Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Departamento de Patología Interpretación de...

UUniversidad Nacional de Colombianiversidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Facultad de Medicina Departamento de PatologíaDepartamento de Patología

Interpretación de patrones de Interpretación de patrones de Restricción del DNA producidos Restricción del DNA producidos por PFGE: Criterios para la por PFGE: Criterios para la tipificación de Cepas tipificación de Cepas Bacterianas.Bacterianas.

HERBERT PUENTES PUENTESHERBERT PUENTES PUENTES

Residente I PatologíaResidente I Patología

Universidad Nacional de Universidad Nacional de ColombiaColombia

GENERALIDADES - PFEG GENERALIDADES - PFEG

Esta técnica separa moléculas de DNA en Esta técnica separa moléculas de DNA en matrices de agarosa, sometiéndolas en matrices de agarosa, sometiéndolas en campos eléctricos que se alternan en dos campos eléctricos que se alternan en dos direcciones.direcciones.

Se considera el Se considera el “Gold standard”“Gold standard” de los de los métodos de tipificación molecular de métodos de tipificación molecular de cepas bacterianas.cepas bacterianas.

Permite separar moléculas desde 20 Kpbs Permite separar moléculas desde 20 Kpbs hasta 10 Mpbs.hasta 10 Mpbs.


Los aislamientos bacterianos crecen Los aislamientos bacterianos crecen en un medio de cultivo habitual, y en un medio de cultivo habitual, y luego se combinan en luego se combinan en agarosa agarosa fundidafundida colocándose en pequeños colocándose en pequeños moldes.moldes.

Obteniéndose insertos de agarosa Obteniéndose insertos de agarosa “plugs”“plugs” que contienen las bacterias que contienen las bacterias completas.completas.


Estas se someten a lisis Estas se someten a lisis “in situ”“in situ” obteniendose DNA libre que obteniendose DNA libre que permanece inmovilizado en la matriz permanece inmovilizado en la matriz de agarosa.de agarosa.

Este DNA se corta con una enzima Este DNA se corta con una enzima de restricción que tenga una de restricción que tenga una frecuencia baja de corte según el frecuencia baja de corte según el genoma estudiado.genoma estudiado.

HISTORIA - PFEGHISTORIA - PFEG

Bruno ZimmBruno Zimm et al. et al. 70’s70’s demostraron que: demostraron que: .. “Después de remover un campo “Después de remover un campo eléctrico, la molécula elongada de DNA se eléctrico, la molécula elongada de DNA se relajaba nuevamente a su estado no relajaba nuevamente a su estado no perturbado, y que la velocidad de perturbado, y que la velocidad de relajación dependía de la longitud del relajación dependía de la longitud del DNA”DNA”

HISTORIA - PFEGHISTORIA - PFEG

David SchwartzDavid Schwartz, teorizó que: , teorizó que: Esta propiedad de relajación del Esta propiedad de relajación del DNA podría ser usada para separar moléculas DNA podría ser usada para separar moléculas grandes de DNA, ya que al cambiar grandes de DNA, ya que al cambiar periódicamente la orientación del campo periódicamente la orientación del campo eléctrico, se podría forzar a estas moléculas a eléctrico, se podría forzar a estas moléculas a relajarse en el gel durante la remoción del 1º relajarse en el gel durante la remoción del 1º campo y a elongarse para alinearse con el campo y a elongarse para alinearse con el nuevo campo. nuevo campo.

HISTORIA - PFGEHISTORIA - PFGE

David SchwartzDavid Schwartz, , demostró la demostró la efectividad de su efectividad de su método de método de alternancia de campo, alternancia de campo, al separar al separar cromosomas de cromosomas de levadura de cientos levadura de cientos de pares de bases de de pares de bases de longitud.longitud.

FUNDAMENTO - PFGEFUNDAMENTO - PFGE

Cuando el primer campo eléctrico se Cuando el primer campo eléctrico se aplica al gel las moléculas se alargan en aplica al gel las moléculas se alargan en dirección al campo y migran en eldirección al campo y migran en el gel.gel.


Luego el primer campo eléctrico se Luego el primer campo eléctrico se suprime y un segundo campo suprime y un segundo campo formando algún ángulo con el formando algún ángulo con el primero, se activa.primero, se activa.

Entonces el Entonces el DNA DNA debe cambiar su debe cambiar su conformación y reorientarse antes de conformación y reorientarse antes de que pueda migrar en la dirección del que pueda migrar en la dirección del 2º2º campo eléctrico. campo eléctrico.


El tiempo requerido para esta El tiempo requerido para esta reorientación tiene mucho que ver con el reorientación tiene mucho que ver con el tamaño de la molécula.tamaño de la molécula.

Moléculas más grandes tardan más Moléculas más grandes tardan más tiempo en realinearse.tiempo en realinearse.

El tiempo en que tarda activo cada campo El tiempo en que tarda activo cada campo se denomina se denomina pulsopulso y su duración depende y su duración depende del tamaño de las moléculas que se del tamaño de las moléculas que se quieran separar. quieran separar.

EQUIPO PARA PFGEEQUIPO PARA PFGE

TIPOS DE SISTEMAS DE PFGETIPOS DE SISTEMAS DE PFGE

Dependiendo de la geometría del Dependiendo de la geometría del electrodo, la homogeneidad y el electrodo, la homogeneidad y el método de reorientación de los método de reorientación de los campos eléctricos existen varios campos eléctricos existen varios sistemas de sistemas de PFGE.PFGE.


Los diferentes sistemas descansan Los diferentes sistemas descansan sobre el mismo principio, someter a sobre el mismo principio, someter a las moléculas de DNA a por lo menos las moléculas de DNA a por lo menos dos campos eléctricos que se dos campos eléctricos que se alternan.alternan.

El tamaño limite máximo que puede El tamaño limite máximo que puede ser resuelto por estos sistemas ser resuelto por estos sistemas parece ser el mismo.parece ser el mismo.

