PRACTICA CROMATOGRAFIA EN GELY CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNASJ.A. REIG

Para saber lo que tengo debo l ifiseparar las partes y cuantificar

1 de 20€2 de 10€1 moneda de 1 €10 monedas 0.20€4 monedas 0.10€3 d d 0 023 monedas de 0.02€2 monedas de 0.01€

CROMATOGRAFIA Y ELECTROFORESIS: Técnicas de separación y resolución de una mezcla de moléculas paraTécnicas de separación y resolución de una mezcla de moléculas para aislar un componente o llevar a cabo un análisis.

PRACTICA DE BIOQUIMICA : CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL YPRACTICA DE BIOQUIMICA : CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL Y DETERMINACION DE PROTEINA EN PLASMA

Perfil cromatografico de un veneno

Fracción IV

CROMATOGRAFIA Diferente velocidad de desplazamiento de moléculas en una mezcla al ser arrastradas por una fase movil a través de un en una mezcla al ser arrastradas por una fase movil a través de un soporte sólido o estacionario… arrastre por presión, capilaridad etc.

Puntode aplicación

Fase estacionariaFase movileluyente

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

distancia migrada por moleculaRf= --------------------------------------

distancia migrada por frente

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA (SILICAGEL (SiO2) ( ( 2)ALUMINA (Al2O3)

CROMATOGRAFIA EN COLUMNAPRACTICA DE LABORATORIO

H2O

Bi G l P4BioGel P4

VASO PLASTICO CONELUYENTE (AGUA DESTILADA)

COLUMNACON GELCON GELEN SUSPENSION

PLACA POROSACANULA GOMA

PINZA DE ROSCAGRADILLACON TUBOSCON TUBOSMARCADOSSIN NUMERAR

TUBO EPPENDORFMUESTRA A SEPARAR

PIPETA PASTEUR

CROMATOGRAFIASEGÚN EL SOPORTE

INTERCAMBIO IONICOSepara por cargaIntercambio aniónicoIntercambio catiónico

AFINIDADAFINIDADSepara por afinidad en la unión con un dominio

FILTRACION EN GELSepara por tamaño

CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GELO DE EXCLUSION MOLECULARLAS MOLECULAS SE SEPARAN EN FUNCION DEL TAMAÑOLAS GRANDES FLUYEN MAS RAPIDAMENTE LAS PEQUEÑAS SE QUEDAN RETENIDASLAS GRANDES FLUYEN MAS RAPIDAMENTE, LAS PEQUEÑAS SE QUEDAN RETENIDASMAS TIEMPO EN EL GEL Y SALEN MAS TARDE DE LA COLUMNA, DISTINTA VELOCIDADDE MIGRACION

Azul dextrano+Vit B12

3ml

AZUL DEXTRANOVIT. B12

1 2 3 4 5 6…………………….

C antifica emosAZUL DEXTRANOPM=200.000VOLUMEN DE EXCLUSIÓN (V0) 6x3ml=18ml

PM=1355CuantificaremosX colorimetria

Aplicar la muestra

MUESTRAazul

1 quitar tapa 2 Vaciar con1.quitar tapa 2.Vaciar conPipeta pasteur 3. Aplicar muestra

y... quitar pinza!!Tuboeppendorf

eluyente

Dejar resbalar por lasparedes de la columna,sin bombardear el gel!sin bombardear el gel!

3mL

L t d b t l l

3mL

La muestra debe penetrar en el gelsin que se seque el gel!!añadiremos un poco (2 dedos)de eluyente, para evitar distorsiones y conectamos la cánula al erlenmeyeren la leja superior con la fase movil.

