UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE...

UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA

“FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS DE LOS GENES CYP1A1 Y

CYP1B1 EN MUJERES CON CÁNCER DE MAMA, EN JALISCO”

TESIS

PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS

PRESENTA:

Biol. Laura Janin Muñoz Islas

Asesor de Tesis:

Dr. en C. Ruth De Celis Carrillo

Investigador Asociado “C”

Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS

Asesor de Tesis:

Dr. En C. Elena Margarita Castro Rodríguez

Investigador Titular “A”

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas

Universidad de Colima

Colima, Colima, Julio 2010

Maestría en Ciencias Médicas Frecuencia de Polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama

Instituciones donde se realizó el proyecto:

Laboratorio de Inmunología molecular de la División de Inmunología

Centro de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO)

Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS)

Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145 (UMAE)

Centro Médico Nacional de Occidente (IMSS)

Hospital Civil, Fray Antonio Alcalde

Instituto de Cirugía Reconstructiva

Secretaría de Salud.

Guadalajara, Jalisco


INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DE OCCIDENTE

ONCOLOGÍA AMBIENTAL Guadalajara, Jalisco a 28 de Julio del 2010 Dr. Carlos Enrique Tene Pérez Director de la Facultad de Medicina De la Universidad de Colima Presente Por medio de este conducto quisiera hacer de su conocimiento que he revisado la tesis en su última versión de mi estudiante Laura Janin Muñoz Islas intitulada “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama, en Jalisco” y verifique que las correcciones que les solicité fueran incorporadas al manuscrito, por lo cual, considero que es apta para su presentación en pleno con el afán de obtener el grado de Maestro en Ciencias. Sin mas por el momento, quedo de Usted Atentamente, Dra. Ruth De Celis Carrillo Mat. 8637954 Investigador Asociado “C” N52 Oncología Ambiental División de Inmunología Centro de Investigación Biomédica de Occidente CIBO IMSS Investigador Nacional Nivel I


UNIVERSIDAD DE COLIMA Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas

Colima, Colima 28 de Julio del 2010 Dr. Carlos Enrique Tene Pérez Director de la Facultad de Medicina De la Universidad de Colima Presente Por medio de este conducto quisiera hacer de su conocimiento que he revisado la tesis en su última versión de mi estudiante Laura Janin Muñoz Islas intitulada “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en mujeres con cáncer de mama, en Jalisco” y verifique que las correcciones que les solicité fueran incorporadas al manuscrito, por lo cual, considero que es apta para su presentación en pleno con el afán de obtener el grado de Maestro en Ciencias. Sin más por el momento, quedo de Usted

Atentamente,

____________________________________ Dra. Elena Margarita Castro Rodríguez

Investigador Titular “A”

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas

Universidad de Colima


Agradezco de manera especial a: CONACYT por la beca No.252200 otorgada durante la Maestría en Ciencias Médicas, realizada en la Universidad de Colima. A la Universidad de Colima por abrirme sus puertas y brindarme la oportunidad de seguir con mi preparación académica y superación personal. Al Centro de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO), por su apoyo incondicional durante mi formación


DEDICATORIAS A mis padres Felipe y Mary a quien amo y admiro, porque gracias a ellos hoy estoy aquí, por transmitirme la bondad, constancia y dedicación. Por su apoyo y confianza, sin ustedes no hubiera podido cumplir mis metas, esta tesis también es su premio. A Francisco Rico por ser mi fuerza y soporte, por su enorme comprensión y paciencia, pero sobre todo por quererme incondicionalmente. Gracias amor por impulsar mis sueños. A mis hermanos Edgar, Alejandra, Felipe y Héctor, por estar conmigo en todo momento y brindarme de su optimismo y entusiasmo, haciéndome ver siempre el lado positivo de las cosas. A mi cuñada y sobrinos con mucho cariño, porque me motivaron a seguir adelante.


AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Ruth De Celis Carrillo por todo lo que me ha enseñado y la confianza que ha depositado en mí; sus consejos, calidad humana, así como su dedicación han sido fundamentales para dar forma a este trabajo. A la Dra. Elena Margarita Castro por su disponibilidad y contribución a lo largo de la maestría. A mis asesores: Dra. Claudia Beltrán, Dr. Luis Felipe Jave, Dr. Alejandro Bravo y al Dr. Marco González gracias por su dedicación y apoyo a este proyecto. A Verónica Preciado Martínez por compartir conmigo no sólo conocimientos sino experiencias de vida, pero sobre todo por permitirme contar con su valiosa amistad todo este tiempo, muchas gracias por escucharme y estar siempre a mi lado. A Lupita, Elena y Paola por su oportuna participación y entusiasmo en este proyecto al hacer más ameno y agradable el trabajo diario. A mis profesores de la Maestría en Ciencias Médicas por sus conocimientos y experiencias brindadas.


ÍNDICE

Índice de cuadros y figuras Abreviaturas Resumen 1 Summary 2 Introducción 3 Antecedentes 5 Polimorfismo y mutación 5 Citocromo p450 6 Gen CYP1A1 8 Gen CYP1B1 8 Tóxicos 9 Cáncer de mama 11 Signos y síntomas del cáncer de mama 13 Epidemiología del cáncer de mama 13 Factores de riesgo para cáncer de mama 15 Justificación 19 Planteamiento del problema 19 Pregunta de investigación 19 Hipótesis 20 Objetivos 20 Objetivo general 20 Objetivos particulares 20 Material y Métodos 21 Diseño de estudio 21 Universo de trabajo 21 Tamaño de la muestra 21 Descripción de grupos de estudio 22 Criterios de selección 22 Criterios de inclusión 22 Criterios de exclusión 22 Variables 23 Operacionalización de variables 23 Descripción de las técnicas 24 Extracción de ADN 24 Integridad y pureza 28 Detección de polimorfismos 32 Amplificación por PCR 34 Descripción de enzimas de restricción 35 Análisis Estadísticos 36 Consideraciones Éticas 36 Resultados 37 Discusión 43 Conclusiones 47 Perspectivas 49 Anexos 51 Anexo I. Carta de consentimiento informado 53 Referencias Bibliográficas 55


ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS

FIGURAS

Figura 1. Citocromo p450 6

Figura 2. Modelo 3D del gen CYP1A1 7

Figura 3. Modelo 3D del gen CYP1B1 8

Figura 4. Mamografía 11

Figura 5. Producto amplificado del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1

37

Figura 6. Producto digerido del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1

38

Figura 7. Producto amplificado del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1

38

Figura 8. Producto digerido del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1

39

Figura 9. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 en grupo con cáncer de mama y de referencia

42

Figura 10. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Leu432Val

42

CUADROS

Cuadro 1. Clasificación del carcinoma mamario de acuerdo a la OMS 12

Cuadro 2. Principales causas de muerte en México 2005-2030 14

Cuadro 3. Factores que incrementan el riesgo de cáncer de mama 17

Cuadro 4. Estrategias de detección de los genes de la familia CYP1 31

Cuadro 5. Condiciones de reacción para la PCR

Cuadro 6. Condiciones de reacción para la digestión conenzimas de restricción

32

Cuadro 7. Frecuencias genotípicas de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en grupo con cáncerde mama y de referencia

40

Cuadro 8. Frecuencias alélicas de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en grupo con cáncer de mama y de referencia

40

Cuadro 9. Determinación de equilibrio Hardy-Weinberg 41

Cuadro 10. Determinación de Chi cuadrada y valor de P 41


ABREVIATURAS

º C Grados centígrados A Adenina ADN Ácido Desoxirribonucleico AHH Aryl hidrocarburos Art Artículo C Citosina CIBO Centro de Investigación Biomédica de Occidente CYP Citocromo p450 dNTPs Desoxinucleótidos trifosfatados EDTA Ácido etilendiaminotetraacético G Guanina GST Glutatión-S-transferasasgr Gramos H Horas Ile Isoleucina KCl Cloruro de Potasio Leu Leucina Lt Litros MgCl2 Cloruro de Magnesio mg Miligramo mL Mililitros µg Microgramo µL Microlitros min Minutos mM Milimolar M Molar ng Nanogramos nm Nabometros NAT N-acetiltransferasasNaCl Cloruro de sodio NH4Cl Cloruro de amonio NH4NCO3 Bicarbonato de amonio O2 Oxígeno Pb Pares de basesPCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PAHs Hidrocarburos aromáticos policíclicos RH Sustrato orgánico RFLPs Fragmentos de restricción polimórficos en longitud rpm Revoluciones por minutoSDS Dodecilsulfato sódico seg Segundos T Timina Tris-HCl Tris-ácido clorhídrico TE Tris-EDTA U Unidades Val Valina


RESUMEN

Introducción. El citocromo p450 es responsable del metabolismo oxidativo de

los xenobióticos. Su expresión es regulada por variabilidad genética,

fisiopatológica y ambiental; y presenta variabilidad en la respuesta

farmacológica o diferente susceptibilidad a la acción de tóxicos o carcinógenos.

