APLICACIÓN DEL ANTICUERPO ANTI -BCG PARA LA DETECCIÓN DE ...

APLICACIÓN DEL ANTICUERPO ANTI-BCG PARA LA DETECCIÓN DE DIFERENTES MICROORGANISMOS EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA

ANABELLA FAJARDO BELTRÁN FANNY ANGÉLICA REY LINARES

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar por el título de

BACTERIÓLOGA

Trabajo presentado a: PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA

Trabajo realizado en: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LABORATORIO DE PATOLOGÍA

Director Asesor Dr. GERZAIN RODRÍGUEZ T Dra. MARCELA NEIRA Médico – Patólogo Bacterióloga Coordinador Laboratorio de Patología Laboratorio de Patología INSTITUTO NACIONAL DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Asesor Dr. FREDY GAMBOA PhD. Microbiología

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA BOGOTÁ D.C.

2001

APLICACIÓN DEL ANTICUERPO ANTI-BCG PARA LA DETECCIÓN DE DIFERENTES MICROORGANISMOS EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA

ANABELLA FAJARDO BELTRÁN

FANNY ANGÉLICA REY LINARES

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGÍA

BOGOTÁ D.C.

2001

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946:

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

tesis de grado.

APLICACIÓN DE ANTICUERPO ANTI-BCG PARA LA DETECCIÓN DE DIFERENTES

MICROORGANISMOS EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA

ANABELLA FAJARDO BELTRÁN

FANNY ANGÉLICA REY LINARES

Director Gerzain Rodriguez

Codirector

Asesor

Decano Facultad de Ciencias

Dr. Carlos Corredor

Directora Carrera de Bacteriología

Dra. Aura Rosa Manascero

Jurado

Jurado

A nuestras familias

por su confianza y apoyo

AGRADECIMIENTOS

CONTENIDO

Pág

CONTENIDO vii

LISTA DE TABLAS xi

LISTA DE FIGURAS xii

RESUMENINTRODUCCIÓN 1

1. JUSTIFICACIÓN 2

2. OBJETIVOS 3

2.1 OBJETIVO GENERAL 3

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3

3. MARCO TEÓRICO: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4

3.1 TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS 4

3.1.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 4

3.1.2 FUNDAMENTO TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS 6

3.1.2.1 TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA 7

3.1.2.2 MÉTODO AVIDINA-BIOTINA 8

4.1.2.3 ENZIMAS 9

3.2 Mycobacterium bovis (BCG) 10

3.2.1 MECANISMO DE ACCIÓN 11

3.2.2 APLICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-BCG 12

3.3 GÉNERO Mycobacterium 13

3.4 TUBERCULOSIS 15

3.4.1 Mycobacterium tuberculosis 15

3.4.2 TAXONOMÍA 17

3.4.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN 17

3.4.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS 19

3.4.4.1 TUBERCULOSIS PRIMARIA 19

3.4.4.2 TUBERCULOSIS SECUNDARIA 20

3.4.4.3 TUBERCULOSIS MILIAR 21

3.4.5 DIAGNÓSTICO 21

3.5 LEPRA 23

3.5.1 Mycobacterium leprae 23

3.5.2 TAXONOMÍA 23



3.5.4.1 CLASIFICACIÓN 25

3.5.4.2 LEPRA INDETERMINADA 26

3.5.4.3 LEPRA TUBERCULOIDE 27

3.5.4.4 LEPRA DIMORFA 27

3.5.4.5 LEPRA LEPROMATOSA 28

3.5.5 HISTOPATOLOGÍA 29


3.6 MICOBACTERIAS ATÍPICAS 32

3.6.1 TAXONOMÍA 32



3.6.3.1 ENFERMEDAD CUTÁNEA 37

3.6.3.2 ENFERMEDADES POSTOPERATORIAS 38

3.6.3.3 ENFERMEDAD PULMONAR 38

3.6.3.4 ENFERMEDAD DISEMINADA 38

3.6.3.5 INFECCIONES MISCELÁNEAS 38



3.7 ESPOROTRICOSIS 42

3.7.1 Sporothrix schenckii 42

3.7.2 TAXONOMÍA 42



3.7.4.1 ESPOROTRICOSIS CUTÁNEA Y LINFOCUTÁNEA 44

3.7.4.2 ESPOROTRICOSIS PULMONAR 44

3.7.4.3 ESPOROTRICOSIS OSTEOARTICULAR 45

3.7.4.4 ESPOROTRICOSIS DISEMINADA VICERAL 46



3.8 HISTOPLASMOSIS 48

3.8.1 Histoplasma capsulatum 49

3.8.2 TAXONOMÍA 49



3.8.4.1 HISTOPLASMOSIS PULMONAR AGUDA 51

3.8.4.2 HISTOPLASMOSIS PULMONAR CRÓNICA 52

3.8.4.3 HISTOPLASMOSIS DISEMINADA 52

3.8.4.4 HISTOPLASMOSIS CUTÁNEA PRIMARIA 53



3.9 LEISHMANIOSIS 55

3.9.1 Leishmania 55

3.9.2 TAXONOMÍA 56





4. MATERIALES Y MÉTODOS 65

4.1 TIPO DE ESTUDIO 65

4.2 MUESTRAS 65

4.2.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 65

4.3 CONTROLES 66

4.4 ESTANDARIZACIÓN 66

4.5 TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA CON ANTI-BCG 67

4.5.1 DESPARAFINIZACIÓN Y DESHIDRATACIÓN 67

4.5.2 DIGESTIÓN ENZIMÁTICA 68

4.5.3 BLOQUEO ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ENDÓGENA 68

4.5.4 DESENMASCARAMIENTO DE ANTÍGENO 68

4.5.5 BLOQUEO DE REACCIÓN CRUZADA 69

4.5.6 ANTICUERPO ANTI-BCG 69

4.5.7 ANTICUERPO ANTI-CONEJO BIOTINILADO 69

4.5.8 COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA (ABC) 69

4.5.9 REVELADO 70

4.5.10 COLORACIÓN DE CONTRASTE 70

4.5.11 REHIDATACIÓN 70

5. RESULTADOS 71

5.1 ESTANDARIZACIÓN 71

5.2 TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA CON ANTI-BCG 71

6. DISCUSIÓN 83

7. CONCLUSIONES 86

8. RECOMENDACIONES 87

9. BIBLIOGRAFÍA 88

LISTA DE TABLAS

Pág

Tabla 1. Clasificación de lepra 26

Tabla 2. Clasificación de las micobacterias atípicas por Runyon 33

Tabla 3. Clasificación actual de las micobacterias atípicas 34

Tabla 4. Síndromes clínicos causados por Leishmania y su distribución

geográfica 59

Tabla 5. Resultados de técnica inmunohistoquímica con anti-BCG 73

LISTA DE FIGURAS

Pág

Figura 1. Mecanismos de virulencia de M. tuberculosis 16

Figura 2. Piel leproma. Coloración ZN. 800x. 74

Figura 3. Piel leproma. Técnica IHQ anti-BCG. 40x. 74

Figura 4. Tuberculosis miliar pulmón. Coloración ZN. 400x. 75

Figura 5. Tuberculosis miliar pulmón. Técnica IHQ anti-BCG. 800x. 75

Figura 6. Granuloma por micobacteria atípica. Coloración ZN. 800x. 76

Figura 7. Granuloma por micobacteria atípica. Técnica IHQ anti-BCG. 800x 76

Figura 8. Lepra post-tratamiento. Coloración H&E. 800x 77

Figura 9. Lepra post-tratamiento. Técnica IHQ anti-BCG. 800x 77

Figura 10. Esporotricosis. Técnica IHQ anti-S. schenckii. 400x 78

Figura 11. Esporotricosis. Técnica IHQ anti-BCG. 1000x 78

Figura 12. Esporotricosis. Técnica IHQ anti-BCG. 2000x 79

Figura 13. Histoplasmosis. Técnica IHQ anti-BCG. 400x,800x. 80

Figura 14. Leishmaniosis experimental. Técnica IHQ anti-BCG. 800x. 81

Figura 15. Leishmaniosis cutánea humana. Técnica IHQ anti-BCG. 800x. 81

Figura 16. Escrofuloderma. Técnica IHQ anti-BCG. 400x, 800x. 82

RESUMEN

El anticuerpo policlonal anti-BCG tiene gran capacidad para reaccionar frente a diferentes

determinantes antigénicos tanto del género Mycobacterium como de otros

microorganismos.

En este trabajo se evaluó la funcionalidad de la técnica inmunohistoquímica (IHQ) con un

anticuerpo policlonal anti-BCG para la detección de antígenos de microorganismos en

tejidos incluidos en parafina. Para tal fin se estandarizó la técnica y se ensayó en

diferentes patologías infecciosas.

Para la estandarización se realizaron variaciones a la metodología convencional y se

utilizaron casos de TBC miliar y lepra lepromatosa con los que se obtuvo como dilución

óptima del anticuerpo 1:300.

Con la técnica IHQ con el anticuerpo anti-BCG se obtuvieron los siguientes resultados: en

12 casos de lesiones por micobacterias atípicas que presentaban tinción de Ziehl-Neelsen

negativa, se observó antígeno intensamente marcado dentro de los macrófagos. En 4

biopsias de pacientes con lepra tratada y curada, se observó marcación persistente de

antígeno dentro de los macrófagos. En 9 casos de esporotricosis se observó tinción de la

levadura, mejor aún que con el anticuerpo anti-Sporothrix shcenckii. En histoplasmosis se

observó marcación con el anticuerpo en los 6 casos. Y en leishmaniosis el resultado fue

positivo para el total de los casos trabajados.

Con los resultados obtenidos se confirma la alta sensibilidad que posee el anticuerpo anti-

BCG, lo que le permite demostrar la presencia de varios antígenos de diferentes

micobacterias y del Sporothrix schenkii entre otros. Aunque la técnica posee una baja

especificidad es muy útil en un laboratorio de patología.

1. INTRODUCCIÓN

En el incremento de patologías infecciosas mundialmente están involucrados factores

como la pobreza, drogadicción, multirresistencia a la terapia, indigencia y la pandemia del

VIH entre otras (1), acentuándose en países como Colombia debido a las condiciones de

vida. Para la realización de un diagnóstico acertado de este tipo de patologías, se debe

realizar un análisis interdisciplinario en el cual el área de la histopatología juega un papel

importante.

El diagnóstico de patologías que involucran daño tisular por parte de microorganismos,

presenta algunos inconvenientes como son, el que este se encuentre en poca cantidad o

que haya sido procesado por células fagocíticas que dañan la estructura del mismo (2). Es

por esta razón, que los métodos convencionales no siempre son óptimos puesto que están

diseñados para demostrar el agente causal basándose en sus propiedades físico-químicas

(3), mientras que las técnicas inmunológicas que involucran anticuerpos policlonales,

pueden asegurar una alta sensibilidad al detectar no solo el microorganismo si no también

su antígeno degradado (4,5).

En el laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud (INS), se trabajó la técnica

inmunohistoquímica (IHQ) con el anticuerpo policlonal anti-BCG, el cual demostró tener

una alta sensibilidad al unirse a determinantes antigénicos de diferentes microorganismos

como Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium leprae, otras micobacterias y algunos

hongos como Histoplasma capsulatum y Sporothrix schenckii, siendo en este último, de

gran utilidad en el diagnóstico, ya que se logra observar la levadura como agente causal.

2. JUSTIFICACIÓN

En la rutina histopatológica se hace necesaria la identificación de los agentes infecciosos

causales de enfermedad mediante diversos métodos como son, la tinción, la

inmunolocalización del antígeno o algunas tan complejas como las basadas en biología

molecular.

Las técnicas utilizadas en el laboratorio de patología, ayudan a la localización de la zona

lesionada y a identificar el posible agente infeccioso causal de la misma, sin embargo, se

pueden presentar fallas en la detección del microorganismo, debidas a que en algunos

casos este ya no se encuentra en forma completa sino que esta fraccionado o ha sido

digerido por macrófagos.

Es por esta razón que se hace necesaria la utilización de una técnica que permita la

localización del antígeno, que sea lo suficientemente sensible para la detección de un

amplio espectro de determinantes antigénicos comunes entre diferentes especies y que a

su vez sea de fácil manejo para poder ser empleada tanto en diagnóstico como en

propósitos de investigación.

Para tal fin, se utilizó un anticuerpo policlonal anti-Mycobacterium bovis BCG (Bacilo de

Calmette - Guérin) que es capaz de reaccionar con aproximadamente 100 antígenos

diferentes de BCG, siendo muchos de estos compartidos con otras micobacterias y en

algunos casos comunes con varias especies bacterianas y fúngicas (4,5).

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la funcionalidad de la técnica inmunohistoquímica con el anticuerpo policlonal anti–BCG en la demostración de antígenos de diferentes microorganismos en tejidos incluidos en parafina del laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud.

3.2 OBETIVOS ESPECÍFICOS

Estandarizar la técnica inmunohistoquímica con el anticuerpo policlonal anti–BCG

para la detección de antígenos en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina.

Determinar la utilidad de la técnica en diferentes entidades infecciosas de origen

bacteriano, protozoario y fúngico, de interés para el laboratorio de Patología del

Instituto Nacional de Salud.

4. MARCO TEÓRICO: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

4.1 TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS

4.1.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

FIJACIÓN: los tejidos deben ser fijados, para preservarlos evitando autolísis de sus

células. El formol es un fijador que actúa por reticularización ya que desnaturaliza las

proteínas, rompiendo los puentes de hidrógeno, formándose una malla reticular

polipeptídica por asociación química entre los grupos activos desenmascarados por el

líquido fijado. Se debe tener en cuenta que este fijador altera más a los antígenos

ricos en proteínas que los ricos en carbohidratos (6).

INCLUSIÓN: para este proceso se utiliza la parafina caliente que puede llegar a

producir perdida de la antigenicidad, por lo que el tiempo de infiltración deberá

disminuirse al mínimo y se deben emplear parafinas de bajo punto de fusión. La

parafina a su vez puede aumentar la tinción de fondo, por lo que es necesario realizar

una desparafinización completa de las preparaciones histológicas antes de la

inmunotinción (6).

CORTES Y ADHESIVOS: los cortes en parafina se realizan en un micrótomo (3 a 5 µm)

y se colocan en láminas previamente tratadas con un adhesivo que puede ser poly-L-

lisina, albúmina de huevo o cromo gel, que ayudan a que el tejido soporte todo el

proceso dejándolas toda la noche en horno a 60ºC. A continuación se desparafinan

cuidadosamente en xilol, llevándose hasta alcohol absoluto e hidratándose (6).

DIGESTIÓN ENZIMÁTICA: la pérdida de antigenicidad ocasionada por los fijadores que

contienen aldehídos como el formol, puede restablecerse por medio de la digestión

enzimática con enzimas como proteasa, tripsina y pronasa entre otras, ya que estas

ayudan a descubrir los diferentes antígenos presentes en el tejido (6).

BLOQUEO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ENDÓGENA: si en la técnica

inmunoenzimática se utiliza como marcador una enzima normalmente presente en el

tejido, se debe inhibir su actividad endógena antes de la inmunotinción, de lo

contrario, la enzima endógena reaccionará con el sustrato empleado para localizar la

enzima marcadora, dando lugar a falsos positivos. Para el bloqueo de la peroxidasa

endógena se emplea peroxido de hidrógeno disuelto en metanol (6).

INCUBACIÓN: para prevenir la evaporación del antisuero, las incubaciones se llevan a

cabo en una atmósfera húmeda, preferiblemente en cámara de incubación, puesto que

la temperatura influye en la velocidad de reacción antígeno-anticuerpo. Si se realizan

incubaciones cortas el procedimiento se hará a temperatura ambiente; pero si por el

contrario, se aplican incubaciones largas se deberá mantener la cámara húmeda a 4ºC

(6).

