MA RIE LA LAZCANO VARGAS Quiero agradecer de manera muy especial a mis maestros que han sido parte fundamental en mi formacion academica, he logrado todos mis xitos gracias a su enseanza muy enriquesida en valores que hoy en dia han definido mi carcter y mi formacin moral.

DULCE KARINA DEL ANGEL TEMPLOS. Yo le agradezco a mi mama que me apoya y el esfuerzo que hace para seguir estudiando, tambin a mis maestros por su tiempo y la enseanza que me dieron que son la base de mi formacin academica.

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En esta investigacin trataremos el tema de la falta de informacin sobre la utilizacin de productos transgnicos en alimentos por parte de las empresas, abarcaremos de manera sencilla pero con un contenido significativo de forma que la informacin provoque el inters del lector. En las pginas siguientes explicaremos composicin qumica de los cidos nucleicos que son el ADN (acido desoxiribonucleico) y el ARN (acido ribonucleico) siendo estos dos portadores de la informacin gnica. Desde tiempos remotos los hombres se preguntaron como es que tenemos el mismo color de ojos de nuestra madre o la foma de la cara del padre, por esa razn chargaff demostr que las proporciones de las bases nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos, aunque seguan algunas reglas y Watson y Crick (1953) fueron los primeros investigadores en proponer una estructura para los cidos nucleicos llamada doble helice. La importancia de las moleculas de ADN es que pueden copiar por medio de enzimas especializadas y de esta manera se conserva su informacin para la siguiente generacin. Parte importante para creacin de organismos trangenicos es la codificacion del ADN en base a esto existen mtodos para la insercin de nuevos genes en plantas los cuales son: El mtodo fsico Agrobacterium tumefaciens Veremos los fines que se tienen a la hora de la produccin de transgnicos que serian: mejorar la productividad y resistencia a una enfermedad o plagas y el aspecto fsico. Los principios antes mencionados son la base teorica para la creacin de trangenicos que estn presentes en los productos que consumimos en la vida diaria, de modo que en esta investigacin mostraremos que empresas utilizan materia prima genticamente modificada y no informa la presencia de ellas.

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Los motivos por los cuales decidimos realizar nuestra tesina sobre el tema de la falta de informacin sobre la utilizacin de transgnicos en los productos que consumimos de manera cotidiana nos parecieron muy importantes y sobre todo es un tema que nos debe preocupar por que consumimos sin saber que son o de donde provienen. Y De acuerdo con la Organizacin de Naciones Unidas, el derecho a la informacin es el primer derecho bsico de los consumidores. Contar con informacin de los bienes y servicios que las compaas ofrecen de manera oportuna, completa, clara y veraz permite a los consumidores elegir qu es lo que quieren comprar. Por ello los mexicanos tenemos derecho a saber si los alimentos que adquirimos para nuestras familias contienen ingredientes o derivados de transgnicos, para que as cada uno decidamos si los comemos o no. Este derecho no est garantizado por la Ley de Bioseguridad de Organismos Genticamente Modificados vigente en Mxico, que slo obliga a informar sobre los transgnicos que sean nutrimentalmente distintos de forma significativa. Esta caracterstica es vaga y discutible por lo que la industria puede usar esta imprecisin para evadir su obligacin de informar al consumidor.

La coperacion de las leyes ayudado a que nuestros derechos sean violados como consumidores no tenemos el respeto ni la concideracion de las empresas ni las leyes que nos deberan proteger, pero no lo hace. De tal manera la situacin es preocupante por lo que debemos saber que articulo esta libre de algn organismo genticamente modificado que te pueda provocar una nueva alergia.

Es necesario que el consumidor conosca que industrias son las que evaden la obligacin de informar. Sobre todo tenemos derecho a saber que consecuencias prodria traer el consumir estos artculos para nuestra salis, las concecuenacias a nuestro ambiente y la combinacin de los organismos nativos con los transgnicos.

Sobre todo nos interesa informar de manera clara la situacin actual que vivomos con las nuevas tecnologas.3

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Demostrar que empresas utilizan transgnicos en los productos que comercializan y no informan al consumidor.

Mostrar la composicin qumica y las bases biolgicas para la obtencin de un transgnico. Analizar los mtodos que las empresas utilizan para la obtencin de productos transgnicos. Enumerar las compaas productoras que utilizan o no ingredientes transgnicos o sus derivados que vende al consumidor.

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TEMA 1. COMPOSICIN QUMICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS Miescher en 1871 aisl del ncleo de las clulas de pus una sustancia cida rica en fsforo que llam "nuclena". Un ao ms tarde, en 1872, aisl de la cabeza de los espermas del salmn un compuesto que denomin "protamina" y que result ser una sustancia cida y otra bsica. El nombre de cido nucleico procede del de "nuclena" propuesto por Miescher., Cuando se realiza la hidrlisis completa de los cidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes principales:

Azcar, en concreto una pentosa. Bases nitrogenadas: pricas y pirimidnicas. cido fosfrico.

El azcar, en el caso de los cidos desoxirribonucleicos (ADN) es la 2-desoxi-Dribosa y en el caso de los cidos ribonucleicos (ARN) es la D-ribosa.

Pentosas

cido fosfrico

Las bases nitrogenadas que forman parte de los cidos nucleicos son de dos tipos, pricas y pirimidnicas. Las bases pricas derivadas de la purina (fusin de un anillo pirimidnico y uno de imidazol) son la Adenina (6-aminopurina) y la Guanina (2amino-6-hidroxipurina). Las bases pirimidnicas (derivadas de la pirimidina) son la Timina (2,6-dihidroxi-5-metilpirimidina o tambin llamada 5 metiluracilo),

Citosina (2-hidroxi-6-aminopirimidina) y Uracilo (2,6-dihidroxipirimidina). Las bases nitrogenadas que forman normalmente parte del ADN son: Adenina (A), Guanina (G), Citosina y Timina (T). Las bases nitrogenadas que forman parte de el ARN son: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U). Por tanto, la Timina es especfica del ADN y el Uracilo es especfico del ARN.6

Adems de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. Ejemplos de algunas de estas bases pricas poco corrientes son: Hipoxantina, Xantina, 2-metiladenina, 6-metil-aminopurina. Entre las bases

pirimidnicas podramos citar la 5-metilcitosina (propia del ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares. En los ARN transferentes (ARN-t) que intervienen en el proceso de traduccin de protenas se encuentran la Ribotimidina, Dihidrouridina, Seudouridina e Inosina (I). La unin de la base nitrogenada a la pentosa recibe el nombre de nuclesido y se realiza a travs del carbono 1 de la pentosa y los nitrgenos de las posiciones 3 (pirimidinas) o 9 (purinas) de las bases nitrogenadas mediante un enlace de tipo Nglucosdico. La unin del nuclesido con el cido fosfrico se realiza a travs de un enlace de tipo ster entre el grupo OH del carbono 5 de la pentosa y el cido fosfrico, originando un nucletido. Los nucletidos son las unidades o monmeros utilizados para construir largas cadenas de polinucletidos.

Nuclesido = Pentosa + Base nitrogenada. Nucletido = Pentosa + Base nitrogenada + cido fosfrico. Polinucleotido = Nucletido + Nucletido + Nucletido + ....

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Nucletido Tanto los nucletidos como los nuclesidos pueden contener como azcar la Dribosa (ribonucletidos y ribonuclesidos) o la pentosa 2-desoxi-D-ribosa

(desoxirribonucletidos y desoxirribonuclesidos). Adems, los nucletidos pueden tener 1, 2 3 grupos fosfato unidos al carbono 5 de la pentosa, existiendo por tanto, nucletidos 5 monofosfato, nucletidos 5 difosfato y nucletidos 5 trifosfato. En algunos casos el cido fosfrico se une a la pentosa por el carbono 3, existiendo nucletidos 3 monofosfato, difosfato o trifosfato segn el nmero de grupos fosfato que posea. La terminologa empleada para referirse a los nuclesidos y nucletidos es la siguiente:

Base Nitrogenada Adenina Guanina Citosina Timina Uracilo

Nuclesido Adenosina Guanidina Citidina Timidina Uridina

Nucletido cido Adenlico cido Guanlico cido Citidlico cido Timidlico cido Uridlico

Los nucletidos se unen entre si para formar largas cadenas de polinucletidos, esta unin entre monmeros nucletidos se realiza mediante enlaces fosfodister entre los carbonos de las posiciones 3 de un nucletido con la 5 del siguiente.8

Polinucletido

1.1

PROPORCIONES

DE

LAS

BASES

NITROGENADAS:

REGLAS

DE

CHARGAFF Al principio se pensaba que los cidos nucleicos eran la repeticin montona de un tetranucletido, de forma que no tenan variabilidad suficiente para ser la molcula biolgica que almacenara la informacin. Sin embargo, Chargaff (1950) demostr que las proporciones de las bases nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos, aunque seguan algunas reglas. Estas reglas de Chargaff se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de doble hlice y son las siguientes: 1.1.1 REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HLICE Edwin Chargaff

La proporcin de Adenina (A) es igual a la de

Timina (T). A = T. La relacin entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T = 1).

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La proporcin de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La relacin entre Guanina y Citosina es igual a la unidad (G/C=1).

La proporcin de bases pricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidnicas (T+C). (A+G) = (T + C). La relacin entre (A+G) y (T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1.

Sin embargo, la proporcin entre (A+T) y (G+C) era caracterstica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores segn la especie estudiada. Este resultado indicaba que los cidos nucleicos no eran la repeticin montona de un tetranucletido. Exista variabilidad en la composicin de bases nitrogenadas.

En la siguiente tabla se observan las proporciones de las bases nitrogenadas en algunos organismos.

Procedencia del ADN Timo de Bovino Esperma de bovino Germen de trigo Saccharomyces Escherichia coli

A 28,2 28,7 27,3 31,3 26,0

G 21,5 22,2 22,7 18,7 24,9 34,9 24,5 26,2 19,5 18,3 G 25,4 17,2 24,0 23,5

C 21,2 20,7 16,8 17,1 25,2 35,4 18,2 27,7 19,5

T 27,8 27,3 27,1 32,9 23,9 14,6 32,3 23,5 30,8 32,4

5-Me-C 1,3 1,3 6,0 17,0 HMC

Mycobacterium tuberculosis 15,1 X174 T3 T5 T7 Virus ARN Mosaico del tabaco (TMV) Mosaico amarillo nabo Poliomielitis Encfalo10

24,3 23,7 30,3 32,4 A 29,8 22,6 28,6 del 27,3

C 18,5 38,0 22,0 23,2

U 26,3 22,2 25,4 25,9

miocarditis

ratn Reovirus Tipo 3 Tumor de las heridas 28,0 31,1 22,3 18,6 22,0 19,1 27,9 31,3

De la observacin de la tabla anterior pueden extraerse las siguientes conclusiones:

Todos los ADN estudiados cumplen la relacin A=T y G=C, excepto el ADN del bacteriofago X174. El ADN de este virus es de una sola hlice.

En los virus ARN no se cumple la equimolaridad de las bases excepto en el caso del virus del Tumor de las heridas y de los Reovirus que tienen ARN de doble hlice. En estos virus se cumple que A=U y G=C, adems se cumple que A+G/U+C=1.

El fago T2 y los otros fagos T-pares (T4 y T6) en vez de citosina tienen hidroximetil-citosina (HMC).

Algunos organismos tiene en su ADN una pequea proporcin de 5-metilcitosina (5-Me-C) que sustituye a la citosina.

Igualmente, en la siguiente tabla puede observarse como la proporcin A+T/G+C varia de un organismo a otro.

Organismo Escherichia coli Diplococcus pneumonia Mycobacterium tuberculosis Levadura Paracentrolus lividus (erizo mar) Arenque Rata Hombre Hombre Hombre

Tejido Esperma Esperma Mdula sea Timo Hgado Esperma

A+T/G+C 1,00 1,59 0,42 1,79 1,85 1,23 1,33 1,52 1,53 1,52

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Por tanto, la proporcin A+T/G+C es especfica de cada organismo y como veremos ms adelante cuando hablemos de las propiedades fsico- qumicas de los cidos nucleicos, dicha proporcin est relacionada con la densidad y la temperatura de fusin. TEMA 2. EL MODELO DE LA DOBLE HLICE: WATSON Y CRICK (1953) Una vez demostrado que los cidos nucleicos eran los portadores de la informacin gentica, se realizaron muchos esfuerzos encaminados a determinar su estructura con exactitud. Watson y Crick (1953) fueron los primeros investigadores en proponer una estructura para los cidos nucleicos y su labor investigadora se vio recompensada con el Premio Nobel en 1962, Premio Nobel que compartieron con M. H. F. Wilkins y que se les concedi por sus descubrimientos en relacin con la estructura molecular de los cidos nuclecos y su significacin para la transmisin de la informacin en la materia viva. Para realizar su trabajo emplearon dos tipos de datos ya existentes.

Francis H. C. Circk

James D. Watson

Maurice H. F. Wilkins

Por un lado, utilizaron los datos obtenidos varios aos antes por Chargaff (1950), relativos a la composicin de bases nitrogenadas en el ADN de diferentes organismos.

El otro tipo de datos eran los procedentes de estudios de difraccin de rayos X sobre fibras de ADN. Para determinar la estructura tridimensional o disposicin espacial de las molculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se recoge la difraccin de los rayos sobre una pelcula fotogrfica. La pelcula se impresiona en aquellos puntos donde inciden los rayos X, produciendo al revelarse manchas. El ngulo de difraccin presentado por cada una de las manchas en la pelcula suministra informacin sobre la posicin en la molcula de ADN de cada tomo o grupo de tomos.

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Mediante esta tcnica de difraccin de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados:

Las bases pricas y pirimidnicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a lo largo del eje del polinucletido a una distancia de 3,4 . Las bases son estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje (Astbury, 1947).

El dimetro del polinucletido es de 20 y est enrollado helicoidalmente alrededor de su eje. Cada 34 se produce una vuelta completa de la hlice.

Existe ms de una cadena polinucleotdica enrollada helicoidalmente (Wilkins et el. 1953, Frankling y Gosling, 1953).

Difraccin de Rayos X: ADN-B

Rosalin Franklin

Basndose en estos dos tipos de datos Watson y Crick propusieron su Modelo de estructura para el ADN conocido con el nombre de Modelo de la Doble Hlice. Las caractersticas del Modelo de la Doble Hlice son las siguientes:

El ADN es una doble hlice enrollada helicoidalmente a derechas (sentido dextrorso). Algo parecido a dos muelles entrelazados.

Enrollamiento de tipo plectonmico: para separar las dos hlices es necesario girarlas como si fuera un sacacorchos.

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Mdelo de la Doble hlice: ADN-B

J. Watson y F. Crick

Cada hlice es una serie de nucletidos unidos por enlaces fosfodister en los que un grupo fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azcares sucesivos (posiciones 3 de un azcar y 5 del siguiente).

Las dos hlices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno producidos entre las bases nitrogenadas de cada hlice. Siguiendo los datos de Chargaff (1959), la Adenina de una hlice aparea con la Timina de la hlice complementaria mediante dos puentes de hidrgeno. Igualmente, la Guanina de una hlice aparea con la Citosina de la complementaria mediante tres puentes de hidrgeno.

Par A-T

Par G-C

Pares A-T y G-C

Las dos hlices por razones de complementaridad de las bases nitrogenadas son antiparalelas, teniendo secuencias de tomos inversas. Una hlice lleva la secuencia 5P 3 OH, mientras que la hlice complementaria sigue la secuencia de tomos 3OH 5P.

El dimetro de la doble hlice es de 20 .

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Las bases nitrogenadas son estructuras planas perpendiculares al eje de la doble hlice y estn apiladas unas sobre otras a una distancia de 3,4 . Cada 10 bases, cada 34 se produce una vuelta completa de la doble hlice (360).

Las bases se encuentran en sus configuraciones cetnicas, cumpliendo as las reglas de apareamiento A-T y G-C.

La secuencia de bases nitrogenadas puede ser cualquiera, no existe ninguna restriccin.

Adems, la estructura en doble hlice propuesta por Watson y Crick (1953) sugera varas propiedades importantes del material hereditario:

Las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas A-T y G-C sugieren una forma sencilla de replicacin del material hereditario. Esta forma sencilla de replicacin se denomina mtodo Semiconservativo. Cuando el ADN se replica sus dos hlices se separan y cada una de ellas sirve de molde para sintetizar una nueva hlice siguiendo las reglas de apareamiento de las bases nitrogenadas.

La mutacin a nivel molecular consistira en un cambio en la secuencia de bases nitrogenadas del ADN.

Al no existir ninguna restriccin en la secuencia de bases nitrogenadas, el ADN posea la suficiente variabilidad como para ser el material hereditario.

Adems, esta estructura sugera la existencia de algn cdigo que permitiera pasar de la secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN a la secuencia lineal de aminocidos en las protenas.

Es necesario tener en cuenta que no todos los organismos vivos tienen como material hereditario ADN de doble hlice, algunos virus tienen ADN de hlice sencilla, ARN de una y de doble hlice.

Palndromos: plegamiento o apareamiento de una hlice consigo misma. El palndromo tambin es una figura gramatical que se lee igual en los dos sentidos, por ejemplo: DABALE ARROZ A LA ZORRA EL ABAD. Existe ADN palindrmico de hlice sencilla y de hlice doble. En el palndromo de doble cadena la secuencia de bases se lee igual en direccin 5 P 3OH en ambas cadenas.

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Secuencias palindrmicas

Palndromos en ADN de una y doble hlice

Existen algunos virus cuyos cidos nucleicos son de una sola hlice: el ADN de los fagos X174 y M13 es circular de hlice sencilla, sin embargo, se ha comprobado que una pequea parte resiste la accin de enzimas que digieren especficamente ADN de hlice sencilla. Por tanto, estas regiones resistentes de ADN presentan complementaridad interna o autoapareamiento, formando ADN duplex o doble hlice, teniendo secuencias

palndrmicas. Una situacin semejante se ha observado en el ARN de hlice sencilla del bacteriofago MS2 (3569 ribonucleotidos y tres genes). En este caso, el gen de la protena de la cubierta del virus presenta segmentos que tienen complementaridad interna (autoapareamiento) que se pliegan sobre si mismos formando horquillas (regiones de ARN de doble hlice).

ARN Fago MS2: protena de la cpside

El ARN transferente (ARN-t) que transporta los aminocidos y el ARN ribosmico (ARN-r) que intervienen en el proceso de traduccin, son cidos ribonucleicos de una sola hlice y tambin presentan autoapareamiento.

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Esquema ARN-transferente

Esquema Tetrahymena

ARN-ribosmico

de

2.1 PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS Las principales propiedades fsico-qumicas de los cidos nucleicos que vamos a considerar son las siguientes: 2.1.1 DENSIDAD DE LOS CIDOS NUCLEICOS Densidad: existe una relacin lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN.

Cuanto mayor es el contenido en (G+C) mayor es la densidad.

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Meselson y col. (1957) desarrollaron una tcnica de centrifugacin en gradiente de densidad. Cuando se centrifuga a alta velocidad un solucin densa (saturada) de un soluto de bajo peso molecular (ClCs 7,7 M, sucrosa, etc.) se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de difusin del soluto y la fuerza de sedimentacin, como consecuencia se produce un gradiente de densidad que aumenta en la direccin de la fuerza centrifuga (aumenta a medida que avanzamos hacia el fondo del tubo de centrifuga). Si aadimos al centrifugar una molcula de ADN, est migrar hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto en que la densidad del soluto de bajo peso molecular (la densidad del ClCs) coincide con la densidad del ADN centrifugado (densidad de flotacin). Posteriormente, es posible aislar las molculas de ADN de diferente densidad practicando un orificio en el fondo del tubo y sacando varias fracciones diferentes. Tambin es posible pinchar el tubo con una jeringa, justo en la posicin de la banda y extraer el ADN contenido de esa zona del tubo.

Centrifugacin en gradiente de CsCl Basndose en mltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su composicin en bases nitrogenadas, se ha establecido una frmula emprica que relaciona la densidad de flotacin () con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Est frmula es la siguiente: = 1,660 + 0,00098(G+C).

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2.1.2 DESNATURALIZACIN: TEMPERATURA DE FUSIN Desnaturalizacin: la proporcin A+T/C+G est relacionada en primer lugar con la estabilidad de la molcula de ADN de doble hlice. Cuanto mayor es el contenido en G+C de una molcula, mayor cantidad de pares G-C presentar, como consecuencia tendr una mayor cantidad de triples enlaces y, por consiguiente, ser necesario suministrar una mayor cantidad de energa a esa doble hlice para separar sus dos hebras (desnaturalizacin o fusin del ADN). Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de doble hlice para desnaturalizarlo. La temperatura de fusin (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reaccin ADN doble hlice ADN hlice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusin (Tm).