Los genes asociados con el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de

mama son CYP1A1: (Ile462Val) y CYP 1B1: (Val432Leu).

Objetivo. Estimar la frecuencia de los polimorfismos Ile462Val y Val432Leude

los genes CYP 1A1 y CYP 1B1, en mujeres con cáncer de mama.

Metodología. Estudio descriptivo transversal. Se analizaron muestras de

sangre periférica de mujeres con cáncer de mama, pacientes de varias

instituciones de salud en Guadalajara, Jalisco. Se obtuvo ADN de cada paciente,

se identificó el tipo de polimorfismo por medio de la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) utilizando enzimas de restricción específicas para los genes

CYP1A1 y CYP1B1, así como electroforesis en geles de agarosa.

Resultados: Se estudió un total de 151 muestras de sangre periférica (76

grupo con cáncer de mama; 75 grupo de referencia). Se utilizó Chi cuadrada

para el análisis estadístico. El polimorfismo que mayormente se presentó fue

Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 muestras del grupo con cáncer de mama

(67.1%) y en 44 muestras grupo de referencia (58.6%); a diferencia del

polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1, el cual sólo se presentó en 25

muestras del grupo con cáncer de mama (32.9%) y en 31 de las muestras de

referencia (41.3%). Aunque la frecuencia de las variantes de los genes

estudiados no fue significativamente diferente a la reportada, concluimos que

fue importante identificarlas debido a que podría ser factible considerarlo en la

estimación de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para contribuir a la

información de toxicidad de ciertas sustancias.

Palabras Claves: Citocromo p450, CYP1A1, CYP1B1, cáncer de mama,

polimorfismos.

1


SUMMARY

Background: Cytochrome p450 is responsible for the oxidative metabolism of

xenobiotics. Its expression is regulated by genetic, pathophysiological and

environmental variability in the response showing pharmacological or different

susceptibility to toxic or carcinogenic action. The genes associated with

increased risk of developing breast cancer are CYP1A1 (Ile462Val) and CYP 1B1

(Val432Leu).

Objective. To estimate the frequency of polymorphisms Ile462Val and

Val432Leu gene CYP 1A1 and CYP 1B1 in women with breast cancer.

Methodology. Descriptive cross-sectional study. We analyzed peripheral blood samples of

survivors of breast cancer from different health institutions in Guadalajara, Jalisco. DNA was

obtained from each patient, type was identified through polymorphism chain

reaction (PCR) using specific restriction enzymes CYP1A1 and CYP1B1 genes

and agarose gel electrophoresis.

Results. We studied a total of 151 peripheral blood samples (76 breast cancer

group, 75 control group). Chi square was used for statistical analysis. The

polymorphism Ile462Val presented was mainly the CYP1A1 gene in 51 samples

from breast cancer (67.1%) and 44 samples reference group (58.6%)

Leu432Val polymorphism unlike CYP1B1 gene, which was only present in 25

samples from breast cancer (32.9%) and 31 reference samples (41.3%).

Although the frequency of the variants of the genes studied was not

significantly different from that reported, we conclude that it was important to

identify because it may be feasible to consider in estimating the risk of

developing breast cancer and to contribute to the toxicity of certain information

substances.

Keywords: Cytochrome P450, CYP1A1, CYP1B1, breast cancer,

polymorphisms.

2


INTRODUCCIÓN

En la actualidad, el cáncer de mama es la neoplasia diagnosticada con mayor

frecuencia en las mujeres[3]. En México, de acuerdo al Registro Nacional de

Cáncer, se estima que cada día mueren diez mujeres por esta enfermedad. En

el 2005, se registraron 2,861 fallecimientos lo que representa el 21 por ciento,

en comparación con el 19 por ciento a causa del cáncer cérvico-uterino [4].

Los principales factores de riesgo para desarrollar cáncer de mama son

de tipo genético y ambiental. Estos últimos han despertado mayor interés [5] al

observar su trascendencia en la etiología de algunos tipos de cáncer como

próstata o mama [6].

Los efectos a la exposición a sustancias tóxicas son variados, por lo cual

las personas no lo perciben como perjudicial para su salud [7-9]; sin embargo,

para nuestra defensa disponemos de sistemas químicos como el citocromo

p450, el cual tiene como función actuar sobre sustancias exógenaspara

convertirlas en formas solubles de fácil excreción, evitando de esta forma que

se acumulen en el organismo y alcancen concentraciones tóxicas o letales[2].

Dicho sistema se encuentra compuesto por varias subfamilias

conformadas a su vez por genes, entre ellas:la Familia 1, constituida por:

a) el gen CYP1A1 que contribuye a la desintoxicación de sustancias como

los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs)[10] y a metabolizar estrógenos,

su polimorfismo con mayor frecuencia es (Ile462Val) [11].

b) El gen CYP 1B1 que se encuentra involucrado en el metabolismo de

PAHs y arilamidas cuyo polimorfismo más frecuente es (Val432Leu); ambos

asociados con el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de mama [12].

3


ANTECEDENTES

Polimorfismo y mutación

Un polimorfismo genético es una variación en la secuencia de un sitio

específico del ácido desoxirribonucleico (ADN), debido a la coexistencia de

alelos múltiples en un locus entre los individuos de una población [13]. Cuando

se presentan en una secuencia codificante o reguladora, producen cambios

importantes en la estructura de alguna proteína o en el mecanismo de

regulación de su expresión, traduciéndose en diferentes fenotipos [14].

Consiste en la sustitución de una base nitrogenada o puede ser más complejo

como la repetición de una secuencia determinada de ADN, donde un porcentaje

de individuos tenga un número estipulado de copias de una secuencia

específica del ADN [15].

Cuando la variación se observa en por lo menos el 1% de la población,

se puede considerar como un polimorfismo [14]. Es importante destacar, que

sólo un número muy pequeño de polimorfismos son responsables de

enfermedades genéticas, la mayoría no tienen efecto sobre el fenotipo.

Se conocen como: mutaciones, cuando los cambios en la secuencia de

bases en el ADN son poco frecuentes, éstas son alteraciones en la información

genética, que producen un cambio en las características, se presentan de forma

súbita y espontánea, y pueden trasmitirse o heredarse a la descendencia [15].

La unidad genética capaz de mutar, es el gen, por poseer la información

hereditaria que forma parte del ADN.

Aunque la replicación del ADN es muy precisa, no es perfecta; algunas

veces se producen errores, y el ADN nuevo contiene uno o más nucleótidos

cambiados [14].

5


Citocromo p450

En el curso de la evolución las especies se desarrollaron sistemas de

defensa endógena que les permitió adaptarse y sobrevivir en hábitats y dietas

diferentes. Para cumplir con este objetivo, el hombre y la mayoría de los seres

vivos, poseen el sistema citocromo p450 (Fig.1) cuya misión es actuar sobre

sustancias químicas exógenas, convirtiéndolas en formas solubles, fácilmente

excretables, evitando que se acumulen en los organismos alcanzando

concentraciones tóxicas o letales[2].Después de haber sido encontrado en

diferentes tipos de organismo, se cree que tiene su origen en un gen ancestral

que existió hace más de tres millones de años.

El citocromo p450 una hemoproteína con un pico de absorbancia de

450nm, capaz de transportar electrones [2],funciona como una monooxigenasa

que cataliza reacciones en las que solamente incorpora un átomo de oxígeno

(O²) en un sustrato orgánico (RH) y el otro se reduce a agua (H²O). [16].

En general, las enzimas se clasifican en dos categorías: Fase I, que

cumple la función de metabolizar; Fase II, que tiene la misión de conjugar los

sustratos con otros compuestos [17]. El citocromo p450, es una enzima

importante en el metabolismo de fase I, actúa dentro de las células en

6

Fig. 1. Citocromo p450


compañía de las enzimas fase II, entre las que se encuentran las glutation-S-

transferasas (GST) y las N-acetiltransferasas (NAT). La mayor o menor

actividad de unas y otras tiene como consecuencia que las sustancias exógenas

que llegan a las células, resulten inocuas o tengan un efecto tóxico [2].

Por lo tanto, el citocromo p450 es el responsable de catalizar la

hidroxilación de múltiples compuestos, así como del metabolismo de

xenobióticos entre los que se encuentran diversas drogas, alcaloides,

carcinógenos, pesticidas e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) [2, 18,

19].

Éste sistema, participa activamente en el metabolismo oxidativo de una amplia

variedad de compuestos endógenos talescomo: esteroides, ácidos grasos y

prostaglandinas; asimismose encuentra implicado en la síntesis de sustratos [2,

18].

