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7/31/2019 Diagnóstico de enfermedades virales
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Por favor,No bebas alcohol si vas a conducir.
Todavía no estás listo para verme.
Dios
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Diagnóstico de enfermedadesvirales
difícil pero posible...
Dr. Nestor Stanchi
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Diagnóstico en el laboratorio
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Examen microscópico de células(citología) Ventajas
Rápida Simple
Barata
Desventajas Poco sensible (38%) Poco específica
Serología Ventajas
Sensible Específica
Desventajas Requiere técnicas
estandarizadas Generalmente
muestras pareadas
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Búsqueda de antígenos virales
Ventajas Rápida Simple Barata Específica
Desventajas Reactivos
estandarizados Controles adecuados Relativamente poco
sensible (55%)
Biología molecular Ventajas
Rápida Específica
Alta sensibilidad
Desventajas Costosa Controles adecuados
Laboratoriosespecializados
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Ventajas
Sensible (82%) Específica Cubre amplio espectro
viral
Desventajas
Puesta a punto Experiencia técnica Relativamente lenta Requiere procedimiento
adicionales deidentificación
Potencialmente peligroso Algunos virus no cultivan Algunos virus no producen
efecto citopatogénicos
Aislamiento o cultivo
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¿Por qué cultivar los virus?
Diagnóstico Epidemiología (Estado) Contempla gran cantidad de virus En insuficiente diagnóstico clínico Presentaciones atípicas Infecciones concomitantes
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Cultivo viral
Animal de laboratorio Embrión de pollo Cultivo de órganos Cultivo de células
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Especies de animales usados
Los más usados Ratón lactante Rata Cobayo
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Animales de laboratorio
Ventajas Cubren amplio
espectro viral
Desventajas Caros
Producen sus propiosanticuerpos
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Tipos de animales de laboratorio
Tipos Comunes Convencionales Gnotobiotes SPF (Specific Patogen Free)
GPF (Germen Free Animals)
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Embrión de pollo
Ventajas Barato Produce gran cantidad
de viriones
Desventajas Dificultad de conseguir
huevos deestablecimientos SPF
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Cultivo de células Ventajas
No tan caro Desventajas
Personal altamenteentrenado
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Laboratorio de cultivo de células
Niveles de seguridad Edilicios
Zona limpia y sucia Cabinas
Materiales Termo de nitrógeno Freezer –70ºC Estufa CO2
Centrífuga refrigerada Microscopia de
fluorescencia
Personal Bioseguridad
Técnicos formados Limpieza de material
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Células
Explante Cultivo primario
Cultivo secundario Líneas celulares
Células transformadas Células infectadas con retrovirus
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Medios de cultivo
Medio de crecimiento Medio de mantenimiento
Complejidad Suero: Fetal Bovino (SFB) Agua tridestilada
Contaminación microbiana de los medios Virus Micoplasmas Bacterias
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Medio Esencial Mínimo Sales inorgánicas
CaCl2(anhidro) Fe(NO3)3.9H2O
KCl
KNO3
MgSO4
NaCl NaHCO3
NaH2PO4
Otros componentes
D-Glucosa
Rojo fenol HEPES-Buffer
Pyruvato sodio
L-phenilalanina
L-serina
L-treonina L-triptofano
L-tirosina
L-valina
Vitaminas
D-Ca pantotenato
Colina
Ac.fólico
Aminoácidos
L-Arginina HCl
L-Cistina
L-glutamina Glicina
L-histidina HCl i-inositol Nicotinamida Pyridoxal Riboflavina Thiamina-HCl L-isoleucina L-leucina L-lisina L-methionina
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Cultivo primario
Órgano de animal sano Extracción aséptica Troceado con tijera
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Recuento celular conAzul tripán (tiñe las
células muertas)
Resuspender delmedio de cultivo
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Cultivo secundario
A partir del primer segundo repique se considerasecundario.
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Línea celular
MK Monkey kidney HAm Human Amnion
HEF Human Embrion Fibroblast Hep2 Human epitelial HeLa Human Carcinoma Derived
RK13 Rabbit Kidney Vero Monkey RD Human
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Cultivo celular
En monocapa Generalmente para diagnóstico
En suspensión Generalmente para producción de vacunas
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El cultivo propiamente dicho
Ante sospecha viral TOMAR LAMUESTRA En etapa aguda Hisopos apropiados Medio de transporte para virus
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Muestras
Biopsias Líquidos de punción LCR Lavado de fauces Orina Esputo Sangre (con heparina)
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Conservación de la muestra
Heladera 4 ºC por 24-48 h Freezer –20 ºC por 48 h Freezer –70 ºC 3 por meses N2 líquido (-196 ºC) años
Y como siempre enviar el material conPROTOCOLO
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Efectos de la acción del virus
Tiempo del efecto Manifestaciones de
pH ECP
Citólisis Alargamiento Cambio de
refringencia Picnosis
Pérdida de unión entrelas células
Levantamiento de lamonocapa Formación de sincicios Redondeamiento
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Células BHK (fibroblastos)
Recién sembradas En desarrollo
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Efecto Citopático(CPE) de células
Vero causedas porinfección viral
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Sincicios Virus de la rubéola
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Efecto citopático Células HeLa
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Coronavirus infectando células VERO
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Cuerpo de inclusión
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Métodos complementarios
Neutralización (referencia) Cuerpos de inclusión
Hemadsorción Inhibición de la hemadsorción Interferencia viral Inmunofluorescencia
Ag. Ultratempranos Ag. Tempranos Ag. tardíos
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Hemadsorciónde células rojas
de mono
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Cuerpo de inclusión