Reacciones Antígeno-Anticuerpoy sus Aplicaciones Diagnósticas

Prof. Edwin Escobaredscobar@gmail.com

Universidad Central de Venezuela

Facultad de Medicina

Escuela de Medicina “José María Vargas”

Cátedra de Inmunología

Tema 42018-2019

Contenido

• Características de la unión Ag/Ac

• Aplicaciones Diagnósticas

•Interacción No Covalente•Afinidad y Avidez•Flexibilidad de la Molécula de Ig

•Serología•Técnicas Serológicas de Unión Primaria

•ELISA, Radioinmunoensayo, Inmunofluorescencia

•Técnicas Serológicas de Unión Secundaria•Aglutinación, Inmunoprecipitación

•Otras Aplicaciones•Inmunohemólisis, Citometría de Flujo

Interacciones Ag/Ac

Unión No Covalente

Interacción Antígeno/Anticuerpo

AntígenoHemaglutinina del Virus de la Influenza

AnticuerpoRegión VL y Región VH

No Covalente / Reversible / Específica

Scientific American 1993; 269(3):22

Inmunología de Kuby

Interacción Antígeno/Anticuerpo•Enlaces No Covalentes

•Muchas Interacciones Débiles = Unión Fuerte•Grupos Moleculares en Posiciones Precisas

•Puentes de Hidrógeno•Enlaces Iónicos•Interacciones Hidrofóbicas•Fuerzas de van der Walls

Inmunología de Kuby

Interacciones Ag/Ac

Afinidad y Avidez

• Es una medida termodinámica de la fuerza de interacción entre un sitio de unión de un anticuerpo y un único epítopo

Interacción MonovalenteAfinidad

Interacción Ag/Ac

Afinidad del AnticuerpoDiálisis de Equilibrio

A) En Ausencia de Anticuerpo

Tiempo, h

50

100

A

B

B) En Presencia de Anticuerpo

Tiempo, h

50

100

B

A

D

Inmunología de Kuby

• Es una medida de la fuerza de interacción entre múltiples sitios de unión de una molécula de anticuerpo y múltiples epítopos repetitivos en un antígeno polivalente

Interacción PolivalenteAvidez

Interacción Ag/Ac

IgMHasta 10 sitios de Unión

107

1011

Avidez

Anticuerpos

Afinidad y Avidez

Constante de

Equilibrio

IgGUnión

Monovalente

104

Afinidad

Aumento

de la

Energía de Unión

103

IgGUnión Bivalente

107

Avidez

Avidez = Afinidad Funcional

Interacciones Ag/Ac

Flexibilidad de la Ig

FV

Fb

CH2

CH3

Bisagra

Codo

EB’SF

AF

0°- 50°0°- 180°

0°- 180°

AF: Flexibilidad Axial (Rotación)

SF: Flexión Segmental

EB’: Flexión del Codo (180° - EB)

SF

AF

EB’

0°- 180°

0°- 180°

0°- 50°

FV

Codo

Fb

Bisagra

CH2

CH3

Fab

Fc

Modificado de: Fundamental Immunology-W.Paul-6th.edition-2008

Flexibilidad de la Molécula de Ig

Fv: VL + VH

Fb: CL + CH1

Fundamental Immunology-W.Paul-6th.edition-2008

Flexibilidad de la Molécula de Ig

http://uhaweb.hartford.edu/bugl/immune.htm

Flexibilidad de la Molécula de Ig

Cambio conformacionalal unirse el antígeno y el anticuerpo

AntígenoProteasa del VIH-1

Anticuerpo•Antes de unirse al Ag•Luego de unirse al Ag

CDRCadena Pesada

H1, H2, H3

Cadena LivianaL1, L2, L3

Inmunología de Kuby

Interacciones Ag/Ac

Reactividad Cruzada

Reacciones Cruzadas• Si dos antígenos diferentes comparten un

epítopo idéntico o muy similar, los anticuerpos específicos contra uno de los antígenos podría reaccionar en forma cruzada con el otro antígeno, aunque generalmente con menor afinidad.

elprofedebiolo.blogspot.com

losgrupossanguineos.blogspot.com

Pared Celular de BacteriasMembrana de Eritrocitos

Grupos Sanguíneos “ABO”Polisacáridos

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Serología

Suero• Suero: es el líquido residual de la sangre,

después que la sangre o el plasma se han coagulado. En el Suero se encuentran los anticuerpos

SueroCoágulo

http://www.centro-medico-aleman.com/terapiaprp.php?lang=CAS

https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/esp_imagepages/10026.htm

Sangre

Total

Antisuero• Antisuero: es una muestra de Suero que tiene

anticuerpos detectables específicos para un antígeno en particular

AntisueroPoliclonal

Inmunización

Inmunología de Kuby

Serología• Serología: es el estudio, a partir de una

muestra de suero, de los anticuerpos y sus reacciones con los antígenos

http://poderinformar.com/dengue-ante-la-gran-demanda-de-casos-febriles-suspenden-estudios-de-serologia/

Ig M Ig G

Antígeno1er. Reto

Antígeno2do. Reto

RespuestaPrimaria

RespuestaSecundaria

Ig M

Ig G

Tiempo

Latencia

Respuesta Primaria y Secundaria

•Memoria•Cambio de Isotipo

•Maduración de la Afinidad(Hipermutación Somática)

Inmunología de Kuby

Respuesta Primaria y Secundaria

Toxoplasma gondii

http://www.diasorin.com/sites/default/files/allegati_prodotti/m0870004275_toxoplasma_igg_igm_torch_flyer_low.pdf

Respuesta Primaria y Secundaria

Toxoplasma gondii

http://www.diasorin.com/sites/default/files/allegati_prodotti/m0870004275_toxoplasma_igg_igm_torch_flyer_low.pdf

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Técnicas Serológicas de Unión Primaria y Secundaria

Técnicas Serológicas

• De Unión Primaria: mide directamente la cantidad de complejo Ag/Ac formado.Mayor sensibilidad (pg/mL), requiere sistema revelador

– ELISA (Reacción Colorimétrica – Enzima/Sustrato)

– Radioinmunoensayo (Isótopos Radioactivos)

– Inmunofluorescencia (Fluorocromos conjugados)

• De Unión Secundaria: mide la consecuencia o efecto de la unión Ag/Ac.

Menor sensibilidad (μg/mL), observación “directa”

– Aglutinación

– Inmunoprecipitación

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

ELISA

ELISAEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

• Permite medir la cantidad de complejo Ag/Ac formado, utilizando un reactivo detector conjugado a una enzima, que en presencia de un sustrato cromógeno resultará en una reacción colorimétrica.

• La intensidad de color será directamente proporcional a la cantidad de complejo Ag/Ac

ELISA Indirecto

•Detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente

•Aplicaciones:•Diagnóstico de Infección o exposición a microorganismos

•Detección de Autoanticuerpos

•Respuesta a Inmunizaciones/Vacunas

Fase de

Captura

Ag de VIH-1Proteínas

Recombinantes

Diagnóstico de Infección por VIH-1

Fase de

Detección

Anti-IgGConjugados a

Enzima

Lavado

Revelado

Reacción de ColorSustrato Cromógeno

Lavado

Marcador

Identificado

IgG anti-VIH-1Anticuerpos en

Suero del Paciente

Agregar

Inmunología de Kuby

ELISA Tipo Sándwich

•Detección de antígenos específicos en el suero del paciente

•Aplicaciones:•Detección de Ag microbianos

•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.

Fase de

Captura

Ac Anti-HBsAg

Determinación de Antígeno de Superficie del Virus de Hepatitis B

Fase de

Detección

Anti-HBsAgConjugados a

Enzima

Lavado

Revelado

Reacción de ColorSustrato Cromógeno

Lavado

Marcador

Identificado

HBsAgAntígeno en

Suero del Paciente

Agregar

Inmunología de Kuby

Anti-

h-CG

ELISA Competitivo

•El antígenos específico en el suero del paciente compite con el

antígeno unido a la fase sólida para unirse al anticuerpo. La intensidad de

color es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra

•Aplicaciones:•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.

Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG)

Fase de

Captura

h-CGProteínas

Recombinantes

IgG

Fase de

Detección

Anti-IgGConjugados a

Enzima

Lavado

Revelado

Reacción de ColorSustrato Cromógeno

Lavado

Marcador

Identificado

h-CGHormona en

Suero del Paciente

Agregar

Inmunología de Kuby

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Radioinmunoensayo - RIA

Radioinmunoensayo – RIARosalyn Yalow* y Solomon Berson

* Premio Nobel 1977

Clin Chim Acta 1968; 22(1):51-69.

El RIA explota la habilidad de hormonas no marcadas presentes en plasma u otras

soluciones, de competir por su unión al anticuerpo con hormanas marcadas

radioactivamente, inhibiendo su unión.

Radioinmunoensayo - RIA

•Unión competitiva de antígenos radiomarcados y antígenos no

marcados a anticuerpos de alta afinidad. Ag marcado a concentraciones

que saturan sitios de unón del Ac.

•Aplicaciones:•Detección de Hormonas, Proteínas séricas, Vitaminas, Ag Microbianos

Diagnóstico de Infección por Virus de Hepatitis B

Inmunología de Kuby

Anti-IgE

marcada (I125)

IgE Total

PRISTIgE Específico

RAST

Radioinmunoensayo - RIA

Anti-IgE

marcada (I125)

RAST: Radio Allergo Sorbent TestPRIST: Paper Radio Immuno Sorbent Test

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Inmunofluorescencia - IF

Estreptococos Anticuerpos Anti-estreptococo

Conjugados a Fluorocromo

Estreptococos“Fluorescentes”

Imagen microscópica de Estreptococos Marcados con

Anticuerpos + Fluocromo

IF DirectaIF Indirecta

CélulaCélula

Antígeno

Antícuerpo Primario

Antícuerpo Secundario

Fluorocromo

http://www.abcam.com/secondary-antibodies/direct-vs-indirect-immunofluorescence

La Inmunofluorescencia (IF) permite evaluar la presencia de antígenos

en células y tejidos; y la detección y titulación de anticuerpos

específicos, utilizando fluorocromos conjugados a anticuerpos

•Inmunofluorescencia Directa: un anticuerpo primario

específico conjugado con el fluorocromo se aplica directamente sobre la

muestra (tejido, célula, u otro) permitiendo identificar la estructura responsable

de la especificidad. Aplicaciones: identificar microorganismos y tipificar

células (por ejemplo: linfocitos T).

•Inmunofluorescencia Indirecta: un anticuerpos primario

no marcado se aplica directamente sobre el sustrato (tejido, célula, u otro) y se

visualiza la reactividad con un conjugado anti-inmunoglobulina-fluorocromo.

Aplicaciones: detección de autoanticuerpos.

Inmunofluorescencia

InmunofluorescenciaCultivos de Células Cerebrocorticales de Ratón

Identificación de Neuronas y Astrocitos

Cell Death and Differentiation 2007; 14:296–305

A

B

A. Neuronas marcadas con anticuerpos anti-MAP-2 (Microtubule Associated Protein-2) evidenciados por un

fluorocromo rojo (Alexa 647). El ADN nuclear se

marca con fluorescencia azul (Hoechst 33342)

B. Astrocitos marcados con anticuerpos anti-GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) evidenciados por un

fluorocromo verde (Alexa 488). El ADN nuclear se

marca con fluorescencia azul (Hoechst 33342)

Inmunofluorescencia

Anticuerpos Antinucleares – ANAPatrones Asociados a Enfermedades Autoinmunes

Diagnostic Pathology 2009, 4:1

http://www.diagnosticpathology.org/content/4/1/1

Patrón

Homogéneo(ADN-dc, Histonas)

•Lupus Eritematoso

Sistémico

•LES inducido por

Drogas

Patrón

Nucleolar

(PM-Scl, ARN Polimerasa I-III,

U3-RNP)

•Esclerosis Sistémica

•Polimiositis

Patrón

Punteado(ENA, RNP, Sm, SSA/Ro,

SSB/La, Scl-70)

•Lupus Eritematoso

Sistémico

•Enfermedad Mixta del

Tejido Conectivo

•Esclerosis Sistémica

•Sindrome de Sjogren

•Polimiositis

Patrón

Periférico(RNP, Sm, SSA/Ro)

•Lupus Eritematoso

Sistémico

•Esclerosis Sistémica

http://asc.dental.ufl.edu/ReferenceSera.html

Anticuerpos AntinuclearesDiferentes Patrones de Fluorescencia

Línea de Células Epiteliales Humanas Hep2

D

Patrón Nucleolar

Ag Asoc.Fibrilarina (U3-RNP)

Enf. Asoc.SSc

Patrón Homogéneo

A

Ag Asoc.dsDNA

Nucleosomas

Histonas

Enf. Asoc.SLE

Lupus Inducido por Drogas

Artritis Idiopática Juvenil

B

Patrón Granular Fino

Enf. Asoc.SjS, SLE,

Dermatomiositis

Ag Asoc.SS-A/Ro, SS-B/La,

Mi-2, TIF1γ, TIF1β,

Ku

C

Patrón Granular Grueso

Enf. Asoc.MCTD,SLE,

SSc

Ag Asoc.hnRNP, U1RNP, Sm,

ARN Polimerasa III

Ag Asoc.CENP-A/B(C)

Enf. Asoc.SSc limitada cutánea,

PBC

E

Patrón Centromérico

F

Patrón PCNA

Ag Asoc.PCNA

Enf. Asoc.SLE,

otras condiciones

http://www.chemgapedia.de/vsengine/tra/vsc/en/ch/25/orgentec/autoimmundiagnostik.tra/Vlu/vsc/en/ch/25/orgentec/autoimmundiagnostik.vlu/Page/vsc/

en/ch/25/orgentec/diagnostik_immunfluoreszenz_en.vscml.html

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Inmunohistoquímica - IHQ

Tinción inmunohistoquímica de ganglio

linfático con anticuerpos anti-CD4

Inmunocitoquímica / Inmunohistoquímica(ICQ) (IHQ)

La ICQ (aplicada a células aisladas)

y la IHQ (aplicada a tejidos/biopsias)

utiliza anticuerpos específicos para

antígenos presentes en las células a

estudiar y los conjuga con enzimas.

La presencia de los antígenos en las

muestras de células/tejidos puede

visualizarse al añadir sustratos que

son modificados por las enzimas

conjugadas con el anticuerpo,

creando precipitados

coloreados insolubles en los sitios

precisos de unión

antígeno/anticuerpo.

http://www.msal.gob.ar/images/stories/bes/graficos/0000001339cnt-20180921-guia-inmunohistoquimica-para-tecnicos.pdf

InmunohistoquímicaCortes de Vaina Linfoide Periarteriolar (PALS) de Bazo de Rata

Identificación de Linfocitos T Totales y Citotóxicos

Toxicologic Pathology 2008; 36: 795-804,

B

D

A

C

A y C. Ratas Han Wistar(Ratas inmunocompetetntes)

B y D. Ratas Desnudas Atímicas(Carecen de Timo y Linfocitos T maduros)

A y BAnti-CD3

C y DAnti-CD8

Las muestras fueron incubadas secuencialmente con anticuerpos primarios (anti-CD3 o anti-CD8), anticuerpos secundarios

conjugados a peroxidasa, y diaminobezidina como sustrato, para dar una coloración marrón-rojiza en los sitios de unión Ag-Ac

Inmunohistoquímica Multiplex Cuantitativa

Cell Reports 2017; 19:203–217

Here, we describe a multiplexed immunohistochemical platform with computational

image processing workflows, including image cytometry, enabling simultaneous

evaluation of 12 biomarkers in one formalin-fixed paraffin-embedded tissue section.

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Reacciones de Precipitación

Zona de Exceso de Anticuerpo

Zona de Equivalencia

Zona de Exceso de Antígeno

SobrenadanteExceso de Anticuerpo

Exceso de Antígeno

Cantidad de Antígeno Añadidomicrobiology4.blogspot.com

Reacciones de Precipitación• El anticuerpo y el antígeno en solución interactúan formando complejos

inmunes en forma de retículos, haciéndose insolubles y precipitando• El anticuerpo debe ser por lo menos bivalente

• El antígeno debe ser bivalente o polivalente

• La relación entre las concentraciones de Ac y Ag deben ser óptimas (Zona de Equivalencia)

Inmunología de Kuby

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Reacciones de Precipitación en Gel

Reacciones de

Inmunoprecipitación en Gel• Permiten detectar la presencia y/o concentración de antígenos y/o

anticuerpos presentes, por la formación de bandas opacas de precipitado que corresponden a complejos antígenos-anticuerpos en la zona de equivalencia.

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/nurse/Bacchalour%20of%20Sciences%20in%20Nurses/ptn/Microbiology/2/14%20The%20usage%20of%20im

munological%20reactions.htm

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Reacciones de Precipitación en Gel

Inmunodifusión Doble (Outchterlony)

Inmunodifusión DobleOutchterlony

• Se basa en la difusión del Ag y el Ac en un medio semisólido (gel de agar), formando bandas de precipitación en el punto donde los reactantes alcanzan proporciones equivalentes.

Banda de PrecitaciónZona de Equivalencia Ag/Ac

Inmunología de Kuby

microbiology4.blogspot.com

Inmunodifusión DobleOutchterlony

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/nurse/Bacchalour%20of%20Sciences%20in%20Nurses/ptn/Microbiology/2/14%20The%20

usage%20of%20immunological%20reactions.htm

Suerodel Paciente

AntígenosNucleares

•SSA/Ro

•SSB/La

Sindrome

de Sjogren

Inmunodifusión DobleAplicaciones

• Análisis de Ag y Ac

• Determinar la relación inmunoquímica entre dos Ag (Identidad, No Identidad e Identidad Parcial)

• Determinar monoespecificidad de un antisuero

• Conocer el título de los anticuerpos..

Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Reacciones de Precipitación en Gel

Inmunoelectroforesis

Inmunoelectroforesis• Combina la electroforesis en una dimensión

en un primer paso, con la inmunodifusión en dirección perpendicular en un segundo paso.

• Permite la identificación de diferentes antígenos en mezclas complejas

• Se utiliza en el diagnóstico de cierto tipo de Inmunodeficiencias y de Mieloma Múltiple

Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002

http://www.scielo.org.pe/pdf/afm/v64n3/a02v64n3.pdf

CCC P P P

Inmunoelectroforesis1. Colocar en pozos de gel de agarosa sueros de Paciente (P) y Control (C) apropiado

Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002

CCC P P P

+

-

Inmunoelectroforesis2. Someter las muestras a un campo eléctrico para separar por Electroforesis

Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002

CCC P P P

+

-

Inmunoelectroforesis3. Abrir canales en la placa de agarosa y colocar antisueros apropiados. Incubar para difusión

IgG IgA IgM κ λ

Anti Anti AntiAnti Anti

Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002

Anti

IgG

Anti

IgA +Anti

κ

Anti

λ

Anti

IgM

CCC P P P

Inmunoelectroforesis4. Evaluar arcos de precipitación

Conclusión: Paciente con Gammapatía Monoclonal IgG-KappaPalomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002

Anti IgG

Anti IgA

Anti IgM

Anti Kappa

Anti Lambda

Anti Inmunoglobulina

Control

Control

Control

Control

Paciente

Paciente

Paciente

Modificado de: Fundamental Immunology-W.Paul-6th.edition-2008

InmunoelectroforesisPaciente con Gammapatía Monoclonal IgG-Kappa

Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac

Reacciones de Aglutinación

Un antígeno particulado (bacterias, eritrocitos), al interactuar con su

anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une por medio de

enlaces cruzados. Este complejo de unión forma Agregados,

produciendo una reacción de aglutinación.

Reacciones de Aglutinación

Aglutinación de Glóbulos RojosHemaglutinación

Modificado de: Rev Bras Hematol Hemoter 2011; 33(4):297-301

Glóbulos RojosAnticuerpos

(Anti-A)Aglutinación

(Entrecruzamiento de GR)

Antígeno A

(Grupo “A”)

Determinación del Grupo Sanguíneo “ABO”Pruebas de Aglutinación

Se estudia la presencia de antígenos del sistema “ABO” en eritrocitos de un paciente, utilizando antisueros específicos para

dichos antígenos (Anti-A y Anti-B). En la figura se presenta además la reacción con el suero Anti-D, para la determinación del

factor Rh y una prueba “Control” negativa, para descartar autoaglutinación. En este caso el paciente es Grupo “A”, Rh: Positivo.

Determinación del Grupo Sanguíneo “ABO”Pruebas de Aglutinación

SueroAnti-A

SueroAnti-B

Grupo “A”

Grupo “B”

Grupo “AB”

Grupo “O”

Modificado de: www.biologycorner.com

Resultados e interpretación de la reacción de aglutinación de eritrocitos de pacientes

con los antisueros anti-A y anti-B, para la determinación del grupo sanguíneo “ABO”

¡GRACIAS!

Para estudiar por su cuenta

• Inmunodifusión Radial

• Aglutinación: Inhibición de la Aglutinación

• Pruebas de Inmunohemólisis: Fijación de Complemento

http://epidemiologiamolecular.com/reacciones-hemaglutinacion-lisis/

Prueba de Fijación de Complemento

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1c/Coombs_test_schematic.png

Pruebas de Coombs: Directa e Indirecta