Las duplicaciones de genes repetidos han dado lugar a una de las

mayores familias de múltiples genes.Las enzimas que incluye esta superfamilia

CYP son: CYP1, CYP2, CYP3 y algunas enzimas de CYP4 [18]. La familia CYP1

está constituida por los genes CYP 1A1, CYP 1A2 y CYP 1B1. Los tres se

caracterizan porque pueden ser activados por hidrocarburos aromáticos

policíclicos (PAHs) [2, 20].

7

Fig. 2. Modelo 3D gen CYP1A1.


El gen CYP 1A1(Fig. 2) constituye la mayor fracción del citocromo p450

extrahepático. Se localiza en el cromosoma 15 q22-q24, posee siete exones y

seis intrones; esta conformado por 5,810 pares de bases, es una enzima

dominante en la bioactivación de la fase I de los xenobióticos. Contribuye a la

desintoxicación de numerosos compuestos, así como a la hidroxilación de los

aryl hidrocarburos, catalizando la primera etapa del metabolismo de una gran

variedad de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) [10]. Se encuentra

implicado en el metabolismo del estrógeno, al catalizar la hidroxilación de 17ß-

estradiol en la posición C-2[10, 11, 21].

El gen CYP 1A1 codifica para una enzima con actividad aryl-hidrocarburo-

hidrolasa (AHH), que es inducible por ligandos de los receptores de aryl-

hidrocarburos en casi todos los tejidos estudiados, entre los que se encuentran:

linfocitos, tejido pulmonar, glándulas mamarias y placenta. Hasta la fecha han

sido identificados diecinueve polimorfismos de este gen; uno de los más

comunes es: CYP 1A1*2 el cual consiste en la sustitución de isoleucina en el

codón 462 por valina (Ile462Val); se asocia con el incremento del riesgo de

distintos tipos de cáncer: pulmón, mama, próstata y cérvico uterino [11].

Por otra parte, el gen CYP 1B1(Fig. 3) constituye también una fracción

importante del CYP extrahepático con expresión en casi todos los tejidos, como

son: riñón, próstata, glándulas mamarias y ovarios. Está localizado en el

8

Fig. 3. Modelo 3D gen CYP1B1


cromosoma 2p21-p22, constituido por tres exones y dos intrones; similar en

tamaño al gen CYP1A1 cuenta con 8.546 pares de bases de longitud.

Es una enzima que cataliza la formación de genotóxicos 4- hidroxi-

estradiol a catecol metabolito estrogénico por lo que posee una actividad

estrogénica significativa, este metabolito puede experimentar un ciclo redox

generando una mutación al producir radicales libres que pueden ocasionar

cambios significativos en el ADN y otras estructuras celulares. Esta enzima

también está involucrada en el metabolismo de hidrocarburos aromáticos

policíclicos (PAHs) y arilaminas y se ha sugerido su sobreexpresión en algunos

tumores [12].

El gen CYP 1B1 presenta varios alelos, en la actualidad se han reportado

42 variantes y aquéllos con actividad enzimática reducida han sido asociados

con glaucomas primarios congénitos[22].

El polimorfismo más común en CYP1B1 consiste en la sustitución de Valina en

el codón 432 por Leucina (Val432Leu), este cambio se asocia directamente con

el incremento de riesgo para desarrollar cáncer de mama [12, 23].

Tóxicos

La mayoría de los tóxicos de uso frecuente son capaces de mutar al ADN

y transformar a las células hasta entidades totalmente extrañas para el

organismo, pueden ejercer efecto estrogénico sobre órganos o tejidos y pueden

causar inmunosupresión en los organismos [4].

Existe una larga lista de sustancias tóxicas, las cuales son consideradas

potencialmente peligrosas para la salud humana como son los hidrocarburos

aromáticos policíclicos (PAHs) un grupo de más de cien sustancias químicas

diferentes, formadas durante la combustión incompleta del carbón, el aceite, el

gas, la basura u otros compuestos orgánicos [24].

9


Desde hace mas de cinco décadas los PAHs han sido el grupo de

compuestos que mayor interés ha despertado porque son empleados en

múltiples actividades y productos, por esa razón tienen una amplia distribución

en el planeta, algunos son extremadamente tóxicos y la mayoría son

químicamente muy estables por lo tanto persisten en el ambiente por largos

períodos de tiempo y son bioacumulables tanto en alimentos como en tejido

adiposo de humanos y animales, de ahí la importancia de su estudio [25,

26][4].

La exposición a sustancias químicas se lleva a cabo por la actividad

laboral de las personas [27], por la utilización o desecho de algunos productos

tales como: combustibles, lacas, pinturas, plásticos, hules, conservadores,

fumigantes, insecticidas, productos de limpieza, cosméticos y alimentos, entre

otros [25, 28, 29], y son pocas las personas que tienden a percibir que esta

exposición a tóxicos es perjudicial para su salud [7-9]. Las principales formas

de ingreso al organismo es por inhalación del aire contaminado; por el consumo

de alimentos con pesticidas; por el uso de fármacos y cosméticos, por el agua

para beber o absorción dérmica [30-32].

Los efectos de la exposición a cualquier sustancia tóxica dependen de la dosis,

la duración, la manera en que las personas están expuestas, sus hábitos y

características genéticas, así como de la presencia de otras sustancias químicas

[33].

10


Cáncer de mama

Es una enfermedad multifactorial dependiente de hormonas con una

clara relación positiva a las altas concentraciones endógenas de estrógeno[34].

Representa una proliferación maligna de células epiteliales que revisten los

conductos o lobulillos mamarios [35].

Las mamas, están formadas por tejido glandular (tejido conectivo) así

como por tejido graso; del 70 al 80 % del peso total de la mama corresponde al

tejido adiposo. En la mama se encuentran las glándulas productoras de

leche[36] (lobulillos); las cuáles se encuentran en el tejido de sostén donde

también se localizan los conductos, los vasos sanguíneos y los linfáticos. Estos

últimos, transportan el líquido linfático cuyo contenido principal son proteínas y

células del sistema inmunológico las cuales son llevadas a los ganglios linfáticos

11

Fig. 4. Mamografía


axilares ubicados sobre la clavícula y otros lo conducen a los ganglios mamarios

internos ubicados cerca del esternón[36].

Al igual que otras neoplasias malignas, el cáncer de mama se inicia

cuando una célula normal escapa a los controles habituales de replicación y se

multiplica sin control. Esta evasión requiere de una acumulación de mutaciones

en los genes que regulan la división celular y aseguran la síntesis y replicación

del ADN. Ciertas hormonas y algunas sustancias tóxicas pueden promover

también el crecimiento celular anómalo hasta lograr el crecimiento del tumor en

la mama [33].

Los tumores invasivos de mama son histológicamente heterogéneos. Los

tipos de cáncer de mama se clasifican histológicamente en carcinoma ductal in

situ, carcinoma ductal infiltrante (o invasivo), casi el 80% de los casos de

cáncer de mama son de este tipo; carcinoma lobular in situ; carcinoma lobular

infiltrante (o invasivo), este tipo de cáncer se presenta en el 15% de las

mujeres que desarrollan cáncer de mama; y carcinoma inflamatorio,se observa

en cerca del 3% de los casos; entre otros subtipos raros (cuadro 1)[37, 38].

Cuadro 1. Clasificación del carcinoma mamario de acuerdo a la OMS [37, 38]

Tipo de tumor Clasificación

No infiltrante Carcinoma lobulillar in situCarcinoma ductal in situ

Invasor

Carcinoma ductal invasor no específico (NST) Carcinoma ductal invasor con extenso componente intraductal Carcinoma ductal invasor con enfermedad de PagerCarcinoma lobulillar invasorCarcinoma medular Carcinoma muscinoso o coloide Carcinoma papilar Carcinoma tubular Carcinoma adenoide quístico Carcinoma secretor (juvenil) Carcinoma apócrifo Carcinoma con metaplasma Tipo escamoso Tipo células fusiformes Tipo cartilaginoso y óseo Tipo mixto Carcinoma inflamatorio

12


En general, el cáncer de mama se estratifica utilizando las directrices del Comité

Conjunto Americano del Cáncer (American Joint Committee on Cancer –AJCC-)

conocida como clasificación TNM [39-41].

La clasificación para los subgrupos se realiza con números que van del I

al IV [39-41]. Los índices de supervivencia relativa a cinco años, según el

estadio del cáncer son los siguientes: I-98%, IIA-88%, IIB-76%, IIIA-56%,

IIIB-49% y IV-16%[35].

Signos y síntomas del cáncer de mama

El indicio más común de cáncer de mama, es la presencia de una

protuberancia en el seno, dura y fija. En casi la mitad de todos los casos esas

protuberancias suelen crecer cerca de los ganglios de la axila, en la parte

superior y externa de la mama; las cuales pueden llegar a distorsionar la forma

del seno haciéndolo parecer más grande o elevado, dándole un aspecto

asimétrico con respecto al otro seno [42].

El pezón de la mama afectada puede verse escamoso o reseco, retraído

o incluso sumido. En ocasiones puede presentarse salida de líquido por el

pezón, de color amarillento semi traslúcido o con sangre [43].

