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APLICACIÓN DEL CULTIVO DE TEJIDOS

EN LA MULTIPLICACIÓN Y CONSERVACIÓN

DE LOS RECURSOS FITOGENÉTICOS

Editores:Gino Aguirre VillarroelJean Pierre BaudoinLilibeth Leigue Arnéz

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN

Facultad de Ciencias Agrícolas, Pecuarias,Forestales y Veterinarias

Convenio UMSS-CIUF

Posgrado de la FCAPFyV

Departamento de Fitotecnia y Producción Vegetal

Laboratorio de Biotecnología

Comisión Universitaria para el Desarrollo (CUD) Consejo Interuniversitario de la Comunidad Francesa de Bélgica - CIUF

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2016

2016 Aplicación del Cultivo de Tejidos en la Multiplicación y Conservación de los Recursos Fitogenéticos

Quedan reservados todos los derechos de propiedad bajo registro

Depósito Legal xxxx

ISBN xxxx

Autores

Editores

Gino Aguirre Villarroel, Jean Pierre Baudoin, Lilibeth Leigue Arnéz

Producción

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN - Convenio UMSS-CIUF Facultad de Ciencias Agrícolas, Pecuarias, Forestales y Veterinarias Posgrado de la FCAPFyV Departamento de Fitotecnia y Producción Vegetal Laboratorio de Biotecnología

Arte y Diagramación

María Isabel Soliz

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Andrea Alemán A. Impresión

Imprenta xxxxxxx

Cita correcta

Aguirre, Gino; Baudoin, Jean Pierre; Leigue, Lilibeth (editores). 2010. Aplicación del Cultivo de Tejidos en la Multiplicación y Conservación de los Recursos Fitogenéticos. Universidad Mayor de San Simón, Facultad de Ciencias Agrícolas, Pecuarias, Forestales y Veterinarias. Cochabamba, Bolivia. 240 p.

Dirección de contacto

Laboratorio de Biotecnología FCAPFyV Telf./Fax: 591 4 4762752 E-mail: [email protected] 2016 Cochabamba - Bolivia

El contenido de cada capítulo, es de exclusiva responsabilidad de cada uno de sus autores.

Noemí Aguilar

Gino Aguirre

Teresa Ávila

Jean Pierre Baudoin

Ximena Cadima

Margarita Calle

Janett Céspedes

Nidia Coca

Mario Coca Morante

Nelson Chávez

Eva Dancé Sifuentes

Sara de la Barra

Rosario Lucero

Katty Rojas

Raúl Blas Sevillano

María State

Lourdes Tapia

Cecilia Ugarte

Claudio Vázquez

Carmen L. Villarroel

Juan Villarroel

Jazmín Yamashiro

El presente documento es uno de los resultados alcanzados a través del Convenio entre laUniversidad Mayor de San Simón y el Consejo Interuniversitario de la Comunidad Francesa deBélgica (UMSS-CIUF) en la Actividad IV: “Conservación y Manejo de los Recursos Fitogenéticos”,misma que desde el año 2000 ha venido impulsando la formación e investigación en RecursosFitogenéticos a profesionales bolivianos comprometidos con esta temática. El apoyo a estaActividad, otorgado por la Coordinación, Gestión y Administración del CIUF, entre los cuales sedestacan los profesores Yves Carlier, Faustino Torrico, Christian Duqué y la Lic. Wilma Gómez, hasido una de las experiencias más gratas. Los responsables de este libro manifiestan su profundoagradecimiento por el constante apoyo.

La revisión de este documento ha sido realizada por la Ing. Agr. M.Sc. Lilibeth Leigue,Coordinadora de la Especialidad en Recursos Fitogenéticos, por la Dra. Ingrid Morales, docenteinvestigadora de la UAGRM, por la Ing. M.Sc. Carmen Villarroel Vogt, docente invitada en elPosgrado de Recursos Fitogenéticos, por el Dr. Raúl Blas Sevillano, docente de la UNALM – Perú,por el Ing. M.Sc. Víctor Hugo Cardoso, Secretario Ejecutivo del Programa Cooperativo deInnovación Tecnológico Agropecuaria para la Región Andina - PROCIANDINO y por la Lic. AndreaAlemán A., Comunicadora Social, a quienes manifestamos nuestro sincero agradecimiento.

Se hace público nuestro reconocimiento a los diferentes autores, todos vinculados con la UMSS,con el posgrado en Recursos Fitogenéticos y el pregrado de la Carrera de Ingeniería Agronómica,quiénes han contribuido con su tiempo y sus experiencias traducidas en los diferentes capítulos.

La participación de la Universidad Nacional Agraria La Molina del Perú, particularmente a travésde los profesores Dr. Raúl Blas e Ing. M.Sc. Lourdes Tapia, ha contribuido significativamente a larealización de este documento, estamos muy reconocidos por su valioso apoyo.

El PROCIANDINO a través del Ing. M.Sc. Víctor Hugo Cardoso, Secretario Ejecutivo y EspecialistaRegional en Tecnología e Innovación, ha contribuido en la realización de este libro, brindando suapoyo en la diagramación a través de la Sra Mary Soliz, quien además ha diseñado la portadadel presente documento. Para ambos nuestro reconocimiento.

La participación facultativa, a su turno, de los Jefes de Departamento de Fitotecnia, Ing. M.Sc.Benigno Bascopé, Ing. Agr. Freddy Espinoza e Ing. Agr. Gustavo Cárdenas; de Betty Barrionuevo,Licet Bernabé y Karina Cardona, secretarias del Posgrado Facultativo y de la Maestría en RecursosFitogenéticos y de Simón Rojas, administrativo del Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de

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Agradecimientos

Ciencias Agrícolas, Pecuarias, Forestales y Veterinarias (FCAPFyV), ha significado un importanteapoyo en la construcción del posgrado en Recursos Fitogenéticos y en la elaboración de estedocumento.

Finalmente, el constante seguimiento del Prof. Jean Pierre Baudoin a la realización del libro, suincondicional apoyo, amistad y marcado interés en desarrollar el conocimiento en el área andinaen aspectos relacionados a la conservación y uso de los recursos fitogenéticos, ha sidodeterminante en la concepción y realización no sólo de este documento, sino de la maestríamisma; va para él nuestro más profundo agradecimiento.

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conservación de los recursos fitogenétic

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Presentación

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Introducción

El desarrollo de la Biotecnología Vegetal hapermitido abrir un importante número deopor tunidades precisamente para los paísesen desarrollo. A lado de los bene ficios quepueden generar estas técnicas, se planteandesafíos científicos, técnicos y sociales, loscuales son dilucidados en las universidades yen los centros nacionales de investigación eincluso en los empren dimientos privados yempresariales. Esta dinámica ha permitido undesarrollo de la bio tecnología vegetal engeneral y más es pe cíficamente del cultivo detejidos in vitro.

CULTIVOS IN VITRO EN BOLIVIA

En Bolivia existe cerca de 18 laboratoriosinscritos en REDBIO1, aunque el desarrollodel cultivo de tejidos vegetales no pasa de los25 años. Su aplicación práctica en el campoagrícola es la conservación de recursosfitogenéticos y la generación de plantas dealta calidad genética y sanitaria, factibles deser certificadas. Estas técnicas son aplicadasa la conservación de tubérculos, raíces,frutales y últimamente, especies forestales.

Los laboratorios bolivianos se aglutinan entorno a la REDBIO Bolivia, misma que permiteformar parte de los 750 laboratorios debiotecnología vegetal registrados en todaLatinoamérica y el Caribe (Ávila e Izquierdo,2006).

Actualmente, las técnicas de cultivo de tejidosmás utilizadas en Bolivia son las siguientes:

• La limpieza viral para la obtención deplantas libres de patógenos.

• La micropropagación a gran escala deplantas, que genera semilla certificada dealta categoría en el caso de papa y dematerial vegetal con alta calidad genética yfitosanitaria en especies aún no incluidasen el proceso formal de produccióncertificada.

• La conservación in vitro como com ponentede la estrategia de conservación de losbancos de germoplasma de especiesmultiplicadas vegetativamente o de semillarecalcitrante.

Estas técnicas, impulsadas por los centros deinvestigación y universidades, han beneficiadoa empresas, productores, comunidadescampesinas y agricultores al poder ofertarmateriales de alta calidad sanitaria. Estaaplicación ha fortalecido a entidades vigentesanteriormente como el Programa Nacional deSemillas y el Sistema Nacional para laConservación de Recursos Genéticos para laAgricultura y la Alimentación (SINARGEAA).

La aplicación del cultivo de tejidos en Bolivia(VMARNDF, 1999) inicia en 1986 con laUnidad de Producción de Semilla de Papa(SEPA), que basa su estrategia para la pro -ducción de cerca de 3.000 toneladas anualesde semilla de papa, a partir de plántulas libres

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1 Red Latinoamericana de Biotecnología. www.redbio.org

de enfermedades mediante el cultivo detejidos in vitro. Los mecanismos de controlinterno de calidad, entre ellos el test de ELISApara detectar la eventual presencia de virus,están sujetos a un cronograma tanto para lasplántulas de laboratorio como de invernadero.

Esta empresa tiene una producción pro medioanual de 322.000 plántulas in vitro, quegenera una producción bajo mallas antiáfidosde 1.290.000 minitu bérculos (semilla pre-básica). Con este volumen SEPA provee almercado nacional con 950.300 Kg de semillabásica. La exporta ción de semilla pre-básicapara el Brasil y Chile es cercana a un millónde mini tubérculos/año.

La fase de remultiplicación de la semilla depapa de categorías básica y registrada seefectúa con más de 1.200 agricultores enparcelas sobre los 3.000 m de altitud. Laproducción anual es de 2.500 toneladas queson utilizadas por agricultores remultiplica -dores de todo el país. La alta calidad desemilla de papa que se comercializa en el paísproviene precisamente de laboratorios decultivo de tejidos nacionales como es el casode SEPA (Aguirre et al., 2007).

A finales de los ochenta, el Instituto Bolivianode Ciencia y Tecnología Nuclear (IBTEN) enLa Paz, instala con el apoyo de la AgenciaInternacional de Energía Atómica un laborato -rio de Cultivo de Tejidos in vitro destinado arealizar mutaciones inducidas en materialvegetal de diferentes especies. Actualmente,el IBTEN está produciendo plántulas in vitropara la obtención de semilla de alta calidad depapa, oca, isaño, haba y ajo, así como plán -tulas in vitro de piña y plátano destinados alos productores.

En 1991, la actual Fundación PROINPA2

establece en la Estación Experimental deToralapa un Laboratorio de Cultivo de Teji dos,el mismo que se especializa en la lim pie zaviral, habiendo saneado más de un cen tenarde variedades de papa y de otros tubérculos

alto andinos (oca, papalisa e isaño), con lafinalidad de recuperar el poten cial productivode estas especies. En base a este material sepropaga cerca a 100.000 plantas al año, parainiciar flujos de producción de semilla de papaen el sistema formal y en el sistema tradicio -nal de semilla.

En 1994, PROINPA inicia la conservación invitro de las entradas en riesgo del BancoNacio nal de Germoplasma de Tubérculos yRaíces Andinas. Hasta el año 2006 se encon -traban conservadas in vitro el 47% de lacolección de papa (828 entradas) y el 97% dela colección de papalisa (192 entradas).

A principios de esta década, PROINPAproduce con éxito y a 3.430 msnm más de120.000 vitroplantas de banano para losprogramas de desarrollo alternativo delTrópico de Cochabamba, demostrando de estemodo que un laboratorio puede ser versátil deacuerdo a las necesidades del mercado. Para -dójicamente, esta es la últi ma y única licita -ción en materia de produc ción de vitroplantasde banano que realiza una entidad de apoyoal desarrollo alternati vo a una entidad local.Previa a esta licita ción, en todos los años devida de estas agen cias en el país, cerca almillón de plan tas fueron importadas del exte -rior por los programas de Desarrollo Alternati -vo, favore ciendo a la consolidación de labo -ratorios extranjeros y no así a los laboratoriosnacionales.

Actualmente PROINPA realiza la genera ciónde material de alta calidad de frutales de cli -ma templado (duraznero, manzano, frambue -so, cerezo y frutilla), así como de algunas es -pe cies ornamentales, para apo yar demandasespecíficas del sector público y privado.

A principios de los años 90, el ProgramaAgroquímico de la Universidad Mayor de SanSimón con el apoyo de la Cooperación Cana -diense, establece un Laboratorio de Cultivo deTejidos de especies aromáticas, realizandoimportantes avances en la generación deprotocolos de laboratorio y en la producciónde piretro para la gene ra ción de insecticidaspiretroides, sin embar go, debido a la finaliza -

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2 PROINPA: Fundación para la Promoción e Investigaciónen Productos Andinos. www.proinpa.org

ción del financiamien to, este laboratorio no seencuentra funcionando actualmente.

La Corporación Andina de Fomento en 1991apoyó a la Universidad Autónoma GabrielRené Moreno de Santa Cruz con el equipa -miento de un laboratorio ubicado en elInstituto de Investigaciones Agrícolas llamado“El Vallecito”; que se dedicaba a la conser -vación de germoplasma de yuca (Manihotesculenta) y camote (Ipomea batata). En laactualidad se multiplican y difunden losclones producidos in vitro de estas especies,como también se realizan trabajos de micro -injertación en cítricos. En la UAGRM3, Ca rrerade Biología, también funciona el labora toriode cultivo de tejidos BIOFAN dedicado a lapropagación de orquídeas y otras plantasorna mentales y forestales, el cual fue donadopor FAN4, que estableció en 1995 un labora -torio de cultivo de tejidos, principalmente parala recupe ración de especies endémicas,habiendo realizado importantes aportes en elcampo de las orquídeas y de otras especiesnativas durante su vigencia.

La Universidad Mayor de San Simón (UMSS),la Facultad de Ciencias Agrícolas y Pecuariases la primera unidad académica en el país enincorporar en su currícula la asignatura deBiotecnología Vegetal en 1993. En estos últi -mos ocho años, el labora torio ha sido equipa -do gracias al apoyo del Consejo de Universi -dades de Bélgica bajo el Convenio UMSS-CIUF5 a través del pro grama CUI6. La investi -ga ción se dirige principalmente a la genera -ción de proto colos de multiplicación y conser -va ción en especies andinas y en espe ciesornamen tales. A partir de este labora torio, seha realizado una Especialidad en RecursosFitogenéticos y Biotecnología Vege tal Apli caday dos Maestrías bajo el mismo título.

En la década de los 90, se establecen otroslaboratorios, como el Laboratorio de Biotec no -

logía del IBTA Chapare, para la produc ción debanano, piña y otras especies tropicales y ellaboratorio privado IN VITRO en La Paz,ambos actualmente no se encuentran enfuncionamiento.

El Laboratorio de Biotecnología del Banco deSemillas Forestales (BASFOR), depen dien teasimismo de la Facultad de Ciencias Agrícolasy Pecuarias y creado a fines de los años 90,se ha especializado en la gene ración de pro -tocolos para la multiplicación de especiesforestales, logrando generar más de 70protocolos para el estableci miento de plantasforestales.

El Centro Fitoecogenético de Pairumani, de -pendiente de la Fundación Simón I. Patiño,establece en el año 2002 un laboratorio decultivo de tejidos, cuyo principal objetivo es lageneración de protocolos para la conser va cióndel género Passiflora, el cultivo de anteras demaíz y la limpieza viral de algunas especiescomo habas. Actualmen te, el centro cuentacon la colecta de once especies de pasiflorasrealizada con apoyo del IPGRI7 en el año1997. Estas muestras recolectadas son con -servadas en cámara fría a 0º C, en campo yen condiciones in vitro, continuando con laoptimización de las metodologías de conser -vación in vitro y crioconservación.

La Universidad Mayor de San Andrés (UMSA)de La Paz, a través del laboratorio de cultivode tejidos del Instituto de Biología Molecular yBiotecnología de la Carrera de Biología, habuscado estrategias para la conservación deespecies forestales alto andinas en riesgo deextinción, así como para la conservación deorquídeas endé micas del subtrópico de LaPaz.

La Facultad de Agronomía de la UMSA cuentacon un laboratorio de Biotecnología Vegetal.Actualmente está realizando inves tigacionesen la propagación de plantas de papa, frutilla,crisantemo y microorganismos de interés agrí -cola. Por otro lado, la Carrera de Bioquí mica

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3 Universidad Autónoma Gabriel René Moreno

4 FAN: Fundación Amigos de la Naturaleza.

5 CIUF: Cooperation Universitaire InstitunionnelleUniversités Francophones de Belgique.

6 CUI: Cooperación Universitaria Institucional.7 IPGRI: International Plant Genetic Ressources Institute.Actualmente BIOVERSITY.

cuenta también con un laboratorio de cultivode tejidos dedicado principalmente a la inves -tigación en plantas aromáticas y medicinales.

La Escuela Militar de Ingeniería en La Pazcumple funciones académicas y de investi ga - ción en un laboratorio de cultivo de teji dos,entre las que se destaca el uso de reem pla -zantes del agar como solidificantes de mediosde cultivo (información utilizada actualmentepor otros laboratorios locales). Sus actividadesde interacción social, se refieren a limpiarvirus de variedades nati vas de papa de la zonacircunlacustre del lago Titicaca para la pro -duc ción de tubércu lo - semilla de alta calidadsanitaria.

En la Universidad Técnica de Oruro, se cuen -ta con un laboratorio de cultivo de teji dos quecumple funciones académicas y de investi -gación y trabaja con especies andinas.

En Bolivia, en los últimos veinte años, a pe sarde los elevados costos de importación y deadquisición de equipos y reactivos, se halogrado un amplio desarrollo de las técnicasde cultivo de tejidos, lo cual puede verificar sea través del significativo incremento de espe -cies, variedades y número de plantas produci -das mediante estas técnicas. Asi mismo, se hafortalecido la capacidad de los laboratorios anivel de equipos y recursos humanos.

Las colecciones resguardadas en bancos degermoplasma han sido fortalecidas al incor -porar en su estrategia a la conserva ción invitro y la crioconsevación. La Red Boliviana deBiotecnología, a través de sus asociados, hagenerado cinco reuniones na cio nales en estosúltimos años, difundien do más de un centenarde trabajos escritos en cada reunión. Estasacciones van forta leciendo paulatinamente aesta asociación, que permite mostrar lacapacidad tecnológi ca y humana existente enel ámbito nacional.

Finalmente, es posible afirmar que el desa -rrollo de la agricultura boliviana, tiene unvalioso aliado en el uso de estas técnicas ymetodologías, que son ampliamente difun -didas por los diferentes laboratorios y cen tros

de enseñanza pertenecientes a univer si dadesy fundaciones de apoyo al desarro llo. Lasexperiencias generadas por los autores,involucrados con la formación académica dela UMSS, se puede apreciar en estedocumento.

CULTIVOS IN VITRO EN PERÚ

De acuerdo a la REDBIO8 y a su directorio delaboratorios inscritos en esta Red, en Perúexisten 56 laboratorios relacionados a la bio -tec nología vegetal, debidamente registrados,de los cuales 32 pertenecen a las univer sida -des tanto nacionales como privadas en suscarreras de ciencias agra rias, bioquímicas ybiológicas. Entre éstas se destaca el Institutode Biotecnología de la UNALM9, que cuentacon los laboratorios de Cultivo de Teji dosVegetales, con activi dades de investigación ydocencia, con laboratorios de BiologíaMolecu lar destina dos a la caracterizaciónmolecular de espe cies nativas tanto de anima -les y vegetales; y el laboratorio de Biotecno -logía Industrial dirigido a la identificación yuso de metabo litos secundarios, generaciónde vacunas e identificación de compuestosvaliosos en los recursos genéticos. Para sudesarrollo y equipamiento, este Instituto hacontado en los últimos diez años con elvalioso apoyo del CIUF.

El Instituto Nacional de Investigaciones Agra -rias del Perú cuenta con 11 laboratorios distri -buidos en un número similar de esta cio nesexperimentales y centros de investi ga ción,ubicados en las diferentes ecoregio nes conque cuenta el país. Existen ade más, treslaboratorios de investigación que dependendirectamente del CIP10, con sede en Lima.

La actividad empresarial se encuentrarepresentada con una decena de laborato rios,misma que ha iniciado emprendimien tos

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8 Red de Biotecnología Vegetal para la América Latina yel Caribe. www.redbio.org

9 UNALM: Universidad Nacional Agraria La Molina.www.unalm.edu.pe

10CIP: Centro Internacional de la Papa. www.cipotato.org

principalmente en la propagación masiva deespecies de alta demanda en la agriculturaperuana y regional.

BIBLIOGRAFÍAAguirre G., Villarroel C., Trujillo A., Rocabado C., Ávila

T., Mendoza V.H., y Pérez J. 2007. El Cultivo detejidos vegetales en Bolivia. Expe rien cias de suactual uso en la Agricultura Boli viana. CongresoSudamericano de Agronomía. Cochabamba,Bolivia. 10 – 12 de Octubre de 2007.

Ávila T., Izquierdo J. 2006. “Management of theappropriate agricultural biotechnology for small

producers: Bolivia case study”. Electronic Journalof Biotechnology. Universidad Católica DeValparaíso; 9 (1): 2-7. En:www.bioline.org.br/abstract?id=ej06001.Consultado 15 de abril 2009. En:www.REDBIO.org

VMARNDF/DGB – PNUMA/FMAN. 1999. ProyectoGEF/1200 -98-71 Apoyo para el Estable ci mientode un Marco Nacional de Biosegu ridad.Diagnóstico sobre la Situación de la seguridadde la Biotecnología y la Biotec nolo gía en Bolivia.La Paz, Bolivia. pp. 68.

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A continuación se indica en orden alfabético lanómina de profesionales que brindaron suexperiencia profesional en la edición técnica,revisión y co autoría de los diferentes capítulos deeste documento.

EDITORES TÉCNICOS:

Gino Aguirre Villarroel([email protected])

Ingeniero Agrónomo FCAyP - UMSS Cochabamba– Bolivia 1983. M.Sc. de la Faculté Universitairedes Sciences Agronomiques de Gembloux –Bélgica 1990. Investigador, Co Director, GerenteTécnico y Responsable de capacitación enPROINPA años 1990 a 2007. Gestor yResponsable de la Actividad IV «Conservación deRecursos Fitogenéticos” Convenio UMSS-CIUF,de 2000 a 2007. Docente en la Carrera deIngeniería Agronómica – UMSS desde 1993 enBiotecnología y Propagación de Plantas.

Jean Pierre Baudoin([email protected])

Ingeniero Agrónomo. Orientación Agronomía deRegiones Tropicales y Subtropicales. FacultéUniversitaire des Sciences Agronomiques deGembloux (Belgique) 1973. Doctor en SciencesAgronomiques - Faculté Universitaire desSciences Agronomiques de Gembloux (Belgique)1981. Profesor ordinario de la Universidad deLiège, Gembloux Agro-Bio Tech. Responsable dela Actividad IV “Conservación de Recursos Fitoge -néticos”. 2000 – 2007. Coordinación de la

Maes tría en Recursos Fitogenéticos y Biotecno -logía Vegetal Aplicada en el marco de la Fase IIICUI UMSS 2008 - 2011. Coordinación de laActividad “Cultivos andinos” con la UNSAAC(Universidad Nacional San Antonio Abad deCusco, Cusco, Perú) en el marco de la Fase I CUIPerú 2009 – 2012. Redactor en jefe RevistaBASE (Biotecnología, Agronomía, Sociedad yMedio Ambiente) de la FASGX Bélgica.

Lilibeth Leigue Arnéz([email protected])

Ingeniero Agrónomo (UMSS-Bolivia), M.Sc. Re -cur sos Naturales, con énfasis en Manejo y Con -servación de Biodiversidad (CATIE- Costa Rica),especialista en Economía del Sistema Agroali -men tario (Cefas-Italia). Trabajó en Cultivo deTejidos in Vitro de especies aromáticas nati vas,en la Universidad de Québec en Chicoutimi(Canadá), y participó en el diseño e implemen -tación del laboratorio de cultivo de Tejidos delCentro de Tecnología Agroindustrial (CTA).Coordinadora de la Especialización y Maestría enRecursos Fitogenéticos y Biotecnología VegetalAplicada entre 2000 y 2003, y docente invitadaentre 2003 y 2006.

REVISORES:

Andrea Alemán A.([email protected])

Comunicadora Social titulada en la UniversidadCatólica Boliviana “San Pablo” (Cochabamba).Realiza estudios de Sociología en la Universidad

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Profesionales participantes en eldocumento

Mayor de San Simón y consultorías para laUnidad de Comunicación de la FundaciónPROINPA, además de la edición y traduccionesde diversos textos.

Raúl Humberto Blas Sevillano([email protected])

Ingeniero Agrónomo y M.Sc. en MejoramientoGenético de Plantas, Universidad NacionalAgraria La Molina (UNALM), Lima-Perú y PhD.en Ciencias Agronómicas e Ingeniería Biológica.Faculté de Sciences Agronomiques deGembloux-Bélgica. En 1997 se incorporó a laFacultad de Agronomía y Departamento deFitotecnia de la UNALM. Actualmente es profesorasociado y dicta cursos de pre y post grado en elárea de mejoramiento genético de plantas ydoctorado en agricultura sustentable. Es miembrodel Instituto de Biotecnología de la UNALM, áreade biología molecular. Su principal área de inves -ti gación es en gestión de recursos genéticos vege -tales de la región andina y mejoramiento de plan -tas. Ha sido docente invitado en la Maestría enRecursos Fitogenéticos de la UMSS el año 2006.

Victor Hugo Cardoso([email protected])

Ingeniero Agrónomo/ESPOCH. Ecuador, Master inAgricultural Extension & Education NMSU.USA.Investigador Instituto Nacional Autónomo deInves tigaciones Agropecuarias INIAP-Ecuador.Experto Internacional Misión de Cooperación Téc -ni ca Holandesa EUROCONSUL/CNS/PROSEMPA-Bolivia, Asesor de la Misión de CooperaciónTécnica de la República de Alemania/INIAP-GTZ/Ecuador; Subsecretario/Ministerio deAgricul tura y Ganadería/Ecuador; Viceministro deAgricultura y Ganadería; Director General delInstituto Nacional Autónomo de InvestigacionesAgropecuarias-INIAP-Ecuador; Especialista Re -gio nal en Tecnología & Innovación y Biotecno -logía para la región Andina/IICA y SecretarioEjecutivo del Programa de Tecnología e Innova -ción Agropecuaria para la Región Andina.

Lilibeth Leigue Arnéz.

Ingrid Morales Benavent ([email protected],[email protected])

Licenciada en Biología por la UAGRM en Bolivia.Especialista en Recursos Fitogenéticos y Biotec -nología Vegetal. Doctorando en “Biotecnología yRecursos Genéticos de plantas y microorganis -mos asociados” de la Universidad Politécnica deMadrid. Docente y Coordinadora del Laboratoriode Biotecnología Vegetal, BIOFAN de la Carrerade Biología de la UAGRM. Ha trabajado por 20años en Cultivo de tejidos vegetales in vitro deespecies agrícolas, forestales y ornamentales,especialmente en orquídeas endémicas y nativasde Bolivia.

Carmen Luz Villarroel Vogt([email protected])

Ingeniera Agrónoma FCAyP - UMSS Cochabamba– Bolivia 1993. Maestria en Ciencias de laFaculté des Sciences Agronómiques deGembloux – Bélgica 2004. Becaria, Técnico,Investigadora y Responsable de Capacitación enla Fundación PROINPA desde 1990 a la fecha.Docente invitada en la Especialidad y Maestríaen Conservación de Recursos Fitogenéticos yBiotecnología Vegetal Aplicada 2000 a 2007.

AUTORES:

Gino Aguirre Villarroel

Teresa Avila([email protected],[email protected])

Ingeniero Agrónomo, UMSS Cochabamba Bolivia1992. Maestría en Ciencias, Especialidad Bio -tecnología, Faculté des Sciences Agronómiquesde Gembloux, Belgica 1994. ResponsableLaboratorios de Biotecnologia, Centro de Investi -gaciones Fitoecogeneticas de Pairumani, desde2002. Docente Carrera de Biologia UMSS desde

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1996. Docente Maestria Proteccion Vegetal(2009), Maestria Ecologia y Medio Ambiente(2004, 2005 y 2006), Maestría en RecursosFitogenéticos y Biotecnología Vegetal Aplicada(2000, 2001 y 2005), UMSS.

Jean Pierre Baudoin

Raúl Blas Sevillano

Ximena Rocío Cadima Fuentes([email protected])

Ingeniera Agrónoma, con maestría en Biotec -nología. Sus áreas de especialidad son los recur -sos genéticos, cultivo de tejidos y biología mole -cular. Realizó sus estudios de licenciatura en laFacultad de Agronomía de la Universidad Mayorde San Simón (UMSS), Cochabamba y la maes -tría en laUniversidad de Wageningen, Holanda.Actualmente ocupa el cargo de Coordinadora delárea temática de recursos genéticos en laFundación PROINPA y es docente invitada en laMaestría de Recursos Genéticos y BiotecnologíaAplicada en la UMSS.

Margarita Calle M.([email protected])

Ingeniera Agrónoma UMSS, Cochabamba,Bolivia, Maestría en Recursos Fitogenéticos yBiotecnología Vegetal Aplicada en 2009,Convenio UMSS CIUF. Pasantía en Cultivos invitro en la UNALM – IBT en 2006. Asistente dellaboratorio de Biotecnología Vegetal de laCarrera de Ingeniería Agronómica de la FCAPFyVgestiones 2005 – 2009. Investigadora del INIAFnoviembre 2009.

Nelson Chávez ([email protected])

Ingeniero Agrónomo FCAyP - UMSS Cochabamba– Bolivia en 2008. Consultor independiente.Trabajo de tesis realizado en el laboratorio deBiotecnología de la FCAPFyV de la UMSS enembriogénesis somática en Violeta africana.

Mario Coca Morante ([email protected] )

Ingeniero Agrónomo Universidad Mayor de SanSimón, Cochabamba, Bolivia. Pos grado(Maestría en Ciencias) en Patología Vegetal,Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima,Perú. Docente de Fitopatología en la FCAPFyV,UMSS, Cochabamba, Bolivia.

Sara de la Barra Delgadillo

Formación en Biología Facultad de Ciencia yTecnología, carerra de Biología – UMSS. Cocha -bamba – Bolivia. Diplomado en Ecología y MedioAmbiente FCyT – UMSS, 2005. Estudiante de laMaestría en Conservación y Manejo de RecursosFitogenéticos y Biotecnología Vegetal Aplicada.Convenio UMSS CIUF 2009 – 2011. Consultoraindividual en biodiversidad y recursosfitogenéticos, experiencia en técnicas de cultivosin vitro

Rosario Lucero León

Ingeniera Agrónoma. Facultad de Ciencias Agrí -colas, Pecuarias y Veterinarias, UniversidadTécnica de Oruro, 1992. Responsable delLaboratorio de Biotecnología IBTA Chapare, de1994 a 2001. Posgrado en Rizobiología.Pasantía en Cultivos in vitro en la UNALM – IBT,Lima – Perú en 2007. Estudiante de posgradode la Maestría en Conservación y Manejo deRecursos Fitogenéticos y Biotecnología VegetalAplicada. Convenio UMSS - CIUF 2005 – 2007.

Katty Guadalupe Rojas Quiroga([email protected])

Licenciatura en Ingeniería Agronómica, UMSS(Cochabamba – Bolivia). Especialidad enConservación de Recursos Fitogenéticos yBiotecnología Vegetal Aplicada, ConvenioUMSS-CIUF (Cochabamba-Bolivia), DiplomadoCASDER, UPB (Cochabamba-Bolivia). Consultorindependiente

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María State Vagaón([email protected])

Ingeniero Petroquímico de la Universidad dePetróleo y Gases de Ploiesti – Rumania. Maestríaen Educación, Mención Educación Superior.Escuela de Comando del Estado Mayor (ECEM),Universidad Militar de las FFAA. Docente titularen la Universidad Mayor de San Simón –FCAPFyV en la asignatura de Química General.

Maria de Lourdes Tapia y Figueroa([email protected])

Ingeniera Agrónoma de la Universidad NacionalHermilio Valdizan de Huanuco - Perú. Maestríaen Ciencias Agronómicas. Faculté de SciencesAgronómiques de Gembloux-Bélgica. Estudiosde Doctorado en la Universidad Ciego de AvilaCuba. Profesor principal en la Facultad de Agro -nomía y Departamento de Fitotecnia de laUNALM. Es Directora del Instituto de Biotecno -logía de la UNALM y Lider del área de cultivo detejidos in vitro. Ha sido docente invitada en laEspecialidad y en la Maestría en RecursosFitogenéticos y Biotecnología Vegetal Aplicada dela UMSS en diferentes gestiones.

Ninfa Cecilia Ugarte Ballón([email protected])

Ingeniera Agrónoma FCAyP - UMSS Cochabamba– Bolivia. 1990. M.Sc. en Biotecnología, Facultédes Sciences Agronómiques de Gembloux –Bélgica. Especialidad en multiplicación in vitroen especies leñosas. CRA – Gembloux. Doctora -nte en Ciencias Agronómicas y Biotecnología(2004 a la fecha), FSAGX – Bélgica. Responsabledel Laboratorio de Biotecnología “Aliso”BASFOR/ESFOR - UMSS. Curadora del Banco deConservación de Germoplasma in vitro deespecies forestales. Convenio MDRyMA-SIBTA-SINARGEAA/ BASFOR- ESFOR/UMSS. DocenteEscuela de Ciencias Forestales ESFOR enGenética y Mejoramiento Forestal, ProcesosBiotecnológicos y Técnicas de Estudio eInvestigación.

Claudio Vázquez([email protected])

Ingeniero Agrónomo FCAyP – UMSS en 2002.Diplomado en Ecología y Medio Ambiente. UMSSen 2005. Primer Premio en Biodiversidad en la IIFeria de Ciencias de la Universidad Mayor, Real yPontificia San Francisco Xavier de Chuquisaca,con su trabajo sobre multiplicación in vitro deorquídeas en 2006. Alumno de la Maestría enConservación y Manejo de Recursos Fitoge né -ticos y Biotecnología Vegetal Aplicada. ConvenioUMSS – CIUF gestión 2009 - 2011. Consultorindividual en temáticas relacionadas a la agrobio -di versidad, certificación orgánica y conservaciónde recursos fitogenéticos.

Carmen L. Villarroel Vogt.

Juan Villarroel Solíz([email protected] )

Ingeniero Agrónomo Facultad de CienciasAgrícolas y Pecuarias – UMSS. Posgrado enBiotecnología en la Universidad Internacional deAndalucía, España. Docente de la FCAPFyV enlas asignaturas de Morfología Vegetal, Sistemá -tica Vegetal y Biotecnología.

Jazmín Yamashiro Q. ([email protected])

Ingeniero Agrónomo de la Universidad Autóno -ma Gabriel Rene Moreno el año 2001 en SantaCruz, Bolivia. Postgrado en Protección Vegetal enla Universidad de Pelotas en Brasil (2004),Estudios superiores a nivel de Maestría en Cien -cias, en el marco del Convenio UMSS CIUF enManejo y Conservación de Recursos Fitoge -néticos y Biotecnología Vegetal Aplicada en laUniversidad Mayor de San Simón deCochabamba en el año 2009. Con experiencia enBiotecnología, Biología Molecular y desarrollo deproyectos en estas áreas.

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Agradecimientos 3Presentación 5Introducción 7Profesionales participantes en el documento 13

PARTE I. FUNDAMENTOS TEÓRICO PRÁCTICOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS IN VITRO 27

CAPÍTULO 1. ASPECTOS GENERALES DEL CULTIVO IN VITRO 29Gino Aguirre, Margarita Calle & Jean Pierre Baudoin

1.1. Introducción 291.2. Principios botánicos para el cultivo in vitro 311.3. Métodos de regeneración in vitro 31

1.3.1. Cultivo de órganos 311.3.2. Explantes primarios 311.3.3. Cultivo celular 31

1.4. Ventajas del cultivo in vitro 321.5. Limitaciones del cultivo in vitro 321.6. Aplicaciones del cultivo de tejidos 321.7. Bibliografía 33

CAPÍTULO 2. ESTABLECIMIENTO DE UN LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS 35Gino Aguirre & Margarita Calle

2.1. Introducción 352.2. Localización de un laboratorio de cultivo de tejidos 352.3. Organización de un laboratorio 36

2.3.1. Antesala o vestíbulo 362.3.2. Área de oficina 362.3.3. Área de lavado y esterilización 362.3.4. Área de preparación de medios 372.3.5. Área de repicaje o siembra 372.3.6. Área de crecimiento 382.3.7. Áreas de observación y examen 392.3.8. Área destinada a la cámara de termoterapia 392.3.9. Áreas de cuarentena y control fitosanitario 392.3.10. Áreas frías 392.3.11. Almacén 392.3.12. Invernaderos y áreas de aclimatación 39

2.4. Equipos y materiales 402.5. Medidas de seguridad del personal 412.6. Bibliografía 41

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Contenido

CAPÍTULO 3. NORMAS DE SEGURIDAD EN LABORATORIOS DE CULTIVO DE TEJIDOS 43Margarita Calle & Gino Aguirre

3.1. Introducción 433.2. Áreas del laboratorio 43

3.2.1. Área del vestíbulo 433.2.2. Área de lavado y esterilización 433.2.3. Señalización 443.2.4. Espacio y seguridad en los ambientes 443.2.5. Área de preparación de medios de cultivo 453.2.6. Área de cámara de flujo laminar 463.2.7. Reglas de manejo en el área de cámara de flujo laminar 46

3.3. Almacén 473.3.1. Almacenamiento de los reactivos o sustancias químicas 473.3.2. Incompatibilidad de sustancias para el almacenamiento 483.3.3. Reglas de almacenamiento 483.3.4. Descripción y manipulación de reactivos 483.3.5. Principales medios de penetración de los agentes químicos 503.3.6. Efectos de los agentes químicos en el organismo 503.3.7. Cámaras de seguridad biológica 503.3.8. Agentes biológicos 513.3.9. Riesgo eléctrico 513.3.10. Manejo de residuos 523.3.11. Cámara de crecimiento 52

3.4. Procedimientos y medidas de primeros auxilios 523.5. Procedimientos para prevenir o eliminar riesgos de accidentes 543.6. Equipos de seguridad 543.7. Invernadero 543.8. Bibliografía 55

CAPÍTULO 4. CONTAMINANTES EN CULTIVO IN VITRO 57Gerónimo G. F., Pérez B. L. F., Plata G.& Aguirre V. J. G

4.1. Introducción 574.2. Principales fuentes de contaminación 574.3. Microorganismos contaminantes introducidos en el laboratorio de cultivo in vitro 574.4. Métodos de detección de vitropatógenos 594.5. Uso de sustancias antimicrobianas 604.6. Identificación de microorganismos contaminantes de hongos

y bacterias en medio de cultivo con vitroplantas 614.7. Aspectos a considerar en la contaminación en Laboratorio de Biotecnología Vegetal 624.8. El laboratorista 634.9. Los equipos y el instrumental 634.10. Efecto de las condiciones ambientales y la fisiología de las plantas 634.11. Eliminación de los contaminantes de los explantes 644.12. Tratamiento a las plantas madres 644.13. Desinfección de los explantes 644.14. Detección de contaminantes latentes 644.15. Prevención y tratamiento de la contaminación en el laboratorio 654.16. Pruebas de sensibilidad bacteriana para cultivo de tejidos vegetales 664.17. Bibliografía 67

CAPÍTULO 5. ASEPSIA Y TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN 69Margarita Calle, Mario Coca Morante & Gino Aguirre

5.1. Introducción 69

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5.2. Fuentes de contaminación 695.2.1. Microorganismos del explante 695.2.2. Contaminantes introducidos en laboratorio 70

5.3. Prevención de contaminantes de los cultivos 705.3.1. Tratamiento de material de origen 705.3.2. Esterilización de medios e instrumentos de cultivo 705.3.3. Asepsia de personal y ambientes 705.3.4. Cultivo de los explantes en cámara de flujo laminar 715.3.5. Incubación de los cultivos en cámaras de crecimiento estéril 71

5.4. Técnicas de esterilización 715.4.1. Métodos físicos 715.4.2. Filtración 725.4.3. Rayos Ultravioleta 72

5.5. Medios prácticos para el control de fuentes de contaminación 755.6. Bibliografía 75

CAPÍTULO 6. MEDIOS DE CULTIVO 77Cecilia Ugarte, Carmen L.Villarroel, Gino Aguirre & María State

6.1. Introducción 776.2. Composición de los medios de cultivo 77

6.2.1. Sales minerales 776.2.2. Reguladores de crecimiento 786.2.3. Agentes quelatos 816.2.4. Carbohidratos 816.2.5. Vitaminas 816.2.6. Aminoácidos 816.2.7. Potencial osmótico 826.2.8. Estabilizadores osmóticos 826.2.9. Suplementos no definidos utilizados en la composición de medios de cultivo 826.2.10. Carbón activo 826.2.11. pH 836.2.12. Modificación del Potencial Redox 836.2.13. Material de soporte 836.2.14. Agua 84

6.3. Preparación de medios de cultivo 846.3.1. Conceptos básicos para la preparación de soluciones 846.3.2. Precauciones en el laboratorio 856.3.3. Preparación de soluciones madre 85

6.4. Preparación del medio de cultivo 866.4.1. Ajuste de pH 866.4.2. Adición de la fuente de energía 866.4.3. Cantidad y distribución del medio 866.4.4. Esterilización del medio 866.4.5. Vida de anaquel del medio 86

6.5. Bibliografía 87

CAPÍTULO 7. MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS 89Carmen L. Villarroel & Ximena Cadima

7.1. La propagación vegetativa in vitro 897.2. Principales aplicaciones 907.3. Tipos de multiplicación in vitro 90

7.3.1. Multiplicación a través de la proliferación de yemas o brotes axilares 917.3.2. Multiplicación a través de la inducción de yemas adventicias 91

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7.3.3. Multiplicación a través de embriogénesis somática 917.4. Fases de la micropropagación 93

7.4.1. Fase 1: Establecimiento 937.4.2. Fase 2: Multiplicación 957.4.3. Fase 3: Enraizamiento 997.4.4. Fase 4: Aclimatación 100

7.5. Principales problemas de la micropropagación 1027.5.1. Contaminaciones fungosas y bacterianas 1027.5.2. Oxidación fenólica 1037.5.3. Vitrificaciones 1037.5.4. Variación somaclonal 1037.5.5. Otros 103

7.6. Bibliografia 104

CAPÍTULO 8. LIMPIEZA VIRAL EN ESPECIES VEGETALES 107Gino Aguirre & Mario Coca Morante

8.1. Introducción 1078.2. Selección del material vegetal a sanear 1088.3. Técnicas de limpieza viral 108

8.3.1. Cultivo de meristemas 1088.3.1.1. Distribución de los virus en la planta 1098.3.1.2. Factores que determinan el cultivo de meristemas 1108.3.1.3. Fases del cultivo de meristemas 1118.3.1.4. Aplicaciones del cultivo de meristemas 1138.3.1.5. Técnicas complementarias al cultivo de meristemas 113

8.3.2. Técnicas avanzadas de diagnóstico de virus 1158.4. Conclusiones y perspectivas 1158.5. Bibliografía 116

CAPÍTULO 9. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA Y MUTAGÉNESIS 117Juan Villarroel & Nelson Chávez

9.1. Introducción 1179.2. Multiplicación vegetativa 1179.3. Morfogénesis 1189.4. Diferencia entre organogénesis y embriogénesis 1189.5. Embriogénesis somática 1189.6. Características de la embriogénesis somática 1189.7. Embriogénesis somática directa 1199.8. Embriogénesis somática indirecta 1199.9. Fases de la Embriogénesis Somática (ES) 1209.10. Factores que influyen en la embriogénesis somática 1239.11. Inducción mutagénica 1239.12. Tipos de Mutaciones 1239.13. Mutación espontánea e inducida 124

9.13.1. Mutación espontánea 1249.13.2. Mutación inducida 124

9.14. Niveles mutacionales 1259.14.1. Mutación génica 1259.14.2. Mutación cromosómica 1259.14.3. Mutación genómica 1269.14.4. Especificidad mutacional 126


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CAPÍTULO 10. CONSERVACIÓN IN VITRO DE ESPECIES VEGETALES 129Ximena Cadima & Carmen L. Villarroel

10.1. Conservación de germoplasma 12910.2. Conservación in vitro 130

10.2.1. Definición de conservación in vitro 13110.2.2. Géneros (cultivos) que se pueden conservar in vitro 13110.2.3. Ventajas y limitaciones de la conservación in vitro 13110.2.4. Requerimientos para la conservación in vitro 132

10.3. Procedimientos para inhibir o frenar el desarrollo in vitro 13310.3.1. Conservación a corto y mediano plazo 13310.3.2. Conservación a largo plazo 13410.3.3. Ventajas de la conservación in vitro a bajas temperaturas 134

10.4. Banco genético in vitro activo 13410.4.1. Etapas para el establecimiento de un banco genético in vitro activo 13410.4.2. Renovación o refrescamiento del material (transferencia a

condiciones de crecimiento normal) 13610.4.3. Monitoreo de la estabilidad genética 13610.4.4. Documentación y sistematización de la información 136

10.5. Banco genético in vitro básico 13710.5.1. Requisitos para la crioconservación 13710.5.2. Etapas de la crioconservación 137

10.6. Conclusiones 13810.7. Bibliografía 138

CAPÍTULO 11. LA DIVERSIDAD MICROBIANA Y LOS SERVICIOS AMBIENTALESDE LAS MICORRIZAS A LA AGRICULTURA 141

Noel Ortuño, Fátima Rojas, Deyby Felipez.11.1. Diversidad microbiana del suelo 14111.2. La diversidad micorricica 141

11.2.1. Plantas simbiontes 14211.3. Tipos de micorrizas 14311.4. Sinergismo con otros microorganismos 14511.5. Importancia en la nutrición vegetal 14611.6. Beneficios para la agricultura 146

11.6.1.Beneficios de las micorrizas en el crecimiento de las plantas 14611.7. Factores del suelo que afectan el desarrollo de las micorrizas 14811.8. Referencias bibliográficas 149

PARTE II. APLICACIONES PRÁCTICAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS IN VITRO 151

CAPÍTULO 12. LA APLICACIÓN DEL CULTIVO DE TEJIDOS EN LA MULTIPLICACIÓNY CONSERVACIÓN DE LOS RECURSOS FITOGENÉTICOS 153Jean Pierre Baudoin

12.1. Introducción 15312.2. Contribución del cultivo in vitro en la conservación de los recursos fitogenéticos 15412.3. Conservación a corto, mediano y largo plazo 15512.4. Cultivo in vitro de crecimiento lento 15612.5. Criopreservación o suspensión total del crecimiento y metabolismo 15712.6. Integridad y estabilidad en cultivo in vitro 15912.7. Bibliografía 159

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CAPÍTULO 13. CONSERVACIÓN IN VITRO Y EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD GENÉTICA 161 Raúl Blas Sevillano, Carmen L. Villaroel & Gino Aguirre

13.1. Introducción 16113.2. Conservación in vitro de germoplasma 16113.3. Variación somaclonal 16513.4. Estabilidad genética 16613.5. Monitoreo de la estabilidad genética y epigenética 167

13.5.1. Marcadores RAPDs 16713.5.2. Marcadores AFLPs 169

13.6. Estrategias para reducir variación somaclonal 17113.7. Bibliografía 172

CAPÍTULO 14. MICROPROPAGACIÓN DE ACHIRA (CANNA EDULIS) 173Eva Dancé Sifuentes, María de Lourdes Tapia & Rosario Lucero

14.1. Introducción 17314.2. Origen y distribución 17314.3. Taxonomía 17414.4. Morfología 17414.5. Ecología de la achira 17414.6. Usos de la achira 17514.7. Cultivo in vitro de achira 17514.8. Desinfección y establecimiento de los explantes 17614.9. Aclimatación 17714.10. Conservación por crecimiento mínimo 17714.11. Bibliografía 177

CAPÍTULO 15. CULTIVO IN VITRO DE PASIFLORAS 179Teresa Ávila, Sara de la Barra, Nidia Coca, Noemí Aguilar & Janett Céspedes

15.1. Introducción 17915.2. Establecimiento in vitro 18015.3. Multiplicación in vitro–micropropagación 18015.4. Aclimatación de las plántulas 18115.5. Conservación in vitro 18215.6. Crioconservación 183

15.6.1. Crioconservación de semillas 18315.6.2. Crioconservación de ápices por vitrificación 183

15.7. Crioconservación de ápices por encapsulación-desecación 18415.8. Bibliografía 185

CAPÍTULO 16. EL CULTIVO IN VITRO EN CHILTO (PHYSALIS PERUVIANA) 187Katty Rojas, Gino Aguirre & Ximena Cadima

16.1. Introducción 18716.2. Descripción taxonómica y morfológica de uchuva Physalis peruviana 18716.3. Distribución geográfica de P. peruviana 18916.4. Uso e importancia económica de P. peruviana 18916.5. Propagación 189

16.5.1. Reproducción Sexual 18916.5.2. Reproducción asexual 190

16.6. Conservación in vitro de Germoplasma 19016.7. Multiplicación in vitro 19316.8. Bibliografía 194

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CAPÍTULO 17. LA APLICACIÓN DEL CULTIVO DE TEJIDOS EN ESPECIESFORESTALES ANDINAS KEWIÑA (POLYLEPIS BESSERI HIERON) 197Cecilia Ugarte

17.1. Introducción 19717.2. Información general y descripción de kewiña 197

17.2.1. Descripción taxonómica 19717.2.2. Descripción morfológica 198

17.3. Micropropagación 19917.3.1. Recolección de material vegetal 19917.3.2. Desinfección y establecimiento 19917.3.3. Multiplicación y enraizamiento 199


CAPÍTULO 18. MULTIPLICACIÓN IN VITRO DE ORQUÍDEAS NATIVAS BOLIVIANAS 201Claudio Vázquez, Gino Aguirre, Cecilia Ugarte, Juan Villarroel & Jazmín Yamashiro

18.1. Introducción 20118.2. Orquídeas endémicas de Bolivia 20118.3. Orquídeas nativas de Bolivia 202

18.3.1. Epidendrum ssp. 20318.3.2. Huntleya meleagris 203

18.4. Las orquídeas en Bolivia. Importancia y conservación 20418.4.1. Importancia biológica 20418.4.2. Importancia de la conservación de germoplasma 204

18.5. Procedimiento para el establecimiento y multiplicación in vitro de orquídeas(Góngora ileniana, Epidendrum ssp. y Huntleya meleagris) mediante protocormos 20518.5.1. Zona de recolección del material vegetal 20518.5.2. Método de secado y almacenamiento 20618.5.3. Fases para la multiplicación in vitro de orquídeas 206

18.6. Conclusiones y perspectivas 21218.7. Bibliografía 212

CAPÍTULO 19. ELEMENTOS PRÁCTICOS DE ESTADÍSTICA Y DISEÑO EXPERIMENTALPARA INVESTIGACIÓN EN CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES 215

Sergio Daniel Moreira Ascarrunz Ph.D.19.1. Introducción 21519.2. Prácticas asociadas a la investigación científica 215

19.2.1. Establecimiento de la hipótesis y de los objetivos experimentales 21519.2.2. Selección del diseño experimental 216

19.2.2.1 Tratamientos, factores y niveles 21619.2.2.2 Unidades Experimentales y unidades observacionales 21619.2.2.3. Diseños experimentales 217

19.3. Submuestreo 21919.4. Repetibilidad 219

19.4.1. Selección de datos y planificación del análisis estadístico 22019.4.2. Conducción del experimento 22119.4.3. Toma de datos 221

19.5. Análisis e interpretación de datos 22219.5.1. Análisis de datos continuos 22219.5.2. Análisis de datos de conteo 22319.5.3. Análisis de datos binomiales 22319.5.4. Análisis de experimentos con sub muestreo 224

19.6. Métodos de comparación de medias 22419.6.1. Error estándar de la media (EEM) 225

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19.6.2. Pruebas comparación múltiple y pruebas de rango múltiple 22519.6.3. Contrastes ortogonales 22719.6.4. Análisis de tendencias 227

19.7. Conclusiones 22819.8. Referencias 228

ANEXOS 229Anexo I 231Anexo II 236Anexo III 238

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Capítulo 1Aspectos Generalesdel Cultivo in vitro

Gino Aguirre, Margarita Calle & Jean Pierre Baudoin

1.1. INTRODUCCIÓN

Como toda técnica científica, el cultivo in vitrode explantes vegetales es el resultado de inno -vaciones, observaciones y experi men ta cio nesque han permitido acumular conoci mientoscada vez más profundos, constituyén dose enuna valiosa fuente de progreso (Seilleur,1989).

Ovando (2004) define al cultivo de tejidosvegetales como una herramienta de la bio tec -no logía vegetal que aisla partes de una plantay las hace crecer en un medio de cul ti vo arti -ficial in vitro en condiciones de asep sia paraobtener metabolitos, tejidos, órga nos o plan -tas completas. El mismo autor menciona queel concepto in vitro, presen te en casi todos losreportes de biotecnolo gía de plantas, es unaforma de indicar que las plantas o partes deplantas estudiadas fueron cultivadas dentrode un contenedor de vidrio (del latín in: aden -tro, vitro: vidrio), es decir, en un frasco de vi -drio, en una placa Petri, en un matrazErlenmeyer, etc. La utilización del términoayu da a entender que las plantas no fueronestudiadas en la naturaleza o en el campo,para lo cual se utiliza el término in situ (en elsitio).

Es así que los orígenes del cultivo de tejidos invitro, se remontan a principios del siglo XX,cuando Haberlandt percibe el concepto de

sustancias de crecimiento al intentar cul ti varcélulas aisladas de plantas, postulando así elprincipio de la totipotencia vegetal, que serefiere a la capacidad de una célula vegetal deformar una planta completa bajo ciertas con -di ciones químicas y físicas a par tir de cual -quier parte aislada de la planta, mis ma que esla base teórica sobre la que se sustentan todaslas técnicas de cultivo in vitro actuales.

White en 1934 logra el crecimiento continuode raíces de tomate en un medio rico en salesminerales y vitaminas del grupo B. Por otrolado, Gautheret en 1939 establece en cortesde zanahoria el primer cultivo a crecimientocontinuo.

En la década del 50 estuvieron disponibles losconocimientos sobre los reguladores de creci -miento y los medios de cultivo que hicieronposible el rápido desarrollo de estas herra -mien tas. Es así que Miller y sus colaborado -res, en 1955, separan la kinetina cuya fun -ción en la inducción de las divisiones celularesya era conocida.