REVELADO: es el proceso mediante el cual, se pone de manifiesto el lugar de la

reacción antígeno-anticuerpo por la adición del sustrato, la enzima y de un cromógeno

(6).

CONTROLES: en el control negativo, se omite el anticuerpo primario y se sustituye por

suero no inmune o buffer; si el resultado es positivo se deberá a una reacción

inespecífica. Para control positivo, se utiliza una sección de tejido de la que se tenga

certeza absoluta de que tiene el antígeno por determinar. Así, si con un control

positivo la técnica es negativa será debido a un defecto de fijación o a cualquier fallo

en el procedimiento técnico (6).

4.1.2 FUNDAMENTO TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS

Las técnicas inmunohistoquímicas son técnicas de inmunolocalización que utilizan una

enzima como trazador del marcaje. Al llevarse a cabo la reacción antígeno-anticuerpo

esta se visualiza añadiendo el sustrato de la enzima más un cromógeno, el producto

originado al actuar la enzima sobre el sustrato, interacciona a su vez sobre el cromógeno,

dando lugar a un precipitado insoluble y coloreado (6). En estas pueden utilizarse tanto

anticuerpos monoclonales como policlonales.

ANTICUERPOS POLICLONALES: son anticuerpos que van dirigidos contra los diferentes

epítopes o determinantes antigénicos de un inmunógeno. Estos anticuerpos, son

elaborados inmunizando un animal hospedero con una molécula específica, en la que

se encuentran diferentes determinantes antigénicos, frente a los cuales se pretende

obtener anticuerpos. El animal produce numerosas clonas de células plasmáticas;

cada una de las cuales es capaz de sintetizar un anticuerpo con especificidad diferente

para cada uno de los epítopes presentes en el inmunógeno (6).

ANTICUERPOS MONOCLONALES: van dirigidos específicamente contra un epítope de

un inmunógeno. Se elaboran fusionando la célula productora de anticuerpos (Linfocito

B) específicos para el epítope deseado, con una célula que tenga ilimitada capacidad

de división (célula de mieloma), de este modo la célula fusionada o hibridoma será

capaz de vivir en un medio de cultivo selectivo, dividirse y producir anticuerpos

específicos (6).

4.1.2.1. TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA

Método directo: es el procedimiento más sencillo pero el menos sensible para la

detección de antígenos. En este, el anticuerpo que va dirigido contra el antígeno

(anticuerpo primario) se une de forma covalente a la peroxidasa (7).

Método indirecto: en este procedimiento el anticuerpo primario o específico sin

conjugar se une al antígeno presente en el tejido, posteriormente se añade un

anticuerpo marcado con el trazador enzimático (anticuerpo secundario), obtenido de

un animal diferente al primario y específico para el animal y la clase de

inmunoglobulina que constituye el anticuerpo primario (7).

Método de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP): este procedimiento desarrollado

por Sternberger y colaboradores en 1970 se utiliza como trazador de inmunocomplejos

formados por la enzima peroxidasa y anticuerpos específicos dirigidos contra ella. La

peroxidasa se obtiene del rábano picante mediante un proceso de purificación y se

inocula a un animal para obtener los anticuerpos dirigidos contra la enzima. De este

modo, al poner en contacto los anticuerpos con la peroxidasa, se forman complejos

antígeno-anticuerpo (complejos peroxidasa-antiperoxidasa o PAP) a través de una

reacción de precipitación. Estos complejos están formados por tres moléculas de

peroxidasa y dos de anticuerpo antiperoxidasa (7).

4.1.2.2. MÉTODO AVIDINA-BIOTINA

Son procedimientos muy sensibles que utilizan anticuerpos marcados y se basan en la

gran afinidad que poseen entre sí las moléculas de biotina y avidina, de forma que se

genera un fuerte enlace no inmune (6).

La avidina es una glicoproteína de alto peso molecular que esta presente en la clara de

huevo y en la bacteria Streptomyces avidinii. Esta molécula esta formada por cuatro

subunidades que configuran una estructura terciaria con cuatro regiones hidrofóbicas de

unión con la biotina (6).

La biotina es una vitamina de bajo peso molecular perteneciente al

complejo B (vitamina H) que se encuentra en la yema del huevo. Se

conjuga fácilmente con anticuerpos y enzimas trazadoras, ligándose de

forma covalente a cadenas laterales amino o carbonilo de residuos

aminoácidos o de azúcares de proteínas y glicoproteínas. Se considera que

pueden unirse hasta 150 moléculas de biotina a una sola molécula de

anticuerpo (6).

En todos los métodos inmunoenzimáticos que utilizan el procedimiento

avidina-biotina, se realiza el marcaje del anticuerpo primario con biotina

(técnica directa) o del anticuerpo secundario (técnica indirecta).

Método puente avidina-biotina: en este se realiza una unión del

anticuerpo biotilinado con avidina sin marcar para ligar a continuación

este complejo con una enzima también biotilinada (7).

Método de complejo avidina-biotina o ABC: se aplica un complejo de

avidina y trazador enzimático biotilinado que contenga lugares de unión

libres en la avidina para que se produzca la fijación sobre el anticuerpo

primario o secundario biotilinado (7).

4.1.2.3. ENZIMAS

PEROXIDASAS: son enzimas que catalizan la oxidación de diversas

sustancias a través de su reacción con el peroxido de hidrógeno (H2O2).

Son muy abundantes tanto en vegetales (rábano picante) como en

tejidos animales (mieloperoxidasa de leucocitos); tienen actividad

pseudoperoxidásica la hemoglobina y ciertas enzimas oxidorreductoras

(catalasas). Como método que más se utiliza para la detección de

peroxidasas, el es el de la bencidina. Esta es una sustancia difenólica

particular que se oxida en presencia de oxígeno naciente. Sin embargo,

el método emplea un derivado de la bencidina, la 3´3-diaminobencidina

la cual proporciona colores estables. El sustrato descompuesto por la

enzima para la obtención de oxígeno, es el peróxido de hidrógeno (6).

FOSFATASA ALCALINA: es una enzima capaz de hidrolizar los ésteres

de fosfato en un medio alcalino, la demostración de la actividad de esta

enzima se realiza empleando naftol-AS-fosfato como sustrato y sales de

diazonio tipo fast red TR o fast blue BB como agente de copulación, el

resultado de la reacción es un colorante azoico rojo o azul. El principal

inconveniente de los métodos que utilizan la fosfatasa alcalina como

trazador, es la necesidad de utilizar un medio de montaje acuoso para

la confección definitiva de las preparaciones. Sin embargo, con los

nuevos procedimientos de revelado mediante neofucsina se obtiene un

compuesto también de color rojo e insoluble tanto en agua como en

disolventes orgánicos (6).

GLUCOSA OXIDASA: es una enzima aislada del Aspergillus niger y de la

que no existe actividad endógena en mamíferos. Histoquímicamente se

demuestra por la oxidación de la glucosa con reducción simultánea de

una sal de tetrazolio incolora que se transforma en un azul formazan

estable y no difusible (6).

4.2 Mycobacterium bovis (BCG)

Mycobacterium bovis es productor de enfermedad fundamentalmente en animales aunque

también puede ser adquirido por el hombre, constituyéndose en la mayoría de los casos

en una enfermedad de tipo profesional. La enfermedad que produce en el hombre es

indistinguible de la causada por el M. tuberculosis (8).

La cepa atenuada del Mycobacterium bovis contenida en la vacuna del bacilo Calmette–

Guérin (BCG), fue inicialmente aislada de la ubre de una vaca con tuberculosis, por Nocard

en el año de 1902 (9).

En el mismo año Calmette y Guérin iniciaron una serie de trabajos con cultivos de este

microorganismo utilizando un medio con glicerol, papa y bilis. Años más tarde y después

de 230 pases lograron obtener una cepa lo suficientemente atenuada, apropiada para ser

utilizada como vacuna y de la cual se dispuso solo hasta el año de 1921 (9).

Sin embargo, en 1930 para Calmette y Guérin fue necesario hacer diferentes

demostraciones de la inocuidad de la vacuna luego de lo ocurrido en Lubeck (Alemania),

cuando por error 251 recién nacidos fueron “vacunados” con una cepa virulenta del bacilo,

de los cuales fallecieron 71 niños (10).

La vacunación tiene por objeto proteger a los no infectados especialmente a las

poblaciones donde existe un gran número de tuberculosos bacilíferos, lo que lleva a que el

riesgo de transmisión sea elevado (10). Su función es reemplazar una infección natural

virulenta por otra, con una cepa de BCG no virulenta pero que es capaz de estimular una

respuesta inmune y que en el huésped creará una protección frente a nuevas infecciones

causadas por M. tuberculosis o por otras micobacterias como M. leprae frente al que ha

mostrado conferir mayor protección en algunos ensayos clínicos poblacionales (11).

4.2.1 MECANISMO DE ACCIÓN

El mecanismo de protección ofrecido por la vacuna BCG, involucra una reacción en la

diseminación hematógena del bacilo desde el sitio de la infección primaria. La vacuna

protege contra las manifestaciones agudas de la enfermedad y reduce el riesgo de

reactivación endógena a lo largo de la vida y de diseminación a partir de un foco adquirido

por una primoinfección. No hay evidencia de que la BCG reduzca el riesgo de infección o

reinfección (12). Sin embargo, hay un consenso acerca del efecto protector de esta

vacuna contra meningitis y las formas diseminadas de la tuberculosis en la infancia (13).

Una vez introducida en el organismo, la vacuna activa la multiplicación y sensibilización de

los Linfocitos T (14).

Ventajas de la vacuna: entre estas tenemos su inocuidad, bajo costo, solo se

requiere de una dosis la cual se puede suministrar a cualquier edad y su alta

inmunogenicidad (12).

Desventajas: la vacuna está compuesta por microorganismos vivos que han sido

sometidos a varios cambios desde la cepa original que pueden haber modificado sus

características inmunogénicas y su virulencia. No previene la infección tuberculosa

pero sí sus manifestaciones más agudas. Presenta mejor eficacia en zonas tropicales

donde existe prevalencia alta de otras micobacterias no tuberculosas. Interfiere con la

utilización diagnóstica de la reacción tuberculínica. Es lábil a la luz y al calor y a pesar

de su inocuidad, presenta complicaciones que van desde la ulceración local y cicatrices

queloideas hasta la osteitis y diseminación (12).

4.2.2 APLICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-BCG

Los anticuerpos anti-BCG, son anticuerpos policlonales capaces de reaccionar contra

diferentes determinantes antigénicos solubles e insolubles de M. bovis (5).

Estos anticuerpos han sido utilizados en técnicas inmunológicas como la

contrainmunoelectroforesis, donde se pudo observar la reacción cruzada que presentan

estos con diferentes determinantes antigénicos de las micobacterias y con algunas

especies de bacterias de diferente familia a la Mycobacteriaceae, entre estas se

encuentran Nocardia asteroides, Corynebacterium pyogenes y Listeria monocytogenes (5).

También se ha comprobado su utilidad en técnicas inmunohistoquímicas (IHQ). En el año

de 1990, un estudio realizado en la Universidad de Texas confirmó la efectividad de la

reactividad cruzada que presentan estos anticuerpos policlonales (anti-BCG) en un trabajo

realizado en biopsias con hiperplasia pseudoepiteliomatosa. La positividad se observó

mediante la reacción de color dada por la presencia del antígeno ubicado en los focos

supurativos descubriéndose así casos de Nocardiosis cutánea primaria los cuales fueron

confirmados por cultivo (15). Estos estudios de reactividad cruzada, han llevado a la

experimentación con otras patologías como micosis en las cuales se ha observado una

reacción positiva con el anticuerpo (16).

Su utilización para la detección de una amplia gama de microorganismos en tejidos fijados

en formol e incluidos en parafina es posible gracias a su alta sensibilidad a la que se le

suma el hecho de que son capaces de reaccionar con cerca de 100 antígenos diferentes

de BCG los cuales son comunes para otras micobacterias e incluso algunos son

compartidos con diferentes especies (4).

Recientemente, Julie Byrd y col. utilizaron una técnica con anticuerpo anti-BCG en biopsias

de pacientes con micosis causadas por Sporothrix shenckii, en las cuales fue posible

detectar tanto antígeno digerido por macrófagos como las levaduras que conservaron su

integridad estructural durante todo el proceso (17).

4.3 GÉNERO Mycobacterium

Las enfermedades ocasionadas por micobacterias constituyen un capítulo importante en la

patología infecciosa humana, con enfermedades tan antiguas como la tuberculosis y la

lepra (18).

El género Mycobacterium incluye más de 100 especies que pueden clasificarse en seis

grupos desde el punto de vista bacteriológico pero con fines didácticos se dividen en tres

apartados:

COMPLEJO TUBERCULOSIS. Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis

(incluida la cepa BCG) y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de

tuberculosis. Se incluye también Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en la

rata (19).

COMPLEJO LEPRA. En el que se incluyen las especies M. leprae productor de la lepra

humana y Mycobacterium lepraemurium que produce lepra en roedores (19).

OTRAS MICOBACTERIAS. Son micobacterias no comprendidas en los dos grupos

anteriores. Sólo algunas de ellas suelen ser patógenas oportunistas y otras suelen ser

saprófitas. Producen las denominadas infecciones por micobacterias atípicas (19).

Los principales antígenos de las micobacterias se dividen en dos grandes grupos:

Solubles o citoplasmáticos.

Insolubles ligados a la pared celular (18).

En relación con la naturaleza de los antígenos solubles se sabe que hay:

De naturaleza polisacárida comunes a todas las micobacterias y constituidos por

arabinosa, arabinogalactanos y glucanos (18).

Proteínas, entre ellas la denominada tuberculina vieja (OT) o el Derivado Proteico

Purificado (PPD). También el antígeno 5 o el de 65 Kda (18).

Lipídica, los monóxidos de fosfatidil inositol (PIM) constituyen una familia de lípidos

polares que se encuentran presentes en la membrana plasmática de las micobacterias.

Entre ellos se pueden citar los glicolípidos fenólicos, bastante específicos para M.

leprae (PGL-1), para M. kansasii (PGL-Kl) y para M. tuberculosis (PGL-Tbl) (18).

El denominado antígeno 60 (Ag 60) es un complejo proteico-lipopolisacárido

procedente del citoplasma y de la membrana celular del M. bovis BCG y es común a M.

tuberculosis, M. bovis y otras micobacterias (18).

Estudiando los antígenos mediante doble difusión en gel, se han establecido cuatro

grandes grupos con mayor o menor especificidad:

Grupo I: compuesto por antígenos comunes compartidos por todas las micobacterias

e incluso con algún otro género bacteriano como Nocardia o Corynebacterium (18).

Grupo II: estaría formado por antígenos propios de las micobacterias de crecimiento

lento (18).

Grupo III: en este estarían incluidos los antígenos de las micobacterias de

crecimiento rápido y nocardias (18).

Grupo IV: constituido por antígenos propios de cada especie (18).

Los antígenos insolubles ligados a pared se han usado con fines taxonómicos mediante

aglutinación por especies no rugosas como el M. avium, estableciéndose serotipos con

excepción del M. tuberculosis en el cual estos procedimientos no resultan útiles puesto

que este produce autoaglutinación (18).

4.4 TUBERCULOSIS

Desde el siglo pasado cuando el Doctor Robert Koch, descubrió el bacilo de la tuberculosis

los investigadores han buscado numerosas estrategias con el fin de controlar la epidemia

que ha durado milenios y que cada año le cuesta la vida a millones de personas en el

mundo entero (8).

A partir de la década de los cuarenta, cuando se desarrollaron las primeras terapias

realmente efectivas contra la enfermedad la comunidad científica pensó ingenuamente

que era posible erradicarla por completo. Así, en naciones industrializadas era evidente el

descenso progresivo en el número de victimas hasta el punto que a comienzos de los 80´s

ya no era considerado un problema de salud pública en abierto contraste con los datos

obtenidos en países en vía de desarrollo, donde la epidemia continuaba campante (8).

