451 Anaacutelisis microbioloacutegico del agua -

1048713 Paraacutemetros bioloacutegicos del aguahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1048713 Determinacioacuten de microorganismos aerobios mesoacutefilos1048713 Determinacioacuten de Coliformes Totales y Fecales helliphelliphellip1048713 Determinacioacuten de Estreptococos Fecaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1048713 Determinacioacuten de Clostridios Sulfito Reductoreshelliphelliphelliphellip1048713 Conclusiones del anaacutelisishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Paraacutemetros bioloacutegicos del aguaEl agua es un recurso natural necesario para el desarrollo de un gran nuacutemero de actividades humanas Su creciente degradacioacuten por disminucioacuten de su calidad implica la reduccioacuten del nuacutemero de usos que se le da es por ello lo que se hace necesario la realizacioacuten de estudios que permitan determinar la calidad de ese agua Los anaacutelisis que se pueden realizar al agua para controlar su calidad son fiacutesicos quiacutemicos y microbioloacutegicos en esta ocasioacuten se haraacute una determinacioacuten microbioloacutegica

Todos los organismos que se encuentran en el agua son importantes en el momento de establecer el control de la calidad de la misma sin considerar si tienen su medio natural de vida en el agua o pertenecen a poblaciones transitorias introducidas por el ser humano si su crecimiento lo propician los nutrientes presentes en el escurrimiento natural y en aguas residuales municipales o lo frenan los venenos procedentes de la actividad agriacutecola o industrial y si tienen capacidad para intoxicar a las personas y a los animales superiores

Se debe conocer la forma de los patoacutegenos hiacutedricos y determinar su presencia y origen la magnitud y oscilacioacuten de su nuacutemero el curso de su ciclo vital y el iacutendice de su supervivencia Los paraacutemetros bioloacutegicos en las aguas potables son de mucho intereacutes los microorganismos que puede haber en el agua son virus bacterias hongos algas y protozoos Aquellos que son inocuos para el hombre no tienen significacioacuten sanitaria por lo que el control microbioloacutegico del agua se va a centrar en las especies patoacutegenas para el hombre Dado que buscar todo tipo de microorganismos patoacutegenos por su diversidad es costoso y complicado y como la relacioacuten patoacutegenosno patoacutegenos es muy pequentildea se realiza un control del agua a traveacutes de indicadores microbioloacutegicos de contaminacioacuten

Hay muchos seres vivos que se emplean como indicadores de la calidad de un agua Asiacute seguacuten predominen unos organismos u otros podremos saber el estado de un agua

Para que un microorganismo sea considerado como indicador microbioloacutegico ha de reunir unas condiciones que son

lowast Debe ser incapaz de desarrollarse en el agualowast Debe tener una supervivencia en el agua superior a los organismos patoacutegenoslowast Debe soportar mejor a los desinfectanteslowast Deben ser faacuteciles de aislar identificar y contarlowast Deben ser muy abundantes en heces y escasos en otros medios

La normativa recoge una serie de anaacutelisis microbioloacutegicos seguacuten se efectuacutee sobre el agua un anaacutelisis miacutenimo Coliformes Totales y Fecales uno normal los anteriores maacutes bacterias aerobias a 37 ordmC Estreptococos Fecalesy Clostridios Sulfito-Reductores o completo los anteriores maacutes aerobias a 22ordmC microoganismos paraacutesitos yo patoacutegenos el anaacutelisis realizado ha sido el normal

El agua problema procede de un manantial vamos a realizar un anaacutelisis microbioloacutegico normal y el objetivo va a ser determinar la contaminacioacuten microbioloacutegica que puede existir buscar las causas de esa contaminacioacuten y proponer soluciones al problema

Determinacioacuten de microorganismos aerobios mesoacutefilosSe determinaraacuten estos microorganismos que son los que se encuentran a temperatura ambiente en el agua

ProcedimientoEl meacutetodo consiste en filtrar a vaciacuteo una determinada cantidad de aguaque va a ser de 100 mL sobre una membrana filtrante esteacuteril depositada con la cuadriacutecula hacia arriba

Una vez filtrada el agua se retira la membrana y se deposita con pinzas esteacuteriles sobre una placa Petri con medio PCA se incuba 37 ordmC 24 -48 horas

Tras la incubacioacuten se realiza un recuento de las colonias aparecidas expresaacutendose el resultado en ufc en 100 mL

Resultados obtenidos recuento de coloniasAl transcurrir el periacuteodo de incubacioacuten establecido se saca la placa de Petri de la estufa y se recuentan las colonias crecidas El nuacutemero de colonias aparecidas es 270 ufc por cada 100 mL de agua problema

Determinacioacuten de Coliformes Totales y FecalesLos Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales capaz de fermentar la lactosa a 44ordm C en vez de 37 ordmC como lo hacen los totalesAproximadamente el 95 del grupo de los Coliformes presentes en heces estaacuten formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacioacuten fecal Eacutestos uacuteltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas maacutes elevadas Esta es la caracteriacutestica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeoteacutermicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgaacutenica pH humedadhellip Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacioacuten fecal Su presencia se interpreta como una indicacioacuten de que los organismos patoacutegenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua se halla exenta de organismos productores de enfermedades

ProcedimientoVamos a seguir el mismo meacutetodo para la determinacioacuten de los dos tipos de Coliformes lo uacutenico que variaraacute seraacute la temperatura de incubacioacuten de cada determinacioacuten que para los Coliformes Totales seraacute de 37 ordmC y para los fecales ha de ser de 44 ordmC

Prueba presuntivaPara determinar estos Coliformes se va a utilizar el medio de cultivo BGBB (dispuesto en tubo) que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de losColiformes a la vez que permite que eacutestos crezcan sin restriccioacuten se distribuye el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno de medio de cultivo y echando 10 ml de el agua a la primera serie de tubos 1 ml de agua a la segunda serie y 01 ml a la tercera Colocaremos en cada tubo una campana Durham para recoger el gas producido y al medio de cultivo se le habraacute antildeadido un indicador aacutecido-baseEstos tubos se incuban a la temperatura correspondiente seguacuten se traten de Coliformes Totales oacute Fecales durante 24 horasLos Coliformes son lactosa positiva es decir son capaces de fermentar a la con produccioacuten de aacutecido y gas estos signos seraacuten los que buscaremosLa reaccioacuten seraacute positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham por lo menos en un 10 de su capacidad y el medio vira a color amarillo debido a formacioacuten de aacutecidoUna reaccioacuten positiva por deacutebil que sea indicaraacute la presencia y coliformes y habraacute que hacer las pruebas confirmativas de IMViCSe aplicaraacute la teacutecnica del nuacutemero maacutes probable (NMP)

Prueba confirmativa siembra en EMB LevineEn los tubos donde se introdujo 01 ml de agua problema o resultados positivos en la prueba presuntiva introduce un asa de siembra esteacuteril y se toma una porcioacuten que va a sembrarse en estriacutea en una placa Petri con medio EMB Levine El EMB Levine contiene eosina y azul de metileno que inhiben parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos ademaacutes la combinacioacuten de azul de metileno y eosina permitiraacuten diferenciar microorganismos lactosa positiva de los negativos

Se incuban los tubos 24 - 48 horas a la temperatura correspondiente seguacuten se trate de Coliformes Totales oacute Fecales

Los Coliformes apareceriacutean como violetas oscuros y si hubiera microorganismos lactosa negativos apareceriacutean como colonias incoloras

Pruebas IMViCLas bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae pueden identificarse a traveacutes de una serie de pruebas bioquiacutemicas que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metaboacutelica Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificacioacuten uno de los maacutes conocidos y utilizados corresponde al IMViC que se desarrolloacute para clasificar especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aeroacutebicas o anaeroacutebicas facultativas Gram negativos bacilares no esporoacutegenas que producen aacutecido y gas durante la fermentacioacuten de la lactosa) Consiste en las siguientes pruebas

- IndolEl triptoacutefano aminoaacutecido suministrado por una peptona adecuada se descompone en indol por accioacuten de algunos microorganismosLa praacutectica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando estaacute en presencia de agua de peptona El indol producidoes detectado por indol de kovacs que produce una coloracioacuten al reaccionar con eacutelSe coge con un asa de siembra colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptonaSe incuba horas a la temperatura correspondiente seguacuten se trate de Coliformes Totales oacute Fecales 24-48 horas pasado el tiempo de incubacioacuten se sacan los tubos de la estufa y se les antildeade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y se deja reposarSi aparece una coloracioacuten roja indica que la prueba es positiva el microorganismo produce indol