Morel y Martin en 1952 inician el cultivo demeristemas, regenerando plantas libres devirus a partir de dalias virósicas.

Murashige y Skoog en los años 60 contribu -yen a popularizar las técnicas del cultivo invitro desarrollando métodos que han permi -

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tido la propagación de diversas especiesvegetales.

Carlson en 1972 inicia la fusión de proto plas -tos obteniendo el primer híbrido ínteres pecífi -co en el género Nicotiana.

Lepoivre y Quoirin, en 1977 difunden un me -dio de cultivo para el cultivo de Prunus.

Boxus en los años 80 impulsa la propaga ciónmasiva de frutilla con resultados muy halaga -dores en condiciones de campo, aspecto quefundamenta aún más el aporte de la propaga -ción masiva a la agricultura.

A partir de los avances alcanzados en la rege -neración de plantas in vitro se ha desa rro lladotoda una industria de micro propa ga ción quese inició en Europa y Estados Uni dos, y que seencuentra ampliamente exten dida en el restodel mundo, incluyendo países en desarrollo deAmérica Latina, Asia y África (Pérez, Jiménez& Agramonte, 1998).

En la actualidad, el uso de técnicas como elsistema de inmersión temporal desarrolladoen Francia y en Cuba y utilizado en diversospaíses, como en la UNALM en el Perú, hapermitido elevar las tasas de multiplicación demanera significativa, misma que se incremen -ta aún más si es suplementada con el uso dediferentes inhibidores de la síntesis de lasgiberelinas.

El cultivo in vitro es un método consideradoruti nario en la propagación vegetativa, el cualpermite la disponibilidad de un gran númerode plantas en tiempos relativa mente reduci -dos. Este proceso ha salido de la investigacióny permite trabajar apoyando el progresivodesarrollo del productor. Por este métodocualquier planta iniciada a partir de un tejidopuede ser cultivada, si se ha desarrollado lafórmula correcta y los procesos para su cultivo(Kyte, 1987).

Algunos autores definen al cultivo de tejidos invitro como una tecnología con facilidades de

producción y propagación de plantas úti les enla agricultura. Comprende un hetero géneogru po de técnicas mediante las cuales unexplante o parte separada de un vegetal (porejemplo: célula, tejido, órgano) se cultivaasépti camente en un medio de composiciónquímica definida y se incuba en condicionescontroladas, debido a que éstas tienen célulastotipotenciales.

Ashmore (1997), indica que los cultivos invitro ofrecen la oportunidad para la propaga -ción, almacenamiento y distribución degermo plasma sano. En Bolivia, Cadima et al.(1996), establecen las pautas para iniciar enel país la conservación a mediano plazo detubérculos andinos; poste riormente, Coca etal. (2004), Morales et al. (2004) y Vázquezet al. (2006) utilizan las técnicas in vitro parala recuperación de diferentes especies,incluyendo pasifloras y orquídeas, muchas deellas endémicas de Bolivia.

En la actualidad, las técnicas de cultivo invitro constituyen uno de los métodos biotec -noló gicos que han aportado al desarrollo deuna nueva agricultura, basándose en la yamencio nada totipotencialidad celular, seantejidos, ápices meristemáticos e inclusocélulas aisla das, genéticamente idénticas a laplanta ma dre en un periodo corto con elobjetivo de multiplicar, mejorar y conservar amediano y largo plazo diferentes especiescomo hortali zas, frutales, ornamentales yforestales de interés alimenticio, medicinal y/oeconómico para el ser humano.

Asimismo, su contribución como herra mien taen la conservación de germoplasma es inne -ga ble, al permitir conservar a mediano o largoplazo, y en espacios reducidos y exen tos depatógenos, un sinnúmero de entradas, pre -cau telando de esta manera los recursos fitoge -néticos, contribuyendo a la seguridad alimen -ta ria de las poblaciones y favoreciendo a larevalorización de especies nativas en riesgo depérdida definitiva (Iriarte et al., 1998).

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1.2. PRINCIPIOS BOTÁNICOS PARA ELCULTIVO IN VITRO

La multiplicación asexual o vegetativa ocu -rrién dose fue dando naturalmente o a travésde la intervención humana, y se ha ido espe -cializando en invernaderos y viveros. El proce -dimiento de propagación vegetativa en lamayo ría de los casos es a partir de cortes detallos, raíces y hojas (Kyte, 1987).

Los tallos, porción de las plantas vascularescon hojas y yemas, tienen el potencial para laregeneración de plantas. Hay tallos subterrá -neos, como el rizoma del lirio o los estolonesde fresa; el tubérculo de la papa y de otrostubérculos andinos como la oca, papalisa eisaño o cormos11 que sirven como estructurasen la reproducción vegetativa.

Las raíces son órganos de las plantas supe -riores, casi siempre subterráneas, que tienenfunciones de absorber, conducir agua, mine -rales disueltos, acumular nu trien tes y fijar laplanta firmemente en la tierra. También ellassirven como estruc tu ras reproductoras vegeta -ti vas, por ejemplo en manzano y rosa.

Las hojas son los principales órganos fotosin -téticos de la gran mayoría de plantas. Bajodeterminadas condiciones, pueden producirnuevas plantas a partir de cortes de las hojas,por ejemplo en begonia, tuna o violeta africa -na. En algunos casos, crecen de las hojasnue vas plantas sin estar separadas de laplanta materna.

La multiplicación in vitro de plantas no creanuevos procesos de crecimiento, simple mentedirige y ayuda al potencial natural de la plantapara regenerar y multiplicar de una maneramuy eficaz y predecible, en contraste con lapro pagación vegetativa convencional que re -quiere más espacio y más tiempo en la pro -duc ción de plantas. A continuación descri bi -mos algunos métodos de regeneración del cul -ti vo in vitro y las aplicaciones de las mismas.

1.3. MÉTODOS DE REGENERACIÓN INVITRO

Los métodos de regeneración in vitro son:

1.3.1. Cultivo de órganos

La organogénesis es un evento morfoge né ticoque se caracteriza por el desarrollo en laforma ción de un primordio unipolar a par tir deuna yema con el subsiguiente desarro llo deéste en un brote vegetativo, existien do siem -pre una conexión entre los nuevos brotes y eltejido paterno. Estos brotes vege tativos sonposteriormente enraizados. Los brotes puedenformarse a partir del explante o callo (Pérez,Jiménez y Agramonte, 1998).

1.3.2. Explantes primarios

Cualquier explante que contenga célulasnucleadas vivas se puede emplear potencial -mente para la obtención de callos (Roca &Mroginski, 1991). En estos frag mentos detejidos o de órganos proliferan las células deacuerdo al medio de cultivo utilizado.

1.3.3. Cultivo celular

Supone previamente una disgregación celular,ya sea por medios enzimáticos o mecánicos.La suspensión celular se puede cultivar en unmedio de cultivo adecuado. Este tipo decultivo permite su propagación, aumentandonotablemente la masa celular del cultivo a lolargo de las generaciones. Como característicanegativa se pierde la heterogeneidad celularde partida, la pobla ción se hace uniforme yhomogénea al pre dominar en el cultivoaquellos tipos celula res que tienen superiortasa de crecimiento. Este tipo de cultivo,aplicado al mejora mien to de plantas, permitesuperar incompatibili dades sexuales en lacruza p. e. entre S. acaule y S. andigenum alrealizar fusiones protoplásmicas, obteniendode esta manera híbridos interespecíficos.

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11 Tallos modificados.

1.4. VENTAJAS DEL CULTIVO IN VITRO

En comparación con los sistemas convencio -na les, la mayoría de los autores coinciden enque el cultivo in vitro presenta las siguientesventajas:

• Posibilidad de producción masiva de plan - tas homogéneas en una superficie reducidaa bajos costos y tiempos reducidos.

• Ahorro de espacio con respecto a los siste -mas tradicionales.

• Mejor control sobre la sanidad del mate rialvegetal que propaga.

• Facilidad para transportar el material invitro de un país a otro.

• Posibilidad de multiplicar rápidamente unavariedad de la cual sólo existen pocosindividuos.

• Propagación de plantas recalcitrantes a lastécnicas convencionales.

• Posibilidad de conservar germoplasma amediano y largo plazo.

1.5. LIMITACIONES DEL CULTIVO INVITRO

• Estabilidad genética débil en algunossistemas de propagación in vitro.

• Aclimatación de las plántulas, como unproceso difícil con mayores probabilida desde pérdidas en esta etapa.

• Poca respuesta inicial de algunas especiesy genotipos.

• Alto costo de establecimiento de un labo -ratorio, lo que incide indirectamente en elprecio final de la planta producida.

• Alto costo de los reactivos, aspecto queinfluye incluso en el desarrollo de lainvestigación en esta área.

• Necesidad de mano de obra especializada.

• Alta dependencia de energía eléctrica.

1.6. APLICACIONES DEL CULTIVO DETEJIDOS

Pierik (1987) y Roca & Mroginski (1991),mencionan que los objetivos perseguidos porel cultivo de tejidos vegetales son numerososy brevemente describen las posibilidades deaplicación de tales objetivos de la siguientemanera:

• Estudios teóricos sobre fisiología y bioquí -mica vegetal.

• Propagación masiva de plantas utilizan dolas técnicas de germinación de semi llas,cultivo de ápices, cultivo de nudos einducción de brotes, microinjertación.

• Establecimiento y/o mantenimiento deplantas libres de virus y patógenos me -diante la utilización del cultivo de meris -temas, como componente inicial de cual -quier programa nacional de certifica ción desemilla.

• Conservación de germoplasma, para locual se utilizan las técnicas de: microtu be -rización, crioconservación y creci mien tomínimo.

• Mejoramiento genético mediante la apli -cación individual o conjunta de técnicasde: cultivo de embriones, cultivo de ante -ras, variación somaclonal, cultivo de ca -llos, cultivo de suspensiones celulares,fusión de protoplastos y como herra mientaen la ingeniería genética (trans for macioneso transferencia de genes).

Fruto de la experiencia boliviana “en terre no”,una de las más interesantes aplica cio nes delcultivo de tejidos en el componente de laconservación y uso de los recursos fitogenéti -cos es su contribución a la revalorización y/orecuperación de especies nativas, dado quepermite inicialmente una multiplicaciónmasiva y favorece a la redistribución de estasespecies con el aditamento de ser materialessanos y de identidad genética conocida.

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2.1. INTRODUCCIÓN

La decisión de establecer un laboratorio decultivo de tejidos debe responder a los pro -pósitos del mismo, ya sea de enseñanza, deinvestigación o de producción; requiere ade -más de un análisis crítico previo acerca de lasnecesidades, objetivos, proyecciones, recur -sos humanos y capacidades financie ras, den -tro de un contexto integral enfocado hacia eldesarrollo de la investigación como base parala producción agrícola. Las limitadas capaci -da des financieras de nuestros centros deinves tigación deben ser optimizadas adecua -da mente, sin necesidad de construir comple -jos laboratorios muy ambiciosos cuyo uso esmínimo, ni tampoco estableciendo laborato -rios exageradamente simples sin proyecciónalguna.

2.2. LOCALIZACIÓN DE UNLABORATORIO DE CULTIVO DETEJIDOS

La ubicación de un laboratorio debe reali zarseen lo posible lejos de potenciales fuentes decontaminación, como es el caso de zonascontaminadas tanto en agua como en aire,lejos de granjas, porquerizas o establos o dezonas de reciclaje de residuos. Se debe tomaren cuenta variadas medidas de asepsia si lainstalación se ubica cerca de laboratorios de

patología (entomología, bacteriología, virolo -gía), ahí normalmente se trabaja con mues -tras enfermas para prevenir posibles fuentesde contaminación.

Si el laboratorio es nuevo, para la localiza cióndebe tomarse en cuenta la topografía delterre no, la facilidad de acceso, la infra estruc -tura circundante, las zonas suscepti bles ainundaciones y la posibilidad de ampliar áreascomplementarias al labora torio como el áreade aclimatación y de invernaderos.

En la repartición de las áreas de un labo ratorioes importante separar el área admi nis trativadel área de laboratorios. En relación a losservi cios de agua, teléfono, energía eléctrica,gas, acceso a Internet, servicios de correo yotros, es imprescin dible contar con los mis -mos. En pleno siglo XXI, cuando es posiblecontar con plantas in vitro provenientes deEuropa, Africa o Asia en menos de 60 horas,el establecer un laboratorio en zonas alejadas,con abaste cimiento irregular de energíaeléctrica, con clima excesivamente húmedo ycaluroso, no es del todo justificado al signi -ficar un mayor costo en su mantenimiento yun mayor riesgo a contaminaciones bacteria -nas y fúngicas.

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Capítulo 2Establecimiento de un laboratorio de

cultivo de tejidos

Gino Aguirre & Margarita Calle

2.3. ORGANIZACIÓN DE UNLABORATORIO

Varios autores, Biondi & Thorpe (1981),Merino (1987), Pierik (1987), Boccon(1989) y Roca & Mroginsky (1991),mencionan la organización de un laboratoriode acuerdo a la secuencia de las fases delcultivo in vitro y a la facilidad en el manejo delos cultivos en cuestión a la asepsia. A conti -nuación se hace la descripción de las áreasmás importantes de un laboratorio:

2.3.1. Antesala o vestíbulo

Parte principal de entrada a un laboratoriodonde se encuentran percheros y gabine tespara guardar ropa de calle. En esta área elpersonal debe cambiar su ropa de calle porguardapolvos y zapatos de uso exclusi vo enlaboratorio. En laboratorios de ense ñanza esimportante que esta área cuente con ca sillerosindividuales para que los estudian tes guardensu ropa de laboratorio y uten silios más impor -tantes como pinzas, escal pelos, marcadores,cuadernos de notas y otros. En laboratorios demayor magnitud esta área consiste en todauna infraestruc tura que contempla duchas yáreas de aseo para el personal.

2.3.2. Área de oficina

Contempla el equipo y mobiliario de oficinacomo teléfono, fax, computadoras, fotoco pia -dora y escritorios, archivos y almacena mientode datos, libros de referencia, catá lo gos yotros documentos. En esta área es conve nien -te incluir una biblioteca espe ciali zada,ambien tes para los estudiantes o inves -tigadores y en lo posible contar con una saladestinada a reuniones.

2.3.3. Área de lavado y esterilización

Puede estar constituida por dos áreasconectadas entre si, o por un sólo ambiente.En esta área se lleva a cabo el lavado de todo

el equipo de vidrio y el acondiciona mien to delmaterial vegetal previo al establecimiento invitro. El área de lavado requiere poseer unainstalación eléctrica de 220V con varias to -mas; el equipo con corriente a 110V, debido asu voltaje dife rente debe ser visiblementeidentificado.

El lavadero debe ser lo necesariamente gran -de; con agua caliente y fría y con sus respecti -vos escurrideros; requiere contar con unafuen te de agua destilada para el enjuaguecorrespondiente del material lava do. Para ga -rantizar la provisión constante de agua de altacalidad, es imprescindible tener un destilador,en lo posible con con den sador de vidrio y undesionizador de agua colocado entre eldestilador y el lavadero.

Esta área debe disponer de gabinetes para elmaterial de vidrio; de preferencia con puertas,para evitar que se llenen de polvo y un espa -cio para almacenar agua destilada en botellasde plástico; también debe contar con recipien -tes para residuos adecuados para el materialorgánico, inorgánico, de plástico y de vidrioque se deseche.

En el área de esterilización se ubica la auto -cla ve para esterilizar tanto el medio de cultivocomo el material y los tubos y frascos conmaterial contaminado. Además debe incluirun espacio para las estufas u otro equipo deesterilización con calor seco.

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Área de lavado. Laboratorio de Biotecnología, FCAPFyV.

2.3.4. Área de preparación de medios

Esta área se utiliza principalmente para pre -pa rar los diversos medios de cultivo que seránutilizados en las diferentes fases de desarrollode los cultivos. Esta área debe contar conrecipientes con agua destilada y desionizada ydebe tener varias tomas de electricidad parael equipo existente (balan zas, pHmetro,refrigeradores, agitadores, horno microondasy otros).

El equipamiento mínimo consta de: el área depreparación de medios, que debe contar conmesas de trabajo separadas, adecua das parala preparación, ubicar las balanzas analítica yde precisión, para el medidor de pH, los platoscon agitación, y otros ele mentos. También de -be incluir vitrinas, es tan terías y espacio paralos refrigeradores y el horno microondas. Ade -más debe tener estantes destinados para al -macenar mate riales de vidrio o de plástico ypa ra alma cenar los reactivos químicos quepue dan ser conservados a temperaturaambiente.

2.3.5. Área de repicaje o siembra

En esta área del laboratorio se realiza eltrabajo de introducción o establecimiento acondiciones in vitro, escisión o aislamiento,inoculación y transferencia de los explantes a

los medios de cultivo. Esta área debe estar losuficientemente aislada para evitar fuentes decontaminación externas, debe contar convarias tomas de electricidad (220V) para elequipo existente.

El equipamiento mínimo consta de: cáma rasde flujo laminar horizontal o vertical de airefiltrado bajo presión, estereoscopios pa ra laescisión de meristemas, equipos para el filtra -do de medios de cultivo, gabinetes para guar -dar desinfectantes, alcohol, medios de cultivoe instrumentos estériles. El personal debetrabajar en este ambiente aséptico con muchapulcritud, utilizando barbijos y gorras (Roca &Mroginski, 1991). Asimismo, el sistema deapertura de puertas, debe contar con gomassellantes para evitar corrientes de aire.

Los principios de trabajo de una cabina deflujo laminar, son bastante simples: unextractor de aire atrae el aire de la habitacióna la unidad, a través de un filtro que eliminalas partículas en suspensión más grandes; elaire pasa a través de una cámara de presión,en la que acumula suficiente presión para quesea expedido a la velocidad deseada. Ese airepasa a tra vés de un filtro HEPA, que no permi -te pasar partículas mayores a 0,2 micras y

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Área de preparación de medios. Laboratorio deBiotecnología, FCAPFyV.

Área de siembra. Laboratorio de Biotecnología, FCAPFyV.

propor ciona corrientes paralelas constantes enla zona de trabajo, (FUDESA12, 1999), brin -dan do de esa manera un área libre de po ten -ciales contaminantes. La cámara, puede dis -po ner de elementos accesorios como: fuentede luz, lámpara de esterilización U.V., conta -dor de horas de funcionamiento, indicador depresión interior y otros.

Su función es la de mantener un área libre departículas, especialmente de posibles conta -minantes como bacterias, levaduras y hongosque puedan acceder al cultivo. Las cabinas deflujo laminar deben ubicarse en un lugar ale -jado de puertas y con un mínimo de corrientede aire con el fin de prolongar la vida útil delos filtros y de garantizar una mínima conta -minación en el trabajo.

Los estantes en la cámara de crecimiento pue -den ser de dimensiones variables, ancho entre0,30 m y no mayores a 1,00 m; largo deacuer do a las dimensiones del ambiente, conuna altura total de 1,80 a 2,20 m; la dis tan -cia entre estantes es de 0,20 a 0,50 m deacuerdo a la ubicación de las fuentes de luz.

2.3.6. Área de crecimiento

El área de crecimiento o incubación de losexplantes in vitro debe contar con un buencontrol de temperatura de acuerdo al tipo deplantas, sean éstas de clima templado o tropi -cal, de iluminación variable según las necesi -da des y con un fotoperíodo contro lado. Estascondiciones se logran incorpo rando sistemasde aire acondicionado en las cámaras decrecimiento, una buena y uniforme circulaciónde aire en el interior, dotados de un buensistema de alarma para interrumpir la ilumi -na ción en caso de no funcionar el aireacondicionado (Mroginski et al., 2004).

La colocación de los estantes obedece abrindar las mejores condiciones de lumi no -sidad a las plantas, con dimensiones y altu ra

fáciles de manejar y de variar. Es posible cons -truir los estantes con base de vidrio o de rejillametálica para facilitar el paso de luz. Cuandose usa tubos fluorescentes, éstos emiten calor,tanto que el cuarto de cultivo necesita serenfriado. El control de la temperatura se logracon la ayuda del ter mostato conectado al aireacondicionado (Pierik, 1987). El suministrode energía de cada estante debe estar indivi -dualizado, de manera que sea posible inte -rrum pir el su ministro de luz en estantes libreso vacíos. Es importante ubicar las reactanciasde los tubos fluorescentes fuera del área decreci miento para no sobrecargar el sistema deaire acondicionado en el mismo ambiente.

La intensidad luminosa en las salas de creci -miento habitualmente varia de 5 a 25 W/m2

(1.000 a 5.000 lux) a veces se puede incre -mentar la intensidad luminosa en la fase IIIpara ayudar a fortificar y preparar a la plantapara transferir al suelo; el foto pe río do gene -ralmente es de 16 h/luz. La calidad de lailumi nación es dada por tubos fluorescentesblanco brillante o Gro lux generalmente. Latemperatura en las salas de crecimiento esconstante de 22-25°C en muchas especies.Sin embargo, existe variación en especies declima templado de 20±1°C y en especiestropicales de 28±1ºC (Boccon, 1989).

El control de la temperatura para que sedesarrolle el cultivo in vitro se efectúa me -

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12FUDESA: Fundación para el desarrollo de la Esteriliza -ción en la Argentina. www.drwebsa.com.ar/fudesa

Área de crecimiento. Laboratorio de Biotecnología,FCAPFyV.

diante un sistema de refrigeración-calefac cióncontrolado a través de un termostato. Lahomogeneidad de la temperatura se pue delograr haciendo circular el aire dentro de lacámara mediante un sistema de ventilación(Pelacho & Closas, 2004). En cualquier caso,es necesario tomar precau ciones para evitar elcalentamiento excesi vo, instalando alarmas ycontroles para cor tar la iluminación cuandofalle el aire acondi cio nado. Esta área debeincluir, además, un espacio para cultivos enagitación (células en suspensión) y para culti -vos estáticos que requieren previo tratamientoen oscuridad.

2.3.7. Áreas de observación y examen

Las áreas de observación están conside ra dasen función a la actividad que se realiza en ellaboratorio (Roca & Mroginski, 1991). Gene -ral mente los microscopios, estereos copios,compuesto, invertido y otros, se loca lizan tan -to en el área de crecimiento como en el desiem bra, pero pueden estar en áreas separa -das. El objetivo de esta área es realizar obser -vaciones periódicas de los cultivos, tanto enmedios semisólidos como en líquidos.

2.3.8. Área destinada a la cámara determoterapia

Esta área es imprescindible en un laborato rioque utiliza técnicas para la obtención deplantas libres de virus; debe estar ubicadacerca al área de siembra y, en lo posible, debeestar destinada exclusivamente para plantasya establecidas in vitro, debido a que el ma -ne jo de plantas en maceta, en este tipo de cá -ma ras, demanda un mayor espacio y un ma -yor equipamiento. Dada la necesidad de lasplantas en maceta de requerir una alta hume -dad relativa para poder soportar temperaturasde 36ºC, es imprescindible incorporar en estecaso de un medidor de humedad conectado aun humidistato, que permita regular la hume -dad ambiente a un mínimo del 80%.

2.3.9. Áreas de cuarentena y controlfitosanitario

Cuando la función del laboratorio es la pro -ducción de materiales élite de sanidad certifi -cada, se hace necesario contar con un áreapara la recepción de las muestras o plan tasdestinadas a la limpieza clonal, generalmenteprotegida contra insectos. Es ta área decuaren tena debe estar separada del resto dellaboratorio pero cercana al área de controlfitosanitario.

2.3.10. Áreas frías

Son áreas destinadas al almacenamiento delos medios de cultivo que va gene ralmente de4°C a -20°C. En laboratorios pequeñospueden ser reemplazadas por refrigeradores ycongeladores ubicados en el área de siembra.

2.3.11. Almacén

Esta área debe comprender un cuarto sufi -cientemente grande para el almacena mientode productos químicos, cristalería y otros artí -culos de repuesto en una cantidad suficientepara prevenir cualquier retraso en las entregasdel suministro. Los reactivos deben estar al -ma cenados ya sea a tempe ratura ambiente oentre 4°C de acuerdo a los requerimientos decada caso, mismos que están indicados en suetiqueta (Jona & Menine, 1987 y Boccon,1989).

2.3.12.Invernaderos y áreas deaclimatación

Son muy importantes las condiciones de losinvernaderos a los cuales se van a transferirlas plantas provenientes del laboratorio, puessi no existen las mínimas facilidades paraaclimatar las plántulas, además de un buenmanejo, éstas se pueden recontami nar, sufrirpérdidas por deshidratación, o daños por in -sec tos, roedores y otros. Lo adecuado e indis -pensable es contar con un ambiente de ingre -

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so previo al invernadero, un control de hume -dad adecuado, pisos de concreto, la estruc -tura con mallas anti áfidos, sistema de nebuli -za ción, áreas de almacenamiento para losimplementos del invernadero, mezclas desustratos desinfes tados, sistema de desinfes -tación de sustra tos.

2.4. EQUIPOS Y MATERIALES

En el cuadro 1 se presentan los equipos ymateriales necesarios según Pierik (1987),Merino (1987), Roca & Mroginski (1991), deacuerdo a las áreas y en base a la expe rienciaen los laboratorios locales:

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Cuadro 1. Áreas, equipos y materiales de laboratorio

2.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD DELPERSONAL

Una de las primeras medidas de seguridadpara el personal es el de facilitarles el desem -peño en el laboratorio mediante una adecuadaseñalización en cada una de sus áreas,incorporando en lugares visibles explicacionessobre el funcionamiento de los diferentesequipos de manera que el personal nuevo nointente “descubrir” el manejo de éstos. Estasseñalizaciones, incluyendo las normas míni -mas de desempeño en laboratorio, son tam -bién un valioso instrumento de orientación yguía para visitantes o estudiantes debutantesen laboratorio.

Asimismo, la seguridad física del personal dellaboratorio es sumamente importante; poresta razón se deben tomar todas las precau -cio nes necesarias para ubicar estratégica men -te en el laboratorio equipos de primeros auxi -lios, extintores de incendios y frazadas contrafuego, así como duchas para baños del cuerpoentero y de los ojos (Roca & Mroginski,1991).

Es recomendable establecer reuniones infor -ma tivas al inicio de cada gestión, en donde seanalicen y socialicen las medidas deseguridad en caso de riesgo.

2.6. BIBLIOGRAFÍABiondi S. & Thorpe T.A. 1981. Requirements for a

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Capítulo 3Normas de Seguridad en Laboratorios

de Cultivo de Tejidos

Margarita Calle & Gino Aguirre

3.1. INTRODUCCIÓN

Los laboratorios (Funes et al., 2005) sonáreas físicas, expuestas a riesgos poten ciales,que hacen necesario el cumplimiento de nor -mas para ofrecer seguridad a su personal. Elno contar con mínimas normas de seguridadpuede ocasionar el deterioro de equipo einstrumental y, lo que es peor, puede poner enriesgo la salud o vida misma del operador.

El término accidente es todo acontecimientono programado, extraño al desenvolvi mientonor mal del trabajo del cual podrá resultar al -gún daño físico o económico (Ferreira da Cos -ta, 1996). Un acto inseguro es aquel que resi -de exclusivamente en el factor humano, debi -do a la ejecución de una tarea realizada demanera contraria a las normas de seguri dad,como ejemplo, el no utilizar Equipo de Protec -ción Individual (EPI) que es de uso obligatorio.

Es así que la seguridad en laboratorio depen -de de la protección cotidiana, uso eficiente demateriales, equipos y atención cuidadosa alos procedimientos y reglas al tratar con situa -ciones que son potencial men te arriesgadas.En todo caso, es esencial que el personal estéalerta a lo que sucede a su alrededor (Jona &Menine, 1987 & Argote, 1998).

A continuación se describen las buenas prác -ticas en cada área del laboratorio tomando en

cuenta aspectos concernientes a la limpieza,seguridad del personal, manejo de equipos yalmacenamiento de reactivos químicos.

3.2. ÁREAS DEL LABORATORIO

3.2.1. Área del vestíbulo

En esta área se advierten los siguientesaspectos:

• Uso de guardapolvo tanto para el personalcomo para visitantes.

• Uso de zapatones protectores.

• No es recomendable el uso de prendas delaboratorio en otros ambientes como: bi -blio tecas, comedores, salas de reunión, ofi -ci nas administrativas y otras áreascomunes.

• La ropa protectora no debe ser guardadaen los mismos casilleros que la ropa decalle.

• Se recomienda llevar zapatos cerrados y nosandalias.

3.2.2. Área de lavado y esterilización

El área de lavado o esterilización está rela cio -nada con todos los aspectos concernien tes ala asepsia como:

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a) Limpieza personal

• Quitarse anillos, relojes y otros articu losde las manos.

• Lavarse las manos y antebrazo con aguay jabón antes de empezar y luego determinar cualquier trabajo dentro ellaboratorio.

• Usar toallas de papel para el secado y notoallas de paño, pues éstas, al igual quelas jaboneras, crían bacterias(Pseudomonas spp.).

b) Limpieza de áreas de laboratorio

• La limpieza física se realiza por víahúme da mediante el uso de paños. No esrecomendable usar vapor ni aerosoles.

• Para desinfectar las áreas del labora to riose puede usar productos desinfec tan tescomo formaldehído al 2% de 15 a 30min, hipoclorito de sodio o calcio al 1%de 3-20 min.

• Los mesones deben ser lavados y desin -fectados antes de iniciar la rutina detrabajo.

• La limpieza debe ser realizada siemprecon guantes de goma.

• No dejar objetos esparcidos por el sueloy evitar que se derramen líquidos por lasmesas de trabajo y el piso.

• Los contenedores y herramientas delimpieza deben tener un lugar espe cífico.

c) Limpieza de materiales de laboratorio

• Siempre debe comenzarse por el materialno contaminado.

• El material debe ser lavado con agua ja -bo nosa, enjuagado con abundante aguacorriente, y luego lavado con agua desti -la da antes de secar por escurri miento.

• Los recipientes con cultivos contamina -dos, deben ser esterilizados en auto -clave.

3.2.3. Señalización

La señalización es uno de los aspectos másim portantes. Como medida educacionalaumen ta la percepción del riesgo a la queestán expuestos los profesionales, inclu yendolas etiquetas de productos riesgosos (Cama -cho, 1997). Todas las áreas de labo ratorio de -ben estar señalizadas para facilitar la orien -tación de los usuarios y advertir acerca de losriesgos existentes. Es impor tante asimismocolocar en lugares visibles el croquis del labo -ra torio, mostrando clara mente las salidas deemergencia.

Los colores pueden ser utilizados como fac to -res de seguridad (Matos, 1992), el color daun confort visual para la identificación, y es uncomplemento de medidas de higiene, adver -ten cia de riesgos, delimita áreas, equipos einstalaciones (Cuadro 1).

Considerando los riesgos más frecuentes en ellaboratorio, los símbolos pictográficos o seña -les mas utilizadas en general sirven para re -pre sentar: riesgos biológicos, ries gos quími -cos, protección de sustancias químicas o mi -cro organismos peligrosos, prevención o prohi -bición, los cuales son esenciales para la segu -ridad del personal (Figura 1).

3.2.4. Espacio y seguridad en losambientes

Según la Universidad Politécnica de Valen -cia13 (2004), las dimensiones y condicionesambientales de los espacios de trabajo debenpermitir al personal realizar sus actividadessin riesgos para su seguridad, salud y en con -di ciones ergonómicas aceptables. Las dimen -siones que deben reunir tales espacios son:altura hasta el techo 3 m y superficie portrabajador 2 m2.

La iluminación dentro del laboratorio debe sercercana a los 300 lux/m2 y el área de trabajoespecífico de 500 lux/m2. En labora torios

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13 UPV: Universidad Politécnica de Valencia.

Cuadro 1. Seguridad en base a colores para el uso en laboratorio

Figura 1. Símbolos pictográficos de riesgo, de protección yde prohibición más utilizados en laboratorio

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básicos con un nivel de seguridad 1, utiliza -dos en enseñanza, se recomienda el 20% deaire externo, el mismo que debe ser filtradoantes de ingresar. La ventilación tiene relacióndirecta con la temperatura y humedad relativadel ambiente (Rodriguez, 1999).

3.2.5. Área de preparación de medios decultivo

Para la seguridad del personal se debeconsiderar lo siguiente:

• Leer atentamente los pasos para lapreparación de la solución.

• Prever todo antes de comenzar. Preparar lavidriería, reactivos, agua destilada, equi -pos. Verificar si se requieren equipos omate riales especiales, ejemplo:microscopio invertido.

• Conocer todo respecto a los reactivos quese van utilizar. Su grado de toxicidad ycómo proceder en caso de intoxicación.

• Transportar los frascos con cuidado. Nuncaintentar abrir puertas apretando los frascoscontra el cuerpo.

• Cuando sea necesario, utilizar guantes degoma y protector facial con filtro químico.

• Limpiar todos los frascos externamenteantes de abrirlos para proceder al pesado omedida del volumen necesarios.

• Los reactivos sólidos o en polvo nuncadeben pesarse sobre papel estañadoaunque se este trabajando con protector yguantes.

• Los reactivos sólidos deben ser manipula -dos con una espátula, tratando de extraerdel recipiente sólo la cantidad requerida.

Una vez extraído el reactivo, debe taparseel frasco inmediatamente.

• No mezclar sustancias para ver quesucede, puede ocasionar un accidente.

• Los frascos que contienen líquidos, de be -rán ser manejados con mucha cautela paraque la sustancia no se escurra por las pare -des externas y dañe el rótulo. Si esto ocu -rriera, es necesario que éste sea reempla -zado por otro que contenga la mis ma infor -mación que el original. Un frasco jamáspuede quedarse sin identificación.

• Después de su utilización, retornar el fras -co a su lugar, limpio y bien cerrado.

• Cuando se utilicen guantes de protecciónno realizar otras actividades que pongan enriesgo la salud de los demás.

• Tener mucho cuidado con la vidriería. Lama yoría de químicos generan calor. Tenercuidado al manejar grandes volúmenes desoluciones principalmente si estuvieran ca -lientes. Aguardar a que la temperatura seestabilice.

• El vidrio caliente debe dejarse encima deuna plancha aislante hasta que se enfríe,caso contrario se causará la rotura delmismo debido al choque térmico.

• Todas las soluciones preparadas deben serrotuladas debidamente, indicando elnombre del producto, la concentración, lafecha y el nombre del operador.

• No pipetear nunca con la boca líquidos co -rro sivos o venenosos. Los reactivos líqui -dos se manipulan con pipetas adaptadas auna perilla o bomba de succión.

• No dejar nunca soluciones en el agitadordurante la noche.

• Colocar los aparatos y reactivos lejos delborde de la mesa.

• Mantener el orden. Acomodar todo en sulugar y dejar los mesones y el piso limpios.

• No utilizar los frascos vacíos de reactivospara guardar otros productos.

3.2.6. Área de cámara de flujo laminar

La asepsia es de mucha importancia en estaárea para lograr resultados adecuados en loscultivos.

3.2.7. Reglas de manejo en el área decámara de flujo laminar

Para los procedimientos correctos en lamanipulación de la cámara de flujo laminar esimprescindible que el usuario conozca lassiguientes reglas:

• Usar barbijos, gorros protectores yanteojos de seguridad.

• La cámara de flujo laminar debe encen der -se 15 minutos antes de empezar el trabajo.

• No abrir ni cerrar puertas en el mismoambiente.

• Desinfectar las manos con alcohol al 70%.

• Limpiar con alcohol al 70% el frontis y lamesa de la cámara de flujo laminar.

• Las herramientas deben colocarse de talforma que los brazos no se crucen sobre elárea de trabajo cuando sea necesariousarlas.

• No usar llama muy alta ni muy cerca de lapared donde se ubica el filtro.

• Los instrumentos de trabajo (pinzas,escalpelos) deben ser flameados en alcoholal 95% antes y después de cada uso.

• Limpiar con etanol al 70% la superficieexterna del material a introducir.

• Flamear la boca de los recipientes que con -tie nen los medios de cultivo antes y des -pués de cultivar el explante y antes decerrarlos.

• Los materiales deben reducirse al míni moindispensable dentro la cámara.

• En el caso de que se averíe un equipo, in -for mar inmediatamente al supervisor, evi -tan do utilizarlo hasta su completareparación.

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• Después de concluir el trabajo en el interiorde la cámara, el ventilador de la mismadebe permanecer en funciona miento por lomenos durante 5 minutos.

• Al terminar el trabajo se debe limpiar todael área.

• Limpiar mensualmente todas las super -ficies exteriores con un paño húmedo, a finde eliminar el polvo acumulado y realizarpruebas de calidad del filtro.

• Se recomienda limpiar y/o cambiar de prefiltro cada seis meses.

3.3. ALMACÉN

El laboratorio debe disponer de salas o áreascon espacio suficiente para el almacena mien -to de los suministros y los equipos (OBA,1997).

3.3.1. Almacenamiento de los reactivos osustancias químicas

Las sustancias químicas son particular men tepeligrosas y deben manejarse con el cui dadoespecial y según los procedimientos reco men -dados (Jona & Menine, 1987). Para alma -cenar sustancias químicas, según Fe rreira daCosta (1996) se debe considerar:

• Incompatibilidad entre materialesalmacenados (Cuadro 2).

• Sistemas de ventilación.

• Señalización correcta.

• Disponibilidad de Equipo de ProtecciónIndividual o Común- EPI ó EPC.

• El área administrativa debe estar separadadel área técnica del almacén.

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Cuadro 2. Incompatibilidad de algunas sustancias químicas

3.3.2. Incompatibilidad de sustancias parael almacenamiento

En la siguiente tabla se observa algunosejemplos de reactivos químicos incompati blesen el almacenamiento.

Cárdenas & Mondeja (2004) indican que en elalmacenamiento no se deben colocar juntos:

• Explosivos con: ácidos fuertes, oxidantesfuer tes, bases fuertes, aminas, materialcombustible.

• Oxidantes con derivados halogenados,com puestos halogenados, reductores,inflamables, ácidos fuertes, metales.

• Ácidos con: oxidantes, bases fuertes,metales.

• Bases y sales básicas con: ácidos, deriva -dos halogenados, metales.

• Metales activos con: agua, ácidos, deriva -dos halogenados.

3.3.3. Reglas de almacenamiento

Leer siempre la advertencia escrita en laetiqueta y continuar de acuerdo con elsiguiente procedimiento:

a) Los reactivos no deben ser almacenados enorden alfabético debido a las posiblesincompatibilidades.

b) Las sustancias más peligrosas no debenser guardadas en la parte superior de losanaqueles.

c) Todo reactivo debe llevar su etiquetacorrespondiente de identificación paraevitar confusiones y accidentes.

d) Verificar periódicamente la caducidad delos reactivos, tiempo de uso y validez.

e) Las soluciones de peróxidos deben seraisladas de material orgánico y almacena -das a bajas temperaturas, en áreas frescascon ventilación y en frascos de polietilenocon tapa rosca, jamás en frascos de vidrio.Los frascos deben ser debidamenteidentificados.

f) El almacén de productos inflamables debetener ventilación adecuada y sistemas decontrol de incendios, con avisos de adver -tencia de no fumar y acceso restringido. Enel interior de los ambientes de trabajo,estos productos deben estar en mínimascantidades, en armarios específicos o enrefrigeradores debidamente protegidos. Losmateriales inflamables no deben serguardados en heladeras, ya que unacentella eléctrica proveniente de unalámpara puede generar explosión.

g) Almacenar los cilindros de gases colocandoen locales externos, amplios, cubiertos,naturalmente ventilados y debidamenteprotegidos; deben ser observadas lasincompatibilidades químicas entre losdiversos tipos de gas.

h) Los recipientes de productos corrosivosdeben ser cuidadosamente manipulados,conservados, fechados y etiquetados.Frascos grandes de muchas sustancias,principalmente de ácidos y álcalis, debenser guardados al nivel del piso en bandejascon orificios para posibles drenajes.Algunos grupos funcionales son explosivospotenciales en el laboratorio: amida,nitrato perclorato, peróxido.

3.3.4. Descripción y manipulación dereactivos

El personal de laboratorio (Funes et al., 2005)utiliza sustancias químicas, ya sea comoreactivos o como productos de desinfección.Las sustancias químicas o reactivos sonpotencialmente peligrosos y pueden ser muyvariados y complejos, con propiedades tóxi -cas, corrosivas, inflamables o explosivas,necesitando de un manejo especial sin el cualel riesgo para el personal que las manipula eselevado. La clasificación de las sustanciasquímicas es variable, la más conocida es deacuerdo al riesgo, clasificada por la NationalFire Protection Association14. En síntesis se

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14 NPFA: National Fire Protection Association.www.nfpa.org

describen los siguientes grupos de sustanciasquímicas, explosivas, inflamables, corrosivasy gases comprimidos, mencionados porFerreira da Costa (1996):

a) Sustancias explosivas. Son agentesquímicos que por la acción de un choque,per cu sión, fricción producen centellas ocalor suficiente para iniciar un procesodestruc tivo a través de violenta liberaciónde ener gía, por lo que es importante evitarfuentes de calor cercanas. Dentro de estegrupo se encuentran los peróxidos que soncom pues tos químicos extremadamenteinesta bles. En general estas sustancias sonirri tantes para el aparato respiratorio, piel yojos.

El uso de estas sustancias debe serlimitado a cantidades mínimas necesarias.Cualquier salpicadura debe ser inmedia ta -mente limpiada. Es recomendable manipu -lar peróxidos con espátulas de madera ocerámica, no así de metal.

b) Sustancias inflamables. Son substanciasque envuelven solventes orgánicos infla -ma bles. Algunos son extremadamente peli -grosos por presentar una alta presión devapor a temperatura ambiente.

Según la NFPA citado por Ferreira da Costa(1996) son considerados líquidos inflama -bles los que en condiciones normales detemperatura y presión tienen punto defulgor debajo de 93° C. Dentro de estegrupo se encuentran el benceno, estireno,metanol, tolueno, xileno, acetona, etanoly éter etílico.

Con estas sustancias se debe trabajar conlas debidas medidas de seguridad, dondela utilización de máscaras es imprescin di -ble. Asimismo, éstas deben ser manipula -das en locales ventilados y lejos de lasfuentes de calor.

c) Sustancias corrosivas. Son agentes quími -cos que desintegran tejidos vivos o mate -

riales inertes. Entre las sustanciascorrosivas están incluidos los ácidos,anhídridos, y álcalis. Estos compuestosgeneralmente destruyen sus recipientes ycontaminan la atmósfera del área dealmacenamiento. Algu nos son volátiles,otros reaccionan con sulfitos, sulfatos,cianatos y otros, liberan do otrassustancias tóxicas. Algunos ejem plos deestos productos son el ácido clorhí dri co,ácido fosfórico, ácido nítrico, ácidopícrico, ácido sulfúrico, hidróxido de sodioy potasio.

Tanto los ácidos como los álcalis causanserias quemaduras y daños en los ojos.Por tanto debe usarse protección comolentes, guantes y delantales cuando semanipula estos productos en ellaboratorio o en almacén. El piso de estoslocales debe ser conservado lo más secoposible.

Cuando se diluyen ácidos con agua, losácidos deben ser adicionados lentamenteal agua, agitando continuamente lamezcla y nunca debe procederse a lainversa. Un derrame de líquidoscorrosivos no debe ser absorbido pormedio de material orgánico como aserríno pedazos de tela; debe neutralizarse conalgún absorbente granulado como laarena.

d) Gases comprimidos. El manejo de gases apresión requiere mucho cuidado, puescual quier defecto en el equipamientopuede provocar una difusión de éstos enel ambiente. Un gas difundido puedetener efecto anestésico, asfixiante, tóxicoo for mar mezclas extremadamenteexplosivas con el aire. Una gran mayoríade los gases son inodoros e incoloros,dificultando así su identificación. Por elloes recomenda ble:

• Procurar informarse sobre las caracte -rísticas del gas en uso tales comoriesgo de explosión y toxicidad.

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• Jamás utilizar grasas, óleos oglicerinas en cilindros que contengangases oxidantes, debido al riesgo deexplosión (Ej.: Oxígeno).

• Utilizar solamente cilindros equipadoscon válvulas que faciliten el manipuleo.

• No colocar los cilindros en lugares confuentes de calor.

3.3.5. Principales medios de penetraciónde los agentes químicos

Según Ferreira de Costa (1996), las princi -pales vías de penetración de las sustanciasson por inhalación, absorción e ingestión;ade más menciona los efectos que puedencausar estas sustancias.

• Inhalación. Mayor grado de riesgo debidoa la rapidez con que las sustanciasquímicas son absorbidas por los pulmones.

• Absorción: Contacto de las substanciasquímicas con la piel.

• Ingestión: Por vías secundarias de ingresoy por incumplimiento de normas de higieney seguridad.

3.3.6. Efectos de los agentes químicos enel organismo

• Efectos mutagénicos. Efectos de cambioque determinadas moléculas provocandirectamente sobre el genoma. Se estimaque el 80% de ellas son tambiéncancerígenas. Ejemplos: Azida sódica,hidroxilamina o bromuro de ethidium(BET).

• Efectos cancerígenos. Estimulan la apari -ción de tumores cancerígenos. Ejemplos:asbesto, benceno, benzidina, cloreto devinilo, acrilonitrila, formaldehído, silicacristalina, etc.

• Efectos teratogénicos. Causa daños direc -ta mente al feto por vía transplacentaria porla exposición a sustancias tóxicas. Ejem -

plos: dimetil mercurio, sales de litio, entreotros.

• Efectos órgano tóxicos: causados directa -men te a determinados órganos generandoefectos neuro, hema, hepa, nefrotóxicos osobre el aparato reproductor.

• Efectos inmunotóxicos: Causan dañodirecto al sistema inmunológico, generan -do hiper sensi bilidad, inmunodepresión yprocesos autoinmunes.

3.3.7. Cámaras de seguridad biológica

Las cámaras de flujo laminar son las zonas deprotección de volumen reducido que permitenefectuar diversas manipulaciones de microor -ganismos y controlar la contaminación(Matos, 1992). Las funciones de la cámara deflujo laminar son:

• Aportar en la zona un aire filtrado yaséptico.

• Evitar la sedimentación de partículas emi -ti das por la manipulación en las activida -des.

• Proteger al operador de compuestostóxicos.

Las cabinas de flujo laminar horizontal sonmuy adecuadas para una buena proteccióndel producto, pero no son adecuadas para eltrabajo con materiales peligrosos o con algúntipo de riesgo pues el operador queda comple -tamente expuesto. En las cabinas de flujovertical se asegura una buena protección delproducto, y una protección total del operador,son por ello más adecuadas para el trabajocon agentes peligrosos.

Las cámaras de flujo laminar deben ser insta -ladas en áreas libres de corrientes de aire,puer tas y zonas de mucho tránsito de perso -nas como los pasillos, que puedan crearpertur baciones en el flujo laminar. Las mismasse instalarán sobre superficies sólidas y nomó viles. Las áreas de flujo laminar deben serde acceso restringido para evitar la contami -

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nación. Las ventanas del laboratorio debenpermanecer siempre cerradas.

3.3.8. Agentes biológicos

El riesgo ocasionado por agentes biológicosdentro el laboratorio está dado generalmentepor bacterias y hongos, que se caracterizanpor pocas probabilidades de causar una enfer -medad, tienen una supervivencia limitada enel medio ambiente y riesgos mínimos para elpersonal del laboratorio.

Según Camacho (1997), un caso particular esel de los hongos, que se comportan comoparásitos saprófitos. Al trabajar en laboratoriocon material contaminado, es necesario saberque cualquier hongo puede contaminar muco -sas, dependiendo del nivel inmunitario deltrabajador. Las micotoxinas son canceríge nasy causan desarreglos nerviosos.

Los microorganismos pueden ser clasificadosen categorías de riesgo 1 a 4 (según la OMS,1994; citado por Argote, 1998):

• Grupo 1. Esta clase posee riesgo individualy colectivo. Son microorganismos quenunca fueron descritos como agente casualpara el hombre y no constituyen riesgopara el medio ambiente. Ejemplos Bacilluscereus, Escherichia coli K12. En general,todos los agentes bacterianos, fúngicos,virales, ricketsias y clamidias no incluidosen clases superiores.

•Grupo 2. Esta clase posee riesgo individualmoderado y riesgo colectivo limitado. Estosmicroorganismos pueden provocar dolen -cias al hombre, con poca probabilidad dealto riesgo para profesionales de laborato -rio. Ejemplos: Virus, hepatitis B,Salmonella typhy.

• Grupo 3. Esta clase posee riesgo individualelevado y riesgo colectivo bajo. Puedencau sar enfermedades graves a profe -sionales de laboratorio. Ejemplos:Micobacterium tuberculosis, HIV,Tripanosoma cruzi, Brucella sp.

• Grupo 4. Esta clase agrupa a los agentesque causan dolencias graves para elhombre y representan un serio riesgo paralos profesionales de laboratorio y para lacolec ti vidad. Posee agentes patogénicosaltamente infecciosos que se propaganfácilmente, pudiendo causar muerte.Ejemplos: Virus Ébola y Marburg (Filovius);Lassa (Arenavirus), priones de la vacaloca.

Existen agentes biológicos susceptibles detrans mitirse por diferentes vías como:

• Vía aérea. En forma de aerosoles produ -cidos por centrifugación de muestras oagitación de tubos.

• Vía oral. Ocurre por malos hábitos detrabajo, como pipetear con la boca, beber,comer o fumar.

• Vía ocular. ocurre por proyección de gotitasde material infectante, con oculares demicroscopio, aparatos ópticos.

• Vía cutánea. Ocurre en general por cortesy salpicaduras.

3.3.9. Riesgo eléctrico

El riesgo eléctrico puede ocurrir por diferentescausas o efectos, con los cuales uno debetener precaución para evitar accidentes. Lapre ven ción de los riesgos eléctricos se logra:

• Siguiendo las instrucciones de funciona -miento y manipulación de los equipos.

• No enchufar nunca un equipo con lasconexiones en mal estado.

• Al manipular en el interior de un aparato,comprobar siempre que se encuentredesconectado de la fuente de alimentación.

• Nunca improvisar instalaciones eléctricas.Solo personas autorizadas deben repararuna instalación.

• Nunca colocar aparatos eléctricos sobre lassuperficies mojadas o húmedas.

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• La instalación debe hacerse en localessecos.

• Informe cualquier quemadura eléctricainmediatamente al técnico de laboratorio.

3.3.10. Manejo de residuosLa manipulación y evacuación de los residuosse debe llevar a cabo con objeto de no poneren peligro la integridad de los ensayos. Paraello es preciso disponer de instalaciones quepermitan colectar, almacenar y evacuar losresiduos de forma adecuada, y asimismo,defi nir los procedimientos de descontami -nación y de transporte (OBA, 1997). Laeliminación e identificación de los residuos, escausa frecuente de accidentes dentro ellaboratorio, y de contaminación ambiental.Para minimi zar los residuos se debe seguir lossiguientes procedimientos:

a) Residuos Químicos

• Los residuos de sustancias inflamablesdeben descartarse en recipientesadecuados y no en el lavadero.

• Los productos químicos tóxicos sealma cenan temporalmente en contene -dores especiales para este fin.

• No descartar residuos de reactivos en ellavadero. Las sustancias líquidas o lasdisoluciones que puedan verterse allavadero, se diluirán previamente, sobre todo si se trata de ácidos y de bases.

• Los residuos de sustancias peligrosasdeben ser colocados en recipientesmetálicos, debidamente cerrados,identi fi ca dos y recogidos por equipos desegu ri dad o por servicios de terceros,transportados en vías apropiadas ydescar gados en áreas predeterminadaspor la autoridad ambiental municipal.

b) Residuos comunes

• Los residuos comunes tipo papeles ycartones se dispondrán en la papelera yposteriormente se seleccionarán yembolsarán debidamente.

• El material de vidrio roto, con fisuras,así como hojas de bisturí usadas debencolocarse en recipientes destinadosespe cialmente a este fin para evitarcortaduras.

c) Residuos sólidos y líquidos

Los residuos sólidos (biológicos) de plantascontaminadas (hongos, bacterias) de frascos otubo de ensayo deben ser esterilizadosdurante el periodo de trabajo en autoclaves.Los residuos líquidos como agua destiladacontaminada deben ser esterilizadas enautoclave de la misma manera que lossólidos.

3.3.11. Cámara de crecimiento

Las medidas preventivas o cuidados del áreade crecimiento son las siguientes:

• Ubicar los cultivos en cámaras de cultivocerrado, libre de corrientes de aire.

• El acceso debe ser restringido para evitar lapresencia de contaminantes en el área.

• Los recipientes con cultivos contaminadosdeben ser rápidamente eliminados.

3.4. PROCEDIMIENTOS Y MEDIDAS DEPRIMEROS AUXILIOS

En caso de accidente por derrame deproductos químicos o incendio, actuar conserenidad y rapidez, examinando la situacióndel entorno y avisar inmediatamente a losservicios de emergencia.

Es importante contar en un lugar visible, lalista de teléfonos más importantes para estetipo de casos, el croquis de evacuación y laubicación del botiquín de primeros auxilios enel croquis.

Las medidas de primeros auxilios (UPV,2004) deben ser aplicadas de la siguientemanera:

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a) Derrame de productos químicos sobre lapiel. Si los productos químicos son vertidossobre la piel deben ser lavados inmediata -mente con abundante agua durante 15minutos. Si la zona afectada es grande seutilizará la ducha instalada en laboratorio.Es necesario quitarle toda la ropa contami -na da a la persona afectada lo antes posiblemientras esté bajo la ducha. Procurarinmediatamente ir al médico.

Algunas veces el agua es suficiente pero enotras ocasiones, como en el caso dequema duras con fenoles, se debe limpiarprimero con alcohol etílico.

Si se producen contactos irritantes porácidos en la piel, lavar rápidamente laszonas afectadas con solución debicarbonato sódi co al 5-10% y si lairritación fue causada por un álcali, lavarrápidamente las zonas afectadas con unasolución saturada de ácido bórico o deácido acético al 1% y posteriormente lavarcon abundante agua en ambos casos.Todos estos preparados deben estarubicados en sitios específicos y claramenteenunciados en el manual de primerosauxilios del laboratorio.

En los casos de salpicaduras de ácidos obases en los ojos, el tiempo para el lavadoes de vital importancia. Cuanto más rápidose lave el ojo afectado, más leves serán losdaños producidos. Lavar la parte afectadacon abundante agua durante no menos de10 minutos con agua corriente. Cuando setrate de irritaciones en los ojos, espreferible recibir asistencia médicainmediata. Si acontece una intoxicacióngrave debe llamarse inmediatamente almedico.

b) Incendios en laboratorio. Si el incendio esde pequeñas proporciones, tratar deapagarlo con una manta protectora defuego, un guardapolvo o paño húmedo ocon un extintor de fuego que debe existir

en laboratorio. No se debe utilizar nuncaagua para extinguir el fuego provocado porla inflamación de un disolvente.