4.4.1 Mycobacterium tuberculosis

El bacilo de la tuberculosis suele tener una morfología característica, se presenta de forma

recta o ligeramente curvo en frotis teñidos y su tamaño es de 1 a 4 µm de largo por 0.3 a

0.5 µm de ancho. Ocasionalmente forman ramificaciones verdaderas y se observan en

cultivos enriquecidos o en frotis de ganglios linfáticos caseosos. No son formadores de

esporas y no poseen flagelo o cápsula. Las micobacterias son aerobios estrictos (20).

Son bacilos ácido-alcohol-resistentes, por lo que la tinción de Ziehl Neelsen es útil para la

coloración de estos microorganismos obtenidos ya sea de muestras clínicas o de cultivo.

Los bacilos tuberculosos son difíciles de teñir con tinción de Gram pero aunque de forma

irregular se alcanzan a teñir como gram positivos (2). Estructuralmente consta de una

gruesa pared separada de la membrana celular por el espacio periplásmico. Posee cuatro

capas perfectamente definidas compuestas así: la más interna es el glicopeptido o

peptidoglicano con moléculas de N-acetilglucosamina y ácido N-glucorilmurámico (en lugar

del habitual N-acetilmurámico) con cortas cadenas de alanina. Externamente hay otras

tres capas compuestas, una por polímeros de arabinosa y galactosa y otra formada por

ácidos micólicos (que son ácidos grasos derivados, de gran importancia taxonómica en

micobacterias y otros géneros relacionados como Nocardia) y otra superficial formada por

lípidos como los sulfolípidos, el cord factor, llamado así por su aparente asociación con la

forma acordonada con que se agrupan las micobacterias virulentas y los micósidos que

son al igual que el anterior glicolípidos. Los bacilos tuberculosos tienen un crecimiento

muy lento, incluso en condic iones óptimas se requiere de 10 a 20 días de incubación a

37ºC (22).

Figura 1. Mecanismos de virulencia de M. tuberculosis . (Tomado de ILADIBA).

(23).

Los tres principales factores de virulencia de M. tuberculosis son:

A) Actividad catalasa-peroxidasa.

B) El factor colonizador de macrófagos, que se encuentra codificado por el gen mce.

C) Moléculas relacionadas con el gen sigA (tales como esterasa, fosfolipasas y lipasas)

(23).

4.4.2 TAXONOMÍA

- Reino: Procaryotae

- Clase: Schyzomycetes

- Familia: Mycobacteriaceae

- Género: Mycobacterium

- Especie: tuberculosis

(24).

4.4.3 EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓN

La tuberculosis constituye una de las enfermedades infecciosas de mayor prevalencia y es

la principal causa de muerte por enfermedad prevenible a nivel mundial. Así, hoy la

tuberculosis supone un importante problema de salud pública con una incidencia que se

ha elevado en muchos países en los últimos años (25).

La epidemia de la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana, el aumento de la

indigencia en los grandes centros urbanos y la inmigración de habitantes de áreas

geográficas con alta prevalencia de tuberculosis, se han señalado como las causas más

importantes que han contribuido a revertir la curva decreciente de nuevos casos de

tuberculosis que se venia observando en los países occidentales (25).

El riesgo de padecer tuberculosis es variable dependiendo de la presencia de

determinados factores. La adquisición de la infección tiene lugar por vía aérea, con un

riesgo que es similar para todos los individuos, variando exclusivamente con la capacidad

infectiva de la persona enferma y la proximidad del contacto. Tras la infección primaria, la

progresión a enfermedad es variable de una persona a otra. En los niños menores de 5

años y en personas inmunodeprimidas existe un riesgo elevado de una rápida progresión

(en semanas o meses) a enfermedad activa, con frecuencia diseminada. En los adultos no

inmunocomprometidos existe mayor posibilidad de que la infección entre en estado de

latencia con un riesgo de reactivación en los años siguientes (26).

Las personas con infección latente pueden ser identificadas mediante la prueba de la

tuberculina (PPD), que permite detectar a las personas infectadas para que se puedan

beneficiar de recibir quimioprofilaxis evitándose así el desarrollo de la enfermedad (27).

Ocasionalmente, en las personas inmunocompetentes, la tuberculosis puede presentarse

con afectación extrapulmonar o diseminada. Aunque estas son las formas clínicas más

frecuentes en pacientes con SIDA o inmunocomprometidas. Entre los órganos que con

mayor frecuencia se afectan se incluyen los ganglios linfáticos, hígado, bazo, riñón,

sistema nervioso central y el pericardio. No es raro el aislamiento de M. tuberculosis a

partir de sangre de pacientes inmunocomprometidos (27).

En 1993 la Organización Mundial de la Salud declaró la tuberculosis como emergencia

global, pues su incidencia ha venido experimentando un preocupante incremento en todo

el mundo, gracias a la epidemia de infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana, al

deterioro de las condiciones de vida en varias naciones y al descuido de las políticas de

salud destinadas a su control. Se calcula que un tercio de la población mundial (dos mil

millones de personas), está infectada por Mycobacterium tuberculosis (28).

4.4.4 MANIFESTACIONES CLÍNICAS

Clínicamente la tuberculosis puede presentarse como: tuberculosis primaria; tuberculosis

secundaria y tuberculosis miliar (20).

4.4.4.1. TUBERCULOSIS PRIMARIA

Esta infección se presenta en personas que no han tenido contacto previo con el

microorganismo. Aunque los bacilos suelen ingresar por el sistema respiratorio, en

ocasiones también lo pueden hacer por el tracto digestivo, por inoculación cutánea o

subcutánea. Los bacilos inhalados suelen depositarse en los alvéolos ubicados justo

debajo de la pleura, por lo general en la parte inferior de los lóbulos superiores o en la

parte superior de los lóbulos inferiores, esto se debe a que en estas áreas se recibe el

mayor volumen de aire inspirado. La infección inicial solo causa alteraciones leves

acompañados en algunas oportunidades de malestar general y fiebre. Como no hay

linfocitos T sensibilizados los bacilos se pueden multiplicar libremente, pasando al torrente

sanguíneo o linfático y la inmunidad celular tarda en desarrollarse un período de más o

menos tres a seis semanas (20).

La infección primaria produce de manera característica un complejo llamado (Complejo de

Ghon), que se presenta como una sola lesión en el parénquima pulmonar, por lo general

subpleural, la cual se ve acompañada de una lesión en los ganglios linfáticos hiliares que

drenan esa parte del pulmón. Esta lesión es típicamente un nódulo gris y circunscrito de

1cm. que se torna granulomatoso a los pocos días. Por la segunda semana adquiere un

centro blando de necrosis caseosa. Los bacilos drenan por las vías linfáticas, infectando

los ganglios linfáticos, formando así la segunda parte del Complejo de Ghon (20).

En la mayoría de los adultos normales, la infección sigue su curso limitado curando las

lesiones del complejo mediante retracción, fibrosis cicatricial y calcificación. La mayoría de

los microorganismos mueren pero algunos pueden continuar viables durante años. Si los

mecanismos inmunes se debilitan o fallan los bacilos inactivos pueden emerger y causar

una grave infección tuberculosa (20).

La tuberculosis primaria progresiva se da cuando la respuesta inmune no logra controlar la

multiplicación de los bacilos, por ello esta es más común en niños menores de 5 años y en

inmunocomprometidos, en estos, el foco de Ghon se agranda en el pulmón y rápidamente

erosiona el árbol bronquial y se propaga ocasionando lesiones satelitales. Paralelamente

se produce una neumonía tuberculosa (20).

4.4.4.2. TUBERCULOSIS SECUNDARIA

Esta suele ocurrir por reactivación de los microorganismos endógenos inactivos en un

paciente sensibilizado y en algunos casos la enfermedad se debe a reinfección por bacilos

exógenos. La tuberculosis secundaria puede ocurrir en cualquier momento después de

una tuberculosis primaria. La reactivación se inicia típicamente en los segmentos apicales

o posteriores de uno o ambos lóbulos superiores, en donde los microorganismos fueron

sembrados durante la infección primaria, en este caso las lesiones son periféricas y

cavitarias. Una cápsula fibrosa rodea a un centro acelular caseoso que contiene

numerosos bacilos de Koch (20).

Los síntomas de esta tuberculosis comienzan con tos, posteriormente aparece febrícula

acompañada de malestar general, cansancio, anorexia, adelgazamiento y a menudo

sudoración nocturna. A medida que la enfermedad progresa aparece expectoración

sanguinolenta. La rotura de una rama de la arteria pulmonar en la pared de la cavidad

produce hemoptisis masiva con asfixia (20).

Estas lesiones pueden presentar diferentes efectos secundarios: 1) Fibrosis y calcificación;

2) propagación a otras áreas; 3) fibrosis pleural con adherencias, dolor pleurítico en

puñalada y disnea; 4) rotura de una lesión caseosa que libera bacilos dentro de la cavidad

pleural y 6) implantación de bacilos en la laringe ocasionando laringitis (20).

4.4.4.3. TUBERCULOSIS MILIAR

Es la forma diseminada, se produce por la siembra de bacilos en vasos linfáticos o

sanguíneos con producción de minúsculas lesiones blanco-amarillentas. Los sitios más

comunes de las lesiones miliares son: el pulmón, ganglios linfáticos, riñones,

suprarrenales, medula ósea, bazo, hígado, meninges, encéfalo, ojos y genitales (20).

4.4.5 DIAGNÓSTICO

El diagnóstico actual de la tuberculosis se basa esencialmente en las mismas técnicas

bacteriológicas que enseñó Robert Koch hace más de 100 años. Sin embargo, si bien la

baciloscopia tiene una alta especificidad, es poco sensible en las formas menos avanzadas

de la enfermedad. Además es un procedimiento que requiere de personal entrenado y de

laboratorios especiales. El cultivo aumenta la sensibilidad diagnóstica, a expensas de un

mayor costo y de una demora de 4 a 8 semanas (29).

Durante el último decenio se ha tomado conciencia que para lograr la erradicación de la

tuberculosis, es más importante mejorar los métodos diagnósticos que intentar seguir

perfeccionando el tratamiento de la enfermedad. Es así como en los últimos años se han

estado introduciendo nuevas técnicas que prometen revolucionar en un futuro próximo el

manejo de la tuberculosis y otras enfermedades infecciosas y aún el de muchas

enfermedades crónicas como el cáncer (29). Entre las técnicas de diagnóstico de la

tuberculosis tenemos:

Técnicas químicas: el método más recientemente desarrollado es el “high

performance liquid cromatography” (HPLC), el cual es capaz de detectar cantidades

mínimas de determinadas sustancias químicas producidas por la micobacteria en los

líquidos orgánicos, amplificando señales hasta en un millón de veces. Sin embargo,

aunque muy prometedor este procedimiento resulta ser muy costoso ya que requiere

de métodos radioactivos y otros de cromatografía de gases y espectrómetro de masas

(30).

Técnicas radiométricas: para este se emplean unos frascos que contienen un medio

de cultivo de Middlebrook enriquecido, rico en ácido palmítico y otros ácidos grasos

marcados con carbono 14 (C14). Este isótopo emite radiaciones â que son de baja

longitud y por lo tanto son inofensivas para el personal de laboratorio. Con este

procedimiento se establece un “índice de crecimiento”, resultando ser un método de

alta sensibilidad y especificidad con el que se permite hacer el diagnóstico en menos

de una semana en el 95% de los casos (31).

Detección de anticuerpos: con esta técnica se busca, identificar y cuantificar en el

suero del enfermo, los anticuerpos dirigidos contra los antígenos más específicos de la

micobacteria (32).

Detección de antígenos: en tuberculosis cada día aparecen nuevas técnicas de

detección de antígenos. Así con la técnica de ELISA y empleando anticuerpos anti-

BCG, se ha podido cuantificar los antígenos solubles del bacilo de Koch en líquido

céfalorraquídeo y hacer así el diagnóstico de meningitis tuberculosa con una alta

sensibilidad y especificidad (32).

4.5 LEPRA

La lepra o enfermedad de Hansen es una infección crónica causada por Mycobacterium

leprae que afecta las partes más frías del cuerpo en particular mucosa nasal, vías

respiratorias superiores, nervios periféricos, testículos, piel de las orejas y segmento

anterior de los ojos (20).

4.5.1 Mycobacterium leprae

Mycobacterium leprae es un bacilo pleomórfico gram positivo (33) y ácido-alcohol

resistente al ser coloreado por el método de Zielh-Neelsen. Mide entre 1 y 8 µm de

longitud por 0.2 a 0.5 µm de ancho, se puede observar como bacilo individual o agruparse

en globias. Esta micobacteria no crece en medios de cultivo artificiales (34).

4.5.2 TAXONOMÍA



- Orden: Actinomycetales



- Especie: leprae

(35)


El reservorio más importante de la lepra es el enfermo humano multibacilar no tratado, el

cual por medio de las mucosas nasal y oral descarga enormes cantidades de bacilos (36)

los cuales utilizan como puerta de entrada la nariz y la mucosa respiratoria (37). Aunque

no se puede descartar la vía cutánea especialmente en pacientes bacilíferos con lesiones

abiertas (38).

En diferentes trabajos se ha mostrado que la infección en convivientes de enfermos es

cercana al 50% y entre los convivientes expuestos a pacientes multibacilares se presentan

porcentajes de infección más elevados que en otros individuos menos expuestos (36).

Siendo un factor de riesgo convivir con una persona infectada.

En Colombia, es notorio el agrupamiento de casos de lepra en los departamentos de Norte

de Santander, Santander y Boyacá, dentro de los que existe agrupamiento municipal (36).

En general la lepra presenta tasa de incidencia y proporciones de prevalencia mayores para

la zona rural que para la urbana.

En adultos la lepra es más común en hombres que en mujeres (33), la razón en Colombia es

2:1 con variaciones dentro de las diferentes regiones, siendo en algunas 1:1. Y con

respecto a la edad, la mayoría de estudios han mostrado un pico alrededor de los 20 años

con estabilización a los 50 años (36).


La lepra presenta una gran variedad de manifestaciones clínicas las lesiones varían desde

pequeñas máculas de la lepra indeterminada hasta las lesiones difusas, desfigurantes y a

veces fatales de la lepra lepromatosa. Esta variación se relaciona con las diferencias en la

reactividad inmune (39).

Dentro del 5 % de los pacientes susceptibles a la enfermedad, existe un amplio espectro

que va desde pacientes anérgicos (que tienen poco o nada de resistencia) que adquieren

lepra lepromatosa, mientras que aquellos hiperérgicos (que tienen gran resistencia) que

adquieren lepra tuberculoide y en el medio se encuentra la lepra dimorfa (20).

4.5.4.1. CLASIFICACIÓN

La clasificación de las diferentes formas de la lepra ha sido bastante controversial, sin

embargo, en el Sexto Congreso Internacional de Lepra en Madrid en 1.953 se recomendó

establecer dos tipos polares, lepromatosa y tuberculoide y dos grupos, indeterminada y

dimorfa (40).

En 1.966 Ridley y Jopling dividieron el espectro en 5 grupos basados en criterios clínicos,

inmunológicos y patológicos (Tabla ) así: Tuberculoide-Tuberculoide (TT), Dimorfo-

Tuberculoide (BT), Dimorfo-Dimorfo (BB), Dimorfo-Lepromatoso (BL), Lepromatoso-

Lepromatoso (LL). Las formas indeterminada (I) y neural pura están fuera de esta

clasificación (41).

Y en 1981 la OMS con el fin de instaurar los regímenes de terapia multidroga, introdujo

una nueva terminología basada en los hallazgos bacteriológicos: pacientes multibacilares

(MB) y paucibacilares (PB) (40).

