UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA

Docente: Martha A Mora García. Esp.Bacteriología lll –

Manejo de muestras biológicas.

CLASIFICACION TAXONOMICADominio: Bacteria

Filo: Actinobacteria

Orden: Actinomycetales

Suborden: Corynebacterineae

Familia: Mycobacteriaceae

Género: Mycobacterium.

Características GeneralesAerobias estrictas (excepto en estado latente)No móvilesPared celular rica en lípidosM. tuberculosis su único hospedero es el

humanoTiempo de replicación muy lento, 15-20 horasClasificación:

Complejo Tuberculoso: Niacina y nitritos positivos, catalasa a 68°C negativa

CARACTERISTICAS

PARED CELULAR

PECTIDOGLICANOPOLIMEROS DE ARABINOSA Y

GALACTOSA.ACIDOS MICOLICOSLIPIDOS SUPERFICIALES: Cord factor Micosidos

Sulfolipidos.

PARED CELULAR MICOBACTERIAS

Pared celular micobacterial: 1-lípidos externos, 2-ácido micólico, 3-polisacáridos (arabinogalactano), 4-peptidoglicano, 5-membrana plasmática, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-fosfatidilinositol manosido, 8-pared celular.

Pared celular micobacterial: 1-lípidos externos, 2-ácido micólico, 3-polisacáridos (arabinogalactano), 4-peptidoglicano, 5-membrana plasmática, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-fosfatidilinositol manosido, 8-pared celular.

CARACTERISTICAS GENERALES

COMPLEJOS

TUBERCULOSIS

M. tuberculosisM. bovis

M. africanum

COMPLEJO LEPRA

M. LepraeM. Lepraeemurium

MICOBACTERIAS ATIPICAS

M. kansassi-intermedium-marinumScrofulaceum-xenopi-avium-IntracelularFortuitum y chelonei-gordonae-szulgai

GENEROS

Epidemiología

El método más efectivo de control de la TB es la búsqueda activa de casos bacilíferos y su tratamiento, ya que desde el punto de vista epidemiológico la infectividad del paciente disminuye en forma importante a las pocas semanas de iniciado un buen tratamiento, y por el contrario un paciente bacilífero infecta de

10 a 15 personas por año.

ANTIGENICIDAD

LIPIDOS Cord factorPROTEINAS TuberculinaMICOBACTINAS EXOQUELINAS

Determinantes de patogenicidad

Factor cordón: Adoptan la forma serpenteante constituido por bacilos que se disponen de manera paralela y compacta, el desarrollo en cordones puede correlacionarse con la presencia del glucolipido trehalosa 6,6’– dimicolato.

Sulfatados: Son glicolípidos localizados de forma periférica responsables de la reactividad al rojo neutro, aunque los sulfatados no son tóxicos pero cuando se administran de forma simultanea con el factor cordón potencia de manera sinérgica la toxicidad de este.

Intracelularidad: promover su propia supervivencia dentro del huésped actuando desde el interior de los fagosomas para prevenir la formación de los fago lisosomas con lo que evita su exposición a enzimas hidrolíticas ( lizosomicas).

MYCOBACTERIUM - TUBERCULOSO CUADRO CLINICO

Se establece en tres fases:INFLAMACIONFORMACION DEL TUBERCULOCACEIFICACION

CUADRO CLINICO

ESTADIOS

PRIMO-INFECCION REINFECCION

Ciclo de vida

PatogénesisDurante la fase de invasión tisular, el transporte de

microorganismos por el macrófago a través de la pared alveolar, permite el acceso del bacilo a la sangre a través de la vía linfática.

Este período de “micobacteremia” le proporciona al microorganismo el acceso y posibilidad de permanecer en el sistema mononuclear fagocítico y sitios que le proveen un medio ambiente favorable (alta presión de oxigeno) , como es el área apical de los pulmones y sitios con alto flujo sanguíneo como nodos linfáticos, riñones, epífisis de huesos largos, cuerpos vertebrales y áreas meníngeas.

La reactivación tardía de estos focos da origen a la tuberculosis extrapulmonar y a la forma pulmonar apical de más frecuente presentación.