Relacin entre el contenido en (G+C) y Curvas de desnaturalizacin de diferentes Tm 2.1.3 ABSORBANCIA A 260 nm Absorbancia a 2.600 : El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado con su capacidad de absorcin de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se produce en estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuando se produce la desnaturalizacin pasando a estado de hlice sencilla (efecto hipercrmico, aumento de la absorbancia) y, por ltimo, si degradamos este ADN de hlice sencilla a nivel de nucletidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia. ADNs

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Esquema efecto hipercrmico Por tanto, la absorbancia a 2.600 se puede utilizar como una medida del estado fsico de la molcula de ADN. Las curvas de fusin tienen forma de S observndose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusin. 2.2 CINTICA DE RENATURALIZACIN: CURVAS CoT Velocidad de renaturalizacin: la velocidad de renaturalizacin del ADN de un organismo est relacionada con su complejidad. La complejidad se define como la suma del nmero de nucleotidos que tiene cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el nmero de veces que esta repetida. El ADN de los virus y las bacterias en su mayora slo tiene secuencias que estn una sola vez en el genoma (secuencias nicas). Sin embargo, el organismo ms complejo, como los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma. Los eucariontes tienen secuencias nicas (SU), secuencias de bajo nmero de copias (SBNC, 2-10 copias), secuencias repetidas (SR, alrededor de 102 copias) y altamente repetidas (SAR, 103 a 106 copias).

Tipo de Secuencia A (SU) B (SU) C (SBNC) D (SBNC) E (SR)

N de repeticiones 1 1 4 6 200

N de nucletidos 5.700 7.530 3.720 4.350 500

20

F (SAR) G (SAR) Complejidad

10.000 1.000.000

300 200 22.300

Si imaginamos un organismo eucarionte con los tipos de secuencias indicados en la tabla anterior, su complejidad sera la suma del nmero de nucletidos de cada tipo de secuencia (22.300) sin tener en cuenta el nmero de veces que est repetida cada una de ellas. No es difcil imaginar que la velocidad de renaturalizacin del ADN (paso de dos hlices sencillas a una doble hlice) este relacionada con el nmero de veces que esta repetida una determinada secuencia. Supongamos que tenemos dos organismos hipotticos distintos, ambos con la misma cantidad de ADN (1.000.000 de pares de nucletidos). El organismo A posee 1.000 secuencias nicas diferentes, cada una con una longitud media de 1.000 nucletidos. El organismo B tiene una secuencia de 100 nucletidos de longitud que est repetida 10.000 veces. Si extraemos el ADN de estos dos organismos por separado, lo desnaturalizamos y las piezas de ADN desnaturalizado de cada organismo se ponen en condiciones de renaturalizar (tamao uniforme de los fragmentos de ADN, entre 250 y 450 pb, temperatura, condiciones inicas, etc), es evidente que el ADN del organismo B renaturalizar mucho antes, ms rpidamente, que el del organismo A, ya que es mucho ms probable que la secuencia que est repetida 10.000 veces encuentre otra complementaria en el medio de reaccin para formar la doble hlice.

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Las curvas de renaturalizacin o curvas Cot, de organismos que carecen de secuencias repetidas como virus y bacterias, tienen forma de S, tienen un slo punto de inflexin o punto medio de la reaccin. Todas las secuencias son nicas y tienen la misma probabilidad de encontrar a su complementaria para formar la doble hlice.

Curvas Cot de virus y bacterias

Curvas Cot de un eucarionte

Las curvas Cot de organismos eucariontes con diferentes tipos de secuencias, poseen varios puntos de inflexin. Cada uno de ellos correspondiente a un tipo de secuencias (nicas, moderadamente repetidas, y altamente repetidas). Como en el caso de las curvas de fusin, tambin se utiliza como medida el punto medio de la reaccin de renaturalizacin, es decir, el Cot o tiempo al que se ha reasociado la mitad del ADN. El Cot es directamente proporcional a la complejidad del ADN del organismo. Valores de Cot bajos (10 -4 a 10-1) corresponden a secuencias altamente repetidas, valores de Cot comprendidos entre 10 y 102 corresponden a secuencias moderadamente repetidas y las secuencias nicas o de bajo nmero de copias dan lugar a valores de Cot altos (mayores de 10 3) . 2.3 HIBRIDACIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS Las tcnicas de desnaturalizacin y posterior renaturalizacin se utilizan para conseguir la hibridacin de cidos nucleicos, es decir, una vez separadas las dos hebras del ADN doble hlice, es posible volver a formar una doble hlice con una hebra de ADN que sea complementaria (hibridacin de ADN con ADN) o volver a formar una doble hlice con un segmento de ARN que contenga la secuencia complementaria (hibridacin de ADN con ARN).

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2.3.1 Endonucleasas de restriccin Las tcnicas de hibridacin (desnaturalizacin y posterior renaturalizacin) permiten, por ejemplo, identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARN-mensajero. Si se asla un mensajero determinado en una clula, es posible hibridar este ARN con el ADN de la clula previamente fragmentado mediante el uso de endonucleasas de restriccin. Las endonucleasas de restriccin de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrmico y cortan por el interior de la secuencia diana a la misma altura en las dos hlices de ADN (corte simtrico) o a distinto nivel en cada hlice (corte asimtrico).

Eco RI

Hae III

Dichas endonucleasas de restriccin fueron descubiertas por Werner Arber, Hamilton O. Smith y Daniel Nathans en la bacteria E.coli , trabajos por los que recibieron el premio Nobel. Estas enzimas forman parte del sistema de defensa (sistema de modificacin-restriccin) de las bacterias frente a la entrada de ADN exgeno en su interior. Existen cientos de endonucleasas diferentes que reconocen distintas secuencias cortas de tipo palndrmico. En la siguiente tabla se indican algunas de las endonucleasas ms frecuentes:

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Endonucleasa de restriccin Eco RI Eco RII Hae III Hin dII Hin dIII Hpa I Hpa II Ava I

Bacteria de la que procede Escherichia coli Escherichia coli Haemophilus aegyptus Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae

Secuencia

que

reconoce

(5' 3') y lugar de corte () 5' GAATTC 3' (asimtrico) 5' CCTGG 3' (asimtrico) 5' GGCC 3' (simtrico) 5' GTPiPu AC 3' (simtrico) 5' AAGCTT 3' (asimtrico)

Haemophilus parainfluenzae 5' GTTAAC 3' (simtrico) Haemophilus parainfluenzae 5' CCGG 3' (asimtrico) Anabaena variabilis 5' CGPuPiCG 3' (simtrico)

La utilizacin de diferentes endonucleasas y la separacin por tamaos de los fragmentos producidos mediante electroforesis permite construir lo que se denomina Mapas de restriccin. Cuando el ADN de un organismo eucarionte se fragmenta con una endonucleasa de restriccin, se producen cientos de miles o incluso hasta millones de fragmentos. Dichos fragmentos se separan por tamaos mediante electroforesis en geles de agarosa, una vez se parados por tamaos se transfieren los fragmentos a una membrana de nylon en condiciones desnaturalizantes y de forma que permanezcan en la misma posicin. Los fragmentos desnaturalizados y pegados a la membrana se pueden renaturalizar o hibridar utilizando una segmento de ADN o de ARN (habitualmente denominado sonda) marcado radiactivamente. Dicha sonda, hibridar solamente con aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria. La tcnica que permite transferir los fragmentos de ADN desnaturalizados a una membrana de nylon y posteriormente hibridar con una sonda de ADN marcada se denomina Tcnica Southern (hibridacin ADN-ADN), cuando la hibridacin se realiza con una sonda de ARN marcada se denomina Northern (hibridacin ADN-ARN). El empleo combinado de endonucleasas de restriccin y de diferentes sondas de ADN de secuencia nica marcadas permite obtener Polimorfismos para

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Longitudes de Fragmentos de Restriccin (RFLPs), muy utilizados en la construccin de mapas de ligamiento. 2.3.2 Hibridacin "in situ" Las tcnicas de hibridacin "in situ" permiten localizar un segmento concreto de ADN (por ejemplo un gen) en una posicin determinada de un cromosoma eucaritico. Es posible obtener preparaciones citolgicas de cromosomas en metafase mittica o en otras fases del ciclo, desnaturalizar el ADN de los cromosomas en la propia preparacin citolgica y posteriormente hibridar con la pieza de ADN deseada marcada. Actualmente, el marcaje suele ser de tipo fluorescente, denominndose dicha tcnica Hibridacin "in situ" mediante fluorescencia (abreviadamente FISH). Tambin, es posible marcar todo el ADN de un genomio o juego de cromosomas completo y realizar una Hibridacin "in situ" Genmica (abreviadamente GISH) que permite averiguar si los cromosomas de un determinado genomio estn presentes. Otra aplicacin, consiste en detectar determinados cromosomas o regiones cromosmicas concretas utilizando sondas o piezas de ADN marcadas mediante fluorescencia y procedentes solamente del cromosoma deseado, de esta manera, se obtiene lo que se denomina Pintura Cromosmica.

FISH

trigo

(Triticum GISH: (Liliaceae)

Hbrido

Pintura cromosmica (ratn)

Pintura (humanos)

cromosmica

intermedium)

2.4 SECUENCIACIN DEL ADN: MTODO DIDESOXI Y MTODO AUTOMTICO El anlisis ms detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucletidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes mtodos para obtener la secuencia de nucletidos del ADN, sin embargo, actualmente los mtodos ms utilizados son el de secuenciacin automtica y el

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mtodo enzimtico de terminacin de cadena de Sanger tambin conocido por el mtodo didesoxi. 2.4.1 Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o mtodo didesoxi de Sanger Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el mtodo enzimtico de terminacin de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Adems, debe estar en estado de hlice sencilla.

Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hlice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va aadiendo nucletidos a partir de un cebador o "primer".

Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a aadir nucletidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucletidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, adems, este cebador procede de una regin del vector muy cercana al punto de insercin del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.

Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucletidos trifosfato en cada reaccin.

Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por tanto,

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una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de ADN.

2.4.2 Breve descripcin del mtodo enzimtico de terminacin de cadena

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucletido dideoxi, por ejemplo ddATP, a una concentracin baja. El nucletido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se est sintetizando, produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora.

Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales

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de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucletido.Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reaccin se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel.

Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde) est la base correspondiente al nucletido didesoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente.

Esquema de las electroforesis de las reacciones de secuenciacin

Autorradiograf a

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva sntesis en la direccin 5' 3'.

2.4.3 Breve descripcin del mtodo automtico de secuenciacin

La principal diferencia entre mtodo enzimtico de terminacin de cadena y el mtodo automtico de secuenciacin radica, en primer lugar en el tipo de

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marcaje. En el mtodo automtico en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin, cada una con nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin.