- Rojo de metiloEsta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampoacuten fosfatoDebido a la acidez producida el medio viraraacute de amarillo a rojo considerando la prueba positiva al antildeadir un reactivoEl procedimiento es el mismo que el del indol con la diferncia que en vez de antildeadir indol de kovacs antildeadimos Rojo de Metilo

- Voges ProskauerAlgunas bacterias producen acatilmetilcarbimol (producto intermedio en la degradacioacuten de la glucosa de los hidratos de carbono) que en presencia de KOH y aire se oxida para dar diacetilo que reacciona con α-naftol y un producto de descomposicioacuten de la arginina de la peptona para producir un color rojoEn un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias aparecidas en las placas EMB LevineSe incuba a 37 oacute 44 ordmC 24-48 horas luego se antildeade 1 mL de reactivo de Voges Proskauerque contiene α-naftol y KOH se antildeade seis gotas de reactivo oacutemehara y dos de reactivo de Barry se agita se deja reposar 10-15 minutos ysi aparece una coloracioacuten roja la prueba es positiva - CitratoEsta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como uacutenica fuente de carbonoEn un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estriacutea Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la produccioacuten de amoniacuteaco que lo alcaliniza) el microorganismo es citrato positivo

Tincioacuten de GramLa coloracioacuten de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciacioacuten morfoloacutegica y taxonoacutemica de las bacterias Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos seguacuten retengan o no el colorante de base usado en la tincioacuten que es el violeta de genciana o el cristal violetabull Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violetabull Las bacterias Gram negativas se tintildeen de rojo por el colorante usado como contrastador fuchina safranina

La diferencia entre unas y otras radica en la composicioacuten quiacutemica de la pared celular y su permeabilidad La pared de las Gram negativas es maacutes delgada y presenta un contenido en liacutepidos grasas diez veces superior que el de las Gram positivas lo cual dificulta la tincioacuten y la retencioacuten del colorante en el citoplasma

Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos una tincioacuten diferencial a continuacioacuten observamos con el microscopio

Resultado de la determinacioacutenSe han obtenido ideacutenticos resultados tanto en la determinacioacuten de coliformes totales como fecales y eacutestos han sido

Prueba presuntivaEn los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la produccioacuten de aacutecido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos2 de los 3 sundos y 1 de los 3 uacuteltimos (viraje del medio y gas) con estos datos vamos a las tablas del nuacutemero maacutes probable(NMP) y tenemosMaacutes de 20 ufc por cada mL de agua problemaComo eacutesta prueba ha sido positiva realizaremos las pruebas confirmativas de haber resultado negativas las primeras dariacuteamos por terminado el anaacutelisis

Prueba confirmativa siembra en EMB Levine

Tras la incubacioacuten han aparecido colonias de color violeta tal y como se esperaba Se pasa a las pruebas de IMViC para determinar el microorganismo existentePruebas IMViC- Indol Aparece un anillo rojo bordeando al tubo Indol positivoel microorganismo produceindolEn la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Rojo de Metilo Tras la incubacioacuten de cuatro diacuteas se antildeade el reactivo y el tubo se colorea de rojo Rojo de metilo positivo el microorganismo produce acidez en su crecimiento En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Voges-Proskauer El microorganismo no produce acetilcarbimol al antildeadirle el reactivo que se detecta con la aparicioacuten del color rojo en este caso el resultado es negativo (tubo del medio)

En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Citrato Tras la incubacioacuten se observa que el microorganismo no ha crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato

El viraje del color del medio se deberiacutea a una produccioacuten de amoniacuteaco que alcalinizariacutea el medio y se habriacutea detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo yresultado positivo a la derecha

El resultado de las pruebas IMViC son++-- con esta combinacioacuten vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia ColiI M VI C

Escherichia Coli + + - -

Tincioacuten de GramCon esta prueba hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caracteriacutesticas y es el mayor indicador de contaminacioacuten fecal en el agua

Determinacioacuten de Streptococcus FecalesLos Streptococcus Fecales son bacterias anaeroacutebias o aeroacutebias facultativas conocidas como bacterias del aacutecido laacutectico integrantes de la flora normal de los animales homeoteacutermicos Actualmente se considera que pertenecen al geacutenero Enterococcus

Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas deshidratacioacuten salinidad luz solarhellip) por lo que se suelen emplear para determinar la contaminacioacuten fecal en aguas de bantildeo mariacutetimas pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad

Los Streptococcus son abundantes en heces de animales por lo que son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la criacutea de ganado Nuestra muestra de agua problema estaacute tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba

ProcedimientoPrueba presuntivaPara determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida) que es un caldo de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida soacutedica inhiben el crecimiento de la flora acompantildeante mientras que los Streptococcus crecen sin restriccioacuten A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra problema y lo incubamos 24 horas a 37 ordmC Si aparece ennegrecimiento la prueba presuntiva es positiva y se pasaraacute a las confirmativas

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarDe los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra en estriacutea muacuteltiple en placas KAA Agar las que se incuban a 37 ordmC 24-48 horas Si pasado el periodo de incubacioacuten aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus FecalesOtras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramEn el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observaraacuten cocos Gram positivos

- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHISe trata del caldo Cerebro-corazoacuten que tiene la caracteriacutestica que contiene una concentracioacuten en NaCl de 65 Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracioacuten en sales minerales es por lo que son iacutendice de contaminacioacuten fecal en agua marina como ya se ha comentado anteriormente

- Prueba de la catalasaConsiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxiacutegeno (O2) Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxiacutegeno lo que nos indicariacutea que se ha reaccioacuten se ha producido

Para realizar esta prueba se efectuaraacute un frotiacutes con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida soacutedica

Una vez fijada la extensioacuten se antildeade H2O2 si aparece un burbujeo la prueba de la catalasa seraacute positiva

Resultado de la determinacioacutenPrueba presuntivaAparece un ennegrecimiento en el tubo la prueba es positivaLos Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reaccionan con el NH4 + que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarLa prueba resulta positiva Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales

Otras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramSe observan cocos Gram positivos que aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violeta- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHILa prueba es positiva aparece en el medio de cultivo los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl- Prueba de la catalasaLa prueba ha resultado negativa es decir los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2

Determinacioacuten de Clostridios Sulfito ReductoresLos Clostridios son un geacutenero de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos Son anaerobias y Gram positivos Estos microorganismos son importantes por los dantildeos que pueden provocar en las personas y por los beneficios econoacutemicos que reportanLos geacuteneros pertenecientes al geacutenero Clostridium tienen la caracteriacutestica comuacuten de poder reducir el sulfito a sulfuro los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como iacutendice de contaminacioacuten fecal sobretodo para apreciar la calidad higieacutenico-sanitaria del agua y productos animales oacute de origen animalEste tipo de microorganismos pueden esporas lo que les confiere una gran resistenciaLa deteccioacuten se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro dando lugar en presencia de hierro sulfuro de hierro que es de negro con lo que la aparicioacuten de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductoresLa deteccioacuten y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas- Investigando la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente- Investigando la presencia de formas esporuladasSe va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente

ProcedimientoDeterminacioacuten de formas esporuladas y viablesSe va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS)

Lo primero seraacute preparar una serie de diluciones decimales

Se preparan dos tubos con medio donde se sembraraacute con pipeta esteacuteril en un tubo un mL de la dilucioacuten 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucioacuten 10-3La siembra se efectuaraacute introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inoacuteculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie Una vez solidificado el medio de cultivo se antildeaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosisSe incuba a 37 ordmC 48 horas y pasado el periodo de incubacioacuten se cuentan las colonias negras aparecidas ese nuacutemero multiplicado por el factor de dilucioacuten seraacute el nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos oacute mL de muestraResultado de la determinacioacutenEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-1 se observa 1 colonia negruzcaEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-2 no se observa ninguna coloniaEl nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas seraacute1 colonia 10 (Inverso del factor de dilucioacuten) =10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problemaEl color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro por eso las colonias aparecidas son negras

Conclusiones del anaacutelisisEl agua constituye un elemento esencial ya que es indispensable para la vida por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad Con este anaacutelisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantialEl reglamento que regula la calidad de las aguas (RD 1402003 del 7 de Febrero (BOE nordm 45 de 2122003)) establece unos liacutemites de contaminacioacuten que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos el liacutemite se supera ampliamenteBACTERIAS A M 200 ufc mLCOLIFORMES 0 ufc 100 mLE COLI 0 ufc 100 mLESTREPTOCOCOS FECALES 0 ufc 100 mLCLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES 0 ufc 100 mL

