Antologia Practicas Nematología

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOAESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE

MANUAL DE PRÁCTICAS DE NEMATOLOGÍADEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA RAMA DE FITOPATOLOGÍA

ING. MENA ADRIANO JORGE DANIEL

JUAN JOSÉ RÍOS, AHOME, SINALOA. JUNIO DEL 2008

INDICE

Introducción 1

Instrucciones para el uso de los laboratorios de fitopatología 3

PROGRAMA DE TRABAJO 4

PRÁCTICA #1. Observación y reconocimiento de los nemátodos fitoparásitos

en el laboratorio 4

PRÁCTICA #2. Técnicas de muestreo para detectar nemátodos fitoparásitos 6

PRÁCTICA #3. Métodos para la extracción de nemátodos del suelo 12

PRÁCTICA #4. Métodos para la extracción de nemátodos de la raíz 16

PRÁCTICA #5. Manipulación de nemátodos 18

PRÁCTICA #6. Preparaciones permanentes de nemátodos 21

PRÁCTICA #7. Identificación de géneros de nemátodos fitoparásitos 23

PRÁCTICA #8. Cuantificación de población de nemátodos 25

PRÁCTICA #9. Cortes y montajes de modelos perineales de Meloidogyne 27

PRÁCTICA #10. Identificación de géneros de nemátodos fitoparásitos con

manejo de claves 31

Bibliografía 33

i

INTRODUCCIÓN

La siguiente antología tiene como finalidad facilitar el siguiente material de estudio;

ya que la vinculación teoría-práctica es una necesidad ineludible en el proceso de

enseñanza-aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biológicas, premisa que

se reproduce para el caso particular de la Nematología.

Como sabemos los nemátodos son animales con una organización muy sencilla,

que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen

nemátodos Saprófagos que favorecen la descomposición de la materia orgánica,

Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos parásitos de

animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que parasitan insectos y

pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas.

Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce,

suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas

cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y

agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de

fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc.

Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el

suelo y/o el interior de las raíces de las plantas.

Son de gran importancia económica ya que les causan serios daños a las plantas

cultivables afectando su rendimiento, se encuentran ampliamente distribuidos en

el suelo, son de fácil diseminación, causan problemas permanentes en el suelo,

son polífagos (fitófagos) y de difícil erradicación una vez establecidos en el suelo o

la planta.

El presente trabajo se ha elaborado con fines didácticos y aplicaciones prácticas

para que los estudiantes que estén cursando la materia de Nematología,

adquieran los conocimientos teórico-prácticos del manejo de nemátodos en el

1

laboratorio de fitopatología. De tal manera que se incluyen las técnicas de

muestreo para detectar nemátodos fitoparásitos, también se incluyen los métodos

para la extracción de nemátodos del suelo y de la raíz, manipulación de

nematodos, así como las preparaciones permanentes de nemátodos y muchas

más que se verán mas adelante.

Agradezco a los doctores Apodaca Sánchez Miguel Ángel y Quintero Benítez José

Alberto, que gracias a la gran experiencia de ambos, contribuyeron con sus

comentarios y sugerencias para la recopilación e integración de las practicas del

presente trabajo. También expreso mi agradecimiento al Ing. Jesús Guadalupe

Loredo Vega y al profesor Marco A. Uribe Domínguez por su gran apoyo en la

organización y ordenamiento de la información que contiene este trabajo.

Las criticas constructivas de los colegas y estudiantes son bienvenidas, ya que se

pretende la mejoría permanente de este trabajo.

2

INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DE FITOPATOLOGÍA

El laboratorio constituye un lugar de trabajo para la enseñanza y la investigación;

los mayores peligros que presenta no lo son ni el fuego ni las descargas eléctricas,

sino el descuido y la irresponsabilidad de los usuarios.

Para la conservación y mejor servicio de los laboratorios de fitopatología, las

personas que deseen usarlo deberán apegarse a las siguientes disposiciones:

LIMPIEZA

Los materiales de desecho deberán depositarse en el recipiente de basura, no

dejarlos nunca sobre la mesa o tirarlos al suelo.