SISTEMAS DE PFGESISTEMAS DE PFGE


Las principales diferencias entre los Las principales diferencias entre los sistemas son: sistemas son: -- Capacidad de obtener líneas Capacidad de obtener líneas rectas. rectas. -- La velocidad de La velocidad de separación. separación. -- La La resolución dentro de un rango particular resolución dentro de un rango particular de tamaños. de tamaños. -- El El tamaño de la porción del gel que provee tamaño de la porción del gel que provee separación útil.separación útil.


Aunque muchos tipos de instrumentación Aunque muchos tipos de instrumentación para PFEG están disponibles en la para PFEG están disponibles en la actualidad, estos generalmente caen en actualidad, estos generalmente caen en dos categorías básicas.dos categorías básicas.

La primera incluye el método más sencillo La primera incluye el método más sencillo el el FIGEFIGE (Field Inversion Gel (Field Inversion Gel Electrophoresis)Electrophoresis)

SISTEMA FIGESISTEMA FIGE

Es el equipo más Es el equipo más simple diseñado para simple diseñado para electroforesis en electroforesis en campo de inversión.campo de inversión.

Funciona mediante la Funciona mediante la inversión periódica de inversión periódica de la polaridad de los la polaridad de los electrodos.electrodos.

Somete el Somete el DNADNA a una a una reorientación de reorientación de 180º.180º.

SISTEMA FIGESISTEMA FIGE

Por lo que este gasta Por lo que este gasta una cantidad de una cantidad de tiempo mayor en tiempo mayor en moverse hacia atrás.moverse hacia atrás.

Un módulo de control Un módulo de control del campo eléctrico, del campo eléctrico, una caja de gel una caja de gel standard vertical u standard vertical u horizontal con control horizontal con control de temperatura.de temperatura.


Los instrumentos de la siguiente categoría Los instrumentos de la siguiente categoría poseen la capacidad de reorientar el DNAposeen la capacidad de reorientar el DNA en un pequeño ángulo oblicuo, en un pequeño ángulo oblicuo, generalmente entre generalmente entre 9696 y y 120º.120º.

Esto hace que el DNA siempre se mueva Esto hace que el DNA siempre se mueva hacia adelante en un patrón en hacia adelante en un patrón en “zig-zag”,“zig-zag”, dentro del gel.dentro del gel.


Bajo un rango de tamaño y condiciones Bajo un rango de tamaño y condiciones óptimas similares, estos equipos son más óptimas similares, estos equipos son más rápidos.rápidos.

Generan un amplio rango de tamaños en Generan un amplio rango de tamaños en los fragmentos y proporcionan una porción los fragmentos y proporcionan una porción útil más grande del gel comparados con útil más grande del gel comparados con FIGE FIGE

SISTEMA SISTEMA TAFETAFE (TRANSVERSE (TRANSVERSE ALTERNANTING FIELD ALTERNANTING FIELD ELECTROPHORESIS)ELECTROPHORESIS)

Usa una Usa una complicada complicada geometría entre geometría entre sus electrodos y sus electrodos y un gel localizado un gel localizado verticalmente, verticalmente, para obtener para obtener líneas rectas. líneas rectas.

SISTEMA SISTEMA RGERGE (ROTATING GEL (ROTATING GEL ELECTROPHORESIS)ELECTROPHORESIS)

Mantiene un campo Mantiene un campo eléctrico homogéneo, eléctrico homogéneo, en combinación con en combinación con un gel horizontal.un gel horizontal.

El campo eléctrico es El campo eléctrico es fijo, para mover el fijo, para mover el DNADNA en una nueva en una nueva dirección , el gel dirección , el gel simplemente rota.simplemente rota.

SISTEMA SISTEMA CHEF CHEF (CLAMPED (CLAMPED HOMOGENEOUS ELECTRIC FIELD HOMOGENEOUS ELECTRIC FIELD

ELECTROPHORESIS)ELECTROPHORESIS)Sistema que se Sistema que se

caracteriza por caracteriza por obtener líneas obtener líneas rectas empleando rectas empleando para tal fin campos para tal fin campos homogéneos.homogéneos.

24 24 electrodos se electrodos se disponen en disponen en arreglo hexagonal.arreglo hexagonal.

SISTEMA SISTEMA CHEF CHEF (CLAMPED (CLAMPED HOMOGENEOUS ELECTRIC FIELD HOMOGENEOUS ELECTRIC FIELD

ELECTROPHORESIS)ELECTROPHORESIS)

El voltaje de la fuente de poder se El voltaje de la fuente de poder se divide en esos electrodos de tal forma divide en esos electrodos de tal forma que el gradiente de voltaje que se que el gradiente de voltaje que se produce es constante a lo largo de produce es constante a lo largo de todo el gel.todo el gel.

El ángulo de orientación de los El ángulo de orientación de los campos puede variar entre campos puede variar entre 6060 y y 120º.120º.

APLICACIÓN DE LOS CAMPOS APLICACIÓN DE LOS CAMPOS ELECTRICOS EN UN SISTEMA CHEFELECTRICOS EN UN SISTEMA CHEF

Cambia la dirección del campo eléctrico Cambia la dirección del campo eléctrico electrónicamente para reorientar el electrónicamente para reorientar el DNADNA, mediante , mediante cambio de la polaridad en el arreglo de electrodos.cambio de la polaridad en el arreglo de electrodos.

BIO-RAD BIO-RAD - CHEF DR III SYSTEM- CHEF DR III SYSTEM

BIO-RADBIO-RAD CHEF-DR III PULSED CHEF-DR III PULSED FIELD ELECTROPHORESIS SYSTEMFIELD ELECTROPHORESIS SYSTEM

““Permite que grandes móleculas de Permite que grandes móleculas de DNADNA(del tamaño de cromosomas o (del tamaño de cromosomas o millones de pares de bases), sean millones de pares de bases), sean eficientemente separadas” .eficientemente separadas” .