Tabla 1. Clasificación de la lepra. Ridley y Jopling (1966), Congreso de Madrid (1953) y

OMS (1982).

CLASIFICACION ESPECTRO DE LA LEPRA

R Y J TT BT BB BL LL

MADRID Tuberculoide Dimorfa Lepromatosa

O M S Paucibacilar Multibacilar

(40)

4.5.4.2. LEPRA INDETERMINADA

Se debe tener en cuenta que antes de presentarse las lesiones cutáneas se producen

parestesias o endurecimientos localizados muy difíciles de diagnosticar como lepra hasta

pasado cierto tiempo. Luego se observarán las alteraciones cutáneas que pueden ser

sutiles y pasar inadvertidas (42). Pero las lesiones características son máculas únicas o

múltiples, asimétricas, hipocrómicas o eritemato-hipocrómicas de límites difusos o mal

definidos. Se localizan en cualquier lugar del cuerpo pero tienen preferencias por las

zonas más frías como la cara, las extremidades y la región glútea. Son lesiones planas

que no hacen relieve sobre la superficie normal de la piel. La sensibilidad cutánea en las

lesiones esta discretamente disminuida, la sudoración y el crecimiento del vello no suelen

estar afectados (40).

La lepra indeterminada puede permanecer como tal, curar espontáneamente o virar a

lepra lepromatosa o tuberculoide, por esto es importante diagnosticarla a tiempo ya que

esto permitirá que los enfermos se curen sin secuelas (42).

4.5.4.3. LEPRA TUBERCULOIDE (LT)

Las lesiones en lepra tuberculoide pueden ser maculosas, placas infiltradas con o sin

microtubérculos en la periferia, eritematosas, hipocrómicas o eritematovioláceas; de pocos

centímetros a lesiones anulares grandes. Es infrecuente pero característico que dentro de

la placa o mácula o en su periferia se palpe un filete nervioso engrosado. Los bordes son

bien definidos (42).

El compromiso neural es precoz e intenso, apareciendo prontamente hipo o anestesia,

disminución de la sensibilidad térmica y táctil, anhidrosis y alopecia. El número de

lesiones es escaso y asimétrico (menos de 5 lesiones) (42).

Las lesiones de la LT pueden curarse espontáneamente, pero el principal riesgo lo

constituye la afección de los troncos nerviosos, que deja secuelas graves e irreversibles

(40).

4.5.4.4. LEPRA DIMORFA

Este grupo es una mezcla de varios grados de componentes lepromatosos y tuberculoides.

Los subgrupos de lepra dimorfa son: (33,40).

Lepra dimorfa-tuberculoide (BT): de 6 a 25 lesiones

Lepra dimorfa-dimorfa (BB): más de 25 lesiones

Lepra dimorfa-lepromatosa (BL): numerosa y variada cantidad de lesiones

Las lesiones suelen ser maculosas o placas eritematosas, violáceas o castañas, infiltradas

en su totalidad, muy características con una zona recortada central neta y una de avance

o externa que gradualmente se confunde con la piel vecina. Varían en número de acuerdo

al sitio del espectro en que se hallen, numerosos en BL, menor número en BT. El

compromiso neural es precoz, intenso y están afectados numerosos nervios. Esta es la

forma clínica con mayor daño neural (42).

4.5.4.5. LEPRA LEPROMATOSA

En la lepra lepromatosa la resistencia al microorganismo es prácticamente nula, lo que le

permite multiplicarse sin obstáculos en todos los órganos del paciente. Las lesiones se

tornan eritematosas, ferruginosas e infiltradas, de límites precisos y se diseminan

ampliamente. Con los años surgirán pápulas, placas y tubérculos o lepromas. Las orejas

se afectan inicialmente por infiltración y posteriormente con lepromas. Hay caída de la

cola de las cejas y de las pestañas (40).

Las infiltraciones de cara acompañada de los lepromas originan la facies leonina típica, con

caída nasal o ensanchamiento de la nariz y de los lóbulos auriculares péndulos. En frente

y mentón abollona la piel y se acentúan los pliegues. A su vez sobre las infiltraciones o en

forma aislada pueden hallarse los tubérculo-nódulos o lepromas , con alteraciones de la

sensibilidad, alopecia, anhidrosis (42).

Los pacientes con LL tienen compromiso de la mucosa nasal, que sin un manejo adecuado

puede llegar a la perforación del tabique y la deformidad de la nariz en silla de montar

(40).

4.5.5 HISTOPATOLOGÍA

LEPRA INDETERMINADA: en la lepra indeterminada se observa escaso o ningún

infiltrado linfohistiocitario perivascular superficial. Infiltrados linfohistiocitarios

perineurales en la dermis profunda. Engrosamiento neural de filetes de límite

dermohipodérmico o subcutáneo, con penetración de linfocitos, plasmocitos y

macrófagos al nervio. Engrosamiento del perinervio con perdida de la delimitación

neta del mismo con el tejido conjuntivo vecino. Infiltrados perivasculares y

perisudoríparos en grado variable, usualmente discreto (39).

Ocasionalmente, se ven bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) en células

subepidérmicas; en el endotelio de vasos del límite dermohipodérmico y en los

músculos erectores del pelo (39).

LEPRA TUBERCULOIDE: en la lepra tuberculoide se ven granulomas subepidérmicos

que tocan y erosionan el epitelio, constituidos por células epitelioides y de Langhans

con abundantes linfocitos. Granulomas semejantes en la dermis profunda que tienden

a confluir y a englobar los anexos cutáneos y los nervios. Grado severo de destrucción

neural por penetración de las células epitelioides, gigantes y linfocitos al nervio, lo cual

los hace irreconocibles en la mayoría de las biopsias (39).

LEPRA DIMORFA: presenta histopatología variable según tienda hacia el polo

tuberculoide o hacia el lepromatoso. En el primer caso, los granulomas son ricos en

células epitelioides y linfocitos, sin mayor número de células de Langhans ni

plasmocitos. Los infiltrados no tocan la epidermis. Los nervios se afectan un poco

menos que en los casos tuberculoides y con las coloraciones para BAAR se observan

escasos o no se observan (39).

En la lepra dimorfa central (BB) se presentan granulomas edematosos de macrófagos

vacuolados con pocas células epitelioides y linfocitos. No hay células de Langhans.

Los nervios están engrosados con alguna tendencia a la laminación y a la invasión por

los infiltrados, se observan numerosos BAAR (39).

En las lepras dimorfas lepromatosas los infiltrados son difusos y están constituidos por

macrófagos vacuolados y escasas células epitelioides dispersas, que no forman

granulomas definidos. Los linfocitos pueden ser abundantes. Los nervios muestran

laminación característica del perinervio. El número de BAAR es muy abundante (39).

LEPRA LEPROMATOSA: la biopsia muestra epidermis atrófica o normal, no hiperplásica,

excepto cuando hay ulceración. Banda estrecha subepidérmica de colágeno horizontal,

no permeada por los infiltrados inflamatorios. Infiltrado dérmico difuso de macrófagos

vacuolados o espumosos que alteran con variable número de plasmocitos a veces muy

importante. El infiltrado puede extenderse al interior de lo lobulillos adiposos

hipodérmicos y a la pared de los vasos de mediano calibre (39).

Se observa enorme número de BAAR en los nervios, los macrófagos, los endotelios y

las estructuras tales como pelos, los músculos erectores del pelo y las glándulas

sudoríparas (39).

4.5.6 DIAGNÓSTICO

El diagnóstico de la lepra se hace por medio del examen clínico, apoyado por la presencia

de Micobacterium leprae en la baciloscopia, pues dependiendo de la carga bacilar se

determinará el esquema y la duración de la terapia (34).

En Colombia, se han estandarizado las baciloscopias así:

Se tomarán mínimo 5 muestras por paciente y las muestras serán de: moco nasal, linfa de

los lóbulos auriculares, linfa de las lesiones y si no las hay, se pueden tomar muestras de

los codos y las rodillas. En todas estas muestras se persigue extraer el líquido intersticial

rico en macrófagos que contienen los bacilos (34).

Estas muestras serán coloreadas por medio de la técnica de Ziehl-Neelsen y se leerán con

las mismas escalas utilizadas en tuberculosis. En el informe se deberá incluir el número

de cruces en cada una de las muestras y el resultado del índice bacilar calculado (34).

La biopsia permitirá confirmar definitivamente la sospecha clínica, clasificar la enfermedad,

contribuir a evaluar los resultados del tratamiento y establecer los diagnósticos

diferenciales. El material de estudio es fijado en formol taponado al 10% e incluido en

parafina y se sacan varias láminas que se colorearan con Hematoxilina-Eosina (HE), Fite-

Faraco (FF) o Ziehl-Neelsen (ZN) (39).

De igual forma se emplean en el laboratorio técnicas como la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR), métodos que dependen de la detección de ADN el cual es más

susceptible a la degradación en células muertas que otros componentes celulares, por lo

que es un indicador más exacto de viabilidad, determinando así el porcentaje de bacilos

vivos, lo que permite la evaluación eficaz de la quimioterapia y la viabilidad de la

micobacteria (43).

4.6 MICOBACTERIAS ATÍPICAS

Entre el género Mycobacterium existen especies saprófitas denominadas micobacterias

oportunistas que normalmente habitan en el medio ambiente, pudiendo causar

ocasionalmente enfermedad tanto en hombres como en animales.

Inicialmente, cualquier micobacteria distinta al M. tuberculosis o M. leprae era considerada

como saprofito ambiental e inofensivo razón por la cual se agruparon dentro del epíteto de

no tuberculosas o anónimas. Actualmente reconocidas como micobacterias atípicas, cuyo

verdadero potencial patógeno solo fue reconocido a mediados de este siglo (44)

Las micobacterias son microorganismos pleomórficos cuando provienen de muestras

clínicas (45) pero en medios de cultivo se observan como bastoncillos delgados, a veces

ligeramente curvos de 0.2 a 0.6 µm por 1 a 4 µm Algunos presentan ramificaciones

filamentosas, no son formadores de esporas y cada célula tiene una estructura granular

marcada, por lo que con frecuencia aparecen abundantes gránulos citoplasmáticos ácido

alcohol resistentes bipolares. Entre las estructuras granulares se encuentran los gránulos

metacromáticos, constituidos por polifosfatos y gránulos lipídicos. Estos lípidos celulares

constituyen hasta un 40% en peso seco de la bacteria (2).

4.6.1 TAXONOMÍA





- Especie: avium;. intracellulare;

kansasii;.haemophilum

scrofulaceum; simiae;

szulgai;. gordonae;

ulcerans; xenopi;

marinum; chelonae;

fortuitum; africanum

y gordonae

entre otras

(24).

En 1957 Runyon propuso para la unificación de criterios en la clasificación de las

micobacterias atípicas, separarlas en cuatro grupos según el tiempo requerido por estas

para formar colonias en medios artificiales de cultivo y su respectiva producción de

pigmento (46). Ver tabla 2 .

Tabla 2. Clasificación de las micobacterias atípicas por Runyon.

(47).

Grupo I o Fotocromógenas: desarrollan un pigmento que va desde el amarillo hasta

el rojo ladrillo cuando se exponen a la luz.

Grupo II o Escotocromógenas: producen este pigmento aun en ausencia de luz.

Grupo III o no Cromógenas: no producen pigmento alguno.

Grupo IV o Crecedoras rápidas: forman colonias en cultivos a temperatura

ambiente en menos de siete días. Dentro de este grupo es posible encontrar cepas

foto, escoto y no cromógenas (48).

Sin embargo, actualmente se acepta que deben individualizarse y denominarse cada una

según su nombre binomial aprobado científicamente. Esta se realiza con base en sus

difentes características bacteriológicas, organizándolas en seis grupos en los que se tiene

en cuenta: velocidad de crecimiento (rápido o lento, según sea inferior o superior a una

semana en medio sólido) y producción de pigmento en presencia o ausencia de luz

(fotocromógeno o escotocromógeno) (49). Ver tabla 3.

Tabla 3. Clasificación actual de micobacterias atípicas

CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS ATÍPICAS POR RUNYON

DE CRECIMIENTO LENTO

GRUPO I FOTOCROMÓGENAS M. marinum; M. kansasii; M. simiae

GRUPO II ESCOTOCROMÓGENAS M. scrofulaceum; M. flavescens; M. szulgai

GRUPO III NO CROMÓGENAS M. avium-intracellulare; M. gastrii; M. terrae

M. triviale; M. xenopi; M. haemophilum; M. novum; M. nonchromogenicum.

GRUPO IV CRECEDORAS RÁPIDAS M. chelonae; m. Abscessus; M. fortuitum M. peregrinum; M. phlei; M. vaccae M. smegmatis; M. diernhoferi.

Grupo I Fotocromógenas

Grupo II Escotocromógenas

Grupo III No cromógenas

M. kansasii a)Pigmento rosa-rojo M. avium M. asiaticum M. lactis M. intracellulare M. intermedium . gastri

b)Pigmento amarillo naranja M. térrea

M. gordonae M. triviale M. scrofulaceum M. nonchromogenicum M. flavescens M .malmoense M. szulgai M. haemophilum c)Pigmento irregular M. shimoidei M. xenopi M. celatum M. simiae M. interjectum M. ulcerans M. branderi

GR

UP

OS

DE C

REC

IMIEN

TO LEN

TO

M. genavense (49).

Grupo IV Fotocromógenas

Grupo V Escotocromógenas

Grupo VI No cromógenas

a)Pigmento rosa-rojoM. fallax M. marinum M. engbaecki M. chelonae M. abscessus

b)Pigmento amarillo naranja M. agri

M. acapulcense M. mucogenicum M. aurum M. chitae M. duvalii M. gadium M. neoaurum M. gilvum M. abuense M. rhodesiae M. aichiense M. chubuense M. tokaiense c)Pigmento irregular

GR

UP

OS

DE C

REC

IMIEN

TO R

ÁP

IDO

M. phlei

M. vaccae M. thermoresistibile M. smegmatis

M. austroafricanum

(49).


En Colombia como en el resto del mundo no se conoce la verdadera prevalencia de las

enfermedades por micobacterias atípicas y tan solo con la aparición de la pandemia del

Síndrome de Inmunodeficiencia Humana SIDA, se ha despertado especial interés (50).

Tal grado de desconocimiento se debe a que no son reportadas en muchos países, por la

falta de claridad en su significancia clínica o porque no existen las facilidades para hacer

su diagnóstico e identificación, o simplemente debido a que no existe interés en el campo

de la salud pública puesto que la enfermedad se presenta como no contagiosa porque no

es trasmisible de persona a persona (50,51).

Es bien sabido que la respuesta inmune mediada por células es necesaria para controlar la

infección por micobacterias, con la aparición del SIDA, la enfermedad inmunosupresora

más importante de los últimos tiempos, la cual ataca directamente la inmunidad celular, se

ha aumentado considerablemente la frecuencia y severidad de estas infecciones. Es esta

la razón por la cual se ha incrementado la aparición de brotes por diferentes especies

como los ocasionados por el complejo M. avium; M. kansasii; M. xenopi; M. scrofulaceum;

M. Fortuitum y M. gordonae. De igual forma, se han ido descubriendo nuevas especies

como lo son M. genavence y M. celatum, los cuales se han involucrado en casos de

enfermedad diseminada en pacientes VIH positivos (52).

Aunque las micobacterias atípicas siempre se han asociado a condiciones de

inmunosupresión, se han reportado casos de agresión a pacientes inmunocompetentes.

En 1966 el Dr. Álvarez, reportó el caso de una lesión cutánea producida por una

micobacteria de rápido crecimiento y en 1981 se describieron 3 casos de lesiones en tejido

blando, todos con antecedentes traumáticos y una posterior contaminación con tierra o

astillas de madera, de los cuales se logró aislar M. fortuitum (53).