La segunda diferencia radica en el sistema de deteccin de los fragmentos de ADN. La deteccin del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reaccin se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamao que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el nmero de nucletidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciacin.

El siguiente esquema representa de forma abreviada el mtodo automtico de secuenciacin.

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Esquema del mtodo automtico de secuenciacin

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el mtodo automtico de secuenciacin. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucletido existente en esa posicin de la secuencia.

30

Secuencia obtenida por mtodos automticos

2.5 DEFINICIN DE CROMOSOMA Y CROMATINA La palabra cromosoma procede del griego y significa "cuerpo que se tie". La palabra cromatina significa "sustancia que se tie". El cromosoma, como ya hemos dicho en el tema anterior, es el material gentico organizado. En el caso de los organismos eucariontes el cromosoma nace fundamentalmente de la interaccin entre el ADN, las histonas y las protenas no histnicas. Los cromosomas eucariticos son molculas muy largas de ADN doble hlice en interaccin con protenas (histonas y no histonas) que se pueden encontrar desde estados relajados o poco compactados como en los ncleos de las clulas en interfase hasta en estados altamente compactados como sucede en la metafase mittica. La cromatina fue inicialmente definida por Fleming (1882) como "la sustancia que constituye los ncleos interfsicos y que muestra determinadas propiedades de tincin". Esta definicin, al igual que la inicial de cromosoma es puramente citolgica. Sin embargo, desde el punto de vista gentico, tanto la cromatina como el cromosoma son el material gentico organizado. Algunos autores piensan que la cromatina es solamente la interaccin entre el ADN y las histonas. Otros consideran que en la estructura de la cromatina tambin intervienen las protenas no histnicas, e incluso algunos autores piensan que el ARN tambin juega un papel importante en la estructura de la cromatina. 2.6 COMPOSICIN QUMICA DE LA CROMATINA: EL NUCLEOSOMA Principales componentes Los principales componentes que se obtienen cuando se asla la cromatina de los ncleos interfsicos son el ADN, las histnicas, las protenas no histnicas y el ARN. Si se toma como unidad de comparacin la cantidad de ADN, los dems componentes aparecen en las siguientes proporciones: ADN 1 HISTONAS 1 NO HISTONAS 0,5 - 1,5 ARN 0,05

31

La cantidad de las protenas no histnicas puede variar de unos tejidos a otros en el mismo individuo y dentro del mismo tejido a lo largo del desarrollo. 2.6.1 Las Histonas Las son protenas bsicas, ricas en residuos de lisina y arginina, que muestran un elevado conservadurismo evolutivo y que interaccin con el ADN formando una subunidad que se repite a lo largo de la cromatina denominada Nucleosoma. Los principales tipos de histonas que se han aislado en los ncleos interfsicos en diferentes especies eucariontes son: H1, H2A, H2B, H3 y H4. Las caractersticas ms sobresalientes de estas histonas aparecen en la siguiente tabla: Contenido en moles Histona N residuos 213 129 Pm % de Lys H1 H2A 21.000 27,7 13.900 10,9 Arg 1,4 9,3 19,78 1,17 V. Lys/Arg Modificacin cambio evolutivo Fosforilacin 4 Fosforilacin, acetilacin Fosforilacin, acetilacin Acetilacin, H3 135 15.273 9,6 13,3 0,72 metilacin fosforilacin Acetilacin, H4 102 11.236 10,8 13,7 0,79 metilacin fosforilacin La velocidad del cambio evolutivo se mide como el nmero de cambios por cada 100 aminocidos por cada 100 millones de aos Adems de estas histonas, tambin existen otras que son especficas de tejido como es la histona H5 muy rica en lisina (25 moles%) especfica de eritrocitos nucleados de vertebrados no mamferos, y de las histonas del esperma. 0,06 0,1 1

H2B

125

13.774 15,2

6,1

2,49

1

32

Una de las caractersticas ms destacables es su elevado conservadurismo evolutivo, sobre todo de las histonas H3 y H4. La histona H4 de guisante y de timo de ternera se diferencia solamente en dos aminocidos. Este dato, indica que las interacciones entre el ADN y las histonas para formar la cromatina deben ser muy semejantes en todos los organismos eucariontes. Los genes para las histonas se encuentran agrupados en nichos (o clusters) que se repiten decenas o centenas de veces (erizo de mar). Cada cluster o grupo contiene el siguiente orden de los genes para histonas: H1-H2A-H3-H2B-H4. Los genes para las histonas son ricos en pares G-C ya que codifican protenas con elevado contenido en Lys y Arg, pero estn separados por secuencias espaciadoras ricas en pares A-T.

Agrupamientos ("cluster") de genes de histonas. 2.6.2 El nucleosoma La observacin de la cromatina interfsica mediante tcnicas de microscopia electrnica podra describirse como la repeticin de una subunidad esfrica o globular (los nucleosomas) que estaran unidos por fibras de ADN. Esto le da un aspecto como de cuentas de un collar o de un rosario.

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Cromatina eucaritica

Cromosoma metafsico de abeja

Un nucleosoma tpico est asociado a 200 pares de bases (pb) y est formado por una mdula ("core") y un ligador (o "linker"). La mdula est formada por un octmero constituido por dos subunidades de las siguientes histonas: H2A, H2B, H3 y H4. Se trata de un dmero de las histonas (H2A, H2B, H3 y H4)2. Los trabajos de A. Klug y colaboradores (1980) sobre la disposicin de las histonas en la mdula del nucleosoma le valieron el Premio Nobel de Qumica en 1982.

Nucleosoma Tpico

Mdula de nucleosoma

Aaron Klug

Alrededor de la mdula se enrolla el ADN (140 pb) dando casi dos vueltas (una vuelta y tres cuartos). El resto del ADN (60 pb) forma parte del ligador ("linker") y est interaccionando con la histona H1. La cantidad de ADN asociado con un nucleosoma varia de una especie a otra, de 154 pb a 241 pb, esta variacin se debe fundamentalmente a la cantidad de ADN asociada al ligador ("linker").34

Las fibras de ADN dplex desnudo tienen un grosor de 20 . La asociacin del ADN con las histonas genera los nucleosomas que muestran unos 100 de dimetro, a su vez los nucleosomas se pueden enrollar helicoidalmente para formar un solenoide (una especie de muelle) que constituye las fibras de cromatina de los ncleos intefsicos con un dimetro aproximado de 300 . Los solenoides pueden volverse a enrollar para dar lugar a supersolenoides con un dimetro de 4.000 a 6.000 que constituiran las fibras de los cromosomas metafsicos.

Mdula ("core") del Nucleosoma Formacin del Solenoide (papel de la histona H1)

2.7 Protenas Cromosmicas No Histnicas: El Armazn Proteico Las protenas cromosmicas no histnicas son protenas diferentes de las histonas que se extraen de la cromatina de los ncleos con ClNa 0.35M (solucin salina), tienen un alto contenido en aminocidos bsicos (25% o ms), alto contenido en aminocidos cidos (20-30%), una elevada proporcin de prolina (7%), bajo contenido en aminocidos hidrofbicos y una alta movilidad electrofortica. Las protenas cromosmicas no histnicas que se extraen de la cromatina de los ncleos varan mucho dependiendo de la tcnica de aislamiento empleada. Un grupo de estas protenas cromosmicas no histnicas presentan alta movilidad electrofretica y se denominan abreviadamente HMG (grupo de alta movilidad). Se han detectado ms de 20 protenas HMG, habindose encontrado las protenas HMG-1, HMG-2 , HMG-14 y HMG-17 en todas las especies de mamferos, aves y peces estudiadas hasta el momento. Las protenas HMG-1 y HMG-2 se encuentran slo en el ncleo, estn implicadas en la replicacin, se unen preferentemente a ADN de hlice sencilla, desenrollan el ADN dplex y se estima que existe una molcula de HMG-1 HMG-2 por cada 15 nucleosomas. Las protenas HMG-14 y HMG-17 se35

encuentran en el ncleo y en el citoplasma, estn relacionadas con la regulacin de la transcripcin y se estima que existe una molcula de HMG14 HMG-17 por cada 10 nucleosomas. Muchos estudios citogenticos muestran que los cromosomas estn claramente enrollados cuando se observan al microscopio, un buen ejemplo de esta situacin son los cromosomas de los ncleos de algunos protozoos. El dimetro de las fibras de solenoides (enrollamiento helicoidal de las fibras de nucleosomas) observadas en ncleos en interfase es de 30 nm, sin embargo, el dimetro observado al microscopio para las fibras cromosmicas durante la divisin celular es de 700 nm. Por tanto, se han tenido que producir nuevos superenrollamientos. De qu forma se producen estos nuevos niveles de compactacin?. Laemmli y colaboradores en 1977 consiguieron aislar cromosomas metafsicos desprovistos de histonas mediante un tratamiento con sulfato de dextrano y heparina. Estos cromosomas metafsicos desprovistos de histonas presentan una mdula central densamente teida que ha sido denominada scaffold (armazn). Este armazn proteico (scaffold) es resistente a la accin de la ADN asa, ARN asa y tambin a soluciones de ClNa 2M. Sin embargo, desaparece por tratamientos con urea 4M y dodecil sulfato sdico o por tratamiento con enzimas proteolticas. Por tanto, se trata de un armazn proteco. La observacin a microscopa electrnica pone de manifiesto que de este armazn proteico (scaffold) salen y llegan lazos o fibras que pueden hacerse desaparecer mediante tratamiento con ADNasa. Por tanto, estos lazos o dominios que arrancan del armazn proteico son lazos de ADN. Uno de los principales componentes del armazn proteico es la enzima topoisomerasa II que produce cortes en el ADN dplex a nivel de ambas hlices. La toposiomerasa II (girasa) interviene durante la replicacin del ADN creando o relajando los superenrollamientos. La aparicin de la topoisomerasa II (girasa) slo en el armazn proteico sugiere que se encuentra en la base de los lazos o dominios de ADN, indicando que esta organizacin en dominios podra estar relacionada con la replicacin y transcrpcin. Otras enzimas como la topoisomerasa I que produce cortes en el ADN dplex a nivel de una sola hlice y la HMG-17 se encuentran slo en los lazos o dominios y no en el armazn proteico.

36

Armazn proteico no histnico

Armazn histnico

proteico

noUlrich Laemmli

K.

La evidencia existente hasta el momento sugiere que las fibras de solenoides (30 nm) formaran los lazos o dominios que emanan del armazn proteico y que este armazn estara a su vez enrollado formando una espiral.