El material de vidrio que se use, deberá llevarse inmediatamente al lavadero para

que el ayudante lo tenga limpio para su uso inmediato.

El material utilizado por los alumnos en actividades extraclase, deberá ser lavado

por el mismo.

Cuando no se utilicen las mesas de trabajo, deberán permanecer libres de polvo y

otros materiales: no dejar materiales innecesarios sobre ellas.

Cuando el caso lo amerite, se deberá cubrir el material (tubos, cajas de petri,

material vegetal, etc.) con un papel polietileno, indicando su nombre y la fecha en

que lo dejan.

Después de hacer uso de algunas substancias y otros materiales de uso general,

regresarse a su gaveta, revisando que no hayan quedado residuos de estas

substancias sobre la mesa.

NOTA: EL MATERIAL QUE NO REÚNA ESTAS CONDICIONES, PODRÁ SER DESECHADO POR EL AYUDANTE O ENCARGADO DE LIMPIEZA

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PROGRAMA DE TRABAJO

PRÁCTICA #1. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIÓN

Como sabemos los nemátodos son animales con una organización muy sencilla,

que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen

nemátodos Saprófagos (vida libre) que favorecen la descomposición de la materia

orgánica, Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos

parásitos de animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que

parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas.

Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce,

suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas

cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y

agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de

fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc.

Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el

suelo y/o el interior de las raíces de las plantas.

OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemátodos

fitoparásitos de los de vida libre en el laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Usando los nemátodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj

una alícuota (2-5 mm) de la suspensión nemátodos-agua, enseguida se pasan al

microscopio de disección para ser observados e identificar los nematodos

4

fitoparásitos de los de vida libre. Y después se observan en el microscopio

biológico.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5

PRÁCTICA #2. TÉCNICAS DE MUESTREO PARA DETECTAR NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS (PRÁCTICA DE CAMPO)

INTRODUCCIÓN

Antes del inicio del muestreo es recomendable la decisión de los propósitos u

objetivos a fin de estar en condiciones de aplicar el método de muestreo mas

aplicado.

Puesto que el “universum” en el que es posible encontrar a los nemátodos puede

ser: 1). En el suelo (ya sea en un terreno agrícola o una muestra de suelo) y/o 2).

Tejido vegetal (un cultivo o una planta), el examen de muestras de suelo y de

raíces es una de los primeros pasos para diagnosticar un problema en un cultivo

en el que estos especimenes se están considerando como factores limitantes en la

producción. Las especies presentes y el numero que se extraigan, nos

proporcionara información útil sobre si son parcial o totalmente los responsables

del pobre desarrollo del cultivo.

OBJETIVOS: Que el alumno realice diferentes tipos de muestreos y se capacite

para aplicar el mas adecuado al cultivo afectado por nemátodos fitoparásitos.

MATERIALES Y METODOS

1.- MUESTREO EN UN TERRENO CON CULTIVO ESTABLECIDO

A).- MUESTREO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando detectamos

manchones de plantas bien definidos que manifiesten síntomas aparentemente

por ataque de namátodos (reducción de tamaño, amarillamiento, estaca

producción, etc.) y queremos saber si son nemátodos los que están causando esta

sintomatología.

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El método consiste en tomar 3 submuestras (plantas enfermas) dentro del

manchón a partir del centro hasta la orilla y por separado se toman otras 3

submuestras fuera de él (plantas aparentemente sanas). Cada submuestra

consistirá aproximadamente de 100-200 grs. de rizosfera (asociación de suelo

mas raíces) por punto de muestreo. La profundidad del muestreo será entre 10-30

cms. Donde se localizan la mayor cantidad de raíces jóvenes y en activo

crecimiento; aquí es donde los nemátodos son más abundantes.

Las muestras se colectarán en bolsas de polietileno a las que se le colocarán una

etiqueta para su identificación.

B.- MUESTREO NO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando se quiere conocer

la fauna nematológica asociada a un cultivo el cuál no muestra síntomas todavía o

bien está afectado de manera general.