En Colombia se han reportado tres microepidemias post inyección, con soluciones

contaminadas causando absceso en el sitio de la inoculación. La primera de ellas ocurrió

entre 1981 y 1982, en un grupo de individuos vacunados contra la Fiebre Amarilla entre

los cuales se pudo aislar M. chelonae subsp. abscessus (54).

Paralelamente a este brote entre 1980 y 1982 en el Laboratorio de Micobacterias del

Instituto Nacional de Salud, se diagnosticó micobacteriosis pulmonar en un paciente

imnunologicamente normal ocasionada por M. simiae (55).

La segunda microepidemia ocurrió en Medellín entre 1988 y 1989 posterior a la aplicación

de unos alergenos, pero en este caso fue imposible determinar la especie micobacteriana

causal (54).

El último de estos brotes sucedió en 1993 en 667 pacientes que recibieron múltiples

inyecciones subcutáneas de xilocaína como terapia para diferentes procesos patológicos,

de estos 297 pacientes presentaron lesiones cutáneas de cuyas secreciones se aisló M.

abscessus y se determinó que la fuente de contaminación era la xilocaína (56).

Cada vez son más frecuentes los casos reportados de abscesos en los sitios de aplicación

de inyecciones atribuidos al uso de jeringas o soluciones contaminadas con la micobacteria

(56,57). El primer informe de absceso post inyección data de 1904 en el cual se involucró

como agente causal el complejo M. fortuitum-chelonae (58).


Ampliamente distribuidas, las micobacterias se han encontrado colonizando de forma

transitoria como flora normal en nasofaringe, mucosa bronquial e intestinal, sin embargo

en algunos casos pueden llegar a causar enfermedad (50).

Los pocos casos mortales informados, se presentaron como enfermedad diseminada

asociada con patología pulmonar, sepsis por infección de heridas quirúrgicas, endocarditis

de válvulas porcinas e inmunosupresión (59,60).

4.6.3.1. ENFERMEDAD CUTÁNEA

Es la manifestación clínica más frecuente, su presentación principal es la de abscesos

localizados en los que la lesión ocurre por acción traumática en cualquier sitio de la piel

(51).

4.6.3.2. ENFERMEDADES POSTOPERATORIAS

Se han descrito casos posteriores a esternotomía medial, mamoplastia de aumento, y

varicectomías entre otras. Los signos y síntomas que presentan estos pacientes son:

dolor, inflamación, eritema, calor y drenaje espontáneo de material purulento o

serosanguinolento y generalmente cursan sin fiebre (51).

4.6.3.3. ENFERMEDAD PULMONAR

Ocurre en pacientes inmunosuprimidos o con enfermedad pulmonar subyacente aunque

también se han informado en pacientes previamente sanos. El 85% de los casos es

producido por M. abscessus y el restante de los casos por M. chelonae (61).

4.6.3.4. ENFERMEDAD DISEMINADA

Se caracteriza por un síndrome en el que hay episodios recurrentes de abscesos de piel y

de tejidos blandos, se presenta en enfermos con alguna condición de inmunosupresión

como transplante renal, terapia con corticoides, artritis reumatoide, linfoma o leucemia

(62).

4.6.3.5. INFECCIONES MISCELÁNEAS

Aquí se incluyen patologías infecciosas como endocarditis de válvulas protésicas,

queratitis, linfadenitis cervical (51) y osteomielitis. En los casos de linfadenitis, con el

tiempo los ganglios se reblandecen y presentan drenaje espontáneo constituyendo

ESCROFULODERMAS. M. chelonae, es responsable solo de una pequeña proporción de

estas infecciones, siendo M. scrofulaceum el principal agente etiológico (63).


Entre las diferentes especies micobacterianas se ha descrito una amplia gama de patrones

histológicos que incluyen abscesos, granulomas tuberculoides y sarcoideos, granulomas

que semejan granulomas reumatoideos e inflamación crónica no específica que en

ocasiones no sugiere lesión por micobacterias (64).

En el caso de las lesiones por M. chelonae y M. abscessus, se observa respuesta

inflamatoria severa, granulomatosa nodular o difusa con granulomas mixtos compuestos

de abscesos centrales rodeados por células gigantes y epiteloides. A veces predominan

los abscesos con poca inflamación granulomatosa. La necrosis es otra característica

constante. Hay presencia de espacios claros redondeados vacuolares rodeados por

polimorfonucleares o células epiteloides que se encuentran ubicadas en el centro de los

abscesos o dentro del área granulomatosa (65).

Estas vacuolas son lipídicas provenientes de la hipodermis. La importancia de estas reside

en que en ellas es más fácil la observación de los microorganismos debido al contraste

creado por la tinción rojo intensa de los bacilos ácido-alcohol resistentes que proporciona

el colorante de Ziehl Neelsen (48).

El examen histopatológico de la enfermedad pulmonar por M. fortuitum, M. abscessus y

M. chelonae se caracteriza por la presencia de polimorfonucleares y microabscesos,

ausencia de necrosis de caseificación y a diferencia de la tuberculosis la respuesta

inflamatoria aguda persiste en asociación con los granulomas epiteloides y células

gigantes sin importar la edad de la lesión. El M. kansasii y el complejo M. avium-

intracellulare, son las dos especies que con mayor frecuencia causan enfermedad

pulmonar produciendo una enfermedad similar a la tuberculosis. Durante la fase

preclínica de la enfermedad aparece un infiltrado neutrofílico, en la segunda semana se

presenta un predominio de monocitos y macrófagos, a la sexta semana es cuando las

lesiones originan síntomas apareciendo células epiteloides y gigantes formando típicos

tuberculos con granulomas y necrosis (66).

La clave para diferenciar la enfermedad pulmonar causada por micobacterias atípicas de la

causada por el M. tuberculosis , radica básicamente en la localización de los bacilos.

Mientras en el primer grupo los bacilos se encuentran entre los microabscesos o en las

vacuolas ya mencionadas, en la tuberculosis se ubican en la zona de necrosis de

caseificación y en su periferia (66).

En las fases avanzadas de la enfermedad en pacientes inmunosuprimidos como en el caso

de los pacientes VIH positivos el M. avium-intracellulare llena en grandes conglomerados

el citoplasma de macrófagos en múltiples órganos como son: pulmón, hígado, bazo,

intestino y ganglios linfáticos (67).

4.6.5 DIAGNÓSTICO

No es fácil hacer el diagnóstico de las enfermedades causadas por micobacterias

ambiéntales, puesto que estas en su gran mayoría carecen de manifestaciones clínicas por

lo que no se les considera como posibles agentes etiológicos, a todo esto se le suma la

falta de conocimiento a cerca de su verdadero potencial patógeno, así como de sus

características bacteriológicas las que a su vez dificultan su identificación (24).

Se ha comprobado que la sensibilidad antimicrobiana presenta importantes variaciones

aún entre especies del mismo grupo (68), por lo que no basta con saber el grupo al que

pertenece la micobacteria, sino que es necesario en algunos casos una identificación

mediante métodos más complejos como lo son la hibridación del DNA entre otras (69).

Las técnicas disponibles pueden resumirse en:

Métodos bacteriológicos: se trata de métodos que permiten en la mayoría de

casos , asignar las micobacterias a un subgrupo. Entre estos se tienen en cuenta

parámetros como: la ácido-alcohol resistencia, velocidad de crecimiento, temperatura

de crecimiento, morfología de las colonias, pigmentación y fotoreactividad (70,71,72).

Métodos bioquímicos: son los métodos que tradicionalmente se han venido

empleando, entre ellos están: prueba de la niacina, prueba de la reducción de los

nitratos, prueba de la hidrólisis del Tween 80, prueba de la arilsulfatasa, prueba de la

catalasa, prueba de la resistencia a la TCH (Hidracida del ácido 2-1 Iofenocarboxílico),

crecimiento en agar MacConkey sin cristal violeta y prueba de la reducción del telurito

potásico (70,71,72).

Métodos genéticos de microbiología molecular: la principal ventaja que aportan

estos métodos es la rapidez en la identificación, ya que son técnicas para las que no se

requieren subcultivos, la mayoría de las veces pueden llevarse a cabo directamente en

el cultivo primario. Como ventaja adicional, los métodos genéticos pueden aplicase

también directamente a los cultivos en medios líquidos (BACTEC radiométrico y nuevos

medios). Las técnicas mas utilizadas son: las sondas de ácidos nucleicos;

secuenciación de ácidos nucleicos, Polimorfismo de Fragmentos de Restricción (FRP) y

técnicas de detección e identificación (70,71,72).

Cromatografía: se trata de una técnica con la que se estudia la composición de

lípidos de la pared celular de las micobacterias. Existen tres tipos de cromatografía

empleados en la identificación de las micobacterias, estas son: la cromatografía de

capa fina, la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC). De ellas, la cromatografía de gases y la HPLC son las que mejores resultados

han dado (70,71,72).

4.7 ESPOROTRICOSIS

La esporotricosis es una infección crónica que se caracteriza por lesiones nodulares de los

tejidos cutáneo y subcutáneo y ganglios linfáticos adyacentes (73), aunque en pacientes

inmunocomprometidos se puede dar compromiso osteoarticular y visceral (74). Es

causada por un hongo llamado Sporothrix schenckii, el cual tiene como hábitat el material

vegetal en descomposición (20).

4.7.1 Sporothrix schenckii

Sporothrix schenckii es un hongo dimórfico térmico (75), el cual en el medio ambiente o

en el laboratorio a temperaturas entre 25 a 30ºC crece como moho e in- vivo a 37ºC se

encuentra en forma de levadura. Las levaduras miden de 4 a 6øm de diámetro y se

pueden encontrar en forma de cigarro (74).

4.7.2 TAXONOMÍA

- Reino: Fungi

- División: Deuteromycota

- Clase: Hyphomycetes

- Orden: Moniliales

- Familia: Cematiaceae

- Género: Sporothrix

- Especie: schenckii

(73,76)


La esporotricosis se encuentra distribuida alrededor del mundo pero la mayoría de casos

son reportados en Norte y Sur América y Japón (74), encontrándose principalmente en

zonas con alta temperatura y áreas tropicales (76).

La infección por Sporothrix schenckii se encuentra ligada a ocupaciones como la jardinería,

agricultura, albañilería, personas que recolectan rosas (77), en general personas que

trabajan con materiales vegetales y suelo ya que el agente etiológico vive en tales

elementos.

En algunos casos se ha aislado el hongo de animales como moscas, hormigas y cerdas de

caballo (73), aunque los animales más comúnmente reportados causantes de transmisión

zoonótica de Sporothrix schenckii son los armadillos y los gatos (78). En los casos de

esporotricosis pulmonar el modo de transmisión es presumiblemente por inhalación de

conidios por aerosoles del suelo y la vegetación (74).


La esporotricosis se manifiesta principalmente como una infección cutánea y subcutánea

crónica, aunque el desarrollo de la enfermedad depende del sitio de inoculación del

microorganismo y de la respuesta del huésped (73). En pacientes que presentan factores

de riesgo como alcoholismo, diabetes mellitus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica e

infección por VIH es más vista la esporotricosis diseminada visceral, osteoarticular,

meníngea y pulmonar (74).

4.7.4.1. ESPOROTRICOSIS CUTÁNEA Y LINFOCUTANEA

La esporotricosis cutánea y linfocutánea son las manifestaciones más comunes de la

infección con S. schenckii y se dan después de la inoculación de la conidia dentro de la

piel o del tejido subcutáneo (74).

En la esporotricosis cutánea las lesiones persisten en el sitio de la inoculación y los lugares

más comunes son cara, cuello y tronco, las lesiones se presentan como úlceras, placas

verrucosas, acneiformes, infiltradas, eritematosas o a manera de parches escamosos;

eritema macular o papular, sin afección linfática local aunque son comunes las pequeñas

lesiones satelitales (79). Las lesiones pueden ser transitorias y sanar de manera

espontánea, pero generalmente retornan permaneciendo activas por años (73).

En la esporotricosis linfocutánea se da como lesión inicial un nódulo que progresa dando

paso a la aparición de lesiones nodulares a lo largo de la distribución linfática proximal a la

lesión inicial (80). No es raro que la lesión primaria se inicie en forma de pequeña ulcera

en vez de un nódulo en el sitio de la lesión. Es posible que algunas lesiones persistan

activas durante años (73).

4.7.4.2. ESPOROTRICOSIS PULMONAR

En este tipo de esporotricosis muy rara vez se ha visto que la infección primaria se

encuentre en otro sitio del cuerpo (73). Se cree que en la mayor parte de las personas se

da la infección primaria en el pulmón por la inhalación de conidios (82). Se considera que

el alcoholismo es un gran factor de riesgo para este tipo de infección (83).

La esporotricosis pulmonar se puede manifestar de dos formas, la más frecuente es la

enfermedad cavitária crónica (83) la cual inicia como neumonía o bronquitis aguda, donde

las partes apicales del pulmón parecen ser los sitios más afectados por la infección. La

enfermedad se convierte en neumonía crónica con masas nodulares y se desarrollan

cavidades de paredes delgadas con fibrosis y derrames pleurales. En ocasiones la

cavitación se vuelve masiva con necrosis caseosa (81).

La otra forma de infección pulmonar afecta en forma primaria los ganglios linfáticos

traqueobronquiales, la enfermedad de los ganglios puede persistir estacionaria durante

periodos prolongados y es frecuente la resolución espontánea (84).

4.7.4.3. ESPOROTRICOSIS OSTEOARTICULAR

La infección osteoarticular es precedida por inoculación cutánea o subcutánea o por una

diseminación por vía hematógena desde los pulmones (74).

La enfermedad ha sido descrita como una artritis destructiva (85) con lesiones osteolíticas,

tenosinovitis y periosteitis, donde se presentan muy pocos casos de lesiones de los huesos

en ausencia de enfermedad articular. Los sitios que más se ven afectados son: carpo,

metatarso, cúbito, radio, fémur y costillas (73). Casi siempre los casos de artritis

comprometen puntos periféricos como: rodillas, codo, tobillo y muñeca (76).

Comúnmente en la esporotricosis articular se presentan síntomas de dolor, hinchazón y

limitación del movimiento progresivo crónico (85).

4.7.4.4. ESPOROTRICOSIS DISEMINADA VISCERAL

La infección diseminada aunque poco común, se da a raíz de la diseminación de una lesión

linfocutánea (74). Se presenta alto riesgo de presentar una infección diseminada en

pacientes con diabetes, sarcoidosis, antecedentes de tratamiento prolongado con

cortisona (86,87), neoplasias y pacientes con SIDA donde comúnmente se presenta

diseminación a meninges y lesiones en la piel con ulceraciones atípicas con mínima

respuesta inflamatoria (74).

Puede haber afección de diferentes lugares como tejido cutáneo, muscular u óseo, hígado,

intestino, bazo, páncreas, cerebro, tiroides y miocardio. A menudo la diseminación se

acompaña de fiebre de 39ºC, anorexia, perdida de peso y rigidez de articulaciones (73).


En el material de biopsia se dificulta la observación del microorganismo ya que este se

encuentra en poca cantidad, excepto si las lesiones se han tratado con esteroides, se

pueden encontrar numerosas células de levadura (88).

Los cuadros histológicos de la esporotricosis son un conjunto de reacciones

granulomatosas, las cuales Lurie en 1963 (89) clasificó así: esporotricosicos, tuberculoides

y de cuerpo extraño. La reacción observada depende, en parte, del sitio de la lesión.

La reacción esporotricósica esta compuesta de masas de histiocitos epitelioides, los cuales

tienden a formar zonas concéntricas. El área central de la lesión consta de neutrófilos o

de material necrótico rodeado de un infiltrado de neutrófilos y algunas células plasmáticas

y linfocitos (89).

En la reacción tuberculoide a veces esta área se fusiona dentro de la zona de las células

epitelioides mezcladas con fibroblastos, linfocitos y células gigantes de langhans. En

algunos casos se puede observar cuadro histológico de un granuloma de cuerpo extraño

sin ninguna demostración de componente piógeno. Y en enfermedad diseminada, en

ocasiones se puede encontrar microabscesos sin componente histiocítico epitelioide (89).

En la esporotricosis diseminada rara vez se presenta ulceración de los nódulos cutáneos y

la dermis y epidermis que los cubre presentan poco cambio patológico. El nódulo mismo

no es diferente al granuloma de las lesiones primarias y consta de una capa externa de

células redondas y células plasmáticas, una capa interna de histiocitos y células gigantes

con un área de necrosis e infiltrado neutrófilo. La presencia de cuerpos asteroides es más

común en estas lesiones secundarias que en las primarias (89).

La biopsia de esporotricosis que puede presentar cuerpos asteroides, muestran en general

gruesas escamocostras, hiperplasia pseudoepiteliomatosa notoria, microabscesos

intraepidérmicos e intradérmicos, granulomas epitelioides centrado por microabscesos e

infiltrados dérmicos de polinucleares, plasmocitos, células gigantes aisladas o en grupos y

siderófagos. El aspecto general de la biopsia es el de una micosis en la que no se ven

levaduras ni hifas (90), el cuerpo asteroide se observa como estructura de 12 a 16 µm,

constituida por una levadura central de 3 a 6 µm de diámetro, de la cual irradian espículas

eosinofílicas en forma de estrella (90).

4.7.6 DIAGNÓSTICO

Se debe considerar la posibilidad de esporotricosis en cualquier caso en el que se

presenten erupciones polimorfas múltiples o úlceras sobre todo si no se resuelven con

tratamiento tópico usual (74).

El diagnóstico de esporotricosis se da por el hallazgo de blastoconidias del Sporothrix

schenckii en muestras como exudados, material purulento, biopsias, esputos, líquido

sinovial y LCR, por medio de coloraciones como la inmunofluorescencia directa, la técnica

de la inmunoperoxidasa o coloraciones histológicas como HE, PAS y plata-metenamina

(92).

Aunque la visualización del hongo y la reacción tisular establecen o sugieren la

esporotricosis, los cultivos son esenciales para el diagnóstico (92). Generalmente se utiliza

para cultivo primario agar Sabouraud dextrosa (74).

Las pruebas serológicas pueden ser de ayuda para el diagnóstico, aunque el definitivo se

debe realizar aislando el microorganismo del lugar de la infección (73).

4.8 HISTOPLASMOSIS

La histoplasmosis clásica es una enfermedad granulomatosa causada por Histoplasma

capsulatum var. capsulatum. La infección inicia después de la inhalación de conidios,

desarrollandose una gran variedad de manifestaciones clínicas, con un gran porcentaje de

casos asintomáticos y el resto de pacientes pueden presentar enfermedad pulmonar

progresiva crónica, enfermedad cutánea generalizada o crónica (73) y en pacientes

inmunosuprimidos se dará diseminación por vía hematógena con complicaciones letales

(76).

4.8.1 Histoplasma capsulatum

Histoplasma capsulatum es un hongo térmicamente dimórfico que con temperaturas

menores a 35 °C crece como un moho, pero a 37°C crece como una levadura. Este

microorganismo es característicamente de crecimiento lento y posee un ciclo reproductivo

sexual (93). Elabora macroconidias características, erizadas, ovales o piriformes que

miden de 8 a 11 µm de diámetro y microconidios que miden de 2 a 4 µm (94,95). Los

microconidios son inhalados de una fuente exógena y penetran a los alvéolos, donde se

convierten en pequeñas células levaduriformes, que son rápidamente fagocitadas por los

macrófagos alveolares (93).

4.8.2 TAXONOMÍA

- Reino: Fungi

- División: Ascomycota

- Clase: Ascomycetes

- Orden: Onygenales

- Familia: Onygenaceae

- Género: Histoplasma

- Especie: capsulatum

- variedad: capsulatum

(76)


El Histoplasma capsulatum agente etiológico de la histoplasmosis se encuentra distribuido

a nivel mundial. Su desarrollo está íntimamente relacionado con la existencia de guano de

pájaros y murciélagos que provee alto contenido de nitrógeno al suelo (96,97).

Los conidios del hongo cuando están secos son fácilmente transportados por el aire,

siendo quizás este el principal agente de diseminación, aunque el hongo también puede

ser transmitido de un lugar a otro en los apéndices dérmicos de pájaros y murciélagos

(93,73).

En Colombia fueron estudiados, datos de 12 brotes de histoplasmosis, por la Corporación

para Investigaciones Biológicas y el Instituto Nacional de Salud entre 1977 y 1994. 3 de

estos brotes ocurrieron en Tolíma (Cunday y Falan), 3 en Caldas (Manizales y Belalcázar),

1 en Cundinamarca (Pedro Palo), 3 en Antioquia (Concordia, Venecia y Medellín), 1 en

Boyacá (Sogamoso) y 1 en Risaralda (99).

Todas las edades y los sexos están sometidos a la infección pulmonar primaria, pero la

distribución de acuerdo con el sexo y la forma de la enfermedad cambian conforme

aumenta la edad del paciente. En algunas personas que padecen enfermedades del grupo

del linfoma de Hodgkin, Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (SIDA) o quienes siguen

tratamiento con esteroides y otros agentes inmunosupresores, se presenta infección

oportunista rápidamente progresiva (73).


Las manifestaciones clínicas de la histoplasmosis están relacionadas con el tamaño del

inóculo y con factores del hospedero, tales como una adecuada respuesta inmune,

exposición previa y presencia de enfermedad pulmonar crónica. Aproximadamente el

90% de los individuos expuestos desarrollan una infección pulmonar asintomática

autolimitada (92). En el otro porcentaje el episodio pulmonar inicial puede ser agudo o

crónico, o puede haber diseminación por vía hematógena o linfática desde los pulmones

hacia otros órganos (93).

4.8.4.1. HISTOPLASMOSIS PULMONAR AGUDA

Los pacientes con histoplasmosis pulmonar aguda presentan síntomas que varían desde

una enfermedad leve que cura espontáneamente, hasta un tipo moderado o severo de

enfermedad. En huéspedes sanos, el grado de compromiso y sintomatología es

aproximadamente proporcional al tamaño del inóculo inhalado. En el individuo

previamente sensibilizado, la exposición a reinfección da como resultado una infección

más corta y leve (93).

Los síntomas que usualmente se presentan son: fiebre, malestar, debilidad, dolor

subesternal o pleurítico, dolor de cabeza, tos, mialgia, escalofrío, nauseas, anorexia y

perdida de peso (99,100).

La curación de la histoplasmosis pulmonar aguda puede ser completa o con fibrosis, pero

típicamente se produce calcif icación. Estas calcificaciones son regulares, con halos y

pueden encontrarse en el hígado, bazo y pulmones (93).

4.8.4.2. HISTOPLASMOSIS PULMONAR CRÓNICA

Esta forma se considera una complicación oportunista de una enfermedad pulmonar

obstructiva crónica subyacente con enfisema y espacios pulmonares anormales. Puede

desarrollarse inmediatamente después de la inhalación primaria o luego de años de

aquiescencia aparente (93).

La enfermedad temprana es manifestada como una neumonitis intersticial, disparada

posiblemente por la reacción inmunológica (101) y la infección tardía se caracteriza por

infección persistente en espacios de aire, con progreso o recaída sin terapia (94).

Dentro de los factores predisponentes se incluye una enfermedad pulmonar obstructiva

crónica subyacente, ser de raza blanca y de sexo masculino y en el caso de que no se

presente la enfermedad obstructiva crónica, la inmunosupresión también predispone a

histoplasmosis cavitaria (102).

Los síntomas clínicos son muy parecidos a los de la tuberculosis. Comúnmente incluyen

tos, perdida de peso, fiebre, disnea, dolor de pecho, hemoptisis, dolor de rodillas, fatiga y

sudoración (103).

4.8.4.3. HISTOPLASMOSIS DISEMINADA

Las células levaduriformes del microorganismo, probablemente se diseminan por el cuerpo

mientras están dentro de macrófagos. Los sitios más comunes de compromiso después

de los pulmones, son los tejidos reticuloendoteliales de bazo, hígado, ganglios linfáticos y

médula ósea. Sin embargo, se han documentado lesiones en casi todos los órganos (93).

La histoplasmosis diseminada puede ser aguda o progresiva. En estos casos los síntomas

pulmonares son insignificantes, y los pacientes pueden presentar hepatoesplenomegalia,

perdida de peso, anemia y leucopenia. Pueden observarse lesiones granulomatosas y

macrófagos cargados con células levaduriformes en hígado, bazo, médula y con bastante

frecuencia en glándulas adrenales (93).

Esta forma de histoplasmosis es una enfermedad oportunista asociada con compromiso de

la inmunidad mediada por células como en pacientes con SIDA que reciben drogas

inmunosupresoras y aquellos con neoplasia linfomatosa subyacente (93).

4.8.4.4. HISTOPLASMOSIS CUTÁNEA PRIMARIA

Se desarrolla después de la inoculación primaria en la piel o tejido mucocutáneo. En estos

casos no hay compromiso pulmonar porque los microorganismos típicamente se

introducen luego de contaminación de una herida traumática. Tales infecciones pueden

estar anatómicamente localizadas, como en algunos casos oculares o pueden progresar

crónicamente con compromiso a lo largo de los linfáticos de drenaje (93).


El cuadro histológico de las lesiones depende de lo reciente de la infección y de la

gravedad y forma de la enfermedad. En la forma aguda, solo se observan numerosas

células de levadura dentro de los histiocitos. Los neutrófilos, las células plasmáticas y los

linfocitos, no son tan abundantes y no contienen células de levadura (73).

Las levaduras que están en los histiocitos son de tamaño uniforme y son visibles con el

método de Gram, Giemsa, Wright o Hematoxilina-Eosina (73).

En las formas menos fulminantes de la enfermedad se forman granulomas epitelioides que

contienen células plasmáticas, linfocitos, macrófagos, neutrófilos y células gigantes. Los

microorganismos se observan en cualquiera de las células fagocíticas, pero en menor

número que en la forma fulminante (73).

4.8.6 DIAGNÓSTICO

La histoplasmosis puede diagnosticarse por hallazgo de células levaduriformes en material

clínico. Las muestras que se pueden utilizar son: esputos, lavado broncoalveolar, médula

ósea, sangre, biopsias, exudados de lesiones mucosas y cutáneas, material de ganglios

linfáticos, LCR y líquidos corporales (92).

Para la visualización de las levaduras se utilizan coloraciones como: Giemsa, Wright o Diff-

Quick para extendidos y HE, PAS y plata metenamina para cortes histológicos. En este

examen microscópico de los extendidos, se observan blastoconidias ovaladas de 2-3µm,

intracelulares, generalmente con una sola gema; por efectos de la coloración ocurre una

retracción de citoplasma (92).

En los cortes histológicos la pared del hongo se tiñe débilmente con la HE pero se destaca

con el PAS, Gram y plata-metenamina. Con HE se puede apreciar la respuesta

inflamatoria del hospedero, en el individuo inmunocomprometido tal respuesta es mínima

y el hongo se reproduce en forma abundante en el interior de los macrófagos. En los

individuos inmunocompetentes, el hongo evoca una reacción granulomatosa, con

predominio de células epitelioides y gigantes, en cuyo interior se encuentra el hongo (92).

Para realizar el cultivo de las muestras, las no estériles deben cultivarse en un medio

enriquecido con sangre y en agar Sabouraud con antibióticos e incubarse durante por lo

menos 4 semanas a 25°C (93).

Se pueden detectar anticuerpos específicos para antígenos de histoplasma por medio de

pruebas serológicas. Actualmente se han aceptado ampliamente dos pruebas serológicas:

la medición de los anticuerpos fijadores de complemento y la prueba de inmunodifusión

(93).

4.9 LEISHMANIOSIS

La leishmaniosis es una zoonosis que puede afectar piel, mucosa o vísceras y cuyo agente

causal es un protozoo flagelado del género Leishmania . La infección ocurre luego de ser

introducido este al huésped mediante la picadura de un insecto flebotomíneo (104).

Las diferentes especies de Leishmania presentan un rango de características clínicas y

epidemiológicas que solo por razones de conveniencia se combinan bajo 3 agrupamientos

clínicos: 1) leishmaniosis visceral 2) leishmaniosis cutánea y 3) leishmaniosis mucocutánea

o nasobucal. Sin embargo, algunas especies pueden inducir varios síndromes patológicos

(por ejemplo leishmaniosis visceral por uno de los agentes de la leishmaniosis cutánea o

leishmaniosis cutánea por el agente de leishmaniosis visceral) (2).

4.9.1 Leishmania

Las características morfológicas de los protozoos del género Leishmania corresponden a

dos formas parasitarias que adoptan según su ciclo de vida: amastigotes y promastigotes.

Los amastigotes son parásitos ovalados o redondeados que miden de 2 a 5 µm de

longitud, no poseen flagelo y se localizan dentro de los macrófagos de los huéspedes

vertebrados. Al ser sometidos a procesos de coloración se observa un citoplasma azul

claro y un núcleo de color rojo con cariosoma central. A un lado se encuentra una

estructura en forma de barra que se denomina cinetoplasto, la cual se tiñe intensamente

de violeta oscuro (105).

Los promastigotes se encuentran en el huésped invertebrado y son la forma que se

inocula al vertebrado. Son parásitos alargados que miden entre 10 y 15 µm de longitud.

Mediante la coloración se observa que tienen un núcleo en la parte media del cuerpo.

Cerca del extremo anterior del parásito está el cinetoplasto, que puede ser terminal o

subterminal, y de donde sale un flagelo que le confiere movimiento. Este flagelo tiene

casi el mismo tamaño del cuerpo. Todos los protozoos del género Leishmania poseen un

ciclo de vida similar, que incluye insectos de la familia Phlebotominae. Los vectores

principales pertenecen a los géneros Phlebotomus y Lutzomyia (105).

4.9.2 TAXONOMÍA

- Reino: Protista

- Subreino: Protozoo

- Phylum: Sarcomastigophora

- Subphylum: Mastigophora

- Clase: Zoomastigophora

- Orden: Kinetoplastida

- Familia: Trypanosomatidae

- Género: Leishmania

Subgénero:.Leishmania

Complejo: L. donovani - Especie: L. chagasi

L. tropica

L. major

L. aethiopica

L. mexicana - Especies: L. venezuelensis

L. mexicana

L. amazonensis

Subgénero: Viannia

Complejo: L. braziliensis - Especies: L. braziliensis

L.peruviana

L. guyanensis - Especies: L. guyanensis

L. panamensis

L.colombiensis

(Tomado del Comité de expertos de la OMS. Lucha contra la leishmaniosis. Ginebra:

OMS;1990. Serie de informes técnicos Nº 793).


La incidencia y prevalencia de la leishmaniosis no es realmente conocida porque se

presentan muchos casos que no son bien diagnosticados o que no son reportados

sobretodo en áreas donde la infección es endémica. En 1993 La Organización Mundial de

la Salud, estimó que aproximadamente 350 millones de personas en el mundo están en

riesgo de infección (106).

Esta zoonosis de amplia distribución mundial representa un problema de salud pública en

muchos países del tercer mundo. En Colombia la enfermedad es endémica y se encuentra

en el 91% de todo el territorio ubicado bajo los 1.750 metros sobre el nivel del mar.

Durante 1995, se registraron casos de la enfermedad en el 45% de los municipios del

país. La leishmaniosis es una dolencia crónica, lo que hace difícil distinguir los casos

nuevos, por lo tanto, los datos aportados por el Ministerio de Salud se presentan en

proporciones de prevalencia, con la población rural de los municipios endémicos como

denominador. Durante el periodo de 1985 a 1996, se informó de 55.888 casos de

leishmaniosis, entre los que predominó la forma cutánea (95%). Se registraron

prevalencias que oscilaron entre 18.03 y 57.36, con una media de 61.1 por 100.000

habitantes (107).