Organizacin en Dominios y Armazn proteico

Lazos en cromosomas sin extraer (Laemmli)

Los dominios de ADN parecen estar unidos al armazn proteico por unas regiones especficas37

denominadas

abreviadamente

SARs

(regiones

de

asociacin

especficas) que se detectan cuando los cromosomas metafsicos desprovistos de histonas se tratan con endonucleasas de restriccin. Despus de este tratamiento quedan regiones de ADN unidas al armazn que a su vez resisten la digestin con exonucleasas gracias a que estn protegidas por una protena. Cuando se digiere esta protena, las regiones de ADN protegidas contienen secuencias que se sabe que son especificas para la unin de topoisomerasas. Estas regiones regiones de unin especficas de los dominios al armazn proteico son las regiones SARs.

Unin de los dominios al armazn a tr avs de las regiones SAR

2.7.1 Papel del ARN El ARN, al igual que suceda en el caso de la organizacin del nucleoide bacteriano, parece jugar algn papel en el plegamiento del cromosoma eucaritico. Al menos en humanos y en Drosophila se han encontrado evidencias de este papel estructural del ARN. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el armazn proteico descrito por38

Laemmli y colaboradores (1977) no se ve afectado por el tratamiento con ARNasa. Podra ser que las propias protenas del armazn protegieran al ARN de la accin de la ARNasa. En cualquier caso, es conveniente recordar que el ADN del cromosoma bacteriano tambin est organizado en dominios y que el ARN podra jugar algn papel en el mantenimiento de dicha estructura. En organismos con caractersticas intermedias entre las de procariontes y eucariontes como los dinoflagelados, tambin existen existen datos que apoyan el papel estructural del ARN en la organizacin cromosmica. 2.8 El Valor C Y Paradoja Del Valor C El valor C se defina como la cantidad de ADN por genoma haploide (un solo juego cromosmico) en estado de un cromatidio (en fase G1). En el caso de la especie humana con 2n=46 cromosomas, especie diploide (2n), con dos juegos de cromosomas, uno recibido del padre y otro de la madre, cada uno formado por 23 cromosomas, el valor C sera la cantidad de ADN correspondiente a un juego de 23 cromosomas en estado de un solo cromatidio (en fase G1 antes del periodo S de sntesis). Una forma mucho ms sencilla de definir el valor C, en el caso de las especies diploides, con dos juegos cromosmicos, sera el contenido de ADN de un gameto de la especie. Un espermatozoide humano y un vulo humano (gametos) contienen 23 cromosomas en estado de un cromatidio, el valor C sera la cantidad de ADN de los 23 cromatidios de un gameto humano. Cuando se estudia el valor C de distintas especies a lo largo de la escala evolutiva, se observa que no existe relacin entre el contenido en ADN y la posicin que una especie tiene en la escala evolutiva. Es decir, especies como la humana poseen una menor cantidad de ADN que algunas especies de salamandras, peces no telesteos y muchas plantas. Existe una gran variacin en la cantidad de ADN (valor C) entre especies pertenecientes a familias o o grupos filogenticos distintos, y adems, dentro de una misma familia de especies tambin se encuentra una enorme variacin en la cantidad de ADN. Por ejemplo, la cantidad de ADN en las plantas con flore varia entre 5 x 108 y 1011 pares de bases, o por ejemplo, en los anfibios varia entre 9 x 108 y 9 x 1010 pares de bases. En la siguiente tabla se indican los valores en pares de bases de algunas especies utilizadas en la investigacin (pb).

39

Grupo Taxonmico Algas Mycoplasma Bacterias Levaduras Hongos Nematodos Insectos Aves Anfibios Mamferos

Especie Pyrenomas salina

Valor C (pb) 6,6 x 105

Mycoplasma pneumoniae 1,0 x 106 Escherichia coli Saccharonyces cerevisiae D. discoideum Caenorhabditis elegans 4,2 x 106 1,3 x 107 5,4 x 107 8,0 x 107

Drosophila melanogaster 1,4 x 108 Gallus domesticus Xenopus laevis Homo sapiens 1,2 x 109 3,1 x 109 3,3 x 109

40

Variacin de la cantidad de ADN (pb) en diferentes grupos de especies

Sin embargo, si dentro de cada familia de especies (por ejemplo los anfibios) elegimos la que tiene menor cantidad de ADN y comparamos este contenido con el de las especies de menor valor C dentro de cada familia o grupo filogentico (por ejemplo, aves, mamferos, peces, etc), encontramos que la cantidad de ADN aumenta con la complejidad evolutiva. Podra pensarse que para pertenecer a un determinado grupo taxonmico se necesita una cantidad mnima de ADN.

41

Especie con menor contenido en ADN de cada grupo taxonmico 2.81 La paradoja del valor C Surge cuando se compara la cantidad de ADN o tamao del genoma con las funciones para las que lleva informacin: La cantidad de ADN de una especie eucarionte es mucho mayor que la esperada para codificar enzimas o protenas. En la especie humana se estima que existen 100.000 genes diferentes que codifican protenas, el tamao medio de una protena es de 500 aminocidos (1.500 pares de bases), por tanto necesitaramos 1,5 x 108 pares de bases. La especie humana tiene 2,8 picogramos de ADN y cada picogramo equivale a 9,1 x 108 pares de bases (2,8 x 9,1 x 108 pares de bases = 25,48 x 108 pb). Por tanto, solamente alrededor de un 6% del ADN humano estara destinado a codificar protenas. Que funcin tendra el 94% restante?. Hoy sabemos que los genes en eucariontes son mucho ms largos que la secuencia necesaria para codificar una protena (existen intrones o zonas que no se traducen a aminocidos). Por tanto, disminuye la cantidad de ADN de funcin desconocida. Sin embargo, sigue existiendo una enorme cantidad de ADN cuya funcin no estara identificada. Por otro lado, existen especies con una complejidad evolutiva semejante que presentan una enorme variacin en la cantidad de ADN. Recuerde el ejemplo de los anfibios, en los que la cantidad de ADN varia entre 9 x 10 8 y 9 x 1010 pb. Es difcil creer que esta variacin pueda reflejar una diferencia de 100 veces en el nmero de genes necesarios para especificar dos especies de anfibios. Por consiguiente42

necesitamos otro tipo de explicacin. Una posible explicacin es como veremos la existencia de duplicaciones, genes que estn en ms de una copia en el genoma de los individuos. Esto nos lleva a considerar la existencia de distintos tipos de secuencias en el genoma de las especies eucariticas. TEMA 3. EUCROMATINA Y HETEROCROMATINA La cromatina o sustancia que compone los ncleos de las clulas y que resulta de la interaccin del ADN con las protenas histnicas, no histnicas y ARN; puede presentar distintos grados de empaquetamiento o contraccin. Cuando los cromosomas se tien con sustancias qumicas que se unen al ADN aparecen regiones densamente teidas y regiones menos densamente teidas. La cromatina mayoritaria, la que constituye la mayor parte del ncleo recibe el nombre de eucromatina y la minoritaria el de heterocromatina. La heterocromatina puede aparecer ms densamente teida que la eucromatina (heteropicnosis positiva) o menos densamente teida que la eucromatina (heteropicnosis negativa). La aplicacin de determinados tratamientos experimentales en combinacin con diferentes tipos de tincin de los cromosomas, puede producir la aparicin de zonas heterocromticas en los cromosomas de muchas especies.

Eucromatina (menos teida) y Heterocromatina (ms teida) Estas zonas heterocromticas presentan una distribucin caracterstica o patrn de bandas tpico de cada cromosoma que permite identificar cromosomas distintos. Estas tcnicas reciben el nombre de tcnicas de bandeo cromosmico y son43

enormemente tiles en la identificacin individual de los cromosomas y en la construccin de cariotipos. La eucromatina y la heterocromatina son ADN pero presentan algunas diferencias:

Diferencias genticas: Los experimentos de construccin de mapas demuestran que la mayor parte de los genes activos se localizan en la eucromatina. En los nucleos interfsicos, la eucromatina se tie menos densamente debido al menor grado de empaquetamiento, en general se acepta que este es el estado ms compatible con la actividad gnica y la transcripcin. La heterocromatina se encuentra en muchos organismos flanqueando las regiones cntromericas, algunas veces tambien se encuentra en regiones telomricas, e incluso se ha observado en algunos casos la existencia de cromosomas completos heterocromticos, por ejemplo, el cromosoma Y de Drosophila melanogater. La funcin de la heterocromatina no es an conocida, se han detectado muy pocos genes activos en la heterocromatina, en Drodophila existen mutaciones letales en genes que se localizan en regiones heterocromticas, por tanto, estos genes deben poseer alguna actividad. En cualquier caso, el porcentaje de genes activos localizados en regiones heterocromaticas es muy bajo comparado con el de genes activos situados en la eucromatina. La principal diferencia entre la eucromatina y la heterocromatina radica por tanto en la actividad de estos dos tipos de cromatina.

Diferencias citolgicas: A nivel estructural, en los nucleos interfsicos, existe un mayor grado de enrollamiento o empaquetamiento en la heterocromatina que en la eucromatina. La forma en la que se mantiene esta diferencia aun no es conocida. Alociclia: la heterocromatina sigue un ciclo de condensacin y

descondensacin distinto a la eucromatina. La heterocromatina puede aparecer ms intensamente teida que la eucromatina o menos intensamente teida dependiendo del estado celular (alociclia). La alociclia a su vez esta relacionada con la replicacin del ADN. La heterocromatina se replica ms tarde que la eucromatina. A su vez es posible distinguir dos clases de heterocromatina:44

- Heterocromatina constitutiva: cromatina que aparece siempre ms intensamente teida que la eucromatina (heteropicnosis positiva), o menos intensamente teida que la eucromatina (heteropicnosis

negativa), independientemente del estado de desarrollo o fisiolgico. Un ejemplo es el ADN satlite de las regiones centromricas.

Heterocromatina

constitutiva:

regiones

cercanas a los centrmeros

- Heterocromatina facultativa: cromatina que aparece ms intensamente teida que la eucromatina, o menos intensamente teida que la eucromatina dependiendo del estado fisiolgico o del momento de desarrollo. El cromosoma X, en algunas especies animales, como el

saltamontes Schistocerca gregaria, aparece ms intensamente teido que el resto de los cromosomas durante la Diplotena de la Profase I de meiosis.