AZULDEXTRANO VIT. B12

Ley de Lambert-Beer

Relación exponencial Relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y su concentración

Absorbancia 1A=log Io/I A=1 lg Io/I =1 Io/I=10 inciden 100 y salen 10

V0 Ve

bso ba c a og o/ g o/ o/ 0 c de 00 y sa e 0Se absorbe un 90% de luz. Si la absorbancia es 2 Io/I=100 se absorbe un 99%Cuanto mayor absorbancia mayor concentración MAS LUZ SE ABSORBE,MENOS SALElog Io/I

VeVo

Gel P4 RANGO EXCLUSIONGel P4 RANGO EXCLUSION800-4000

VitB12

D=1,7cmr=0,85cm

AD

VitB12

AD=200.000 excluidoVit B12=1355 parcialmente incluida

Vt= πr2xhVt (cc = ml)

Vo volumen exterior de la columna recorrido por moléculas no incluídas (marcador= azul dextrano)Ve volumen al que sale la vit. B12

Se puede normalizar para cada columna el comportamiento cromatografico en función delos paramentros de cada columna.

Ve-VoKd=Kd= ---------

Vt-Vo

DETERMINACION DE CONCENTRACION PROTEICAMEDIANTE REACCION CON BIURET2ª parte de la práctica

REACTIVO DE BIURET:Cu(SO4) y NaOH

PROHIBIDAS LAS SIESTAS

DETERMINACION DE LA CANTIDAD DE PROTEINA EN UNA MUESTRA DE SUERO

REACTIVOBIURET (azul)

1 2 3 4 5 6 M

SOLUCIONESTÁNDAR ALBUMINA 10mg/ml

Reactivo 1

M t ALBUMINA 10mg/mlAbs Muestrasuero

Y=mX+b Y=mXMAbs

mg proteinax0 1 3 5 8 10

0.15abs

0.12

0.05

0.1

8,5mg/0.1ml

0 1 3 5 8 10 mg Proteina

8,5mg/0.1ml

g

0 15

0.05

0.1

0.15

ajustar una recta

1 3 5 8 100100L=0.1mL

PIPETAS DE VIDRIO Y PIPETEADORES

INDIVIDUAL!! NOMBRES Y APELLIDOS (CON MAYUSCULAS)Tubo/Abs

1-02-0,03

P4/800-4000 Φ=1,7 cm

2 0,033-0,014-0,065-0,76-0,237 0 40

Cromatografia en gel que separa por….P4/800-40007-0,40

-----etc

Vo VeA0.50

Abs

1 2 3 4 5 6......

0.25Tubo nº/ml 3 mLTubo/abs

1(0mg)/02(1mg)/0,05

0 2Abs

3 l/ i

( g)/0,05……6(10mg/0,28

0.050.10.150.2

X=7,7mg/0.1ml

A=0.12

LOS CUESTIONARIOS

=3ml/xminManual=77Ordenador=72,7

x1001 3 5 8 10

LOS CUESTIONARIOSSE ENTREGAN AL FINALIZAR!

mg PROTEÍNA 77mg/mL

OTRAS CROMATOGRAFIASCROMATOGRAFIA DE GASES

Identificacion en base a standars

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION (HPLC)

Adsorventes de distinta hidrofobicidad sonempaquetados en columnas

sac

¿?Si

¿?

F2-

F1+ sac

ELECTROFORESIS:MIGRACION DIFERENCIAL DE MOLECULAS EN EL SENO DE UN CAMPO ELECTRICOMIGRACION DIFERENCIAL DE MOLECULAS EN EL SENO DE UN CAMPO ELECTRICOSOBRE UN SOPORTE DETERMINADO.PAPELAGAROSAPOLIACRILAMIDAPOLIACRILAMIDA

MOVILIDAD DEPENDE DE CARGA Y TAMAÑO

-

+pI

ELECTROFORESIS EN AGAROSAACIDOS NUCLEICOS

ELECTROFORESIS DE SDS-POLIACRILAMIDAPROTEINASPROTEINAS

REVELADO CON COLORANTES:AZUL DE COOMASSIE

MUCHO CUIDADO EN EL UC O CU OLABORATORIO...!

No olvideis la bata de laboratorioNo olvideis los guiones de prácticasNo olvideis los guiones de prácticasNo olvideis traer firmado la hoja de conocimiento de normativaNo olvideis una calculadora, un lapiz y una goma....