““El El DNADNA obtenido de tal manera obtenido de tal manera puede usarse para el análisis puede usarse para el análisis cariotipico.” cariotipico.”

BIO-RADBIO-RAD CHEF-DR III PULSED CHEF-DR III PULSED FIELD ELECTROPHORESIS SYSTEMFIELD ELECTROPHORESIS SYSTEM

““Los cromosomas pueden evaluarse para Los cromosomas pueden evaluarse para mapear las localizaciones de genes de interés, y mapear las localizaciones de genes de interés, y el el DNADNA digerido con endonucleasas de digerido con endonucleasas de restricción puede evaluarse también para restricción puede evaluarse también para detectar polimorfismos de longitud.”detectar polimorfismos de longitud.”

““La cámara de La cámara de 14 cm x 12.7 cm14 cm x 12.7 cm que contiene el que contiene el gel de agarosa puede cargarse con más de gel de agarosa puede cargarse con más de 15 15 muestrasmuestras (moldes de (moldes de 6 mm x 1.5 mm6 mm x 1.5 mm ) y el ) y el módulo de enfriamiento se usa para mantener módulo de enfriamiento se usa para mantener una temperatura constante al nivel operacional una temperatura constante al nivel operacional de de 14° C14° C.” .”

TÉCNICATÉCNICA

OBTENCION DE LAS CEPAS OBTENCION DE LAS CEPAS BACTERIANASBACTERIANAS

Las bacterias de la muestra a aislar se ponen en Las bacterias de la muestra a aislar se ponen en crecimiento en el medio de cultivo apropiado, en crecimiento en el medio de cultivo apropiado, en condiciones condiciones microaerófilasmicroaerófilas (10% CO (10% CO2, 2, 5% 5% HH22 y y 85% N85% N22), toda la noche a ), toda la noche a 42ºC42ºC..

Todos los aislados deben ser previamente Todos los aislados deben ser previamente identificados al nivel de especie por las técnicas identificados al nivel de especie por las técnicas standard.standard.

Las suspensiones celulares se obtienen de la Las suspensiones celulares se obtienen de la superficie de las cajas de cultivo, mediante un superficie de las cajas de cultivo, mediante un escobillón.escobillón.

PREPARACION DE LOS INSERTOS PREPARACION DE LOS INSERTOS “PLUGS”“PLUGS” DE AGAROSA DE AGAROSA

Las suspensiones se hacen en tubo seco Las suspensiones se hacen en tubo seco con 2 ml de con 2 ml de buffer salino fosfatadobuffer salino fosfatado (PBS: (PBS: 0,01 fosphate buffer, [pH 7,4] o con 0,01 fosphate buffer, [pH 7,4] o con buffer buffer de suspensión celularde suspensión celular (CBS 100mM Tris, (CBS 100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8).100mM EDTA, pH 8).

Cada suspensión celular fue ajustada a Cada suspensión celular fue ajustada a una densidad óptica de una densidad óptica de 0,35 0,35 a a 0,45 0,45 usando un turbidímetro.usando un turbidímetro.


Esto corresponde a valores de Esto corresponde a valores de absorbancia de absorbancia de 0,5700,570 a a 0,8200,820 a una a una longitud de onda delongitud de onda de 610 610 nm usando un nm usando un espectrofotómetro.espectrofotómetro.

Una alícuota de 400 microl de la Una alícuota de 400 microl de la suspensión se transfieren a tubos de 1,5 suspensión se transfieren a tubos de 1,5 ml de una microcentrífuga con 25 microl ml de una microcentrífuga con 25 microl de de proteinasa K,proteinasa K, y mezclados por y mezclados por agitación suave 3 o 4 veces. agitación suave 3 o 4 veces.


Otros 400 microl de agarosa fundida al 1% Otros 400 microl de agarosa fundida al 1% en en TETE (100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8) (100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8) son adicionados a la suspensión celular, y son adicionados a la suspensión celular, y mezclados suavemente con una pipeta mezclados suavemente con una pipeta hacia arriba y abajo por 3 veces.hacia arriba y abajo por 3 veces.

La suspensión así obtenida fue vertida de La suspensión así obtenida fue vertida de inmediato en unos moldes reutilizables inmediato en unos moldes reutilizables para obtener los para obtener los “plugs”.“plugs”.


Posteriormente los “plugs”, se Posteriormente los “plugs”, se dejan a solidificar a temperatura dejan a solidificar a temperatura ambiente por 15 minutos, o en ambiente por 15 minutos, o en nevera a 4ºC por 5 minutos.nevera a 4ºC por 5 minutos.

LISIS CELULAR EN LOS LISIS CELULAR EN LOS “PLUGS”“PLUGS”

Los Los “plugs”“plugs” se llevan a tubos de 50 ml, que se llevan a tubos de 50 ml, que contienen contienen buffer de lisisbuffer de lisis (50mM Tris, 50mM (50mM Tris, 50mM EDTA, [pH 8], 1% de sarcocina, 0,1 de EDTA, [pH 8], 1% de sarcocina, 0,1 de proteinasa K/ml).proteinasa K/ml).

La lisis se deja llevar a cabo por 15 min. en un La lisis se deja llevar a cabo por 15 min. en un agitador orbital de agua, con constante y agitador orbital de agua, con constante y vigorosa agitación.vigorosa agitación.

Aquí los tiempos de lisis varían según la cepa Aquí los tiempos de lisis varían según la cepa bacteriana y varían entre bacteriana y varían entre 0,25, 0,5, 1, 0,25, 0,5, 1, yy 2 horas 2 horas. .

LAVADOLAVADO

Después de la lisis los Después de la lisis los “plugs”,“plugs”, se lavan 3 se lavan 3 o 4 veces, 15 a 20 min. por lavado a 54ºC.o 4 veces, 15 a 20 min. por lavado a 54ºC.

Una vez con agua estéril ultrapura y tres Una vez con agua estéril ultrapura y tres veces con buffer veces con buffer TE [pH 8].TE [pH 8].