Saltamontes: heteropicntico positivo45

XInterfase: Cromatina sexual, X inactivo en la mujer (cuerpo de Barr)

En la especie humana, todos los cromosomas X que estn en exceso de uno aparecen ms intensamente teido que el resto de los cromosomas (heteropicnosis positiva) en los ncleos de clulas en interfase. Por tanto, las mujeres normales que tienen dos cromosomas X, tienen un cromosoma X que aparece ms intensamente teido y que est inactivado. Sin embargo, durante las primeras etapas del desarrollo embrionario (durante los 16 primeros das de gestacin en la especie humana) ambos cromosomas X son activos.

Diferencias en las secuencias: En algunas especies eucariontes, el ADN satlite o ADN minoritario que presenta un contenido en G+C distinto al ADN principal o mayoritario, est constituido por unas secuencias cortas de ADN que estn repetidas millones de veces. En concreto en ratn se ha demostrado que el ADN satlite esta localizado en la zona centrmerica, este ADN satlite constituye un ejemplo de heterocromatina constitutiva cuya presencia y accin es constante en el cromosoma.

TEMA 4. ESTRUCTURA EXTERNA DE LOS CROMOSOMAS: FORMA, TAMAO Y NMERO El estudio de la estructura externa de los cromosomas de cualquier especie eucaritica consiste en analizar la forma tamao y nmero de los cromosomas que posee. El mejor momento para llevar a cabo dicho estudio suele ser aquel en el que los cromosomas han alcanzado su mximo grado de contraccin y tienen sus bordes perfectamente definidos. Dicho momento suele ser la metafase mittica. El estudio de la estructura externa de los cromosomas culmina con la obtencin del cariotipo. Naturalmente, los cromosomas se pueden estudiar en distintos momentos segn la especie y dependiendo de los objetivos planteados. Algunas especies tienen cromosomas que se pueden observar con gran detalle en interfase, tal es el caso de Drosophila melanogaster, que posee cromosomas politnicos gigantes que se observan en las glndulas salivales de dicho insecto y el deChironomus tentans otro diptero.

46

Cromosomas (interfsicos) 4.1 Forma

Politnicos

de

Chironomus

tentans

En metafase mittica los cromosomas ya han pasado por un periodo de sntesis de ADN y estn constituidos por dos cromatidios o

cromatidas idnticas en grosor y longitud. Los cromosomas en estado de dos cromatidios han alcanzado su mximo grado de contraccin y estn en el centro de la clula, en la placa ecuatorial. La forma de los cromosomas viene determinada por la posicin del centrmero o constriccin primaria, regin por la que los cromatidios interaccionan con las fibras del huso acromtico para separarse a polos distintos. El centrmero aparece menos teido que el resto del cromosoma. La mayora de los cromosoma de las especies eucariticas tienen el centrmero localizado en una regin concreta.

Existen cromosomas Metacntricos, con el centrmero en el centro que divide al cromosoma en dos brazos iguales, existen cromosomas Submetacntricos, con el centrmero desplazado hacia un lado que lo divide al cromosoma en dos brazos, uno47

un

poco

ms

largo

que

el

otro;

hay

cromosomas Subtelocntricos oAcrocntricos que tienen el centrmero situado hacia el extremo dividiendo al cromosoma en dos brazos muy desiguales, uno bastante largo y el otro muy corto, y por ltimo hay cromosomas Telocntricos que tienen el centrmero en un extremo y, por consiguiente poseen un solo brazo. Un cromosoma metafsico tpico est constituido por dos cromatidios hermanos idnticos (en groso, longitud y con igual informacin gentica), dichos cromatidios contienen un centrmero y telmeros en el extremo. Los extremos de los cromatidios poseen una estructura caracterstica denominada Telmero, un cromosoma metacntricos presenta telmeros al final de los dos brazos (en ambos extremos), mientras que un cromosoma telocntrico tiene telmeros al final de su nico brazo (en un extremo), por el otro extremo se encuentra en centrmero. Existen especies que tienen cromosomas con el centrmero difuso, situado a todo lo largo del cromosoma, sin localizar en un solo punto concreto.

Algunos cromosomas eucariticos, adems de la constriccin primaria o centrmero, poseen constricciones secundarias, la ms importante es la Regin Organizadora del Nucleolo (abreviadamente NOR), dicha zona contiene la informacin para producir el ARN-ribosmico y aparece menos teida que el resto del cromosoma. Los cromosomas con NOR en muchos casos tienen despus de la regin NOR, entre est y el telmero un segmento ms o menos grande que se denomina Satlite o Trabante (no confundir con el ADN satlite).

48

En el caso de la especie humana, existen cinco pares de cromosomas que poseen regiones NOR, los pares 13, 14, 15, 21 y 22.

Metafase mittica de Vicia Faba (2n=12)

Metafase mittica de un hombre (2n=46)

4.2Tamao Los cromosomas sufren grandes variaciones en su tamao a lo largo del ciclo celular, pasando de estar muy poco compactados (interfase) a estar muy compactados (metafase), por tal motivo, los estudios sobre el tamao suelen realizarse en metafase mittica. Adems, es necesario tener en cuenta que los tratamientos para teir los cromosomas y para obtener las metafases mitticas influyen de manera muy importante en el tamao de los cromosomas. En cualquier caso, en general es posible decir que hay especies eucariticas con cromosomas grandes y especies con cromosomas pequeos. Las monocotiledneas (vegetales) y49

los anfibios y ortpteros (animales) poseen cromosomas muy largos (10 a 20 micras). Las dicotiledneas, las algas, los hongos y la mayora de las especies animales poseen cromosomas pequeos (longitud inferior a 5 micras). Naturalmente, existen algunas excepciones en los ejemplos citados. El cromosoma 1 humano tiene 0,235 pg de ADN, que equivalen a una longitud total de ADN doble hlice 7,3 cm y en metafase mittica presenta una longitud aproximada de 0,001 cm. 4.3 Nmero Las clulas somticas de la mayora de las especies eucariticas tienen dos juegos de cromosomas, se trata de especies diploides, con un juego de cromosomas materno y otro paterno. El nmero de cromosomas se denomina nmero diploide y se representa como 2n. El nmero de cromosomas de un juego cromosmico y que se corresponde con el nmero de cromosomas de un gameto de la especie se le denomina nmero haploide y se representa como n. Todos los cromosomas de las clulas somticas aparecen por parejas de cromosomas homlogos (uno procedente del padre y otro de la madre) existiendo por tanto n parejas de homlogos. Los dos cromos omas homlogos tienen informacin para los mismos tipos de genes, aunque no poseen idntica secuencia de bases nitrogenadas, ya que en un posicin determinada o locus puede encontrase la informacin que determina el color azul de ojos mientras que en el homlogo puede existir informacin para el color marrn. Sin embargo, los dos cromatidios hermanos de un mismo cromosoma poseen exactamente la misma informacin gentica (la misma secuencia de bases nitrogenadas). El nmero de cromosomas 2n vara mucho de unas especies a otras y no existe relacin entre el nmero de cromosomas, existen especies vegetales con pocos cromosomas como Haplopappus gracilis (2n=4), Crepis capillaris (2n=6) y Secale cereale (2n=14), especies vegetales con bastantes cromosomas

como Triticum aestivum (2n=42) y especies vegetales con muchos cromosomas como Ophioglossum petiolatum (n >500). En animales sucede algo semejante, hay especies con pocos cromosomas como la hormiga australiana Myrmecia

pilosula cuyos machos tienen un cromosoma (2N01) y las hembras dos cromosomas (2n=2), especies con bastantes cromosomas como la humana Homo

sapiens (2n=46) y especies con muchos cromosomas como el lepidoptero Lysandra atlantica (2n=434-466). No existe ninguna relacin entre el nmero de cromosomas 2n y la complejidad evolutiva, ni entre el nmero de cromosomas y la cantidad de ADN. Un ejemplo claro de esta situacin es el de los ciervos del gneroMuntiacus en50

el que hay especies muy similares (denominadas especies gemelas) una con 2n=6 (M. muntjak) y otra con 2n=46 (M. reevesi).

Muntiacus muntjak

Cariotipo 2n=6

Muntiacus reevesi

Caritotipo 2n=46

Nmero diploide de diferentes especies animales y vegetales N Organismo Cromosomas Organismo (2n) Hombre, Homo sapiens Chimpanc, Pan troglodytes Mono mulata Caballo, Equus caballus51

N Cromosomas (2n) Roble alba Pino ponderosa Cerezo cerasus Col oleracea (repollo), Brassica cido, Prunus amarillo, Pinus blanco, Quercus 24

46

48

24

rhesus, Macaca

48

32

64

18

Asno, Equus asinus Perro, Canis familiaris

62 78

Rbano, Raphanus sativus 18 Guisante de jardn, Pisum sativum Guisante, Lathyrus odoratus Frijol, Phaseolus vulgaris Pepino, Cucumis sativus Algodn, Gossypium hirsutum Patata, Solanum tuberosum Tomate, Solanum lycopersicum Tabaco, Nicotiana tabacum Trigo aestivum candeal, Triticum 14

Gato, Felis domesticus Ratn musculus Rata, Ratus norvegicus Zarigeya, Didephys virginiana Pollo, Gallus domesticus domestico, Mus

38

14

40 42 22

22 14 52

78

48

Pavo, Meleagris gallopavo 82

24

Rana, Rana pipiens

26

48

Platypoecilus maculatus Estrella de mar, Asterias forbesi Gusano de seda, Bombix mori Mosca domestica, Musca

48

42

36

Trigo duro, Triticum durum 28

56

Cebada, Hordeum vulgare 14

domestica Mosca fruta, Drosophila

12

Centeno, Secale cereale

14

melanogaster Mosquito, Culex pipiens Cucaracha, Blatta germanica Cangrejo ermitao, Eupagurus52

8

Arroz, Oryza sativa Boca de

24

6

dragn, Anthirrinum majus Levadura, Saccharomyces cerevisiae Alga verde, Acetabularia

16

23, 24

18

254

mediterranea

20

ochotensis

Tabla tomada del libro de Gentica Moderna (F. J. Ayala y J. A. Kiger). Ed. Omega. 1984.

