agentes quimicos 1

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.Práctica:

Acción de los Agentes Químicos sobre los Microorganismos

Las sustancias químicas pueden actuar sobre los microorganismos en varias formas, dependiendo de la composición físico-química del medio ambiente, la concentración, la temperatura y el tiempo que dura el contacto.

Pueden actuar mostrando una acción “bactericida” mediante la eliminación total de los microorganismos, o acción “bacteriostática” mediante inhibición temporal del crecimiento bacteriano.

Objetivo: Determinar la acción de algunos agentes químicos sobre los microorganismos.

Muestra Biológica: Cultivo bacteriano en caldo de: Escherichia coli, Pseudomonas sp. y

Staphylococcus aureus.

Material y Medio de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fósforo Placas de Petri con Agar Müller-Hinton Discos de papel de filtro estériles en una placa Torundas estériles dentro de un tubo Pinza de metal estéril Plumón de tinta indeleble.

Reactivo: Frascos con agentes químicos: Alcohol al 70 %

Fenol al 1 %Mercurio cromo al 2 %Cristal Violeta 1/1000Merthiolate 1/1000, Lejía 10%, Tintura de Yodo 10%, etc.

Procedimiento: Encienda el mechero, protéjase (guantes), acerque los materiales necesarios Introduzca una torunda estéril dentro del cultivo microbiano y al retirar presione el

algodón sobre las paredes del tubo para evitar que salga chorreando Siembre en toda la superficie del medio en la placa Luego de unos 5 minutos, previa señalización de los lugares donde se colocaran los

discos (promedio entre 5 ó 6 por placa) Con la pinza estéril coja un disco de papel de filtro e introduzca en un agente químico

(tenga cuidado de no impregnar los discos demasiado), luego colóquelo sobre el lugar predestinado y presione suavemente (no reubicar el disco desplazándolo)

Haga lo mismo con los demás desinfectantes o agentes químicos Incube las placas a 37º C por 24 – 48 horas y observe lo obtenido.

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.Resultados:Realice la medición del diámetro de los halos de inhibición formados y registre en la siguiente tabla:

AGENTEQUÍMICO

TAMAÑO DE DIÁMETRO DELHALO DE INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANOEscherichia coli Pseudomonas sp Staphylococcus aureus

Alcohol al 70 %Fenol al 1 %

Mercurio cromo al 2 %Cristal Violeta 1/1000

Merthiolate 1/1000Lejía 10%

Tintura de Yodo 10%

Interpretación:Generalmente el agente químico desinfectante que muestre mayor diámetro de halo de inhibición de crecimiento será el que tenga mayor efectividad.

Haga el esquema de lo observado.

Cuestionario: ¿Mencione cual es el mecanismo de acción del Alcohol, Fenol, Mercurio Cromo,

Cristal Violeta y Merthiolate? ¿Mencione 3 sustancias colorantes de acción antibacteriana y 3 antimicótica? ¿Cómo organizaría un enfrentamiento de agentes químicos pero frente a hongos?


El Antibiograma

En los últimos años se ha observado diferentes comportamientos de resistencia bacteriana a los antibióticos, por ello es necesario establecer programas nacionales e internacionales de vigilancia de la resistencia de las bacterias a los antibióticos, utilizando pruebas de sensibilidad fidedignas que proporcionen datos comparables. La información microbiológica y epidemiológica disponible ayudará a los clínicos a seleccionar el agente antimicrobiano más apropiado para tratar cada infección.

Objetivo: Evaluar la capacidad de los antibióticos para inhibir “in vitro” el desarrollo bacteriano, tanto por el método de difusión como por el método de dilución.

Muestra Biológica: Cultivo bacteriano en caldo de: Escherichia coli, Pseudomonas sp. y

Staphylococcus aureus comparables con el Tubo Nº 3 de la escala de Mc. Farland.

Material y Medio de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Placas de Petri con Agar Müller-Hinton (con aproximadamente 20 ml de medio) Caldo Nutritivo Discos de sensibilidad impregnados con antibióticos y quimioterápicos. Torundas estériles dentro de un tubo Pinza de metal estéril Tubos de ensayo de 13 x 100 mm estériles (10 tubos por microorganismo) Pipetas de 5 mL Gradillas Plumón de tinta indeleble.

Reactivo: Solución de antibióticos.

