63 horas
debido a su alto contenido de ácido siálico (Barrett, Bartlewski, Batista-
Arteaga, Symington, & Rawlings, 2004; Hafez, E. & Hafez, 2002).
El tratamiento de ovulación múltiple utilizando eCG presenta ventajas al ser
un tratamiento económico, puede administrase en una sola dosis lo que
evita el manejo excesivo que resulta ser un factor estresante para los
animales criados en condiciones extensas como los del presente estudio,
y dicho estrés resulta ser perjudicial para el rendimiento reproductivo
(Simonetti et al., 2008).
Tratamiento con FSH
Es una alternativa para la ovulación múltiple la presentación comercial es a
partir de extractos de hipófisis de especie ovina o porcina, por tanto su
relación FSH:LH puede variar (A. Abecia & Forcada, 2010).
La FSH tiene una vida media corta, por lo que necesita una administración
frecuente para poder mantener concentraciones séricas capaces de
generar una respuesta superovulatoria, es necesario administrar la
hormona entre 4 a 8 veces en un lapso de 12, y coincidiendo la última
11
aplicación 12 horas después de retirada la esponja. Se obtiene mejores
resultados de aplicando la hormona en dosis decreciente, que a dosis
constantes, este tratamiento también puede ir acompañado de una sola
dosis de eCG (A. Abecia & Forcada, 2010; Gibbons & Cueto, 2013).
TIPOS DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL
El objetivo de la inseminación artificial es depositar el material seminal en
el aparato genital de la hembra en el sitio y momento adecuado de tal modo
que este alcance el oviducto y fecunde el óvulo (Aisen, 2004; Evans &
Maxwell, n.d.)
IA Vaginal
Es el tipo de IA más sencilla requiere poco entrenamiento, es necesario
emplear semen fresco con una alta concentración espermática, mayor a
300 millones para que esta técnica sea exitosa, se deposita el semen
únicamente en la vagina sin localizar el cuello uterino (Aisen, 2004)
IA cervical
Esta técnica necesita menor concentración de espermatozoides 100
millones con la ayuda de un vaginoscopio y una fuente de luz se ubica la
entrada al cérvix y es depositado el materia seminal en la entrada del cérvix
ya que es poco probable poder atravesar los anillos cervicales (Abecia &
Forcada, 2010; Sanchez, Mejia, & Manzur, 2014).
IA intrauterina
Es un método invasivo de IA, pero permite la utilización de semen fresco o
congelado consiste en que mediante laparoscopia el tracto reproductivo es
localizado y el semen es inyectado en el lumen del útero (Bearden, Fuquay,
& Willard, 2004).
12
COLECTA DE EMBRIONES
Existen dos técnicas: La quirúrgica que consiste en realizar una
laparotomía media y determinar la respuesta ovulatoria (conteo de cuerpos
lúteos), exponer el útero y mediante una sonda Foley generar una corriente
de arrastre con un medio adecuado y se colecta en un filtro para embriones.
En la no quirúrgica, son procedimientos poco experimentados, requiere de
un profesional que maneje bien esta técnica (Alfonso Abecia & Forcada,
2010; Gibbons & Cueto, 2013). Para el manejo del embrión es necesario
utilizar medios e insumos no tóxicos y estériles (Phillips & Jahnke, 2016).
CALIFICACIÓN EMBRIONARIA
Tabla 1. Valoración del estadio de desarrollo embrionario
Estadio
Desarrollo
Característica Edad Embrionaria post
celo
0 Sin Fertilizar
1 2-4 células 24-60 horas
2 8 células Día 3 (72 horas)
3 16 células: Mórula temprana Día 4 (96 horas)
4 Mórula Día 5
5 Blastocisto temprano Día 5 - 6
6 Blastocisto Día 6
7 Blastocisto expandido Día 7
8 Blastocisto eclosionado Día 8
Adaptado de (Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004)
13
Tabla 2. Valoración de la calidad embrionaria
Calidad Característica Descripción
1 Excelente Embrión ideal, esférico, simétrico con células
de tamaño, color y textura uniforme. Desarrollo
embrionario correspondiente al día de
recolección. No existen defectos visibles los
blastómeros son visibles y la zona pelúcida
está intacta.
2 Bueno Posee imperfecciones triviales, el embrión
tiene pocos blastómeros desprendidos de la
masa celular y/o posee una pequeña cantidad
de vesículas. Su forma puede ser ligeramente
irregular.
3 Regular El embrión posee defectos definidos: detritus
celulares, forma irregular, color muy oscuro o
muy claro y/o ligero agrietamiento de la zona
pelúcida. Pocas células degeneradas,
vesículas y presencia de blastómeros
desprendidos.