53

4.4 El Cariotipo El cariotipo de una especie se obtiene cuando a partir de varias clulas en metafase mittica de muchos individuos distintos de la especie se determina el nmero, forma y tamao de los cromosomas. En las especies diploides, como la especie humana, el nmero de cromosomas normal (el ms frecuente) es 2n=46, de manera que existen 22 pares deautosomas y un par de cromosomas sexuales. Como se trata de una especie diploide, con dos juegos de cromosomas (dos genomios), uno de origen materno (23 cromosomas) y otro de origen paterno (23 cromosomas), todos los cromosomas estn por parejas de homlogos. Genomio: el conjunto de los n cromosomas distintos de una especie. Una vez fijado el nmero cromosmico normal, se procede a elegir la mejor clula disponible de una metafase mittica en la que todos los cromosomas estn bien definidos y separados. Seguidamente se realiza una foto de dicha clula y despus se recortan todos los cromosomas. Una vez recortados todos los cromosomas, se ordenan por parejas con el brazo corto hacia arriba, posteriormente se ordenan por tamaos (de mayor a menor) y dentro de un tamao semejante por la posicin del centrmero ( de metacntricos a submetacntricos, acrocntricos y telocentricos). En el caso de existir cromosomas sexuales diferenciados, como sucede en la especie humana, los cromosomas sexuales ( X e Y) pueden colocarse en el grupo que les corresponde por tamaos o bien pueden colocarse formando el par sexual separados de los autosomas (cromosomas no sexuales). Cuando no existan las tcnicas de bandeo cromosmico era muy difcil diferenciar unas parejas cromosmicas de otras en algunas especies, ya que el nico criterio para ordenarlos era el tamao y la posicin relativa del centrmero (longitudes relativas de cada brazo).

54

Metafase bandear

mittica

de

un

varn

sinMetafase mittica de un varn con bandas G

Sin embargo, con las tcnicas de bandeo cromosmico que se desarrollaron posteriormente fue mucho ms fcil identificar los diferentes pares de cromosomas.

Cariotipo de un varn normal (Bandas G)

Idiograma humano (bandas G)

Caritipo: Ordenacin de los cromosomas por parejas, tamao y posicin del centrmero. Idiograma: Representacin esquemtica mediante un dibujo a escala, que incluya las bandas e interbandas, del cariotipo de una especie. Tcnicas de Bandeo cromosmico: Existen diferentes sistemas de tratamiento y de tincin de los cromosomas que permiten obtener una secuencia caracterstica de bandas e interbandas transversales sobre los cromosomas. Las tcnicas de bandeo55

ms frecuentes suelen ser las bandas G (Giemsa) bandas C, Bandas R, Bandas Q, etc. El desarrollo de estas tcnicas ha permitido identificar cromosomas que no era posible distinguir con los mtodos convencionales de tincin (no producen bandas transversales). Inclusive permiten distinguir anomalas cromosmicas, como translocaiones (intercambios de segmentos entre cromosomas), deleciones (prdidas de segmentos, etc). Tambin es posible utilizar tcnicas de hibridacin "in situ" mediante fluorescencia (FISH) para identificar cromosomas.

FISH Gc-1R) TEMA

de Aegilops

speltoides (clon Translocaciones con bandas C

5.

ESTRUCTURA

INTERNA

DE

LOS

CROMOSOMAS:

CROMATIDIO, CENTRMEROS, TELMEROS Y ORGANIZADOR NUCLEOLAR Cromatidio: El cromatidio es una doble hlice de ADN lineal. Existen experimentos, realizados en Vicia faba, en los que se demuestra que en la replicacin el cromatidio se comporta como una doble hlice de ADN (Taylor y col. 1957). Los cromosomas pueden estar en estado de un solo cromatidio (perodo G 1, anafase y telofase) o bien en estado de dos cromatidos despus de haber pasado por el preodo de Sntesis (S) como sucede en el periodo G2, profase y metafase.

Molcula de ADN de Drosophila melanogaster (1,5 cm longitud). Cromosoma 156

Telmero: Son los extremos de los brazos cromosmicos y tienen una estructura especial (formacin de ADN cuadruplexo) que protege al cromosoma de su degradacin por los extremos y que adems permite la replicacin de los extremos cromosmicos mediante la actuacin de encimas especficas como las telomerasas. Los telmeros poseen extremos 3' monocatenarios (de una sola hlice) constituidos por una secuencia corta rica en Guanina que est repetida en tndem cientos de veces. En la siguiente tabla se indican algunas secuencias telomricas encontradas en humanos, protozoos, algas y vegetales:

Organismo Tetrahymena Paramecium Tripanosoma Arabidopsis Homo

Secuencia repetida 5' TTGGG 3' 5' TTGGGG 3' 5'TTAGGG 3' 5' TTTAGGG 3' 5' TTAGGG 3'

Modelo de estructura de los telmeros Centrmero: Zona por la que el cromosoma interacciona con las fibras del huso acromtico en las anafases mitticas y meiticas y que es responsable de los movimientos cromosmicos que tienen lugar durante estas fases. Las estructuras centromricas que interaccionan con las fibras del huso se denominan cinetocoros. En la estructura del centrmero tambin intervienen protenas centrmricas. Es la constriccin primaria y aparece menos teida que el resto del cromosoma. Los anlisis llevados a cabo enSaccharomyces cerevisiae (levadura) han permitido aislar el ADN centromrico (ADN CEN) de todos sus cromosomas, habindose encontrado57

que en todos los centrmeros estudiados existen tres regiones muy conservadas, en la siguiente tabla se indican dichas regiones: Regin pb) PuTCACPuTG I (8

Regin II (76-86 pb)

Regin III (25 pb)

rica en pares AT (87- TGTTT(T/A)TGNTTTCCGAAANNNAAAA 95%) Palndromo

El centrmero tiene un comportamiento diferentes durante la Anafase mittica y la Anafase-I de la meiosis, de manera que durante la Anafase mittica los cromatidios hermanos se separan a polos opuestos (Segregacin Anfitlica) mientras que en la Anafase-I de la meiosis lo que se separa a polos opuestos son los cromosomas homlogos completos, cada uno constituido por dos cromatidios (Segregacin Sintlica).

Segregacin Anfitlica

Segregacin Sintlica

Crommero: son regiones ms condensadas de los cromosomas que se observan al microscopio como partculas discretas y que suelen verse con mayor claridad en determinados estados celulares, como por ejemplo, en paquitena de la Profase-I meitica en algunas especies. TEMA 6. ORGANIZACIN DEL MATERIAL HEREDITARIO EN SECUENCIAS: NICAS, REPETIDAS, MODERADAMENTE REPETIDAS Y ALTAMENTE

REPETIDAS Los virus y las bacterias presentan secuencias que en su inmensa mayora estn una sola vez en el genoma. Las bacterias poseen algunos genes que estn

58

repetidos muy pocas veces, entre 5 y 10, como los genes que llevan informacin para el ARN ribosmico (ARN-r). Los estudios de la cintica de renaturalizacin o reasociacin ( curvas Cot) ponen de manifiesto, como ya hemos visto, que los virus y bacterias presentan curvas Cot ideales correspondientes a ADN sin secuencias repetidas. Sin embargo, las curvas Cot de organismos eucariontes revelan a existencia de distintos tipos de secuencias que varan en el grado de repeticin.

Tipos de secuencias de los organismos eucariticos Los distintos tipos de secuencias que se observan en el ADN de organismos eucariticos son los siguientes: 6.1 Secuencias Unicas

Genes o secuencias de copia nica. En general, la mayor parte de los genes que codifican para polipptidos, los llamados genes estructurales, se encuentran en una sola copia en el genoma.

6.2 Secuencias Repetidas

Secuencias o genes que estn repetidas pocas veces. Se trata de genes o secuencias funcionales que codifican para protenas relacionadas y que se han originado por duplicacin de secuencias individuales y una posterior

59

evolucin divergente (las mutaciones afectan de forma diferente a las dos copias existentes de la secuencia). Suelen ser familias de genes y de pseudogenes relacionados. Los pseudogenes (y ) son secuencias de ADN que debido a mutaciones han dejado de ser funcionales y que por tanto no se transcriben. El mejor ejemplo de este tipo de familias de genes son los que llevan informacin para los polipptidos o cadenas de globina (a, b, d, g, y e) que forman las hemoglobinas humanas. En este grupo tambin se pueden incluir las familias de genes dispersas por el genoma. Algunos tipos de protenas estn codificadas por familias de genes homlogos distribuidas por todo el genoma. Tales familias puede estar formadas por unos pocos o por muchos genes. Algunos ejemplos son: los genes que codifican para la actina (de 5 a 30 copias), las keratinas (ms de 20 copias), la cadena pesada de la miosina (de 5 a 10 copias), las tubulinas (de 3 a 15 copias) y las protenas de la cubierta del huevo de los insectos (50 copias). Dentro de este grupo tambin podran incluirse los genes que llevan informacin para el ARN transferente (ARN-t), en Saccharomyces existen de 5 a 7 copias de cada uno de los 61 ARN-t diferentes y en D. melanogaster unas 13 copias de cada ARN-t. Los genes de una familia, al igual que los genes para las cadenas de globina, pueden diferir algo en su secuencia y tambin en su funcin.

Familias de genes de las globinas humanas

60

6.3 Secuencias Moderadas

Secuencias moderadamente repetidas. Familias de secuencias repetidas en tndem. En este caso, se trata de genes que existen en varias copias esencialmente idnticas que derivan por duplicacin de secuencias ancestrales. Se trata de genes funcionales y las copias son idnticas tanto en secuencia como en funcin. La existencia de este tipo de genes permite a los organismos generar una gran cantidad de determinados productos en poco tiempo. Algunos ejemplos de este tipo de secuencias son:

- ADN-r: los genes que llevan informacin para el ARN-r , que se encuentran localizados en una zona concreta de los cromosomas que es el Organizador nucleolar (NOR). Esta zona aparece menos teida que el resto del cromosoma (heteropicnosis negativa). En D. melanogaster existen unas 130 copias de estos genes, enXenopus laevis alrededor de 400 a 500 copias por genoma haploide. En algunos organismos como Neurospora crassa se encuentran dispersos por el genoma en vez de en tndem. - ADN-5S: los genes que codifican para el ARN-5S que forma parte de la subunidad grande de los ribosomas. En D. melanogaster existen 200 copias, en Xenopus laevis 25.000 y en la especie humana 2.000. - ADN-t: Los genes que codifican para los ARN-transferentes encargados de transportar los aminocidos durante el proceso de traduccin. - ADN-h: genes para las histonas: aparecen en familias o cluster que incluyen los cinco genes (H1, H2A, H2B, H3 y H4) y que estn repetidas decenas de veces (Xenopus laevis) o centenas de veces (erizo de mar). - ADN-a: genes para anticuerpos o inmunoglobulinas. La regin variable de los anticuerpos o inmunoglobulinas (500 secuencias no idnticas entre si).

Tambin existen secuencias de ADN que se han originado por duplicacin de otras existentes, que derivan de familias multignicas en tndem (genes de histonas o genes para ARN-r) y que se encuentran aislados (separados de su familia) y dispersos por el genoma. Este tipo de secuencias recibe el nombre de Orfones.