Patogénesis

Las vías de entrada del bacilo tuberculoso al organismo son la inhalación, ingestión e inoculación directa. La más importante es la inhalación de partículas infectantes expulsadas por medio de la tos de un paciente bacilífero. Partículas mayores de 10 µm son filtradas en la nariz y menores de 5 µm evitan las barreras mecánicas y pueden penetrar y depositarse en la superficie respiratoria.

La respuesta inmune celular efectiva, cura la lesión primaria espontáneamente con calcificación del foco paren quimatoso (Foco de Gohn y nódulos hiliares) constituyendo el complejo de Ranke.

Patogénesis

Los linfocitos T, sensibilizados con antígenos del M. tuberculosis determinan la aparición del fenómeno de hipersensibilidad retardada medida a través de la prueba de tuberculina.

Los linfocitos (específicamente CD4) de individuos con fuerte hipersensibilidad retardada, son capaces de producir linfoquinas que activan la capacidad microbicida del macrófago y junto con el linfocito organizan el granuloma, el cual sirve para detener la infección, reducir el crecimiento del bacilo y restringir la movilidad de los macrófagos infectados, evitando la diseminación de la infección.

En individuos con inmunodeficiencia como la producida por infección por VIH,hay falta de formación de granuloma y no se restringe la movilización del macrófago infectado, resultando en la tuberculosis miliar o de diseminación hematógena.

Manifestaciones clínicas.

Debilidad Malestar generalPerdida de pesoPerdida del apetitoFiebre de predominio visceralSudoración nocturna El compromiso particular pulmonar

característicamente se asocia a tos hemoptoica (tos con expectoración y presencia de sangre) Dolor Toráxico

Formas Clínicas

La entrada del bacilo al organismo produce la PRIMO-INFECCION TUBERCULOSA, con lesiones generalmente limitadas, pero con persistencia de bacilos en forma latente, sin multiplicación, pero que se expresan en una prueba de tuberculina positiva en pacientes asintomáticos.

Estas lesiones pueden permanecer inactivas el resto de la vida, o sufrir reactivación posterior cuando el estado inmune del huésped lo permita.

La mayor parte de los casos de ENFERMEDAD

TUBERCULOSA son producidos por la reactivación endógena y menos frecuentemente por nueva infección o infección exógena, la cual puede ser reconocida por la caracterización del genotipo del M.tuberculosis.

Presentaciones clínicas

Tuberculosis pulmonar. Tuberculosis meníngea. Tuberculosis extra pulmonar. Tuberculosis milliar. Tuberculosis linfática. Tuberculosis genitourinaria. Tuberculosis

gastrointestinal.

Formas Clínicas

L a forma pulmonar es a mas frecuente, pero el compromiso extrapulmonar es la mas frecuente en pacientes con algún factor de inmunosupresión.

Las manifestaciones clínicas de la tuberculosis pueden ser:

Sistémicas relacionadas con la infección por sí misma (fiebre, malestar general, pérdida de peso, diaforesis nocturna, anorexia, adinamia, anemia, leucocitosis o leucopenia.

Locales determinadas por el órgano o sistema comprometido.

Metabólicas como hipona tremia por secreción inapropiada de hormona antidiurética y anormalidades neurosicoló gicas como depresión.

Patogénesis en Tuberculosis

10% de personas que se infectan con Tb y tienen un sistema inmune normal desarrollarán Tb en algún momento de su vida

Pacientes con HIV tienen el mayor riesgo de desarrollar Tb, 7-10% cada año

Otras patologías también incrementan el riesgo para que la infección progrese a enfermedad.

El Panorama Actual de la Tuberculosis en el Mundo

Un tercio de la población mundial está Un tercio de la población mundial está infectado con el baciloinfectado con el bacilo M. tuberculosis M. tuberculosis..

7.5 millones 7.5 millones de casos nuevos por año casos nuevos por año

Se presentan 2,8 millones de muertes por Se presentan 2,8 millones de muertes por añoaño

Problema ActualAumento en el número de casos

Fallas en los programas de salud pública que manejan la vigilancia de casos y controles

La no supervisión del tratamiento (TAS-DOTS)

Retardo en el diagnóstico tanto clínico como microbiológico

Aumento de la resistencia a medicamentos tradicionales

Disminución de las posibilidades terapéuticas

MDR - XDR

MDR: aislamiento resistente al menos a isoniazida y rifampicina

XDR: aislamiento MDR con resistencia a la quinolona ( ofloxacina, ciprofloxacina) y algunos de los inyectables: kanamicina, amikacín o capreomicina