4 Malo El embrión posee severos defectos: los
correspondientes a la calidad 3 más desarrollo
retardado, seria ruptura de la zona pelúcida (el
embrión puede estar parcialmente fuera de la
misma), forma muy asimétrica, tendencia a la
desintegración con granulación y vacuolización
de los blastómeros. Incluye a los estados hasta
8 células y la degeneración. Esta categoría de
embriones no es transferible.
Clasificación convenida por la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria
(IETS) Adaptado de (Gibbons & Cueto, 2013)
14
CAPITULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
CARACTERÍSTICAS DE LA ZONA DE ESTUDIO.
La investigación se desarrolló en la Hacienda Zuleta y Anexas S.A, ubicada
en la provincia de Imbabura, Cantón Ibarra, Parroquia Angochagua. El
relieve de la parroquia es irregular, su altitud va desde los 2589 msnm hasta
los 3899 msnm de altitud. La precipitación oscila entre los 700 mm y 1.500
mm, con frecuencia se presenta neblina y lluvia en la zona, aunque en los
últimos años han sido recurrente las sequías. La temperatura en la zona
varía entre los 10°C y 16°C (GAD, 2015).
Figura 2. Ubicación geográfica Hacienda Zuleta y Anexas S.A.
MATERIALES
Materiales químicos y biológicos
- Unidades experimentales.
15
- Esponjas intravaginales (Chronogest® CR)
- Hormona eCG (Folligon ®)
- Análogo de la prostaglandina F2α dinoprost (Lutalyse®)
- Análogo de la GnRH, acetato de buserelina (Conceptal ®)
- Selenio ( Seleben E)
- Bio-Life® Advantage Embryo collection medium
- Vigro holding plus
- Clorhexidina
- Alcohol yodado
- Agua destilada
- Cloruro de sodio
- Xilacina
- Ketamina
- Antibiótico (Shotapen® LA)
- Alcohol
- Lidocaína sin epinefrina 1%
Equipos
- Camilla de IA para ovinos
- Vaginoscopio
- Equipo quirúrgico básico
- Lámpara de cabeza
- Termo
- Termómetro
- Maquina rasuradora
- Estereomicroscopio
- Ecógrafo
- Pipeta Automática
Insumos médicos
- Catéter Foley # 10 3cc
- Pipeta para IA
16
- Jeringuilla 50ml
- Caja Petri cuadriculada
- Punta para pipetas
- Filtro Emcon
- Sutura Vicryl 0
- Campos estériles
- Gasas estériles
- Guantes quirúrgicos estériles
- Toallas papel
- Caja jeringuillas 3ml
- Caja jeringuillas 5ml
- Caja agujas
- Guantes manejo
Unidades Experimentales
Las ovejas de 2-4 años con condición corporal entre 3-3,5 y con pesos entre
65-75 kg que se encontraban dentro del calendario reproductivo (época
reproductiva), y cumplían las características fenotípicas de la raza. Los
animales en el tratamiento 1 y 2 se encontraron bajo las mismas
condiciones de manejo, nutricionales, condición corporal, tipo de
instalaciones, además se utilizaron hormonales de los mismos lotes de
fabricación.
Tipo de investigación
El tipo de investigación que se realizó fue experimental, de campo y
laboratorio. Y se utilizó un muestreo estratificado para la selección de las
unidades experimentales.
17
METODOLOGÍA
TRATAMIENTOS
PROTOCOLO TRATAMIENTO 1.
Día 0: A las 9am se colocó la esponja intravaginal (EIV) Chronogest® CR,
y se aplicó 1ml de Selenio (Seleben E®) vía intramuscular (IM).
Día 1, 2, 3, 4: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida
de la EIV.
Día 5: Se retiró la primera EIV Chronogest® CR, y se reemplazó por una
nueva.
Día 6: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV.
Día 7: Se administró 1000 UI de eCG (Folligon ®) vía IM.
Día 8: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV.
Día 9: A las 12pm se retiró la segunda EIV Chronogest® CR, y se
administró un análogo de la prostaglandina F2α (Lutalyse® 10mg).
Día 10: Se detectó celo a las a las 24 horas post retiro de EIV. Se aplicó un
análogo de GnRH (Conceptal ® 8µg) al momento del celo.
Día 11: Se realizó la inseminación artificial (IA) a las 48 horas post retiro de
EIV.
Día 16: A las 7 am se inició el ayuno de agua y alimento de los animales,
24 horas previas a la laparotomía.
