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Universidad Veracruzana

Facultad de Nutrición – Xalapa

Manual de Prácticas de la Experiencia Educativa de:

“Microbiología de los alimentos “

Elaborado por:

Dra. Marcela Rosas Nexticapa

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Xalapa, Veracruz Julio 2017

INDICE

Núm. Pág. 0 Normas de seguridad en el laboratorio 1 Morfología de bacterias y coloraciones simples

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2 Morfología de hongos y levaduras

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3 Observación de cápsulas

8

4 Coloración del núcleo

10

5 Coloración de esporas

12

6 Tinción de Gram

15

7 Preparación de medios de cultivo

17

8 Siembre y estudio de cultivos puros

21

9 Identificación de una bacteria desconocida

24

10 Pueblas bioxidativas

27

11 Pruebas de hidrólisis

31

12 Análisis de agua. Número Más Probable

34

13 Prueba de reductasa en la leche

36

14 Cuenta total de bacterias en leche

39

15 Cuenta de mesófilos aerobios en alimentos 41 16 Determinación de coliformes totales, Salmonella

y Sigella en alimentos que se comen crudos

44

17 Determinación de S. Aureus en productos Cárnicos derivados de la leche y de la carne

46

Anexo NORMA Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba

microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos

patógenos

BIBLIOGRAFÍA

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

Facultad de Nutrición

PRACTICA #0 Seguridad en el laboratorio

Área académica: Ciencias de la Salud Fecha de la última

revisión: Julio 2017

Academia:

Ciencias Alimentarias

4h

Prácticas CS-01

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA INTRODUCCIÓN Todas las personas que trabajan con materiales que contengan agentes infecciosos deben estar conscientes de los peligros potenciales asociados a estos agentes, además deben estar entrenadas en las prácticas y técnicas requeridas para manejar estos materiales de una manera segura. Es por ello que antes de comenzar con las actividades prácticas, todas las personas involucradas (estudiantes y profesores) tenemos la obligación de conocer cuáles son las normas de seguridad a seguir en el laboratorio de manera tal, que el trabajo se realice con un riesgo mínimo de exposición, tanto para las personas que lo ejecutan como para el medio ambiente. El objetivo general de esta lectura, es ofrecerle al estudiante una guía para que realice sus actividades prácticas en el Laboratorio de Microbiología de una manera adecuada y segura. BIOSEGURIDAD La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conocimiento, de las técnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposición del personal, del área de laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos. Agentes Biopeligrosos Son todos aquellos agentes biológicos y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos citar: bacterias, virus, hongos, parásitos, productos recombinantes, alergenos, priones, etc. Riesgo Microbiológico En el Laboratorio de Microbiología existen dos fuentes principales de peligros biológicos, uno de ellos lo representa el procesamiento de muestras provenientes de un paciente y en segundo lugar el manejo de cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a provocar una infección si no son manipulados con precaución. El Riesgo Microbiológico se encuentra presente cada vez que realicemos una actividad práctica en el Laboratorio de Microbiología, razón por la cual debemos llevarlas a cabo con precaución, además de tener un ambiente de trabajo en el que seamos capaces de

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reconocer y evitar los peligros involucrados con estas actividades, para así poder evitar posibles accidentes. Infecciones Adquiridas en el Laboratorio Se dice que ocurre una contaminación en un Laboratorio Microbiológico, cuando un microorganismo, capaz de causar enfermedad, entra al cuerpo de un individuo en una concentración suficiente y a través de una ruta determinada, siendo capaz de vencer las defensas del individuo. Una Infección Adquirida en el Laboratorio (IAL) es aquella que resulta de una tarea realizada en el Laboratorio de Microbiología, tanto por el operador como por cualquier otra persona que pudo quedar expuesta, como resultado de la manipulación de un determinado agente infeccioso. Vías de Infección

Los microorganismos pueden ingresar al organismo a través de: la boca, los pulmones, la piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, etc. Las vías de contaminación más frecuentes en el laboratorio se dan a través de:

La boca

Comer, beber y fumar en el laboratorio.

Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección.

Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.).

La piel

Inoculación accidental con una aguja hipodérmica u otros instrumentos punzantes o de vidrio.

Cortaduras o rasguños.

Los ojos

Salpicaduras de materiales infecciosos.

Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados.

Los pulmones

Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

En los Laboratorios de Microbiología de la Facultad de Farmacia estamos seguros

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que comprendiendo y teniendo conocimiento de todos estos posibles riesgos, aprendiendo y ejecutando las técnicas adecuadas, contribuiremos con una parte importante e integral del proceso de educación, así como también a reducir el número de accidentes en el laboratorio y en futuras actividades fuera de él.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.

Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe

permane- cer completamente cerrada.

Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar

la sesión práctica.

Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las acti-

vidades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospe- cha que son contaminantes.

Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura y estando físicamente cómodo.

Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y

de suela antideslizante en las áreas de laboratorio.

Evitar llevar al laboratorio accesorios que podrían ser fuente de contaminación (por ejemplo joyas).

Recoger el cabello largo.

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Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable.

No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse cosméticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningún área del laboratorio.

Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear

antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.

Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuader-

nos u objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo práctico.

Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero.

Nunca debe dejar éste desatendido.

Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Re- porte cualquier daño de los mismos al profesor.

Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin, por ejemplo: las pipetas en los pipeteros, tubos y placas de Petri en las ollas de desecho, etc.

No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las etique- tas de los mismos y estar seguro de cómo emplearlo.

No devolver sustancias a sus envases originales.

Emplear la propipeta al medir líquidos. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. De igual manera las pipetas tendrán tapones de algodón para reducir la contami- nación de estos dispositivos de pipeteo.

Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo experimentos no autorizados.

Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material

contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.

Reducir al mínimo la formación de aerosoles durante la realización de cualquier

trabajo práctico.

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Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la ino- culación accidental y la generación de aerosoles durante su manipulación y desecho.

Emplear técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos.

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

A continuación mencionaremos los pasos que se deben seguir en caso de que ocurran los siguientes accidentes:

Derrame de material biológico sobre el cuerpo:

Remover la ropa inmediatamente.

Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto.

Reportar el incidente al profesor.

Buscar atención médica si es necesario. La ropa contaminada debe ser colocada en

una solución desinfectante antes de ser lavada.

Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos:

Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del párpado con abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar efectivamente el lavado, comenzando por los párpados.


Buscar atención médica inmediatamente.

Cortadas menores y heridas por pinchazo:

Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón por varios minutos. Aplicar un antiséptico adecuado Reportar el incidente al profesor.

Buscar atención médica inmediatamente.

En el caso de derrames:


Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el área del derrame. Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo necesario.

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Retirar el material absorbente junto al material roto y colocarlos en un recipiente para residuos contaminados o bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con los guantes utilizados.

Limpiar y desinfectar nuevamente el área empleando nuevas toallas de papel y desinfectante.

Lavarse las manos con abundante agua y jabón

El éxito de estas normas depende de la sinceridad, la constancia, la participación activa y cooperativa de cada estudiante, por ello antes de asistir al laboratorio, deben leer el fundamento y las actividades a realizar, para así evitar posibles accidentes, con el conocimiento y las técnicas de trabajo apropiadas.

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PRACTICA #1 MORFOLOGÍA DE BACTERIAS Y COLORACIONES SIMPLES



Academia:


4h

Prácticas CS-01

INTRODUCCIÓN:

Las bacterias son microorganismos que pertenecen al grupo de protistos inferiores. Son células

de tamaño variable entre 0.2 y 50 micras. Las bacterias son células procariotas.

Las bacterias tienen gran importancia en la naturaleza y en el hombre, ya que la presencia de

una flora bacteriana normal es indispensable. Análogamente tienen un papel importante en la

industria de los alimentos así mismo permiten desarrollar importantes progresos en la

investigación científica específicamente en fisiología celular y genética. El examen

microscópico de las bacterias nos permite identificarlas de acuerdo a su morfología en cocos

(esféricos), bacilos (bastón), espirilos (espiras) por lo que es necesario recurrir a técnicas de

tinción.

Los elementos básicos de la anatomía de la bacteria comprenden: 1) la pared celular y 2) el

cuerpo interno o citoplasma. Este último se encuentra rodeado de una membrana

citoplasmática, situada justamente en el interior de la pared celular y contiene generalmente

varios gránulos y otras inclusiones celulares. Finalmente este el material nuclear. Además toda

la bacteria puede estar cubierta de un material viscoso o gelatinoso, que forma una cápsula

definida. También se pueden encontrar en la superficie órganos de locomoción como flagelos;

algunos bacilos tienen pelos o vellosidades. Algunas bacterias pueden desarrollar estructuras

internas llamadas esporas.

OBJETIVOS:

Que el alumno realice tinciones simples, para conocer la morfología de las bacterias.

MATERIAL:

Microscopio Cultivos Mechero bunsen Escherichia Coli Porta objetos Bacillus subtilis Asa de cultivo Aceite de inmersión Varilla doblada en U Sol. De fucsina fenicada Sol. Azul de metileno Pinzas

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METODO:

1. Flamear el porta objetos limpio y desengrasado. Dejarlo enfriar. Poner las iniciales del

cultivo q se va a teñir.