Tanto el agua como el buffer se Tanto el agua como el buffer se precalientan a 54ºC.precalientan a 54ºC.

Luego de el último lavado, se adicionan 5 Luego de el último lavado, se adicionan 5 ml de buffer ml de buffer TETE fresco a Tº ambiente. fresco a Tº ambiente.

DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE RESTRICCIONRESTRICCION

Una amplia lámina de 2mm se corta de Una amplia lámina de 2mm se corta de cada cada “plug”“plug” con un bisturí o con una con un bisturí o con una cuchilla de afeitar.cuchilla de afeitar.

Y se transfiere a un tubo que contiene 1 X Y se transfiere a un tubo que contiene 1 X de buffer de restricción con la cantidad de buffer de restricción con la cantidad especificada de la especificada de la enzima de restricción.enzima de restricción.

La elección de esta varía en la literatura La elección de esta varía en la literatura internacional dependiendo de la cepa internacional dependiendo de la cepa ??, al , al igual que el tiempo de incubación.igual que el tiempo de incubación.

ENZIMAS DE RESTRICCIONENZIMAS DE RESTRICCION

DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE RESTRICCIONRESTRICCION

Las láminas se incuban a temperatura ambiente Las láminas se incuban a temperatura ambiente (23 a 25ºC por 2 horas).(23 a 25ºC por 2 horas).

Antes de moldear el gel, la mezcla de restricción Antes de moldear el gel, la mezcla de restricción es reemplazada por 200 microl de buffer es reemplazada por 200 microl de buffer TBE TBE (10 X TBE = 0,89 M de Tris borado, 0,02 EDTA, (10 X TBE = 0,89 M de Tris borado, 0,02 EDTA, pH 8,3)pH 8,3)

Las láminas se llevan a Tº ambiente por 5 min, y Las láminas se llevan a Tº ambiente por 5 min, y luego se llevan al recipiente apropiado para luego se llevan al recipiente apropiado para electroforesis con electroforesis con gel de agarosa SKG al 1%.gel de agarosa SKG al 1%.

ELECTROFORESIS DE CAMPO ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO (PFGE)PULSADO (PFGE)

El gel se prepara en agarosa SKG al El gel se prepara en agarosa SKG al 1% en TE 0,5 X (Tris 0,1 M, Ácido 1% en TE 0,5 X (Tris 0,1 M, Ácido bórico 0,08 M, EDTA 0,1 mM).bórico 0,08 M, EDTA 0,1 mM).

Existen diversos protocolos en lo Existen diversos protocolos en lo referente a la duración e intensidad referente a la duración e intensidad de los pulsos eléctricos.de los pulsos eléctricos.


En el protocolo de PFEG del En el protocolo de PFEG del CDCCDC para tipificación del C. Jejuni, usaron para tipificación del C. Jejuni, usaron un tiempo inicial de un tiempo inicial de “switch”“switch” de 6,75 de 6,75 seg. con un seg. con un “switch”“switch” final de 38,35 sg. final de 38,35 sg.

En un gradiente de 6V x cm. y un En un gradiente de 6V x cm. y un ángulo incluido de 120º. ángulo incluido de 120º.


Estos valores de tiempo “switch” Estos valores de tiempo “switch” pueden calcularse usando la función pueden calcularse usando la función de auto-algoritmo del de auto-algoritmo del CHEF mapperCHEF mapper ((Bio-RadBio-Rad), para separar fragmentos ), para separar fragmentos en el rango de 50 a 400 kpb.en el rango de 50 a 400 kpb.

En este equipo el tiempo total En este equipo el tiempo total estimado de electroforesis es de estimado de electroforesis es de 18 18 horas.horas.


Después de completada la Después de completada la electroforesis, los geles se tiñen con electroforesis, los geles se tiñen con 400 ml de solución de 400 ml de solución de Bromuro de Bromuro de EtidioEtidio (50 microg/ml) (50 microg/ml)

Y el patrón de bandas se observa Y el patrón de bandas se observa bajo iluminación con rayos UV.bajo iluminación con rayos UV.

Y se fotografían con cámara polaroid.Y se fotografían con cámara polaroid.


La imagen digitalizada del gel se introduce La imagen digitalizada del gel se introduce al programa al programa “Quanty one - Discovery “Quanty one - Discovery Series”Series” ( (Bio-RadBio-Rad), donde se estima el ), donde se estima el peso molecular de cada fragmento.peso molecular de cada fragmento.

El programa tiene la capacidad de tener El programa tiene la capacidad de tener en cuenta los defectos de migración como en cuenta los defectos de migración como “sonrisas” o líneas convergentes, al “sonrisas” o líneas convergentes, al estimar los pesos moleculares, siendo así estimar los pesos moleculares, siendo así más preciso.más preciso.

ANALISIS COMPUTADORIZADO PARA ANALISIS COMPUTADORIZADO PARA LOS PATRONES DE PFGELOS PATRONES DE PFGE

En el protocolo del En el protocolo del CDCCDC los patrones fueron los patrones fueron analizados usando el software analizados usando el software “Molecular “Molecular analyst fingerprinting package”analyst fingerprinting package” (version 1,2 (version 1,2 Bio-Rad).Bio-Rad).

Determinándose así el error intra o intergelesDeterminándose así el error intra o intergeles Las imágenes se normalizan, por alineación Las imágenes se normalizan, por alineación

de los picos de una cepa standard, misma de los picos de una cepa standard, misma que se carga en dos o tres líneas de cada que se carga en dos o tres líneas de cada gel.gel.

TECNICA FINALTECNICA FINAL

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

Frecuentemente los Frecuentemente los microbiólogos clínicos se ven microbiólogos clínicos se ven abocados a a determinar la abocados a a determinar la relación de un grupo de relación de un grupo de aislamientos bacterianos, en el aislamientos bacterianos, en el evento de un brote epidémico.evento de un brote epidémico.