Día 17: A partir de las 7am realizó el lavado y recuperación de embriones.
18
Adaptado de (Alfonso Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004; Azawi & Al-
Mola, 2011; Blanco, Simonetti, & Rivera, 2003; Durán, 2013; Gibbons &
Cueto, 2013)
PROTOCOLO TRATAMIENTO 2.
Día 0: A las 9am se colocó la esponja intravaginal (EIV) Chronogest® CR,
y se aplicó 1ml de Selenio (Seleben E®) vía intramuscular (IM).
Día 1, 2, 3, 4: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida
de la EIV.
Día 5: Se retiró la primera EIV Chronogest® CR, y se reemplazó por una
nueva.
Día 6: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV.
Día 7: Se administró 1500 UI de eCG (Folligon ®) vía IM.
Día 8: Se observó por la mañana y tarde que no existiera pérdida de la EIV.
Día 9: A las 12pm se retiró la segunda EIV Chronogest® CR, y se
administró un análogo de la prostaglandina F2α (Lutalyse® 10mg).
Día 10: Se detectó celo a las a las 24 horas post retiro de EIV. Se aplicó un
análogo de GnRH (Conceptal ® 8µg) al momento del celo.
Día 11: Se realizó la inseminación artificial (IA) a las 48 horas post retiro de
EIV.
Día 16: A las 7 am se inició el ayuno de agua y alimento de los animales,
24 horas previas a la laparotomía.
Día 17: A partir de las 7am realizó el lavado y recuperación de embriones.
19
Adaptado de: (Alfonso Abecia & Forcada, 2010; Aisen, 2004; Azawi & Al-
Mola, 2011; Blanco et al., 2003; Durán, 2013; Gibbons & Cueto, 2013)
Figura 3. Esquema del Protocolo de superovulación y transferencia de
embriones.
CEIV: Colocación de EIV. Se: Seleben E. CEIV*: Retiro de 1era EIV y colocación de una nueva. eCG: Administración IM de eCG. REIV+PF2α: Retiro de EIV + aplicación IM de análogo de prostaglandina F2α. DC + GnRH: Detección de celo + aplicación IM de análogo de GnRH. IA: inseminación artificial. LRE: Lavado y recuperación de embriones.
Procedimiento para colocación de esponja intravaginal
- Se desinfectó el aplicador de esponjas (Chronogest® CR) con
amonio cuaternario al 0,1%.
- Se colocó la EIV Chronogest® CR en la extremidad posterior del
aplicador de esponjas Chronogest® CR.
- Se abrió la vulva e introdujo el aplicador lubricado, se lo desliza
suavemente hasta el fondo de la vagina, se retiró ligeramente el
aplicador, se empujó la esponja con ayuda del embolo hasta que
salga del tubo aplicador.
- Se retiró de la vagina el tubo aplicador y el émbolo del aplicador
suavemente (Daza, 1997).
20
Técnica de inseminación artificial cervical
La IA se realizó a las 48 horas post retiro de EIV.
- Registrada la oveja se la colocó en la camilla con los miembros
posteriores levantados.
- Se realizó una limpieza de la vulva con una toalla de papel.
- Se introdujo el vaginoscopio, empleando una lámpara de cabeza,
dirigiendo la luz hacia la vagina, a través del vaginoscopio, hasta
ubicar el orifico de entrada del cérvix.
- Se introdujo la pipeta en el cérvix lo más profundo posible, hasta
sentir resistencia, se empujó el embolo hasta depositar 0,20 ml de
semen con una concentración de aproximadamente 100 millones de
espermatozoides, se retiró la pipeta y luego el vaginoscopio
- Una vez terminada la IA, se bajó a la oveja y se la dejo de pie
(Sanchez et al., 2014)
Técnica de lavado y recuperación de embriones
La recuperación de embriones debido a las características anatómicas de
la hembra ovina se realizó mediante laparotomía.
- El preanestésico utilizado fue xilazina 2% IM a una dosis de
0,2mg/kg y como anestésico ketamina 5% IV a una dosis de
0,2mg/kg, y un anestésico local lidocaína al 2% (Gibbons & Cueto,
2013; Pugh & Baird, 2012)
- Se colocó a la oveja en la camilla con la cabeza hacia abajo, se
sujetó a la oveja, se realizó antisepsia y desinfección del campo
operatorio, se realizó la incisión de 8 a 10cm, a 3 cm por delante de
la ubre, en la línea alba, hasta entrar a cavidad abdominal,
exteriorizar los ovarios y útero (Morrow et al., 1994; Pugh & Baird,
2012).