Tabla 4. Síndromes clínicos causados por leishmania y su distribución geográfica (108).

SINDROMES CLINICOS ESPECIES DE LEISHMANIA LOCALIZACIÓN

- Leishmaniosis visceral Kala-azar :compromizo generalizado del Sistema retículoendotelial (médula ósea, bazo e hígado).

L. (L.) donovani L. (L.) infantum

India, norte y este de la China, Pakistán y Nepal. Mediterraneo Medio Oriente, centro y sur de Asia, norte y noreste de China y norte de África.

L. (L.) donovani (archibaldi) Sudan, Kenya y Etiopía

L. (L.) species Kenya, Etiopía y Somalia

L. (L.) chagasi América Latina

L. (L.) amazonensis Brasil (Estado de Bahía)

L. (L.) tropica Israel, India y enfermedad con viscerotropismo en Arabia Saudita (grupo U.S.)

- Leishmaniosis dérmica Post- Kala-azar. L. (L.) donovani L. (L.) species

India Kenya, Etiopía y Somalia

- Leishmaniosis cutánea del Viejo Mundo con un limitado número de lesiones en piel. L. (L.) major

Oriente Medio, noroeste de China, noreste de la India, Pakistán y África

L. (L.) tropica Litoral Mediterráneo, Oriente Medio, área occidental de Asia y la India.

L. (L.) etiópica Terrenos montañosos de Etiopía, Kenya y Yemen

L. (L.) infantum Cuenca Mediterránea.

L. (L.) donovani (archibaldi) Sudan y este de África

L. (L.) species Kenya, Etiopía y Somalia

- Leishmaniosis cutánea difusa - Leishmaniosis cutánea del Nuevo Mundo con limitado número de lesiones en piel.

L. (L.) etiópica L. (L.) mexicana (ulcera del chiclero)

Terrenos montañosos de Etiopía, Kenya y Yemen América central, México y Texas

L. (L.) amazonensis Cuenca Amazónica, áreas vecinas, Bahía y otros estados en Brasil. Zona amazónica

L. (V.) braziliensis Múltiples áreas de centro y sur América.

L. (V.) guyanensis (bosques) Guyana, Surinam y Norte de la cuenca Amazónica

L. (V.) peruviana (uta) Perú (este de los Andes), Montañas de Argentina

L. (V.) pifanoi Venezuela

L. (V.) garnhami Venezuela

L. (V.) venezuelensis Venezuela

- Leishmaniosis visceral del Nuevo Mundo L. (L.) chagasi Centro y sur América

- Leishmaniosis cutánea difusa L. (L.) amazonensis Cuenca Amazónica, áreas vecinas, Bahía y otros estados en Brasil.

L. (V.) pifanoi Venezuela

L. (L.) mexicana México y América central

L. (L.) species República Dominicana

- Leishmaniosis mucocutánea L. (V.) braziliensis (espundia)Múltiples áreas de América Latina.

L. (L.) species República Dominicana

L. (V) panamensis Múltiples áreas de América Latina


La leishmaniosis tegumentaria americana se presenta a cualquier edad, con notorio

pleomorfismo. La úlcera franca, única o múltiple, de borde elevado, firme, infiltrado y

fondo granulomatoso y limpio, es la variante más frecuente, la más conocida y la de

diagnóstico clínico más preciso. Existen formas ulcerocostrosas, nodulares, en placa,

verrucosas, papulosas (109), y linfangíticas (110). Se localizan en cualquier área cutánea,

menos en el cuero cabelludo. La lesión mutilante, costrosa y ulcerada del pabellón

auricular o “úlcera de los chicleros”, es clásica por su cronicidad, por su resistencia al

tratamiento y por su falta de curación espontánea, lo que comparte con otras formas de

leishmaniosis como la difusa (109), la mucocutánea y la visceral (111).

La leishmaniosis mucocutánea afecta la nariz y la orofaringe principalmente. En más del

90% de los casos se presenta una lesión cutánea luego de meses o años de curar

espontáneamente o por tratamiento inadecuado, pero excepcionalmente las dos pueden

ser concomitantes. También puede presentarse la lesión mucosa por extensión de una

lesión cutánea contigua. Comienza con sensación de prurito y obstrucción nasal, con

secreción mucosanguinolenta o epistaxis, seguida de ulceración y perforación de tabique

que progresa paulatinamente sin curación espontánea, extendiéndose a la rinofaringe, el

paladar, el labio superior, y aún en la traquea y los bronquios, en los casos terminales y

anérgicos. Puede originar complicaciones como bronconeumonías, disfagia, disfonía,

meningitis y caquexia, que llevan al paciente a la muerte (112).


En la leishmaniosis tegumentaria americana, la lesión correspondiente a la entrada del

parásito se inicia con una reacción inflamatoria en el tejido conectivo que forma una

pápula y al desarrollarse la inmunidad se produce necrosis en la dermis y ulceración. El

infiltrado existente esta compuesto por plasmocitos, linfocitos y células gigantes, en las

lesiones antiguas. Ciertos pacientes forman un granuloma con infiltrado tuberculoide hay

fibrosis y existen pocos parásitos o no se encuentran, por lo cual suele informarse como

granuloma inespecífico. La mayoría de las lesiones se encuentran en la piel y ocupan el

corion incluyendo las papilas, existe atrofia cutánea y desaparición de la epidermis (113).

La invasión mucocutánea además de las lesiones ulcerativas, puede presentar cordones

epiteliales que entran profundamente en la dermis, la mucosa muestra reacción infiltrativa

y ulcerativa. En las formas anérgicas o difusas no hay necrosis ni granulomas y los

parásitos se multiplican en gran cantidad dentro de los histiocitos o macrófagos (113).

En la Leishmaniosis cutánea del Viejo Mundo, al comienzo de la infección se observan los

amastigotes dentro de los histiocitos de la epidermis. La lesión se ulcera progresivamente

y se forma una reacción inflamatoria o granulomatosa, similar a la descrita en la

leishmaniosis tegumentaria americana. Hay hipertrofia de la capa córnea con hiperplasia

de las papilas. La infiltración esta formada por macrófagos, células plasmáticas y linfoides

(105).

4.9.6 DIAGNÓSTICO

El diagnóstico clínico se comprueba mediante el hallazgo de los parásitos en los

extendidos de linfa del borde activo de las úlceras y su posterior aislamiento en medio de

cultivo, por la inoculación de la muestra en el hocico y almohadillas plantares de un

hámster o mediante la demostración de los amastigotes en la biopsia de tejido. En el

Laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud, se logran revelar los parásitos

hasta en un 55% de los casos (104).

Clínicamente la leishmaniosis se puede presentar en varias formas y es necesario

establecer diagnóstico diferencial con otras enfermedades, aunque existen úlceras

características que desde la primera inspección se sospecha con certeza el diagnóstico,

especialmente cuando el paciente procede de un foco activo, pero cuando aún no se ha

formado la úlcera se puede confundir con una pápula por picadura de insectos, nódulos de

una enfermedad de Hansen, granuloma por cuerpo extraño, sarcoidosis, y psoriasis entre

otras (105).

Si la úlcera ya esta formada, es necesario diferenciarla de otro tipo de úlceras como las

piógenas, especialmente las de evolución crónica, úlceras traumáticas, pioderma

gangrenoso, úlcera vascular, esporotricosis tanto en su forma fija como en la linfagítica,

pian, lepra, tuberculosis cutánea principalmente por micobacterias atípicas, cromomicosis,

histoplasmosis, lobomicosis, tumores de piel como carcinoma espinocelular, etc (105).

Cuando existe compromiso de mucosa o lesiones mucocutáneas, es importante el

diagnóstico diferencial con paracoccidiomicosis, histoplasmosis, rinoescleroderma, úlceras

traumáticas, granuloma letal de la línea media, granulomatosis de Wegener, úlcera de la

anemia falciforme, tuberculosis, lepra, sífilis, esporotricosis, perforación del tabique nasal

por alguna de las anteriores entidades o secundaria al uso de vasoconstrictores, trauma,

aspiración de cocaína, etc (105).

Para confirmar la leishmaniosis es indispensable identificar el parásito por cualquiera de

los siguientes métodos:

Examen directo: con este es posible obtener una buena muestra de aspecto granular

con células de tejido y muy poca sangre y en donde la coloración muestra los

amastigotes intra o extracelulares. Esta prueba tiene una especificidad del 100%, pero

la sensibilidad es variable de acuerdo al tipo de muestra (105).

Biopsia: es el procedimiento más útil cuando se atienden pacientes en áreas rurales,

suburbanas o selváticas, porque es fácil de realizar, no es costoso y porque aclara el

diagnóstico diferencial. Se logra demostrar los amastigotes en 70 – 80% de las

biopsias de leishmaniosis, dentro de macrófagos univacuolados a los que han

denominado “macrófagos leishmaniásicos”. La vacuola es un fagolisosoma, a cuya

membrana se adhiere el amastigote de una manera característica, que se puede

demostrar perfectamente por microscopia electrónica. Además las biopsias, exhiben

grados diversos de hiperplasia seudoepiteliomatosa con epidermis muy clara y un

infiltrado dérmico e hipodérmico, masivo, difuso, con granulomas constituidos por

macrófagos vacuolados o por células epitelioides y gigantes, que en general es poco

organizado y que varía con el germen productor, el tiempo de evolución de las lesiones

y la respuesta inmune del huésped (104).

Cultivo: el medio más utilizado es el Novy – MacNeal – Nicolle, conocido como medio

NNN. La incubación se hace entre 20ºC y 30ºC, transcurridos ocho días se revisan los

cultivos buscando la presencia de amastigotes en la fase líquida, que con frecuencia

están aglomerados y entrelazados por los flagelos, formando unas rosetas

características (105). Sin embargo, se debe tener en cuenta que hay cepas que

proliferan con mayor dificultad como es el caso de L. braziliensis (114).

Intradermorreacción de Montenegro: esta corresponde a una reacción de

hipersensibilidad tardía, mediante la aplicación de un antígeno compuesto por una

suspensión de promastigotes procedentes de cultivo. La lectura se realiza entre 48 y

72 horas posteriores a la aplicación y se reporta como positiva si se palpa un nódulo

inflamatorio de 5mm o más (105).

Métodos serológicos: para esta se han utilizado técnicas como ELISA, IFI, DAT y

RIA entre otras (105).

Métodos de Biología Molecular: entre los que más se han empleado esta la prueba

de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (105).

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 TIPO DE ESTUDIO

El estudio realizado fue de tipo descriptivo puesto que involucró la estandarización y

evaluación de la funcionalidad de una técnica que no había sido empleada anteriormente

en el Laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud (INS).

5.2 MUESTRAS

Para el estudio se utilizaron 48 biopsias de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina.

Los casos se seleccionaron según el diagnóstico emitido por el Laboratorio de Patología

del INS, teniendo en cuenta únicamente las siguientes patologías: tuberculosis (7 casos),

lepra (8 casos), lesiones por micobacterias atípicas (12 casos), esporotricosis (9 casos),

histoplasmosis (6 casos) y leishmaniosis (6 casos).

5.2.1. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Las biopsias de tejido que llegan al Laboratorio de Patología del INS, se encuentran fijadas

en formol tamponado al 10%, lo que asegura su preservación evitando la autolísis celular

(6), posteriormente son tratadas en el procesador automático de tejidos Histokinette

LEICA (TP-1010), en el cual pasan por: etanol al 100% (7 pases), xilol al 100% (2 pases)

y parafina (2 pases).

La inclusión en bloques de parafina ultra pura (MERCK Ref. 107164) se lleva a cabo en el

Histoembedder LEICA (D-6907 Nussloch), de los cuales se obtienen cortes de 3 a 5 µm en

un micrótomo de rotación LEICA, los cortes se extienden en láminas previamente tratadas

con Poly-L-lisina que proporciona una mayor adhesión del tejido (6).

5.3 CONTROLES

Como controles de la técnica se utilizaron casos en los que la tinción con Ziehl-Neelsen

demostrara presencia de abundantes bacilos ácido-alcohol resistentes y en la tinción con

Hematoxilina-Eosina se observara una evidente lesión del tejido, por esta razón, se

emplearon muestras con diagnóstico de tuberculosis miliar y lepra lepromatosa. Estos se

trabajaron tanto como controles positivos como negativos en cada montaje de la técnica.

De igual forma, se utilizó como control para cada caso una muestra del mismo sin adición

del anticuerpo primario (control negativo).

5.4 ESTANDARIZACIÓN

Para la estandarización de la técnica inmunohistoquímica con anticuerpo anti-BCG

elaborado en conejo (DAKO cod.B 0124), se utilizaron biopsias de tejido con diagnóstico

de tuberculosis miliar y lepra lepromatosa, ya que en estas por medio de la tinción de

Ziehl-Neelsen se observan abundantes bacilos ácido-alcohol resistentes.

En el laboratorio de Patología del INS, las técnicas inmunohistoquímicas se encuentran con

tiempos y concentraciones estandarizadas, las cuales fue necesario modificar para obtener

un resultado óptimo al emplear el anticuerpo anti-BCG.

Las modificaciones que se realizaron fueron:

Los pases consecutivos en buffer citrato (de 1 a 3) a 99 ºC en horno microondas,

dejando las láminas 20 minutos en buffer caliente y 20 minutos en buffer a

temperatura ambiente.

El tiempo de incubación del suero normal se duplicó, quedando este en una hora en

cámara húmeda.

El tiempo de incubación del anticuerpo anti-conejo biotilinado se triplicó, quedando en

tres horas en cámara húmeda.

El tiempo de incubación del complejo ABC se duplicó, quedando en dos horas en

cámara húmeda

Para buscar la concentración óptima del anticuerpo policlonal anti-BCG fue necesario

ensayar diluciones seriadas y variaciones de tiempo a diferentes temperaturas.

5.5 TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA CON ANTI-BCG

5.5.1 DESPARAFINIZACIÓN Y DESHIDRATACIÓN

Una vez secos los cortes de tejido, se sometieron a desparafinización dejándolos

aproximadamente 12 horas en un horno a 60 ºC, una vez transcurrido este tiempo se

deshidrataron pasándolos por 3 xiloles al 100% y 5 alcoholes (2 al 100%, 2 al 95% y 1 al

70%), para luego ser lavados con agua a chorro.

5.5.2 DIGESTIÓN ENZIMÁTICA

El tratamiento con enzimas como la tripsina (ICN cod. 19626) o proteasa (SIGMA P5380),

ayuda al desenmascaramiento del antígeno. Para esto, se diluyó la enzima en PBS

precalentado a 37 ºC, en esta solución se dejaron las láminas por un periódo de 30 min en

horno a 37 ºC, luego se lavaron tres veces con PBS.

5.5.3 BLOQUEO ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ENDÓGENA

El utilizar peroxido de hidrógeno (MERCK 7210) disuelto en metanol (EM MX 0485-7),

permite inhibir la actividad de la peroxidasa endógena presente en algunas células del

tejido evitando así los falsos positivos. Se utilizaron 3 ml de H2O2 en 100 ml de metanol y

se sumergieron las láminas durante 40 minutos a temperatura ambiente, posteriormente

se lavaron 3 veces con PBS.

5.5.4 DESENMASCARAMIENTO DE ANTÍGENO

Se utilizó buffer citrato con varios cambios de temperatura así: se sumergieron las láminas

en el buffer y se pusieron en el microondas hasta alcanzar una temperatura aproximada

de 99 ºC, se repitió el procedimiento de 1 a 3 veces dependiendo de la resistencia que

presentó cada tejido, se dejaron en el buffer caliente por 20 min y luego se cambió por

buffer a temperatura ambiente en el que se dejaron las láminas por otros 20 minutos.

5.5.5 BLOQUEO DE REACCION CRUZADA

El empleo de un suero normal elaborado en caballo, bloquea y evita las posibles

reacciones cruzadas que se puedan presentar. Con este suero se hizo una dilución 1:20

en buffer citrato y se cubrieron los tejidos dejándolos en incubación por 1 hora en cámara

húmeda.

5.5.6 ANTICUERPO ANTI-BCG

El anticuerpo anti-BCG elaborado en conejo, se empleó en dilución 1:300 en buffer citrato,

una vez cubiertos los tejidos con este se dejaron en incubación por 12 horas en cámara

húmeda a 4 ºC.

5.5.7 ANTICUERPO ANTI-CONEJO BIOTINILADO

El anticuerpo (VECTOR BA-1000) va dirigido contra la región Fc del anti-BCG y va marcado

con biotina la cual va a permitir la unión de la enzima. Este anticuerpo se utilizó en una

dilución 1:200 en buffer citrato, el cual se dejó incubando en cámara húmeda por 3 horas.

5.5.8 COMPLEJO AVIDINA–BIOTINA (ABC)

El ABC (VECTOR LAB), se diluyó con PBS y se adicionó a los tejidos, dejandolo en

incubación por un periodo de 3 horas en cámara húmeda.

5.5.9 REVELADO

Para el revelado se utilizó una solución cromógena de diaminobenzidina (SIGMA 3´3 –

Diaminobenzidine Tablets), esta se disolvió en 10 ml de PBS adicionándole 12 µl de

peróxido de hidrógeno. Una vez disuelta la tableta, se agregó a los tejidos por un periodo

de 1 a 2 minutos, cuando se obtuvo el tono café deseado se lavaron las láminas con agua

a chorro.

5.5.10COLORACIÓN DE CONTRASTE

En este caso se utilizó como colorante de contraste la hematoxilina, la cual permite

observar núcleos y citoplasmas celulares. Se sumergieron las láminas por 5 minutos y

luego se lavaron con agua a chorro, posteriormente se introdujeron en una solución de

agua amoniacal por unos segundos y se lavaron nuevamente.

5.5.11REHIDRATACIÓN

Los tejidos se rehidratan para poder observar su estructura original, se pasaron las

láminas por 5 alcoholes de diferentes concentraciones (1 al 70%; 2 al 95% y 2 al 100%) y

por 3 xiloles al 100%, finalmente se cubrió el tejido con una laminilla adherida con

citorrecina. Los tejidos se observaron al microscopio óptico de luz en diferentes aumentos.

6. RESULTADOS

6.1 ESTANDARIZACIÓN

Para la estandarización de la técnica se utilizaron casos de tuberculosis miliar y lepra

lepromatosa, puesto que en estas dos entidades se encuentran grandes acumulos de

bacilos ácido-alcohol resistentes. Para la titulación del anticuerpo primario (anti-BCG) se

utilizaron diluciones seriadas hasta observar que en la dilución 1:300, la tinción de fondo

era aceptable o mínima y el antígeno se teñía intensamente, con un período de incubación

de 12 horas a 4 ºC en cámara húmeda. De igual manera se utilizó buffer citrato a alta

temperatura (99ºC), para lograr una mejor exposición de los diferentes determinantes

antigénicos, asegurando que la integridad del tejido fuera alterada lo menos posible

(Figura 2,3,4,5).

6.2 TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA CON ANTI-BCG

Un total de 52 muestras de tejidos, fijados en formol e incluidos en parafina fueron

procesados con la técnica inmunohistoquímica (IHQ) con el anticuerpo policlonal anti-BCG.

Se utilizaron casos con diagnóstico de tuberculosis, lepra, lesión por micobacterias

atípicas, esporotricosis, histoplasmosis y leishmaniosis, emitido por el Laboratorio de

Patología del INS y confirmado mediante métodos de tinción convencional como

Hematoxilina-Eosina (HE) y Ziehl Neelsen (ZN) y algunas técnicas especiales como IHQ

con anticuerpo anti-Sporothrix schenckii. (Los resultados se encuentran resumidos en la

tabla 5).

En los casos positivos de tuberculosis, lepra, lesión por micobacterias atípicas,

esporotricosis, histoplasmosis y leishmaniosis se observó marcación persistente del

antígeno en los macrófagos, a su vez, estos se analizaron paralelamente con su propio

control negativo, al cual no se le agregó anticuerpo primario (anti-BGC).

Con la tinción de Ziehl-Neelsen no se evidenció la presencia de bacilos ácido-alcohol

resistentes en las biopsias de lesiones por micobacteria atípicas, sin embargo, se pudo

establecer la presencia de antígeno localizado en los macrófagos mediante la técnica con

anti-BCG (Figura 6,7).

En las lepras post tratamiento se observó antígeno positivo, sin embargo en los nervios no

se vio tinción alguna (Figura 8,9)

En los casos de esporotricosis e histoplasmosis, no sólo se presentó marcación del

antígeno digerido por células, si no que también se vió con claridad la levadura del hongo

causante de la enfermedad (Figura 10,11,12,13).

Las biopsias de leishmaniosis cutánea humana y las leishmaniosis experimentales

procedentes de almohadilla plantar de hámster, mostraron marcación positiva del antígeno

en células fagocíticas. En ninguno de estos casos se presentó marcación de los

amastigotes (Figura 14,15).

Tabla 5. Resultados de técnica inmunohistoquímica con anti-BCG.

DIAGNÓSTICO

CASOS

CASOS POSITIVOS

CON ANTI-BCG

CASOS NEGATIVOS

CON ANTI-BCG

Micobacterias atípicas 12 12

Tuberculosis

TBC miliar 1 1

TBC ganglionar 2 2

Granuloma tuberculoide 3 2 1

Esclofuroderma 1 1

Lepra

Lepra lepromatosa 4 4

Lepra post-tratamiento 4 4

Esporotricosis 9 9

Histoplasmosis 6 6

Leishmaniosis 6 6

TOTAL DE CASOS POSITIVOS 47

TOTAL DE CASOS NEGATIVOS 1

TOTAL DE CASOS 48

Figura 2. Piel leproma. Coloración de Ziehl Neelsen. Se observan bacilos y globias fagocitados dentro de los macrófagos. 800x.

Figura 3. Piel leproma (Control). En el mismo espécimen de Figura 2, la técnica inmunohistoquímica con anti-BCG demuestra la tinción difusa del antígeno micobacteriano contenido dentro de los macrófagos, sin delimitación de los bacilos. Técnica IHQ método ABC. 400x.

Figura 4. Tuberculosis miliar pulmón. Coloración de ZN. Se ven bacilos ácido-alcohol resistentes fagocitados dentro de los macrófagos. 400x.

Figura 5. Tuberculosis miliar pulmón (Control). El mismo espécimen de Figura 4 teñido con IHQ contra BCG. Se demuestra una mayor cantidad de antígeno micobacteriano dentro de los macrófagos de la lesión. Técnica IHQ método ABC. 800x.

Figura 6. Granuloma cutáneo por una micobacteria atípica (M. abscessus) aislado en cultivo de la lesión. Coloración de ZN. Se observan macrófagos vacuolados, neutrófilos y plasmocitos pero no se demuestra el agente causal. 800x.

Figura 7. IHQ con anti-BCG en corte de la misma lesión de la Figura 6. Muestra amplio contenido de antígeno micobacteriano dentro de los macrófagos del granuloma cutáneo. Técnica IHQ método ABC. 800x.

Figura 8. Lepra lepromatosa curada y tratada. La coloración de Hematoxilina Eosina (H&E) demuestra macrófagos espumosos como signos residuales en un leproma cutáneo.800x.

Figura 9. Lepra lepromatosa tratada y curada. La IHQ para BCG demuestra persistencia de antígeno micobacteriano dentro de estos macrófagos. Estos antígenos pueden explicar la aparición de reacciones lepróticas post-tratamiento. Técnica IHQ método ABC. 800x.

Figura 10. Lesión cutánea de esporotricosis. Tinción con IHQ con anticuerpo policlonal anti- Sporothrix schenckii. Numerosos macrófagos dan reacción positiva para este antígeno. Técnica IHQ método ABC. 400x.

Figura 11. IHQ con anti-BCG en el mismo caso de la Figura 10. Menor número de macrófagos tiene reacción antigénica positiva pero se ve con más claridad la presencia de levaduras de S. schenckii. Técnica IHQ método ABC. 1000x.

Figura 12. IHQ con anti-BCG. Caso de esporotricosis donde se observa levadura gemante del hongo. Téncnica IHQ método ABC. 2000x.

Figura 13. Histoplasmosis cutánea en paciente con SIDA. La levadura del hongo se tiñe bien con la IHQ con anti-BCG. Técnica IHQ método ABC. 400x, 800x.

Figura 14. Leishmaniosis experimental en almohadilla plantar de hámster por L. panamensis. La IHQ con BCG muestra que algunos macrófagos dan reacción positiva difusa en su citoplasma y los amastigotes no dan reacción alguna. Esto podría indicar que la reacción se da solo en amastigotes desintegrados en el citoplasma de macrófagos. 800x.

Figura 15. Leishmania cutánea en hombre. Numerosos macrófagos dan reacción positiva difusa en su citoplasma. Técnica IHQ método ABC. 800x.

Figura 16. Lesión cutánea de cuello en niña. Escrofuloderma. La tinción con IHQ con anti-BCG muestra numerosos macrófagos y célula gigante con tinción granular difusa. Técnica IHQ método ABC. 400x, 800x.

7. DISCUSIÓN

Las técnicas inmunohistoquímicas (IHQ) son cada vez más empleadas en el diagnóstico e

investigación de enfermedades de origen infeccioso. Es por esta razón, que se quiso

ensayar la técnica con el anticuerpo anti-BCG (anticuerpo primario), que ya ha sido útil en

otros estudios (4,17).

El anticuerpo anti-BCG es un anticuerpo policlonal elaborado en conejo (DAKO cod.B

0124), el cual va dir igido contra antígenos solubles e insolubles de Mycobacterium bovis-

BCG. Al ser utilizado en inmunoelectroforesis cruzada reacciona con aproximadamente

100 antígenos diferentes de BCG, siendo muchos de estos comunes entre micobacterias y

algunos pocos con otras especies de microorganismos causantes de enfermedades como:

eritrasma, vasculitis séptica, nocardiosis, aspergilosis, blastomicosis, histoplasmosis,

esporotricosis, dermatofitosis, tuberculosis, lepra e infecciones por micobacterias atípicas

entre otras (3,4,5,15,16,115).

Aunque las técnicas IHQ se encuentran estandarizadas en el Laboratorio de Patología del

INS, para la utilización del anticuerpo anti-BCG fue necesario hacer variaciones como: el

empleo de buffer citrato a altas temperaturas, que si bien ayuda al desenmascaramiento

del antígeno, puede llagar a afectar la estructura del tejido. Así mismo, los tiempos de

incubación se tuvieron que prolongar para asegurar una mejor unión de los anticuerpos.

En los trabajos realizados por Kutzner (4), Byrd (17) y en el inserto del reactivo, se

recomienda la utilización del anticuerpo anti-BCG (anticuerpo primario) en dilución 1:1000.

Sin embargo, en este trabajo se estableció como concentración óptima 1:300, debido a

que no se contó con la olla a presión Vaporella (116), que proporciona un mejor

desenmascaramiento del antígeno, la cual fue sustituida durante la estandarización por

buffer citrato a 99°C en horno microondas, razón por la cual fue indispensable aumentar

la concentración del anticuerpo primario.

La reactividad cruzada que presenta el anticuerpo anti-BCG frente a diversos

determinantes antigénicos de bacterias, hongos y protozoos fue demostrada en este

estudio mediante la positividad observada en los diferentes casos trabajados. Es

importante mencionar que el anticuerpo no presenta reacción cruzada con el tejido.

En las biopsias con esporotricosis e histoplasmosis, la técnica IHQ reveló no solo la

presencia de antígeno en macrófagos sino que también permitió observar las levaduras del

hongo, las cuales no siempre son teñidas con el anticuerpo anti-Sporothrix schenkii

(elaborado en conejo por el Laboratorio de Microbiología del INS), por esta razón se

considera que el anticuerpo anti-BCG puede ser empleado con fines diagnósticos en estas

patologías.

La alta sensibilidad que tiene el anticuerpo, hace que éste pueda ser empleado como

ayuda diagnóstica en casos en los que las técnicas convencionales como la tinción con

Ziehl-Neelsen (ZN), no revelen la presencia de microorganismos. Tal es el caso de las

lesiones ocasionadas por micobacterias atípicas, en las que a pesar de tener un ZN

negativo, la IHQ con BCG mostró positividad en las células fagocíticas.

En la lepra post-tratamiento la técnica IHQ con BCG reveló positividad en células

espumosas, en las cuales también se observa algunos fragmentos del clofazimine,

medicamento utilizado para el tratamiento de estos pacientes. Sin embargo es importante

resaltar que no se observó ningún tipo de marcación en nervios. Estos antígenos pueden

explicar la aparición de la típica reacción leprótica post-tratamiento.

Aunque en el trabajo en que se ha empleado la técnica IHQ con anti-BCG para lesiones de

leishmaniosis, reporta resultados negativos (4), en el estudio realizado en el Laboratorio

de Patología del INS, se observó que en las biopsias de almohadilla plantar de hámster

con la enfermedad, así como las de leishmaniosis cutánea en humano ocasionadas por L.

panamensis, se evidenció la presencia de reacción positiva en macrófagos, sin que en

ninguno de los casos se tiñeran los amastigotes. La positividad en las células fagocíticas,

puede deberse a que la degradación del antígeno en el interior de estas células, permita la

exposición de diferentes determinantes antigénicos que puedan ser reconocidos por el

anticuerpo policlonal anti-BCG.

8. CONCLUSIONES

Para obtener un mejor marcación con anticuerpo policlonal anti-BCG, este debe

emplearse en dilución 1:300 con un período de incubación de 12 horas en cámara

húmeda a 4°C y debe utilizarse buffer citrato a 99°C.

Con los resultados se hace evidente la reacción cruzada que presenta el anticuerpo

anti-BCG frente a diferentes determinantes antigénicos de diversos

microorganismos, lo cual asegura su alta sensibilidad y baja especificidad.

Al utilizar el anticuerpo anti-BCG en inmunohistoquímica este proporciona gran

ayuda diagnostica en los casos en que las técnicas histoquímicas no permitan

observar el microorganismo, cuando este se encuentra en poca cantidad o ya haya

sido procesado por el sistema inmunológico del paciente.

La inmunohistoquímica con anticuerpo anti-BCG, en los casos en que la

histopatología es similar como en esporotricosis, lesiones por micobacterias atípicas

e incluso en algunas tuberculosis, es de gran utilidad diagnóstica ya que con gran

sensibilidad permite observar la levadura del Sporothrix schenkii.

En los casos de leishmaniosis la reacción cruzada con el antígeno de los

amastigotes presente en las células fagocíticas, confirma que Mycobacterium bovis

y Leishmania comparten antígenos.

En lepra post tratamiento, histoplasmosis y leishmaniosis, la técnica mostró una

alta sensibilidad marcando antígeno en células fagocíticas, en la totalidad de los

casos.

9. RECOMENDACIONES

Continuar el estudio con un número de muestra significativo, determinando la

sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivo y negativo de la

técnica.

Determinar la utilidad de la técnica en diferentes patologías de interés.

Utilizar otros métodos de desenmascaramiento del antígeno que no alteren la

estructura del tejido como los que utilizan vapor y calor.

Trabajar con otro tipo de enzimas reveladoras como la fosfatasa alcalina, ya que

con esta se logra un mejor color de contraste, visualizándose el antígeno de color

rojo en un fondo azul.

Emplear microscopia electrónica para observar ultraestructuralmente la marcación

intracitoplasmática de los macrófagos en las diferentes patologías.

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