2. Esterilizar el asa, calentándola al rojo vivo y dejarla enfriar.

3. Tomar con el asa una gota de cultivo en caldo y colocarla en el porta objetos;

extendiéndola en una capa delgada. Si el cultivo se toma de un medio sólido, se coloca

sobre el porta objetos una gota de agua destilada y en ella se emulsiona el cultivo y se

extiende en una película delgada.

4. Esterilizar nuevamente el asa.

5. Dejar secar la película al aire.

6. Fijar la preparación pasando el porta objetos 2 o 3 veces a la flama.

7. Cubrir la preparación con uno de los colorantes y dejarlo actuar de 15 a 30 segundos si

se emplea fucsina fenicada o 5 minutos en el caso de usar azul de metileno.

8. Escurrir el colorante y lavar la preparación con agua de la llave.

9. Dejar secar al aire o bien colocar sobre la preparación papel filtro, teniendo cuidado de

no frotar la preparación

10. Anotar los resultados observados, hacer dibujos de los campos observados y diga que

formas presentan las bacterias y como se agrupan. Decir cuál es la función de cada uno

de los colorantes observados.

11. Anotar la bibliografía empleada.

Resultados:

Anotar los resultados obtenidos, realizar una discusión de ellos por equipo, en la bitácora

describir lo que se aprendió.

Bibliografía:

Díaz, G. (2005). Manual Práctico de Microbiología. (3ª ed.) Editorial Castellano.

Frazier, W. (1993). Microbiología de Alimentos (4a ed.). España: Editorial Acribia.

Hazelwood, D. (1993). Curso de Higiene para Manipuladores de Alimentos (3a ed.) España: Editorial Acribia.

Chapera, E. (2001) Bacteriological Analytical Manual Online, Parasitic Animal in Foods, U.S.A. Food & Drug Administration. Recuperado el 15 de enero de 2017 de https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm2006949.htm

https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm2006949.htm

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PRACTICA #1 MORFOLOGÍA DE HONGOS Y LEVADURAS



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 2

MORFOLOGÍA DE HONGOS Y LEVADURAS

INTRODUCCIÓN.

Los mohos y las levaduras son dos grupos de plantas de la familia de los hongos. Ambos

grupos pueden causar reacciones alérgicas debido a que pueden circular en el aire. El tamaño

de los hongos varía desde las dimensiones de una bacteria y las de una estructura visible

microscópicamente. Los mohos presentan características morfológicas como son las hifas las

cuales son hilos relativamente rugosos, al conjunto de hifas se le denomina micelio el cual

puede ser septado o no. La reproducción de los hongos puede ser sexual o asexual. Las

esporas asexuales de acuerdo a su reproducción pueden ser blastosporas, clamidiosporas,

artrosporas, esporangiosporas y conidios. Mientras que la reproducción sexual se puede ser

mediante zigosporas y acosporas. Los mohos que más frecuentemente aparecen en los

alimentos se clasifican entre los géneros Mucor, Rhyzopus, Penicillinum y Aspergillus.

Las levaduras forman un grupo de hongos cuyas actividades han sido siempre de gran

importancia práctica en las actividades del hombre. Las levaduras tienen una forma redonda u

ovoide y se multiplican generalmente por gemación. Muchas levaduras tienen paredes gruesas

que dan a las células un contorno doble. Cada levadura tiene un núcleo, a menudo no visible.

El citoplasma contiene gránulos y vacuolas y con frecuencia gotas de grasa. Algunas levaduras

más importantes son Saccharomyces, Torula, Candida.

OBJETIVO

Que el alumno identifique las diferentes morfologías de hongos y levaduras.

MATERIAL

Microscopio Cultivos Mechero bunsen Streptomyces sp Porta objetos Saccharomyces sp Cubre objetos Pulque Asa de cultivo Varilla doblada en U Sol. Lactofenol azul de algodón Rojo neutro o verde Janus Sol. Yodo diluida

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METODO

Morfología de hongos:

1. Colocar una gota de Lactofenol azul de algodón en el centro de un porta objetos limpio

y desengrasado.

2. Con el asa de siembra doblada en ángulo recto y esterilizada transferir una pequeña

cantidad del cultivo.

3. Dispersar el cultivo y colocar un cubre objetos.

4. Observar el microscopio utilizando el objeto seco débil y seco fuerte.

Morfología de levaduras

1. Con una pipeta Pasteur tome un pequeño volumen del cultivo de levaduras y colóquelo

en el centro de un porta objetos limpio.

2. Cubra la preparación con un cubre objetos.

3. Observe al microscopio con los objetivos secos.

4. Anotar los resultados observados, hacer dibujos de los campos observados y diga que

formas presentan las levaduras y hongos.

Resultados:



Bibliografía:






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PRACTICA #3 OBSERVACIÓN DE CÁPSULAS



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 3

OBSERVACIÓN DE CÁPSULAS

INTRODUCCIÓN.

Una de las estructuras de la superficie bacteriana es la cápsula, la cual solo la poseen ciertas

bacterias, situada fuera de la capa más externa de la pared celular. El material capsular

laxamente asociado también puede ser llamado capa borrosa. Tal material es de naturaleza

polisacarida. Entre las funciones de la cápsula se encuentra la de proporcionar protección a la

célula en la desecación y protección del medio ambiente así como agentes químicos además

de promver la concentración de nutrientes en la superficie de la bacteria; debido a la naturaleza

polianiónica interviene en la adherencia de las bacterias a las células y mucosas superficiales

así como también participa en la resistencia a la acción bacteriana.

OBJETIVO.

Que el alumno realícela tinción de gin para identificar cápsulas.

MATERIAL

Mechero Bunsen Cultivos 2 Porta objetos Azotobacters sp. Aceite de inmersión Pulque Asa porta objetos Cubre objetos Varilla de vidrio doblada en U Alcohol metílico Tinta china

Cristal violeta de Hucker

MÉTODO

1. Colocar una gota de la solución de tinta china en el extremo de un porta objetos limpio

y desengrasado.

2. Con el asa estéril tomar un poco del cultivo azotobacter sp o pulque y mezcle

perfectamente con la solución de tinta china.

3. Extender la suspensión con otro portaobjetos como frotis de sangre.

4. Secar al aire.

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5. Fijar al calor o añadir una gota de alcohol metílico.

6. Teñir con la solución de cristal violeta de Hucker durante 2 minutos.

7. Lavar con agua de la llave y dejar secar.

8. Observar con el objetivo de inmersión. Las células se ven de color violeta rodeadas por

las cápsulas incoloras sobre un fondo gris.

9. Resultados:

10. Anotar los resultados obtenidos, realizar una discusión de ellos por equipo, en la bitácora


11. Bibliografía:

12. Díaz, G. (2005). Manual Práctico de Microbiología. (3ª ed.) Editorial Castellano. 13. Frazier, W. (1993). Microbiología de Alimentos (4a ed.). España: Editorial Acribia. 14. Hazelwood, D. (1993). Curso de Higiene para Manipuladores de Alimentos (3a ed.)

España: Editorial Acribia. 15. Chapera, E. (2001) Bacteriological Analytical Manual Online, Parasitic Animal in Foods,

U.S.A. Food & Drug Administration. Recuperado el 15 de enero de 2017 de https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm2006949.htm


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PRACTICA #4 COLORACIÓN DE NUCLEO



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 4

COLORACIÓN DEL NÚCLEO

INTRODUCCIÓN.

El material genético de una célula (ADN, ácido desoxirribonucleico) También conocido como

genoma. Las estructuras moleculares básicas del ADN procariótico y eucariótico son

indistinguibles. Ambos se componen de dos cadenas helicoidales de nucleótidos de purina y

pirimidina unidos entre sí por enlaces hidrógeno para formar una doble hélice. En las

eucariotas, el material genético está encerrado dentro de una bicapa lipídica conocida como

membrana nuclear. Esta membrana tiene una estructura similar a la citoplásmica, con la

excepción de estar interrumpida a intervalos regulares por aberturas llamadas poros nucleares.

Estos poros permiten que las sustancias entren y salgan del núcleo haciendo posible la

comunicación entre ese organelo y citoplasma. El ADN junto con el ARN contienen el código

genético que determina la composición genética del organismo y en última instancia controla

todas sus actividades.

OBJETIVO.

Que el alumno realice tinciones para identificar el núcleo de algunos microorganismos.

MATERIAL

Mechero Bunsen Cultivos 2 Porta objetos B. Subtillis Aceite de inmersión Asa porta objetos Cubre objetos Varilla de vidrio doblada en U Cloruro de mercurio Cristal violeta al 1%

MÉTODO.

1. Preparar el frotis con el cultivo B. Subtillis.

2. Dejar secar al aire. No fijar al calor

3. Cubrir el frotis con la solución de cloruro de mercurio durante 15 segundos.

4. Lavar y dejar secar al aire.

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5. Cubrir la preparación con cristal violeta al 1% durante 2 minutos.

6. Escurrir el exceso de colorante, lavar con agua de la llave y dejar secar.

7. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión. Las proteínas nucleares se tiñen

de color violeta más intenso que el resto de las células.