61

Telmeros: secuencias repetidas con funcin conocida pero que no codifican para ningn ARN o protena. Los extremos de los cromosomas o telmeros tienen una secuencia de ADN repetida en tndem. Esta secuencia en el caso del ciliado Tetrahymena es TTGGGG y en humanos es TTAGGG. Esta secuencia esta repetida varias veces en el extremo de los cromosomas (telmero) y tiene la propiedad de aparearse consigo misma formando enlaces de hidrgeno entre guaninas (situacin inusual). Este autoapareamiento suministra un extremo 3 libre que permite la replicacin de los extremos de las molculas de ADN doble hlice lineal.

6.4 Secuencias Altamente Repetidas

Secuencias altamente repetidas y que carecen de funcin conocida. Son secuencias cortas de ADN repetidas entre 1.000 y 1.000.000 de veces y las copias no son totalmente idnticas.

- Secuencias centromricas altamente repetidas (1.000.000 de copias) que suelen agruparse en zonas concretas de los cromosomas. El tamao de estas secuencias es variable, desde menos de 10 pares de bases por repeticin hasta 200 300 pb. En Drosophila melanogaster la secuencia AATAACATAG este repetida en tndem en regiones prximas al centrmero. Dado que que estas secuencias cortas de 10 pb no son representativas del genoma de una especie, suele suceder que su contenido en G+C es diferente al contenido en G+C del resto del genoma. Esta causa hace que cuando se centrifuga en gradiente de densidad (ClCs) el ADN de una especie eucarionte, aparezca una banda principal que contiene la mayor parte del ADN de la especie y una banda satlite (minoritaria) que est formada por una secuencia corta de ADN repetida en tndem. El ADN satlite en algunas especies tiene mayor densidad que el ADN principal (mayor contenido en G+C) y en otras especies tiene menor densidad y, por tanto, menor contenido en G+C que el ADN principal. Cuando el ADN satlite de ratn se marca radiactivamente y se realiza una hibridacin in situ con el ADN de cromosomas metafsicos mitticos, se observa que el marcaje radiactivo (hibridacin) se produce en regiones prximas al centrmero. Los cromosomas de ratn son telocntricos.

62

ADN

satlite

de

ratn

localizado

en

regiones

centromricas

- Secuencias repetidas del orden de miles de veces y dispersas por el genoma entre las secuencias de copia nica. Algunos ejemplos de estas secuencias son: - VNTRs: Secuencias repetidas en tndem un nmero variable de veces. Se trata de unas secuencias cortas (entre 10 y 100 pb) que pueden estar repetidas por ejemplo 5 veces en un lugar concreto del cromosoma (locus) y estar repetida 4 veces en otro locus distinto y 7 veces en otra posicin. El nmero de veces que esta repetida vara de un lugar a otro del mismo cromosoma y entre cromosomas distintos. Tambin vara de unos individuos a otros. Este tipo de secuencias se llaman tambin minisatlites .En la especie humana, la primera secuencia VNTR fue descrita por A. Jeffries y era una secuencia de 33 pb encontrada en el interior del primer intrn del gen de la mioglobina. Gracias a la existencia de este tipo de secuencias se han desarrollado tcnicas que permiten identificar con un gran poder el ADN de dos personas diferentes. Estas tcnicas se llaman huellas dactilares de ADN y se emplean en estudios de medicina forense. Tambin hay VNTRs en los que el tamao de la secuencia que se repite es ms pequeo (entre 1 y 10 pb) y que se denominanmicrosatlites, los microsatlites ests distribuidos (dispersos) de manera uniforme sobre los cromosomas, mientras que los minisatlites tienden a concentrarse cerca e los telmeros.

63

VNTRs: Secuencias repetidas en tndem en nmero variable - Transposones: tambin es posible encontrar en los genomas de especies eucariontes secuencias o elementos que pueden cambiar de posicin dentro del genoma, transposones. Algunos genomas muestran mltiples copias de estos elementos genticos mviles, o versiones truncadas de ellos dispersas a lo largo del genoma. Algunos ejemplos son: - Retrotransposones: Secuencias que se han dispersado en el genoma despus de una transcripcin inversa a partir de ARN. La transcriptasa inversa es una enzima que produce ADN tomando como molde ARN. Posteriormente estas copias de ADN pueden ingresar en los cromosomas. Un ejemplo son las secuencias Alu humanas, llamadas as por contener generalmente en su interior una diana para la endonucleasa de restriccin Alu. El genoma humano contiene cientos o miles de secuencias completas o parciales Alu que se localizan en el interior de intrones y entre genes. Esta secuencia Alu tiene una longitud de 200 pb y representa el 5% del genoma humano. Tienen un importante parecido con el ARN-7S y se piensa que se han producido a partir de l por transcripcin inversa. Las secuencias cortas interpuestas como las Alu se han denominado genricamente

como SINEs (elementos interpuestos cortos). - Secuencias que muestran homologa con retrovirus, virus ARN que se replican produciendo ADN que se integra en los cromosomas. Un ejemplo son los elementos copia64

de Drosophila (secuencia

de

5

Kb

repetida

50

veces)

y

los

elementos Ty (secuencia de 6 Kb repetida 30 veces) de levaduras. En mamferos se han descrito secuencias de 1 a 5 Kb repetidas de 20.000 a 40.000 veces por genoma humano y que se han denominado LINEs (elementos interpuestos largos).

ADN espaciador: la funcin de este tipo de secuencias no es conocida, posiblemente sea simplemente separar a los genes. Se encuentran por ejemplo entre los genes de histonas y son en este caso secuencias ricas en pares A-T.

TEMA 7. ADN DE MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS Los organismos eucariontes adems de poseer ADN en el ncleo, tambin tienen ADN en orgnulos citoplsmicos. Las especies vegetales contienen en el citoplasma de sus clulas cloroplastos y mitocondrias, mientras que las clulas de especies animales contienen mitocondrias en su citoplasma. Al igual que el ADN nuclear est organizado en cromosomas, tambin el ADN de los orgnulos citoplsmicos est organizado en cromosomas. 7.1 ADN Mitocondrial. El ADN mitocondrial (ADNmt) es una molcula doble hlice circular cuyo tamao vara de unas especies a otras. El tamao del ADN miotocondrial es las especies animales es inferior al de las especies vegetales y oscila entre 15 y 18 Kpb. En los hongos oscila entre 18 y 78 Kpb y en las plantas vara entre 250 y 2.500 Kpb. El ADNmt humano tiene 16.800 pb. Una clula tpica de levadura puede tener de 1 a 45 mitocondrias en su citoplasma, cada mitocondria posee entre 10 y 30 nucleoides, y a su vez cada nucleoide est constituido pos 4 5 molculas de ADNmt doble hlice circular. Por tanto, una clula de levadura puede llegar a tener en su interior 45 x 30 x 5 = 6750 molculas de ADNmt doble hlice. El nmero de mitocondrias de las clulas humanas varia de unos tejidos a otros y dentro de cada mitocondria hay un nucleoide que contiene 5 molculas ADNmt doble hlice circular.

65

Mitocondria

Organismo gracilis

unicelular:

Euglena

El ADN mitocondrial de mamferos se replica de forma semiconservativa pero de manera particular, ya que existen dos orgenes de replicacin diferentes, uno para la hlice H (pesada) y otro para la hlice L (ligera). La sntesis de ambas hlices no se lleva a cabo al mismo tiempo, primero comienza replicndose de forma unidireccional la hlice H y ms adelante y con un origen de replicacin distinto se inicia la replica unidireccional de la hlice L en sentido opuesto al de la hlice H. La replicacin del ADNmt sigue lo que se denomina mecanismo de replicacin de lazo D o lazo de desplazamiento. 7.2 ADN de cloroplastos. El ADN de cloroplastos (ADNcp) de las clulas de plantas es una molcula doble hlice circular que posee un tamao que vara entre 120 y 160 Kpb. En algas verdes el rango de variacin es mayor, oscila entre 85 y 292 Kpb, con la excepcin de Acetabularia cuyo ADNcp tiene 2.000 Kpb.

Cloroplasto66

Los cloroplastos presentan regiones que se tien intensamente con colorantes de ADN, dichas regiones se denominan nucleoides. El nmero de cloroplastos vara de unas clulas a otras dentro de la misma especie y de unas especies a otras. Las clulas de hojas de la remolacha contienen en su citoplasma alrededor de 40 cloroplastos, cada cloroplasto posee entre 14 y 18nucleoides y cada nucleoide puede estar constituido por 4 a 8 molculas de DNcp. Por tanto, una clula de remolacha puede llegar a contener 40 x 18 x 8 = 5760 molculas de ADNcp doble hlice circular. En maz se estime que existen entre 20 y 40 mleculas de ADNcp doble hlice circular por cada cloroplasto. En Chlamydomonas reindardii existe un solo cloroplasto por clula que contiene entre 500 y 1500 mleculas de ADNcp doble hlice circular empaquetadas en varios nucleoides. Teora endosimbionte: los antepasados de las mitocondrias y los cloroplastos seran organismos procariticos unicelulares. Los antepasados de las mitocondrias seran las bacterias y los de los cloroplastos seran por ejemplo las cianobacterias. Tanto las mitocondrias como los cloroplastos poseen un cromosoma mucho ms pequeo que el de sus antepasados procariontes, de manera que durante la evolucin se ha reducido drsticamente el tamao del genoma de los orgnulos citoplasmas en un perodo relativamente breve a partir de su origen endosimbionte. TEMA 8. SIGNIFICADO BIOLGICO DE LA MITOSIS Todos los organismos vivos utilizan la divisin celular, bien como mecanismo de reproduccin, o como mecanismo de crecimiento del individuo. Lo seres unicelulares utilizan la divisin celular para la reproduccin y perpetuacin de la especie, una clula se divide en dos clulas hijas genticamente idnticas entre s e idnticas a la original, manteniendo el nmero cromosmico y la identidad gentica de la especie. En organismos pluricelulares la divisin celular se convierte en un proceso cclico destinado a la produccin de mltiples clulas, todas idnticas entre s, pero que posteriormente pueden derivar en una especializacin y diferenciacin dentro del individuo. Desde un punto de vista puramente evolutivo un organismo unicelular es simplemente una estructura dentro de la cual se realizan las funciones vitales bsicas de nutricin y reproduccin. Las nicas presiones selectivas son67

la

adquisicin de alimento y las fuerzas de tensin superficial. El organismo unicelular debe por tanto aislarse del medio mediante una membrana o pared que le permita adquirir alimento a la vez que soporte las fuerzas de tensin superficial del medio en que se desarrolla. Dic