En la última década los métodos En la última década los métodos tradicionales de tipificación de tradicionales de tipificación de bacterias han sido reemplazados por bacterias han sido reemplazados por nuevos métodos moleculares como nuevos métodos moleculares como “fingerprinting” de plásmidos, “fingerprinting” de plásmidos, ribotipificación, PCR y análisis de ribotipificación, PCR y análisis de patrones de restricción del DNA patrones de restricción del DNA cromosómico por cromosómico por PFEGPFEG. .


Aún presentan utilidad ciertos Aún presentan utilidad ciertos métodos como la tipificación por métodos como la tipificación por bacteriófagos para el estudio del bacteriófagos para el estudio del Staphylococcus Aureus.Staphylococcus Aureus.

La serotipificación resulta aún útil La serotipificación resulta aún útil como herramienta de vigilancia como herramienta de vigilancia epidemiológica de vigilancia para epidemiológica de vigilancia para especies de especies de Salmonella.Salmonella.


Sin embargo existe la necesidad de Sin embargo existe la necesidad de un método de tipificación de cepas un método de tipificación de cepas que pueda ser utilizado en un amplio que pueda ser utilizado en un amplio grupo de especies bacterianas.grupo de especies bacterianas.

En el presente la En el presente la PFGE PFGE esta muy esta muy cerca de satisfacer esta necesidad. cerca de satisfacer esta necesidad.


PFGEPFGE implica el embeber organismos en implica el embeber organismos en agarosa.agarosa.

Lisis bacteriana “in situ”.Lisis bacteriana “in situ”.Digestión del DNA cromosómico con Digestión del DNA cromosómico con

endonucleasas de restricción.endonucleasas de restricción.Los Fxs de DNA se aíslan en un patrón de Los Fxs de DNA se aíslan en un patrón de

bandas discretas en el gel, por medio de bandas discretas en el gel, por medio de un aparato que cambia la dirección de la un aparato que cambia la dirección de la corriente en un patrón predeterminado. corriente en un patrón predeterminado.


Actualmente no existen criterios Actualmente no existen criterios standard para el análisis de los standard para el análisis de los patrones de los fragmentos.patrones de los fragmentos.

Consecuentemente varios Consecuentemente varios investigadores pueden llegar a investigadores pueden llegar a diferentes conclusiones sobre si los diferentes conclusiones sobre si los aislados pertenecen o no, a la cepa aislados pertenecen o no, a la cepa del brote.del brote.


Este artículo propone unas guías Este artículo propone unas guías para la interpretación para los para la interpretación para los patrones de restricción del DNA patrones de restricción del DNA generados por generados por PFGE.PFGE.

En un esfuerzo por hacer del En un esfuerzo por hacer del PFGE PFGE un método más comprensible, se un método más comprensible, se abolieron los métodos estadísticos.abolieron los métodos estadísticos.

DEFINICIONESDEFINICIONES

Aislado:Aislado: Es un término general para Es un término general para un cultivo puro de bacterias obtenido un cultivo puro de bacterias obtenido de un subcultivo de una colonia de un subcultivo de una colonia simple desde una caja de aislamiento simple desde una caja de aislamiento primario, presumiblemente derivado primario, presumiblemente derivado de un organismo simple, pero sin de un organismo simple, pero sin información disponible acerca de su información disponible acerca de su género o especie.género o especie.


Aislados epidemiológicamente Aislados epidemiológicamente relacionados: relacionados: Son aislados cultivados de Son aislados cultivados de especímenes recolectados de pacientes, especímenes recolectados de pacientes, fómites o del medio ambiente durante un fómites o del medio ambiente durante un corto período, en un área bien definida, corto período, en un área bien definida, como parte de una investigación como parte de una investigación epidemiológica que sugiere, estos pueden epidemiológica que sugiere, estos pueden ser derivados de una fuente comúnser derivados de una fuente común


Aislados genéticamente relacionados Aislados genéticamente relacionados (clones):(clones): Son aislados que son Son aislados que son indistinguibles de otros por una indistinguibles de otros por una variedad de test genéticos, o que son variedad de test genéticos, o que son tan similares que se presume son tan similares que se presume son derivados de una fuente parental derivados de una fuente parental común.común.


Brote: Brote: Un brote es el aumento de la Un brote es el aumento de la incidencia de una enfermedad incidencia de una enfermedad infecciosa en un sitio específico, infecciosa en un sitio específico, durante un período dado y que esta durante un período dado y que esta por encima de la rata de la línea de por encima de la rata de la línea de base para un lugar y un tiempo dado. base para un lugar y un tiempo dado.


Cepa: Cepa: Es Es un aislado o un grupo de aislados un aislado o un grupo de aislados que pueden distinguirse de otros de que pueden distinguirse de otros de los mismos géneros y especies por los mismos géneros y especies por las características fenotípicas y/o las características fenotípicas y/o genotípicas. genotípicas. Una cepa es una subdivisión Una cepa es una subdivisión descriptiva de una especie.descriptiva de una especie.


Cepa del brote: Cepa del brote: Son aislados de la misma especie Son aislados de la misma especie que son tanto epidemiológica que son tanto epidemiológica (tiempo, lugar y fuente de infección (tiempo, lugar y fuente de infección común) y genéticamente relacionadas. común) y genéticamente relacionadas. Tales aislados puede asumirse que Tales aislados puede asumirse que están clonalmente relacionados. están clonalmente relacionados.


Cepas endémicas:Cepas endémicas: Son aislados que se recobran Son aislados que se recobran frecuentemente de pacientes infectados frecuentemente de pacientes infectados bajo el marco de una institución de salud o bajo el marco de una institución de salud o comunidad, y que son indistinguibles o comunidad, y que son indistinguibles o estrechamente relacionados a otras por estrechamente relacionados a otras por métodos de tipificación, pero que no métodos de tipificación, pero que no tienen asociación epidemiológica directa tienen asociación epidemiológica directa que pueda ser demostrada.que pueda ser demostrada.