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacioacuten microbioloacutegica del agua donde no deberiacutea aparecer ninguacuten tipo de contaminacioacuten puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano aunque actualmente se conociacutea la no potabilidad de la mismaDurante antildeos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los paraacutemetros bioloacutegicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momentoLa causa presumible es la ubicacioacuten de unas grandes instalaciones ganaderas a pocos metros de distancia de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originariacutean la contaminacioacutenEs normal que aparezca una contaminacioacuten fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli que es el mejor indicador de este tipo de contaminacioacuten asiacute lo confirma

El problema de la no potabilidad del agua seriacutea solucionado con una buena gestioacuten de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacioacuten

ProcedimientoEl meacutetodo consiste en filtrar a vaciacuteo una determinada cantidad de aguaque va a ser de 100 mL sobre una membrana filtrante esteacuteril depositada con la cuadriacutecula hacia arriba

Una vez filtrada el agua se retira la membrana y se deposita con pinzas esteacuteriles sobre una placa Petri con medio PCA se incuba 37 ordmC 24 -48 horas

Tras la incubacioacuten se realiza un recuento de las colonias aparecidas expresaacutendose el resultado en ufc en 100 mL

Resultados obtenidos recuento de coloniasAl transcurrir el periacuteodo de incubacioacuten establecido se saca la placa de Petri de la estufa y se recuentan las colonias crecidas El nuacutemero de colonias aparecidas es 270 ufc por cada 100 mL de agua problema

Determinacioacuten de Coliformes Totales y FecalesLos Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales capaz de fermentar la lactosa a 44ordm C en vez de 37 ordmC como lo hacen los totalesAproximadamente el 95 del grupo de los Coliformes presentes en heces estaacuten formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacioacuten fecal Eacutestos uacuteltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas maacutes elevadas Esta es la caracteriacutestica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeoteacutermicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgaacutenica pH humedadhellip Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacioacuten fecal Su presencia se interpreta como una indicacioacuten de que los organismos patoacutegenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua se halla exenta de organismos productores de enfermedades

ProcedimientoVamos a seguir el mismo meacutetodo para la determinacioacuten de los dos tipos de Coliformes lo uacutenico que variaraacute seraacute la temperatura de incubacioacuten de cada determinacioacuten que para los Coliformes Totales seraacute de 37 ordmC y para los fecales ha de ser de 44 ordmC

Prueba presuntivaPara determinar estos Coliformes se va a utilizar el medio de cultivo BGBB (dispuesto en tubo) que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de losColiformes a la vez que permite que eacutestos crezcan sin restriccioacuten se distribuye el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno de medio de cultivo y echando 10 ml de el agua a la primera serie de tubos 1 ml de agua a la segunda serie y 01 ml a la tercera Colocaremos en cada tubo una campana Durham para recoger el gas producido y al medio de cultivo se le habraacute antildeadido un indicador aacutecido-baseEstos tubos se incuban a la temperatura correspondiente seguacuten se traten de Coliformes Totales oacute Fecales durante 24 horasLos Coliformes son lactosa positiva es decir son capaces de fermentar a la con produccioacuten de aacutecido y gas estos signos seraacuten los que buscaremosLa reaccioacuten seraacute positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham por lo menos en un 10 de su capacidad y el medio vira a color amarillo debido a formacioacuten de aacutecidoUna reaccioacuten positiva por deacutebil que sea indicaraacute la presencia y coliformes y habraacute que hacer las pruebas confirmativas de IMViCSe aplicaraacute la teacutecnica del nuacutemero maacutes probable (NMP)

Prueba confirmativa siembra en EMB LevineEn los tubos donde se introdujo 01 ml de agua problema o resultados positivos en la prueba presuntiva introduce un asa de siembra esteacuteril y se toma una porcioacuten que va a sembrarse en estriacutea en una placa Petri con medio EMB Levine El EMB Levine contiene eosina y azul de metileno que inhiben parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos ademaacutes la combinacioacuten de azul de metileno y eosina permitiraacuten diferenciar microorganismos lactosa positiva de los negativos

Se incuban los tubos 24 - 48 horas a la temperatura correspondiente seguacuten se trate de Coliformes Totales oacute Fecales

Los Coliformes apareceriacutean como violetas oscuros y si hubiera microorganismos lactosa negativos apareceriacutean como colonias incoloras

Pruebas IMViCLas bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae pueden identificarse a traveacutes de una serie de pruebas bioquiacutemicas que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metaboacutelica Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificacioacuten uno de los maacutes conocidos y utilizados corresponde al IMViC que se desarrolloacute para clasificar especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aeroacutebicas o anaeroacutebicas facultativas Gram negativos bacilares no esporoacutegenas que producen aacutecido y gas durante la fermentacioacuten de la lactosa) Consiste en las siguientes pruebas

- IndolEl triptoacutefano aminoaacutecido suministrado por una peptona adecuada se descompone en indol por accioacuten de algunos microorganismosLa praacutectica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando estaacute en presencia de agua de peptona El indol producidoes detectado por indol de kovacs que produce una coloracioacuten al reaccionar con eacutelSe coge con un asa de siembra colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptonaSe incuba horas a la temperatura correspondiente seguacuten se trate de Coliformes Totales oacute Fecales 24-48 horas pasado el tiempo de incubacioacuten se sacan los tubos de la estufa y se les antildeade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y se deja reposarSi aparece una coloracioacuten roja indica que la prueba es positiva el microorganismo produce indol

- Rojo de metiloEsta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampoacuten fosfatoDebido a la acidez producida el medio viraraacute de amarillo a rojo considerando la prueba positiva al antildeadir un reactivoEl procedimiento es el mismo que el del indol con la diferncia que en vez de antildeadir indol de kovacs antildeadimos Rojo de Metilo

- Voges ProskauerAlgunas bacterias producen acatilmetilcarbimol (producto intermedio en la degradacioacuten de la glucosa de los hidratos de carbono) que en presencia de KOH y aire se oxida para dar diacetilo que reacciona con α-naftol y un producto de descomposicioacuten de la arginina de la peptona para producir un color rojoEn un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias aparecidas en las placas EMB LevineSe incuba a 37 oacute 44 ordmC 24-48 horas luego se antildeade 1 mL de reactivo de Voges Proskauerque contiene α-naftol y KOH se antildeade seis gotas de reactivo oacutemehara y dos de reactivo de Barry se agita se deja reposar 10-15 minutos ysi aparece una coloracioacuten roja la prueba es positiva - CitratoEsta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como uacutenica fuente de carbonoEn un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estriacutea Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la produccioacuten de amoniacuteaco que lo alcaliniza) el microorganismo es citrato positivo

Tincioacuten de GramLa coloracioacuten de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciacioacuten morfoloacutegica y taxonoacutemica de las bacterias Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos seguacuten retengan o no el colorante de base usado en la tincioacuten que es el violeta de genciana o el cristal violetabull Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violetabull Las bacterias Gram negativas se tintildeen de rojo por el colorante usado como contrastador fuchina safranina

La diferencia entre unas y otras radica en la composicioacuten quiacutemica de la pared celular y su permeabilidad La pared de las Gram negativas es maacutes delgada y presenta un contenido en liacutepidos grasas diez veces superior que el de las Gram positivas lo cual dificulta la tincioacuten y la retencioacuten del colorante en el citoplasma

Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos una tincioacuten diferencial a continuacioacuten observamos con el microscopio

Resultado de la determinacioacutenSe han obtenido ideacutenticos resultados tanto en la determinacioacuten de coliformes totales como fecales y eacutestos han sido

Prueba presuntivaEn los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la produccioacuten de aacutecido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos2 de los 3 sundos y 1 de los 3 uacuteltimos (viraje del medio y gas) con estos datos vamos a las tablas del nuacutemero maacutes probable(NMP) y tenemosMaacutes de 20 ufc por cada mL de agua problemaComo eacutesta prueba ha sido positiva realizaremos las pruebas confirmativas de haber resultado negativas las primeras dariacuteamos por terminado el anaacutelisis