El método consiste en recorrer una sección del lote en zig-zag y establecer 5

puntos de muestreo (plantas) a una distancia de 20 pasos (metros) uno de otro.

En cada punto de muestreo se toman aproximadamente 100 grs. de rizosfera

(asociación de suelo más raíces) a una profundidad de 10-30 cms. Eliminando la

capa superficial del suelo (unos 10 cms.). Las muestras se colectan en bolsas de

polietileno y se le coloca una etiqueta de identificación.

2.- MUESTREO SISTEMATIZADO 8X8

Este método se utiliza cuando se quiere conocer la fauna nematológica existente

en un terreno antes de establecer un cultivo.

El método consiste en colectar pequeñas submuestras cada 8 pasos (metros) a lo

largo del terreno y otros 8 a lo ancho, pero regresando en línea paralela al

recorrido anterior, con esto estamos prácticamente cuadriculando el terreno y en

los puntos de intersección, tomamos las submuestras a una profundidad entre 10-

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30 cms. de donde se tomarán de 50-60 grs. de suelo. La muestra se colectara en

una bolsa de polietileno y se le colocará su etiqueta de identificación.

En el caso de que el muestreo sea para detectar nemátodos formadores de

quistes, se procede de igual manera que en el caso anterior, solo que las

submuestras se obtienen de la superficie del terreno.

3).- MUESTREO EN HUERTAS FRUTALES (AGUACATE, MANGO, VID,

CITRICOS, PLATANO, ETEC.)

A).- MUESTREO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando detectamos

manchones de árboles bien definidos que manifiesten síntomas aparentemente de

estar afectados por nemátodos, como son: reducción del crecimiento,

amarillamientos, hojas pequeñas y escasas, baja producción, etc.

El método consiste en tomas 3 submuestras (árboles enfermos) dentro del

manchón a partir del centro hasta la orilla del manchón y por separado se toman

otras 3 submuestras fuera de él (árboles sin síntomas). En cada árbol (punto de

muestreo) se toman 4 submuestras a 1 m. de distancia del tronco del árbol hacia

fuera en dirección de los puntos cardinales.

La profundidad del muestreo será en el lugar donde se encuentren el mayor

número de raíces jóvenes y en crecimiento activo, lo cual puede variar entre los

10-40 cms. dependiendo del árbol frutal. La cantidad de rizosfera (suelo más

raíces) obtenida por submuestras será aproximadamente de 100 grs. Las

muestras se colectarán en bolsas de poliétileno y de etiquetaran para su

identificación.

B).- MUESTREO NO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando se quiere conocer

la fauna nematológica asociada a una huerta de un frutal, donde todavía no hay

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síntomas evidentes de ataque de nemátodos o bien se ve afectado de manera

general.

El método consiste en recorrer una sección en zig-zag y establecer 5 puntos de

muestreo (árboles) a una distancia de 20 pasos (metros). Otra forma seria

muestreando 1 de cada 10 árboles revisados de la huerta. La obtención de las

muestras en cada punto de muestreo sería siguiendo la misma metodología

explicada anteriormente en el método dirigido.

¿QUÉ DATOS DEBEN TOMARSE EN EL MUESTREO?

Es importante que el técnico anote cierta información que le será de utilidad en la

interpretación de los resultados o para que si es necesario un nuevo muestreo le

sea fácil localizar el lugar. Debe informarse del tipo de manejo del cultivo

(fertilización, aplicación de plaguicidas, riegos, etc.), las características del suelo

(textura, ph, etc.), tipo de malezas, así como la localización exacta, fecha, cultivo

(anterior, actual), colector y otra información que le sea útil. Para esto deberá tener

una libreta de campo y etiquetas para colgar, en estas ultimas anotará el numero

de muestra (identificación), fecha de muestreo, cultivo y variedad.

¿CÓMO DEBEMOS MANEJAR LAS MUESTRAS?

Las muestras al ser transportadas del campo al laboratorio deben cuidarse que no

le peguen directamente los rayos solares y no se golpeen porque muchos

nemátodos morirán por deshidratación. En el laboratorio deben ser procesadas

inmediatamente, y si no conservarlas en el refrigerador a unos 4 ºC.