Resultados:



Bibliografía:






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PRACTICA #5 COLORACION DE ESPORAS



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 5

COLORACIÓN DE ESPORAS

INTRODUCCIÓN.

Las esporas son estructuras esféricas u ovales formadas dentro de ciertas especies

bacterianas que representan un estado latente o de reposo en el ciclo de crecimiento de esos

microorganismos. Entre las bacterias con gran importancia en los alimentos se encuentran los

bacilos aerobios gram positivos formadores de endosporas pertenecientes al género Bacillus y

los bacilos anaerobios gram positivos formadores de esporas del género Clostridium. Las

endosporas se forman a la falta de nutrientes dentro de la célula bacteriana vegetativa, estas

estructuras son altamente resistentes a los efectos destructivos del calor, sequedad, presión y

a muchos agentes desinfectantes. Se requieren procesos de esterilización para matar las

esporas. Las endosporas pueden ser esféricas, subesféricas u ovales, pueden ubicarse dentro

de la célula en la parte central, terminal o subterminal y pueden hinchar o no a la célula.

OBJETIVO.

Que el alumno realice una preparación para observar las esporas.

Material Mechero Bunsen 2 Porta objetos Asa porta objetos Carbol Fucsina Ácido acético al 5% Azul de metileno

Microscopio Nigrosina

MÉTODO.

1. Flamear el portaobjetios limpio y desengrasado. Dejarlo enfriar. Poner las iniciales del

cultivo que se va a teñir.

2. Esterilizar el asa, calentándola al rojo vivo y dejarla enfriar.

3. Tomar con el asa una gota del cultivo en caldo y colocarla en el porta objetos.

Extendiéndola en una capa delgada. Si el cultivo se torna de un medio sólido, se coloca

sobre el porta objetos una gota de agua destilada y en ella se emulsiona el cultivo y se

extiende en una película delgada.

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4. Esterilizar nuevamente el asa.

5. Dejar secar al aire y fijar al calor.

6. Cubrir el frotis con la solución de carbol fucsina y dejar actuar el colorante 5 minutos

calentándolo suavemente hasta obtener vapores.

7. Decolorar con ácido acético al 5% hasta que el frotis tenga un color rosa pálido (esto

toma pocos segundos)

8. Colorear con azul de metileno de loeffter durante 3 minutos.

9. Lavar con agua.

10. Secar al aire y observar al microscopio.

Las bacterias se ven azules y las esporas rojas. En ocasiones las esporas aparecen sin

teñir debido a que toman los colorantes con dificultad, pero estas aparecen en forma

definida y en lugares precisos.

Coloración de esporas por el método de Denner modificado por Zinder.

1. Preparar un frotis y fijar la flama.

2. Cubrir el frotis con un pequeño trozo de papel filtro y saturarlo con la solución de fucsina

fenicada.

3. Calentar sobre un bañi de agua durante 5 -10 minutos, conservando el papel húmedo

con el colorante.

4. Lavar con agua de la llave.

5. Cubrir con una gota de nigrosina y extenderla uniformemente.

6. Calentar moderadamente para secar poco a poco y lavar.

7. Hacer observaciones.

Las esporas se verán de color rojo, las células vegetativas incoloras sobre un fondo gris.

Realizar ambas observaciones y decir cuál es la diferencia en las tinciones.

Resultados:



Bibliografía:




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PRACTICA #6 TINCIÓN DE GRAM



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 6

TINCIÓN DE GRAM

INTRODUCCIÓN.

La tinción de Gram es la más empleada en la microbiología es conocida como tinción

diferencial. Por este método se clasifican las bacterias en 2 grupos: Gram positivos y Gram

negativos en función a la coloración de las células previamente fijadas, se tiñen con una

solución de cristal violeta, se lavan y se tratan con lugol. El yodo forma un complejo con cristal

violeta, que sirve para fijar esta célula. Se agrega un agente decolorante (alcohol, cetona o

mezcla de ambos) en el cual el complejo yodo-cristal violeta de las células.

OBJETIVO.

Que el alumno realice la técnica de tinción de gram para que pueda diferenciar

microorganismos gram positivos y gram negativos.

MATERIAL

Porta objetos Cristal violeta Lugol Alcohol acetona o alcohol etílico al 95% Safranina Aceite de inmersión Microscopio

MÉTODO

1. Prepare dos frotis con los cultivos E.Coli y B. Subtilis o susando pulque.

2. Cubrir los frotis con la solución de cristal violeta de Bucker y dejar actuar 30 segundos.


4. Cubrir el frotis con lugol durante 30 segundos.


6. Decolorar aplicando la solución de alcohol acetona o alcohol etílico al 95% durante unos

10 segundos.


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8. Cubrir el frotis con la solución safranina durante 30 segundos.

9. Lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.

10. Observar las preparaciones con objetivo de inmersión.

11. Los organismos gram positivos se observan de color morado del violeta de genciana y

los llamados gram negativos, pierden el violeta de genciana al lavar el frotis con alcohol

acetona y por lo tanto se colorean por contraste.

Resultados:



Bibliografía:






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PRACTICA #7 Preparación de medios de cultivo



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 7

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

Para cultivar a los microorganismos se utilizan medios de cultivo que pueden ser: líquidos como

en caldo nutritivo o el caldo glucosado, utilizados tanto en el cultivo de microorganismo como

en la realización de algunas pruebas como los estudios de fermentación y medios de cultivo

sólidos como el agar nutritivo (gelosa nutritiva), gelosa sangre, gelatina nutritiva que se utilizan

en cultivos de superficie, en aislamientos de microorganismos para observar morfología de

colonias etc. Los agentes solidificantes como el agar-agar y la gelatina se incluyen en los

medios sólidos. Los medios semi-sólidos, de consistencia intermedia, entre los otros dos, se

utilizan en pruebas de motilidad y en pruebas de fermentación.

Necesidades nutricionales

Para obtener el máximo crecimiento de los microorganismos se deben conocer sus

requerimientos nutritivos para formular un medio nutritivo adecuado. Los requerimientos

básicos de todos los microorganismos incluyen: agua, carbón, energía, nitrógeno, minerales y

factores de crecimiento.

Agua

El protoplasma está constituido por un 70-85% de agua. En un organismo unicelular el agua

intracelular y extracelular sirven de vehículo en la penetración de los nutrientes y en la

excreción. Todas las reacciones químicas controladas enzimáticamente se realizan únicamente

en presencia de una cantidad adecuada de agua. En la preparación de medios de cultivo la

cantidad de agua es importante. Debe utilizarse agua destilada

Carbón

En lo que respecta a las fuentes de carbono, los organismos se dividen en dos grupos:

Autótrofos, los que pueden utilizar en la síntesis de sus materiales celulares el carbono del CO2;

Heterótrofos, los que necesitan uno o más compuestos orgánicos como fuente de carbono.

Este grupo también necesita la presencia del CO2. En su ausencia se retarda su crecimiento,

sobre todo en la fase inicial. Las fuentes de carbono son tan diversas como los

microorganismos mismos.

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Energía

Los organismos que tienen pigmentos y pueden utilizar la energía solar se denominan

fotoautótrofos. Algunas bacterias realizan fotosíntesis a través de la energía luminosa que es

absorbida por pigmentos fotosintéticos y, después, esta energía se transforma en energía de

enlace químico, dando lugar a la formación de ATP. Este proceso se llama fosforilación

fotosintética. El aparato bacteriano que contiene los pigmentos fotosintéticos y los sistemas

enzimáticos necesarios para generar ATP es una estructura subcelular discreta, llamada

cromatóforo. Una vez formado el ATP se llevan a cabo en otras partes de la célula otras

reacciones biosintéticas similares a las de los microorganismos no fotosintéticos, para producir

protoplasma bacteriano.

Nitrógeno

Los organismos autótrofos pueden utilizar fuentes inorgánicas de nitrógeno, mientras que los

heterótrofos las obtienen de compuestos como aminoácidos, péptidos, etc. El extracto de carne

y la peptona que se utilizan en el caldo nutritivo, son la fuente de nitrógeno que utilizan los

heterótrofos.

Minerales

Todos los organismos requieren de varios elementos para su crecimiento, como el sodio,

potasio, calcio, magnesio, manganeso, fierro, zinc, cobre, fósforo y cobalto. Las bacterias son

la excepción, sus requerimientos son mínimos.

Factores de crecimiento

Cualquier componente esencial del material celular que el organismo es incapaz de sintetizar

a partir de sus fuentes de carbono y de nitrógeno se le llama factor de crecimiento. Aquí se

incluyen ciertos aminoácidos y vitaminas. Muchos de los heterótrofos se satisfacen con los

componentes del extracto de carne del caldo nutritivo, pero muchos patógenos tienen

requerimientos más estrictos y en esos casos se necesitan medios de cultivos enriquecidos

como la gelosa sangre.

PH

El crecimiento de los microorganismos en un medio determinado requiere de unos límites de

pH específicos, puesto que las enzimas pueden ser afectadas. La mayor parte de las bacterias

crecen en un pH alrededor de 7. El pH del caldo nutritivo se debe ajustar a 6.8. En cambio los

organismos patógenos un medio alcalino, como el caldo de soya deben tener un pH de 7.3.