- Se realizó el conteo y registro de los cuerpos lúteos (CL), se perfora
el cuerno uterino con una aguja no traumática, se inserta la sonda
Foley en la luz uterina, creando una corriente de arrastre con 20-25
21
ml de medio Bio-LifeTM Advantage Embryo collection medium
(Morrow et al., 1994), mediante técnica de la jeringa, el medio se
inyectó con jeringa a través de la sonda Folley en cada cuerno y se
recuperó el medio a través de la jeringuilla y el medio se colocó en
un filtro Emcon (Phillips & Jahnke, 2016).
- Una vez terminado el lavado de los cuernos uterinos, se suturó los
planos quirúrgicos, el plano muscular-aponeurótico con una sutura
reabsorbible, y el cutáneo con una sutura no absorbible. Se
administró un antibiótico de amplio espectro y larga acción,
analgésico y un análogo de la prostaglandina F2α (Aisen, 2004;
Gibbons & Cueto, 2013).
Búsqueda y clasificación de embriones
Se vertió el medio recuperado sobre una caja Petri de búsqueda
(cuadriculada) de embriones con un aumento de 10X con el
estereomicroscopio. Conforme fueron encontrados los embriones se
aspiraron y se colocaron en una caja Petri con medio de mantenimiento
Holding, para su clasificación convenida por la Sociedad Internacional de
Transferencia Embrionaria (IETS) (Tabla 2) con un aumento de 40X (Aisen,
2004; Phillips & Jahnke, 2016).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Tamaño de la muestra
Debido a que los animales utilizados en este estudio debían cumplir con
criterios de inclusión para su selección, dejó una población pequeña. Para
calcular la muestra se utilizó la siguiente ecuación (Jaramillo & Martínez,
2010).
n= ( z^2 pq ) / d^2
n= [( 1.96 ) ^ 2 ( 0.5 ) ( 1 - 0.5)] /[(0.05)]^2
n=384
n= tamaño de la muestra
22
z= nivel de confianza 95%=1,96 p=probabilidad de que ocurra el evento q= 1-p, probabilidad que no ocurra el evento d= error estimado
Debido a que el tamaño de la muestra es mayor a la población fue
necesario realizar un ajuste de la muestra, utilizando la siguiente ecuación
(Jaramillo & Martínez, 2010).
na= n/(1+(n-1)/N) na=384/(1+(384-1)/16) na=15,42
na= tamaño de la muestra ajustado n= tamaño de la muestra N= total de individuos en la población
Los resultados fueron registrados en los formularios respectivos, y
digitalizados en hoja de cálculo Excel 2013. Los resultados del número de
cuerpos lúteos observados mediante laparotomía, fueron evaluados
estadísticamente mediante análisis de varianza simple. Debido a que los
datos no presentaban distribución normal se realiza la transformación
logarítmica de su logaritmo natural con el programa, PROGRAMA
STATGRAPHICS Centurion XVI versión 16.1.18 (32bits) considerando la
variable dependiente, el número de cuerpos lúteos producido y variable
independiente el tratamiento.
Los resultados del número de embriones obtenidos mediante lavado uterino
fueron evaluados estadísticamente mediante análisis de varianza simple
con el programa, PROGRAMA STATGRAPHICS Centurion XVI versión
16.1.18 (32bits) considerando la variable dependiente, el número de
embriones viables y variable independiente el tratamiento.
23
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El número de cuerpos lúteos obtenidos (Tabla 3) en el tratamiento 1 fue de
5,40 ±3,02 mientras que para el tratamiento 2 fue de 9,8±5,20
encontrándose una diferencia estadísticamente significativa (p ˂0,05) entre
el promedio de cuerpos lúteos del T1 y el T2. Estos resultados confirman la
hipótesis alternativa demostrando que los animales del T1 tienen diferente
respuesta ovulatoria que los animales del T2.
Tabla 3. Numero de cuerpos lúteos observados mediante
laparotomía.
Tratamiento n cuerpos
lúteos
Desviación
estándar
Análisis
estadístico*
Razón-F Valor-P
T1
(1000 UI eCG)
8 5,40 ±3,02 4,95 0,0431
T2
(1500 UI eCG)
8 9,8 ±5,20
* Análisis de Varianza del logaritmo natural.
: Promedio.
24
Los resultados obtenidos son similares a los reportados por Blanco et al.,
(2003) quienes obtuvieron 6,2±0,8 con una dosis de 1200 UI de eCG y
11±3,0 cuerpos lúteos con una dosis de 1600 UI de eCG, encontrando una
diferencia significativa entre los tratamientos.