9


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REGISTRO DE MUESTRAS NEMATOLÓGICAS

No. de muestra ........ Fecha .................. Cultivos y variedad ....................................

Ubicación del lote muestreado ...................................................................................

Nombre del propietario ..............................................................................................

Dirección y teléfono ...................................................................................................

Fecha de siembra ó transplante ................................................................................

Método de siembra ................................. Densidad de siembra ...............................

Material de siembra: Certificado ............................ No certificado ............................

Forma de riego: Goteo ......... Aspersión .......... Gravedad .......... Inundación ..........

Frecuencia de riegos .................................. Fertilización (material y dosis) ..............

....................................................................................................................................

Control de plagas y enfermedades ............................................................................

....................................................................................................................................

Ph del suelo: Alcalino ........................ Neutro ........................ Acido .........................

Tipo de suelo: Arcilloso ............ Limoso ............. Franco ............. Arenoso ..............

Topografía del suelo: Plano ................... Ladera ................... Ondulado ..................

Síntomas (en follaje y raíz) ........................................................................................

....................................................................................................................................

Fecha aproximada de inicio del problema .................................................................

Superficie: Afectada ...................................... Muestreada ........................................

Numero de muestras por hectárea ..................... Tipo de muestreo .........................

Producción anterior ..................................... Producción actual ................................

Otras observaciones de campo .................................................................................

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

11

PRÁCTICA #3. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS)

INTRODUCCIÓN

Las muestras traídas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para

obtener los nemátodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su

identificación y conteo. Hay nematodos fitoparásitos que se alimentan de las

raíces como ectoparásitos, los que siempre estarán en el suelo; pero otros se

introducen al sistema radical (endoparásitos) del cual se alimentan e incluso

algunos se mueven hasta las partes áreas. El método de extracción será de

acuerdo al tipo de nemátodos mencionados anteriormente.

OBJETIVOS: Qué el alumno se adiestre en las diferentes técnicas para la

extracción de nemátodos del suelo (nemátodos de vida libre y fitoparásitos).

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

La muestra que se recogió en el campo se esparce sobre un pedazo de plástico,

se desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las raíces para

procesarlas posteriormente y extraer los nemátodos endoparásitos. Una vez

mullido el suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras

formen una muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plástico.


1).- MÉTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de

goma (8-10 cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de diámetro,

enseguida se lavan ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presión

en el tubo de goma para cerrar el paso del agua. Después se procede a llenar con

agua hasta 1 cm. bajo del borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla.

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Enseguida se etiqueta con los datos necesarios como: # de muestra, hospedero,

fecha y lugar de colecta

Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre

que de antemano esté amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial

(kleneex) y luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se

humedece con una piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando

que esta toque el agua del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24

horas se sacan en un vaso de precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los

nemátodos parásitos y saprófitos que pasaron por el papel facial y la malla.

Si se desea, se pueden observar directamente los nemátodos al microscopio de

disección, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensión en un vidrio de

reloj, luego se observan. En caso contrario o después de realizado lo anterior, se

procede a matarlos y fijarlos para su preservación por tiempo indefinido.

2).- MÉTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo

distribuido en el plástico, se toman muestras en diversos puntos agregándose a

una probeta que contiene 200 cc de agua hasta aforar a 300 cc. El contenido de la

probeta se pasa a una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen

desmenuzando los terrones hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la

solución y la dejamos reposar durante 15-30 segundos para que se sedimente el

material pesado y los nemátodos permanezcan flotando. El contenido de la cubeta

A, se pasa a través de un tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta

B, en la cual se agita y la dejamos sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 (ó

500) y lo que queda en él se pasa al embudo de Baermann.

3).- MÉTODO DE FLOTACIÓN (TAMIZ-CENTRÍFUGA): Lo que queda en el tamiz

de 325 ó 500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la

centrifuga a los que previamente se les agregó 0.5-1.0 g de kaolín, el cual se

mezcla bien y se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la

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sedimentación de los nemátodos junto con las partículas de suelo (favorecido por

el kaolín). Después se decanta el sobrenadante eliminando la materia orgánica

suspendida.

El sobrenadante eliminado se sustituye por solución sucrosa (45 g. de solución

sucrosa o azúcar refinada en 100 cc. de agua destilada) y se mezcla con la

muestra. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa

por el tamiz de 325 ó 500 mallas donde los nemátodos quedan retenidos

procediéndose inmediatamente a lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para

eliminar el azúcar del cuerpo de los nemátodos. Con la ayuda de una piceta se

pasan a un vaso de precipitado, quedando listo los nemátodos para hacer

observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para estudios posteriores de

identificación y conteo.

4).- MÉTODO PARA EXTRAER DEL SUELO A NEMÁTODOS FORMADORES

DE QUISTES: De la muestra completamente seca (si es de cultivo en pie se debe

secar a temperatura ambiente por unos 15 días) se toman 1000 g. que se colocan

sobre un tamiz de 8 mallas por pulgada cuadrada sobre la boca del flotador de

Fenwick lleno de agua.

Se hace pasar el suelo a través del tamiz utilizando una corriente de agua. Lo que

hace que el material pesado se vaya al fondo del deposito, floten los quistes

mezclados con restos de material orgánico, que son arrastrados hacia fuera al

derramarse el agua haciéndolos caer en dos tamices, uno (el superior) de 20

mallas y el otro (inferior) de 60 mallas. El primero retendrá todo los materiales

grandes y el segundo partículas pequeñas junto con los quistes, en caso de existir.

El material retenido en el tamiz de 60 mallas se pasará a un vaso de precipitado

utilizando una piceta el cual contiene agua y se le colocó previamente una tira de

papel absorbente. Se agrega una pequeña cantidad de jabón detergente con el fin

de romper la tensión superficial y propiciar que la materia orgánica y quistes se

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adhieran al papel. Esta se extrae y se coloca sobre una tira de vidrio para

observarse al microscopio estereoscópico y colectar los quistes si la muestra los

contiene.

RESULTADOS Y DISCUCIÓN

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PRÁCTICA #4. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS)

INTRODUCCIÓN

Paralelamente al grupo de los nemátodos ectoparásitos (es decir, aquellos que

se alimentan externamente de la raíz y cuyo hábitat es el suelo), existe el grupo de

los endoparásitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y

que ya no dependen totalmente del ambiente del suelo, sino más bien de lo que

ocurre en la planta. Así pues, podemos encontrar nemátodos desde la raíz, tallos y

hojas hasta en las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema

para la agricultura porque son un grupo mucho más peligroso que el anterior.

Para la extracción de estos nemátodos, existen algunos métodos que por su

sencillez y efectividad vale la pena conocerlos.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los métodos de extracción más

sencillos y prácticos que se conocen para extraer nemátodos endoparásitos.


1).- OBSERVACIÓN DIRECTA: Se usa en raíces con agallamiento, se utilizan

agujas de disección para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles,

machos y masas de huevecillos de los nemátodos que causan agallas

(Meloidogyne spp. y Nacobbus spp.).

2).- INCUBACIÓN: Las raíces previamente lavadas o el follaje son cortados en

pequeñas piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejándose reposar

por unas 24-48 horas para que los nemátodos salgan de los tejidos.

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3).- LICUADORA CENTRÍFUGA: Las raíces lavadas se licuan a alta velocidad

durante un minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotación para

nemátodos ectoparásitos.

4).- EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para

ectoparásitos, solo que aquí usamos en lugar de suelo, pequeñas piezas de raíces

previamente lavadas.

5).- LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de

raíces; los trocitos de raíz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar

durante un minuto. El material licuado se pasa a través de un tamiz de 325 mallas,

recogiendo el material en un vaso de precipitado. Después observar al

microscopio de disección.


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PRÁCTICA #5. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS

INTRODUCCIÓN

La manipulación de los nemátodos previo a su identificación y conteo una vez que

han sido extraídos por las técnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy

importante porque lleva implícitos el matado, fijado y pesca de estos organismos.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca las técnicas de manipulación más usadas

para realizar la identificación y conteo de nemátodos en un análisis nematológico

de una muestra.


1).- MATADO: Existen varios métodos para realizar el matado de los nemátodos

pero todos ellos lo hacen tratando de evitar su distorsión. Hay 2 formas generales

para realizar esta operación, ellas son:

A).- MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alícuota

de la suspensión nemátodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a

la flama de una lámpara de alcohol. Después se observan al microscopio de

disección para verificar su muerte.

B).- MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de

500 ml., cuando alcance una temperatura de 60 ºC se retira de la flama y se

introduce durante 3-4 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc.

de agua con nemátodos. También se puede matar dejando hervir el agua

introduciendo el tubo de ensayo durante un minuto.

2).- FIJACIÓN: Una vez que los nemátodos han sido matados, se deja enfriar el

agua con nemátodos y se le agrega el fijador (F.A. 4:10) en una porción de 1:1.

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Fijador F.A. 4:10

Formol al 40% .................... 10 cc.

Acido glacial acético ............10 cc.

Agua destilada .....................10 cc.

Nota: Con este fijador los nemátodos rara vez se distorsionan, pero tienden a

tornarse café y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven

transparentes después de unos cuantos días.

3).-PESCA DE NEMÁTODOS: Después de la extracción, matado y fijación de los

nemátodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de

agua para observarlos, estudiar sus características e identificación bajo el

microscopio biológico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de

una varita de bambú con la punta bien adelgazada. La técnica para pescar

nematodos es la siguiente:

1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua.

2.- Se coloca una alícuota de la suspensión agua-nemátodos matados y fijados en

un vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscópico.

3.- Se localiza un nemátodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la

varita de bambú se lleva al nemátodo hacia la superficie lentamente y una vez en

la superficie, se saca rápidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos.

4.- Nuevamente se busca otro nemátodos y se sigue el mismo procedimiento

hasta trasladar por lo menos 5 nemátodos al portaobjetos.

5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemátodos. Enseguida se

observa al microscopio biológico.

6.- Se estudian las características de cada nemátodo para su identificación y su

posterior cuantificación.

19


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PRÁCTICA #6. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS

INTRODUCCIÓN

En nemátodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente

gónadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los

especimenes pueden ser aclarados procesándolos a lactófenol ó glicerina, los

cuales son medios de montaje apropiados. Además es muy importante con fines

académicos o de investigación al conservar preparaciones permanentes de

nemátodos.

OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de

nemátodos para su conservación.


Transferir nemátodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga

0.5 ml. de la siguiente solución:

Solución I:Etanol 96% .................... 20 partes

Glicerina ........................ 1 parte

Agua destilada .............. 79 partes

Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su

capacidad con etanol 96% y déjelo cuando menos durante 12 horas en una estufa

a 35-40 ºC. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemátodos

en una mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solución II (5

partes de glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colóquelo

durante 3 horas en una estufa a 40 ºC para que se evapore lentamente el etanol

hasta que los nemátodos queden en glicerina pura.

21

Los nemátodos así deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura

(purificarla dejándola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que

contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de

ángel, después se coloca un cubreobjeto y el borde de éste se sella con esmalte

de uñas transparentes.

Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos:

1.- Nombre científico

2.- Localidad

3.- Hospedante

4.- No. de hembras y machos

5.- Colector

6.- Fecha


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PRÁCTICA #7. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS

INTRODUCCIÓN

Los nemátodos fitoparásitos abarcan un gran número de géneros y especies de

gran importancia agrícola. El conocimiento de la sintomatología, morfología,

biología y control es de interés fundamental para el parasitólogo.

El control de los nemátodos fitoparásitos, se basa en una identificación correcta

del nemátodo en cuestión, de ahí que sea importante conocer las características

morfológicas más importantes de los principales géneros de estos patógenos.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca y diferencie las características morfológicas

de los principales géneros de nemátodos fitoparásitos de importancia agrícola.


1.- Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o suelo procesado, los

montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente.

2.- Usando los montajes permanentes disponibles en el laboratorio, observar al

microscopio biológico los especimenes, con los objetivos 10x y 40x.

3.- Dibujar cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más

importantes: forma, tamaño, tipo de estilete, tipo de esófago, unión del bulbo basal

con el intestino, posición de la vulva, tipo de cola, características del sistema

reproductor de la hembra, etc.

4.- Se estudiarán los siguientes géneros:

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a).- Meloidogyne

b).- Globodera

c).- Heterodera

d).- Punctodera

e).- Nacobbus

f).- Xiphinema

g).- Helicotylenchus

h).- Mononchus

i).- Rhabditis

j).- Ditylenchus

k).- Otros


1.- Se presentan los dibujos tal como se hicieron en el laboratorio.

2.- Indique cómo diferenciar entre sí los géneros observados, para ello consulte la

literatura al respecto.

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PRÁCTICA #8. CUANTIFICACIÓN DE POBLACIÓN DE NEMÁTODOS

INTRODUCCIÓN

Las poblaciones de nemátodos en el suelo y raíces aumentan o disminuyen a

través del tiempo y son afectadas por las condiciones fisiológicas del hospedante,

la presencia de otros organismos, el tipo de suelo y por influencias ambientales y

edáficas.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca una metodología para cuantificar

poblaciones de nemátodos, en una muestra de suelo o raíces.


En un vaso de precipitado se toman 20 ml. de la suspensión agua con nemátodos

del método de extracción desarrollado; enseguida se extrae una alícuota de 1 ml.

usando una jeringa hipodérmica y se vierte en un vidrio de reloj, previamente

cuadriculado marcando cuadros de 5 mm. por lado. Si los nemátodos están vivos

se matan bajo la flama de una lámpara de alcohol durante 12 segundos. Después

se deja enfriar y se coloca el vidrio de reloj bajo el microscopio de disección; se

cuentan los nemátodos en forma ordenada en cada cuadro. Esta operación se

repite con 5 alícuotas de 1 mm. del mismo vaso de precipitado para sacar un

promedio. Después se obtiene mediante una regla de tres simple, el número total

de nemátodos en los 20 ml. que representan la muestra procesada.

Cuando en una muestra tenemos varios géneros se cuantifica cada uno por

separado.

Ejemplo: Se quiere conocer el número de nemátodos contenidos en una muestra

de 1 kg. de suelo procedente de una huerta de cítricos. Para la extracción de los

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nemátodos en el laboratorio se empleo el método tamiz-embudo, se procesaron

200 ml. de suelo. A las 48 horas se tomaron 20 ml. de agua con nemátodos.


1.- Los resultados presentarlos en cuadros.

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PRÁCTICA #9. CORTES Y MONTAJES DE MODELOS PERINEALES DE Meloidogyne

INTRODUCCIÓN

La identificación de las especies del género Meloidogyne spp. esta basada

primordialmente en el tipo de modelo perineal que presentan las hembras; por tal

motivo es importante cortar y montar adecuadamente la región genital de estos

nematodos.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca una de las metodologías para identificar

especies de Meloidogyne.


1.- Para la extracción de nemátodos del género Meloidogyne se observa la raíz

afectada con nódulos, y con 2 agujas de disección se extraen las hembras

(globosas) endoparásitas.

2.- Sobre un portaobjetos, poner una gota de agua o acido láctico.

3.- Colocar una hembra de Meloidogyne sobre la gota.

4.- Con una aguja hipodérmica (para insulina), realizar un corte perineal (región

del ano y vulva) debajo de la línea ecuatorial. Se elimina la parte anterior del

cuerpo.

5.- Se lava y limpia el corte cuidando no romper la estructura.

6.- Sobre un portaobjetos limpio, se deposita una gota de lactófenol y sobre este

se le colocan 4 cortes, de forma tal que la parte interna del modelo perineal haga

contacto con la superficie del portaobjetos.

7.- Colocar un cubreobjetos, sellar con barniz de uñas y etiquetar.

8.- Se observan al microscopio compuesto para su identificación, de acuerdo a las

estructuras que tiene en la parte anal y con base en claves taxonómicas para

especies de Meloidogyne se logra la identificación a nivel especie.

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CLAVES DE LAS ESPECIES MAS IMPORTANTES DEL GÉNERO Meloidogyne BASADAS EN LA MORFOLOGIA DEL PATRÓN PERINEAL

1. Puntuaciones presentes en el área terminal de la cola

Puntuaciones ausentes en el área terminal de la cola

M. hapla2

2. Campo lateral marcado con profundas incisuras,

generalmente extendiéndose más allá del perineum

Campo lateral no claramente marcado o terminado cerca

del perineum

M. javanica

3

3. Estrías del arco dorsal fusionadas y entremezcladas

Estrías del arco dorsal no fusionadas ni entremezcladas

M. chitwoodi4

4. Campo lateral cerca del perineum marcado por incisuras

gruesas, curvadas, elevadas y dobladas

Campo lateral no marcado por estrías curvadas y

dobladas

M. exigua

5

5. Arco dorsal alto y cuadrado, estrías lisas a onduladas

Arco dorsal bajo y redondeado

M. incognita6

6. Estrías en el arco dorsal cerca del perineum gruesas y

toscas

Estrías en el arco dorsal cerca del perineum no gruesas ni

toscas

M. artiellia

7

7. Estrías en el arco dorsal redondeadas formando

hombreras

Arco dorsal sin hombreras evidentes

M. arenaria8

8. Fasmidias grandes

Fasmidias muy pequeñas

M. naasiM. graminicola

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MORFOLOGÍA DEL PATRÓN PERINEAL DE LAS HEMBRAS DE Meloidogyne

2.1.- Meloidogyne incognita

2.19.- Meloidogyne hapla

1.1.- Morfología general de un

modelo perineal

2.7.- Meloidogyne javanica

2.13.- Meloidogyne arenaria

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PRÁCTICA #10. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS CON MANEJO DE CLAVES

INTRODUCCIÓN

Es muy importante que el estudiante adquiera a través de la práctica, la habilidad

para identificar los géneros de nemátodos más comunes, distinga sus rasgos

distintivos y determine su clasificación, la sintomatología que causan en las

plantas y los principales hospederos. Lo anterior es importante porque con

frecuencia los nemátodos son más dañinos de lo que puede imaginarse, por lo

que su determinación e identificación permiten al agrónomo aplicar las medidas de

control más eficientes.

OBJETIVOS: Que el alumno conozca y desarrolle la metodología necesaria para

identificar géneros de nemátodos, mediante el manejo de claves.


Para la realización de esta práctica es necesario contar con las “claves para la

identificación de nemátodos” de Fernando de la Jara A. y Filiberto Zerón B.

El desarrollo de la misma se basará en el manejo de las claves.

1.- Elaborar montajes a partir de muestras de nemátodos matados y fijados, los

montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente.

2.- Observar detalladamente las características del nemátodo bajo el microscopio

biológico con el objetivo 40x.

3.- Siga cuidadosamente la secuencia de la clave hasta llegar al género al que

pertenece el nemátodo en estudio.

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BIBLIOGRAFÍA

AGRIOS, G. N. (1995). Fitopatología, 2da. Ed. Limusa. México. 838 pp.

CEPEDA, S. M. (1995). Prácticas de nematología agrícola. Ed; Trillas. México. 109

pp.

GERARDO, A. M. (2002). Manual de prácticas de Micología. Juan José Ríos, Sin;

México. 35 pp.

JESSE, R. (1978). Fitonematología tropical. Campo experimental de la

Universidad de Puerto Rico, Puerto Rico. 256 pp.

MEREDITH, J. A. (1973). Algunos métodos de campo y laboratorio para trabajar

con nemátodos. Facultad de Agronomía. Universidad Central de Venezuela.

Maracay, Venezuela. 79 pp.

PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan

José Ríos, Sin; México. 20 pp.

THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York,

Estados Unidos. 553 pp.

YEPEZ, T. G. (1972). Los nemátodos enemigos de la agricultura, Imprenta

Universidad de Caracas; Universidad Autónoma de Venezuela, Facultad de

Agronomía. Venezuela. 220 pp.

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