Prueba confirmativa siembra en EMB Levine

Tras la incubacioacuten han aparecido colonias de color violeta tal y como se esperaba Se pasa a las pruebas de IMViC para determinar el microorganismo existentePruebas IMViC- Indol Aparece un anillo rojo bordeando al tubo Indol positivoel microorganismo produceindolEn la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Rojo de Metilo Tras la incubacioacuten de cuatro diacuteas se antildeade el reactivo y el tubo se colorea de rojo Rojo de metilo positivo el microorganismo produce acidez en su crecimiento En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Voges-Proskauer El microorganismo no produce acetilcarbimol al antildeadirle el reactivo que se detecta con la aparicioacuten del color rojo en este caso el resultado es negativo (tubo del medio)

En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Citrato Tras la incubacioacuten se observa que el microorganismo no ha crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato

El viraje del color del medio se deberiacutea a una produccioacuten de amoniacuteaco que alcalinizariacutea el medio y se habriacutea detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo yresultado positivo a la derecha

El resultado de las pruebas IMViC son++-- con esta combinacioacuten vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia ColiI M VI C

Escherichia Coli + + - -

Tincioacuten de GramCon esta prueba hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caracteriacutesticas y es el mayor indicador de contaminacioacuten fecal en el agua

Determinacioacuten de Streptococcus FecalesLos Streptococcus Fecales son bacterias anaeroacutebias o aeroacutebias facultativas conocidas como bacterias del aacutecido laacutectico integrantes de la flora normal de los animales homeoteacutermicos Actualmente se considera que pertenecen al geacutenero Enterococcus

Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas deshidratacioacuten salinidad luz solarhellip) por lo que se suelen emplear para determinar la contaminacioacuten fecal en aguas de bantildeo mariacutetimas pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad

Los Streptococcus son abundantes en heces de animales por lo que son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la criacutea de ganado Nuestra muestra de agua problema estaacute tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba

ProcedimientoPrueba presuntivaPara determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida) que es un caldo de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida soacutedica inhiben el crecimiento de la flora acompantildeante mientras que los Streptococcus crecen sin restriccioacuten A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra problema y lo incubamos 24 horas a 37 ordmC Si aparece ennegrecimiento la prueba presuntiva es positiva y se pasaraacute a las confirmativas

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarDe los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra en estriacutea muacuteltiple en placas KAA Agar las que se incuban a 37 ordmC 24-48 horas Si pasado el periodo de incubacioacuten aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus FecalesOtras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramEn el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observaraacuten cocos Gram positivos

- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHISe trata del caldo Cerebro-corazoacuten que tiene la caracteriacutestica que contiene una concentracioacuten en NaCl de 65 Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracioacuten en sales minerales es por lo que son iacutendice de contaminacioacuten fecal en agua marina como ya se ha comentado anteriormente

- Prueba de la catalasaConsiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxiacutegeno (O2) Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxiacutegeno lo que nos indicariacutea que se ha reaccioacuten se ha producido

Para realizar esta prueba se efectuaraacute un frotiacutes con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida soacutedica

Una vez fijada la extensioacuten se antildeade H2O2 si aparece un burbujeo la prueba de la catalasa seraacute positiva

Resultado de la determinacioacutenPrueba presuntivaAparece un ennegrecimiento en el tubo la prueba es positivaLos Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reaccionan con el NH4 + que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarLa prueba resulta positiva Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales

Otras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramSe observan cocos Gram positivos que aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violeta- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHILa prueba es positiva aparece en el medio de cultivo los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl- Prueba de la catalasaLa prueba ha resultado negativa es decir los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2

Determinacioacuten de Clostridios Sulfito ReductoresLos Clostridios son un geacutenero de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos Son anaerobias y Gram positivos Estos microorganismos son importantes por los dantildeos que pueden provocar en las personas y por los beneficios econoacutemicos que reportanLos geacuteneros pertenecientes al geacutenero Clostridium tienen la caracteriacutestica comuacuten de poder reducir el sulfito a sulfuro los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como iacutendice de contaminacioacuten fecal sobretodo para apreciar la calidad higieacutenico-sanitaria del agua y productos animales oacute de origen animalEste tipo de microorganismos pueden esporas lo que les confiere una gran resistenciaLa deteccioacuten se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro dando lugar en presencia de hierro sulfuro de hierro que es de negro con lo que la aparicioacuten de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductoresLa deteccioacuten y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas- Investigando la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente- Investigando la presencia de formas esporuladasSe va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente

ProcedimientoDeterminacioacuten de formas esporuladas y viablesSe va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS)

Lo primero seraacute preparar una serie de diluciones decimales

Se preparan dos tubos con medio donde se sembraraacute con pipeta esteacuteril en un tubo un mL de la dilucioacuten 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucioacuten 10-3La siembra se efectuaraacute introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inoacuteculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie Una vez solidificado el medio de cultivo se antildeaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosisSe incuba a 37 ordmC 48 horas y pasado el periodo de incubacioacuten se cuentan las colonias negras aparecidas ese nuacutemero multiplicado por el factor de dilucioacuten seraacute el nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos oacute mL de muestraResultado de la determinacioacutenEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-1 se observa 1 colonia negruzcaEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-2 no se observa ninguna coloniaEl nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas seraacute1 colonia 10 (Inverso del factor de dilucioacuten) =10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problemaEl color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro por eso las colonias aparecidas son negras

Conclusiones del anaacutelisisEl agua constituye un elemento esencial ya que es indispensable para la vida por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad Con este anaacutelisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantialEl reglamento que regula la calidad de las aguas (RD 1402003 del 7 de Febrero (BOE nordm 45 de 2122003)) establece unos liacutemites de contaminacioacuten que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos el liacutemite se supera ampliamenteBACTERIAS A M 200 ufc mLCOLIFORMES 0 ufc 100 mLE COLI 0 ufc 100 mLESTREPTOCOCOS FECALES 0 ufc 100 mLCLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES 0 ufc 100 mL

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacioacuten microbioloacutegica del agua donde no deberiacutea aparecer ninguacuten tipo de contaminacioacuten puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano aunque actualmente se conociacutea la no potabilidad de la mismaDurante antildeos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los paraacutemetros bioloacutegicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momentoLa causa presumible es la ubicacioacuten de unas grandes instalaciones ganaderas a pocos metros de distancia de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originariacutean la contaminacioacutenEs normal que aparezca una contaminacioacuten fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli que es el mejor indicador de este tipo de contaminacioacuten asiacute lo confirma

El problema de la no potabilidad del agua seriacutea solucionado con una buena gestioacuten de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacioacuten

Los Coliformes apareceriacutean como violetas oscuros y si hubiera microorganismos lactosa negativos apareceriacutean como colonias incoloras

Pruebas IMViCLas bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae pueden identificarse a traveacutes de una serie de pruebas bioquiacutemicas que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metaboacutelica Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificacioacuten uno de los maacutes conocidos y utilizados corresponde al IMViC que se desarrolloacute para clasificar especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aeroacutebicas o anaeroacutebicas facultativas Gram negativos bacilares no esporoacutegenas que producen aacutecido y gas durante la fermentacioacuten de la lactosa) Consiste en las siguientes pruebas

- IndolEl triptoacutefano aminoaacutecido suministrado por una peptona adecuada se descompone en indol por accioacuten de algunos microorganismosLa praacutectica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando estaacute en presencia de agua de peptona El indol producidoes detectado por indol de kovacs que produce una coloracioacuten al reaccionar con eacutelSe coge con un asa de siembra colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptonaSe incuba horas a la temperatura correspondiente seguacuten se trate de Coliformes Totales oacute Fecales 24-48 horas pasado el tiempo de incubacioacuten se sacan los tubos de la estufa y se les antildeade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y se deja reposarSi aparece una coloracioacuten roja indica que la prueba es positiva el microorganismo produce indol

- Rojo de metiloEsta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampoacuten fosfatoDebido a la acidez producida el medio viraraacute de amarillo a rojo considerando la prueba positiva al antildeadir un reactivoEl procedimiento es el mismo que el del indol con la diferncia que en vez de antildeadir indol de kovacs antildeadimos Rojo de Metilo