Plan Nacional de Salud pública Plan Nacional de Salud pública Colombia 2007-2010Colombia 2007-2010

Estrategias para disminuir los riesgos para las enfermedades transmisibles y las zoonosis:

• Implementar el Plan Estratégico Colombia Libre de TB 2006-2015

Metas Mundiales y Adoptadas en los Niveles Nacionales

• 2005: – Diagnosticar al 70% de los casos TBP Bk+– Curar al 85% de los casos TBP Bk+

• 2015 (objetivos de desarrollo del milenio)– Disminuir de forma significativa la prevalencia y

mortalidad

• 2050– Eliminar la TB como un problema de salud

pública (<1 caso por 1 millón de habitantes)

Desafíos del Control de TBDesafíos del Control de TB

• Pobreza – Desnutrición

• Poblaciones vulnerables– Indígenas

– Desplazados

– Población carcelaria y penitenciaria

• Coinfección TB/VIH

• MDR- XDR TB

• Reformas del sector salud

Niveles de LaboratorioNivel I:

Recoge muestras y realiza baciloscopia y remite muestras a nivel superior.

Nivel II: Realiza baciloscopia Cultivos en medios a base de huevo Identifica M. tuberculosis Pruebas de sensibilidad a primera línea

Nivel III: Mismos procesos del nivel II mas: Métodos de cultivo diferentes a a LJ O OK Identificación de MNT Sensibilidad a medicamentos de primera y segunda línea

DIAGNOSTICO

PRUEBA DE TUBERCULINA

RADIOGRAFIA DETORAX

MICROBIOLOGIABaciloscopia

Cultivo Técnicas moleculares

Elementos en el Diagnóstico de Tuberculosis

SINTOMÁTICOS RESPIRATORIOS

Historia Clinica

Examen fisico

tuberculina

Estudios radiológicos

Baciloscopia: Examen directo con coloración para bacilos ácido alcohol resistentes

Cultivo

Proceso de la Muestra en el Laboratorio

+

CD MGIT

Centrifugación 4°C

Incubación

IdentificaciónFenotípica-Genotípica

MGIT LJAR

•PulmonaresDescontaminación:

NaOH 4%Mucolítico: N-acetyl cisteína

•Estériles siembra directa

Sedimento

Inocular

PulmonaresDecontaminación +

CDMGIT

Extra-pulmonares

MuestraCentrifugación

Incubación

Identificación

MGIT LJAR

AR

Proceso de las muestras

KY

Incubación 36°C

Adenosin Deaminasa (ADA)Citoquinas

Enzima producida por linfocitosEvaluada extensamente en tuberculosis pleural,

peritoneal, meningitis

Citoquinas: Interferon y TNFMétodos rápidos, simples, no invasivosPoca precisión si se utilizan como única prueba

PRUEBA DE TUBERCULINA

INYECCCION INTRADERMICA:SU POSITIVIDAD INDICA:Seguridad de protecciónVacunación previaRiesgo de desarrollar enfermedad por

reactivaciónINDURACION MAYOR DE 10 mm de diámetro,

con sintomatología – Enfermedad actual.

DIAGNOSTICO

POSITIVA +10 mmDUDOSO 5-9 mm

Tiempo deLectura 72 horas

MUESTRAS PARA INVESTIGAR Mycobacterium

ESPUTOLIQUIDO CEFALORRAQUIDEOORINABIOPSIASMUESTRAS DE PIELASPIRADOS BROCOALVEOLARESOTROS LIDQUIDOS ORGANICOSPIEL

MEDIOS DE CULTIVOINVESTIGACION DE MICOBATERIAS

LOWENSTEIN JENSENOGAWA KUDOHSTONENENBRINGMIDDLEBROOKAGAR y CALDOS 7H9 -7H10 Y 7H11.

Factor CordónM.tuberculosis

Agar CDFactor CordónM.tuberculosis

Colonia MTB en LJ

Colonia MTB en LJ

Niacina

+ -

Reducción de Nitratos

+ -+

Cat 68°CPirazinamidasa

Pruebas bioquímicas

Métodos para Detección Rápida de M. tuberculosis a partir de la MuestraAmplificación de ácidos

nucleícos Sistemas capaces de detectar

pequeñas cantidades de materia genético (secuencias de DNA

PCR (IS6110) Secuenciación (gen 16S rRNA) Sondas. Genes de resistencia (rpoB, Kat

G) Roche: Amplicor® Mycobacterium

tuberculosis test The Gen-Probe Amplified

Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD®)

The BD ProbeTec (multiplex strand displacement system)

INNO-LIPA PCR “casera” Otros genes de resistencia: MBP64,

rpob, hsp65

PCR sensibilidad en muestras Bk +: 90–100% y en muestras Bk-: 60–70%

TRATAMIENTO FARMACOS ISONIAZIDARIMFAMPICINAPIRAZINAMIDAESTREPTOMICINAETHAMBUTOL

Pruebas de Sensibilidad

• Método de las proporciones– Directa– Indirecta

• MGIT 960• Bactec 460*• Alamar Azul • Nitrato Reductasa• Dx Molecular• Genes de resitencia:

– Rpob: Rifampicina– KG: Isoniazida

Método Proporciones directasMétodo Proporciones directas M. tuberculosis, M. tuberculosis, INH (R), RIF (R),INH (R), RIF (R), 8 D8 Díasías

ACD+PNB

ACD+INH ACD+RIF

ACD

Proporciones Indirecto

Micobacteriófagos

Micobacteriófagos (D29) s una metodología rápida que puede ser aplicada

directamente a la muestra, no requiere de

infraestructura especial y su costo es bajo. Además ha sido aplicado con éxito

en la detección de resistencia, especialmente la resistencia a rifampicina

Nuevas Pruebas para el Diagnóstico de Tuberculosis Activa

Las limitaciones de la microscopía y el lento crecimiento en los medios tradicionales para hacer diagnóstico de infección por M. tuberculosis, ha hecho que todas las herramientas nuevas están enfocadas en buscar un a metodología ideal:

La prueba ideal sería aquella que permitiera una identificación temprana del bacilo y el diagnóstico rápido de su sensibilidad especialmente la identificación de los aislamientos MDR

PRESENCIA DE BAAR Y PMN

Métodos para Aislamiento de Micobacterias Coloración para BAARColoración para BAAR::

Auramina Rodamina (AR)Auramina Rodamina (AR) KinyounKinyoun

CultivoCultivo:: Lowenstein-Jensen (LJ)Lowenstein-Jensen (LJ) Middlebrook 7H11 Middlebrook 7H11

(capa delgada: CD)(capa delgada: CD) Sistema MGIT: Sistema MGIT: PositivosPositivos::

Subcultivos a CDSubcultivos a CD Coloración para BAARColoración para BAAR

32°C - 37°C

MICOBACTERIAS ATIPICASMYCOBACTERIAS

ATIPICAS

CARACTERISTICAs•MORFOLOGIA COLONIAS

•PRODUCCION DE PIGMENTO•VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

CUADRO CLINICO•INFECCION PULMONAR•ADENITIS CERVICALES•INFECCIONES EN PIEL•INFECCIONES TEJIDOS

• BLANDOS

DIAGNOSTICO•CLINICO

•RADIOLOGICO•MICROBIOLOGICO

•MOLECULAR

PARAMETROS PARA CLASIFICACION

1. MORFOLOGIA DE COLONIAS2. PRODUCCION PIGMENTO FOTO Y ESCOTO

3. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

Grupos Establecidos

GRUPO I FotocromogenasGRUPO II EscotocromogenasGRUPO III No fotocromogenasGRUPO IV Crecedores rapidos Crecedores lentos.

Clasificación de Micobacterias según el riesgo de Clasificación de Micobacterias según el riesgo de infección en humanos*infección en humanos*Grupo Riesgo IGrupo Riesgo I M. gordonae M. tokaiense M. flavescens

M. smegmatis M. gastri, M. terrae M. mucogenicum M. chitae M. parafortuitum M. hassiacum M. triplex M. phlei M. hiberniae M. triviale M. obuense M. hodleri M. vaccae. M. confluentis. M. nonchromogenicum, M. porcinum ,M. cookii M. Interjectum M. branderi M. gilvum M. aurum M. madagascariense M. sphagni M. Moriokaense M. neoaurum . M.gadium

Grupo Riesgo IIGrupo Riesgo II M. celatum ,M. chelonae ,M. fortuitum ,M. avium, M. abscessus , M. xenopi, M. malmoense, M. intracellulare, M. haemophilum, M. kansasii M. paratuberculosis, M. genavenseM. marinum, M. ulcerans, M. peregrinum, M. scrofulaceum, M. szulgai

Grupo Riesgo IIIGrupo Riesgo III M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M leprae

•*Practical handbook for the phenotypic and genotypic identification of mycobacteria

Toma de MuestraMuestras recomendadas:

Biopsias En tubo tapa rosca y estéril (seco)

Material obtenido por punción Tubo tapa rosca y estéril

Muestras No recomendadasAplicadores de algodón

RecomendacionesConfirmar diagnóstico de infección por

MNT siempre con cultivos, con la identificación de la especie

Correlacionar los resultados del laboratorio con otros hallazgos (epidemiología, clínica, histopatología)

Realizar pruebas de sensibilidad Terapia con antibióticos específica +

drenaje y/o resección

ClasificaciónFenotípica: Fenotípica:

Tiempo de crecimientoCaracterísticas morfológicas

Producción de pigmento Morfología de colonia

Reacciones bioquímicas HPLC (perfil de ácidos micólicos)HPLC (perfil de ácidos micólicos)

Genotípica:Genotípica:Detección de regiones altamente conservadas dentro del

genomaDeleciones, inserciones que son especie específicas

Clasificación por secuenciación del gen 16S rRNA PCR del gen hsp 65 con Enzimas de restricción (PRAPRA)

Lesiones

Toma de Muestras

Microcolonias NT

Identificación Fenotípica

Mic

roco

lon

ias

M.fortuitum M.chelonae

M.tuberculosis

M.aviumM.tuberculosis

Cromatografía Líquida de Alta PresiónHPLC

HPLC analiza la composición de los

ácidos micólicos de la pared de la

micobacteria, cada especie tiene un perfil específico de ácidos

micólicos. Es un método con alta sensibilidad y

especificidad. Su limitación los altos costos del equipo y personal altamente

especializado.

Identificación inicial

Tiempo de crecimiento

No cromógeno: No produce pigmento

Fotocromógeno:Produce pigmento en presencia de luz

>7 días: LENTO< 7 días: RÁPIDO

Escotocromógeno:Produce pigmento en luz y oscuridad

Identificación FenotípicaArylsulfatasa

Positiva Negativa

R. Nitratos

Positivos Negativos

NaCl

Positivo Negativo

Manitol

Positivo negativo

M. peregrinum M. fortutitum

Positivo

M. chelonae

M. abscessus

Cto. 45°C

Positivo Negativo

M. smegmatis M. chitae

Cto. 32°C

Crecedores Rápidos-No pigmentados

Identificación FenotípicaNitratr Reduction

Positive Negative

UreaseGrow NaCl

Negative

M. gordonae

Positive

M. scrofulaceum

Grow 45°Cpositive

M. xenopi

Negative

Positive

M. flavescens*

M. szulgai

Crecedor Lento - Escotocromógeno

Identificación FenotípicaNitrate Reduction

Positive Negative

Urease

Positive Negative

M. asiaticumTween H

Positive Negative

M. marinum M. simiae

Tellurite R

Positive Negative

M. Szulgai* M. kansasii

Crecedor Lento - Fotocromógeno

Identificación Fenotípica

Cultivos Rápidos en Medio Líquido

Estos sistemas miden cambios en la presión de gases como la producción de dioxido de carbono, el consumo de oxigeno.

Hacen un monitoreo continuo del cultivoMultiples estudios han mostrado las ventajas de estos

sistemas en el aumento en el porcentaje de recuperación La disminución en el tiempo de crecimiento Disminución de el % de contaminación.

Septi-Chek MGIT 960 (Tubo Indicador de Crecimiento de Micobacterias) MGIT manual Bactec 460 * BACTEC 9000MB. MB/BacT

Métodos para Realizar Diagnóstico de Infección por MicobacteriasColoración para BAAR: (Se:45-70%)

ZN Kinyoun Auramina-Rodamina

Cultivos: Medios a base de huevo (LJ- OK) Medios con fórmula definida:

(Middlebrook: 7H9-7H10-7H11-7H12*)Sistemas automatizados

Bactec 460*- MGIT (Becton Dikison) Hemocultivos

HPLCMoleculares

Sondas PCR

GRACIAS POR SU ATENCION.