La piel de la mama también puede verse afectada observándose

acartonada y con pequeños hoyitos, similar a la de una cáscara de naranja.

Otras señales que podemos observar es inflamación, enrojecimiento, irritación,

descamación o grietas en la piel de la mama o del pezón, dolor en el pezón o

en el brazo. Así mismo pueden presentarse punzadas o piquetes que llegan

desde los hombros hasta el pezón o que se inician en el pezón y se profundizan

dentro de la mama en los conductos lactíferos [43].

Epidemiología de cáncer de mama

Actualmente, el cáncer de mama es la neoplasia que con mayor

frecuencia se diagnostica en las mujeres, representa 15% de todos los tipos de

13


cáncer [3] es la segunda causa de muerte por cáncer en mujeres a nivel

internacional (las 411,000 muertes anuales representan el 14 por ciento de

muertes femeninas por este tipo de cáncer) [44].

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el año 2005

murieron 58 millones de personas en todo el mundo, de las cuales casi ocho

millones murieron por cáncer, y se estima que en el año 2015 aumentará a

nueve millones y para el 2030 a más de once millones de fallecimientos por

cáncer.[45-47].

Cuadro 2.Principales causas de muerte en México 2005-2030. Fuente OMS

De acuerdo al Registro Nacional de Cáncer, se ha estimado que en

México cada día mueren diez mujeres por cáncer de mama y una de cada ocho

mujeres lo desarrolla; por tal razón, en algunos estados del país esta es la

principal causa de muerte de mujeres en edad reproductiva (entre 15 y 64

años), 47 por ciento del total de muertes ocurre en mujeres entre 45 y 64 años,

debido a que el riesgo aumenta con la edad, como sucede con cualquier tipo de

cáncer[48].

14


Tan sólo en el 2005, a nivel nacional se registraron 2,861 fallecimientos

de mujeres por cáncer de mama, lo que representa el 21 por ciento de las

muertes de mujeres por cáncer, comparado con el 19 por ciento que murieron

por cáncer cérvico-uterino.

La incidencia de cáncer de mama se ha incrementado en México año tras

año. Según el Sistema Nacional de Información en Salud (SINAIS), en el año

2000 se registró una incidencia de 10,758 y se tiene una estimación de 19,811

para el año 2012; esto representa un incremento anual del 1 por ciento en

promedio[47].

La tasa de mortalidad por cáncer de mama en mujeres mexicanas se

estimó en 14.7 por 100 mil mujeres mayores de 25 años, con una sobre vida de

38 por ciento dentro de los primeros cinco años después de haberse establecido

el diagnóstico y de 22 por ciento en los diez años posteriores al diagnóstico[4].

Factores de riesgo para cáncer de mama

Cuando el organismo funciona adecuadamente, es capaz de reconocer

microorganismos, virus o células que están dañadas o células tumorales, y los

destruyen para controlar las infecciones o el crecimiento de tumores[43, 49].

Los principales factores de riesgo para desarrollar cáncer de mama son factores

de tipo genético, principalmente mutaciones en los genes p53, BRCA1, BRCA2,

Her2, Her2Neu, otros son de tipo reproductivo, una menarca temprana (antes

de los 12 años), menopausia tardía (después de los 52 años), uso de hormonas

exógenas (contraceptivos orales, terapia de hormona de reemplazo), edad del

primer embarazo a término (después de los 30 años), nuliparidad, ausencia de

lactancia materna, pero también existen otros factores como malos hábitos en

la alimentación como exceso de grasas de origen animal, pobre ingesta de

antioxidantes o vitaminas de origen vegetal, ciertas adicciones como

alcoholismo o tabaquismo y drogadicción, y otros factores de tipo ambiental

como exposición laboral a tóxicos o residencia en áreas altamente

contaminadas[50].

15


Dos tipos de cambios en el genoma son la acumulación de mutaciones

somáticas y el desarrollo de inestabilidad genética. Muchos tipos de cáncer

tienen un mayor número de mutaciones comparado con las células normales.

Existe una correlación directa entre la progresión del tumor y el número

de mutaciones. La mutación de genes reparadores conduce a un aumento en el

daño del ADN y con esto también se incrementa la tasa en que las mutaciones

pueden ocurrir. La inestabilidad genética está reflejada en cambios en el

número de genes en células cancerosas. Esto puede ser el resultado de

pequeñas duplicaciones o deleciones, translocaciones de material de un

cromosoma a otro o incluso cambios que afectan a cromosomas completos. La

inestabilidad cromosómica puede ser causada por complejos o proteínas que

actúan en la partición (anafase) durante la mitosis (cuadro 2) [51].

Los factores genéticos, incluyendo los genes de mayor susceptibilidad,

pueden explicar hasta el 10% de los casos de cáncer de mama en países

desarrollados [22, 52], pero su prevalencia en la población es demasiado baja

para explicar el aumento del uno por ciento anual sostenido a lo largo de los

últimos 20 años a nivel internacional. Por lo que se cree, que la mayoría debe

ser por lo tanto, una consecuencia a diversas exposiciones ambientales [5], [8,

27, 53].

De hecho recientemente se ha sugerido que el residir cerca de una zona

industrial y estar expuesto a las sustancias contaminantes del ambiente que

derivan de los procesos industriales puede ser la causa potencial del aumento

en las tasas de incidencia de cáncer de mama y de la posible variación en las

tasas alrededor del mundo [6]. Investigaciones recientes han demostrado que

los factores ambientales pueden desempeñar un papel importante en la

etiología de algunos tipos de canceres tales como tumores malignos en mama

o próstata[4, 29, 49, 54].

16


Factores de riesgo de cáncer de mama Magnitud de riesgo

Factores confirmados

Edad incrementada ++ Región geográfica (EU y países del Oeste) ++Historia familiar de cáncer de mama ++Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 ++Mutaciones en otros genes de alta penetrancia (p53, ATM, NBS1,LKB1) ++

Exposición a radiación ionizante (en la niñez) ++Historia de enfermedad de mama benigna ++Edad tardía de menopausia (mayor de 54 años) ++ Edad tardía de menopausia (mayor de 54 años) ++ Edad temprana de menarca (menos de 12 años) ++ Nuliparidad y edad avanzada en el primer embarazo a término ++

Alta densidad en tejido mamario ++ Terapia de remplazo hormonal ++Uso prolongado de anticonceptivos orales ++ Obesidad en mujeres post-menopáusicas + Consumo de alcohol (una copa por día) + Estatura alta +

Factores probables

Altos niveles de factor de crecimiento parecido a insulina 1 (IGF1) ++

Altos niveles de prolactina + Consumo de grasas altamente saturadas + Polimorfismos en genes de baja penetrancia + Alto status socioeconómico +

Factores de riesgo de cáncer de mama Magnitud de riesgo

Factores confirmados

Región geográfica (Asia y África) ++ Edad temprana en el primer embarazo a término ++Alta paridad ++Lactancia (entre cuatro y seis meses de duración) ++Obesidad en mujeres premenopáusicas ++Consumo de frutos y vegetales ++Actividad Física ++Agentes quimiopreventivos ++

Factores probables Drogas anti-inflamatorias no esteroideas ++ Polimorfismos en genes de baja penetrancia +

Cuadro 3. Factores que incrementan el riesgo de cáncer de mama[50]

17


JUSTIFICACIÓN

Debido a que la mayoría de las personas están expuestas a una mezcla de

tóxicos presentes en el ambiente, resulta de gran importancia conocer la

frecuencia de los polimorfismos que presentan los genes CYP 1A1 y 1B1 en

mujeres con cáncer de mama y que han estado expuestas a tóxicos en forma

más prolongada o por más tiempo. Si se encontrara que alguno de los

polimorfismos es más frecuente que otros, podría ser factible considerarlo en la

estimación de riesgo para desarrollar este tipo de cáncer en mujeres,

posteriormente está información sirva de base para realizar estudios ulteriores

que permitan contribuir a la información de toxicidad de ciertas sustancias.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Si se considera que de los genes en p450 CYP 1A1 y CYP 1B1, codifican para

las enzimas involucradas en el metabolismo de ciertos tóxicos [2], resulta

importante conocer las frecuencias de los polimorfismos de estos genes en

mujeres con cáncer de mama.

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Cuál de lospolimorfismos que presentan los genes CYP 1A1 y 1B1 será más

frecuente en mujeres que han desarrollado cáncer de mama?

19


HIPÓTESIS DE TRABAJO

Algunos de los polimorfismos que se presentan en los genes CYP 1A1 y 1B1,

entre ellos Ile462Val y Val432Leurespectivamente, están asociados al cáncer de

mama.

OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN

OBJETIVO GENERAL

Identificar y estimar la frecuencia de los polimorfismosde los genes CYP

1A1 y CYP 1B1 (Ile462Val y Val432Leu, respectivamente) en mujeres

que han desarrollado cáncer de mama y en un grupo de referencia,

mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

OBJETIVO PARTICULAR

Identificar y describir las frecuencias genotípicas y alélicas para los

polimorfismos Ile462Val y Val432Leu, en los genes CYP 1A1 y CYP 1B1.

20


MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño del estudio. Transversal.

Universo de trabajo

Mujeres con Cáncer de Mama, que fueron pacientes de diferentes Hospitales o

Institutos, tales como la Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145 (UMAE);

Hospital de Especialidades; del Centro Médico Nacional de Occidente del IMSS,

así como del Hospital Civil, Fray Antonio Alcalde en Guadalajara, Jalisco y del

Instituto de Cirugía Reconstructiva; ambos de la Secretaría de Salud.

Tamaño de Muestra

Se considero todas las muestras de sangre periférica de pacientes con

diagnóstico de cáncer de mama reciente o que tuvieron cáncer,

correspondientes al período del 1 de enero del 2009 al 31 de diciembre del

2009, de acuerdo a los criterios de inclusión. El número total de muestras

seleccionadas fueron 151.

De las cuales 76 pertenece a muestras de sangre periférica de pacientes con

cáncer de mama, y 75 a muestras referencia de sangre periférica de individuos

del banco de sangre de Centro Médico Nacional de Occidente (CMNO).

21


Descripción de grupos de estudio

Casos con cáncer de mama. Pacientes que mediante ecosonograma de

mamas o mamografía presenten cáncer de mama con diagnóstico confirmado

mediante biopsia.

Referencia. Individuos pertenecientes a población en general de los cuales se

desconozcan sus datos clínicos, antecedentes personales y familiares. Este

grupo se consideró para establecer parámetros poblacionales de los

polimorfismos que se seleccionaron en el presente proyecto.

CRITERIOS DE SELECCIÓN

Criterios de inclusión (pacientes)

Mujeres con diagnóstico reciente o que tuvieron cáncer de mama.

Derechohabientes de la Unidad Médica de Alta Especialidad No. 145

(UMAE); Hospital de Gineco-obstetricia; Instituto de Cirugía

reconstructiva y; Hospital Civil; Guadalajara, Jal.

Referencia:

Individuos que acudieron al Banco de sangre del CMNO, como

donadores, de quienes se desconocen sus datos clínicos, antecedentes

personales y familiares.

Criterio de exclusión

Muestra de sangre insuficiente, sea perdida involuntariamente, se degrade o

contamine, antes o durante todos los procedimientos del análisis molecular.

22


VARIABLES

Variable dependiente

Polimorfismos encontrados de los genes CYP1A1 Y CYP1B1.

Polimorfismo: variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre

los individuos de una población.

Polimorfismos Gen CYP1A1: Ile462Val

Polimorfismos Gen CYP1B1: Val432Leu

Variable independiente

Como variable independiente se considerará el diagnóstico de cáncer de mama.

Cáncer de mama: Proliferación acelerada, desordenada y no controlada de

células con genes mutados, los cuales suprimen o estimulan la continuidad del

ciclo celular pertenecientes a distintos tejidos de una glándula mamaria.

Cuadro de Operacionalización de variables Variable Interrelación Naturaleza Medición Análisis

Polimorfismos

CYP1A1 (Ile462Val) y

CYP1B1 (Val432Leu)

Dependiente Cualitativa

Nominal

Dicotómica

(ausente/presente)

Chi

cuadrada

Cáncer de mama

Independiente

Cualitativa

Nominal

Dicotómica

(ausente/presente)

Chi

cuadrada

23


Descripción de las Técnicas

Extracción de ADN.

Se obtuvieron muestras de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama.

Se llevó a cabo la extracción de ADN de cada muestra mediante protocolos

previamente descritos. La sangre periférica (5 mL) se colectó en tubos con

EDTA como anticoagulante y la extracción de ADN se realizó por el método

Miller. La integridad y pureza se determinó mediante espectrofotometría y

electroforesis en gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. Todas

las muestras una vez cuantificadas se ajustaron a 100 µg/mL para utilizarlas en

los procedimientos moleculares.

MMaaccrroommééttooddoo ddee MMiilllleerr

Tipo de muestra: Sangre periférica.

Reactivos Necesarios:

Solución buffer de lisis

Solución B

SDS

Proteinasa K

NaCl 6M

Etanol 100%

Etanol 70%

TE

24


Preparación de reactivos

Solución buffer de lisis

Pesar 15.4 gr. de cloruro de amonio (NH4Cl) 0.44M y aforar en 2 Lt de agua

destilada.

Pesar 0.158 gr. de bicarbonato de amono NH4NCO3 0.01M.e hidratar en 200 mL

de la solución de NH4Cl 144 M mezclar y agregar al matraz de la primera

solución aforar a 2 Lt.

Solución B Miller.

Sustancias. Mili

moles

pH Gramos

Tris base 10 mM 7.5 0.6055

NaCl 40 mM 11.688

EDTA 2 mM 8.0 0.3722

En un Vaso 1000 mL colocar un agitado magnético

Vaciar 350 mL de agua bidestilada

Agregar el tris base ya que esté disuelto agregar en NaCl y al final el

EDTA

Ajustar pH a 8.2 (con HCl diluido)

Vaciar a un matraz de 1000 mL llevar a esterilizar

Posteriormente vaciarlo a un matraz volumétrico de 500 mL y aforar con

agua destilada estéril, mezclar y almacenar.

SDS al 20%.

Pesar 5 gr. de SDS y disolver en 25mL de agua destilada.

25


Proteinasa K

Reactivo Gramos

Proteinasa K 0.050

SDS 0.5

EDTA 0.0372

Aforar a 50 mL para 100 muestras.

Colocar un agitador magnético limpio poner 35 mL de agua des-ionizada estéril

colocar el vaso en un plato con agitador agregar primero el EDTA, ya que esté

disuelto, vaciar el SDS (agitar suavemente cuidando que no se forme espuma),

agregar la proteinasa K hasta que se disuelva, vaciar a un tubo de 50 mL y

aforar.

*Cubrir de la luz con papel aluminio.

NaCl 6M

Pesar 35.1gr. de cloruro de sodio (NaCl) en 100 mL de agua destilada.

Etanol al 70%

Tomar 35 mL de etanol al 100% y aforar con 15 mL de agua destilada estéril.

TE

Reactivo Gramos

Tris base 0.0605

EDTA 0.0186

Pesar todo en ese orden, disolver y aforar a 50 mL con H2O destilada estéril.

26


Equipo

Centrífuga refrigerada

Incubadora

Micro centrifuga

Congelador

Procedimiento

1.- Para obtener el botón se depositarán 10 mL de sangre periférica con EDTA

más solución buffer de lisis hasta aforar los tubos a 35 mL.

2.-Refrigerar por 10 minutos.

3.-Centrifugar a 3900rpm durante 15 min. 4C.

4.-Decantar y lavar el botón con un poco de solución de lisis con movimiento

circular, retirar el sobrenadante y desbaratar el botón, .después agregar

solución de lisis hasta alcanzar un volumen de 25 mL.

5.-Centrifugar nuevamente a 3900 rpm 15 min. a 4C.

6.-Decantar y guardar el botón a -20C (opcional).

7.-Se re suspenderá el botón en 3 mL de solución B (búffer de lisis de Miller).

8.-Agregar 200 L de SDS al 10% + 500L de solución de proteinasa K,

agitar suavemente, 15 seg. en un vórtex.

.9.-Incubar 24-48 h. a 37C.

10.-Después de incubar se adicionará 1mL NaCl 6M

11.-Agitar en el vórtex durante 15 seg.

12.-Centrifugar a 3900rpm durante 15 min. a -4C.

13.-Se tendrá preparados 10 mL de etanol frió al 100% en un tubo de 15 mL,

posteriormente se agrega el sobrenadante y se agita suavemente hasta

precipitar.

14.- Transferir el ADN precipitado en un tubo de 1.5 mL con una pipeta y se

agrega 750L de etanol al 70%.

15.-Centrifugar a 10,000 rpm de 3-5min.

1.6-Decantar el etanol

27


17.-Realizar un segundo lavado con 750L de etanol a 70%, centrifugando a

10,000 rpm durante 3min.

18.-Decantar el etanol y dejar secar a temperatura ambiente.

19.-Agregar búffer TE para re suspender el ADN.

IInntteeggrriiddaadd yy ppuurreezzaa

Método Electroforesis en geles de Agarosa

Equipo y Materiales

Cámara para electroforesis horizontal

Cama o soporte para hacer geles

Plancha de calentamiento

Balanza Analítica

Fuente de poder

Peine para hanchura de pozos de 8 dientes

Matraz Erlenmeyer de 100 mL

Guantes

Reactivos

Agarosa

Búffer TBE 1X

Agua Bidestilada

Nota: El gel debe prepararse en el mismo búffer de corrimiento, para

proporcionar las mismas condiciones en el soporte (gel) y en la fase líquida. El

corrimiento se realiza a un voltaje moderado que puede ser de 65 V durante 30

min. (hasta que se separen los colorantes del búffer cargador o jugo azul) y 80

V durante 30 min, dependiendo también del tamaño del fragmento y de la

cámara de electroforesis.

28


Procedimiento

1. Pesar 0.75 gr. de agarosa y agregar cuidadosamente a un matraz

Erlenmeyer de 150 mL con 50 mL de TBE 1X, a pH de 8.0. Se coloca

sobre la placa para calentar (o en el microondas), se espera a que

comience a hervir.

2. Se agita suavemente el matraz para diluir todos los residuos de

agarosa, hasta que la solución quede cristalina.

3. Revisar el volumen de la agarosa disuelta y completar (aforar) a 100

mL con TBE 1X, mezclando suavemente por agitación.

4. Lavar previamente el molde en que se vaciará el gel y la cámara de

electroforesis. Poner el molde en una tabla o mesa nivelada.

5. Esperar a que la temperatura llegue aproximadamente a 55 ºC para

así aplicar la agarosa en el molde, cuidando que no queden burbujas

en la matriz del gel.

6. Poner el peine y esperar a que gelifique completamente, para

después remover el peine cuidando de no romper los bordes de los

pozos.

7. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y adicionar TBE 1X a un

pH de 8.0 observando que el nivel del búffer este aproximadamente

0.5 – 1cm por encima de la superficie del gel.

8. Colocar las muestras de ADN (previamente mezcladas sobre un

parafilm con jugo azul) en los pozos del gel. La cantidad dependerá

del tamaño de los pozos.

9. Conectar los cables de la fuente de poder. El voltaje debe estar en un

rango de 60 a 80 V. Recordar que el ADN tiene una migración

anódica: tiene carga negativa (-) y migrará hacia el cátodo (+) o polo

positivo.

Anotar condiciones de corrimiento para cada experimento particular.

29


Rango de separación de ADN en geles de agarosa

Cantidad de Agarosa en el gen

(% [peso/volumen])

Rango de separación efectivo de ADN en

geles de agarosa

0.3 5-60

0.6 1-20

0.7 0.8-10

0.9 0.5-7

1.2 0.4-6

1.5 0.2-3

2.0 0.1-2

Método de tinción con bromuro de etidio

Equipo y material

Lámpara de luz ultravioleta o transiluminador

Máscaras protectora de luz ultravioleta

Charola para colocar el gel

Gasas

Guantes

Reactivos

Solución de bromuro de etidio

Agua bidestilada

Procedimiento

1. Colocar el gel en un envase plano (preferiblemente de vidrio) con 300

mL de solución de bromuro de etidio en 300 mL de agua destilada por 5-

15 min.

30


2. Pasar el gel a una charola con agua bidestilada por 1 ó 2 min. Según se

requiera.

3. Observar el gel con el ADN en el transiluminador de luz UV utilizando la

protección adecuada.

Método para cuantificación de ADN

Para cuantificar la cantidad de ADN o ARN, deben tomarse las lecturas de la

densidad óptica (DO) o absorbancia a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm

permite calcular la concentración de ácido nucleico en la muestra. Una DO de 1

corresponde a aproximadamente 50 µg/mL de ADN de doble cadena, 40 µg/ml

de ADN de cadena sencilla y ARN, y alrededor de 20 µg/mL de oligonucléotidos

de cadena sencilla. La tasa entre las lecturas a 260 nm y 280 nm (DO260/ DO280)

proporciona un estimado de la pureza del ácido nucleico.

Las preparaciones puras de ADN o ARN tienen valores de DO260/DO280 de

1.8 y 2, respectivamente. Si hay una confirmación con proteínas o fenol, este

valor será significativamente menor y no será posible la cuantificación exacta

del ácido nucleico.

Procedimiento

1. Las muestras perfectamente homogéneas se bajan en la

microcentrífuga.

2. Encender en el espectro la lámpara de luz UV, si es computarizada

utilizar el programa para ácidos nucleicos.

3. Ajustar con el blanco el espectro, midiendo 1000 µL de agua bidestilada

o inyectable en la celdilla de cuarzo para el espectrofotómetro.

4. Rotular un tubo de 1.5 mL por cada muestra.

5. Colocar 995 µL de agua MilliQ en cada tubo.

6. Adicionar 5 µL de ADN a su tubo correspondiente.

7. Para cuantificar se coloca el contenido de cada tubo en la celdilla de

cuarzo, agitar perfectamente la solución y leer la muestra.

31


8. Se repiten los pasos 3 al 7 para cada muestra.

9. Registrar las lecturas de densidad óptica (DO) a 260 nm y 280 nm, para

calcular la cantidad de pureza del ADN.

Fórmula para calcular la concentración del ADN

Considerando que:

50 µg/mL de ADN de doble hebra absorben 1 DO a 260 nm.

La relación de lecturas de DO 260 nm/DO 280 nm nos proporciona

una estimación de la pureza de los ácidos nucleicos. Las

preparaciones puras de ADN presentan valores aproximados de 1.7 a

2.0.

CONCENTRACIÓN DE ADN (µg/mL) = (DO 260nm) (Factor de dilución) (50)

El factor de dilución en este caso es el volumen total de la celdilla entre el

volumen de la muestra (en este caso 200/1 0 200).

DDeetteecccciióónn ddee ppoolliimmoorrffiissmmooss

Para la detección de los polimorfismos se diseñaron protocolos de PCR/RFLP, la

descripción de cada uno se muestra en el cuadro 3.

Gen

Polimorfismo

Iniciadores

Tº de

alineamiento

(ºC)

Producto

amplificado

(pb)

Enzima de

restricción

Corte de

Enzima

CYP1A1

(Ile462Val)

F:5´GGC CCC AAC TAC TCA GAG GCT

3´

R:5´ GC TGA GCA ATC TGA CCC TA 3´

56

147

MspI

C CGG

CYP1B1

(Val432Leu)

F:5´ AAT TTC AGC TTG CCT CTT G 3´

R:5´ TCA CTT GCT TTT CTC TCT CC 3´

55

113

AcuI

CTGAAG_N(16)

Cuadro 4. Estrategias de detección de los genes de la familia CYP1. Iniciadores y

enzima de restricción correspondiente para la genotipificación de cada polimorfismo.

32


Para la selección de los polimorfismos de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 se

consultó la base de datos SNP del NCBI. Se diseñaron iniciadores específicos a

partir de la secuencia obtenida del

GenBankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank para la amplificación de

fragmentos de ADN que contiene a los polimorfismos seleccionados de los

genes CYP1A1 Y CYP1B1 mediante el programa OligoTM v6.0.

Se llevó a cabo la estandarización a partir de las condiciones de reacción

mostradas en el cuadro 4 tanto para amplificación por PCR como para la

reacción de digestión con enzimas de restricción mostradas en el cuadro 5 para

la detección de los polimorfismos del cuadro 3.

Reactivos Concentración µL por reacción Muestra DNA 500ng/μL 1 Iniciador 1 (foward) 15 pmol/µL 1.5 Iniciador 2 (reverse) 15 pmol/µL 1.5 dNTP´s 100nM 2 Búffer 10 x (Mg+) 1 X 2.5 H²O cbp 25 µL 16.5 Taq pol 0.5 U 0.2 Volumen total por tubo

- 25

Cuadro 5. Condiciones de reacción para la PCR.

*Mg+, mercurio *Taq pol

Reactivos Concentración µL por reacción

Búffer (depende de cada enzima) 1 X 2

Enzima de restricción 1 U 0.2

Agua cbp 20 µL 2.8

Producto amplificado - 15

Volumen final 20

Cuadro 6. Condiciones de reacción para la digestión con enzimas de restricción.

33


TTééccnniiccaa RReeaacccciióónn eenn CCaaddeennaa ddee llaa PPoolliimmeerraassaa ((PPCCRR))

La Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (por sus siglas en inglés

Polymerase Chain Reaction) es un método que permite la amplificación

selectiva in vitro de secuencias específicas del ADN blanco a partir de una

fuente heterogénea y grande como el ADN genómico.

Condiciones

95 °C/4min

95 °C/10seg

60 °C/30seg

72 °C/1 1/2min

72 °C/5min

Ciclos: 35

Paso 1.-Se preparará Mix1, en un tubo estéril de 0.2 µL (en hielo) de la

siguiente manera:

MIX1 Volúmenes

cDNA 1.0 µL

Primer 1 1.5 µL

Primer 2 1.5 µL

H2O 1.5 µL

Σ= 5.5 µL

Paso 2.-Se preparará Mix2 cbp todas las relaciones del paso anterior en un tubo

de 2 ml estéril (en hielo).

Paso 3.- Agregar 15.0 µl de la Mix2 a cada tubo del paso 1 (trabajar en hielo)

Paso 4.-Homogenizar cada tubo y colocar en el termociclador.

34


DDeessccrriippcciióónn ddee eennzziimmaass ddee rreessttrriicccciióónn

MspI

Sitio de reconocimiento: C CGG

GCC G

Temperatura de reacción: 37 ºC

Concentración: 5 U/µL46

AcuI

Sitio de reconocimiento: CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN ... ...

GACTTCNNNNNNNNNNNNNNNNN ... ...

Temperatura de reacción: 37 º C

Concentración: 10 U/µL

35


Análisis Estadístico

Se realizó conteo génico para establecer frecuencias génicas y

genotípicas y mediante la prueba de Χ2 de bondad de ajuste se calculó el

equilibrio Hardy-Weinberg. Las frecuencias de los genotipos fueron

determinadas por conteo genotípico y la prueba estadística fue Χ2.

Se calculó un Intervalo de Confianza de 95 % para las mediciones

obtenidas y un valor de p < 0.05 se considero significativo.

Consideraciones éticas

El protocolo de estudio fue elaborado de acuerdo con la Norma Oficial

Mexicana en materia de investigación en humanos y de acuerdo con las normas

de bioética que establece al respecto en la Ley General de Salud de la

República Mexicana haciendo hincapié en los artículos estipulados en el titulo

segundo capítulo I (Art.13, 14, 15, 16). Conforme al artículo 17 el presente

proyecto se encuentra en la categoría de investigación con riesgo mínimo [55].

Durante todo el estudio, se observaran los lineamientos definidos en el tratado

de Helsinki y en las enmiendas realizadas a éste, en Tokio, en relación con la

realización de investigación en humanos [56].

36


RESULTADOS

Población estudiada

Se captaron un total de 151 muestras de sangre periférica que se

clasificaron en 76 casos (con cáncer de mama) y 75 individuos de referencia

(población general) para establecer parámetros poblacionales de los

polimorfismos.

Análisis Molecular

Las figuras 4 y 5 muestran la amplificación y digestión del polimorfismo

Ile462Val del gen CYP1A1. El fragmento amplificado tiene un tamaño de 147

pb. En la digestión con la enzima MspI se observaron dos bandas de 90 y 61

pb.

Figura 5. Producto amplificado del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. Gel de

agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. El producto amplificado observado en todos los

carriles es de 147 pb, M: escalera de 100 pb.

37

147 pb


Figura 6. Producto digerido del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1. Gel de agarosa al 1.5%

teñido con bromuro de etidio. Se observan dos bandas de 90 y 61 pb. Genotipos en números negros:

genotipo 1, Ile/Ile (carriles 1,3,5,6,7), genotipo 2, Ile/Val (carriles 2,4,8,9,10,11,13) y genotipo 3, Val/Val

(carril 12).

Se detectó el polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 al amplificar un producto

de 113 pb y digestión de este con la enzima AcuI donde se observaron dos

bandas de 95 y 75 pb lo que se muestra en las figuras 6 y 7.

Figura 7. Producto amplificado del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1. Gel de agarosa al

1.5% teñido con bromuro de etidio. El producto amplificado observado en todos los carriles es de 113 pb,

M: escalera de 100 pb.

38


Figura 8. Producto digerido del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1. Gel de agarosa al 1.5%

teñido con bromuro de etidio. Genotipos en números negros: genotipo 1, Leu/Leu (carril 1), genotipo 2,

Leu/Val (carriles 4,5) y genotipo 3, Val/Val (carril 3).

Análisis estadístico

Mediante conteo génico se realizó la determinación de la frecuencia de

los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 en

mujeres con cáncer de mama. Se determinó la frecuencia de los polimorfismos

mencionados en población en general (referencia) para determinar si los

genotipos se encontraban en equilibrio Hardy-Weinberg, ya que los

polimorfismos no han sido analizados en población Mexicana por lo que se

desconocen sus frecuencias en ésta.

El polimorfismo que mayormente se presentó fue Ile462Val del gen CYP1A1 en

51 casos de mujeres con cáncer de mama (67.1%) y en 44 muestras de la

población de referencia (58.6%) a diferencia del polimorfismo Leu432Val del

gen CYP1B1 que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama

(32.9%) y en 31 de las muestras de referencia (41.3%). La frecuencia de los

polimorfismos analizados en los grupos cáncer de mama y en la población de

referencia se muestra en el cuadro 6 y 7.

39


Polimorfismo Genotipos Ca mama

Casos (porcentaje)

Referencia

Casos (porcentaje)

Ile462Val

AA 10 (19.60) 13 (29.54)

AG 18 (35.29) 11 (25)

GG 23 (45.09) 20 (45.45)

Total 51 44

Leu432Val

GG 7 (28) 10 (32.25)

GC 10 (40) 12 (38.70)

CC 8 (32) 9 (29.03)

Total 25 31

Cuadro 7. Frecuencia genotípica de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes

CYP1A1 y CYP1B1, en grupo con cáncer mama y de referencia.

Polimorfismo Alelos Ca mama

Casos (porcentaje)

Referencia

Casos (porcentaje)

Ile462Val

A 37 (36.27) 29 (32.95)

G 65 (63.72) 59 (67.04)

Total 102 88

Leu432Val

G 17 (34) 42 (67.74)

C 33 (66) 20(32.25)

Total 50 62

Cuadro 8. Frecuencia alélica de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1

y CYP1B1, en grupo con cáncer de mama y de referencia.

Los genotipos de los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1

Y CYP1B1, se encuentran en equilibrio Hardy-Weinberg. Las consideraciones

estadísticas entre los grupos se describen en el cuadro 8.

40


Polimorfismo Ca mama Referencia

Ile462Val

Χ2=2.5851

P= 0.0582

Χ2= 0.4084

P=0.4152

Leu432Val Χ2=1.1918

P=0.5494

Χ2=1.8476

P=0.3970

Cuadro 9. Determinación de equilibrio Hardy-Weinberg de la distribución de los genotipos de los

polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 en los grupos de estudio.

La determinación de la prueba de chi cuadrada y el valor de p de los

polimorfismos Ile462Val y Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 se

describen en el cuadro 9.

Polimorfismo Ca mama %

Referencia %

Ile462Val

67.10

58.66

Leu432Val

32.89

41.33

Χ2 = 0.47870634

P = 0.7921

Χ2 = 0.67709214

P = 0.2785

Cuadro 10. Determinación de chi cuadrada y valor de p en los polimorfismos Ile462Val y Leu432Val

de los genes CYP1A1 y CYP1B1.

41


Las frecuencias genotípicas y alélicas para los polimorfismos Ile462Val y

Leu432Val de los genes CYP1A1 Y CYP1B1 se muestran en la figura 8 y 9

respectivamente.

Figura 9. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Ile462Val del gen CYP1A1 en

grupo con cáncer de mama y de referencia

Figura 10. Frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1 en

el grupo con cáncer de mama y grupo de referencia

42


DISCUSIÓN

En mujeres, el cáncer de mama es una de las principales causas de muerte. La

complicación más frecuente es la invasión, la cual puede presentarse por un

gran número de factores entre los cuales están un diagnóstico tardío o erróneo,

antecedentes familiares y la susceptibilidad personal hacia la metástasis. En la

bibliografía internacional numerosos estudios describen y clasifican los genes

que intervienen o participan en el cáncer de mama. El presente estudio analiza

los genes que se asocian al incremento del riesgo de cáncer de mama mediante

la identificación de genotipos particulares. Los polimorfismos Ile462Val y

Leu432Val de los genes CYP1A1 y CYP1B1 respectivamente, no han sido

analizados en población Mexicana, únicamente se han estudiado en población

Caucásica y China pero con asociación a otro tipo de cáncer como el de

pulmón.

Existen varios factores que pueden alterar no sólo la producción, sino también

la exposición a las hormonas endógenas, como la edad de la menarquía, edad

del primer embarazo a término, número de embarazos y la edad de la

menopausia, y muchos de estos factores tienen un efecto adicional en el riesgo

de desarrollar cáncer de mama[5, 34, 57]. Por lo tanto, los genes implicados

en el metabolismo de las hormonas sexuales son candidatos a genes de

susceptibilidad para desarrollar cáncer de mama.

Los genes que están en la ruta de biosíntesis de hormonas sexuales pueden

afectar la síntesis y el periodo de exposición del estrógeno más activo, el

estradiol. Los genes que se encuentran en esta vía son los de la familia de

CYP.[45, 46]

En este estudio nosotros consideramos importante estudiar estos genes debido

a que muchos tóxicos ambientales tienen la capacidad de ingresar al organismo

y competir por el sitio activo del receptor a estrógeno con lo cual sin tener una

naturaleza de hormona, se comportan como tal y pueden ejercer algunas de las

43


funciones que se han descrito para las hormonas, en particular, para los

estrógenos, como son la capacidad de incrementar el índice mitótico en muchos

tipos de células, pero algunos tóxicos adicionalmente también pueden inducir

mutaciones e inmunosupresión[4, 58]. Por esta razón muchos hidrocarburos

han sido llamados xenoestrógenos y han sido asociados al incremento del

riesgo para desarrollar algunos tipos de tumores malignos, en especial aquellos

que son de tipo hormono-dependiente como es el cáncer de mama o el de

próstata [29, 49, 58].

En particular la CYP1A1 es una enzima extrahepática. Su expresión

constitutiva es muy baja, pero es muy inducible por ligandos del receptor Ah

(hidrocarburos aromáticos policíclicos, dioxinas, humo del tabaco y otros

xenoestrógenos) por lo que la exposición a estos compuestos aumenta de

forma significativa sus niveles en tejidos como el pulmón, la placenta, la

glándula mamaria o los linfocitos [10, 11, 59].

En otras poblaciones estudiadas anteriormente algunas de las variantes

polimórficas, se han relacionado con una mayor incidencia del cáncer de

pulmón en algunos grupos de población, sin embargo no había evidencia de un

riesgo mayor de desarrollar cáncer de mama entre las mujeres que

presentaban alguna de las variantes polimórficas de los genes CYP1A1 o

CYP1B1. [12, 20, 60]

Ningún reporte anterior demostró un aumento de riesgo de cáncer de

mama asociado con algún polimorfismo en particular de estos genes. Sin

embargo, se publicó recientemente un meta-análisis que informó de un OR de

0.91 (IC 95% 0.79, 1.04) asociado con la condición de ser heterocigoto Asn/Ser

y un OR de 0.85 (95% IC 0,54, 1,34) asociado con la condición de ser

homocigoto Ser/Ser para estos genes y un riesgo mayor para desarrollar cáncer

de mama[23]. Esto es importante debido a algunas variantes polimórficas de

los genes CYP1A1 y CYP1B1 han mostrado ser funcionalmente más eficientes

en su actividad catalítica para la conversión de estrógeno a 4-hidroxi-estrógeno

44


y de algunos tóxicos en compuestos menos agresivos, por medio de procesos

de metilación, así como diferentes respuestas ante la exposición a tóxicos y

niveles de daño al ADN, este mecanismo puede ser el más relevante en la

presentación de una enfermedad benigna del tejido mamario y su progresión

hasta cáncer de mama, incluso con la formación de metástasis[61-63].

Nuestros resultados mostraron que el polimorfismo que mayormente

se presentó fue Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 casos de mujeres con cáncer

de mama (67.1%) y en 44 muestras de la población de referencia (58.6%) con

un valor de p=0.7921; a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1

que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama (32.9%) y

en 31 de las muestras de referencia (41.3%) con un valor de p=0.2785.

Consideramos que pese a que nuestra muestra fue pequeña, la

diferencia que encontramos puede sugerir que debido a que las enzimas

CYP1A1 y CYP1A2 juegan un papel importante en la activación de algunos pro-

carcinógenos, convirtiéndolos en metabolitos intermediarios que pueden unirse

al ADN originando mutaciones[1],y que la CYP1A1 activa el beno(a)pireno y

otros hidrocarburos aromáticos policíclicos, y participa fundamentalmente en la

activación de nitrosaminas, aflatoxina B1 y aminas aromáticas[59, 64], con las

cuales muchas personas tienen exposición no sólo por actividad laboral o por

lugar de residencia, sino también por tóxicos que son ingeridos en los

productos para la alimentación o para uso domestico, y es muy posible que la

variante polimórfica que nosotros encontramos como más frecuente, no sea la

más apta para el adecuado metabolismo de los tóxicos y que muchas de las

mujeres que desarrollaron este tipo de tumor hubieran sido susceptibles por

esta deficiencia en esta enzima.

En el caso del CYP1B1 que también se expresa de forma constitutiva en el

riñón, próstata, glándula mamaria o el ovario, pero no en el hígado [12, 61]. Y

que en general su expresión basal (en situaciones de no inducción) es mayor

que la del CYP1A1 y que participa tanto en el metabolismo de estrógenos como

45


de hidrocarburos aromáticos policíclicos y de aminas heterocíclicas [19, 22, 61,

62]. Para este gen del CYPlB1 se han descrito diferentes variaciones alélicas

algunas de las cuales se traducen en una alteración funcional [22, 63]. Se ha

sugerido un posible papel del enzima como modulador de ciertos procesos de

crecimiento y diferenciación, así como una sobreexpresión del mismo en

algunos tumores[12, 62]. Sin embargo, en este estudio nosotros observamos

que esta variante Leu432Val del gen CYP1B1 (32.9%) que fue encontrada para

esta población estudiada no fue significativamente diferente a la reportada para

la variante Ile462Val del gen CYP1A1(67.1%), lo cual podría tener explicación

en el tipo de agentes tóxicos a los que estuvieron expuestas estas pacientes o

sus factores de exposición a estrógenos endógenos que pudieron jugar un

papel importante como ya lo hemos mencionado.

Es importante señalar que las limitantes principales de este estudio fue el

de encontrar personas que de acuerdo a los criterios de inclusión desearan

participar en el estudio, lo cual redujo nuestro universo de trabajo. Sin

embargo, aun cuando nuestra población de estudio fue pequeña la posibilidad

de identificar la frecuencia de los polimorfismos de los genes de la familia CYP1

fue importante debido a que podría ser factible considerarlo en la estimación

de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para contribuir a la información de

toxicidad de ciertas sustancias.

46


CONCLUSIONES

Los resultados del presente estudio indican una clara diferencia en la

frecuencia de los polimorfismos Ile462Val del gen CYP1A1 en 51 casos de

mujeres con cáncer de mama (67.1%) y en 44 muestras de la población de

referencia (58.6%) a diferencia del polimorfismo Leu432Val del gen CYP1B1

que se presentó sólo en 25 casos de mujeres con cáncer de mama (32.9%) y

en 31 de las muestras de referencia (41.3%). Siendo el polimorfismos del gen

CYP1A1 el que con mayor frecuencia se observó en el grupo con cáncer de

mama, a diferencia del grupo tomado como referencia.

47


PERSPECTIVAS

La identificación y estimación de la frecuencia de los polimorfismos de los

genes de la familia CYP1, es importante debido a que podría ser factible

considerarlo en la estimación de riesgo para desarrollar cáncer de mama y para

contribuir a la información de toxicidad de ciertas sustancias.

Es necesario hacer un estudio con un mayor tamaño de muestra, ya que

el análisis estadístico puede encontrarse en el límite de la diferencia

significativa, por el reducido número de individuos analizados debido a las

dificultades técnicas para conseguir muestras.

El cáncer de mama es una enfermedad heterógenea debido a sus

múltiples formas de presentación, es por esto que es importante realizar otros

estudios que permitan determinar la distribución de los polimorfismos en todo

el país, así como su interacción con otros factores tanto genéticos como

ambientales

Es el primer estudio en nuestro conocimiento que realiza una estimación de la

frecuencia de los polimorfismos presentados asociados con el incremento del

riesgo para cáncer de mama en población Mexicana. Es necesario incrementar

el número de polimorfismos de los genes estudiados para poder analizar de qué

manera contribuyen al desarrollo de este tipo de tumor y de esta forma poder

considerarlo, en un futuro, en la estimación de riesgo.

49


ANEXOS


Anexo I. Carta Consentimiento Informado

Guadalajara, Jalisco a _____de_____del 200_

A quien corresponda:

Por este medio comunico que se me ha informado con detalle, los objetivos, alcances y

beneficios del proyecto de investigación “Frecuencia de los polimorfismos de los genes CYP1A1

y CYP1B1 en mujeres con Cáncer de Mama”, en el cual deseo participar libre y voluntariamente.

Se me ha explicado claramente que mi participación consiste, en permitir que el personal

responsable del proyecto, me realice preguntas para la elaboración de mi historia clínica, que

me tomen muestras de sangre, en las fechas que se me indique. Asimismo estoy informada que

voy a recibir los resultados de mis estudios y que puedo solicitar mas información si tuviera

alguna duda en cuanto a ellos.

Se me ha indicado también, que puedo dejar de participar en el proyecto en el momento en

que yo así lo desee y que esta decisión no tendrá ninguna consecuencia negativa para mí, ni

para recibir la atención médica que requiera.

____________________________________

Nombre y firma del participante

Domicilio ____________________________

Teléfono ____________________________

____________________________ _________________________

Nombre del Testigo Firma del Testigo

____________________________ ______________________________

Investigador Responsable

Dra. Ruth De Celis Carrillo Biol. Laura Janin Muñoz Islas

Lab. de Oncología Ambiental Lab. Oncología Ambiental

División de Inmunología, CIBO, IMSS División de Inmunología, CIBO, IMSS

53


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