Evaluación de una cepa de levadura para fermentar diferentes concentraciones de miel de Apis mellifera. Lic. Miriam Concepción Lorenzo, MsC. Carlos Alberto del Risco Ríos, Lic. Dora María Lorenzo, Lic. Mario Fajardo e Ing. Juan Carlos Pérez Morales. Estación Experimental Apícola, Tel. 2020027, E-Mail miriam@eeapi.cu Cuba Resumen S e prepararon dos corridas experimentales en paralelo a diferentes concentraciones de miel de Apis mellifera desde 10 hasta 21ºBrix, con tres réplicas por cada concentración. A la miel utilizada se le controlaron los siguientes parámetros: diastasa, hidroximetilfurfural, por ciento de humedad, acidez libre, por ciento de sólidos solubles, Fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa y turanosa. La primera de las corridas sin fuente de nitrógeno exógena y la segunda con un exceso de esta fuente. Dichos mostos fueron inoculados con la cepa a evaluar controlándose el final de la fermentación con la toma del ºBrix aparente por refractometría y la producción de alcohol por oxidación del dicromato de potasio. La tolerancia al etanol se midió haciendo crecer la cepa en mosto de 10 ºBrix a concentraciones de etanol absoluto desde 1 hasta 16 %. La miel utilizada para este fin no cumplió con ciertos parámetros de la exportación. La cepa utilizada se clasificó como productora de alcohol, esta no excedió el 10% y alta tolerante al mismo. La producción de alcohol, los azúcares fermentables iniciales y finales medidos por cromatografía líquida de alta resolución así como el rendimiento y las eficiencias fermentativas arrojaron que los puntos más adecuados para preparar el mosto son 18 y 19 ºBrix y que la adición de la fuente de nitrógeno exógena no tuvo influencia sobre el rendimiento de alcohol. Introducción Los procesos fermentativos que conducen a productos de utilidad cotidiana, resultan de gran importancia para la humanidad debido a su amplio uso, ya sea de forma directa como medicamentos o alimentos, o de forma indirecta como materiales para la industria farmacéutica, alimenticia o química. La creciente lista de nuevos productos comerciales derivados de la fermentación y el incremento de la demanda para su utilización, han intensificado la búsqueda de nuevos conocimientos sobre la tecnología de estos bioprocesos. El proceso fermentativo es uno de los primeros aporte de la humanidad para la obtención de productos biotecnológicos y se desarrolló empíricamente en el antiguo Egipto según testimonios que datan del año 2000 A.N.E. (Llyons, Kelsall y Murtagh, 1995). A pesar de su uso milenario, no ha perdido perspectiva por cuanto constituye aun un modo de producción de vital interés. La fermentación es un proceso mediante el cual la levadura convierte azúcares en alcohol, CO 2 y otros metabolitos secundarios, regido químicamente por la ecuación establecida por el químico francés Joseph-Louis Gay Lussac en 1815.

C 6 H 12 O 6 2CO 2 + C 2 H 5 OH Sin embargo, a pesar de la existencia de esta ecuación que describe la esencia del proceso, su naturaleza no es químicamente pura. Teniendo en cuenta que los fermentos alcohólicos son productos biológicos, la interrelación de los eventos microbiológicos, bioquímicos y de ingeniería, así como su conocimiento y cuidadoso manejo son los llamados a jugar el papel esencial en el éxito del proceso fermentativo, siendo este último el causante de las principales pérdidas en la producción.

Algunas de las tendencias actuales en nuestro país sobre esta temática han estado encaminadas a la producción y fermentación de mostos de alta gravedad, lo que implica la selección de microorganismos que sean capaces de imponerse a las adversas condiciones ambientales y nutricionales propias del proceso; esto permitirá aumentar los rendimientos y productividad del mismo. La finalidad de este trabajo es evaluar una cepa de levadura en cuanto a su producción y tolerancia al alcohol, determinando el ºBrix de mejor rendimiento y eficiencia fermentativa, así como, determinar la influencia de una fuente de nitrógeno en exceso sobre la producción de alcohol. Materiales y Métodos S e prepararon dos corridas experimentales en paralelo de diferentes concentraciones de miel de Apis mellifera utilizando agua estéril y suave. Los mostos fueron ajustados por refractometría desde 10 hasta 21 ºBrix y envasados en Erlenmeyers de 500 mL a razón de 450 ml . La primera de las corridas se realizó sin fuente de nitrógeno exógeno mientras que a la segunda se le añadieron 10 g de sulfato de amonio por replica como fuente de nitrógeno en exceso. Dichos mostos fueron inoculados con la cepa a evaluar, perteneciente al género Saccharomyces , controlándose el final de la fermentación con la toma del ºBrix aparente cada 24 h. Para la determinación de etanol en el medio fermentado se utilizó una modificación de la técnica de Dietrich, (del Risco 1999). Se aplicó la técnica de tolerancia al alcohol (Bendová, 1981 y KocKová, 1954) que consistió en preparar mosto de 10 ° Brix conteniendo a su vez 0, 1, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 16 % de alcohol absoluto en volumen, cuya respuesta es la siguiente: • Las cepas con alta tolerancia soportan de 12 hasta 16 % de etanol. • las cepas con tolerancia soportan de 9 hasta 11 % de etanol. • Las cepas con mediana tolerancia soportan de 4 hasta 8 % de etanol. • Las cepas con tolerancia negativa soportan de 1 hasta 3 % de etanol. Para el control de la calidad de la miel utilizada se evaluaron los siguientes parámetros: Diastasa, hidroximetilfurfural, % de humedad, acidez libre y % de sólidos solubles (Harmonized methods in the Apimondia honey commissión, 1995; Harmonized methods of the European honey commission, 1997 and AOAC of Oficial method 980.23). Los azúcares fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa y turanosa se determinaron por cromatografía gaseosa de alta resolución en las siguientes condicione: Modelo del equipo: Cromatógrafo líquido KNAUER Detector IR Columna NH 2 Flujo: 1,3 mL por minutos Temperatura del horno 30ºC A partir de los valores obtenidos de alcohol y azúcares fermentables se calcularon los siguientes índices fermentativos, según:

Donde 64.4 es el valor teórico del rendimiento de la fermentación (Jörgensen, 1959).

R: Rendimiento, EP: Etanol Producido, AFI: Azúcares Fermentables Iniciales, E1: Eficiencia fermentativa 1, E2: Eficiencia fermentativa 2, ETT: Etanol Teórico Total. Resultados y Discusión En la Tabla 1 se muestran los resultados del control de la calidad de la miel utilizada; la misma no cumple con las normas cubanas en cuanto a los niveles de diastasa e hidroximetilfurfural (HMF). Lo anteriormente planteado es compatible con la finalidad de las mieles que se desean destinar a la fermentación, las cuales no corresponden con ciertos parámetros de las normas de exportación. El HMF es un compuesto hidrosoluble y se oxida rápidamente expuesto al aire o por acción de la luz. Se origina a partir de una deshidratación irreversible de las hexosas, principalmente de la fructosa. La formación de HMF puede favorecerse por la presencia de aminoácidos (reacción de Maillard) (Tegge, 1984), que juegan un papel importante durante el proceso de fermentación, garantizando la fuente de nitrógeno a-amino. Los azúcares Fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa y turanosa de la miel empleada, fueron cuantificados por ser los más comúnmente fermentables por las levaduras. Además, fructosa y glucosa son los monosacáridos más abundantes en la miel y por tanto los de más rendimiento alcohólico durante la fermentación. No se observa sacarosa, lo que denota una actividad invertasa alta, mientras que los resultados de la maltosa y la turanosa son bajos, no ofreciendo así importancia en el rendimiento alcohólico una vez que la miel ha sido diluida a sus respectivas concentraciones. Según la bibliografía los porcentages de los elementos solubles en la miel no concernientes a los azúcares son los siguientes: Proteínas 1.50%, sales de hierro, cobre, calcio, fósforo, potasio, azufre y otros 1.80%, enzimas 2.60%, vitaminas 0.003% y ácidos orgánicos 0.67 %. La suma de estos valores con los de fructosa 37.64%, glucosa 29.20%, maltosa 1.08% y turanosa 1.78% es igual a 76.3%. El resultado del por ciento de sólidos solubles de la miel utilizada es de 80,4; la diferencia de 4% pudiera corresponder a azúcares fermentables no cuantificados en el experimento que incrementan los porcientos de alcohol. La adición de 10 g de sulfato de amonio como fuente de nitrógeno a las distintas concentraciones de miel durante la fermentación, surte a las levaduras de una fuente externa de nitrógeno en exceso. Esto se traduce en el metabolismo como un incremento en la producción de alcohol si la materia prima carece de nitrógeno a-amino. Casey (1985) estudiando el comportamiento de cepas de levadura para cerveza en fermentaciones de alta gravedad (27 % de carbohidratos) concluyó que los factores que limitan tales fermentaciones eran, sobre todo, el contenido de lípidos del mosto y la cantidad total de nitrógeno asimilable en el medio. Como podemos observar en la tabla 2, la adición del sulfato de amonio incrementó los ºBrix establecidos entre 12.4 y 22.4, lo que justifica que los ºBrix aparentes al final de la corrida experimental con nitrógeno exógeno fueron superiores a la corrida en paralelo sin nitrógeno. Por una parte el sulfato de amonio favorece la reacción fermentativa y por otra incrementa el ªBrix inicial, aumentando las presiones osmóticas del medio que se oponen a los procesos celulares. De igual modo se justifica el ascenso de los ºBrix finales a medida que crecen los iniciales, producto del aumento de la concentración de carbohidratos en el medio. En la tabla 3 se presentan las concentraciones de fructosa y glucosa iniciales de cada ºBrix analizado. Como era de esperar, las mismas se incrementan. La suma de los porcentajes de fructosa y glucosa permitió el cálculo del etanol teórico donde se asumió de manera ideal que toda fructosa y glucosa se convirtieran en etanol. En la figura 1 se muestran los azúcares finales de las fermentaciones sin nitrógeno exógeno. Se observa que desde 10 hasta 20 ºBrix, el comportamiento tanto de fructosa como de glucosa es cero o muy cercano a cero. Esto evidencia la casi totalidad de consumo de los azúcares controlados, no siendo así para 21 ºBrix, donde la sumatoria fructosa más glucosa fue de 3.64%.

En la figura 2, referente a los azúcares finales de la corrida experimental con nitrógeno, los resultados se comportaron con cierta regularidad. En este caso, la sumatoria de los porcientos de fructosa mas glucosa entre 10-19 ºBrix fue generalmente cero o muy cercanos a cero (en el caso de 18 y 19 ºBrix con 0.42 y 0.46 % respectivamente). A partir de 20 ºBrix se incrementaron los azúcares reductores finales por encima del 1%. En la corrida experimental sin nitrógeno, las condiciones se mostraron adversas a partir de 21 ºBrix y como consecuencia, se proyectó un salto de los azúcares fermentables finales. Este fenómeno sucedió en la corrida experimental con nitrógeno pero a partir de los 20 ºBrix, esto puede ser consecuencia del incremento de los ºBrix iniciales al añadir el sulfato de amonio. El aumento progresivo de los niveles de sólidos en el medio incrementan las presiones osmóticas, lo que conlleva a un incremento en la concentración de etanol intracelular, lo cual da como resultado un decremento de las enzimas intracelulares que intervienen en la producción de etanol. Otros reportes (Yonnis, 1999; Stewart, 1999; O´Connor-Cox, 1996; Edelen-CL, 1996 y Anon, 1996) confirman estos resultados e indican que un nivel intracelular de etanol de 0.20 a 0.25 X 10 -6 mg por célula viable es el límite máximo antes de que la viabilidad de la célula de levadura se afecte negativamente. Las producciones de alcohol de ambas corridas experimentales se muestran en la figura 3. Como se puede observar, los resultados para cada ºBrix entre las corridas experimentales son muy similares, la fuente de nitrógeno exógeno no ejerce efecto en cuanto al aumento de la producción de alcohol. Esto evidencia que la miel utilizada contiene la suficiente cantidad de nitrógeno alfa amino para el metabolismo celular a estas concentraciones. En las corridas experimentales con nitrógeno y sin nitrógeno los resultados de etanol se comportaron en el rango de 4.88 - 9.84 % y 4.95 - 9.56% respectivamente. En ninguno de los casos se excedió el 10% por lo que se clasificó la cepa de levadura como media productora de etanol. A partir de los 18 ºBrix los ingresos de alcohol para ambas corridas no fueron relevantes, pues los efectos osmóticos comienzan a jugar el papel inhibitorio junto con las concentraciones de alcohol citoplasmáticas. Se ha demostrado que las membranas citoplasmáticas y de varios organelos son el blanco principal para la inhibición por etanol (Ingram y Buttke, 1984). El alcohol ocasiona alteraciones en la organización y permeabilidad de las mismas al afectar su composición lipídica y el funcionamiento de proteínas de membrana involucradas en el transporte de azúcares y aminoácidos (Lucero y cols., 1997; Aguillera y Benítez, 1986; Ingram, 1984; Leao y Van Uden, 1984). Estos cambios en la permeabilidad, causan la fuga de cofactores, coenzimas y nucleótidos (Mizoguchi y Hara, 1998). La pérdida de estas biomoléculas, esenciales para la actividad de enzimas involucradas en la glicólisis y producción de alcohol, son suficientes para explicar el efecto inhibitorio del mismo. Observemos que en ambas corridas entre 10-16 ºBrix, la producción de alcohol está por encima de los resultados teóricos planteados , entre 17-21 ºBrix son similares y finalmente los teóricos sobrepasan los prácticos. Los resultados teóricos son calculados en base a la concentración de fructosa y glucosa. Se conoce que en la miel existen otros azúcares fermentables en bajas concentraciones .No obstante, la sumatoria de los mismos puede incrementar las concentraciones de alcohol práctico por encima de los teóricos de forma notable, mientras las presiones osmóticas y las concentraciones de alcohol lo permitan. Una vez aumentados los ºBrix entre 17-21, el incremento de las presiones osmóticas así como la concentración de alcohol comienzan a ejercer su papel inhibitorio sobre la célula, el cual se hace máximo al llegar a 21 ºBrix. En la figura 4 se muestra el rendimiento y las eficiencias de cada fermentación sin nitrógeno. El valor teórico de rendimiento fermentativo es igual a 64.4%. Como podemos ver, desde 10 hasta 16 ºBrix los rendimientos se comportan por encima del teórico y las eficiencias por encima del 100%, desde 17 hasta 19 ºBrix los rendimientos prácticos son

similares al teórico y las eficiencias cercanas al 100%, para 20 y 21 ºBrix los rendimientos y las eficiencias quedan por debajo del valor teórico. Es lógico que el rendimiento y las eficiencias se expresen de la misma forma ya que ambos parámetros son directamente proporcionales al alcohol obtenido. Existe un decrecimiento escalonado tanto del rendimiento como de las eficiencias: en el primer escalón tenemos 11, 12, 13, 14, 15 y 16 ºBrix, en el segundo 17, 18 y 19 ºBrix y finalmente decrece de forma lineal. Los rendimientos y las eficiencias de las fermentaciones con nitrógeno se muestran en la figura 5. Ambos parámetros se encuentran por encima de los teóricos entre 10-16 ºBrix y a partir este último valor, los mismos están notablemente por debajo del umbral. Esto es debido al incremento de las presiones osmóticas correspondientes a los carbohidratos de la miel y a la adición del sulfato de amonio. Los ºBrix de mayor rendimiento y eficiencia fermentativa que se ajustan a la etapa experimental fueron 18 y 19. Es conocido el procedimiento de obtención de alcohol etílico por la vía fermentativa según el método Mell-Bonet. En este método se realiza el tratamiento previo de la miel (melaza de la caña de azúcar) y el ajuste del mosto entre 18 y 20º Brix en los cuales se obtienen mejores rendimientos y eficiencias fermentativas. Otro método de obtención del alcohol etílico por vía fermentativa es el de Jacquemine en el cual se ajusta también el mosto entre 18 y 20º Brix (Sánchez Collazo, 1987). La tolerancia al etanol es una característica importante en la selección de cepas por su incidencia en la eficiencia de la producción de alcohol (Gera y Sharma, 1991). La evaluación realizada al respecto, mostró que la producción de etanol así como la disminución del ºBrix aparente de todas las cepas se afectó con el incremento de las concentraciones de alcohol en el medio. Este efecto inhibitorio se hizo más evidente a partir de 8% en lo adelante, haciéndose nula la actividad celular después del 13% como lo muestra el gráfico 6. Al respecto, comparada con otros eucariontes, el género Saccharomyces spp. se muestra como el más alcohol resistente, ya que es capaz de crecer en concentraciones etanólicas de hasta un 12-20 % (Mizogrchi, 1998; Dieren, 1996; Price, 1995). Como podemos observar entre los valores de 1 y 4 hay una caída drástica en cuanto a la actividad celular lo cual se repite a partir del 8% de etanol inicial en el medio. No siendo de este modo entre los valores 4 y 8% lo cual existe una meseta que demuestra la estabilidad en la actividad celular dentro de esos valores. El etanol ejerce influencia negativa sobre muchos componentes y eventos intracelulares. Dentro de estos, podemos citar la inhibición y desnaturalización de varias proteínas internas y enzimas glicolíticas, la inhibición del flujo de protones inducidos por glucosa, así como la inducción de una acelerada reentrada pasiva de protones (Juroszek, Fenillat y Charpentier, 1987; Cartwright y cols.,1986; Nagodawithana; Whitt y Cutala,1977; O'Connor, 1991). Tabla 1 Control de la calidad de la miel utilizada y azúcares fermentables más comunes

Parámetros de control Resultados Normas

Cubanas Diastasa U.Gothe 18.24 >20 HMF mg/kg miel 23.44 <20 % Humedad 17.8 <=20 Acidez libre meq/kg 22.41 <=40 %Fructosa 37.64 ------- %Glucosa 29.20 ------- %Sacarosa nd < 5 %

%Maltosa 1.08 ------- %Turanosa 1.08 ------- % Reductores T. 69.7 >65 % % Sólidos solubles 80.4

Tabla 2 Control del ºBrix antes y después de las fermentaciones

ºBrix Inicial Final Aparentre normal con SO4(NH4)2 con SO4(NH4)2 sin SO4(NH4)2 10 12.4 6 3.4 11 13.2 6.2 3.9 12 14.3 6.3 4.3 13 15.1 6.9 4.9 14 15.8 7.4 5 15 16.9 8 5.4 16 17.8 8.1 5.8 17 18.7 9 6 18 19.6 9.5 6.9 19 20.4 10.3 7.1 20 21.5 10.7 7.9 21 22.4 11.6 8.1

Tabla 3 Azúcares Controlados

ºBrix % F m/v % G m/v % F+G m/v 10 3.70 2.59 6.29 11 4.03 2.84 6.87 12 5.34 3.74 9.08 13 5.83 3.72 9.55 14 6.18 4.37 10.55 15 6.47 4.67 11.14 16 6.89 4.89 11.78 17 7.82 5.63 13.45 18 8.47 5.97 14.44 19 8.60 6.31 14.91 20 9.23 7.01 16.24 21 10.49 7.37 17.86

Figura 1 Azúcares finales en la fermentación sin nitrógeno

Figura 2 Azúcares finales en la fermentación con nitrógeno

Figura 3 Etanol teórico y práctico de las fermentaciones con nitrógeno y sin nitrógeno

Figura 4 Rendimiento y eficiencias en las fermentaciones sin nitrógeno

Figura 5 Rendimiento y eficiencias en las fermentaciones con nitrógeno

Gráfico 6 Alcohol producido durante la fermentación. Conclusión a diferentes concentraciones de etanol inicial en el medio

Concluciones En nuestro estudio, la cepa se evaluó como media productora al alcohol así como resistente al mismo, mostrando los mayores rendimientos y eficiencias fermentativas a los 18 y 19 ºBrix. La adición de sulfato de amonio ejerce un efecto positivo como fuente de nitrógeno pero a la vez incrementa, a la concentración utilizada, las presiones osmóticas del medio lo que actúa como efecto negativo. Los efectos se anulan entre sí por no existir un incremento del rendimiento y la eficiencia fermentativa que puede estar dado también por la presencia de suficiente nitrógeno alfa amino en la miel utilizada que surta el fuego metabólico de la célula durante la fermentación. Recomendaciones Recomendamos el estudio de la misma fuente de nitrógeno pero a concentraciones inferiores. Continuar el estudio con otras cepas en busca de resultados más prometedores. Referencias Bibliográficas • Llyons, T. P.; Kelsal, D. R. y Murtagh, T. E. 1995. The alcohol Textbook. Ethanol Production by Press, Nottinghan. • Del Risco, C. (1999). Modificación del método de Witmark para la determinación de alcohol en cerveza. Forum Científico. • Jôrgensen, A. (1959). Microbiología de las fermentaciones industriales. 7 ma Edición, Edit. Por Hansen, A., Editorial Acribia, Zaragoza. • Tegge, G., Stärke und Stärkederivate . 1984, Hamburg: Behr's Verlag. • Juroszek, J. R.; Feuillat, M. y Charpentier, C. 1987. Effect of ethanol on glucose-induced movements of protons across the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae NCYC 431. Can. J. Microbiol. 33:93.

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