- Voges ProskauerAlgunas bacterias producen acatilmetilcarbimol (producto intermedio en la degradacioacuten de la glucosa de los hidratos de carbono) que en presencia de KOH y aire se oxida para dar diacetilo que reacciona con α-naftol y un producto de descomposicioacuten de la arginina de la peptona para producir un color rojoEn un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias aparecidas en las placas EMB LevineSe incuba a 37 oacute 44 ordmC 24-48 horas luego se antildeade 1 mL de reactivo de Voges Proskauerque contiene α-naftol y KOH se antildeade seis gotas de reactivo oacutemehara y dos de reactivo de Barry se agita se deja reposar 10-15 minutos ysi aparece una coloracioacuten roja la prueba es positiva - CitratoEsta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como uacutenica fuente de carbonoEn un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estriacutea Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la produccioacuten de amoniacuteaco que lo alcaliniza) el microorganismo es citrato positivo

Tincioacuten de GramLa coloracioacuten de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciacioacuten morfoloacutegica y taxonoacutemica de las bacterias Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos seguacuten retengan o no el colorante de base usado en la tincioacuten que es el violeta de genciana o el cristal violetabull Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violetabull Las bacterias Gram negativas se tintildeen de rojo por el colorante usado como contrastador fuchina safranina

La diferencia entre unas y otras radica en la composicioacuten quiacutemica de la pared celular y su permeabilidad La pared de las Gram negativas es maacutes delgada y presenta un contenido en liacutepidos grasas diez veces superior que el de las Gram positivas lo cual dificulta la tincioacuten y la retencioacuten del colorante en el citoplasma

Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos una tincioacuten diferencial a continuacioacuten observamos con el microscopio

Resultado de la determinacioacutenSe han obtenido ideacutenticos resultados tanto en la determinacioacuten de coliformes totales como fecales y eacutestos han sido

Prueba presuntivaEn los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la produccioacuten de aacutecido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos2 de los 3 sundos y 1 de los 3 uacuteltimos (viraje del medio y gas) con estos datos vamos a las tablas del nuacutemero maacutes probable(NMP) y tenemosMaacutes de 20 ufc por cada mL de agua problemaComo eacutesta prueba ha sido positiva realizaremos las pruebas confirmativas de haber resultado negativas las primeras dariacuteamos por terminado el anaacutelisis

Prueba confirmativa siembra en EMB Levine

Tras la incubacioacuten han aparecido colonias de color violeta tal y como se esperaba Se pasa a las pruebas de IMViC para determinar el microorganismo existentePruebas IMViC- Indol Aparece un anillo rojo bordeando al tubo Indol positivoel microorganismo produceindolEn la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Rojo de Metilo Tras la incubacioacuten de cuatro diacuteas se antildeade el reactivo y el tubo se colorea de rojo Rojo de metilo positivo el microorganismo produce acidez en su crecimiento En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Voges-Proskauer El microorganismo no produce acetilcarbimol al antildeadirle el reactivo que se detecta con la aparicioacuten del color rojo en este caso el resultado es negativo (tubo del medio)

En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Citrato Tras la incubacioacuten se observa que el microorganismo no ha crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato

El viraje del color del medio se deberiacutea a una produccioacuten de amoniacuteaco que alcalinizariacutea el medio y se habriacutea detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo yresultado positivo a la derecha

El resultado de las pruebas IMViC son++-- con esta combinacioacuten vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia ColiI M VI C

Escherichia Coli + + - -

Tincioacuten de GramCon esta prueba hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caracteriacutesticas y es el mayor indicador de contaminacioacuten fecal en el agua

Determinacioacuten de Streptococcus FecalesLos Streptococcus Fecales son bacterias anaeroacutebias o aeroacutebias facultativas conocidas como bacterias del aacutecido laacutectico integrantes de la flora normal de los animales homeoteacutermicos Actualmente se considera que pertenecen al geacutenero Enterococcus

Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas deshidratacioacuten salinidad luz solarhellip) por lo que se suelen emplear para determinar la contaminacioacuten fecal en aguas de bantildeo mariacutetimas pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad

Los Streptococcus son abundantes en heces de animales por lo que son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la criacutea de ganado Nuestra muestra de agua problema estaacute tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba

ProcedimientoPrueba presuntivaPara determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida) que es un caldo de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida soacutedica inhiben el crecimiento de la flora acompantildeante mientras que los Streptococcus crecen sin restriccioacuten A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra problema y lo incubamos 24 horas a 37 ordmC Si aparece ennegrecimiento la prueba presuntiva es positiva y se pasaraacute a las confirmativas

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarDe los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra en estriacutea muacuteltiple en placas KAA Agar las que se incuban a 37 ordmC 24-48 horas Si pasado el periodo de incubacioacuten aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus FecalesOtras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramEn el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observaraacuten cocos Gram positivos

- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHISe trata del caldo Cerebro-corazoacuten que tiene la caracteriacutestica que contiene una concentracioacuten en NaCl de 65 Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracioacuten en sales minerales es por lo que son iacutendice de contaminacioacuten fecal en agua marina como ya se ha comentado anteriormente

- Prueba de la catalasaConsiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxiacutegeno (O2) Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxiacutegeno lo que nos indicariacutea que se ha reaccioacuten se ha producido

Para realizar esta prueba se efectuaraacute un frotiacutes con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida soacutedica

Una vez fijada la extensioacuten se antildeade H2O2 si aparece un burbujeo la prueba de la catalasa seraacute positiva

Resultado de la determinacioacutenPrueba presuntivaAparece un ennegrecimiento en el tubo la prueba es positivaLos Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reaccionan con el NH4 + que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarLa prueba resulta positiva Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales

Otras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramSe observan cocos Gram positivos que aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violeta- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHILa prueba es positiva aparece en el medio de cultivo los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl- Prueba de la catalasaLa prueba ha resultado negativa es decir los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2

Determinacioacuten de Clostridios Sulfito ReductoresLos Clostridios son un geacutenero de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos Son anaerobias y Gram positivos Estos microorganismos son importantes por los dantildeos que pueden provocar en las personas y por los beneficios econoacutemicos que reportanLos geacuteneros pertenecientes al geacutenero Clostridium tienen la caracteriacutestica comuacuten de poder reducir el sulfito a sulfuro los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como iacutendice de contaminacioacuten fecal sobretodo para apreciar la calidad higieacutenico-sanitaria del agua y productos animales oacute de origen animalEste tipo de microorganismos pueden esporas lo que les confiere una gran resistenciaLa deteccioacuten se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro dando lugar en presencia de hierro sulfuro de hierro que es de negro con lo que la aparicioacuten de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductoresLa deteccioacuten y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas- Investigando la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente- Investigando la presencia de formas esporuladasSe va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente

ProcedimientoDeterminacioacuten de formas esporuladas y viablesSe va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS)

Lo primero seraacute preparar una serie de diluciones decimales

Se preparan dos tubos con medio donde se sembraraacute con pipeta esteacuteril en un tubo un mL de la dilucioacuten 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucioacuten 10-3La siembra se efectuaraacute introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inoacuteculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie Una vez solidificado el medio de cultivo se antildeaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosisSe incuba a 37 ordmC 48 horas y pasado el periodo de incubacioacuten se cuentan las colonias negras aparecidas ese nuacutemero multiplicado por el factor de dilucioacuten seraacute el nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos oacute mL de muestraResultado de la determinacioacutenEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-1 se observa 1 colonia negruzcaEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-2 no se observa ninguna coloniaEl nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas seraacute1 colonia 10 (Inverso del factor de dilucioacuten) =10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problemaEl color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro por eso las colonias aparecidas son negras

Conclusiones del anaacutelisisEl agua constituye un elemento esencial ya que es indispensable para la vida por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad Con este anaacutelisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantialEl reglamento que regula la calidad de las aguas (RD 1402003 del 7 de Febrero (BOE nordm 45 de 2122003)) establece unos liacutemites de contaminacioacuten que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos el liacutemite se supera ampliamenteBACTERIAS A M 200 ufc mLCOLIFORMES 0 ufc 100 mLE COLI 0 ufc 100 mLESTREPTOCOCOS FECALES 0 ufc 100 mLCLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES 0 ufc 100 mL

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacioacuten microbioloacutegica del agua donde no deberiacutea aparecer ninguacuten tipo de contaminacioacuten puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano aunque actualmente se conociacutea la no potabilidad de la mismaDurante antildeos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los paraacutemetros bioloacutegicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momentoLa causa presumible es la ubicacioacuten de unas grandes instalaciones ganaderas a pocos metros de distancia de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originariacutean la contaminacioacutenEs normal que aparezca una contaminacioacuten fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli que es el mejor indicador de este tipo de contaminacioacuten asiacute lo confirma

El problema de la no potabilidad del agua seriacutea solucionado con una buena gestioacuten de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacioacuten

Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos una tincioacuten diferencial a continuacioacuten observamos con el microscopio

Resultado de la determinacioacutenSe han obtenido ideacutenticos resultados tanto en la determinacioacuten de coliformes totales como fecales y eacutestos han sido

Prueba presuntivaEn los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la produccioacuten de aacutecido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos2 de los 3 sundos y 1 de los 3 uacuteltimos (viraje del medio y gas) con estos datos vamos a las tablas del nuacutemero maacutes probable(NMP) y tenemosMaacutes de 20 ufc por cada mL de agua problemaComo eacutesta prueba ha sido positiva realizaremos las pruebas confirmativas de haber resultado negativas las primeras dariacuteamos por terminado el anaacutelisis

Prueba confirmativa siembra en EMB Levine

Tras la incubacioacuten han aparecido colonias de color violeta tal y como se esperaba Se pasa a las pruebas de IMViC para determinar el microorganismo existentePruebas IMViC- Indol Aparece un anillo rojo bordeando al tubo Indol positivoel microorganismo produceindolEn la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Rojo de Metilo Tras la incubacioacuten de cuatro diacuteas se antildeade el reactivo y el tubo se colorea de rojo Rojo de metilo positivo el microorganismo produce acidez en su crecimiento En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Voges-Proskauer El microorganismo no produce acetilcarbimol al antildeadirle el reactivo que se detecta con la aparicioacuten del color rojo en este caso el resultado es negativo (tubo del medio)

En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo y resultado positivo a la derecha

- Citrato Tras la incubacioacuten se observa que el microorganismo no ha crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato

El viraje del color del medio se deberiacutea a una produccioacuten de amoniacuteaco que alcalinizariacutea el medio y se habriacutea detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo yresultado positivo a la derecha

El resultado de las pruebas IMViC son++-- con esta combinacioacuten vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia ColiI M VI C

Escherichia Coli + + - -

Tincioacuten de GramCon esta prueba hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caracteriacutesticas y es el mayor indicador de contaminacioacuten fecal en el agua

Determinacioacuten de Streptococcus FecalesLos Streptococcus Fecales son bacterias anaeroacutebias o aeroacutebias facultativas conocidas como bacterias del aacutecido laacutectico integrantes de la flora normal de los animales homeoteacutermicos Actualmente se considera que pertenecen al geacutenero Enterococcus

Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas deshidratacioacuten salinidad luz solarhellip) por lo que se suelen emplear para determinar la contaminacioacuten fecal en aguas de bantildeo mariacutetimas pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad

Los Streptococcus son abundantes en heces de animales por lo que son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la criacutea de ganado Nuestra muestra de agua problema estaacute tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba

ProcedimientoPrueba presuntivaPara determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida) que es un caldo de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida soacutedica inhiben el crecimiento de la flora acompantildeante mientras que los Streptococcus crecen sin restriccioacuten A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra problema y lo incubamos 24 horas a 37 ordmC Si aparece ennegrecimiento la prueba presuntiva es positiva y se pasaraacute a las confirmativas

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarDe los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra en estriacutea muacuteltiple en placas KAA Agar las que se incuban a 37 ordmC 24-48 horas Si pasado el periodo de incubacioacuten aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus FecalesOtras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramEn el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observaraacuten cocos Gram positivos

- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHISe trata del caldo Cerebro-corazoacuten que tiene la caracteriacutestica que contiene una concentracioacuten en NaCl de 65 Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracioacuten en sales minerales es por lo que son iacutendice de contaminacioacuten fecal en agua marina como ya se ha comentado anteriormente

- Prueba de la catalasaConsiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxiacutegeno (O2) Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxiacutegeno lo que nos indicariacutea que se ha reaccioacuten se ha producido

Para realizar esta prueba se efectuaraacute un frotiacutes con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida soacutedica

Una vez fijada la extensioacuten se antildeade H2O2 si aparece un burbujeo la prueba de la catalasa seraacute positiva

Resultado de la determinacioacutenPrueba presuntivaAparece un ennegrecimiento en el tubo la prueba es positivaLos Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reaccionan con el NH4 + que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarLa prueba resulta positiva Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales

Otras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramSe observan cocos Gram positivos que aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violeta- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHILa prueba es positiva aparece en el medio de cultivo los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl- Prueba de la catalasaLa prueba ha resultado negativa es decir los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2

Determinacioacuten de Clostridios Sulfito ReductoresLos Clostridios son un geacutenero de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos Son anaerobias y Gram positivos Estos microorganismos son importantes por los dantildeos que pueden provocar en las personas y por los beneficios econoacutemicos que reportanLos geacuteneros pertenecientes al geacutenero Clostridium tienen la caracteriacutestica comuacuten de poder reducir el sulfito a sulfuro los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como iacutendice de contaminacioacuten fecal sobretodo para apreciar la calidad higieacutenico-sanitaria del agua y productos animales oacute de origen animalEste tipo de microorganismos pueden esporas lo que les confiere una gran resistenciaLa deteccioacuten se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro dando lugar en presencia de hierro sulfuro de hierro que es de negro con lo que la aparicioacuten de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductoresLa deteccioacuten y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas- Investigando la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente- Investigando la presencia de formas esporuladasSe va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente

ProcedimientoDeterminacioacuten de formas esporuladas y viablesSe va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS)

Lo primero seraacute preparar una serie de diluciones decimales

Se preparan dos tubos con medio donde se sembraraacute con pipeta esteacuteril en un tubo un mL de la dilucioacuten 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucioacuten 10-3La siembra se efectuaraacute introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inoacuteculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie Una vez solidificado el medio de cultivo se antildeaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosisSe incuba a 37 ordmC 48 horas y pasado el periodo de incubacioacuten se cuentan las colonias negras aparecidas ese nuacutemero multiplicado por el factor de dilucioacuten seraacute el nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos oacute mL de muestraResultado de la determinacioacutenEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-1 se observa 1 colonia negruzcaEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-2 no se observa ninguna coloniaEl nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas seraacute1 colonia 10 (Inverso del factor de dilucioacuten) =10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problemaEl color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro por eso las colonias aparecidas son negras

Conclusiones del anaacutelisisEl agua constituye un elemento esencial ya que es indispensable para la vida por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad Con este anaacutelisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantialEl reglamento que regula la calidad de las aguas (RD 1402003 del 7 de Febrero (BOE nordm 45 de 2122003)) establece unos liacutemites de contaminacioacuten que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos el liacutemite se supera ampliamenteBACTERIAS A M 200 ufc mLCOLIFORMES 0 ufc 100 mLE COLI 0 ufc 100 mLESTREPTOCOCOS FECALES 0 ufc 100 mLCLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES 0 ufc 100 mL

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacioacuten microbioloacutegica del agua donde no deberiacutea aparecer ninguacuten tipo de contaminacioacuten puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano aunque actualmente se conociacutea la no potabilidad de la mismaDurante antildeos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los paraacutemetros bioloacutegicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momentoLa causa presumible es la ubicacioacuten de unas grandes instalaciones ganaderas a pocos metros de distancia de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originariacutean la contaminacioacutenEs normal que aparezca una contaminacioacuten fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli que es el mejor indicador de este tipo de contaminacioacuten asiacute lo confirma

El problema de la no potabilidad del agua seriacutea solucionado con una buena gestioacuten de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacioacuten

El viraje del color del medio se deberiacutea a una produccioacuten de amoniacuteaco que alcalinizariacutea el medio y se habriacutea detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo En la figura aparecen de izquierda a derecha tubo sin inoculacioacuten de bacterias resultado negativo yresultado positivo a la derecha

El resultado de las pruebas IMViC son++-- con esta combinacioacuten vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia ColiI M VI C

Escherichia Coli + + - -

Tincioacuten de GramCon esta prueba hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caracteriacutesticas y es el mayor indicador de contaminacioacuten fecal en el agua

Determinacioacuten de Streptococcus FecalesLos Streptococcus Fecales son bacterias anaeroacutebias o aeroacutebias facultativas conocidas como bacterias del aacutecido laacutectico integrantes de la flora normal de los animales homeoteacutermicos Actualmente se considera que pertenecen al geacutenero Enterococcus

Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas deshidratacioacuten salinidad luz solarhellip) por lo que se suelen emplear para determinar la contaminacioacuten fecal en aguas de bantildeo mariacutetimas pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad

Los Streptococcus son abundantes en heces de animales por lo que son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la criacutea de ganado Nuestra muestra de agua problema estaacute tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba

ProcedimientoPrueba presuntivaPara determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida) que es un caldo de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida soacutedica inhiben el crecimiento de la flora acompantildeante mientras que los Streptococcus crecen sin restriccioacuten A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra problema y lo incubamos 24 horas a 37 ordmC Si aparece ennegrecimiento la prueba presuntiva es positiva y se pasaraacute a las confirmativas

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarDe los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra en estriacutea muacuteltiple en placas KAA Agar las que se incuban a 37 ordmC 24-48 horas Si pasado el periodo de incubacioacuten aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus FecalesOtras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramEn el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observaraacuten cocos Gram positivos

- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHISe trata del caldo Cerebro-corazoacuten que tiene la caracteriacutestica que contiene una concentracioacuten en NaCl de 65 Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracioacuten en sales minerales es por lo que son iacutendice de contaminacioacuten fecal en agua marina como ya se ha comentado anteriormente

- Prueba de la catalasaConsiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxiacutegeno (O2) Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxiacutegeno lo que nos indicariacutea que se ha reaccioacuten se ha producido

Para realizar esta prueba se efectuaraacute un frotiacutes con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida soacutedica

Una vez fijada la extensioacuten se antildeade H2O2 si aparece un burbujeo la prueba de la catalasa seraacute positiva

Resultado de la determinacioacutenPrueba presuntivaAparece un ennegrecimiento en el tubo la prueba es positivaLos Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reaccionan con el NH4 + que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarLa prueba resulta positiva Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales

Otras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramSe observan cocos Gram positivos que aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violeta- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHILa prueba es positiva aparece en el medio de cultivo los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl- Prueba de la catalasaLa prueba ha resultado negativa es decir los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2

Determinacioacuten de Clostridios Sulfito ReductoresLos Clostridios son un geacutenero de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos Son anaerobias y Gram positivos Estos microorganismos son importantes por los dantildeos que pueden provocar en las personas y por los beneficios econoacutemicos que reportanLos geacuteneros pertenecientes al geacutenero Clostridium tienen la caracteriacutestica comuacuten de poder reducir el sulfito a sulfuro los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como iacutendice de contaminacioacuten fecal sobretodo para apreciar la calidad higieacutenico-sanitaria del agua y productos animales oacute de origen animalEste tipo de microorganismos pueden esporas lo que les confiere una gran resistenciaLa deteccioacuten se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro dando lugar en presencia de hierro sulfuro de hierro que es de negro con lo que la aparicioacuten de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductoresLa deteccioacuten y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas- Investigando la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente- Investigando la presencia de formas esporuladasSe va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente

ProcedimientoDeterminacioacuten de formas esporuladas y viablesSe va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS)

Lo primero seraacute preparar una serie de diluciones decimales

Se preparan dos tubos con medio donde se sembraraacute con pipeta esteacuteril en un tubo un mL de la dilucioacuten 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucioacuten 10-3La siembra se efectuaraacute introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inoacuteculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie Una vez solidificado el medio de cultivo se antildeaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosisSe incuba a 37 ordmC 48 horas y pasado el periodo de incubacioacuten se cuentan las colonias negras aparecidas ese nuacutemero multiplicado por el factor de dilucioacuten seraacute el nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos oacute mL de muestraResultado de la determinacioacutenEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-1 se observa 1 colonia negruzcaEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-2 no se observa ninguna coloniaEl nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas seraacute1 colonia 10 (Inverso del factor de dilucioacuten) =10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problemaEl color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro por eso las colonias aparecidas son negras

Conclusiones del anaacutelisisEl agua constituye un elemento esencial ya que es indispensable para la vida por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad Con este anaacutelisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantialEl reglamento que regula la calidad de las aguas (RD 1402003 del 7 de Febrero (BOE nordm 45 de 2122003)) establece unos liacutemites de contaminacioacuten que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos el liacutemite se supera ampliamenteBACTERIAS A M 200 ufc mLCOLIFORMES 0 ufc 100 mLE COLI 0 ufc 100 mLESTREPTOCOCOS FECALES 0 ufc 100 mLCLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES 0 ufc 100 mL

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacioacuten microbioloacutegica del agua donde no deberiacutea aparecer ninguacuten tipo de contaminacioacuten puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano aunque actualmente se conociacutea la no potabilidad de la mismaDurante antildeos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los paraacutemetros bioloacutegicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momentoLa causa presumible es la ubicacioacuten de unas grandes instalaciones ganaderas a pocos metros de distancia de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originariacutean la contaminacioacutenEs normal que aparezca una contaminacioacuten fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli que es el mejor indicador de este tipo de contaminacioacuten asiacute lo confirma

El problema de la no potabilidad del agua seriacutea solucionado con una buena gestioacuten de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacioacuten

Tincioacuten de GramCon esta prueba hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caracteriacutesticas y es el mayor indicador de contaminacioacuten fecal en el agua

Determinacioacuten de Streptococcus FecalesLos Streptococcus Fecales son bacterias anaeroacutebias o aeroacutebias facultativas conocidas como bacterias del aacutecido laacutectico integrantes de la flora normal de los animales homeoteacutermicos Actualmente se considera que pertenecen al geacutenero Enterococcus

Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas deshidratacioacuten salinidad luz solarhellip) por lo que se suelen emplear para determinar la contaminacioacuten fecal en aguas de bantildeo mariacutetimas pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad

Los Streptococcus son abundantes en heces de animales por lo que son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la criacutea de ganado Nuestra muestra de agua problema estaacute tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba

ProcedimientoPrueba presuntivaPara determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida) que es un caldo de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida soacutedica inhiben el crecimiento de la flora acompantildeante mientras que los Streptococcus crecen sin restriccioacuten A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra problema y lo incubamos 24 horas a 37 ordmC Si aparece ennegrecimiento la prueba presuntiva es positiva y se pasaraacute a las confirmativas

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarDe los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra en estriacutea muacuteltiple en placas KAA Agar las que se incuban a 37 ordmC 24-48 horas Si pasado el periodo de incubacioacuten aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus FecalesOtras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramEn el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observaraacuten cocos Gram positivos

- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHISe trata del caldo Cerebro-corazoacuten que tiene la caracteriacutestica que contiene una concentracioacuten en NaCl de 65 Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracioacuten en sales minerales es por lo que son iacutendice de contaminacioacuten fecal en agua marina como ya se ha comentado anteriormente

- Prueba de la catalasaConsiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxiacutegeno (O2) Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxiacutegeno lo que nos indicariacutea que se ha reaccioacuten se ha producido

Para realizar esta prueba se efectuaraacute un frotiacutes con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida soacutedica

Una vez fijada la extensioacuten se antildeade H2O2 si aparece un burbujeo la prueba de la catalasa seraacute positiva

Resultado de la determinacioacutenPrueba presuntivaAparece un ennegrecimiento en el tubo la prueba es positivaLos Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reaccionan con el NH4 + que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarLa prueba resulta positiva Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales

Otras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramSe observan cocos Gram positivos que aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violeta- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHILa prueba es positiva aparece en el medio de cultivo los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl- Prueba de la catalasaLa prueba ha resultado negativa es decir los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2

Determinacioacuten de Clostridios Sulfito ReductoresLos Clostridios son un geacutenero de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos Son anaerobias y Gram positivos Estos microorganismos son importantes por los dantildeos que pueden provocar en las personas y por los beneficios econoacutemicos que reportanLos geacuteneros pertenecientes al geacutenero Clostridium tienen la caracteriacutestica comuacuten de poder reducir el sulfito a sulfuro los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como iacutendice de contaminacioacuten fecal sobretodo para apreciar la calidad higieacutenico-sanitaria del agua y productos animales oacute de origen animalEste tipo de microorganismos pueden esporas lo que les confiere una gran resistenciaLa deteccioacuten se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro dando lugar en presencia de hierro sulfuro de hierro que es de negro con lo que la aparicioacuten de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductoresLa deteccioacuten y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas- Investigando la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente- Investigando la presencia de formas esporuladasSe va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente

ProcedimientoDeterminacioacuten de formas esporuladas y viablesSe va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS)