METAS PARA LA TIPIFICACION METAS PARA LA TIPIFICACION DE CEPASDE CEPAS

La meta es proveer evidencia de que La meta es proveer evidencia de que AERAER recolectados durante el brote de recolectados durante el brote de la enfermedad son también la enfermedad son también GRGR y y representan la misma cepa.representan la misma cepa.

Información útil para el entendimiento Información útil para el entendimiento y control de la extensión de y control de la extensión de enfermedades en hospitales y enfermedades en hospitales y comunidades.comunidades.

METAS PARA LA TIPIFICACION METAS PARA LA TIPIFICACION DE CEPASDE CEPAS

El análisis de resultados para el El análisis de resultados para el control de infecciones se basa en: control de infecciones se basa en: --Si la cepa del brote es de una Si la cepa del brote es de una progenie reciente o de un precursor progenie reciente o de un precursor común. común. --Si tales aislados son del mismo Si tales aislados son del mismo genotipo. genotipo. --Si Si AER AER tienen diferentes genotípostienen diferentes genotípos

¿DE DONDE OBTENER LOS ¿DE DONDE OBTENER LOS AISLADOS?AISLADOS?

De pacientes, fómites y fuentes De pacientes, fómites y fuentes ambientales, que estén relacionados con: ambientales, que estén relacionados con: - - El área donde las infecciones están El área donde las infecciones están ocurriendo. ocurriendo. -- El período durante el cual El período durante el cual las infecciones ocurrieron. las infecciones ocurrieron. -- La fuente común de La fuente común de infeccióninfección. .

ANALISISANALISIS

Los estudios de tipificación hechos en Los estudios de tipificación hechos en aislados en los cuales la información aislados en los cuales la información epidemiológica no está disponible, puede epidemiológica no está disponible, puede conducir a información errada.conducir a información errada.

La tipificación de las cepas no sustituye La tipificación de las cepas no sustituye los datos epidemiológicos.los datos epidemiológicos.

Por lo tanto dos sets de datos deben Por lo tanto dos sets de datos deben desarrollarse independientemente, pero desarrollarse independientemente, pero ser analizados juntos.ser analizados juntos.

CRITERIOS INTERPRETATIVOSCRITERIOS INTERPRETATIVOS

Para interpretar los patrones de Para interpretar los patrones de fragmentos de DNA generados por fragmentos de DNA generados por PFGE PFGE y transformarlos en y transformarlos en información epidemiológicamente útil, información epidemiológicamente útil, el microbiólogo debe entender como el microbiólogo debe entender como comparar estos patrones y cómo los comparar estos patrones y cómo los eventos genéticos al azar pueden eventos genéticos al azar pueden alterarlos.alterarlos.


Eventos genéticos al azar: Eventos genéticos al azar: Mutaciones puntuales, inserciones y Mutaciones puntuales, inserciones y deleciones del DNA alteran los deleciones del DNA alteran los patrones de patrones de PFGE PFGE durante el curso durante el curso de un brote.de un brote.

El conocimiento de éstos permite al El conocimiento de éstos permite al microbiólogo asignar al aislado a una microbiólogo asignar al aislado a una de cuatro categorías.de cuatro categorías.


Los criterios propuestos son Los criterios propuestos son fidedignos si la PFGE demuestra al fidedignos si la PFGE demuestra al menos menos 10 10 fragmentos distintos.fragmentos distintos.

Cuando son menos la veracidad y Cuando son menos la veracidad y habilidad discriminatoria de los habilidad discriminatoria de los criterios se desconoce.criterios se desconoce.

ASIGNACIÓN DE CATEGORÍASASIGNACIÓN DE CATEGORÍAS

Lo primero es comparar el patrón del Lo primero es comparar el patrón del brote, con el patrón de la cepa aislada.brote, con el patrón de la cepa aislada.

Tamaño y número de los fragmentos.Tamaño y número de los fragmentos.Con base en el apareo de fragmento por Con base en el apareo de fragmento por

fragmento de cada aislamiento, se fragmento de cada aislamiento, se clasifica entonces según su relación con la clasifica entonces según su relación con la cepa del brote.cepa del brote.

ASIGNACIÓN DE CATEGORÍASASIGNACIÓN DE CATEGORÍAS

Patrones distintivamente diferentes Patrones distintivamente diferentes de el del brote de el del brote (< 50%(< 50% fxs comunes) fxs comunes) se consideran tipos no relacionados.se consideran tipos no relacionados.

Patrones que difieren en dos o tres Patrones que difieren en dos o tres fragmentos se consideran subtipos fragmentos se consideran subtipos del patrón del brote. del patrón del brote.

CATEGORIASCATEGORIAS

Indistinguible: Indistinguible: Los aislados se designan Los aislados se designan como genéticamente indistinguibles, como genéticamente indistinguibles, si las bandas de los patrones de si las bandas de los patrones de restricción tienen el mismo número y restricción tienen el mismo número y tamaño aparente. tamaño aparente.

CATEGORÍASCATEGORÍAS

Estrechamente Relacionada:Estrechamente Relacionada: Un aislado cae dentro de Un aislado cae dentro de esta categoría, si los patrones de esta categoría, si los patrones de PFEGPFEG difieren de los del brote por cambios difieren de los del brote por cambios generados por un generados por un simple evento genéticosimple evento genético (mutación puntual, inserción o deleción). (mutación puntual, inserción o deleción). Tales cambios Tales cambios presentan diferencias en dos o tres presentan diferencias en dos o tres bandas.bandas.

EFECTO DE LOS EVENTOS GENÉTICOS EFECTO DE LOS EVENTOS GENÉTICOS EN LOS PATRONES PFEGEN LOS PATRONES PFEG

Mutación puntual resultante en un sitio de Mutación puntual resultante en un sitio de restricción:restricción: La cepa alterada puede carecer de La cepa alterada puede carecer de un fragmento presente en el patrón del un fragmento presente en el patrón del brote, y concomitantemente generarse brote, y concomitantemente generarse dos pequeños fragmentos no presentes dos pequeños fragmentos no presentes en la cepa original, las sumas de estos en la cepa original, las sumas de estos deben aproximarse al tamaño del original. deben aproximarse al tamaño del original. A esto se considera una A esto se considera una diferencia de tres fragmentos.diferencia de tres fragmentos.

MUTACION PUNTUAL GENERADORA DE MUTACION PUNTUAL GENERADORA DE UN UN SITIO DE RESTRICCIONSITIO DE RESTRICCION


Mutación puntual resultante en pérdida de Mutación puntual resultante en pérdida de un sitio de restricción: un sitio de restricción: La cepa alterada puede La cepa alterada puede tener un nuevo fragmento de mayor tener un nuevo fragmento de mayor tamaño no presente en la cepa del brote, tamaño no presente en la cepa del brote, habiendo perdido dos pequeños habiendo perdido dos pequeños fragmentos. fragmentos. Esta es una Esta es una diferencia de diferencia de tres fragmentostres fragmentos. .

MUTACION PUNTUAL CON PERDIDA DE MUTACION PUNTUAL CON PERDIDA DE UN UN SITIO DE RESTRICCIONSITIO DE RESTRICCION


Inserción de DNA dentro de un fragmento de Inserción de DNA dentro de un fragmento de restricción preexistente: restricción preexistente: La cepa alterada puede La cepa alterada puede tener el mismo número de fragmentos que la tener el mismo número de fragmentos que la cepa del brote, pero esta carece de un cepa del brote, pero esta carece de un pequeño fragmento generándose un nuevo pequeño fragmento generándose un nuevo fragmento de mayor tamaño. fragmento de mayor tamaño. A esta diferencia se le A esta diferencia se le conoce como conoce como “desviación de fragmento” “desviación de fragmento”

INSERCIONINSERCION DE DNA EN UN FX DE DE DNA EN UN FX DE RESTRICCIONRESTRICCION


Deleción de DNA de un fragmento: Deleción de DNA de un fragmento: La La cepa alterada puede mostrar un cepa alterada puede mostrar un nuevo fragmento de menor tamaño nuevo fragmento de menor tamaño con perdida de un fragmento mayor. con perdida de un fragmento mayor. Esta es una diferencia de dos Esta es una diferencia de dos fragmentosfragmentos..

DELECIÓNDELECIÓN DE DNA DE UN DE DNA DE UN FRAGMENTOFRAGMENTO

CATEGORIAS CATEGORIAS

Posiblemente relacionada: Posiblemente relacionada: Un aislado se considera Un aislado se considera posiblemente relacionado si el patrón posiblemente relacionado si el patrón de PFGE, difiere del patrón del brote de PFGE, difiere del patrón del brote por cambios consistentes en por cambios consistentes en dos dos eventos genéticoseventos genéticos independientes. independientes.

CATEGORÍASCATEGORÍAS

Diferencias de Diferencias de 44 a a 66 bandas pueden bandas pueden explicarse por inserciones o deleciones explicarse por inserciones o deleciones simples, o por ganancia o pérdida de sitios simples, o por ganancia o pérdida de sitios de restricción.de restricción.

Los aislados al no ser genéticamente Los aislados al no ser genéticamente estrechamente relacionados a la cepa del estrechamente relacionados a la cepa del brote es menos probable que estén brote es menos probable que estén relacionados epidemiológicamente.relacionados epidemiológicamente.

CATEGORIASCATEGORIAS

No Relacionado:No Relacionado: Un aislado se considera no Un aislado se considera no relacionado a la cepa del brote si su patrón relacionado a la cepa del brote si su patrón de PFGE, difiere por cambios consistentes de PFGE, difiere por cambios consistentes con con 3 o más eventos genéticos3 o más eventos genéticos independientes (diferencias de independientes (diferencias de 77 o más o más bandas). Esto implica que < bandas). Esto implica que < 50% de los fragmentos de tal aislado están 50% de los fragmentos de tal aislado están presentes en la cepa del brote.presentes en la cepa del brote.

MÉTODO DE REPORTEMÉTODO DE REPORTE

El patrón de restricción de DNA de la cepa El patrón de restricción de DNA de la cepa del brote se reporta como tipo del brote se reporta como tipo A.A.

Si el aislado tiene todos los patrones de la Si el aislado tiene todos los patrones de la cepa original, hace parte del brote.cepa original, hace parte del brote.

Patrones estrecha o posiblemente Patrones estrecha o posiblemente relacionados, se consideran subtipos de A relacionados, se consideran subtipos de A y se nombran y se nombran A1 A1 y y A2.A2.

MÉTODO DE REPORTEMÉTODO DE REPORTE

Los aislados Los aislados estrechamenteestrechamente o o posiblementeposiblemente relacionados según los relacionados según los patrones de restricción se reportan como patrones de restricción se reportan como probableprobable o o posiblementeposiblemente relacionados relacionados epidemiológicamente.epidemiológicamente.

Los patrones que difieren sustancialmente Los patrones que difieren sustancialmente del patrón del brote y que se clasifican del patrón del brote y que se clasifican como no relacionados se designan con los como no relacionados se designan con los tipos tipos BB y y CC..

CRITERIOS PARA LA CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE PFEGINTERPRETACIÓN DE PFEG

CONSIDERACIONES GENERALES PARA CONSIDERACIONES GENERALES PARA EL USO DE LAS GUIASEL USO DE LAS GUIAS

Esas guías fueron diseñadas para Esas guías fueron diseñadas para analizar pequeños sets de aislados analizar pequeños sets de aislados obtenidos durante brotes potenciales obtenidos durante brotes potenciales en hospitales o comunidades en en hospitales o comunidades en periodos relativamente cortos.periodos relativamente cortos.


Los criterios para la identificación de Los criterios para la identificación de las cepas son estrictos y no son las cepas son estrictos y no son apropiados para estudios de grandes apropiados para estudios de grandes poblaciones de aislados recolectados poblaciones de aislados recolectados en periodos de más de un año.en periodos de más de un año.