Investigar: Las propiedades y características que presentan los siguientes medios de cultivos:

caldo nutritivo y medios de agar, medios especiales y enriquecidos, medios diferenciales y

selectivos.

OBJETIVO.

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Conocer los diferentes medios y formas que se emplean en el cultivo de microorganismos.

MATERIAL

Tubos de ensaye de 15 x 150 Tubos de ensaye de 20 x 150 Cajas petri Autoclave Matraz Erlenmeyer Medios de cultivo

METODO

1. Pese la cantidad precisa que vaya a necesitar de acuerdo a la cantidad de tubos que va

a preparar.

2. Coloque el medio de cultivo en un vaso de precipitado y agregue la cantidad de agua

necesaria.

3. Si se trata de un caldo generalmente no requiere de calentamiento. Agite bien hasta la

disolución y vacíelo en tubos.

4. Si el medio de cultivo tiene agar deje reposar la mezcla con agua unos 5 minutos. Para

que el agar se hidrate.

5. Caliente la mezcla n mechero o parrilla.

6. Agite constantemente con un agitador de vidrio para que el medio no se pegue en el

fondo del matraz.

7. Caliéntelo hasta que hierva y cuando empiece a subirse retírelo de la fuente de calor.

8. Use pinzas para retirar el matraz.

9. Posteriormente sirva en los tubos de ensaye.

10. Esterilice de inmediato de acuerdo a las especificaciones del fabricante del medio.

11. Posteriormente deje solidificar los medios.

Resultados:



Bibliografía:




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PRACTICA #8 Siembre y estudio de cultivos puros



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 8

SIEMBRA Y ESTUDIO DE CULTIVOS PUROS DE BACTERIAS

INTRODUCCIÓN

Existen diversas técnicas de sembrado para llevar a cabo el estudio de microorganismos, éstas

requieren de una manipulación adecuada. Se pueden sembrar en medios líquidos sacudiendo

el asa estéril. Los pasos de cultivos líquidos a otros medios se llevan a cabo con pipetas de

vidrio estériles. Los cultivos en agar inclinado u otros medios se siembran tocando ligeramente

con el asa la superficie inclinada, de abajo hacia arriba. La superficie de agar no se debe

romper. El agar inclinado se siembra haciendo primero una perforación en línea recta en el

centro del tope de la superficie y luego retirando la aguja y haciendo una estría en el plano

inclinado.

El cultivo por picadura se hace sumergiendo una aguja de siembra rígida y larga en el centro

de la columna profunda de agar semisólido o gelatina en el tubo de ensaye, la aguja se retira

por el mismo camino. Los cultivos en agar u otros medios sólidos realizados en cajas petri se

llaman cultivos en placa. Las preparaciones que resultan de cada caso se llaman placas

invertidas y placas por estría.

OBJETIVO

Que el alumno realice diversas técnicas de sembrado para llevar a cabo el estudio de

microorganismos mediante cultivos líquidos y sólidos.

MATERIAL

Mechero Cultivos Asa E. Coli B. Subtilis S. Lutea

METODO

SIEMBRA EN MEDIO LÍQUIDIO

1. Esterilizar el asa a la flama

2. Asegurar que los tapones de los tubos estén despegados girando suavemente y

destapándolos cerca del mechero, manteniéndolos en posición horizontal y con la boca

de estos próxima al mechero.

3. Enfriar el alambre en la pared del tubo o bien sumergiendo el asa en el tubo no

sembrado.

22

4. Tomar una asada del cultivo de E. Coli y pasarla al tubo por sembrar.

5. Flamear rápidamente las bocas de los tubos y los algodones y taparlos.

6. Esterilizar el asa.

7. Marcar el tubo con las iniciales de la cepa y la fecha en que se sembró.

8. Sembrar los tubos con los cultivos proporcionados.

9. Se emplea un tubo como testigo.

10. Incubar a 37ºC y obsérvese el desarrollo a 24 hrs y 48 hrs.

SIEMBRA POR PICADURA

1. Siguiendo las instrucciones anteriores y con el asa recta, inocular 3 tubos que contengan

6 ml. De gelosa o agar nutrityivo y estén en posición vertical con los mismos

microorganismos.

2. Incubar un tubo como testigo, incubar a 37ºC.

SIEMBRA EN MEDIO INCLINADO

1. En los tubos que contienen gelosa (o agar nutritivo). Inclinada sembrar cada una de las

cepar anteriores por estría recta.

2. El cuarto tubo sembrarlo por estría recta.

3. Incubar un tubo testigo.

4. Incubar a 37ºC y obsérvese el desarrollo a 24 hrs y 48 hrs.

SIEMBRA EN CAJA PETRI

1. Sembrar en cada una de las cajas los microorganismos proporcionados, trazando una

estría ondulada sobre la superficie del medio de cultivo.

2. Destapar una caja y dejarla expuesta al medio ambiente y taparla.

3. Invertir las cajas e incubar todos los cultivos a 37ºC durante 24 hrs y 48 hrs.

RESULTADOS. Observe las características de los tubos y descríbalas en el cuadro siguiente

basándose en la terminología que a continuación se describe, las características morfológicas

descríbalas en base a los resultados de las prácticas anteriores. Anotar los resultados

obtenidos, realizar una discusión de ellos por equipo, en la bitácora describir lo que se aprendió.

Bibliografía:




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PRACTICA #9 Identificación de bacteria desconocida



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 9

IDENTIFICACIÓN DE UNA BACTERIA DESCONOCIDA

INTRODUCCIÓN.

La identificación de microorganismos es de gran importancia en microbiología para identificar

el microorganismo en cuestión. El primer paso en la identificación es acular la información de

las características morfológicas, fisiológicas y características de cultivo. Para esto en necesario

realizar frotis y tinciones para hacer estudios celulares e inocular varios tipos de medios de

cultivo para observar las características de crecimiento y el tipo de enzimas producidas. Toda

esta información se compara con un cuadro para identificar al microorganismo en cuestión.

OBJETIVO

Que el alumno siembre y realice diversas pruebas para recopilar la información necesaria para

identificar el microorganismo desconocido.

MATERIAL

2 tubos de agar nutritivo inclinado Asa 2 placas de agar nutritivo Tubos con gelatina nutritiva 2 tubos de medio fluido tioglicolato Todo lo necesario para la tinción de esporas Todo lo necesario para la tinción de Gram.

METODO

Usted va a tener siempre 2 tubos de su cepa problema. Uno le va a servir para que realice sus

pruebas y el otro lo va a guardar de reserva. Este va a ser su cepa stock, no use el stock para

frotis o inoculaciones de rutina, y lo va a sembrar en agar inclinado cada ocho días para

cultivarlo.

1. Siembre dos tubos de agar nutritivo inclinados con la cepa que se le proporciono (en

caldo). Incube un tubo a 20ºC y el otro a 37ºC. Para observar cual es la temperatura más

adecuada de desarrollo. La siembra hágala en estría recta para que después de 24 hrs

de incubación pueda estudiar su forma de desarrollo.

25

2. Anote en su cuadro de resultados, cual es la temperatura en que se desarrolla mejor el

tipo de desarrollo del cultivo; filiforme (liso), equinulado (en punta), perlado, arborescente

(ramificado), rizoide (en forma de raíz).

3. Realice una tinción de gram del de desarrollo de su tubo inclinado de trabajo anotando

en su cuadro de resultados la forma de su microorganismo y su tipo de gram. En

ocasiones es difícil decidir si es un bacilo o un coco. Debe de recordar que los bacilos

pueden aparecer como coco en ciertas condiciones de desarrollo, pero los cocos nunca

aparecerán como bacilos. Otras complicaciones pueden ser los bacilos cortos,

especialmente los cocobacilos que aparecen como cocos. Examine cuidadosamente su

frotis para hacer estas diferenciaciones. Si usted observa cocos y bacilos cortos, puede

ser clasificado como bacilo (siempre y cuando no haya usted contaminado su cepa). Si

tiene cocos anote su forma de agrupación.

4. Si su bacilo es gram positivo, realice una tinción para esporas. Muy raramente un coco

o un bacilo gram negativo produce esporas. Para observar las esporas se necesita un

cultivo de 24 o 36 horas. En el gram las esporas parecen como hoyos blancos en el

bacilo. Anote si la espora es terminal, subterminal o media.

5. Inocule los tubos con caldo nutritivo. Incube los tubos a 37ºC. Después de 24 hrs.

Revíselos con cuidado sin agitarlos para que observe el tipo de desarrollo en la

superficie del tubo: anillo, película, en membrana, en flóculos. Observe también el

desarrollo en el centro y fondo del tubo.

6. Siembre en estría, para aislar una placa de agar nutritivo. Incube a 24 hrs a 37ºC.

Observe y anote las características de las colonias aisladas. Color, opacidad bordes,

elevación, (consulte los esquemas).

7. Inocule el tubo en gelatina nutritiva, sembrando por piquete, con aguja recta

verticalmente hasta el fondo haciendo una sola perforación. Incube a 37ºC durante 24

hrs. Aquí vamos a observar dos cosas: el tipo de desarrollo y la presencia o ausencia de

licuefacción. Tipo de crecimiento (no licuefacción): no todos los organismos crecen en

gelatina nutritiva, pero si hay crecimiento, sin licuefacción, registre la forma de

crecimiento según el esquema.

8. Licuefacción: algunos organismos producen la enzima gelatinasa que digiere la gelatina.

La licuefacción puede ser de diferentes formas.

Requerimiento de oxígeno. El rango de requerimiento de oxígeno de las bacterias va desde

aerobios estrictos hasta anaerobios estrictos. Entre estos dos extremos se encuentran los

facultativos, y los microaerofilicos. Las bacterias facultativas tienen un sistema enzimático

capaz de utilizar el oxígeno libre o una fuente alternativa, como los nitratos. En presencia de

oxigeno, lo prefieren a la fuente alternativa. Los microaerofilicos son organismos que requieren

oxígeno libre, pero en pequeñas cantidades.

Para determinar los requerimientos de oxígeno de su cepa problema vamos a utilizar el medio

fluido de tioglicolato. Este medio tiene glucosa, cistina y tioglicolato de sodio para bajar su

potencial de óxido-reducción. Tiene además un colorante, la resazurina, que en presencia de

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oxígeno se torna color rosa. Ya que la tensión de oxígeno es siempre más alta en la superficie

del medio, los tubos con medio se presentan color rosa en la superficie e incoloros en el resto

del tubo. El medio tiene un poco de agar que favorece la anaerobiosis en el fondo del tubo y

localiza los organismos.

Siembre su cepa en el medio fluido de trioglicolato. Antes de sembrar revise sus tubos. Si más

del 30% del tubo este color rosa colóquelo en un baño de agua hirviente durante unos minutos

para eliminar el oxígeno absorbido. Deje enfriar el tubo antes de sembrar.

Después de sembrar no lo mezcle por agitación. Ruede el tubo entre sus manos.

Siembre los demás tubos con los microorganismos proporcionados. Incúbelos a 37ºC durante

38 hrs.

Revise con cuidado sus tubos, sin agitarlos y note en su cuadro de resultados si su organismo

es aerobio, anaerobio etc.

Resultados:



Bibliografía:






27



PRACTICA #10 PRUEBAS BIOXIDATIVAS



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Num 10

PRUEBAS OXIDATIVAS

INTRODUCCION

Las características fisiológicas o bioquímicas son los criterios más importantes en la

identificación de un organismo desconocido. Sin datos fisiológicos suficientes no es posible

determinar la especie de un organismo.

Las reacciones bioxidativas se refieren a aquellas reacciones enzimáticas relacionadas con la

respiración y la fermentación. Una diferencia entre los aerobios estrictos y los otros organismos

es que los aerobios estrictos obtienen su energía por respiración y los otros por fermentación.

Una diferencia entre los aerobios estrictos y los otros organismos es que los aerobios estrictos

obtienen su energía por respiración y los otros por fermentación, por lo tanto se dice que los

aerobios estrictos son oxidativos y los otros fermentativos.

La respiración puede definirse como un proceso metabólico productor de energía. Los aerobios,

oxidan las sustancias orgánicas obteniéndose como producto final CO2 y agua. Esta habilidad

para utilizar el oxígeno libre se realiza gracias a un sistema citicromo enzimático.

Por su parte los organismos fermentativos utilizan compuestos orgánicos para producir su

energía y como compuestos finales de las reacciones se obtienen compuestos oxidados y

reducidos. Estos productos pueden ser ácidos, aldehídos y alcoholes etc. También se pueden

producir gases como bióxido de carbono, hidrógeno, metano etc. La fermentación puede

definirse como bioxidación productora de energía en la cual las sustancias orgánicas sirven

como donadoras y receptoras de electrones. La fermentación no utiliza sistemas de citocromo.

Una de las sustancias más frecuentes utilizadas por los organismos fermentadores es la

glucosa. Algunas bacterias pueden utilizar otras sustancias orgánicas como: ácidos orgánicos,

aminoácidos, purinas, pirimidinas. El producto final de la fermentación depende de la naturaleza

del organismo, de las características del sustrato y de las condiciones del medio, tales como

temperatura y pH.

La fermentación se realiza en condiciones anaerobias. Sin embargo, no debemos olvidar que

las anaerobias facultativas, en presencia de aire, cambian su metabolismo de fermentación a

respiración. Hay una excepción, las bacterias productoras de ácido láctico son fermentativas

en presencia de aire.

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OBJETIVO

Que el alumno realice pruebas bioxidativas para identificar la especie de un organismo.

MATERIAL

Tubos con caldo glucosa y rojo fenol E. Coli Tubos con caldo lactosa y rojo fenol B. Subtillis Tubos con caldo manitol y rojo fenol S. Aureus Caldo RM-VP Pseudomona Tubo con agar inclinado K. Neumonia Placa con agar soya Caldo nitrato

METODO

FERMENTACIÓN DE AZÚCARES EN TUBOS DE DURHAM

1. Marque sus tubos y siembre cada una de sus cepas problema en:

Caldo de glucosa y rojo fenol

Caldo de lactosa y rojo fenol

Caldo de manitol y rojo fenol

2. Como prueba positiva inocule E. Coli en un caldo glucosado.

3. Incube sus tubos a una temperatura de 24 a 48 hrs a 37ºC.

4. Observe sus tubos después de la incubación y registre sus resultados en la tabla de

estos. Indicando si hay la producción de ácido o ácido y gas.

Observaciones: Si se fermenta un azúcar en particular, como se producirá ácido, y

también se puede producir gas. Las producción de gas la veremos en el tubo invertido y

la producción de ácido nos la muestra el indicador de pH (rojo de fenol) que cambia a

color amarillo.

PRUEBA DE ROJO DE METILO – VOGES PROSKAUER (Fermentación con producción de mezclas de ácidos)

1. Marque sus tubos

2. Siempre sus cepas problemas en caldo RM-VP

3. Utilice como tubo control E. Coli incúbelo 5 días a una temperatura de 30ºC.

4. Incube sus tubos E. Aerogenes o K. Neumanie a 48 hrs a una temperatura de 37ºC.

5. Con los tubos de 48 hrs. Se realizara la prueba de VP.

6. Con los tubos de 5 días se realizará la prueba de rojo de metilo.

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER

1. Agregue 0.5 ml (18 gotas) de alfa naftol a los dos tubos.

2. Agregue la misma cantidad de hidróxido de potasio a los dos tubos.

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3. Agite los tubos vigorosamente cada 20 segundos. Hasta que el tubo control se ponga

rosa o rojo.

4. Deje los dos tubos a reposar una o dos horas para ver si el problema se pone de color

rojo.

PRUEBA DE ROJO DE METILO

1. Agregue 4 gotas de rojo de metilo al cultivo de 5 días de E. Coli.

2. Agregue 4 gotas de rojo de metilo a los demás cultivos.

Observaciones: Si su problema da una coloración roja indica que la prueba es positiva

y una coloración amarilla indica que la prueba es negativa. Anote sus resultados.

PRUEBA DE CATALASA

1. Siembre en un tubo de agar inclinado su cepa problema.

2. Siembre los demás tubos con los microorganismos dados utilizando S. Aureus como

control.

3. Incube a 37ºC de 24 a 48 hrs.

4. Después de incubar agregue unas gotas de agua oxigenada al 3% al cultivo de S. Aureus

para que observe la prueba positiva.

5. Repita lo mismo con el cultivo de la cepa problema y demás cultivos.

6. Registre sus resultados.

PRUEBA DE LA OXIDASA

1. Marque en la base de una placa de agar soya el microorganismo a sembrar.

2. Siembre en sus extremos por estria la cepa problema.

3. Como prueba positiva siembre Ps. Aeroginosa.

4. Incube a 37ºC durante 48 hrs.

5. Después de incubar cubra varias colonias de Pseudomona y de su cepa problema

simultáneamente y observe con el reactivo de oxidasa el desarrollo de coloración.

6. Como prueba positiva las colonias se deben teñir de color rosa al negro.

REDUCCIÓN DE NITRATO

1. Marque los tubos de caldo de nitrato con su cepa problema y E. Coli como prueba

positiva.

2. Siembre sus microorganismos en estudio.

3. Incube a 37ºC durante 24 a 48 hrs.

4. Después de incubar al cultivo de E. Coli agregue unas gotas de ácido sulfanílico y la

misma cantidad de dimetil alfa natil amina.

5. Casi inmediatamente aparecerá una coloración roja que indica que la prueba es positiva.

6. Repita la misma prueba con su cepa problema y demás microorganismos.

30

7. Registre sus resultados en su cuadro de estos.

Resultados:



Bibliografía:






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PRACTICA #11 PRUEBAS DE HIDROLISIS



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Num. 11

PRUEBAS DE HIDRÓLISIS

INTRODUCCIÓN

Muchas bacterias producen exoenzimas hidrolasas, las cuales convierten compuestos

orgánicos complejos en pequeñas unidades. Esta hidrólisis enzimática se realiza en presencia

de agua. En ésta práctica vamos a observar la hidrólisis del almidón, caseína, grasa, triptófano

y urea. Estas pruebas son importantes en la identificación de bacterias.

OBJETIVO

Que el alumno observe las diferentes pruebas de hidrólisis enzimática que presentan algunos

microorganismos.

MATERIAL

2 cajas con gelosa almidón E. Coli 2 cajas de agar leche B. Subtillis 2 cajas de gelosa-grasa 2 tubos de caldo triptona 2 tubos de caldo urea 2 tubos de Kligmer 2 tubos citrato de Simmons

HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

1. Marque sus cajas con gelosa almidón e identifique el microorganismo a sembrar.

2. Siembre en línea recta su cepa problema en los extremos opuestos de la caja.

3. Como testigo utilice B. Subtillis.

4. Incube de 37ºC de 24 a 48 hrs.

5. Después de incubar cubra el desarrollo de la línea con la solución de yodo (de gram)

que nos va a servir de indicador.

6. Cuando el yodo entra en contacto con la gelosa almidón, se vuelve azul. En donde el

almidón ha sido hidrolizado la placa aparece transparente.

7. Si el área adyacente al desarrollo se presenta incolora quiere decir que se ha producido

amilasa, ya no hay almidón y no reacciona con el yodo, por lo tanto la prueba es positiva.

8. Compare su cepa problema con el testigo.

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HIDRÓLISIS DE CASEINA

1. Marque su caja de agar leche identificando su cepa y medio.

2. Siembre su cepa problema como en el caso del almidón.

3. Siembre como prueba positiva el B. Subtilis de igual forma que la prueba de almidón.


5. Examine todo lo largo de su cepa sembrada.

6. Observe que se note una zona clara adyacente al cultivo en su cepa testigo. Esta zona

es la evidencia de la hidrólisis de la caseína.

7. Compare sus resultados con su cepa problema y demás microorganismos.

8. Anote sus resultados.

HIDRÓLISIS DE GRASA

1. Marque sus cajas de gelosa –grasa identificando su cepa y medio.

2. Siembre en su caja como en las pruebas anteriores B. Subtillis como control.

3. Incube a 37ºC durante 7 días.

4. Al finalizar la incubación agregue 3-4 ml de solución saturada de sulfuro de cobre y deje

actuar de 10 a 15 min. Terminando el tiempo elimine el exceso del reactivo y examine la

caja.

5. El color azul verdoso alrededor de las colonias indica la hidrólisis de las grasas.

6. Registre sus resultados.

HIDRÓLISIS DEL TRIPTOFANO (PRUEBA DE INDOL)

1. Marque los tubos de caldo triptona con sus cepas problemas y uno con E. Coli como

testigo.

2. Inocule los tubos con su cepa problema y E. Coli.


4. Después de incubar agregue a los tubos 10 a 12 gotas de reactivo de kovac. Si se forma

una capa roja en la parte superior del tubo la prueba es positiva.

HIDRÓLISIS DE UREA

1. Marque e identifique los tubos de caldo urea con su cepa problema y demás

microorganismos.

2. Utilice como prueba positiva P. Vulgaris.

3. Inocule los tubos con su cepa problema y P. Vulgaris.

4. Incube sus tubos a 37ºC 24-48 hrs.

5. Cuando se produce ureasa, el amoniaco proveniente de la urea eleva el pH del medio y

toma un color rojo cereza.

PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIDRÓGENO

1. Marque sus tubos de Kligmer con la cepa problema y P. Vulgaris como testigo.

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2. Siembre por picadura en la base del tubo y por estría en la superficie con cada

microorganismo.

3. Incubar los tubos a 37ºC durante 24-48 hrs.

4. El cambio de color rojo de fenol nos indica si hay fermentación.

Fondo: glucosa

Superficie: lactosa

Producción de H2S. Ennegrecimiento

Observar si hay gas.

5. Anote sus resultados

.

UTILIZACIÓN DE CITRATO

1. Etiquete los tubos de citrato de Simmons con su cepa problema y E. Aerogenes como

prueba positiva.

2. Siembre primero por estría en la superficie y después por piquete en el centro. Utilice

asa recta.

3. Incube de 37ºC durante 24-48 hrs.

4. El agar citrato de Simmons contiene azul de bromotimol como indicador y cambia de

verde a azul cuando el crecimiento de los organismos produce alcalinidad.

5. Observe y anote los resultados.

Resultados:



Bibliografía:






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PRACTICA #12 ANALISIS DE AGUA, NUMERO MAS PROBABLE



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 12.

ANÁLISIS DE AGUA, NÚMERO MÁS PROBABLE.

INTRODUCCION

El análisis de agua comprende (1) análisis cuantitativo y (2) un análisis cualitativo. El análisis

cuantitativo, se realiza en placas de agar, posteriormente se incuban y se cuentan el número

de colonias que crecieron por mililitro reportándose como unidades formadoras de colonias por

mililitro (UFC/ml).

El análisis cualitativo consta de dos pruebas una presuntiva y otra confirmativa. La prueba de

presunción se hace inoculando caldo lauril triptona en tubos de fermentación con diferentes

cantidades de agua, la prueba se considera positiva si después de 48 horas de incubación hay

formación de ga. Por lo que se procede a realizar la prueba confirmativa realizando la

transferencia de los tubos de cultivo de lactosa original en los tubos que se ha formado gas.

Los grupos indicadores de contaminación más comunes coliformes totales y coliformes fecales.

OBJETIVO

Que el alumno realice pruebas de rutina para el análisis de agua potable.

MATERIAL

6 Tubos de fermentación con 10 ml de caldo lactosado de concentración simple. 3 tubos de fermentación con 10 ml de caldo lactosado concentración doble. 1pipeta estéril de 10 ml 2 pipetas estériles de 1 ml 1 mechero

PRUEBA PRESUNTIVA

METODO

1. Inocular los tres tubos de fermentación de caldo lactosado de concentración doble con 10

ml de agua.

2. Inocular tres tubos de caldo lactosado de concentración simple con 1 ml de agua.

35

3. Inocular tres tubos de caldo lactosado de concentración simple con .1 ml de agua.

4. Incubar los tubos de fermentación sembrados a 35ºC de 24 a 48 hrs.

5. Anotar los resultados obtenidos después del tiempo de incubación. Los tubos que presentes

formación de gas serán considerados positivos. La formación de gas dentro de 48 hrs

constituye una prueba presuntiva positiva y nos da un indicio de presencia de coliformes.

La ausencia de gas al final de las 48 hrs, indicará una prueba negativa, es decir ausencia

de coliformes y por lo tanto el análisis quedará concluido.

6. Consultar la tabla para calcular el NMP (número más probable) de microorganismos en el

agua analizada.

PRUEBA CONFIRMATIVA DE COLIFORMES FECALES

Para corroborar la presencia de coliformes totales y fecales se realiza la prueba confirmativa.

MATERIAL

Tubos positivos de la prueba presuntiva.

Un tubo de fermentación con caldo lactosa bilis-verde brillante por cada tubo positivo de la

prueba presuntiva.

Un tubo de fermentación de caldo E.C. por cada tubo positivo de la prueba presuntiva.

Un asa de siembra.

Un mechero.

MÉTODO

1. Los tubos positivos de la prueba presuntiva se resiembran con un asa de siembra en caldo

lactosa bilis-verde brillante y se incuban a 35ºC por 48 hrs.

2. Los tubos positivos de la prueba se resiembran con un asa de siembra en caldo E.C. y se

incuban a 48 hrs en baño de agua.

3. Se examina cada tubo a las 24 hrs.

4. Los tubos de caldo lactosa verde brillante que presenten gas a las 24 hrs y 48 hrs. Se

consideran positivos.

5. La ausencia de gas al final de 48 hrs. Indicará la ausencia del grupo oliforme.

6. Los caldos de E.C. que presenten gas a las 24 y 48 hrs. Se consideran positivos.

7. Consultar tabla para determinar el NMP.

Resultados:



Bibliografía:

Díaz, G. (2005). Manual Práctico de Microbiología. (3ª ed.) Editorial Castellano. Frazier, W. (1993). Microbiología de Alimentos (4a ed.). España: Editorial Acribia. Hazelwood, D. (1993). Curso de Higiene para Manipuladores de Alimentos (3a ed.) España: Editorial Acribia.

36



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PRACTICA #13 PRUEBA DE REDUCTASA EN LECHE



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 13

PRUEBA DE REDUCTASA EN LECHE

INTRODUCCIÓN

La leche de vaca es un producto que ha adquirido gran importancia en la alimentación humana.

Habitualmente no se consume en crudo, sino que es sometida a diferentes tratamientos

térmicos a través de los cuales se obtienen las leches de consumo. Los dos riesgos de

ontaminación de la leche son microbiológicos y químicos los cuales obedecen a

contaminaciones que se producen en la extracción, el transporte y manipulación de esta.

Las bacterias que proliferan en la leche tienen actividad reductora como consecuencia de la

desaparición del oxígeno disuelto a causa de la respiración, lo cual provoca un descenso en el

potencial redox y de la producción de un sistema reductor propio de las bacterias. Las pruebas

de reducción de colorantes que miden el índice del metabolismo bacteriano son muy útiles para

clasificar la leche de acuerdo a su calidad microbiológica. Estas pruebas no son fiables si el

número de bacterias se encuentra debajo de 10,000 por ml. Los colorantes comúnmente

usados son el azul de metileno y la resazurina. El tiempo de decoloración del colorante da una

medida del grado de contaminación de la leche, ya que existe una relación entre el desarrollo

microbiano y el descenso del potencial redox.

MATERIAL

4 Tubos de ensaye de 15 X 150 con tapón de hule o de rosca estériles.

2 Pipetas estériles de 10 ml.

2 Pipetas estériles de 1 ml

Muestra de leche bronca

Solución de azul de metileno tiocianato.

Solución de resazurina.

Baño maría eléctrico calibrado a 35ºC.

MÉTODO

1. Con una pipeta estéril colocar 10 ml en los cuatro tubos

2. Agregar dos tubos de 1 ml de azul de metileno y a los otros dos 1 ml de resazurina y mezclar

bien hasta q el color sea uniforme.

3. Incubar los tubos en baño de agua a 35ºC durante el tiempo necesario para que se lleve a

cabo la decoloración.

38

4. Observar cada 30 min teniendo cuidado de agitar para homogenizar el contenido cada

ocasión.

5. Anotar el tiempo requerido para que se efectúe la decoloración.

6. Clasificar la leche de acuerdo a las siguientes tablas.

CLASIFICACIÓN DE LA LECHE POR REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO

Clasificación Tiempo de decoloración Microorganismos por ml

Excelente No se decolora en más de 8 horas.

Muy buena Clase I Más de 5 hrs 30 min. Aprox. 500,00

Mediana Clase II Entre 2 y 5 hrs. 30 min. 500,00 a 4 millones

Mala Clase III Entre 20 min. Y 2 hrs. De 4 a 20 millones

Pésima Clase IV 20 min. O menos. Más de 20 millones.

Excelente Color violeta

Excelente Color violeta

Buena Color violeta-rosado

Mala Color rosa

Muy mala Decoloración completa

CLASIFICACIÓN DE LECHE POR REDUCCIÓN DE RESAZURINA

Resultados:



Bibliografía:






39



PRACTICA #14 CUENTA TOTAL DE BACTERIAS EN LECHE



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 14

CUENTA TOTAL DE BACTERIAS EN LECHE

INTRODUCCIÓN

El recuento total de bacterias en placa es un índice de calidad sanitaria en leche. Aun cuando

los patógenos humanos no estén presentes en una cuenta elevada, nos indica un mal manejo

sanitario o unas condiciones de conservación inadecuadas, como temperaturas elevadas; sin

embargo una cuenta baja o dentro de los límites normales, puede tener organismos patógenos

como Brucella o Mycobacterium. Los exámenes de rutina del ganado y las condiciones de

higiene en la ordeña son la mejor salvaguarda.

En esta práctica vamos a analizar dos leches, una de buena y otra de mala calidad.

LECHE PASTEURIZADA

MATERIAL Y EQUIPO

Muestra de leche

1 frasco con 99 ml de agua esteril.

4 cajas petri estéril.

1 Pipeta de 1.1 ml.

1 matraz con 50 ml de agar soya.

1 cuenta colonias de Quebec.

MÉTODO

1. Marque las 4 cajas de petri con: 1, 10, 100, 1000, que son las diluciones de la leche que se

van a sembrar de acuerdo con el esquema 1.

2. Agregue el agar soya licuado y enfriado a 450ºC.

3. Mezcle bien las muestras de leche con el agar por agitación circular.

4. Deje solidificar el agar.

5. Incube a 350 ºC durante 24 hrs.

6. Cuente las colonias de las cajas que tengan entre 30 y 300 colonias con la ayuda de una

cuenta colonias de Quebec. Multiplique por la dilución.

LECHE BRONCA

MATERIAL

Muestra de leche.

40

1 frasco con 99 ml de agua esteril.

4 cajas petri estéril.

1 Pipeta de 1.1 ml.

1 matraz con 50 ml de agar soya.


METODO

1. Marque las 4 cajas de petri con 10,000, 100,000, 1 millón y 10 millones que son las

diluciones de la leche que se van a sembrar según el esquema 2

2. Proceda a sembrar las muestras de leche como en el caso anterior. Incube a 35ºC durante

24 hrs.

3. Cuente las colonias de las cajas que tengan entre 30 y 300 colonias con la ayuda de un

cuenta colonias de Quebec. Multiplique por la dilución realizada.

4. De acuerdo con los siguientes es esquemas coloque la dilución correspondiente en la caja

petri y agregue agar bilis rojo violeta. Licuado a 45ºC. Incube a 35ºC durante 24 hrs. Y

cuente cuantas colonias rojas o rosa encuentre.

Resultados:



Bibliografía:






41



PRACTICA #15 CUENTA DE MESOFILOS AEROBIOS EN ALIMENTOS



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 15

CUENTA DE MESOFILOS AEROBIOS EN ALIMENTOS

INTRODUCCIÓN

La muestra debe ser representativa del producto y tanto la toma de las muestras como el

transporte al laboratorio no deben alterar la flora existente.

La toma de muestra se efectúa en condiciones asépticas, con utensilios estériles, se guarda en

frascos estériles y se transporta al laboratorio en refrigeración. La muestra debe identificarse

correctamente con los datos necesarios como son tipo de muestra, hora y fecha.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Tornar de varias unidades, si son pequeñas, o de diferentes partes si son muestras grandes,

alrededor de 250 gr del producto. Homogenizar perfectamente. Pesar 10 g del homogenizado

y transferirlo al vaso estéril de una licuadora. Agregar 90 ml de solución reguladora de fosfatos

y licuar a 8000 rpm aproximadamente durante 2 min. Esta es la dilución 1:10.

PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES

Agitar la primera dilución 25 veces en 7 seg. Haciendo un arco de 30 cm, de arriba hacia abajo.

Es importante efectuar la agitación siempre de la misma manera para obtener resultados

comparables.

Tomar con una pipeta estéril 10 ml de la solución 1:10 y transferirlos a un frasco con 90 ml de

amortiguador de fosfatos, estéril. Agitar como se indico anteriormente.

Para este tipo de productos generalmente se practican diluciones hasta de 1:10,000.

ANÁLISIS QUE SE REALIZAN

1. Cuenta de bacterias mesofílicos aerobias. Se reportan como mesofilicos aerobios a 22ºC

durante 72 hrs por gramo de alimento.

2. Cuenta de Staphilococus aureus incluyendo las pruebas de coagulase y de termonucleasa.

3. Investigación de Salmonella, incluyendo las pruebas de enriquecimiento, aislamiento,

identificación bioquímica y confirmación serológica.

4. Cuenta de hongos y levaduras, aplicable a las carnes desecadas y a las conservadas en

vinagre.

INTERPRETACION DE RESULTADOS

42

La carne cruda presenta una gran variedad de microorganismos procedentes de diferentes

fuentes. Así, por ejemplo se encuentran frecuentemente bacterias de origen intestinal, como

conformes fecales, E. Coli, Ci, perfringes y Salmonella.

Las condiciones inadecuadas de conservación, manejo y tansporte de la carne permiten la

proliferación de tales gérmenes por lo que su presencia no puede emplearse como indicador.

Una vez sometida a algún tratamiento de conservación, la flora disminuye, en consecuencia, la

cuenta total de colonias de productos cocidos frescos debe ser baja. Cuentas altas significan

fallas en el proceso, en el almacenamiento o en general, que el producto ha sido manejado en

condiciones inadecuadas.

En productos fermentados como muchos tipos de salami, salchichones, etc. La cuenta total no

tiene un significado ya que la flora que se desarrolla en el medio de cultivo estará formada

fundamentalmente por los microorganismos propios del proceso de fermentación a que se

sometió el producto (lacto bacilos, micrococos, etc.). La proliferación previa de estos gérmenes

en el producto ocasiona que disminuya el pH e inhiben en consecuencia el crecimiento de otros

microorganismos, como pueden ser los patógenos.

El hallazgo de s. aureus en los productos cárnicos indica un riesgo potencial para la salud del

consumidor, cuando se halla presente en altas concentraciones; sin embardo, en productos

empacados al vacio, la baja tensión de oxígeno, aunadas a la presencia de nitritos, inhiben el

crecimiento del germen y la producción de enterotoxinas. Los nitritos inhiben también el

desarrollo de C. Botullinum y la producción de toxina.

Por lo que se refiere a salmonella, esta es usualmente destruida por los procesos de

calentamiento, ahumado, etc., y en caso de sobrevivir a ellos, su número debe ser bajo por

efecto del pH o la presencia de conservadores.

En productos cocidos la presencia de salmonella indica contaminación post-proceso por

contacto con superficies contaminadas o alimentos crudos que la contengan.

MATERIAL

Alimento; carne molida, fruta seca, comida congelada, verdura congelada (deshelados por lo

menos durante 2 horas) etc.

Por alimento:

5 cajas de petri estériles.

1 matraz con 75 ml de agar para cuenta estándar, licuado y caliente.

6 tubos con 9 ml de agua peptonada.

3 pipetas estériles de 1 ml.

180 ml de agua destilada estéril en un matraz.

1 espátula esteril.

Por grupo:

1 licuadora

1 vaso de licuadora estéril, por alimento.

1 cuenta de colonias québec.

MÉTODO

43

1. Pesar asépticamente 20 g de alimento

2. Colocarlos en la licuadora con 180 ml de agua destilada estéril.

3. Licuar bien el alimento durante 2.5 min.

4. Pasar 1 ml a un tubo con 9 ml de agua peptonada y repetir la operación con un total de 6

tubos.

5. Colocar 1 ml de cada una de las últimas 5 diluciones en una caja de petri estéril.

6. Añadir a cada una de ellas aproximadamente 15 ml de agar métodos estándar licuado a

una temperatura de 45 ºC.

7. Mezclar perfectamente en redondo para distribuir bien la muestra en la caja.

8. Dejar solidificar.

9. Incubar a 35ºC durante 24 hrs.

10. Contar con la ayuda de un cuenta colonias de Quebec.

Resultados:



Bibliografía:






44



PRACTICA #16 DETERMINACION DE COLIFORMES, SALMONELLA Y SHIGELLA EN ALIMENTOS QUE SE COMEN CRUDOS



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 16

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES, SALMONELLA Y SHIGELLA EN ALIMENTOS QUE

SE COMEN CRUDOS

INTRODUCCION

Existen 4 tipos principales de enfermedades agudas por alimentos: 1) intoxicación alimenticia

estafilocócica, 2) infección alimenticia por salmonella, 3) infección alimenticia estreptocócica y

4) botulismo. Es necesario tener presente que los estafilococos se encuentran siempre en la

piel humana, nariz, garganta y son organismos de granos, no debe quizá sorprendernos que

los casos de intoxicación alimenticia sean debidos frecuentemente a estos organismos.

Los alimentos más frecuentes responsables son sobre todo los pasteles, de crema y productos

similares de repostería, aun cuando algunos brotes se originen por bocadillos así como

alimentos cuya preparación requiere extensa manipulación como jamón y quesos procesados.

Sin embargo la infección alimenticia por Salmonella se caracteriza por el retraso de la aparición

de los síntomas después de la comida. El periodo de incubación es por lo menos de 6 horas.

Las principales especies de salmonella son: S. tiphimurium, S. Enteritiditis y a veces S.

Choleraesuis. La mayoría de los brotes se deben principalmente a la carne, leche, pescado u

otras proteínas animales y rara vez a frutas o vegetales.

OBJETIVO

Determinar la presencia de estos microorganismos mediante medios de enriquecimiento y

medios selectivos en alimentos que se comen crudos.

MATERIAL

Alimento: verduras, frutas, quesos, etc.

Por alimento:

5 tubos con 9 ml de agua peptonada.

9 tubos con 9 ml de caldo selenito.

2 placas de E.M.B.

5 pipetas estériles de 1 ml.

3 cajas de petri estériles.

3 tubos con 15 ml de agar XLD.

180 ml de agua destilada estéril en un matraz.

45

1 asa de siembra.

1 espátula estéril.

1 cuadro de papel de aluminio estéril.

Por grupo:

1 licuadora

1 vaso de licuadora estéril, por alimento.


MÉTODO

1. Pesar asépticamente 20 g de alimento.

2. Colocarlos en la licuadora con 180 ml de agua destilada estéril.

3. Licuar bien el alimento (durante 2.5 min).

4. Pasar 1 ml a un tubo con 9 ml de agua peptonada y repetir la operación con un total de 5

tubos. Según el esquema.

5. Colocar por triplicado 1 ml de la dilución en 3 tubos con 9 ml de caldo selenito o tetrationato

y repetir esta operación con las diluciones 4 y 5.

6. Incubar a 43ºC de 16 a 18 horas. (después de 18 horas crecen otros microorganismos).

7. Ver el número de tubos positivos para calcular con ellos el NMP.

8. Colocar 1 ml de cada una de las últimas 3 diluciones en una caja petri estéril.

9. Añadir a cada una de ellas aproximadamente 15 ml de agar XLD licuados a temperatura

45ºC.

10. Mezclar bien agitando en redondo para distribuir bien la muestra en la caja.

11. Dejar solidificar.

12. Incubar a 35ºC por 24 hrs.

13. Contar las colonias con la ayuda de un cuenta colonias de Quebec.

Resultados:



Bibliografía:






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PRACTICA #17

DETERMINACION DE S. AUREUS EN PRODUCTOS DERIVADOS DE LA LECHE Y DE

LA CARNE.



Academia:


4h

Prácticas CS-01

Práctica Núm. 17.

DETERMINACION DE S. AUREUS EN PRODUCTOS DERIVADOS DE LA LECHE Y DE LA

CARNE.

INTRODUCCIÓN

El recuento de S. aureus en los alimentos se viene haciendo mediante siembra directa por

extensión en placas por medio de Baird Parker (agar, yema de huevo, telurito, glicina, piruvato,

cloruro de litio) con incubación a 37ºC durante unas 30 horas. Este medio tiene la ventaja de

ser selectivo, diferencial y permitir el crecimiento incluso de células de estafilococo que han

sufrido daño subletal por diversos agentes. Sin embargo, en algunos casos la recuperación no

es posible por lo que se recomienda a veces la revitalización antes de la seimbra.

Las colonias yema de huevo positivas se resiembran en caldo de infusión de cerebro y corazón

o en caldo de soya y se incuban a 43ºC. Las cepas que se multiplican a 43ºC se confirman

como típicas mediante la prueba de la coagulase.

Esta determinación se aplica a cremas para pasteles, quesos (principalmente frescos), postres

preparados a base de leche como flanes, gelatinas o natillas. En helados solamente en una

posible intoxicación cuando se sospeche que la proliferación haya tenido lugar antes de

congelar la muestra.

La toma de muestra requiere de material y utensilios esterilizados. La muestra puede consistir

en envases o paquetes originales, cerrados listos para la venta o en muestras tomadas a

granel. El tamaño de la muestra no debe ser menos a 100. El muestreo debe ser representativo

del lote y se hará de acuerdo al alimento que se trate.

Leche acidificada y crema:

Homogenizar perfectamente la muestra y transferir por medio de cucharas de mango largo a

frascos estériles de boca ancha. Colocar inmediatamente las muestras debidamente

inidentificadas entre 2 y 40ºC y transportarlas al laboratorio. El análisis debe efectuarse entre

4 y 6 horas después del muestreo.

Quesos blandos o semiduros:

Se tomará una rebanada en forma de cuña con un cuchillo estéril, haciendo el corte desde el

centro del queso. Debe eliminarse la capa superior no comestible.

47

Quesos grandes, duros:

Es conveniente usar un muestreador para quesos que debe ser insertado en forma oblicua

desde la superficie hasta el centro del queso, penetrando de 10 a 20 cm. Las muestras se

transportan al laboratorio en cajas refrijeradas entre 2 y 40ºC. El análisis debe efectuarse dentro

de las 24 horas de haber tomado la muestra.

En el caso de las carnes, esta determinación se aplica a carnes crudas y escaldadas.

Toma de muestra de derivados lácticos.

Mantequilla

La toma de muestra a partir de bloques puede efectuarse con un muestreados de mantequilla

que se inserta verticalmente en una esquina, se coloca la muestra en un frasco estéril y se

repite la operación en la esquina opuesta diagonalmente. Si no se cuenta con el muestreador,

puede utilizarse una cuchara o una espátula. La muestra tomada no será menor de 60 g. Las

muestras de mantequilla no deberán estar en contacto con papel o superficies absorbentes. Se

transportarán refrigeradas y se analizarán lo más pronto posible.

MATERIAL

3 placas de agar Baird-Parker.

3 pipetas de 1 ml estériles.

2 frascos con 90 ml de amortiguador estéril.

3 varillas de vidrio dobladas en ángulo recto de 4x20 cm.

Tubos con 0.5 ml de caldo de soya o caldo de infusión de cerebro y corazón

Plasma de conejo con E.D.T.A. al 2% como anticoagulante.

MÉTODO

1. Hacer las diluciones marcadas en el esquema de la práctica.

2. Colocar 0.1 ml de las diluciones 1:10, 1:100, y 1:1000 en cada una de las placas de agar

Baird Parker y extenderlo perfectamente en la placa con la ayuda de una varilla doblada en

ángulo recto. Mantener las placas en su posición hasta que se haya absorbido totalmente

el inóculo.

3. Incubar a 35ºC durante 45 a 48 horas.

4. Seleccionar las placas que tengan entre 20 y 200 colonias típicas de S. aureus (colonias

negras, lustrosas, convexas, de 1-5 mm. De diámetro rodeadas de un halo transparente), y

contar las colonias. Calcular el número de microorganismos por gramo de alimento. En este

tipo de alimentos pueden aparecer colonias negras sin brillo, que no presentan zonas claras;

practicar la observación microscópica y probar alguna de ellas.

5. Seleccionas colonias características de S. aureus y sembrarlas en 0.5 ml de caldo de soya

o cerebro y corazón e incubar a 35ºC durante 24 hrs. Sembrar el número de colonias según

el siguiente cuadro.

Núm. De colonias sospechosas Colonias a probar

Menos de 50 3

De 51 a 100 5

48

De 101 a 200 o más 7

6. A los tubos con desarrollo positivo realizarles la prueba de la coagulasa.

Resultados:



Bibliografía:






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