Lo primero seraacute preparar una serie de diluciones decimales

Se preparan dos tubos con medio donde se sembraraacute con pipeta esteacuteril en un tubo un mL de la dilucioacuten 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucioacuten 10-3La siembra se efectuaraacute introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inoacuteculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie Una vez solidificado el medio de cultivo se antildeaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosisSe incuba a 37 ordmC 48 horas y pasado el periodo de incubacioacuten se cuentan las colonias negras aparecidas ese nuacutemero multiplicado por el factor de dilucioacuten seraacute el nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos oacute mL de muestraResultado de la determinacioacutenEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-1 se observa 1 colonia negruzcaEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-2 no se observa ninguna coloniaEl nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas seraacute1 colonia 10 (Inverso del factor de dilucioacuten) =10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problemaEl color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro por eso las colonias aparecidas son negras

Conclusiones del anaacutelisisEl agua constituye un elemento esencial ya que es indispensable para la vida por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad Con este anaacutelisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantialEl reglamento que regula la calidad de las aguas (RD 1402003 del 7 de Febrero (BOE nordm 45 de 2122003)) establece unos liacutemites de contaminacioacuten que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos el liacutemite se supera ampliamenteBACTERIAS A M 200 ufc mLCOLIFORMES 0 ufc 100 mLE COLI 0 ufc 100 mLESTREPTOCOCOS FECALES 0 ufc 100 mLCLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES 0 ufc 100 mL

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacioacuten microbioloacutegica del agua donde no deberiacutea aparecer ninguacuten tipo de contaminacioacuten puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano aunque actualmente se conociacutea la no potabilidad de la mismaDurante antildeos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los paraacutemetros bioloacutegicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momentoLa causa presumible es la ubicacioacuten de unas grandes instalaciones ganaderas a pocos metros de distancia de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originariacutean la contaminacioacutenEs normal que aparezca una contaminacioacuten fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli que es el mejor indicador de este tipo de contaminacioacuten asiacute lo confirma

El problema de la no potabilidad del agua seriacutea solucionado con una buena gestioacuten de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacioacuten

- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHISe trata del caldo Cerebro-corazoacuten que tiene la caracteriacutestica que contiene una concentracioacuten en NaCl de 65 Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracioacuten en sales minerales es por lo que son iacutendice de contaminacioacuten fecal en agua marina como ya se ha comentado anteriormente

- Prueba de la catalasaConsiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxiacutegeno (O2) Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxiacutegeno lo que nos indicariacutea que se ha reaccioacuten se ha producido

Para realizar esta prueba se efectuaraacute un frotiacutes con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida soacutedica

Una vez fijada la extensioacuten se antildeade H2O2 si aparece un burbujeo la prueba de la catalasa seraacute positiva

Resultado de la determinacioacutenPrueba presuntivaAparece un ennegrecimiento en el tubo la prueba es positivaLos Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina la cuaacutel reaccionan con el NH4 + que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco

Prueba confirmativa Siembra en KAA AgarLa prueba resulta positiva Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidroacutelisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales

Otras pruebas confirmativas- Tincioacuten de GramSe observan cocos Gram positivos que aparecen con el citoplasma tentildeido uniformemente de color azul o violeta- Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHILa prueba es positiva aparece en el medio de cultivo los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl- Prueba de la catalasaLa prueba ha resultado negativa es decir los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2

Determinacioacuten de Clostridios Sulfito ReductoresLos Clostridios son un geacutenero de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos Son anaerobias y Gram positivos Estos microorganismos son importantes por los dantildeos que pueden provocar en las personas y por los beneficios econoacutemicos que reportanLos geacuteneros pertenecientes al geacutenero Clostridium tienen la caracteriacutestica comuacuten de poder reducir el sulfito a sulfuro los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como iacutendice de contaminacioacuten fecal sobretodo para apreciar la calidad higieacutenico-sanitaria del agua y productos animales oacute de origen animalEste tipo de microorganismos pueden esporas lo que les confiere una gran resistenciaLa deteccioacuten se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro dando lugar en presencia de hierro sulfuro de hierro que es de negro con lo que la aparicioacuten de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductoresLa deteccioacuten y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas- Investigando la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente- Investigando la presencia de formas esporuladasSe va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas yesporuladas conjuntamente

ProcedimientoDeterminacioacuten de formas esporuladas y viablesSe va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS)

Lo primero seraacute preparar una serie de diluciones decimales

Se preparan dos tubos con medio donde se sembraraacute con pipeta esteacuteril en un tubo un mL de la dilucioacuten 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucioacuten 10-3La siembra se efectuaraacute introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inoacuteculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie Una vez solidificado el medio de cultivo se antildeaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosisSe incuba a 37 ordmC 48 horas y pasado el periodo de incubacioacuten se cuentan las colonias negras aparecidas ese nuacutemero multiplicado por el factor de dilucioacuten seraacute el nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos oacute mL de muestraResultado de la determinacioacutenEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-1 se observa 1 colonia negruzcaEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-2 no se observa ninguna coloniaEl nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas seraacute1 colonia 10 (Inverso del factor de dilucioacuten) =10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problemaEl color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro por eso las colonias aparecidas son negras

Conclusiones del anaacutelisisEl agua constituye un elemento esencial ya que es indispensable para la vida por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad Con este anaacutelisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantialEl reglamento que regula la calidad de las aguas (RD 1402003 del 7 de Febrero (BOE nordm 45 de 2122003)) establece unos liacutemites de contaminacioacuten que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos el liacutemite se supera ampliamenteBACTERIAS A M 200 ufc mLCOLIFORMES 0 ufc 100 mLE COLI 0 ufc 100 mLESTREPTOCOCOS FECALES 0 ufc 100 mLCLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES 0 ufc 100 mL

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacioacuten microbioloacutegica del agua donde no deberiacutea aparecer ninguacuten tipo de contaminacioacuten puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano aunque actualmente se conociacutea la no potabilidad de la mismaDurante antildeos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los paraacutemetros bioloacutegicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momentoLa causa presumible es la ubicacioacuten de unas grandes instalaciones ganaderas a pocos metros de distancia de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originariacutean la contaminacioacutenEs normal que aparezca una contaminacioacuten fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli que es el mejor indicador de este tipo de contaminacioacuten asiacute lo confirma

El problema de la no potabilidad del agua seriacutea solucionado con una buena gestioacuten de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacioacuten

Lo primero seraacute preparar una serie de diluciones decimales

Se preparan dos tubos con medio donde se sembraraacute con pipeta esteacuteril en un tubo un mL de la dilucioacuten 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucioacuten 10-3La siembra se efectuaraacute introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inoacuteculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie Una vez solidificado el medio de cultivo se antildeaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosisSe incuba a 37 ordmC 48 horas y pasado el periodo de incubacioacuten se cuentan las colonias negras aparecidas ese nuacutemero multiplicado por el factor de dilucioacuten seraacute el nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos oacute mL de muestraResultado de la determinacioacutenEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-1 se observa 1 colonia negruzcaEn el tubo sembrado a partir de la dilucioacuten 10-2 no se observa ninguna coloniaEl nuacutemero total de formas vegetativas y esporuladas seraacute1 colonia 10 (Inverso del factor de dilucioacuten) =10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problemaEl color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro por eso las colonias aparecidas son negras

Conclusiones del anaacutelisisEl agua constituye un elemento esencial ya que es indispensable para la vida por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad Con este anaacutelisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantialEl reglamento que regula la calidad de las aguas (RD 1402003 del 7 de Febrero (BOE nordm 45 de 2122003)) establece unos liacutemites de contaminacioacuten que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos el liacutemite se supera ampliamenteBACTERIAS A M 200 ufc mLCOLIFORMES 0 ufc 100 mLE COLI 0 ufc 100 mLESTREPTOCOCOS FECALES 0 ufc 100 mLCLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES 0 ufc 100 mL

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacioacuten microbioloacutegica del agua donde no deberiacutea aparecer ninguacuten tipo de contaminacioacuten puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano aunque actualmente se conociacutea la no potabilidad de la mismaDurante antildeos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los paraacutemetros bioloacutegicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momentoLa causa presumible es la ubicacioacuten de unas grandes instalaciones ganaderas a pocos metros de distancia de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originariacutean la contaminacioacutenEs normal que aparezca una contaminacioacuten fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli que es el mejor indicador de este tipo de contaminacioacuten asiacute lo confirma

El problema de la no potabilidad del agua seriacutea solucionado con una buena gestioacuten de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacioacuten