GUIA LABORARORIO MICROBIOGÍA

Titulo del Laboratorio: Identificacion de Microorganismos y Antibiograma.

Nombre de la carrera: Medicina

Nivel del curso: VI Nivel

Nombre de los docentes responsables: TM Maria Ester Aliaga Lopez TM Lina Castillo Catalan Fecha de ejecución: 21 y 22/04/2011

1.- Objetivo del laboratorio:

2.- Introducción

3.- Desarrollo de la actividad

4.- Tipo de evaluación_

4.1.- Quíz de entrada : Objetivo : alumno este informado de la teoría para realizar la actividad

4.2.- Informe de la actividad realizada a entregar en el laboratorio siguiente Objetivo: Evaluar aprendizaje del laboratorio realizado

DESARROLLO

1.- Objetivo del laboratorio:Proporcionar al estudiante el conocimiento científico y las habilidades prácticas de los métodos y técnicas utilizados en Microbiología Médica para el aislamiento e identificación de los principales agentes patógenos para el hombre y su estudio de susceptibilidad a los antibióticos ,a partir de muestras clínicas, lo que le permitirá actuar correctamente en su práctica médica en el campo de las enfermedades infecciosas

- 2.- Introducción:

El primer paso del diagnóstico microbiológico comienza con la obtención de la muestra clínica adecuada. Para ello es preciso conocer los posibles agentes etiológicos de las enfermedades infecciosas y los mecanismos patogénicos de los mismos. La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso que se pretende diagnosticar, teniendo siempre en cuenta que en determinadas infecciones, muestras no relacionadas directamente con la focalidad clínica, pueden tener también un buen rendimiento microbiológico. El síndrome clínico y los posibles agentes etiológicos implicados condicionan no sólo el tipo de muestra a enviar sino también su procedimiento de obtención y el transporte al laboratorio. En la tabla 1 se resumen los distintos tipos de muestras adecuadas en función de las infecciones más comunes. Igualmente, la información clínica es la que permite al laboratorio aplicar las técnicas diagnósticas disponibles de manera más eficiente. Por ello es fundamental que el microbiólogo esté en estrecha comunicación con los clínicos y que participe activamente en el proceso diagnóstico del paciente. A su vez, el laboratorio de microbiología debe poner a disposición de los clínicos toda la información necesaria sobre las posibilidades diagnósticas que el laboratorio ofrece.

Tabla 1.- Muestras clínicas recomendadas para el diagnósitico microbiológico de las infecciones más comunes

Tipo de infección Muestra ComentariosBacteriemia Hemocultivos  Infecciones cardiovasculares y asociadas a dispositivos intravasculares (IV)Endocarditis Hemocultivos/Válvula/Verrugas

Infección del catéter Catéter IV, piel pericatéter, conexión del catéter

Pericarditis Líquido pericárdico

Sistema nervioso centralMeningitis LCR

Abscesos cerebrales Aspirados de abscesos

Tracto respiratorioFaringoamigdalitis Exudado faríngeo

Sinusitis Aspirado sinusal No válidos los exudados nasales

Otitis media Timpanocentesis

Otitis externa Exudado oído externo

Neumonia Esputo, muestras obtenidas por fibrobroncoscopia, punción transtorácica aspirativa, punción transtraqueal, broncoaspirado

Empiema y abscesos pulmonares Líquido pleural, aspirados de abscesos

Nasofaríngeo Diagnóstico tosferina/Infecc. víricas

Nasal Detección de S. aureus

Infecciones ocularesConjuntivitis Exudado conjuntival/raspado

Queratitis Raspado corneal

Endoftalmitis Líquido intraocular

Infecciones gastrointestinalesDiarrea Heces/Biopsia intestinal/ 

Aspirado duodenal

Infecciones intraabdominalesPeritonitis Líquido peritoneal

Abscesos intraperitoneales y abscesos viscerales

Aspirados de abscesos

Colecistitis Líquido biliar

Tracto urinarioInfección urinaria Orina (micción media, sonda)

Orina obtenida mediante punción suprapúbica

Diagnóstico de bacteriuria por anaerobios y de ITU en niños

Tracto genitalÚlceras genitales Raspado de la úlcera

Nódulos genitales Aspirado del nódulo

Uretritis Exudado uretral

Vulvovaginitis Exudado vaginal Detección de S.agalactiae (también exudado rectal )

Cervicitis Exudado endocervical

Prostatitis Secreción prostática Acompañada de orina pre y post masaje prostático

Piel y tejidos blandosImpétigo, foliculitis, erisipela, celulitis, úlceras, infecciones gangrenosas, abscesos cutáneos, heridas y quemaduras

Preferiblemente aspirados tomados con jeringa y biopsias de tejido. Son menos recomendables las muestras tomadas con torundas

Hueso y articulacionesArtritis Líquido sinovial

Osteomielitis Biopsia ósea o exudado

En la clínica, la rápida y correcta identificación del microorganismo o microorganismos causantes de una infección puede ser trascendental para la

implantación del tratamiento adecuado. De ahí la importancia de las pruebas que se seleccionen para llegar a dicha identificación.El método más extendido para llegar a la identificación de microorganismos se basa en la realización de una batería de pruebas bioquímicas, a través de las cuales se va a detectar el metabolismo del microorganismo, enzimas que posee, características de resistencia a determinadas sustancias, etc... La identificación es tanto mejor cuanto mayor es el número de caracteres investigados.Para realizar correctamente las pruebas bioquímicas es fundamental tener colonias perfectamente aisladas, es decir, partir de cultivos puros.

Las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana las podemos clasificar atendiendo a varios criterios:PROCESOS RESPIRATORIOS QUE UTILIZAN LAS BACTERIAS PARA LAOBTENCIÓN DE ENERGÍAA) PRUEBA DE LA CATALASA* Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzimacatalasa, capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada(H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma de burbujas en el medio. ElH2O2 se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azúcares; si se acumulara sería tóxica para la bacteria.

B) PRUEBA DE LA OXIDASA* Fundamento: se investiga la presencia de la enzima citocromooxidasa en elmicroorganismo, la cual oxida al dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro)dando un producto de color.El sistema citocromooxidasa se encuentra, por lo general, en microorganismosaerobios.* Reactivos: Dimetil-p-fenilendiamina o tetrametil-p-fenilendiamina impregnadosobre tiras o discos de papel de filtro.Identificación presuntiva

PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO GLUCÍDICOLa mayoría de las bacterias son capaces de metabolizar la mayoría de loshidratos de carbono, ya sea por vía oxidativa o fermentativa.A) PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER* Fundamento: observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la víabutanodiólica. Si es así, se forma un producto intermedio (acetoína) que formaun complejo de color rojizo con el á-naftol.

B) PRUEBA CON AGAR HIERRO DE KLIGLER (TSI)* Fundamento: mediante esta prueba vamos a poder determinar:a. La capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono específico (en este caso glucosa, lactosa o ambas)incorporado en un medio de crecimiento básico.b. Producción o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono.c. Producción de ácido sulfhídrico (SH2).

El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa.Existe otro medio, el TSI, que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa; los fundamentos bioquímicos de ambos son los mismos.

C) PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA (para diferenciar los Estreptococos del grupo D y Enterococos, que tienen esta propiedad, de otros Estreptococos, que no pertenecen a dicho grupo.

PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO PROTÉICOSe investiga la presencia en los microorganismos de enzimas con actividadproteolítica.

A) PRUEBA DE LA COAGULASA* Fundamento: se pretende comprobar la facultad de un microorganismo decoagular el plasma por acción de la enzima coagulasa. La coagulasa se puedeencontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la pared bacteriana).La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz detransformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulovisible.

B) PRODUCCIÓN DE HEMÓLISIS* Fundamento: los microorganismos, cuando se cultivan "in vitro" sobre medios que contienen sangre, pueden producir alrededor de las colonias unas zonas de hemólisis variables, según se origine una destrucción parcial o total de los eritrocitos. Las sustancias responsables de estos fenómenos son exotoxinas,liberadas por las bacterias al medio, llamadas hemolisinas.

C. PRUEBA DEL INDOL* Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima triptofanasa o triptofanodesaminasa, capaz de desdoblar el triptófano (aminoácido) en indol más alanina. Se detecta la presencia de esta enzima mediante la reacción del indol producido con el reactivo p-dimetilaminobenzaldehido.

E) PRUEBA DE LA UREASA* Fundamento: mediante esta prueba determinamos la capacidad del microorganismo de desdoblar la urea en CO2 y amoníaco por acción de la enzima ureasa. Se visualiza el proceso debido a que la alcalinidad que se produce origina un cambio de color en el indicador que lleva incorporado el medio.Esta prueba se puede realizar en tubo con medio sólido o sobre discos de papel de filtro.

PRUEBAS BASADAS EN CARACTERES DE RESISTENCIA A CIERTAS SUSTANCIASA) TEST DE LA OPTOQUINA* Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la optoquina.

B) TEST DE LA BACITRACINA* Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina.

INVESTIGACIÓN DE SUSTANCIAS ENERGÉTICAS NUTRITIVASA) PRUEBA DE LA UTILIZACIÓN DE CITRATOS* Fundamento: mediante esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono.El medio incluye citrato de sodio como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato como única fuente de carbono también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoníaco, llevando a la alcalinización del medio.

El medio lleva un indicador, el azul de bromotimol, que es amarillo a pH ácido,verde a pH neutro y azul a pH alcalino.

Interés: La batería clásica para la identificación de enterobacterias esta formada por:TSILIAMIOCitrato SimmonsUREA

El antibiograma

Por qué realizar un antibiograma?

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones terapéuticas individuales.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en los hospitales.

Hay pues un doble interés: Terapéutico y epidemiológico.

Cuándo realizar un antibiograma?

Siempre que una toma bacteriológica de finalidad dìagnóstica haya permitido el aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infección.

Establecer esta responsabilidad exige una colaboración entre el bacteriólogo y el clínico. En efecto, en ciertas circunstancias, el microbiólogo no podrá

determinar con certeza que el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clínicos que le aporta el médico. Por ejemplo, una bacteria no patógena puede ser responsable de la infección de un enfermo inmunodeprimido o en un lugar determinado del organismo. La presencia de signos clínicos puede ser también determinante para la realización de un antibiograma (por ejemplo: la infección urinaria con un número reducido de gérmenes).

Sensibilidad bacteriana a los antibióticos

Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa,1) las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o semiautomatizados), 2)E-Test, 3)Metodo de Kirby Bauer(difucion en agar.

Estos diferentes métodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al antibiótico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótìco.

Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la CLSI:

*Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosìs habitual.

*Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.

*Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posología).

3.- Desarrollo de la actividad

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION BACTERIANA.El aislamiento de los microorganismos, presentes en las muestras biológicas,suele indicar que se trate del agente causal de la enfermedad infecciosa que se está investigando y se lleva a cabo, utilizando medios de cultivo sólido contenido en una placa de Petri. Los medios más usados en el laboratorio, comprenden el de agar sangre de cordero 5%, y agar MacConkey.*Se observarán en las placas los tipos de colonias que han crecido en la superficie del medio y se anotarán las características más importantes que

puedan ser útiles en una identificación preliminar, se anotara en el informe final.**Se realizará la coloración de Gram y se procederá de acuerdo al resultado a la identificación del Microorganismo.***Con los cultivos donde se observen cocos Grampositivos,según coloración de Gram.si están en disposición de racimos o en diplococos o cadenas, hacer prueba de catalasa, para diferenciar estafilococos de estreptococos.**** Observar hemolisis, (Alfa, beta o gamma).*****Cocos Gram positivos con disposición en racimos , catalasa (+), hacer prueba de coagulasa y urea.******Cocos Gram (+) con disposición en diplo o cadenas,catalasa (-)efectuar test de bacitracina, sembrar medio de bilis esculina, tolerancia a la sal, test de optoquina.

Si al Gram se observan bacilos Gram negativos en disposición irregular, efectuar batería para enterobactereas e interpretar según tabla proporcionada por ayudantes.

ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS EN EL LABORATORIO

OBJETIVOS:

• Conocer y realizar los métodos de estudio de sensibilidad en los antimicrobianos o antibiograma

• Realizar antibiograma por el método de Kirby y Bauer a diferentes cepas bacterianas

• Interpretar los antibiogramas realizados

• Discutir y analizar la importancia del estudio de sensibilidad de las bacterias de importancia clínica

ACTIVIDADES:

• Se cuenta con cepas bacterianas con 24 horas de incubación para realizar los antibiogramas

a) Preparar un inóculo en caldo Müller – Hinton correspondiente a 1 x 108 UFC/ml, comparándolo con el Standard de Mac Farland 0.5. Control de turbidez.

b) A partir del inóculo sembrar con tórula una placa de agar Müller – Hinton, cubriendo completamente su superficie con la siembra.

c) Dejar secar por 10 minutos y depositar sobre la superficie del agar sembrado un multidisco para cocáceas gram positivas o bacilos gram negativos según corresponda

d) Incubar por 18 a 24 horas en estufas de cultivo a 35º C.

e) Leer los antibiogramas realizados según tablas estandarizadas del CLSI 2010.

f) Interpretar los resultados de los antibiogramas valorando su importancia en el estudio de agentes bacterianos patógenos

ANEXO PRUEBAS BIOQUIMICAS IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS

PRUEBAS DIFERENCIALES MICROBIOLOGICAS

PARA COCACEAS GRAM POSITIVAS (CGP)

Prueba de Catalasa: Diferencia entre Staphylococcus y Streptococcus

Catalasa Positiva (Staphylococcus) Catalasa Negativa (Streptococcus)

Prueba de Coagulasa: Diferencia entre Staphylococcus coagulasa positiva o negativa

Coagulasa Negativa Coagulasa Positiva

Prueba de Bilis Esculina Prueba de Tolerancia a la Sal

Genero Prueba de Bilis Esculina B/E

Prueba de Tolerancia a la Sal (NaCl 6,5%)

Staphylococcus Negativa PositivaStreptococcus grupo D Positiva NegativaEnterococcus faecalis Positiva Positiva

DIFERENTES TIPOS DE HEMOLISIS EN AGAR SANGRE

PARA BACILOS GRAM NEGATIVOS (BGN)

Batería Básica

TSI LIA MIO CITRATO UREA DE SIMONS CRISTHENSEN

INDOL POSITIVO INDOL NEGATIVO

CITRATO (+) CITRATO(-)KLEBSIELLA E.COLI

PNEUMONIAE

REACCIONES TSI LIA (-) UREA (+)

REACCIONES MIO

HALOS DE SENSIBILIDAD METODO DE DIFUCION EN AGAR(KIRBY BAUER) AGAR MUELLER HINTON

AGAR SANGRE

E- TEST Vista general de una placa con crecimiento bacteriano y con dos tiras de E-test. La zona de color más claro que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Las elipses más oscuras que rodean la parte superior de las tiras E-test marcan las zonas en que los respectivos antibióticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio.