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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC

Definición: Técnica que realiza la separación de

una mezcla de compuestos a través de la interacción selectiva entre los solutos, una fase estacionaria y una fase móvil, haciendo uso de instrumentación automatizada de alta eficiencia

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Definición:Técnica de separación que se lleva a cabo en una columna empacada con un soporte (gel de sílice o alúmina)

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNAFase estacionaria:

• Silica gel (polar)

• Carbonato de calcio

• Almidón

• Alúmina (polar)

Diámetro: 5 - 50 mm

Longitud:5 cm – 1 m

Tamaño40 - 63 μm.63 – 200 μm.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNAFase móvil: Solventes utilizados en cromatografía en capa fina funcionan adecuadamente.

Serie eluotrópica

PentanoÉter de petróleoHexanoCiclohexanoTetracloruro de carbonoToluenoXilenoBencenoCloroformoAcetonaAcetato de etiloAcetonitriloIso-propanolMetanolAgua Rubinson & Rubison Química Analítica Contemporánea

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Mecanismo de separación:

K = CS/CM

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNATipos de cromatografía en columna:

Intercambio Iónico

Exclusión Molecular

Afinidad

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Cromatografía en columnaDesventajas de la cromatografía

en columna

Diámetro: 5 - 50 mmLongitud: 5 cm – 1 mTamaño de partícula: 40 – 200 μmGrandes volúmenes de fase móvilTiempos de análisis largosGran tamaño de muestra La identificación y cuantificación por algún método no acoplado

Antecedentes históricos 1952 Premio Nobel de Química par Martin y Synge por el

desarrollo de cromatografía líquido-líquido 1959 Primer trabajo de exclusión molecular aplicado a

biopolímeros polímeros por Flodin y Porath 1960 Separación de solutos iónicos . Ionizables y neutros 1970 La técnica de HPLC se difunde ampliamente, la

instrumentación se mejora 1970-1980 Uso de modificadores de fase móvil para mejorar la

eficiencia 1990 Se mejora la tecnología de fase reversa

1951 Martin y Synge: Sugieren que altas presiones de fase móvil y tamaño reducido de partículas puede mejorar notablemente la eficiencia en la cromatografía en columna.

Instrumentación: Reservorio de fase móvil

Reservorios de fase móvil

Recipiente de vidrio

Filtro

Fase Móvil:Libre de partículasFiltrar en membranas de 0.45 12μmLibre de aire

Tubo de Teflón 1/8’’

Instrumentación: Sistema de bombea

Sistema de bombeo de fase móvil

Es el sistema mediante el cual la fase móvil se introduce através de la columna

Características:Resistente a los solventesAmplio intervalo de flujosFacilidad de cambiar un solvente por otroDe fácil manejo y mantenimiento

Sistema de bombeo de fase móvil

Sistema de bombeo a presión constante Bomba Neumática

Sistema de bombeo a flujo constante

Bomba tipo jeringa

Bomba reciproca

Bomba neumática

10 bar

Bomba tipo jeringa

Volumen de la cámara: 200 – 500 cm3

Bomba reciproca

Instrumentación: Puerto de inyección

Válvula Rheodyne

Características de la muestra

Libre de partículasFiltrar en membranas de 0.45 μm

Diagrama de flujo válvula Rheodyne

Loop de 10 -50 μl

Diagrama de flujo válvula Rheodyne

Instrumentación: Columna

Acero ( Cr-Ni-Mo)Relativamente inerte a la corrosión químicaLongitud: 10, 12.5 o 15 cmDiámetro: 4.6, 6.2 o 9 mmSoporte: 10, 5, 4 o 3 μm

Instrumentación: Soporte

Silica microporosa

Permeable a solventes (fase estacionaria)Diámetros : 3 - 10 μmÁrea superficial: 500 m2/g

Fases estacionaria enlazada covalentemente a la silica

Instrumentación: Fase estacionaria

Fase polar Fase no polar

R= (CH2)3NH2 Amino R= (CH2)17CH3 Octadecilo

R= (CH2)3C=N Ciano R= (CH2)7CH3 Octilo

R= (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH

Diol R= (CH2)3C6H5 Fenilo

Modo de separación

Fase Normal Fase Reversa

Polaridad fase estacionaria

Alta Baja

Polaridad fase móvil

Baja- media Media- alta

Típica fase móvil Heptano/CHCl3 CH3OH/H2O

Orden de elusión 1º Menos polar 1º Mas polar

Fase reversa

• Separación de mezclas con polaridades diversas

• Rápido equilibrio de la columna con la fase móvil

• Fácil, rápido y reproducible

• Picos menos coleados • Se estabiliza

rápidamente a cambios de fase móvil

• Reproducible

Fase normalVentajas

Fase móvil

Modalidades de separación

Isocrático Gradiente por etapas

Curvas de gradiente

Modalidades de separación

Isocrático

Gradiente

Elución de picos mas rápido, ahorro de tiempo de análisis, mayor productividad

Efecto de la temperatura

Efecto del tipo de fase estacionaria

Efecto del flujo de fase móvil

Efecto del pH

Efecto del fase móvil

Detectores

Tipo Respuesta

Rango lineal Detecta

UV/VisArreglo de diodos

Selectivo 10-4 -10-5Enlaces C-O, aromáticos, alquenos

Florescencia Selectivo 10-3 – 10-4 Hidrocarburos policíclicos

Conductividad

Selectivo 10-3 – 10-4 NO3-, NO2

-, SO42-, Cl-

Índice de refracción Universal 10-3 – 10-4

Ácidos orgánicos, azúcares

Aniones

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