Laboratorios de referencia que investigan Laboratorios de referencia que investigan relaciones potenciales entre los aislados relaciones potenciales entre los aislados por periodos extendidos, deben modificar por periodos extendidos, deben modificar estos criterios y reacomodarse al uso de estos criterios y reacomodarse al uso de múltiples enzimas y análisis.múltiples enzimas y análisis.

Diferentes enzimas de restricción han Diferentes enzimas de restricción han probado ser útiles para el análisis de probado ser útiles para el análisis de PFGE de diferentes especies bacterianas.PFGE de diferentes especies bacterianas.

DATOS REPRESENTATIVOS PARA DATOS REPRESENTATIVOS PARA BACTERIAS ANALIZADAS POR PFEGBACTERIAS ANALIZADAS POR PFEG


Antes de que Antes de que PFGE PFGE pueda ser pueda ser considerado disponible para la considerado disponible para la tipificación de especies bacterianas, tipificación de especies bacterianas, la técnica debe ser validada.la técnica debe ser validada.

CONTROLESCONTROLES

Una cepa bien caracterizada debe ser Una cepa bien caracterizada debe ser procesada junto con los aislados procesada junto con los aislados desconocidos a evaluarse.desconocidos a evaluarse.

Un tamaño Un tamaño molecular estándarmolecular estándar debe debe correrse en al menos una línea del gel correrse en al menos una línea del gel para proveer orientación del tamaño de para proveer orientación del tamaño de los fragmentos (línea externa o línea de la los fragmentos (línea externa o línea de la mitad).mitad).

CONTROLESCONTROLES

Si se obtienen los resultados esperados Si se obtienen los resultados esperados con el organismo de control, se puede con el organismo de control, se puede afirmar: afirmar: - - El procedimiento, incluyendo lisis El procedimiento, incluyendo lisis celular, lavado y digestión por celular, lavado y digestión por endonucleasas, fue hecho endonucleasas, fue hecho apropiadamente. apropiadamente. - - El gel y las condiciones electroforéticas El gel y las condiciones electroforéticas fueron apropiadas. fueron apropiadas. - - Las condiciones del Las condiciones del procedimiento condujeron a resultados que procedimiento condujeron a resultados que son reproduciblesson reproducibles..

CONTROLESCONTROLES

Los estándares son necesarios para Los estándares son necesarios para evaluar las diferencias menores de perfil evaluar las diferencias menores de perfil que puedan resultar de un cambio que puedan resultar de un cambio genético simple.genético simple.

En la mayoría de los casos los estimados En la mayoría de los casos los estimados visuales del tamaño de los fragmentos son visuales del tamaño de los fragmentos son adecuados para la interpretación de las adecuados para la interpretación de las diferencias de perfil en PFGE.diferencias de perfil en PFGE.

CONTROLESCONTROLES

Entre los estándares moleculares Entre los estándares moleculares comúnmente usados están: comúnmente usados están: -- Fagos Lamda Fagos Lamda -- Tapones de agarosa que contienen Tapones de agarosa que contienen fragmentos de restricción de DNA del fragmentos de restricción de DNA del Saccharomyces cerevisiae.Saccharomyces cerevisiae. - - Fragmentos restricción de DNA de varios Fragmentos restricción de DNA de varios organismos bien caracterizados, como organismos bien caracterizados, como S. S. aureus, Enterococus faecium, E colíaureus, Enterococus faecium, E colí, etc., etc.

CEPAS BACTERIANAS CON PATRONES CEPAS BACTERIANAS CON PATRONES DE RESTRICCION CONOCIDOSDE RESTRICCION CONOCIDOS

SEGURIDADSEGURIDAD

Tres tópicos de seguridad deben tocarse Tres tópicos de seguridad deben tocarse antes de aplicar PFGE a una bacteria antes de aplicar PFGE a una bacteria patógena: patógena: - - Riesgos asociados a la propagación Riesgos asociados a la propagación de la bacteria. de la bacteria. -- Manipulación y disposición de Manipulación y disposición de reactivos químicos. reactivos químicos. -- Riesgo de shock eléctrico. Riesgo de shock eléctrico.

SEGURIDADSEGURIDAD

Se deben tomar precauciones para evitar Se deben tomar precauciones para evitar la producción de aerosoles durante la la producción de aerosoles durante la centrifugación.centrifugación.

Prevenir la liberación del agente Prevenir la liberación del agente infeccioso al medio por ruptura de pipetas infeccioso al medio por ruptura de pipetas o tubos.o tubos.

Precaución especial con agentes Precaución especial con agentes infecciosos que colonizan por la vía infecciosos que colonizan por la vía respiratoria.respiratoria.

SEGURIDADSEGURIDAD

Precaución con bacterias que requieren Precaución con bacterias que requieren bajas dosis de inoculación para ser bajas dosis de inoculación para ser patógenas (Shigella, E colí).patógenas (Shigella, E colí).

Químicos peligrosos como el Bromuro de Químicos peligrosos como el Bromuro de Etidio, que es un poderoso mutágeno.Etidio, que es un poderoso mutágeno.

Fenilmetilsulfonil fluorado, destructor de Fenilmetilsulfonil fluorado, destructor de las mucosas de tracto respiratorio, ojos y las mucosas de tracto respiratorio, ojos y piel, fatal si se ingiere o inhala.piel, fatal si se ingiere o inhala.

SEGURIDADSEGURIDAD

La separación de los grandes fragmentos La separación de los grandes fragmentos de DNA en el gel de electroforesis por de DNA en el gel de electroforesis por PFGE, se debe a los altos voltajes PFGE, se debe a los altos voltajes eléctricos.eléctricos.

Goteos en el sistema de recirculación del Goteos en el sistema de recirculación del buffer pueden someter al operador a altos buffer pueden someter al operador a altos voltajes.voltajes.

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Departamento de Patología Interpretación de...

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