MÉTODO DE DIFUSIÓN:El método de disco-difusión en agar es una manera sencilla, práctica y rápida para realizar el antibiograma. El recomendado es el estandarizado por Kirby-Bauer, con el que se ha logrado uniformizar criterios que toman en cuenta los conceptos de concentración mínima inhibitoria (MIC o CIM) y de concentración promedio en sangre de las drogas frecuentemente usadas.


algodón sobre las paredes del tubo para evitar que salga chorreando Siembre en toda la superficie del medio Müller-Hinton en la placa Luego de unos 5 minutos, previa señalización de los lugares donde se colocaran los

discos (promedio entre 5 ó 6 por placa)

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S. Con la pinza estéril coja un disco de sensibilidad impregnado con antibiótico, luego

colóquelo sobre el lugar predestinado y presione suavemente (no reubicar el disco desplazándolo)

Haga lo mismo con los demás discos con antibióticos o quimioterápicos Incube las placas a 37º C por 24 horas y observe lo obtenido.

Resultados:Después del periodo de incubación, realice la medición del diámetro de los halos de inhibición formado para cada antibiótico ensayado y compare con la Tabla patrón.

TABLA DE INTERPRETACIÓN DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN

ANTIBIÓTICO CONCENTRACIÓN DEL DISCO (µg)

DIÁMETRO EN mm DE LA ZONA INHIBIT.RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE

AMICACINA 10 < 11 12 - 13 14 >AMPICILINAGram – y enterococosEstafilococos y resistentes a penicilina.

1010

< 11< 20

12 - 1321 - 28

14 >29 >

BACITRACINA 10 < 8 9 - 12 13 >CARBENICILINAProteus sp, E. coli P. aeruginosa

5050

< 17< 12

18 - 2213 - 14

23 >15 >

CAFELOTINA 30 < 14 15 - 17 18 >CLORANFENICOL 30 < 12 13 - 17 18 >CLINDAMICINA 2 < 14 15 - 16 17 >COLISTINA 10 < 8 9 - 10 11 >ERITROMICINA 15 <13 14 - 17 18 >GENTAMICINA 10 < 12 13 >KANAMICINA 30 < 13 14 - 17 18 >NEOMICINA 30 < 12 13 - 16 17 >NOVOBIOCINA 30 < 17 18 - 21 22 >PENICILINA GEstafilococosOtros gérmenes

10 < 20< 11

21 - 2812 - 21

29 >22 >

POLIMIXINA B 300 < 8 9 - 11 12 >RIFAMPIN(sólo para N. meningitidis) 5 < 24 25 >

ESTREPTOMICINA 10 < 11 12 - 14 15 >TETRACICLINA 30 < 14 15 - 18 19 >VANCOMICINA 30 < 9 10 - 11 12 >

AGENTE QUIMIOTERAPICO

NITROFURANTOINA * 300 < 14 15 - 16 17 >AC. NALIDIXICO * 30 < 13 14 - 18 19 >AC. OXOLINICOTRIMETROPRIN /SULFAMETOXAZOL

1.25 / 23.75 < 10 11 - 15 16 >

TRIPLE SULFA ** 300 < 12 13 - 16 17 >* Solamente para infecciones urinarias

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.** Solamente para infecciones urinarias. Todos los discos de sulfanilamidas de 250 ó 300 µg pueden ser interpretados similarmente.

Interpretación:La tabla patrón permitirá considerar al germen como: SENSIBLE, INTERMEDIO o RESISTENTE a la acción del antibiótico según corresponda su medida de halo de inhibición. Se reportan la valoración de los antibióticos si sus medidas han caído en ese orden.


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MÉTODO DE DILUCIÓN:Para evaluar cuantitativamente la actividad de un antibiótico puede agregarse diluciones de este a un caldo de cultivo o a un medio sólido en el que luego se siembra el microorganismo problema. La concentración más baja que impide el crecimiento bacteriano se considera concentración inhibitoria mínima (CIM o MIC) del fármaco.

Procedimiento: Encienda el mechero, protéjase (guantes), acerque los materiales necesarios Diluir el antibiótico a la concentración adecuada para trabajo (200 unidades por mL ó

500 µg por mL según sea el antibiótico) Colocar 10 tubos de 13 x 100 mm estériles, numerados del 1 al 10 Con una pipeta de 5 mL estéril, colocar 0,5 mL de caldo nutritivo en los tubos

marcados del 2 al 10 Agregar 0,5 mL del antibiótico al tubo 1 y 2, mezcle el contenido del tubo 2 y

trasvasar (transferir) 0,5 mL al tubo 3, continuando hasta el tubo 9. Retirar 0,5 mL del tubo 9 y descartar; el tubo 10 no recibe antibiótico y sirve como control

Agregar a todos los tubos 0,5 mL de la cepa bacteriana (cultivo bacteriano en caldo) Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas, observar lo sucedido.

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.Resultados:Realice la lectura e interpretación de los resultados teniendo en cuenta la concentración del antibiótico que va desde la mitad de la concentración dispuesta en la dilución obtenida y en forma decreciente desde el tubo 1 al 10. Observar si hay o no crecimiento bacteriano.

BACTERIACRECIMIENTO BACTERIANO

EN EL TUBO Nº (indicar con + ó -)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Interpretación:El tubo con la menor concentración del antibiótico que haya impedido el crecimiento bacteriano representará el MIC o CIM (Mínima Concentración Inhibitoria), es decir la concentración mínima del antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano.



Cuestionario: ¿Citar 5 enfermedades microbianas y el antibiótico utilizado en la actualidad? ¿Los antibióticos muestran actividad eficaz contra infecciones virales, por que? ¿Qué es la hipersensibilidad a la penicilina? ¿Cuál es el mecanismo de acción del ácido nalidixico, cloranfenicol y de las

cefalosporinas?


Actividad antimicrobiana de plantas medicinales (método de difusión en placa excavada)

Ante la creciente demanda de productos naturales como productos energéticos, suplementarios, nutricionales o de uso médico y las evidencias de resistencia a los antibióticos con el poco acceso a estos, se hace necesario contar con alternativas efectivas contra los microorganismos, para ello es necesario determinar su capacidad antimicrobiana comparada con productos bioquímicos conocidos (antibiótico) que puedan servir como opciones inmediatas para el tratar cada infección.

Objetivo: Evaluar la capacidad antimicrobiana “in vitro” de extractos de plantas medicinales por el método de difusión en placa escavada.

Muestra Biológica: Cultivo bacteriano en caldo de: Escherichia coli y Staphylococcus aureus

comparables con el Tubo Nº 5 de la escala de Mc. Farland.

Material y Medio de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fósforo Placas de Petri con Agar Müller-Hinton (con aproximadamente 20 mL de medio) Torundas estériles dentro de un tubo Sacabocado estéril Pipetas de 2 mL Matraz con medio de cultivo fundido (agar Müller Hinton) Plumón de tinta indeleble Regla.

Reactivo: Solución de antibiótico Extracto de planta medicinal.

Método de Difusión en Placa Excavada:El método de difusión en placa escavada es una manera sencilla, práctica y rápida para realizar la determinación de la actividad antimicrobiana de un extracto de planta, proceso que también se puede evaluar mediante la técnica de difusión simple en superficie de agar, pero permite un mejor manejo de los productos naturales a ensayar; así mismo, evaluar el efecto comparativo con un antibiótico estándar.


algodón sobre las paredes del tubo para evitar que salga chorreando Siembre en toda la superficie del medio Müller-Hinton en la placa Luego de unos 5 minutos, realizar señalización de los lugares donde se realizarán las

excavaciones (promedio entre 5 ó 6 por placa)

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S. Con el sacabocado retirar medio de cultivo en las zonas pre-señaladas y luego

colocar una gota del medio fundido en el fondo de cada excavación, permitir que enfríe y endurezca.

Rellene cada pocillo o excavación con un tipo de extracto de planta diferente o con diferentes concentraciones de un mismo tipo de extracto.

Haga lo mismo con la solución de antibiótico referencial en uno de los pocillos. Incube las placas a 37º C por 24 horas y observe lo obtenido.

Resultados:Después del periodo de incubación, realice la medición del diámetro de los halos de inhibición formados y compárelo con el del antibiótico patrón.

Interpretación:La presencia de halos de inhibición del crecimiento microbiano indicará actividad antimicrobiana, y al avaluar comparativamente con la medida del halo de inhibición formado con el antibiótico patrón se determinará el porcentaje de inhibición relativa (PIR) que evidenciaría una similar o desigual actividad, permitiendo ser considerado con alternativa para el tratamiento de infecciones microbianas.


Cuestionario: ¿diferenciar agente bactericida de bacteriostático? ¿describa como se puede obtener el extracto de una planta medicinal mediante

diferentes técnicas?

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