DIAGNÓSTICO DE HPN Rol de la

Citometría de flujo

• Detección y Cuantificación de células con deficiencia de GPI. • Subclasificación de tipo de celulares

Dra . Nora Silvia Halperin

-Laboratorio de Citometría de Flujo-

División hematología

Hospital de Clínicas José de San Martín

GRCF

¿Cuál es el rol de la Citometría de flujo en el

diagnóstico de anemia?

Diferenciar diferentes patologías como

Desorden linfoproliferativo

Mieloma múltiple

Mielodisplasia

HPN

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¿Qué es la Hemoglobinuria paroxística nocturna? (Sindrome de Marchiafava-Michelli)

Hemopatía adquirida poco frecuente

Consecuencia de una expansión clonal, no maligna, de células progenitoras hematopoyéticas que han adquirido una mutación somática en el gen PIG-A (brazo corto del cromosoma X)

Este gen codifica una enzima que cataliza el primer paso en la biosíntesis del grupo de anclaje glycosylphosphatidylinositol

Condicionando la carencia total o parcial de la expresión de proteínas ancladas por GPI

Incidencia de 0,05-0,13 casos por 100.000 habitantes/año.

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Indicaciones de búsqueda de clon(es) HPN por citometría de flujo 1. Hemólisis intravascular evidenciada por Hemoglobinuria Hemosiderinuria

2. Hemólisis no explicada + 1 de los siguientes Ferropenia Dolor abdominal o espasmos esofágicos Trombosis Neutropenia o trombocitopenia Daño renal crónico sin causa evidente

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3. Anemia hemolítica adquirida Coombs negativa sin anormalidades morfológicas celulares (ejemplo: esquistocitos) y no infecciosa

4. Trombosis con ≥ 1 de los siguientes: Localizaciones venosas atípicas: esplácnica, cerebral o dérmica Con signos de hemólisis Con citopenias no explicadas

5. Anemia aplásica, mielodisplasia de bajo grado, otras citopenias de causa no aclarada (ensayos de alta sensibilidad para clones muy pequeños).

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El anticoagulante de elección es el EDTA, pero puede

utilizarse heparina o citrato.

Debe conservarse a temperatura ambiente y remitirla al laboratorio dentro de las 24 hs.

En caso de no poder procesarse en ese lapso de

tiempo, se debe agregar el estabilizante TransfixTM que conserva la muestra estable por 7 días.

Indicaciones para la obtención, preservación y transporte de la muestra

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¿Qué tipos de HPN existen?

HPN clásica (clon en G. cercano al 50%) Con evidencia clínica de Hemólisis intravascular o trombosis sin

evidencias de fracaso medular. Clonas de HPN grandes, con MO normal o con hiperplasia roja.

HPN en el contexto de otra patología hematológica (clon en G.<30%)

Datos claros de hemólisis y otra patología medular asociada (anemia aplásica, SMD o mielofibrosis primaria (la presencia del clon indica mejor respuesta al tto.inmunosupresor)

HPN subclínica (clon en G. <1%) Sin datos de hemólisis. Se asocia a aplasia medular.

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¿Cuál es el rol de la Citometría de flujo en el

diagnóstico de HPN?

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Es el método de elección

Sirve para la detección y cuantificación de

células con deficiencia de GPI.

Subclasificación del tipo celular

¿Qué tipos de células HPN existen?

1. HPN I----EXPRESIÓN NORMAL*

2. HPN II---EXPRESIÓN PARCIAL*

3. HPN III---SIN EXPRESIÓN*

* De moléculas ancladas a la membrana por GPI

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¿Cuáles son las proteínas asociadas a GPI?

Enzimas

Acetilcolinesterasa: hematíes

CD73: subpoblaciones de linfocitos B y T

CD157: monocitos y neutrófilos

Fosfatasa alcalina del neutrófilo: neutrófilos

ADP-ribosiltransferasa: subpoblaciones de linfocitos T y neutrófilos

Moléculas de adherencia celular

CD48: linfocitos

CD58: todas las células hematopoyéticas

CD66b y CD66c: neutrófilos

Proteínas de superficie reguladoras de la actividad del complemento

CD55: todas las células hematopoyéticas

CD59: todas las células hematopoyéticas

Receptores

CD16: neutrófilos y células dendríticas relacionadas con monocito; en

forma transmembranaria se expresa en linfocitos citolíticos

CD14: monocitos y macrófagos

CD87: monocitos y granulocitos

CD90: célula madre y subpoblaciones de linfocitos T

Sistemas de antígenos sanguíneos eritrocitarios

Cromer: hematíes

Cartwright/Yt: hematíes

John Milton Hagen: hematíes

Dombrock: hematíes

Holley-Gregory: hematíes

Antígenos del neutrófilo

Otras

CD24: linfocitos B, neutrófilos

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¿ Cuales son las células diana más informativas y en qué muestra debo

investigar?

SI-----------------------------GRANULOCITOS Y MONOCITOS NO----------------------------LINFOCITOS (vida 1/2 larga, Variable expresión de las proteínas unidas por GPI) NO----------------------------GR (transfusiones, hemólisis Intravascular previo al test). NO---------------------------MO (formas mieloides inmaduras)* SI----------------------------SP (cuidado en MDS)

*Si con marcadores de madurez como IREM para monocitos

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Anticuerpos utilizados en glóbulos blancos

Marcador Granulocitos Monocitos

CD14 NA ++

CD16 ++ NA

CD24 ++ NA

CD66b + NA

FLAER* ++ ++

* DERIVADO FLUORESCENTE DE LA TOXINA BACTERIANA AEROLISINA MODIFICADA, CAPAZ DE UNIRSE AL GPI EN LEUCOCITOS , NO EN HEMATÍES (sensib.: 0.5%)

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FLAER

No se lo utiliza el GR porque se une a uniones inespecíficas

Antígenos utilizados (recomendados) en G.R.

Recomendación Guidelines for the Diagnosis and Monitoring of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria

and Related Disorders by Flow Cytometry- Borowitz et al. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B:211–230 (2010)

Proteínas reguladoras del complemento

CD59 puede estar conjugado con FITC (altamente expresado) , clon MEM-43

Permite distinguir diferentes tipos de células HPN

(MIRL : inhibidor de la lisis reactiva de la membrana)

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Protocolo de marcación 3 fluorescencias (1 láser) FacsCan

Glóbulos rojos 1. Glicoforina A PE/ CD59 FITC (MEM-43) Lavar 2 veces para sacar uniones no específicas!!!!

Glóbulos blancos 1. CD45PCP/CD14 PE/CD64FITC 2. CD15PC5/CD16PE/CD45FITC 3. CD45PCP/CD24PE/CD66b FITC

Marcaje multiparamétrico*: comparación de dos tecnologías

*Sensibilidad de 0.1% con marcaje múltiple (mínimo 3 Ac.)

Protocolo de marcación con 7 fluorocromos (3laser) FacsCANTO II

Glóbulos rojos Glicoforina A FITC- CD59PE- CD45 PerCP

Glóbulos blancos FLAER-Alexa fluor 488 * CD24PE * CD45PerCP * CD16PE-Cy7 * CD33 APC * CD14 APC-H7 * HLA-DRV450

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Búsqueda de células HPN en glóbulos blancos

Lavo 2 veces la SP

Marco

liso

Adquisición de la muestra

Incubar 20’ en oscuridad

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Búsqueda de células HPN en glóbulos rojos

60 ul de G.R. al 0.75% (3 ul de SP en 400ul en PBS)

Acs. Monoclonales

Lavar 2 veces!! con PBS

Resuspendemos con PBS

Incubar 20’ en oscuridad

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Adquisición de la muestra 10000 eventos para 1% de cél HPN

¿Cuántas células debo adquirir?

Para una sensibilidad de 0,1%:

Adquiero 250.000 cél de interés (por ejemplo: granulocitos), requiriendo 25 eventos para identificar una población

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Detección de CD14 en monocitos, estrategia de gating

Tubo CD45/CD14/CD64

HPN I

HPN II

HPN III

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FACScan – Cell-quest- Paint-a gate SELECCIÓN DE GRANULOCITOS Y BÚSQUEDA DE EXPRESIÓN DE CD66b, CD16 Y CD24

TUBOS: CD45/CD24/CD66b y CD15/CD16/CD45

HPN I

HPN II

HPN III

EOSINÓFILOS

FACScan – Cell-quest- Paint-a gate EXPRESIÓN DE CD59 EN GLÓBULOS ROJOS (ADQUISICIÓN EN ESCALA LOGARÍTMICA)

HPN III HPN II

HPN I

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HPN III HPN II

HPN I

Caso 2 : paciente con anemia aplásica, con altos requerimientos transfusionales, metrorragias por mioma uterino

monocitos

granulocitos

0,42%

22,23%

Caso 2: glóbulos rojos

Control negativo Control positivo ????

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Tipo Celular DEFICIENCIA RESULTADOS

ERITROCITOS

Tipo II (deficiencia parcial de CD59 ) 0,04%

Tipo III (deficiencia total de CD59 ) 0,36%

Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 0,40%

MONOCITOS

Tipo II (deficiencia parcial de CD14) 1,21%

Tipo III (deficiencia total de CD14) 25,00%

Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 26,21%

NEUTROFILOS

Tipo II(deficiencia parcial de CD16/CD24/CD66b) 0,42%

Tipo III (deficiencia total de CD16/CD24/CD66b ) 22,23%

Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 22,65%

. Conclusiones: Se observa un clon de HPN entre los eritrocitos (0,40%), monocitos (26,21%) y granulocitos neutrófilos (22,65%). Estos hallazgos son compatibles con un diagnóstico de hemoglobinuria paroxística nocturna. La variación del tamaño del clon entre las diferentes poblaciones puede deberse a la baja viabilidad de la muestra y/o hemólisis y/o reciente transfusión. Se sugiere correlacionar estos resultados con el resto de los datos clínicos y de laboratorio para arribar a un diagnóstico definitivo. Se recomienda tener en cuenta la vida media de los glóbulos rojos si el paciente hubiera recibido una transfusión.

Los glóbulos blancos fueron marcados con anticuerpos monoclonales dirigidos contra las moléculas CD14, CD16, CD66b y CD24 (estos antígenos están anclados a la superficie celular por medio de las moléculas GPI) para evaluar el tamaño del clon y lisada con una solución de FACS Lysing

con el fin de eliminar sus glóbulos rojos. Otra parte de la muestra fue marcada con la molécula CD59 para evaluar su expresión en glóbulos rojos y calificar los diferentes tipos de

células HPN. Se comparó el patrón de marcación con el de una sangre periférica normal.

INFORME: ¿Qué debe constar en el informe?

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Caso 3: paciente con leucopenia, anemia, con tratamiento inmunosupresor

monocitos

granulocitos

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Caso 3: glóbulos rojos

Control negativo Control positivo ??????

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• Los glóbulos blancos fueron marcados con anticuerpos monoclonales dirigidos contra las moléculas CD14, CD16, CD66b y CD24 (estos antígenos están anclados a la superficie celular por medio de las moléculas GPI) para evaluar el tamaño del clon y lisada con una solución de FACS Lysing con el fin de eliminar sus glóbulos rojos..

• Otra parte de la muestra fue marcada con la molécula CD59 para evaluar su expresión en glóbulos rojos y calificar los diferentes tipos de células HPN.

• Se comparó el patrón de marcación con el de una sangre periférica normal.

Tipo Celular DEFICIENCIA RESULTADOS

ERITROCITOS

Tipo II (deficiencia parcial de CD59 ) 4%

Tipo III (deficiencia total de CD59 ) 57%

Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 61%

MONOCITOS

Tipo II (deficiencia parcial de CD14) 4%

Tipo III (deficiencia total de CD14) 94%

Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 98%

NEUTROFILOS

Tipo II(deficiencia parcial de CD16/CD24/CD66b) 3%

Tipo III (deficiencia total de CD16/CD24/CD66b ) 78%

Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 81%

. Conclusiones:

Se observa un clon de HPN entre los eritrocitos (61%), monocitos (98%) y granulocitos neutrófilos (81%).

Estos hallazgos son compatibles con un diagnóstico de hemoglobinuria paroxística nocturna.

La variación del tamaño del clon entre las diferentes poblaciones puede deberse a la baja viabilidad de la muestra y/o hemólisis

y/o reciente transfusión.

Se sugiere correlacionar estos resultados con el resto de los datos clínicos y de laboratorio para arribar a un diagnóstico definitivo.

Se recomienda tener en cuenta la vida media de los glóbulos rojos si el paciente hubiera recibido una transfusión.

INFORME: ¿Qué debe constar en el informe?

SIN LAVAR

1 LAVADO

2 LAVADOS

EXPRESIÓN DE CD55 Y CD59 EN GLÓBULOS ROJOS DEL PACIENTE CON HPN

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CD55 CD59

Criterios diagnósticos

El diagnostico de HPN por citometría de flujo requiere

demostrar el déficit de expresión de 2 o más proteínas

asociadas a GPI en 2 o más líneas celulares

hemopoyéticas distintas (pueden ser 2 proteínas asociadas

a GPI o una proteína asociada a GPI + FLAER).

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Comparación entre CD55 y CD59, sensibilidad

No permite diferenciar HPN II de HPN III

Sin sensibilidad por debajo de 1-2%

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Se recomienda monitorear el tamaño del clon mediante citometría de flujo en: Pacientes con HPN tratados con Eculizumab: al inicio del tratamiento, a los 6 meses y posteriormente de forma anual.

Pacientes con HPN clásica sin tratamiento y HPN asociada (Anemia aplásica, MDS o subclínica) de forma anual.

Todos los casos en que se observen cambios en la clínica del paciente.

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Seguimiento de los clones HPN

MUCHAS GRACIAS !!!

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