También estos resultados coinciden con los obtenidos por Azawi et al.,
(2011) los mismos que obtuvieron 7,33±0,54 cuerpos lúteos utilizando una
dosis de 1200 UI de eCG.
Según Donaldson (1982) citado por Liu et al. (2007) un factor determinante
en la respuesta al tratamiento superovulatorio además de la dosis
administrada de eCG son las características intrínsecas de cada individuo
sus estudios muestran que solamente el 68% de las hembras respondieron
al tratamiento y el 32% restante no tuvo respuesta a la estimulación, por
consiguiente siempre se debe tener presente que un porcentaje de
hembras no responderá al tratamiento hormonal de ovulación múltiple. En
el presente estudio en el T1 solamente 1 de las 8 ovejas tratadas no tuvo
respuesta, representando un 12,5% de las ovejas que no respondieron al
tratamiento a diferencia del T2 donde 8/8 ovejas respondieron a la
estimulación, consiguiendo una respuesta del 100%.
Los resultados obtenidos confirman lo mencionado por Bartlewski et al.,
(2016), donde indica que a pesar del extenso conocimiento de la fisiología
ovárica, particularmente de dinámica folicular y su supuesta relación con el
resultado superovulatorio, ha proporcionado valiosas pautas e indicios para
predecir la respuesta superovulatoria anticipada de las ovejas donantes.
Sin embargo, al existir una continua falta de consistencia en los
rendimientos superovulatorios entre diversos estudios, sugiere que es
necesario cambiar y ampliar la orientación de los estudios, más allá de
modificaciones en protocolos de estimulación ovárica, sino enfocarse ahora
en la evaluación de aspectos relacionados con la condición gonadal, tales
como: la medición de las concentraciones séricas de hormonas ováricas
(inhibina A, estrógeno, FSH y LH endógena), evaluar la presencia y número
25
de estructuras ováricas (folículos y CL), además el flujo sanguíneo en el
tracto reproductivo.
La caracterización de perfiles hormonales podría enfocarse a establecer
dichos perfiles en base a características específicas como: razas (prolíficas
y no prolíficas), edad, historia reproductiva (nulíparas, multíparas), regiones
geográficas y temporadas, incluso para diferentes tipos de progestágenos
usados en la sincronización del estro. Factores hemodinámicos podrían
tener una interacción en la salud folicular y la calidad del ovocito que a
través de ecografía Doppler permitiría establecer una relación individual en
la respuesta ovulatoria (Bartlewski et al., 2015, 2016).
Otro de los factores que puede dar una variación en la respuesta individual
a la estimulación hormonal según Bruno-Galarraga et al. (2015) está el
estado fisiológico del ovario y por el número de folículos al iniciar el
tratamiento hormonal. Lo cual es corroborado por González-Bulnes et. al.,
(2000, 2002) citado por (Mossa, Duffy, Naitana, Lonergan, & Evans, 2007);
demostrando que en su estudio los animales con el mayor número de
folículos (≥8) con un diámetro ≥ 2 mm denominado grupo alto al iniciar la
superovulación produjeron más cuerpos lúteos (P <0,05) con relación a los
que presentaban menos folículos (<7) denominado grupo bajo al inicio de
la superovulación. Además el número de embriones totales, y de buena
calidad fue mayor en el grupo alto pero sin existir una diferencia
estadísticamente significativa en cuanto a dicha calidad, y tampoco se vio
afectada la tasa de recuperación embrionaria.
La variabilidad en el número de folículos es aún desconocida, pero podría
estar influenciada por factores intrínsecos como el número de folículos
primordiales al nacer (Erickson, 1966), mecanismos genéticos (Spearow &
Bradfoed, 1983), niveles hormonales o por factores externos como nutrición
(Lucy et al., 1991) condiciones ambientales (Kafi & McGowan, 1997) citado
por (Mossa et al., 2007)
26
En cuanto al número de folículos al inicio del tratamiento superovulatorio
Bartlewski et al. (2016) establece que no se relaciona con la respuesta
ovulatorias, pero establece una relación entre el número de folículos de
tamaño mediano es decir 4 mm de diámetro detectados 12 horas después
de la primera inyección de pFSH con el número CL y embriones viables
después de la superovulación. Puesto que a pesar de la existencia de los
receptores de gonadotropina sólo una parte de folículos podría utilizar FSH
exógena para el crecimiento que culminara en la ovulación y posterior
formación del CL.
Según varios autores mencionan que la dominancia folicular tiene un efecto
perjudicial sobre el resultado superovulatorio en ovejas, disminuyendo el
número de ovulaciones, viabilidad y recuperación embrionaria, asociando
la presencia de un folículo dominante con disminución en la tasa de
ovulación y recuperación embrionaria (Bartlewski et al., 2016).
Tabla 4. Embriones obtenidos mediante lavado uterino, y
clasificación a través del esteromicroscopio.
Tratamiento n
embriones
obtenidos
por oveja
EV (%) ENV
(%)
Análisis
estadístico*.
Razón-
F Valor-P
T1 (1000 UI
eCG) 8 0,63±1,41 5/5 (100) 0 (0)
2.48 0.1374 T2 (1500 UI
eCG) 8 2,13±2,30
17/19
(89,47)
2/19
(10,53)
: Promedio. *Análisis de varianza. EV: Embriones viables. ENV: Embriones no viables
27
El promedio de embriones viables obtenidos (Tabla 4) en el tratamiento 1
fue 0,63±1,41 embriones por donadora. En el tratamiento 2 el número de
embriones viables fue 2,13±2,3. Lo que indica que no hay diferencia
estadísticamente significativa (p ˃0,05) entre los embriones viables del T1
y el T2.
Para el T1 con un promedio de 0,63±1,41 embriones obtenidos por oveja
es inferior frente al promedio reportado por Blanco et. al (2003) donde
obtuvo un promedio de 1,0±0,5 embriones por oveja. y para el T2 el
resultado 2,13±2,3 embriones obtenidos por oveja es superior frente a
1,2±0,6 embriones por oveja reportado por Blanco et. al (2003) a pesar de
tener una dosis menor para la estimulación.
Los 0,63±1,41 embriones recuperados por donadora son diferentes a los
reportados por Azawi et al., (2011) en cuyo estudio se recuperaron
4,32±0,56 embriones a una dosis de 1200UI de eCG
Los estudios anteriores (Jabbour y Evans, 1991, Mahmood et al., 1991,
Chagas e Silva et al., 2003) demostraron que una dosis alta de eCG puede
causar el desarrollo de folículos anovulatorios probablemente debido a la
larga vida media de esta hormona. Dichos folículos con una alta producción
hormonal podrían producir elevadas concentraciones de estradiol (Jabbour
y Evans, 1991), afectando el medio uterino interfiriendo con el transporte
de óvulos al momento de la captura de óvulos por las fimbrias (Murray et
al., 1994) y espermatozoides a través del tracto genital femenino (Evans y
Armstrong, 1984) afectando la recuperación de embriones citado por
(Blanco et al., 2003; Simonetti et al., 2008).
En estudios que comparan tratamiento superovulatorios utilizando pFSH y
eCG, coinciden que la pFSH produjo mayor numero de embriones viables
y mejor desarrollados, en comparación con la eCG. Posiblemente porque
la pFSH, al ser una glucoproteina natural, con menor vida media que es
captada y metabolizada más fácil y eficientemente (Blanco et al., 2003;
Garzón, Urrego, & Giraldo, 2007).
28
Bartlewski et al. (2016) reporto que folículos ≥4 mm de diámetro el día de
la remoción de la EIV se asoció con una aparición temprana de estro y
aumento de la LH circulante y una mayor tasa de ovulación. Sin embargo,
la tasa de recuperación de embriones disminuyó significativamente en
ovejas con picos de LH preovulatorios tempranos, por consiguiente bajas
en la recuperación de embriones que pueden anular el número de
ovulaciones en ovejas con un alto número de pequeños folículos presentes
al inicio de la estimulación hormonal, a pesar de ello no es clara la relación
que existe por lo que sugiere más estudios para aclarar dichas relaciones
en ovejas.
Existen factores antes mencionados los que en conjunto van a inferir y
modificar la respuesta ovulatoria y la recuperación embrionaria, para lo cual
sería necesario evaluar más aspectos como perfiles hormonales que deben
ser evaluados durante todo el tratamiento hasta la recuperación
embrionaria, además características y cambios en los ovarios antes,
durante y después de la estimulación hormonal, que podrían tomarse en
cuenta para futuros estudios.
En cuanto al análisis de los costos parciales de producción de los
embriones en este estudio (Tabla 5) se determinó que en el T1 que incluye
8 donadoras es de 739,68 dólares y de 795,28 dólares en el T2, dividido
para el número de embriones viables obtenidos por tratamiento en T1: 5
embriones viables, da un costo parcial de 147,94 dólares por embrión
viable y en el T2: se obtuvo 17 embriones, dando un costo parcial de 46,78
dólares por embrión viable.
29
Tabla 5. Costos parciales de producción de embriones ovinos por
tratamiento y por donadora.
T1 T2
Ovejas Tratadas 8 8
Costo de sincronización y
superovulación $ (por donadora)
36,11 43,06
Costo de Inseminación Artificial
$ (por donadora)
2 2
Costo de lavado y recolección de
embriones $ (por donadora)
54,66 54,66
Costo total $ (por donadora) 92,77 99,57
Costo por tratamiento 742,15 796,55
Embriones Viables 5 17
Costo parcial por embrión 148,43 46,86
El costo parcial de la superovulación (Tabla 5) en el T1 que incluye 8
donadoras es de 739,68 dólares y de 795,28 dólares en el T2, dividido para
el número de embriones viables obtenidos por tratamiento en T1: 5
embriones viables, da un costo parcial de 147,94 dólares por embrión
viable y en el T2: se obtuvo 17 embriones, dando un costo parcial de 46,78
dólares por embrión viable.
Estos valores nos indican que con la aplicación del T2 es posible obtener
mayor número de embriones por lo tanto disminuyendo los costos parciales
de producción, permitiéndonos obtener mayor rentabilidad en una
producción comercial.
30
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES
- El número de cuerpos lúteos obtenidos 9,8±5,20 en el tratamiento 2
con 1500 UI de eCG mostro una mejor respuesta ovulatoria que el
tratamiento 1 con 1000 UI eCG donde se obtuvo 5,40±3,02 cuerpos
lúteos.
- El número de embriones obtenidos en el tratamiento 1 (0,63±1,41)
con 1000 UI de eCG fue menor que el número de embriones
obtenidos en el tratamiento 2 (2,13±2,30) con 1500UI de eCG. Sin
embargo no hay diferencia estadísticamente significativa entre los
tratamientos.
- El costo parcial de producción por embrión viable con el tratamiento
1 de 1000 UI de eCG fue 148,43 dólares, y el costo parcial por
embrión viable y en el tratamiento 2 con 1500 UI de eCG fue 46,86
dólares, demostrando que el tratamiento 2 produce embriones con
menor costo parcial.
31
BIBLIOGRAFÍA
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35
ANEXOS
36
ANEXO 1. REGISTRO DE PROTOCOLO DONADORAS
N° ID
Donadora
DIA 0
COLOCACION
EIV
DIA 5
CAMBIO
EIV
DIA 7
DIA 9
RETIRO
EIV
DETECCION
CELO SERVICIO
FECHA
LAVADO
Fecha Se eCG + PF2α Fecha GnRH Fecha Id macho
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
37
Elaboración: El autor
11
12
13
14
15
16
38
ANEXO 2. REGISTRO DE COLECTA DE EMBRIONES
Elaboración: El autor
ID hembra:………………………………………….
ID macho:…………………………………………..
Número de cuerpos
lúteos por ovario
Izquierdo:
Derecho:
Embriones colectados
Estadio de desarrollo Calidad
1 2 3 4
Sin Fertilizar
2-4 células
8 células
16 células: Mórula temprana
Mórula
Blastocisto temprano
Blastocisto
Blastocisto expandido
Blastocisto eclosionado
TOTAL EMBRIONES:
TOTAL OVOCITOS SIN FERTILIZAR
39
ANEXO 3. ANÁLISIS DE COSTO PARCIALES TRATAMIENTO 1
COSTO PARCIAL DE PRODUCCION TRATAMIENTO 1
COSTO DE SINCRONIZACION Y SUPEROVULACIÓN
ITEM
valor
frasco ($)
presentación
(ml/uni)
dosis
(ml/uni)
Valor
unitario
($)
Seleben E® 14,50 100,00 2,00 0,29
Chronogest® CR 1era 150,00 25,00 1,00 6,00
Chronogest® CR 2da 150,00 25,00 1,00 6,00
Gel Lubricante 5,00 30,00 3,00 0,50
Guantes Manejo 8,00 100,00 6,00 0,48
Folligon ® 13,90 5,00 5,00 13,90
Lutalyse® 31,50 30,00 2,00 2,10
Conceptal ® 27,70 10,00 2,00 5,54
Jeringuillas 0,13 1,00 10,00 1,30
SUBTOTAL 36,11
COSTO DE INSEMINACION ARTIFICIAL
Frasco colector de semen 0,50 1,00 1,00 0,50
Catéter de Inseminación 1,50 1,00 1,00 1,50
SUBTOTAL 2,00
COSTO DE LAVADO Y RECOLECCION DE EMBRIONES
Xilacina 20,00 30,00 1,00 0,67
Ketamina 25,00 30,00 0,30 0,25
Jeringuillas 0,13 1,00 5,00 0,65
Hoja de Bisturí 12,00 100,00 1,00 0,12
Lidocaína 3,50 50,00 6,00 0,42
Campo operatorio 1,20 1,00 1,00 1,20
Gasas estériles 8,00 100,00 3,00 0,24
Guantes Quirúrgicos 0,50 1,00 2,00 1,00
40
Sutura Reabsorbible 36,00 12,00 1,00 3,00
Sonda Foley 4,50 1,00 1,00 4,50
Filtro Emcon 21,66 1,00 1,00 21,66
Jeringuillas baja citotoxicidad 30,00 100,00 1,00 0,30
Medio de lavado 55,00 1000,00 50,00 2,75
Puntas para pipeta 28,50 96,00 2,00 0,59
placa petri para búsqueda 22,00 10,00 1,00 2,20
Placa petri lavado 12,00 10,00 1,00 1,20
Holding 62,70 50,00 0,30 0,38
Pajillas 48,00 50,00 6,00 5,76
Etilenglicol 54,72 50,00 1,50 1,64
Antibiótico 25,00 100,00 5,00 1,25
Estrumate 48,80 20,00 2,00 4,88
SUBTOTAL 54,66
COSTO PARCIAL POR DONADORA
92,77
COSTO PARCIAL POR TRATAMIENTO
742,15
41
ANEXO 4. ANÁLISIS DE COSTO PARCIALES TRATAMIENTO 2
COSTO PARCIAL DE PRODUCCION TRATAMIENTO 2
COSTO DE SINCRONIZACION Y SUPEROVULACIÓN
ITEM
valor
frasco ($)
presentación
(ml/uni)
dosis
(ml/uni)
Valor
unitario ($)
Seleben E® 14,50 100,00 2,00 0,29
esponja 1 150,00 25,00 1,00 6,00
esponja 2 150,00 25,00 1,00 6,00
Gel Lubricante 5,00 30,00 3,00 0,50
Guantes Manejo 8,00 100,00 6,00 0,48
Folligon ® 13,90 5,00 7,50 20,85
Lutalyse® 31,50 30,00 2,00 2,10
Conceptal ® 27,70 10,00 2,00 5,54
Jeringuillas 0,13 1,00 10,00 1,30
SUBTOTAL 43,06
COSTO DE INSEMINACION ARTIFICIAL
Frasco colector de semen 0,50 1,00 1,00 0,50
Catéter de Inseminación 1,50 1,00 1,00 1,50
SUBTOTAL 2,00
COSTO DE LAVADO Y RECOLECCION DE EMBRIONES
Xilacina 20,00 30,00 1,00 0,67
Ketamina 25,00 30,00 0,30 0,25
Jeringuillas 0,13 1,00 5,00 0,65
Hoja de Bisturí 12,00 100,00 1,00 0,12
Lidocaína 3,50 50,00 6,00 0,42
Campo operatorio 1,20 1,00 1,00 1,20
Gasas estériles 8,00 100,00 3,00 0,24
Guantes Quirúrgicos 0,50 1,00 2,00 1,00
Sutura Reabsorbible 36,00 12,00 1,00 3,00
42
Sonda Foley 4,50 1,00 1,00 4,50
Filtro Emcon 21,66 1,00 1,00 21,66
Jeringuillas baja citotoxicidad 30,00 100,00 1,00 0,30
Medio de lavado 55,00 1000,00 50,00 2,75
Puntas para pipeta 28,50 96,00 2,00 0,59
placa petri para búsqueda 22,00 10,00 1,00 2,20
Placa petri lavado 12,00 10,00 1,00 1,20
Holding 62,70 50,00 0,30 0,38
Pajillas 48,00 50,00 6,00 5,76
Etilenglicol 54,72 50,00 1,50 1,64
Antibiótico 25,00 100,00 5,00 1,25
Estrumate 48,80 20,00 2,00 4,88
SUBTOTAL 54,66
COSTO PARCIAL POR DONADORA
99,72
COSTO PARCIAL POR TRATAMIENTO
797,75
43
ANEXO 5. RESULTADOS ANALISIS DE LABORATORIO
44
45
46
47
ANEXO 6. FOTOGRAFÍAS
Ovejas donadoras Aplicación de esponja intravaginal
Hormona eCG Aplicación IM de hormona
Ubicación del cérvix Inseminación Artificial
48
Colocación y sujeción de oveja Respuesta superovulatoria
Respuesta superovulatoria Materiales para manejo de
embriones
Búsqueda de embriones Embriones recuperados