En caso de que los incendios sean deproporciones grandes mantener la calma ydar alarma de fuego, realizar la evacuaciónde acuerdo con la señalización, avisar alservicio de emergencia.

• Si una persona se quema se debe pedirauxilio inmediato.

• Si es una segunda persona socorrer deinmediato prosiguiendo de la siguientemanera:

– Apagar las llamas con una mantaprotectora de fuego.

– Conducir a la persona hasta laducha de seguridad.

– No se debe utilizar nunca un extintorde fuego sobre una persona.

– No quitar la ropa que haya podidoquedar pegada a la piel.

– Las pequeñas quemadurasproducidas por material caliente, setratarán lavando la zona afectadacon agua fría durante 10-15minutos.

– Colocar un apósito limpio sobre laquemadura.

– No romper las ampollas que sehayan podido formar.

• Si las quemaduras son graves solicitarayuda médica inmediatamente.

c) Cortes. Los cortes producidos por la roturade material de vidrio o bisturís son unriesgo común en los laboratorios. Cuandose producen estos cortes se debe lavar laherida con abundante agua y jabón, yluego cubrir las heridas y lesiones conapósitos impermeables antes de comenzarel trabajo. Si las lesiones no puedencubrirse adecuadamente, no exponersehasta que curen.

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3.5. PROCEDIMIENTOS PARAPREVENIR O ELIMINAR RIESGOSDE ACCIDENTES

La seguridad del laboratorio depende de laprotección cotidiana y atención cuidadosa delas normas de trabajo. A continuación semenciona algunos aspectos a tomar encuenta:

a) Nunca debe trabajar una persona sola enlaboratorio.

b) Muchos accidentes ocurren a través de lainexperiencia, cualquier duda que se tengaen cualquier técnica debe superarsepidiendo ayuda y consejo.

c) Orden y seguimiento de las normas sonfundamentales para evitar accidentes enlaboratorio.

d) Utilizar los Equipos de Protección Indivi -dual (EPI) - protector facial, anteojos dese gu ridad, guantes, pipetor automáticopara minimizar la exposición a riesgosindividuales.

e) No guardar alimentos o líquidos para elconsumo humano en los refrigeradores nien ninguna de las áreas de trabajo dellaboratorio.

f) A las áreas de trabajo sólo tiene acceso elpersonal autorizado.

g) Colocar indicadores de riesgos o señaliza -ción de las áreas de riesgo en el labora -torio.

h) Verificar las condiciones de seguridad delos equipos.

i) No comer, beber, ni fumar, en las zonas detrabajo.

j) Orientar a personal nuevo y leer manualesde seguridad.

k) Mantener y anunciar condiciones deinseguridad.

l) Las instalaciones de energía eléctrica,ventilación, y de equipos de laboratorio

deben ser revisadas periódicamente ymantenidas en perfectas condiciones.

m)Mantener el orden y los pasillos limpios ylibres de materiales.

n) Contar con procedimientos escritos deprimeros auxilios de forma clara y directa.

o) Contar con teléfonos de emergencia enlugares visibles.

p) Tener instalada una sirena de alerta y unresponsable de activarla.

3.6. EQUIPOS DE SEGURIDAD

Los laboratorios que utilizan substancias oreactivos químicos según Jona & Menine(1987) y Ferreira da Costa (1996) debenposeer:

• Duchas que deben ser fácilmenteaccesibles.

• Lavamanos de emergencia cerca a lasduchas para lavar los ojos.

• Todo el laboratorio debe contar condispositivos de protección tales comoextintores de incendio (compatibles con lanaturaleza de trabajo, debidamentelocalizados y en un número suficiente),además debe disponerse de un botiquínde primeros auxilios.

• Mantas contra incendio localizadas enlugares estratégicos.

• Sacos de arena para absorción de líquidosderramados.

• Frascos de substancias absorbentes quedeben ser esparcidos por los diversossectores de laboratorio.

3.7. INVERNADERO

Dentro el área de invernadero se debe consi -derar las siguientes medidas de precaución enla manipulación y aplicación de losplaguicidas:

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• Elegir el producto adecuado y leeratentamente las instrucciones de usorespetando las dosis recomendadas.

• Para la aplicación de agroquímicos, debesiempre usarse el equipo de protecciónadecuado (overoles, mascarillas y lentes).

• No limpiar las boquillas de aplicaciónsoplando.

• Cuando se realice algún descanso, hacerlosiempre fuera de la zona tratada.

• Ducharse y cambiarse de ropa al terminarel trabajo y separar la ropa de trabajo.

• No permanecer ni entrar en la zona tratadacomo mínimo por 48 horas.

• Mantener el plaguicida sobrante en suenvase original, almacenado en lugarfresco, seguro y ventilado.

• Ante cualquier malestar que se experimen -te tras haber aplicado un plaguicida (dolo -res de cabeza, náuseas, mareos, vómitos)acudir inmediatamente al médico.

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Capítulo 4Contaminantes

en Cultivo in vitro

Gerónimo G. F., Pérez B. L. F., Plata G.& Aguirre V. J. G

INTRODUCCIÓN

La contaminación microbiana es uno de losproblemas más limitantes del cultivo in vitro ocultivo de tejidos vegetales, la misma queintervienen en forma negativa en su forma deataque a las vitroplantas esto puede originarsede dos fuentes fundamentales: una llevada acabo por microorganismos que colonizan lasuperficie o el interior de los tejidos de losexplantes y la otra por microorganismosintroducidos durante la manipulación de losoperadores en el laboratorio. La misma quepuede ocasionar grandes pérdidas hasta un90% en las diferentes fases del cultivo invitro.

Estos microorganismos que ingresan al tejidoa través de aberturas naturales y/o, heridas,son en muchos casos oportunistas que llegana colonizar los tejidos vegetales y una vezintroducidos en laboratorio pueden llegar adesarrollarse con mucha facilidad por lariqueza del medio de cultivo.

Principales fuentes de contaminación

Las principales fuentes de contaminación son:

• Ineficiente desinfección de los explantesprimarios utilizados en la fase deestablecimiento.

• Por inadecuada manipulación delmaterial vegetal, deficientes técnicas deasepsia y/o incompleta esterilización delmedio de cultivo.

• Por fallas en el funcionamiento del flujolaminar

• Mala limpieza o desinfección de losambientes.

• Presencia de ácaros, trips y hormigas.

Microorganismos contaminantesintroducidos en el laboratorio de cultivo invitro

Son generalmente contaminantesambientales; saprófitos o patógenos de lasplantas, así como habitantes de la microbiotanormal del cuerpo humano que se relacionancon procederes inadecuados en el laboratorio,condiciones higiénicos sanitarios deficientes oincumplimientos de la disciplina tecnológica.Contaminantes más frecuentes en condicionesin vitro son los hongos, las bacterias ylevaduras, ver fig. 1, denominados"vitropatógenos", aunque también existenotros menos frecuentes como los virus,viroides y microartrópodos (ácaros ytrips).George, E. F. 1993).

Entre los contaminantes más comunes de lasvitroplantas se mencionan a los géneros

fúngicos: Cladosporium, Aspergillus,Penicillium, Microsporium, Phialophora,Neurospora, Fusarium, Rhizopus,Curvularia, Alternaria, Candida,Rhodotorula, Chryptococus, entre otros y alos géneros bacterianos; Bacillus yStaphylococcus. Díaz, M. 2010.

Las bacterias son consideradas como loscontaminantes más comunes y son las queocasionan los problemas más serios, porquepueden ser sistémicas, y su detección es másdifícil, entran al cultivo de tejidos con losexplantes iniciales aunque existen otras queson introducidas en el laboratorio pormanipulación.

Estudios realizados mencionan que determi -nados microorganismos son particularmenteintroducidos en el cultivo de tejidos comoresultado de prácticas deficientes en el labora -torio. Ej. Bacillus spp. que puede contaminarlos medios de cultivo por insuficienteesterilización o mal funcionamiento de lasautoclaves. Las endosporas de esta bacteriason altamente resistentes al calor y aproductos químicos como los desinfectantes,pueden sobrevivir a temperaturas de 100°C osuperiores. Aunque también se ha reportadosu resistencia en medio de cultivos despuésdel auto clavado y antes de ser utilizado ypuede ser diseminado durante las operacionescon el material vegetal.

El término vitropatógeno ha sido usado paraaquellos organismos que no sonnecesariamente patógenos para las plantas enel campo, pero sí son perjudiciales paracélulas, tejidos u órganos cultivados in vitro,mientras que el término patógeno ha sidoconfinado para describir a un organismo quecausa enfermedad a las plantas cultivadas enel campo. estos vitropatógenos pueden serdañinos para el cultivo de tejidos vegetales,porque compiten con el explante por losnutrientes del medio y les producen dañosdirectos e indirectos por la colonización de sustejidos o liberación al medio de metabolitostóxicos Leifert, C., Waites, W. M.; Camotta, H.y Nicholas, J. R. 1989.

Hernández. J. y González. M. 2010,determino que los coeficientes demultiplicación de plantas infectadas concontaminantes bacterianos latentes puedenmantenerse inalterables, pero reiteradamentese ha referido que decrecen su crecimiento,esta investigación es cierta debido querealizada practicas con plantas contaminadasen laboratorio de la FCAPyF sucedió lo mismoencontrándose una disminución en la tasa demultiplicación con plantas tratadas conantibióticos.

Como contaminantes in vitro de plantas, sehan aislado especies de bacterias

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Figura 1. Contaminantes introducidos enmedios de cultivos

pertenecientes a los géneros: Micrococcus,Bacillus, Staphylococcus, Mycobacterium,Pseudomonas, Enterobacter, Acinetobacter,Xanthomonas, Lactobacillus, Erwinia,Agrobacterium, Corynebacterium,Methylobacterium, entre otros y como losmicroorganismos fungosos más comúnmenteintroducidos al cultivo de tejidos seencuentran los géneros Cladosporium,Aspergillus, Penicillium y Curvularia Boxus,P. H. y Terzi, J. M. 1988.

Al realizar el establecimiento in vitro despuésde 15 días, se identificaron como géneros dehongos contaminantes a Fusarium sp.,Botryodiplodia sp., Alternaria sp. yAspergillus sp. Así diferentes autores comoLeifert, C., Waites, W. M.; Camotta, H. yNicholas, J. R. 1989.

Hernández. J. y González. M. 2010. Señalanque frecuentemente es difícil identificar lafuente de contaminación y que se handesarrollado protocolos para reducir lapresencia de estos microorganismoscontaminantes, que pueden encontrarse en lasuperficie (ectófitos), en el interior (endófitos)del explante o en ambos sitios, siendo los dela superficie los más fácil es de eliminar.

Niedz, R. P. y Bausher, M. G. 2002. Indicanque el éxito de los sistemas de propagación deplantas por biotecnología depende en granmedida del control y la prevención de lacontaminación microbiana. Uno de losprocedimientos para disminuir los riesgos decontaminación en el establecimiento de losexplantes, es la aplicación de fungicidas sinté -ticos, combinados o independientes, combi -nando fungicidas preventivos de contactoMancozeb (10 g/l), Benomil (2 g/l) ybactericidas como la cetofaxima, ampicilinaque has sido utilizados en una relación de25mg/l que en muchos casos ha resultadoexcelente. Sin embargo; otros investigadorescomo Cruz, M.; Acosta, M.; Leiva, M.;Alvarado, y.; Lezcano, M. 2002, indican, queel empleo del complejo carbendazim--ciclodextrina, en concentraciones variables,

demostraron que era posible inhibir elcrecimiento micelial de diferentescontaminantes pertenecientes a los géneros:Aspergillus, Penicillium, Spicaria, Fusarium,Pestalotia y Colletotrichum.

El tamaño del explante es otra de las causasque incrementa la presencia de contaminan -tes in vitro, pues mientras mayor sea elexplante, más difícil es desinfectar Surga, J.G. y Guevara, 1994. Del mismo modo, lasirregularidades ubicadas en la superficie delexplante afectan el éxito de la desinfecciónsuperficial, ya que pueden servir de depósitode esporas y polvo, y los productos empleadosno logran llegar y desinfectar las áreas deinterés. Roca, W. y Mrogrinski, L. 1993

Para la desinfección del explante inicial, sehan empleado soluciones de hipoclorito desodio (NaClO) en concentraciones entre 0.5 y5% . Asimismo las soluciones de hipocloritode calcio (CaClO) son tan efectivas como lasde sodio. De forma general, se plantea que laescisión del explante es recomendablerealizarla después de la desinfección, paraeliminar tejidos que han sido dañados por lasolución de hipoclorito.

La aplicación de una doble desinfección conhipoclorito de sodio o calcio, seguido delenjuague con agua destilada y esterilizada pordos a tres minutos, ha sido empleada porvarios investigadores. Esto permite que lasesporas que no puedan ser destruidasinicialmente, pasen a formas vegetativas ydurante la doble desinfección sean eliminadasfácilmente de los explantes primarios, lo queconlleva a un menor porcentaje decontaminación microbiana. Novat, F. J.; Afza,R.; Van Durein, M. 1988.

Métodos de detección de vitropatógenos

La detección de vitropatógenos constituyenuna herramienta muy importante, en elmomento de planificar cultivos in vitro y paracombatir enfermedades de poblaciones

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vegetales. Saber con qué patógeno se estálidiando es el paso más importante paraeliminarlo. Muchos vitropatógenos tienenasociaciones naturales con las plantas, por loque las pruebas de calidad también debenrealizarse para material vegetal, del cual no setenga absoluta certeza de que está libre depatógenos. Fontúrbel, F. 2001.

Investigadores en biotecnología de plantas amenudo utilizan la observación visual de suscultivos, como método para saber si estánlibres o no de contaminantes. Leifert, C.,Waites, W. M.; Camotta, H. y Nicholas, J. R.1989. Los signos de contaminación sóloaparecen después de que las plantas han sidosubcultivadas en varias oportunidades. Estopuede estar relacionado con el crecimientolento de las bacterias en medios de cultivo y asu estado de latencia.

Por esta razón, se precisa de métodos rápidosy seguros de detección temprana; entre losmás utilizados se encuentran rozar lasuperficie cortada del explante sobre unmedio de cultivo bacteriológico durante lossubcultivos. Fossard, R. A. y De Fossard, H.1988. Otro aspecto es la modificación de losmedios de cultivo de plantas con la adición debacterias. Boxus, P. H. y Terzi, J. M. 1988.

Los métodos de detección de vitropatógenosse dividen en dos grandes grupos: detecciónde bacterias y hongos, y detección de virus.Los procesos de detección de virus sonconsiderados por separado de los empleadospara bacterias y hongos, puesto que dadas lascaracterísticas de los virus, se necesitantécnicas especiales (serología, microscopiaelectrónica, etc.). Fontúrbel, F. 2001.

Uso de sustancias antimicrobianas

El éxito de su aplicación en el medio decultivo varía según los criterios, métodos deapreciación, microorganismos, etc. y dependeen gran medida del desarrollo de un buenprotocolo Así, por ejemplo, se ha planteado

que los antibióticos no sustituyan las técnicasde asepsia y deben ser empleados sólocuando éstas son inadecuadas, preferente -mente como tratamiento profiláctico más quepara tratar la infección.

Un compuesto antimicrobiano debe cumplirlas siguientes condiciones: debe ser soluble,estable, no afectar el pH ni el medio de culti -vo, mínimos efectos secundarios (no fitotóxi -cos), amplio espectro, ser bactericida, debeser usado sistemáticamente y en alter nanciacon otras sustancias antimicrobianas, paraevi tar desarrollar resistencia. Falkiner, F.1990. El empleo de antibióticos solamente sejustifica, en casos de excepción y en cultivosde corta duración, porque su alta especifici -dad implica que no previenen la proliferaciónde todos los microorganismos. Además, talesproductos modifican la composición de losmedios de cultivos y pueden ser metaboliza -dos por los explantes.

El uso de ciertos antibióticos pueden eliminargrupos discretos y particulares de bacterias,pero en la mayoría de los casos se necesitansustancias de amplio espectro. El empleo deagentes químicos desinfectantes como elBasamid, Brassicol, Benlate, PCNB o mezclasde ellos permite la eliminación de la sarnacomún (Streptomyces scabies) de la papa.Marcano, D. y Pire, A.1993. Otros investi ga do -res, en la micropropagación de especiesvegetales, obtuvieron experiencias con el usode sustancias inhibidoras del crecimiento bac -te riano. Meyer, H.; Staden, V.; Allen, S. y VanStaden, J. 1992. Estas sustancias son anti bió -ticos como la rifampicina, cefotaxima, gentami -cina, estreptomicina, ampicilina, etc. Tambiénse han empleado otras sustancias como extrac -tos filtrados de microorganismos (metabolitos).Entre estos, el extracto de Pseudomonasfluorescens ha mostrado una elevada actividadantimicrobiana. El G1 (1-(5-bromofur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno) es un producto desarro -llado en Cuba, con acción de esterilizantequími co, que se incorpora a los medios de cul -tivo para eliminar los contami nantes micro -bianos. Hussain, S.; Lane, S. y Price, D. A.

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El uso de nitrato de plata en los medios decultivo permitió controlar el crecimiento decontaminantes no patogénicos, sin afectar elcrecimiento en plántulas de tomate tal comomenciona Kubota, C. y Tadokoro, N. 1999.

Identificación de microorganismoscontaminantes de hongos y bacterias enmedio de cultivo con vitroplantas

Uno de los mayores problemas que se tieneen la propagación de plantas in vitro en ellaboratorio de biotecnología son loscontaminantes como ser: Hongos que muchasveces son difíciles de detectar en el medio de

cultivo pues su crecimiento en un inicio no esvisible pero transcurrido cierto tiempo seobserva el crecimiento en forma de coloniasaisladas o alrededor de los explantes (fig.2).En su gran mayoría éstos corresponden ahongos ambientales.

Las bacterias son los contaminantes in vitromás comunes escapan a los efectos de losesterilizantes superficiales y pueden ser inter ointracelulares. Asimismo entre los últimos, seencuentran los virus, viroides y muchosgéneros bacterianos como: Agrobacterium,Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus,Erwinia, Enterobacter y Pseudomonas.Madoff, S. 1981.

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Figura 2. Algunos Contaminantes Fúngicos en laboratorio de biotecnología vegetal FCAP y F

Su distribución puede ser localizada osistémica por xilema o floema. Debergh, P. yZimmerman, R. 1991. Estos contaminantesno se manifiestan en los primeros subcultivos,porque la alta presión osmótica, el pH yciertas hormonas de los medios de cultivopueden inhibir su crecimiento. Debido a esteefecto inhibitorio, muchos microorganismosrequieren un período de adaptación a lasnuevas condiciones antes de manifestar supresencia; esto ocurre por lo general en la fasede establecimiento y multiplicación. Entre lasprincipales fuentes de contaminaciónbacteriana se citan los explantes, el ambientede los locales de trabajo, los operadores y lastécnicas deficientes de esterilización. Además,

los microorganismos pueden diseminarse porácaros, trips y hormigas.

Así mismo cabe mencionar que crecensuperficialmente en el medio del cultivo dondeestán los explantes; si están asociadas altejido vegetal no se distinguen coloniasaisladas sino una masa bacteriana en formade pliegues, halos o rosetas en el interior delmedio sólido ver fig. 3. y se apreciaabundante y escaso crecimiento sobre lasuperficie. En el medio líquido formanturbidez uniforme o no, películas o sedimentoe incluso tienen la habilidad de licuar el mediosólido.

Aspectos a considerar en la contaminaciónen Laboratorio de Biotecnología Vegetal

- Contaminación de las plantas madres

La recolección de plantas madres es muyimportante, ya que puede constituirse en lamayor fuente de contaminación. Es más fácildetectar contaminantes en los tejidosmaduros de las plantas madre, porquegeneralmente manifiestan los síntomas(manchas con bordes aceitosos).

- Contaminación en el explante

El tipo de explante es muy importante de ellodepende que los microorganismos ectófitosoendofítos de las plantas pueden serintroducidos al cultivo in vitro. Bajo la técnicade cultivo de meristemos, pueden sereliminados muchos de ellos pero en explantesde hojas, peciolos o tallos en su mayoríapueden ser introducidos.

Los métodos de desinfección utilizados nosiempre eliminan las poblaciones demicroorganismos asociados a los tejidos delas plantas, muchos son capaces depermanecer latentes en el interior de lascélulas, en los espacios intercelulares o en loshaces conductores donde quedan protegidosde los agentes químicos. De esta forma seintroducen en el cultivo de tejidos, sepropagan con el material vegetal y puedenmanifestarse sobre los medios de cultivo en la

fase de establecimiento o permanecer sinexpresarse por largos períodos de tiempohasta llegar a la fase de multiplicación dondepuede aparecer con mayor frecuencia.

- Contaminación del ambiente

El ambiente de laboratorio o de trabajo es unafuente de contaminación ya sea directa oindirectamente. A través de las corrientes deaire las partículas de suelo cargadas deesporas son arrastradas y penetran a loslocales por los acondicionadores de aire; sontransportadas o introducidas por ellaboratorista o el visitante y permanecen en elambiente por condiciones higiénicasinadecuadas.

- Aspectos a considerar para evitar lacontaminación del ambiente

Se requiere el mantenimiento de condicionesasépticas.

- El uso de aires acondicionados, los cualesintercambian constantemente aire con elambiente, elevan las probabilidades deentrada de microorganismos.

- Es importante el estricto mantenimiento dela limpieza para disminuir la cargamicrobiana ambiental.

- Finalmente la organización adecuada delproceso productivo de las etapas de lamicro propagación en laboratorio.

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Figura 3.Contaminación porbacterias

El laboratorista

El Laboratorista interviene directamente entodas las operaciones y es una fuente primariade contaminantes a través del estornudo, tos,conversación, etc. La presencia demicroorganismos contaminantes que sonhabitantes de la microbiota normal del cuerpohumano como por ejemplo: Staphylococcusepidermidis o Candida albicans,generalmente indican ineficientes técnicas deasepsia por parte de los operarios o la malaasepsia de los mismos por ejemplo la higieneal lavarse las manos y la desinfección conalcohol al 70%.

Díaz, M. 2010, menciona que el trabajodentro de la cabina de flujo laminar es dondeel operario puede introducir la mayoría de losmicroorganismos llegando a ocasionarpérdidas muy costosas entre ellos están lasbacterias en ocasiones a diferencia de otrosmicroorganismos no producen crecimientovisible hasta mucho tiempo después de quefueron introducidas.

Asi mismo, Díaz, M. 2010, indica que a altaspresiones osmóticas, el pH y determinadashormonas pueden inhibir o limitar elcrecimiento bacteriano. Se ha comprobadoque las citoquininas ejercen un efectobacteriostático sobre ellas.

Por estas razones se precisa de métodos dedetección rápidos y seguros, como latransferencia de fragmentos del materialvegetal a medios bacteriológicos donde crecenvarios representantes de este grupo o tambiénse utilizan componentes de medios bacterioló -gicos en el medio de cultivo de plantas y elempleo de métodos turbidimétricos.

Los equipos y el instrumental

La esterilización de equipos por calor húmedoen autoclave se emplea comúnmente paraeliminar los microorganismos de los mediosde cultivo, de la calidad de este paso depende

en gran medida la continuidad del proceso.Los problemas en la esterilización puedendeberse a fallas del funcionamiento deautoclaves o a errores en su manipulación.(Instituto de Estándares Clínicos y deLaboratorio, 2009).

El género Bacillus, puede contaminar mediosde cultivo por insuficiente esterilización o malfuncionamiento de las autoclaves y puede serdiseminado durante las operaciones con elmaterial vegetal. Por otro lado, las coloniasbacterianas pueden detectarse dentro delmedio a partir de las 24 horas de preparado yluego emergen a la superficie. Es importantemantener en reposo los medios de cultivo por24-72 horas para verificar la calidad de laesterilización. La cabinas de flujo laminar sifuncionan adecuadamente proporcionancondiciones de asepsia para el trabajo enbiotecnología vegetal, pero esto depende engran medida del uso, cuidado y revisiónperiódica de los filtros. (Instituto deEstándares Clínicos y de Laboratorio, 2009).

Los equipos destinados al tratamiento de agua(desionizadores, destiladores, etc.) tambiénpueden introducir contaminación; por fallosen el mantenimiento o procederesinadecuados, en sus resinas pueden abrirseoquedades donde los microorganismos,principalmente bacterias, se sitúan ymultiplican.

En los laboratorio con clima centralizadopueden introducirse y diseminarcontaminación cuando la limpieza esineficiente focos contaminantes y se producenfluctuaciones de temperatura; en losconductos de aire hongos filamentosos comoCladosporium sp (hongo verdoso y polvoso).Estos se pueden multiplicar y esparcir.

Efecto de las condiciones ambientales y lafisiología de las plantas

Estos organismos generalmente se conviertenen patogénicos en el cultivo de tejidos porque

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las condiciones ambientales y la fisiología delas plantas son diferentes in vitro. Los mediosde cultivo de tejidos contienen todos losnutrientes minerales esenciales para lasplantas en concentraciones que son de 3 a 20veces superiores a las encontradas en losmedios usados para cultivo hidropónicos invivo.

Sin embargo, por la adición de azúcar y otroscompuestos orgánicos, el medio de cultivo seconvierte en un buen sustrato para eldesarrollo de hongos, levaduras y algunasespecies de bacterias.

La desinfección de la superficie de las plantasno elimina solamente a los microorganismosque pueden convertirse en patógenos in vitro,sino también a la microflora antagonista queevita el establecimiento de otros saprófitos yalgunos microorganismos patógenos, y enalgunos casos estos protegen a las plantascontra ciertas enfermedades del campo. Eluso de microorganismos benéficos se hasugerido como un método alternativo para elcontrol de la contaminación.

La alta humedad en la mayoría de los frascosde cultivo, como los estomas permanecenabiertos y hay una constante presencia deagua en la superficie de las plantas. Laausencia de lignificación y capa de ceramuestran que el crecimiento de plantas encampo o invernadero son más susceptibles alataque microbiano.

Eliminación de los contaminantes de losexplantes

Uno de los alternativas es la prevención ytratamiento de los contaminantes que sonintroducidos con los explantes tomados de lasplantas in vivo. Para ello se considera los trespuntos que debe estar dirigido el control yprevención de los contaminantes:

• Tratamiento a las plantas madres.

• Desinfección de los explantes.

• Detección de contaminanteslatentes.

Tratamiento a las plantas madres

Las plantas madres deben mantenerse libresde enfermedades por estrictos métodos decontrol biológico y químico. El número debacterias y hongos en el tejido aéreo de lasplantas usadas como explantes deben serreducidos además debe ser mantenimiento eninvernadero. Los explantes que usualmenteson tomados de tejidos aéreos jóvenes de lasplantas (meristemos, segmentos nodales,botones florales, discos de hojas, anteras,polen, etc.) están por lo general libres depoblaciones internas detectables de viroides,virus, micoplasmas, bacterias y hongos.

Desinfección de los explantes

Los explantes son desinfectados generalmentepor la inmersión en: hipoclorito de sodio ocalcio, alcoholes, cloruro de mercurio u otrosproductos químicos con actividad másselectiva como son los fungicidas, insecticidasy antibióticos.

La mayoría de los biocidas de amplio espectroson no sistémicos, pero los explantes muerensi se les permite que penetren en sus tejidosinternos. El éxito de la desinfección utilizandoestos compuestos está en que el tejido internode la planta esté libre de microorganismoscontaminantes; sin embargo, si este estáinfestado por hongos, bacterias,micoplasmas, virus o viroides, estos soninevitablemente transferidos al cultivo detejidos.

Detección de contaminantes latentes

Los explantes tomados de las plantas madresdeben ser testados para la presencia decontaminantes latentes en todos lossubcultivos al menos seis meses después dela desinfección, y testados para las bacterias

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vitropatógenas a intervalos regulares de dos atres meses.

Prevención y tratamiento de lacontaminación en el laboratorio

Los parámetros probados y los métodosmicrobiológicos utilizados son similares a losempleados en industrias que elaboranproductos asépticos o libres decontaminación, esto incluye:

• El monitoreo de diferentes fuentes decontaminación mediante el testajeregular del aire del laboratorio, laesterilidad del medio preparado y elfuncionamiento de autoclaves, flujoslaminares e instrumentales, además, ladeterminación de tasas de contami -nación por línea vegetal individual yoperadores y por último, la identifica -ción de “organismos indicadores”.

• El medio de cultivo puede contaminarsea causa de una insuficienteesterilización y/o durante lamanipulación después del autoclaveo.Esto puede evitarse garantizando quecada ciclo de autoclaveo alcance latemperatura adecuada.

• Las levaduras y los hongos introducidosdurante las manipulaciones del mediode cultivo generalmente crecen enforma de colonias visibles después deuna o dos semanas de incubación a

temperatura ambiente, y el mediopuede haber sido descartado antes deintroducir las plantas si se observaronaparentes colonias; sin embargo, losmedios son generalmente utilizadosantes de que este crecimiento se hagavisible y/o son ubicados en locales fríosdonde las tasas de crecimiento fungososon limitadas.

• La detección de las bacteriasintroducidas durante la preparación delmedio es más difícil de acuerdo a lo quese ha explicado en epígrafes anteriores,aunque, el medio puede ser testado poradición de nutrientes extras en forma decaldo nutriente o caldo triptona-soyadespués de ser vertido. Esto permite elcrecimiento bacterial y la detecciónvisible de colonias de microorganismosen el medio.

• La adición de reguladores delcrecimiento sensitivos al calor mediantela esterilización del filtro después delautoclavado, permiten que el medio seaautoclaveado por más tiempo. El éxitode la esterilización de los ciclosindividuales de autoclaves puede sermonitoreado por la cinta para autoclaveu otros indicadores físicos detemperatura o mediante métodosbiológicos más precisos que sonbasados en la sobrevivencia de esporasde Bacillus.

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Pruebas de sensibilidad bacteriana para cultivo de tejidos vegetales

Cuadro 1. Los halos de inhibición de los diferentes antibióticos en cada una de las bacteriasexpresados en mm

Bacteria

B1 gram +

B2 gram+

B5 gram-

B6 gram-

B7 gram+

B8 gram-

Antibiótico

LevofloxacinoAzitromicinacloxacilinaDicloxacilinaamoxicilina



levofloxacinoazitromicinacloxacilinadicloxacilinaamoxicilina



Halo deinhibición mm

24,817,3

017,618,3

189000

25,67000

2412000

3526,330

26,315

31,625,621,328,616,8

Grado desensibilidad

SensibleSensibleresistenteintermedioresistente

resistenteresistenteresistenteresistenteresistente

SensibleResistenteResistenteResistenteResistente

SensibleSensibleResistenteResistenteResistente

SensibleSensibleintermediointermedioSensible

SensibleSensibleIntermedioIntermedioSensible

Bacteria

inhibición mmAntibiótico

sensibilidadGrado de

inhibición mmHalo de

sensibilidadGrado de

B2 gram+

B1 gr B1 ram +

cloxacilinaAzitromicinaLevofloxacino

amoxicilinaDicloxacilinacloxacilinaAzitromicinaLevofloxacino

resistenteresistenteresistente

resistenteintermedioresistenteSensibleSensible

09

18

18,317,6

017,324,8


resistenteintermedioresistenteSensibleSensible

B5 gram-


amoxicilinaDicloxacilinacloxacilina

esistenteResistenteResistenteResistenteR

Sensible


0007

25,6

000

esistenteesistenteesistenteesistente

Sensible


B6 gram-

amoxicilinadicloxacilinacloxacilinaazitromicinalevofloxacino

amoxicilina

esistenteResistenteResistenteR

SensibleSensible

esistenteR

000

1224

0

esistenteesistenteesistente

SensibleSensible

esistente

B8 gram-

B7 gram+

AzitromicinaLevofloxacino


SensibleSensible

SensibleintermediointermedioSensibleSensible

25,631,6

1526,330

26,335

SensibleSensible

SensibleintermediointermedioSensibleSensible

amoxicilinaDicloxacilinacloxacilina

SensibleIntermedioIntermedio

16,828,621,3

SensibleIntermedioIntermedio

Fuente: Pérez &Plata, 2012.

Cuadro 2. Efecto de las bacterias ante diferentes Antibióticos

Fuente: Pérez& Plata.

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Bacteria Resultados

Bacteria1 Es una bacteria de color blanco, se reproduce muy rápido, de acuerdo a la prueba de KOH se determinó que es una bacteria Gram+, ha sido controlada con dos antibióticos: levofloxacina y el otro la azitromicina

Bacteria2 Es una bacteria de color crema, muy invasiva, de acuerdo a la prueba de KOH se determinó que es una bacteria Gram+, ha sido controlada solo con levofloxacina.

Bacteria4 Es una bacteria de color amarillo intenso, Gram- (patógenica para las plantas), ha sido controlada con levofloxacina

Bacteria5 Es una bacteria de color crema de invasión circular, es una Gram- (patogénica a plantas), ha sido controlada con levofloxacina

Bacteria6 Es una bacteria de color blanco de lento crecimiento, Gram- (patogénica a plantas), ha sido controlada por dos antibióticos: levofloxacina y azitromicina

Bacteria7 Es una bacteria cremosa de color blanco, de elevación plana, se determinó que es una bacteria Gram+, ha sido controlada por todos los antibióticos utilizados.

Bacteria8 Es una bacteria de color crema, de lento crecimiento, bacteria Gram- (patogénica a plantas), ha sido controlada por todos los antibióticos utilizados.

A pesar que existen antibióticos específicospara diferentes bacterias gram + y gram-como lo afirma el Instituto de EstándaresClínicos y de Laboratorio, 2009: Laspenicilinas son activas principalmente contralas bacterias aerobias gran positivas que noproducen betalactamasas, aerobias granpositivas, algunas bacterias gran negativasexigentes y algunas anaerobias. Lasaminopenicilinas (ampicilina y amoxicilina)son activas contra otras especies gramnegativas, en los resultados se observó quelas bacterias 1 y 2 que son gram positivas nohan sido controladas por los antibióticosesperados como la amoxicilina.

La levofloxacina demostró tener los mejoresresultados por su amplio espectro en elcontrol de bacterias, pertenece al grupo de lasquinolonas (quinolonas y fluoroquinolonas)según el Instituto de Estándares Clínicos y deLaboratorio, 2009. Son agentesantimicrobianos estructuralmenterelacionados, cuyo principal mecanismo de

acción es inhibir la actividad de la ADN girasao de la topoisomerasa de muchas bacteriasgram positivas y gram negativas.

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5.1. INTRODUCCIÓN

Las condiciones de asepsia en un laboratoriode cultivo de tejidos son de vital importancia.La asociación explante-medio de cultivo y lascondiciones físicas en que normalmente seincuban los cultivos (temperatura y luz), for -man un ambiente adecuado para el desarrolloy proliferación de microorganismos (bacterias,hongos y levaduras) y que generalmente, sonconsiderados contaminantes. Cuando se pro -du ce el desarrollo de estos microorganismosen los medios de cultivo, pueden destruir ocompetir con el explante; por esta razón, eléxito para alcanzar la asepsia en un labo -ratorio, en gran medida depende del control yprevención de la contaminación microbiana(Alvarado, 1998 y Mroginski et al., 2004).Conocer el tipo y característica del microorga -nismo contaminante y lograr ubicarlo taxonó -micamente ayuda a determinar las fuentes decontaminación y proporciona informaciónvaliosa para trazar las estrategias de controladecuadas (Alvarado, 1998).

Las técnicas de esterilización en un labora -torio de cultivo de tejidos están orientadas areducir las contaminaciones provenientes demicroorganismos. En general se conocen dife -rentes técnicas, las cuales deberían serutilizadas integralmente o en función a laprioridad de cada laboratorio.

5.2. FUENTES DE CONTAMINACIÓN

Las fuentes de contaminación pueden serorigi nadas a partir de dos vías: los microor -ganismos del explante y los introducidos enlaboratorio.

5.2.1. Microorganismos del explante

Los microorganismos que infectan los cultivosde tejidos vegetales in vitro comprenden a lasbacterias, los hongos y levaduras. Entre estosse incluyen varios géneros de bacterias(Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia,Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus,Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus,Mycobacterium, Corynebacterium) y dehongos filamentosos (Aspergillus, Penicilium,Fusarium, Alternaria, Cladosporium yNeurospora) que están frecuentemente en loscultivos (Mroginski et al., 2004).

En el caso de levaduras, por la similitud desus características, se confunde con muchafrecuencia con bacterias y esa es la causa deque en la mayoría de los laboratorios lacontaminación bacteriana se estime muchomás alta de lo que en la realidad es (Leifert etal., 1994).

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Capítulo 5Asepsia y Técnicasde Esterilización

Margarita Calle, Mario Coca Morante & Gino Aguirre

5.2.2. Contaminantes introducidos enlaboratorio

Los microorganismos que se introducen en ellaboratorio son generalmente habitantes delsuelo que se encuentran en el ambiente, seansaprófitos o patógenos de las plantas (Alva ra -do, 1998). El aire también contiene una grancantidad de microorganismos en suspensióncomo esporas de hongos o bac terias, siendo laprincipal vía para su disemi na ción. Otras víasson los mismos tejidos vegetales (microorga -nis mos endofíticos, pató ge nos internos delexplan te) y el cuerpo hu ma no a través de lapiel y la transpiración, que es transporte demúltiples microorganis mos (Boccon, 1989;Hernández & Nápoles, 2000).

La contaminación interna en las plantas es amenudo por la presencia de bacterias de tipoBacillus linchiniformis y Bacillus subtilis.Estas bacterias saprofíticas se encuentrantambién frecuentemente distribuidos en loslaboratorios de microbiología (Pierik, 1987).

Entre los hongos filamentosos contaminantes(Alvarado, 1998), los géneros encontrados conmayor frecuencia son Aspergillus, Clodospo -rium, Penicilllum, Fusarium, Altenaria yNeurospora.

La detección e identificación de los microorga -nismos contaminantes son aspectos impor -tan tes para el éxito de los cultivos. Para estoconviene inspeccionar visualmente con la ayu -da de un microscopio estereoscopio los culti -vos en forma periódica (por lo menos sema -nal mente). También se pueden realizar prue -bas con medios de cultivo diferenciales ypruebas bioquímicas específicas (Roca &Mroginski, 1991 y Alvarado, 1998).

5.3. PREVENCIÓN DECONTAMINANTES DE LOSCULTIVOS

Para evitar y/o minimizar las contaminacionesde los cultivos con microorganismos es

necesario tener en cuenta los siguientesaspectos:

5.3.1. Tratamiento de material de origen

Es necesario conocer el origen del materialvegetal con el que se trabaja y los posiblescontaminantes, además de realizar una ade -cuada preparación de la planta donadora deexplantes. Primero, cultivar en invernaderosde cuarentena sobre suelo previamente desin -fectado. Segundo, realizar en las plantas apli -ca ciones con soluciones de fungicidas, insec -ticidas y acaricidas, con la finalidad de reducirlas posibles fuentes de contaminación en elmomento del establecimiento de los explan -tes. El material vegetal debe inicialmente serlavado en detergente y separado de residuosde tierra y de partes maltratadas antes de serllevado a la cámara de siembra.

5.3.2. Esterilización de medios einstrumentos de cultivo

Es importante emplear medios e instrumentoslibres de cualquier microorganismo. Para estepropósito todos los medios, equipos e instru -mentos a ser utilizados deben encontrarsepreviamente esterilizados. La esterilización deéstos se puede realizar mediante el uso delcalor en sus diversas formas: calor húmedo ocalor seco, conforme a procedimiento einstruc ciones específicas para cada caso. Porejemplo, es importante la previa desinfecciónde las paredes de la cámara de flujo laminarcon etanol al 70% y la desinfección exteriorde todos los recipientes con medios de cultivoo materiales que ingresen al área de aireestéril.

5.3.3. Asepsia de personal y ambientes

Tanto el personal como los diferentes ambien -tes deben mantenerse lo más pulcros posi -bles. Es importante que los laboratorios cuen -ten con medios mínimos para el manteni -

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mien to de accesos que eviten el ingreso direc -to de fuentes de contaminación. Asímismo, esimportante la aplicación de las normasestrictas de manejo de laboratorios.

5.3.4. Cultivo de los explantes en cámarade flujo laminar

La siembra de los explantes debe ser estricta -mente realizada en cámaras de flujo en condi -cio nes esterilizadas y adecuadas de volumende aire a objeto de evitar la contaminación delos explantes.

5.3.5. Incubación de los cultivos encámaras de crecimiento estéril

Los cultivos in vitro deben incubarse en am -bien tes estériles, sin corrientes de aire paraevitar posibles fuentes de contaminación.

5.4. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN

Varias técnicas son empleadas para la esterili -zación de vidrieía, instrumentos, líquidos, ymaterial inicial de la planta. Dodds & Roberts,(1985), Pierik, (1987) y Roca & Mroginski(1991) indican que los métodos de esteriliza -ción pueden ser clasificados en métodos físi -cos y métodos químicos.

La destrucción o eliminación de los microor -ga nis mos puede realizarse por métodos físicoso químicos a través de los cuales se destruyetoda forma de vida microbiana, inclusive lasesporas bacterianas, empleando en cada casoun agente destructor de microorganismos(des infectante) específico, o la combinaciónde varios, logrando así las condiciones deausencia total de microorganismos (Melé,1992).

No existen instrucciones específicas relacio na -das con algún método de esterilización, sinembargo, existen algunas sugerencias genera -les relacionadas con los procedimientos.

5.4.1. Métodos físicos

a) Calor. La utilización y eficacia de este mé -to do, depende de dos factores: el tiempode exposición y la temperatura. Todos losmicroorganismos son susceptibles, en dis -tinto grado, a la acción del calor. El calorprovoca desnaturalización de proteínas,fusión y desorganización de las membra -nas y/o procesos oxidantes irreversibles enlos microorganismos.

Se puede usar en forma de llama directa,de calor húmedo (vapor) o de calor seco(aire caliente). Cuando se utiliza el calorhúmedo, puede ser en forma de vaporabierto o de vapor bajo presión (Dodds &Roberts, 1985, Pierik, 1987).

b) Calor directo. El calor directo o flameadose emplea para escalpelos, espátulas, pin -zas y otros materiales metálicos. Losinstru mentos deben ser colocados antes enalcohol etílico al 96% durante 2-3 minutosy luego pasarlos por el fuego. En laborato -rios con mayores recursos se utilizan en lascámaras de flujo laminar, equipos de calorcon perlas de vidrio, con una resistenciaeléctrica interior que permite esterilizar elinstrumental cuando el mismo se depositadurante algunos minutos.

c) Calor seco. El calor seco se emplea enestufas de aire caliente y es aceptable paramatar microorganismos por destrucciónoxi da tiva de los componentes celularesjugando un papel importante el contenidode agua de la célula.

La esterilización en estufas mediante calorseco o aire caliente es recomendable paraesterilizar recipientes de vidrio como pipe -tas, cápsulas petri y tubos. En estos casosse expone estos materiales durante 1 a 2horas en estufas a 180-200 ºC los cualesbrindan excelentes resultados (Mroginskiet al., 2004).

d) Vapor bajo presión (autoclave). El vaporbajo presión es un método eficaz para des -truir microorganismos (bacterias y hongos

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y sus esporas) causa la desnaturalizaciónirreversible de las proteínas y en conse -cuen cia, la muerte celular. Es usada paraesterilizar los medios de cultivo, agua des -ti lada y todo elemento capaz de resistir laselevadas temperaturas sin descomponerse.También se emplea para el material devidrio e instrumentos y para esterilizarmate rial contaminado antes del lavado(Biondi & Thorpe, 1981, Pierik, 1987,Roca & Mroginski, 1991).

El autoclave permite esterilizar los mediosde cultivo a una presión de 15 lb/pulg2 du -rante 20 minutos; a esta presión la tempe -ratura del vapor es aproximadamente121ºC, suficiente para matar virtualmentetodas las formas de vida en cinco minutos.

El tiempo requerido de exposición en elautoclave dependerá tanto del tipo delmaterial que se va a esterilizar como de sucantidad (Biondi & Thorpe, 1981; Pierik,1987). El tiempo mínimo recomendadopara esterilizar en autoclave medios decultivos y otros materiales es:

• Frascos con medios de cultivo de 25-50ml por 20 min a 121° C

• Frascos con medios de cultivo de 50-500 ml por 25 min a 121° C

• Frascos con medios de cultivo de 500-5000 ml por 30 min a 121° C

El tiempo de esterilización de la vidrieríano es crítico y generalmente es de 10-15minutos como tiempo mínimo, a 15lb/pulg2 (1 Kg/cm2) a 121º C. Losinstrumentos como pinzas, tijeras, mangosde bisturís, etc. o material de vidrio comocápsulas petri se envuelven en papel esta -ñado o en algún papel que aísle el materiala esterilizar del medio externo (papelsábana o papel madera), aunque tambiénpueden ser colocados en cajas metálicaspara someterlos a esterilización.

Es importante tomar en cuenta que atemperaturas elevadas durante y despuésdel periodo en el autoclave, en los medios

de cultivo puede ocurrir una serie de pro -ble mas como: la degradación de algunoscomponentes del medio, precipitación desales, descomposición de azúcares (D-glu -cosa, y D-fructuosa), pérdida de efectivi -dad de: las giberelinas en un 90%, delácido absícico, degradación de vitaminas:B1(tiamina), B12 (cyanocobalamina),ácido pantoténico, ácido ascórbico yantibióticos; además, el pH del medio bajade 0,3 a 0,5 unidades (Biondi & Thorpe1981, Pierik, 1987 y Boccon, 1989). Enestos casos es necesario conocer los com -ponentes termolábiles y se debe utilizarotro método de esterilización como lafiltración.

5.4.2. Filtración

La filtración se emplea en general para esteri -lizar algunos componentes termolábiles delmedio como: vitaminas, reguladores de creci -miento, antibióticos, etc., que son añadidosdespués al medio esterilizado en autoclave. Elmétodo de filtración o esterilización en fríoconsiste en usar una gran variedad de filtros,que son empleados para separar los micro or -ganismos de las soluciones. Los más adecua -dos son las membranas con una porosidadentre 0,22 y 0,4 micras, fabricados con ace -ta to y nitrato de celulosa, previamente esterili -zados. Estos filtros, dada su porosidad, sonespecíficos para evitar por completo el pasode todas las bacterias y microorganismos deltipo eucariótico (Dodds & Roberts, 1985,Pierik, 1987).

5.4.3. Rayos Ultravioleta

Los rayos ultravioleta (U.V.) más efectivosestán entre los 2.500-2.800 A. Con pocopoder de penetración en la materia y de ac -ción superficial. Son absorbidos fuertementepor las proteínas y los ácidos nucleicos; susefectos nocivos sobre las células se centran enla alteración de la sustancia nuclear.

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Las radiaciones ultravioletas tienen un ampliouso en el laboratorio para esterilizar cuartosde siembra. También pueden utilizarse paraeliminar microorganismos del aire y superfi -cies de trabajo. Sin embargo se debe tenercuidado a la exposición porque resultan serpeligrosos para el ser humano.

a) Métodos químicos. Los métodos químicosprovocan la pérdida de viabilidad de losmicroorganismos.

• Desinfectantes. Los desinfectantes quí -micos inhiben o destruyen los microor -ga nismos nocivos evitando su desarrolloen el material vegetal cultivado in vitro.Estos se utilizan para descontaminarma terial vegetal, mesas de trabajo,pisos, equipos y otros materiales delaboratorio.

Los principales factores que debenconsiderarse cuando se utilice unagente químico para matar o inhibir unmicroorganismo son (Hernández &Nápoles, 2000):

• Tipo de microorganismo.

• Acción del producto químico sobre eltejido o sustancia.

• Reacción del tejido o sustancia.

• Propiedades venenosas del agentequímico.

• Tiempo de que dispone el agentequímico para actuar.

• Concentración a la que debe serempleada el agente químico.

b) Desinfectante para superficies, pisos yma teriales de laboratorio. Los desinfectan -tes de uso común en laboratorio son:

• El formol comercial, el cual es una diso -lu ción acuosa del 27-40% de aldehídofórmico y una pequeña cantidad de

alco hol metílico. Una disolución acuosade alde hído fórmico a la concentraciónde 0,1-0,5% es antiséptica para la ma -yor parte de los microorganismos; a laconcentración de 5-10% es altamentegermicida (Hernández & Nápoles,2000).

• Alcohol al 70% para superficies, ma -nos, frascos, desde segundos a algunosminutos y al 96% para esterilizar instru -mentos por flameo.

• Hipoclorito de sodio e hipoclorito decalcio en concentraciones de 0,1 hastael 2% pa ra superficies desde 2 hasta30 minutos.

• Jabones y detergentes. Para manos ybrazos.

c) Desinfectantes para material vegetal.Antes de poner el material vegetativo encontacto con el agente desinfectante, sesumerge en alcohol (etanol) al 70% v/vdurante 15 a 30 segundos, con lo cual seelimina las grasas de las hojas y se permiteuna mejor penetración del agente desin fec -tante en los explantes.

Existen varios compuestos químicos que sepueden utilizar como desinfectantes paralos explantes (Cuadro 1). El hipoclorito desodio (NaOCl) contenido en productos deuso doméstico (Clorox, Lavandina y otros).Con menor frecuencia se usa el hipocloritode calcio Ca (ClO)2 y muy excepcional men -te el cloruro de mercurio (HgCl2), aunquehay que recalcar que este compuesto esaltamente tóxico y que no es fácilmenteremovible del explante (Dodds y Roberts1985, Pierik 1987, Bocón 1989; Roca &Mroginski, 1991).

A continuación se presenta la tabla dedesinfectantes mas comúnmente utilizados:

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En algunos casos resulta útil el agregar unagente tenso activo, por ejemplo Tween-20 oTween 80 (0,08 a 0,12% de concentración)que permiten bajar la tensión de la superficiede los explantes y permite un mejor contactocon los desinfectantes.

Después de tratar el explante con las solucio -nes desinfectantes, es necesario remover de éllos restos del producto mediante varios lava -dos con agua destilada previamente esteriliza -da. A pesar de la óptima desinfección de losexplantes, en algunos casos se observa la pre -sencia de microorganismos internos (bacteriasendógenas) dentro la planta, que representanun problema considerable para el estableci -miento in vitro.

Los antibióticos y fungicidas aplicados almedio de cultivo pueden ser de utilidad parala desinfección de los explantes. No obstante,mu chos autores coinciden que el empleo deéstos solamente se justifica en casos deexcep ción, y en cultivos de corta duración,ya que no previenen la proliferación de todoslos microorganismos. Además, talesproductos modifican la composición de losmedios de cul tivo y pueden sermetabolizados por los explantes. Asimismo,muchos son fitotóxicos para las plantas (Roca& Mroginski, 1991; Falkiner, 1996). Sinembargo, es importante recalcar que sólo encasos de contaminación persistente ofrecuente se deben acudir a los antibióticosen los medios de cultivo y no así como unapráctica rutinaria, es decir, la tenden cia aluso de químicos debe ser menor.

Entre algunos fungicidas que con frecuenciahan sido utilizados en diferentes laboratoriosse mencionan al Benlate (0,1%), Bavistín yCaptán. El procedimiento consiste en lainmer sión en cualquiera de las soluciones yenjuague en agua estéril.

Pollock et al. (1983) citado por Gratapaglia &Machado (1997), estudiaron más de 20 anti -bióticos en protoplastos de Nicotiana plum -ba ginifolia y concluyeron que los menos tóxi -cos son los betalactamatos: ampicilina, carbe -ce lina y cefalosporinas que son de amplioespectro y menos tóxicos en concentracionesmínimas. Los antibióticos del grupo de amino -glicosidos como: estreptomicina, neomicina,kanamicina y gentamicina son menos reco -men dables por su toxicidad.

Los antibióticos más utilizados contra bacte -rias son: Ampicilina (100 mg/l), Sulfato degentamicina (50 mg/l), Estreptomicina (100mg/l), y contra hongos: Anfoterín (2,5 mg/l),Nistatín (50 mg/l) (Hernández & Nápoles,2000).

En la actualidad han aparecido solucionesbio ci das que matan bacterias y hongos, pre -vie nen la germinación de esporas y a concen -traciones altas pueden eliminar las contami -na ciones de microorganismos endófitos. Unode estos compuestos es el PPM (PlantPreservative Mixture), (Mroginski et al.2004). Otro ejemplo es el denominado G-1desarrollado por el Centro de BioactivosQuímicos de la Universidad Central de lasVillas en Cuba, este producto es derivado delos furfurales de la caña de azúcar el cual

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Cuadro 1. Desinfectantes químicos usados en cultivo de tejidos vegetales

tiene la siguiente formula química: 1-(5-bromo fur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno. Estoscompuestos tienen las siguientes ventajas: 1)Efecto bactericida y fungicida de amplioespec tro, probado en los principales conta -minantes que se presentan en cultivo in vitro,en dosis que no sobrepasan los 35 mg/l. 2).No presenta efecto fitotóxico a las dosis quecontrola la contaminación en caña de azúcar,papa, banano, forestales y otros (Pérez et al.,1998).

5.5. MEDIOS PRÁCTICOS PARA ELCONTROL DE FUENTES DECONTAMINACIÓN

Algunas consideraciones mínimas de manejoy operación en laboratorio para evitar conta -minaciones son las siguientes:

• La verificación y control de todas las ope -raciones y tareas donde es probable la in -tro ducción de microorganismos incluyendoprincipalmente al operario mismo (Alvara -do, 1998).

• El orden y mantenimiento de regímenes delimpieza y de higiene en todos los localesde trabajo como pisos, paredes, puertas, yventanas, a fin de disminuir la carga micro -biana ambiental (Biondi & Thorpe, 1981).

• El mantenimiento de un ambiente estérildurante los trabajos de cultivo de tejidosvegetales, para evitar la contaminaciónmicrobiana y no utilizar tiempo valioso enla repetición de experimentos (Roca &Mroginski, 1991).

• La revisión periódica del estado técnico delos equipos y los locales de trabajo paralocalizar fisuras o aberturas por dondepueden penetrar los insectos y el polvo; siexistieran, éstos deben sellarse inmediata -mente.

• El empleo de guardapolvos, guantes ymás caras protectoras de la boca y de lanariz, así como gorros protectores decabellos. Estos ayudan a reducir los riesgos

de contaminación por el factor humano asícomo con el perfeccionamiento y respetode las medidas de asepsia, (Dodds &Roberts, 1985; Mroginski et al., 2004).

• Los frascos o tubos de ensayo que contie -nen el material limpio sellado con parafilmo bandas de film plástico.

• Desde un punto de vista práctico la mejormedida es descartar o autoclavar los fras -cos contaminados, si no es posible, se de -be realizar tratamientos curativos con anti -bióticos (Grattapaglia & Machado, 1997;Orozco, 2004).

• Aplicación de insecticidas o trampas en lossitios de entrada para el control de insectosy mantenimiento de una estricta higiene.Una forma práctica de utilizar antibióticoses humedecer pequeños trozos de papelfiltro previamente esterilizado en el antibió -tico, y a diferentes concentraciones. Unavez secos estos papeles, se los introduceen los medios de cultivo contaminadoshasta lograr el control definitivo de lasbacterias.

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6.1. INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo constituyen unelemento fundamental para el desarrollo delcultivo in vitro y en su mayoría estánconformados por una serie de componentesgenerales y específicos, cuya presencia yconcentración estará en dependencia delobjetivo que se persiga en su utilización(George, 1993 a).

El medio M&S (Murashige & Skoog, 1962) esconsiderado como el medio basal másutilizado en la regeneración de plantas puestoque es apto para el desarrollo de variasespecies, sin embargo, existen numerosasvariaciones comerciales de este medio queson utilizados de acuerdo al requerimiento delcultivo (Evans et al., 1984).

6.2. COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOSDE CULTIVO

Los medios de cultivo están conformados por:sustancias minerales (macro y micronu -trientes), vitaminas, aminoácidos, azúcares yreguladores de crecimiento. Estos mediospueden ser líquidos o tener un soporte sólido(George, 1993 a).

6.2.1. Sales minerales

a) Macronutrientes. Los macronutrientes sonconstituyentes esenciales para elcrecimien to de los tejidos vegetales debidoa que intervienen en la conservación delequi librio iónico en las plantas (Bengoa,1990).

Estos macronutrientes proveen los seiselementos indispensables: Nitrógeno (N),Fósforo (P), Potasio (K), Calcio (Ca),Magnesio (Mg) y Azufre (S). Laconcentración óptima de cada nutrientepara alcanzar la máxima tasa decrecimiento varía conside rablemente entreespecies y la finalidad del cultivo (DeFossard, 1984).

b) Micronutrientes. Los micronutrientesrepre sentan un papel esencial en losmecanismos enzimáticos como activadoreso cons tituyentes de las coenzimas. Losprin cipales micronutrientes son: Hierro(Fe), Manganeso (Mn), Zinc (Zn), Boro (B),Co bre (Cu) y Molibdemo (Mo). Algunosme dios contienen Cobalto (Co), Yodo (Y) yClo ro (Cl), aunque no son esenciales parael crecimiento (George & Sherington,1984).

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Capítulo 6Medios de Cultivo

Cecilia Ugarte, Carmen L. Villarroel, Gino Aguirre & María State

6.2.2. Reguladores de crecimiento

Se entiende por reguladores de crecimiento alas hormonas vegetales, las mismas que sonsintetizadas en un determinado lugar de laplanta y se translocan a otro donde actúan amuy bajas concentraciones, regulando elcreci miento, desarrollo o metabolismo delvege tal. El término “substancias reguladorasdel cre ci miento” es más general y abarca a lassubs tancias, tanto de origen natural comosintetizadas en laboratorio que determinanres puestas a nivel de crecimiento, meta -bolismo o desarrollo en la planta.

Las fitohormonas son las moléculasresponsables del desarrollo, aunque no sesabe bien cómo actúan en las células. Se sabeque su mecanismo de acción es porinteracción con un receptor específico (lasensibilidad de un tejido hace referencia a sunúmero de recep tores) y que su modo deacción, una vez reci bida la señal, es portransducción.

Se denomina nivel activo de una hormona alas formas que desencadenan respuestas. Esnecesario un control u homeostasis hormonal,el cual es importante para el control del creci -miento y la defensa ante situaciones eventua -les como cerrar constantemente los estomasen sequía. Para ello existen diversos mecanis -mos:

• Biosíntesis: es la fabricación de hormonaspara aumentar su concentración.

• Degradación catabólica: es la eliminaciónde las hormonas para conseguir el efectocontrario.

• Transporte: se trata de llevar hormonas dezonas de afloramiento a zonas de déficit ode transportarlas al lugar donde se nece -sita su acción.

• Conjugación: es la modificación de hor mo -nas (añadiendo azúcares o aminoácidosprincipalmente u otras moléculas de bajopeso molecular). Sirve como paso inicialen la degradación de éstas, para poder

almacenarlas, buscando su mayor eficaciaen el transporte o para inactivarlas.

• Compartimentación: sirve para aumentaro disminuir los niveles hormonales.

a) Auxinas. Scott citado por Krikorian (1991),menciona que son las primeras hormonasque se describieron. Su estructura es underivado del fenol o el indol, y tienenanillos aromáticos con dobles enlacesconjugados. Todas las auxinas son ácidos.No se sabe el modo de acción pero ésteestá relacionado directamente con suestructura, ya que si se modifica pierde sufunción. Las auxinas pueden ser naturaleso sintéticas, las principales son:

• Naturales:

Ácido indolacético (AIA)

Conjugados del AIA (glicoproteínas,pequeños péptidos)

• Sintéticas:

Derivados indólicos, ácido indolbutí rico(IBA)

Derivados del naftaleno: α−naftalé na cé -tico β-naftalénacético (αNAA, βNAA)

Derivados del fenoxiacético y del ácidobenzoico: 2,4 diclorofenoxia cético(2,4,D) y 2,6 diclorofenoxia cético(2,6,D). Ácido 4-amino-3,5,6-tricloro -pico linico (Picloram)

Efectos

• Crecimiento: estimulan la elongacióncelular en tallos y coleoptilos (tallosjóvenes), incrementan la extensibilidadde la pared celular y estimulan ladiferenciación del xilema y el floema.

• Tropismos: responsables del fototropis -mo y gravitropismo positivo de lasraíces (García et al., 2008).

• Dominancia apical: la yema apical deltallo inhibe el crecimiento de yemasaxilares cercanas.

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• Abscisión de órganos (hojas, flores yfrutos): posee un control genético y lasauxinas retrasan la caída, aunque eletileno la induce.

• Rizogénesis: estimulan la formación deraíces laterales o adventicias. Inhiben laelongación de la raíz principal. George(1993 b), señala que las concentracio -nes óptimas de auxinas varían de 0,1 a10 mg/l.

b) Giberelinas. Son hormonas que procedende una estructura química, no de unafunción concreta. Su estructura químicaderiva del ent-giberelano. Es un grupo dehormonas muy heterogéneo, son demuchas formas aunque pocas con función.Hay 130 distintas repartidas en distintosreinos y especies.

Todas son ácidos, y se denominan GAX,siendo x un número del 1 al 130 enfunción del orden de descubrimiento.

Efectos

• Estimulan el crecimiento de los tallos(elongación) e hipocótilos. Tienen unpapel mayor que las auxinas en plantascon crecimiento de entrenudos. En lareproducción estimulan la floración,sobre todo en aquellas plantas con flo -ración por factores ambientales o flora -ción del día largo como las coníferas.No son universales, en algunas especiespuede inhibir la floración (angiospermasleñosas y frutales). Producen parteno -car pia (reproducción sin fecundacióndonde el fruto se genera sin semillas).Tienden a producir plantas masculinasen especies dioicas. Provocan la rever -sión a fases juveniles de la planta. Pue -den suplir los fotoperíodos y los termo -pe ríodos necesarios para el crecimiento.

• La germinación es su principal efecto.Casi todas las semillas germinan indu -cidas por GA. Posibilitan la movilizaciónde reservas en la semilla. Sustituyenrequisitos ambientales (Zrÿd, 1988).

Roca (1997), menciona que el uso delAG3 ha demostrado ser bastante activo,en concentraciones óptimas de 0,01 a1 mg/l, debido a que niveles superioresa 1 mg/l son tóxicos para el desarrollodel explante.

c) Citoquininas. Son un grupo más reducidode hormonas que deben su nombre a sufunción (citoquinesis). En conjunto con lasauxinas estimulan la división celular.

Derivan de adeninas y las más frecuentesson:

• Naturales

La zeatina N6 (N6-4 Hidroxi, 3 metil, 2buteril), posee un doble enlace en elcentro de la cadena y tiene isómeros cisy trans que parecen ser formasnaturales. La zeatina puede estar en labase siguiente al 3’ del anticodón delARNt.

No purínicas como el Thidiazuron,(TDZ) y el CPPU N-(2-cloro-4-piridil)-N-fenil úrea. Estos compuestos tienenuna actividad histoquímica muy alta yson muy eficientes en la propagación invitro de las plantas maderables (DelSolar, 1985).

• Sintéticas

La quinetina (KIN), N6 Benzylaminopu -rina (BAP), N6benciladenina (BA), N6dimetil alil aminopurina (2ip) (Mejia,1994).

Efectos

• Crecimiento: en conjunto con lasauxinas, las citoquininas estimulan laproliferación de células meristemáticas,y también estimulan la expansión de loscotiledones tras el primer haz de luzque reciben George (1993 b).

• Dominancia lateral: estimulan el creci -miento de yemas laterales inhibiendo laapical (contrario a las auxinas, por loque deben estar en equilibrio).

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• Diferenciación y morfogénesis: provo -can cambios en la morfología según eltipo de crecimiento. Junto a las auxinasestimulan la formación de raíces ytallos.

• Senescencia: son anti-senescentes(García et al., 2006).

d) Ácido Abscísico. Históricamente se haconsiderado como un inhibidor. Se trata deuna molécula terpénica de 15 carbonos(sesquiterpeno) similar a los carotenoidespero con algunas particularidades.

Efectos

Estas hormonas proceden de la abscisiónde órganos vegetales, pero no es lacausan te de éste en el 90% de los casos.Es una hormona anti-estrés. Actúa contrael estrés hídrico provocando el cie rre deestomas. Contrarresta el efecto de laauxina, pero no inhibe el crecimiento en sí.También provoca el letargo de las yemas(en ese sentido sí es anti-crecimiento). Esesencial para la embriogénesis (formaciónde embriones viables). Evita la germina -ción prematura y por eso bloquea lasgiberelinas.

e) Etileno. Es la molécula C2H4, un hidrocar -buro insaturado liposoluble, capaz detranspasar la membrana celular. Es un gasvolátil a temperatura ambiente.

Efectos

Sus efectos fisiológicos son:

• En cuanto al crecimiento: Interviene enel desarrollo del síndrome de la triplerespuesta: el tallo se curva perdiendo elhábito geotrópico normal, se inhibe elcrecimiento en longitud de tallos y raí -ces, y los tallos engrosan (el etilenoaumenta el grosor de las células paren -qui máticas).

• Epinastia foliar: en la zona superior delos peciolos se produce una estimula -ción temporal del crecimiento. Forma -

ción del “gancho” en plantas dicotile -dóneas.

Estimula la elongación en tallos deplan tas aromáticas, ya que éstasnecesitan tener hojas fuera del mediorápidamente.

El etileno es una hormona de la absci -sión casi universal. La abscisión estácontrolada por la planta de forma pre -determinada. En el peciolo está la zonade abscisión, que con la acción de enzi -mas rompen las células provocando lacaída de las estructuras. Los frutos pue -den caer por otro fenómeno diferente ala abscisión. Acelera la senescencia entejidos vegetales. Es el responsable dela maduración de frutos climatéricos(to mate, manzana, aguacate, exceptoen cítricos), y de otros tejidos como lashojas, tallos y flores. En los tomatestrans génicos se inhibe la síntesis deetileno.

• Germinación: Estimula la germinaciónde semillas. En cuanto a las aplicacio -nes agrícolas destacan la inducción dela floración en bromeliáceas, la madu -ra ción controlada y el desverdizado (porejemplo los cítricos pierden el colorverde pero el fruto continúa inmaduro).

• Brotación: En tubérculos, contribuye aromper la dormancia de los mismos,favo reciendo la emisión de manerauniforme de los brotes para su siembra.

f) Poliaminas. Son compuestos policatiónicosderivados de aminoácidos, por lo que po -seen carga positiva, la misma que es ma -yor cuanto más grande es la molécula. Sonesenciales para la vida. Su concentraciónes 10 veces mayor que la de otras hormo -nas. Químicamente se parecen a las proteí -nas. Son muy heterogéneas, poseen tama -ños y cargas muy distintas. Las más gene -rales y comunes, en función de su númerode NH2, son:

• Diaminas: putrescina y cadaverina.

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• Triaminas: espermidina.

• Tetraaminas: espermina.

Efectos

Sus funciones son: mucha participación enla división celular, por lo que generalmenteabundan más en tejidos jóvenes.

Son esenciales para la morfogénesis(embriogénesis).

• Formación de raíces: Estabilizan lamembrana celular por ser proteínas.

• Retrasa la senescencia: al estabilizar lamembrana y al actuar con los ácidosnucleicos evitando la degradación deéstos. Intervienen en el estrés.

6.2.3. Agentes quelatos

López (1990) indica que son necesarios parala síntesis de la clorofila y en muchasfunciones de oxidación y reducción, pues soncompuestos cuyas moléculas son capaces deadsorber un ión de un metal.

Existen varios agentes quelatantes, pero elmás usado es el EDTA (Ácido EtilendiaminTetra Acético) por ser menos tóxico que otrosquelatos y, que en combinación conFeSO4·7H2O en bajas concentraciones, esti -mula el crecimiento permitiendo la dispo nibili -dad de hierro al cultivo (Gonzáles, 2004).

6.2.4. Carbohidratos

Margara (1988), señala que los tejidos invitro son organismos heterótrofos y por estarazón es indispensable añadir una fuente decarbono al medio de cultivo, como fuente deenergía y regulador osmótico.

La sacarosa es la fuente de energía másutilizada en cultivo in vitro, pero en ocasionesse emplean otros carbohidratos como laglucosa, fructuosa, galactosa y maltosa, peroestos compuestos son inferiores a la sacarosa,

que puede ser sustituida por azúcar comer -cial, llegándose a obtener óptimos resultados(Darias, 1993).

Hurtado & Merino (1994) indican que lasconcentraciones óptimas son de 2 a 3%, sinembargo, en ciertas especies se utilizanconcentraciones muy elevadas de 5 a 12%.

6.2.5. Vitaminas

Las vitaminas son utilizadas como catalizado -res en varios procesos metabólicos y son aña -di das al medio de cultivo para estimular pro -cesos de crecimiento específicos en los teji -dos, y no se excluye que la falta de alguna deellas pueda ser un factor limitante de los fenó -menos de organogénesis (Torres, 1988).

Para Murashige (1974) las vitaminas esencia -les para el crecimiento de células en plantassuperiores son:

• Tiamina es considerada la vitamina im -pres cindible en el cultivo in vitro para unbuen crecimiento del cultivo.

• Myo-inositol estimula el crecimiento ydivisión celular en muchas especiesvegetales con fines de micropropagación.La concen tración más utilizada es de 100mg/l.

Hartmann & Kester (1995), indican que otrasvitaminas también han demostrado tener unefecto positivo en el crecimiento in vitro yestas son: piridoxina (B6), ácido nicotínico(B3), pantotenato cálcico (B5), riboflavina,prolina y glicina.

6.2.6. Aminoácidos

El aporte de aminoácidos favorece la prolife ra -ción de callos, aunque cuando más se acudea los mismos es en las experiencias sobre laórganogénesis y en la multiplicación vegetati -va “in vitro”. Las mezclas de aminoácidosparecen también presentar efectos sinérgicosestimulando fuertemente la proliferación de

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callos y la órganogénesis. Los efectos obteni -dos mediante el aporte de aminoácidos pare -cen muy variables según la especie y el tipode morfogénesis estudiada. Hasta el momentono es posible establecer una regla general(García et al., 2008).

6.2.7. Potencial osmótico

Algunas especies propagadas in vitro presen -tan diversos desórdenes fisiológicos, como lahiperhidratación, debido entre otros factores ala alta humedad relativa en los recipientes.Por ello es importante conocer el potencialosmótico del medio de cultivo en función de laconcentración de solutos (Cardenas &Villegas, 2002).

Morard & Henry (1998) citados por Mollinosda Silva et al. (2004) mencionan que elpoten cial osmótico del medio de cultivo tieneefecto directo en los explantes; conforme seamás negativo, menor será la absorción deagua y, por consecuencia, se dificultará lamultiplicación de brotes axilares por la bajadisponibilidad de los nutrientes del medio. Lacomposición mineral de los medios de cultivoresulta fundamental, ya que tiene un efectodecisivo en el potencial osmótico y el pH delmedio, así como en la nutrición de losexplantes.

En este sentido, George (1993 a) señala quelas células mantenidas en un ambiente conbajo potencial osmótico pierden agua ydisminuyen su potencial hídrico, alterando sumorfogénesis. Por otra parte, Pierik &Steegmans (1975) citados por Mollinos daSilva et al. (2004), indican que el crecimientoy organogénesis de los explantes se detienencuando el potencial osmótico es más negativoque -0,3 MPa debido a la baja absorción deagua.

6.2.8. Estabilizadores osmóticos

Todos los medios de cultivo de protoplastoscon tienen estabilizadores osmóticos, conoci -

dos simplemente como osmóticos. Presentanen los protoplastos diferentes niveles óptimosen relación con la presión osmótica y con eltipo de omótico empleado, si se cultiva enmedios no óptimos osmoticamente, es posibleque haya un estrés celular y, como resultado,una baja eficiencia del cultivo. Los más comu -nes son el manitol, el sorbitol, la glucosa y lasacarosa (Takeuchi et al., 1982; Vardi et al.,1982; Smith et al., 1984; citados porSzabados, 1991).

6.2.9. Suplementos no definidos utilizadosen la composición de medios decultivo

Existe una lógica bien documentada tras eluso de sustancias líquidas como el agua decoco que se encuentran en forma natural. Conel uso individual de estas sustancias se obtie -ne poco efecto por encima del esperado, pare -ce que las sustancias de esta naturaleza pue -den desempeñar un papel pequeño pero signi -fi cativo en la estimulación del crecimiento enlos tejidos de explantes, mediante la divisióncelular (Nitsch, 1962; Lee et al., 1965;Paulet, 1970 citados por García et al., 2008).

Se puede anticipar que los investigadores enlos trópicos y subtrópicos tendrán acceso auna gama de líquidos estimuladores del creci -miento que son de origen novedoso, distinti -vos o incluso morfológicamente únicos(Steward, 1959; Shantz, 1966; citados porGarcía et al., 2008).

Después de que Gautheret observó que elextracto de levadura tenía efectos sobre lascélulas cultivadas in vitro, muchos investiga -do res empezaron a buscar sustancias orgá -nicas que pudieran ejecutar algún efectomorfogenético (García et al., 2008).

6.2.10. Carbón activo

El carbón activado presenta cargas residuales,que son capaces de absorber las sustancias

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fenólicas excretadas por el explante, normal -mente el carbón activo es prelavado antes deser incorporado al medio de cultivo y las con -cen traciones varían de 0,1 a 5% (Gonzáles,2004). Pierik (1990), describe los siguientesefectos del carbón activo:

• Efecto favorable sobre el crecimiento en(Annona cherimolia), debido a laabsorción de sustancias tóxicas excretadaspor el explante en el proceso de la síntesisfenólica.

• Efecto favorable al desarrollo de raícesdebido al oscurecimiento del medio encaña de azúcar.

• Efecto inhibidor sobre el crecimiento debi -do a la absorción de reguladores del creci -miento (auxinas, citoquininas) contenidasen el medio (aspecto que no está compro -bado).

En la práctica parece que el carbón activopuede proporcionar resultados positivos enalgunos casos, mientras que en otros promue -ve efectos desfavorables tales como la inhibi -ción del sistema radicular en el almendro ymortandad prematura en explantes delmelocotonero (Lane, 1982).

6.2.11. pH

Quak (1977) señala que el pH es un factorlimitante para el crecimiento y desarrollo delos explantes, el rango óptimo de pH fluctúade 5 a 6 debido a que las sales se encuentranen forma soluble, valores superiores a 6presentan problemas de precipitación denutriente y valores inferiores a 3,5 manifiestanmala gelificación.

6.2.12. Modificación del Potencial Redox

La adición de sustancias antioxidantes almedio nutritivo o el lavado de los tejidos enantioxidantes son los métodos más utilizadospara la reducción del Potencial Redox (López,2000). A continuación se detalla una lista de

antioxidantes utilizados en el cultivo detejidos:

• Ácido cítrico y ascórbico. Son los antioxi -dantes más utilizados en cultivo in vitropa ra evitar la oxidación de tejidos, son so -lu bles en agua, las concentraciones ópti -mas oscilan de (1 a 10 mg/l) en ácido as -cór bico y (50 a 100 mg/l) en ácido cítrico(Dublín s/f, citado por Roca & Mrogniski,1991).

• (PVP) Polyvinilpolypyrrolidona. Es un polí -mero sintético soluble en agua muy utiliza -do en cultivo in vitro por sus cuali dadesantioxidantes (Vellilla, 2002).

• L–Cisteína. Gonzáles (2004) indica que laL - Cisteína es considerada como un agen -te reductor que absorbe los compuestosfenólicos excretados por el explante.

•Tocoferol. Druart (1987) menciona que lavitamina E, actualmente es utilizada comoun excelente antioxidante y vitamina parala propagación de una gran variedad dePrunus. Así mismo Badia (1982) citadopor Seilleur (1989), indica que el Tocoferoles utilizado como antioxidante para lapropagación in vitro de diversas especiesleñosas.

• Pycnogenol. El Pycnogenol es un antioxi -dante natural elaborado a partir de la cor -te za de Pinus maritima, que contiene unacombinación de flavonoides que aparecende forma natural y en pequeñas cantidadesen algunas frutas y verduras (Packer &Rimbach, 1999). Vargas (2004), citadopor Sánchez (2006), menciona que estecompuesto es un antioxidante que reducela oxidación significativamente en elestablecimiento de especies forestales.

6.2.13. Material de soporte

a) Medios sólidos. Los medios líquidos sonlos medios de cultivo que llevarán distintoscomponentes que tienden a solidificar yman tener el material cultivado en la super -

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ficie. La selección de un agente gelificantepara las plantas específicas es general -men te empírica y por razones desconoci -das, los tejidos de algunas especies crecenmejor en algunos gelificantes que en otros(Orellana, 1998).

El agar es el material de soporte más utili -zado en el cultivo de tejidos por proveer almedio de un excelente gel húmedo, sinembargo, fisiológicamente no es inerte(Hurtado & Merino, 1994).

Villegas (1988) indica que el phytagel® esproducido en laboratorio, se caracteriza porser uno de los gelificantes con menor por -cen taje de impurezas, de textura fina y decalidad más consistente que la mayoría delos agares, facilita la detección de cual -quier agente contaminante por su aparien -cia cristalina. Sigma-Aldrich (2003-2004)señala que el phytagel es un gel de alta-fuerza, de textura fina descolorida, con0,85% de Calcio, 0,35% de Magnesio,1,70% de Potasio, 0,15% Fósforo y0,45% de Sodio, minerales que facilitan eldesarrollo del cultivo.

Pérez & Claure (2004), mencionan que elagente gelificante más económico hastaahora probado en los laboratorios localeses la carragenina, el mismo se obtiene dealgas rojas como principal fuente(McHugh, 2002). Su uso en el Laboratoriode cultivo de tejidos de la FCAyP abarataen un 35% el costo del gelificante (Calle etal., 2006).

b) Medios líquidos. Los medios líquidos sonuna alternativa interesante para cultivarexplantes in vitro. Con ayuda de un agita -dor el medio de cultivo está constante men -te homogeneizado y, lo que es más impor -tante, oxigenado. Estas condiciones pue -den superar algunas limitantes del mediosólido; sin embargo, puede a su vez suce -der una mayor susceptibilidad de losexplantes a vitrificarse.

Al momento de utilizar medios líquidos, sepuede colocar el explante sobre un puentede papel filtro que permanece en contactodirecto con el medio líquido, generalmenteeste tipo de medios es utilizado en espe -cies con problemas de oxidación (Mejia &Vittorelli, 1996).

6.2.14. Agua

En la micropropagación comercial, rutinaria -mente se usa agua destilada común, peropara los estudios de investigación se requiereformas más puras: desionizada, bidestilada(Hartmann & Kester, 1995).

Normalmente, se recomienda que el agua seadesionizada, además de estar destilada encondensador de vidrio.

6.3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DECULTIVO

6.3.1. Conceptos básicos para lapreparación de soluciones

El cultivo de tejidos vegetales in vitro es unatécnica basada en la capacidad que tiene unacélula vegetal de regenerarse en una plantacompleta, idéntica a la planta madre, bajo unmedio artificial que posee la mayor parte delos componentes que normalmente estaplanta extrae del suelo y del medio ambiente,ello para poder regenerarse y desarrollarse.

Siguiendo el mismo concepto, el éxito del cul -tivo de tejidos in vitro radicará básicamenteen la cantidad balanceada de nutrientes quese le brindará a la planta, por lo que una ade -cuada preparación de los medios artificialesen los cuales crecerá el explante, es una con -di ción determinante para lograr los objetivosque plantea esta técnica. Por otra parte, sibien el trabajo de laboratorio tiene mucho deagradable, resulta ser peligroso si no se tomanlas precauciones necesarias. Una primeraregla para un adecuado trabajo en laboratorioes el de conocer los reactivos químicos, así

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como un cuidadoso manejo del material delaboratorio, ya que la mayoría es de vidrio.Dada la característica del presente libro, diri -gi da principalmente al componente estudian -til, se ha incorporado en el Anexo I algunosconceptos básicos para la preparación desoluciones y un breve recordatorio referente ala preparación de las mismas.

6.3.2. Precauciones en el laboratorio

• Nunca dirigir un tubo de ensayo conlíquido hirviendo hacia el vecino, puedecausarle daño.

• Nunca forzar un tubo de ensayo dentro deun tapón empujando por el extremosuperior; usar la parte inferior y girarlo amedida que empuje.

• Nunca calentar una botella o una probeta.

• Siempre oler una sustancia, llevando vapo -res de ella suavemente hacia la cara.

• Nunca echar agua en un ácido concen tra -do, el calor generado puede salpicar o rom -perse el recipiente. Se vierte el ácido fuertesobre el agua, lentamente agitando cons -tan temente.

• La limpieza del equipo se hace utilizandoagua y detergente, pero si eso no resulta,se puede utilizar ácido nítrico diluido ocon centrado y si aún esto no diera resulta -do, se puede emplear la mezcla sulfocró -mi ca (60 g dicromato de Potasio K2Cr2O7y 300 cc ácido sulfúrico H2SO4 GN). Setie ne que manejar con mucho cuidado estamezcla sulfocrómica porque es muycorrosiva.

6.3.3. Preparación de soluciones madre

Un número importante de sustancias y algu -nas veces una mezcla de las mismas son adi -cionadas al medio de cultivo. Las concentra -ciones de sustancias particulares pueden serdadas en diferentes medidas (Pierik, 1987).Si cualquier solución precipita no poseerá elequilibrio químico correcto porque algunos

ele mentos se quedan en el precipitado.Ninguna solución precipitada puede ser usadade una manera efectiva por las plantas. Paraevitar la formación de precipitado, cuando sepreparan soluciones existen dos alternativasque pueden seguirse: 1) combinar sólo com -ponentes que no forman el precipitado a altasconcentraciones o, 2) preparar sólo solucionesbastante débiles que no formen precipitado(Kyte, 1987).

Por otro lado se podrían pesar las cantidadesnecesarias de todos y cada uno de los compo -nentes del medio. Ello, no obstante, sería unaoperación larga y tediosa, además de muyimprecisa puesto que obligaría a pesar algu -nas cantidades muy pequeñas. Por todas esasrazones, es una práctica habitual en todos loslaboratorios preparar soluciones stock concen -tradas de los distintos componentes, agrupa -dos de forma que no se produzcan fenómenosde precipitación. Proceder de esa forma sim -pli fica la preparación del medio: un medio co -mo el MS, que contiene un total de 20 subs -tancias diferentes, requeriría otras tantas pe -sa das, mientras que a partir de solucionesstock su preparación se reduciría a cuatromedidas de volumen y una pesada (sacarosa).Las soluciones stock pueden mantenersedurante un cierto tiempo en la nevera o en elcongelador.

Para una correcta preparación de lassoluciones stock se debe:

• Pesar los componentes en una balanza deprecisión.

• Asegurarse que el material que entrará encontacto con los componentes de las solu -ciones se encuentra perfectamente limpio.En caso de duda, lavarlo y hacer un últimoenjuague con agua destilada para retirarlos restos de las sales minerales del aguacorriente.

• Mezclar los componentes con la ayuda deun agitador magnético.

• Una vez obtenida la solución stock, etique -tar el recipiente que la contendrá indicando

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qué tipo de solución es, su concentración,la fecha en que se preparó y la persona quela hizo.

6.4. PREPARACIÓN DEL MEDIO DECULTIVO

Medir el volumen deseado de las solucionesstock (macro, micronutrientes, quelatos, vita -minas y otros componentes). Para ello, (AnexoII) se realizan cuatro soluciones stock basepara la preparación de medio: 1) una de ma -cro nutrientes, 2) una de micronutrientes, 3)una de hierro con un agente quelante, 4) otrade vitaminas y mioinositol; así como con solu -ciones específicas para los demás componen -tes del medio (reguladores de crecimiento,etc.). Éstas pueden mantenerse durante uncierto tiempo en refrigeración o congeladas(Blanco, 2008).

6.4.1. Ajuste de pH

Una vez obtenido el volumen de medio desea -do, completado a volumen con agua destila -da, se procede a ajustar su pH al valor prefija -do mediante la adición de OHNa y/o HCl 0,1-1 N, para subir o bajar el pH respectivamentehasta obtener el deseado (Hartmann & Kester,1995).

La adición del gelificante dependerá si el me -dio a preparar será un medio sólido o un me -dio líquido. Se añadirá en el primer caso elagente solidificante y se fundirá por calenta -miento breve, utilizando horno a microondas oen estufa con agitador.

6.4.2. Adición de la fuente de energía

Se añade junto con el agar diluyéndolo porcalentamiento.

6.4.3. Cantidad y distribución del medio

En el caso de medios sólidos, una vez fundi -dos por calentamiento, éstos deben ser dosi -

ficados en los recipientes escogidos. En el ca -so de medios líquidos se procederá a dosificardirectamente en los frascos escogidos. Tantosi es un medio sólido como líquido, se proce -derá inmediatamente a autoclavar los conte -ne dores con el medio15. Para evitar inconve -nientes durante el proceso de esterilización, serecomienda no cerrar con fuerza los frascoscon tapa a rosca.

6.4.4. Esterilización del medio

La esterilización se realiza en un autoclave auna temperatura de 110 a 120°C, por 20minutos a 15 lb/in2 de presión. Se debe tenercuidado de que la presión del autoclave,nunca rebase las 20 lb/in2, ni esté por debajode las 15 lb/in2. Transcurridos los 20 minu -tos, se desconecta el autoclave. Se abre muylentamente la válvula para liberar el vapor pa -ra que la presión comience a bajar. El autocla -ve puede abrirse únicamente cuando el manó -me tro marque cero (Hartmann & Kester,1995).

Conviene tener en cuenta que algunos de loscomponentes del medio de cultivo pueden sertermolábiles (algunas vitaminas, reguladoresde crecimiento y diversos componentes orgá -ni cos). En este caso, la esterilización de lasolución que contiene la substancia termolábildebe hacerse por filtración y añadirse una vezesterilizada al medio de cultivo previamenteesterilizado y parcialmente (en medios sóli -dos) o totalmente (en medios líquidos)enfriado.

6.4.5. Vida de anaquel del medio

El medio debe usarse en el transcurso de unasdos semanas, y refrigerarse si se conserva pormás tiempo (Hartmann & Kester, 1995).

En el siguiente diagrama, se ilustra el flujo delproceso de preparación de un medio de culti -vo a partir de soluciones stock (Figura 1).

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15 http://www.etsea2.udl.es/invitro/presolst-htm

En el Laboratorio de Biotecnología de laFacultad de Agronomía, la preparación de losdiferentes medios de cultivo se iniciaelaborando las soluciones stock, las mismasque se realizan de acuerdo a protocolos yaestablecidos en el Laboratorio de Fitopatologíade la Faculté des Siences Agronómiques deGembloux. Las soluciones stock se presentanen el Anexo II.

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7.1. LA PROPAGACIÓN VEGETATIVA INVITRO

La propagación vegetativa in vitro, tambiéndenominada micropropagación, es indiscuti -ble mente la aplicación más concreta del culti -vo de tejidos y la de mayor impacto. Consisteen reproducir plantas conformes a la plantamadre por la estimulación de capacidades na -tu rales de multiplicación vegetativa de la es -pe cie o por la inducción de una nueva organo -gé nesis de brotes y raíces. Los objetivos de lamicropropagación son los siguientes (Auge etal., 1982):

• Adquisición de una gran velocidad de mul -ti plicación y de propagación de “plantasidénticas” a la planta de inicio.

• Constitución de una colección de pies ma -dres. Las técnicas de cultivo in vitro permi -ten efectivamente almacenar sobre peque -ñas superficies, grandes cantidades de“microplantas” que serán utilizadas comopies madres.

• Recuperación de especies en vía deextinción.

Hace algunas décadas, los trabajos concultivo de tejidos tenían como objetivo laregeneración de plantas a partir de cultivo deápices caulinares. Estos estudios buscabanestablecer una mejor comprensión de la fisio -

lo gía del crecimiento de regiones aisladas sinla interferencia de los efectos correlativos delresto de la planta y de influencias del medioambiente (Grattapaglia & Machado, 1997).

Este método toma todo su interés en la multi -pli cación masiva de plantas en condicionesestériles, a partir de plántulas provenientes demeristemas y reconocidas como sanas, por lotanto, salvo de contaminaciones. La tasa demultiplicación es muy elevada, de miles poraño, lo que permite lograr al horticultor y a losviveristas un producto de calidad y en grancantidad en un lapso de tiempo muy corto.

La primera aplicación comercial de la micro -propagación fue hecha por Morel (1960), almultiplicar orquídeas a través de ápices cauli -nares y de la regeneración de protocormos, di -minutas estructuras que se diferenciaban yda ban origen a embriones. La sucesiva divi -sión de estos protocormos aceleraba la propa -gación de orquídeas (Dodds & Roberts,1990). Posteriormente se aplicó comercial -men te en fresas y gerbera con resultados muyalentadores así como en árboles frutales (cere -za, manzano, duraznero). Los cultivos in vitropermiten la posibilidad de mantener las plán -tu las sanas bajo forma de miniaturas (en tu -bos o frascos). Ellas se conservan así sin cui -da dos particulares durante algún tiempo (4-6semanas), sin riesgo de contaminaciones y sinperder su capacidad de multiplicación rápida.

Capítulo 7Micropropagación de plantas

Carmen L. Villarroel Vogt & Ximena Cadima

De este modo las técnicas in vitro (cultivo demeristemas, micropropagación y conservaciónin vitro), se complementan una con otra. Esun hecho que ya por los años ochenta, estastécnicas revolucionaron los métodos clásicosde producción de plantas (Augé et al., 1982).

La utilización de la micropropagación a nivelcomercial se hizo realidad en diversos paísesdel mundo, destacándose los de Europa occi -den tal y EEUU. Los laboratorios comercialessurgían en su gran mayoría, asociados a vive -ros como iniciativa de las propias compañíastradicionalmente productoras de plantas. Ellastrabajaban con el objetivo de satisfacer lasnecesidades internas de material de propaga -ción libre de enfermedades, o para acelerarlos métodos convencionales de propagaciónvegetativa. Un menor número de compañíastrabaja con la producción de plantas in vitropara el abastecimiento de viveros de terceros(Grattapaglia & Machado, 1997).

En Bolivia, la aplicación comercial de la mi -cro pro pagación es relativamente reciente, conalgunos grupos trabajando en universidades einstituciones de investigación. En la actuali -dad, la actividad comercial de la micropropa -ga ción se concentra principalmente en la lim -pieza viral y la consecuente multiplicación deespecies ornamentales herbáceas y arbusti -vas. En segundo plano se encuentran las leño -sas, destacándose los portainjertos de frutalesde clima templado y árboles élite de rápidocrecimiento.

El objetivo de este capítulo es la descripcióngeneral del proceso de micropropagación ypretende brindar al lector las bases generalesde este proceso; recomendaciones específicasno son posibles ya que la literatura disponiblees bastante extensa y las variaciones presen -ta das son innumerables.

7.2. PRINCIPALES APLICACIONES

El conocimiento de los factores que afectan ala multiplicación vegetativa, así como las faci -

li da des existentes actualmente para su con -trol, han incrementado el uso del sistema demicropropagación. Sin duda la gran aplicaciónpráctica de las técnicas de micropropagaciónse encuentra en la producción comercial agran escala de plantas, posibilitando su multi -plicación rápida y en períodos de tiempo yespacio físico reducido. La micropropagaciónha sido usada con éxito, no sólo en plantas dereproducción vegetativa, sino también enotras especies de semilla recalcitrante oleñosa donde el tipo de reproducción es difícil(Grattapaglia & Machado, 1997; Villalobos &Thorpe, 1991).

Asociada a la actividad del viverista, la propa -ga ción masiva vía cultivo de tejidos ha tenidoun éxito comercial. En Bolivia por ejemplo,exis ten programas bien establecidos deproducción de semilla de papa de alta calidadutilizando plántulas in vitro como material deinicio.

Las técnicas de micropropagación, se ade -cúan a programas de introducción, almacena -miento e intercambio de germoplasma, contri -buyendo a prevenir la pérdida de variabilidadgenética. Una descripción detallada de lasme to dologías de conservación se encuentraen el capítulo 9.

Como técnica de propagación rápida y a granescala, la micropropagación ha encontradouna particular aplicación en programas demejoramiento genético, haciendo tambiénviable la propagación vegetativa de especiesque en condiciones naturales normalmente sereproducen por semillas (Grattapaglia &Machado, 1997).

7.3. TIPOS DE MULTIPLICACIÓN INVITRO

Conforme el explante es utilizado y subse -cuen temente manipulado, la micropropaga -ción puede ser conducida de las siguientestres maneras: 1) multiplicación a través de laproliferación de yemas axilares; 2) multiplica -

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ción a través de la inducción de yemas adven -ticias y 3) multiplicación a través deembriogé ne sis somática (Grattapaglia &Machado, 1997).

7.3.1. Multiplicación a través de la prolife -ración de yemas o brotes axilares

Este método de multiplicación incluye a lamayoría de los sistemas de micropropagaciónincluyendo el aislamiento de órganos meriste -máticos pre-formados (normalmente yemasaxilares) y la quiebra de la dominancia apicalcon la aplicación de citoquinina exógena. Lasyemas axilares que naturalmente se formanen las inserciones de las hojas son estimula -das a crecer, dando origen a partes aéreasnue vas, que a su vez, repiten el mismo proce -so. Estas pueden ser subdivididas en conjun -tos menores, o en brotes individuales para laformación de nuevos explantes; ejemplos deespecies que responden a este tipo de multi -pli cación son el banano, la frutilla y especiesleñosas entre otras. Si la especie presenta na -tu ral mente una gran capacidad de formaciónde hojas y un rápido elongamiento del tallo,como ocurre en la papa o en el yacón, no esnecesaria la quiebra de la dominancia apical,y buenas tasas de multiplicación puedenigual mente ser obtenidas por la simple sub-división del tallo en diversos segmentos noda -les, cada uno conteniendo una yema axilar.Las partes aéreas producidas son enseguidaenraizadas y transplantadas.

7.3.2. Multiplicación a través de lainducción de yemas adventicias

Las yemas adventicias son aquellas originadasen lugares diferentes de aquellas donde seforman en el curso del desarrollo normal de laplanta. Esta formación ocurre de manera di -rec ta o indirecta. La organogénesis directa, serefiere al surgimiento directo de yemas a partirde tejidos que presentan potencial morfogéni -co en la planta in vivo, pero que en general,no se expresa. Estos tejidos incluyen el

cambium vascular, la base del pecíolo en lasdicotiledóneas, la base de las hojas y esca masen bulbos de monocotiledóneas y seg men tosde raíces, entre otros. Un ejemplo claro es lavioleta africana, donde el cultivo puedeiniciarse a partir de segmentos de hoja.

La organogénesis indirecta ocurre cuando elproceso de regeneración de yemas es precedi -do por la formación de callo. A partir de célu -las no organizadas del callo, surgen yemasadventicias que crecen y se desarrollan ennue vas partes aéreas. Las multiplicacionessucesivas pueden darse ya sea por la subdi vi -sión del callo y mantenimiento de un sistemaadventicio, o alterándose el proceso para laproliferación axilar sin pasar por la fase decallo. Sea cual fuera el modo, las partesaéreas producidas son individualizadas,enraizadas y trasplantadas.

7.3.3. Multiplicación a través deembriogénesis somática

La embriogénesis somática es la formación deembriones por la vía asexual. En condicionesin vitro, es factible diferenciar embriones apar tir de células tanto del esporofito como delgametofito (Villalobos & Thorpe, 1991). Laembriogénesis puede también ser directa oindi recta. La gran mayoría de los sistemas deembriogénesis somática se da por la vía indi -rec ta, donde los callos embriogénicos son in -du cidos y mantenidos a lo largo de la multipli -ca ción. Embriones somáticos son formados enla superficie del callo. Alternativamente, estoscallos, generalmente obtenidos en medio só li -do, pueden dar origen a cultivos de células ensuspensión a partir de las cuales se forman losembriones. Los embriones somáticos puedentambién formarse directamente sobre lasuperficie del explante sin pasar por la fase decallo, como en el caso del tejido del nucelo encitrus, que tiene un gran potencial embriogé -nico natural (Kochba & Safran, 1972). Desdeel punto de vista del potencial de multiplica -ción y el costo, la embriogénesis somáticapre senta una enorme ventaja sobre otros

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siste mas de micropropagación. Grandescantidades de embriones pueden formarse ensuspensiones de células embriogénicas conun mínimo de manipulación manual y espaciofísico de laboratorio, principales componentesdel costo de una planta micropropagada.Actualmente son utilizados bioreactoresdiseñados especialmente para el cultivo decélulas vegetales en suspensión, con miras ala propagación por embriogénesis somática(Castro et. al., 2002).

Todas estas vías de multiplicación, presentanventajas y problemas desde el punto de vistadel potencial de multiplicación y la fidelidadgenética del material propagado. En compara -ción con la embriogénesis somática, el cultivode partes aéreas presenta la desventaja derequerir mayor manipulación, pues partesaéreas de raíces son formadas en fases distin -tas. Además de eso, el espacio físico de labo -

ra torio para mantener el crecimiento de lasplan tas es mucho mayor. Sin embargo, el ca -mino de la proliferación de yemas axilares esgeneralmente preferido para la micropropaga -ción ya que este sistema es más fácilmentecontrolado y presenta una fidelidad genéticamuy alta.

Apices caulinares, yemas axilares y meriste -mas aislados son los explantes más indicadosen la propagación clonal in vitro. Ellas poseendeterminación para el crecimiento vegetativo yse desarrollarán naturalmente en plantas en -te ras si satisfacen sus necesidades nutriciona -les. No se observaron variaciones en plantasregeneradas de cultivos iniciados a partir deápices caulinares y multiplicados por prolife -ra ción axilar. En la Figura 1, se hace unaesque matización de los tipos de multiplica -ción in vitro.

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Figura 1. Tipos de multiplicación in vitro

7.4. FASES DE LAMICROPROPAGACIÓN

El éxito de un sistema de micropropagacióndepende del control de un gran número devariables, no solamente de la composición delmedio de cultivo, como normalmente se cree.El verdadero desafío, se encuentra en el mate -rial vegetal (genotipo) y en la manipulacióndesde antes de aislar el explante inicial y entodos los pasos hasta el trasplante de la plan -ta producida. Esta manipulación incluye elmanejo de la planta madre, las característicasdel explante utilizado, el procedimiento decul ti vo adoptado, las condiciones ambientalesy microambientales dentro del frasco de culti -vo y el trasplante. Todas estas etapas soninfluenciadas por diversas variables imponde -rables, que frecuentemente restringen la repe -ti ción de los resultados, dificultando la deter -minación de un protocolo efectivamentecomer cial de micropropagación.

El rápido progreso de las técnicas de micro -propagación se dió en la década de los seten -ta, gracias a la contribución de los trabajos deMurashigue (1974), quien subdividió el pro -ce dimiento en tres fases: fase I, estableci -mien to; fase II, multiplicación y fase III, enrai -za miento (Villalobos & Thorpe, 1991;Grattapaglia & Machado, 1997). Posterior -men te se consideró una cuarta fase más comoparte del proceso, la aclimatación. Todasestas fases serán presentadas a continuación,cabe resaltar que son posibles innumerablesmodificaciones e innovaciones de acuerdo a laespecie, las facilidades disponibles para eltrabajo, la iniciativa y la creatividad.

7.4.1. Fase 1: Establecimiento

El objetivo de esta fase es obtener un cultivoaséptico de la especie que se quiere multipli -car. El establecimiento, incluye la selecciónpre via del explante más adecuado, su desin -fección y la siembra en condiciones asépticasen medio de cultivo. Esta Fase termina con laobtención de un cultivo libre de contaminacio -

nes visibles y suficientemente adaptada a lascondiciones in vitro, de modo que pueda pre -sentar una reacción favorable a la aplicaciónde fitorreguladores en la fase siguiente(multiplicación).

a) Selección del explante. Diversos explantespueden ser utilizados para iniciar la propa -gación in vitro de una planta. En la selec -ción de los explantes debe considerarseaspectos como el nivel de diferenciacióndel tejido utilizado y la finalidad de micro -pro pagación. Teóricamente cualquier tejidopuede ser utilizado como explante, en vistade la totipotencia de las células vegetales.Sin embargo es importante considerar eltipo de explante, la edad fisiológica de laplanta madre y el estado sanitario.

• Tipo de explante. En la práctica, se de -be procurar utilizar explantes que con -ten gan mayor proporción de tejido me -ris temático o que tengan mayor capaci -dad de expresar la totipotencia. Yemasapicales normalmente presentan mayorcapacidad de crecimiento que las ye -mas axilares, que se encuentran bajoefecto de la dominancia apical. Esto escomún en plantas herbáceas ornamen -tales, mientras que lo contrario, engene ral es válido para especies arbóreas(Grattapaglia & Machado, 1997).Murashigue (1974) observó que la ca -pa ci dad de producción de partes aéreasde tabaco decrece, cuando la distanciaes mayor con relación al ápice. Sinembargo, puede ocurrir lo contrario,dependiendo de la especie.

• Edad fisiológica de la planta madre oplanta donadora del explante. El estadofisiológico de la planta de donde seextraen los explantes tiene gran influen -cia en el posterior comportamiento delos cultivos (Villalobos & Thorpe,1991). La primera consideración es elestado nutricional de la planta y la fasede crecimiento en que se encuentra.Plantas bien nutridas, sin síntomas dedeficiencia nutricional o hídrica, en

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gene ral, donan mejores explantes. Serecomienda también utilizar explantescolectados de regiones meristemáticasjuveniles. Diversas prácticas son adop -ta das para obtener brotaciones juveni -les o promover el rejuvenecimiento detejidos adultos. La más común es lapoda drástica, rompiendo la dominan -cia apical y estimulando el desarrollo deyemas.

• Estado sanitario. El estado sanitario dela planta madre es un factor importanteque irá a determinar la facilidad de des -contaminar el explante durante el aisla -miento. La primera medida es el mante -nimiento de la planta madre en unambiente más limpio, en invernadero oen cámara de crecimiento, ya que encampo, está expuesta a todo tipo declima e insectos que provocan heridas ypermiten la entrada de microorganis -mos.

b) Época de recolección de los explantes. Laextracción de los explantes debe ser reali -zada de preferencia a partir de brotacionesnuevas que son formadas durante la faseactiva de crecimiento de la plantas, al finalde la fase de dormancia, durante los mesesmás calientes del año (primavera y vera -no). Altman & Goren (1974) verificaronque yemas de citrus colectadas al inicio dela primavera, brotaron en menor tiempo yno dependían de la aplicación exógena decitoquininas, mientras que yemas colecta -das al final de la primavera y durante elinvierno, brotaron en un tiempo cincoveces superior.

El problema de la época de recolección delos explantes radica en las especies donde,esquemáticamente, se puede distinguir unestado de vida activa y un estado de vidadormante. En estos estados las reaccionesson frecuentemente diferentes. Por ejem -plo, en las primeras experiencias de cultivode meristemas de especies leñosas, todaslas recolecciones de ramas en crecimientoderivaron en fracasos. Los primeros éxitos

han sido obtenidos por la recolección deye mas dormantes. A lo largo del cicloanual, la planta pasa por diferentes etapas.En la primavera, los órganos crecen y losanálisis muestran la presencia dereguladores como la auxina, las gibere linasy citoquininas; a lo largo del verano, estosflujos de sustancias disminuyen, ya que enotoño aparecen ciertos inhibidores (Augeet al., 1982).

c) Tamaño del explante. El tamaño del frag -mento puesto en cultivo tiene una granimportancia; en efecto, mientras más gran -de sea el explante, los equilibrios endóge -nos serán más determinantes. De estehecho, el medio no tendrá más que unainfluencia limitada. Por lo contrario, unexplante de tamaño pequeño será másfácilmente orientado por las sustanciascontenidas en el medio de cultivo (Auge etal., 1982).

d) Desinfección. La principal dificultad en laetapa de establecimiento reside en poderobtener tejido descontaminado sin condu -cirlo a la muerte después de aislado. Lospretratamientos aplicados a la planta ma -dre son determinantes para el éxito de estaetapa de trabajo, principalmente en lo quese refiere a los microorganismos endóge -nos. Varias sustancias con acción germici -da pueden ser utilizadas en la desinfecciónde explantes (ver capítulo 5). Los más co -munes y menos nocivos, son los compues -tos en base a cloro como el hipoclorito desodio o de calcio. Algunas gotas dedetergente son comúnmente adicionadas aestas soluciones para mejorar el contactode éstas con los tejidos. El Tween 20 es elmás utilizado en concentraciones de 0,01a 0,05% (v/v), sin embargo, detergentesde cocina son buenos substitutos. El etanolgeneralmente es utilizado a 70 y 80%(v/v), mayores concentraciones son menoseficientes y pueden deshidratar los tejidos.Además de ser germicida, el etanol es sur -fac tante y aplicado al inicio, facilita laacción de los otros productos. Después de

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la desinfección, le siguen tres a cinco lava -dos en agua estéril. Es posible el uso deagua de grifo estéril para los primeros lava -dos y se recomienda agua destilada estérilen el último lavado.

e) Aislamiento de explantes. Tanto la desin -fec ción como el aislamiento de los explan -tes deben ser realizados en la cámara deflujo laminar. La manipulación del explanteen esta primera fase determina, en parte,su sobrevivencia y posterior desarrollo. Esimportante evitar la deshidratación de lostejidos por lo que la operación de aisla -miento del explante debe ser rápida y pre -ci sa. El tiempo del proceso de desinfecciónvaría de acuerdo a la especie y el tipo deexplante, por ejemplo en papa puede to -mar de 15 a 20 min. mientras que enbanano de 30 a 45 min. Los instrumentosutilizados incluyen bisturíes, pinzas, estile -tes, agujas de jeringas hipodérmicas, fras -cos y cajas petri.

f) Medios de cultivo y hormonas de creci -mien to. Diferentes formulaciones de me -dios básicos han sido utilizadas para lainiciación del cultivo. Generalmente el me -dio utilizado en esta fase también es utili -zado en la de multiplicación. No existe unafórmula patrón, pero el medio MS16, hapresentado resultados satisfactorios paradiversas especies. Para especies leñosas,composiciones más diluidas en macronu -trientes pueden dar mejores respuestas. Laadición de fitorreguladores no siempre esbenéfica en la etapa de establecimiento,estos pueden estimular respuestas inde -sea bles como la formación de callo y even -tual mente intoxicar los tejidos. Sin embar -go, en la mayoría de los casos la adición defitorreguladores tiene el objetivo principalde suplir las posibles deficiencias de lostenores endógenos de hormonas de losexplantes que se encuentran aislados delas regiones productoras de la planta ma -triz. Además la adición de fitorreguladoresestimula cierta respuesta como elonga -

mien to o multiplicación de la parte aérea.Esta respuesta depende del estado fisioló -gico de los explantes, lo que está relacio -na do con la época del año (Altman &Goren, 1977) y el estado general de laplanta matriz. La adición de citoquinina esfavorable y hasta necesaria. El BAP enconcentraciones de 0,05 a 1,0 mg/l hasido utilizado con buenos resultados parael cultivo de ápices caulinares de variasespecies herbáceas y leñosas.

Medios sólidos en tubos de ensayo indivi -duales son normalmente utilizados en estafase inicial, aunque en algunos casos seemplean medios líquidos donde es necesa -ria la utilización de puentes de papel filtro.

g) Condiciones de incubación. Las condicio -nes de incubación en esta fase pueden va -riar mucho. Oscuridad total o intensidadesde luz reducidas son útiles los primerosdías después del aislamiento, para reducirla oxidación fenólica (Franclet & Boulay,1982). La luz involucra varios componen -tes como intensidad, fotoperíodo y calidad.Para la gran mayoría de las especies, laincubación inicial de luz con intensidadesde 2.000-2.500 lux (200-300 footcandles) es satisfactoria. La luz es otorga -da por tubos fluorescentes tipo blanca fría(Grolux); el fotoperíodo tiende a ser de díaslargos para evitar la inducción de dorman -cia. En general, se utilizan 16 horas de luzpor 8 de oscuridad. La mayor parte de lasespecies crece satisfactoriamente en tem -pe ra turas que varían de 20-27ºC; algunasespecies son favorecidas con una incuba -ción inicial a temperaturas bajas lo quepuede contribuir a romper la dormancia deyemas.

7.4.2. Fase 2: Multiplicación

La fase II se refiere a la multiplicación delpropágulo a través de cultivos sucesivos en unmedio adecuado para la multiplicación. Seinicia la fase de multiplicación con la obten -ción de un cultivo de partes aéreas y yemas

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libres de contaminación y que están suficien -te mente establecidas y receptivas a la aplica -ción de fitorreguladores. El principal objetivode esta fase es de producir el mayor númerode plantas posible, en el menor espacio detiem po. No basta conseguir altas tasas demul tiplicación en algunos explantes, lo impor -tante es la reproducibilidad del sistema, esdecir, conseguir una tasa media satisfactoriacon el mínimo de variación de explante aexplante. Otro aspecto esencial es la calidad yhomogeneidad de las partes aéreas produci -das, lo que va a determinar en gran parte eléxito de una fase siguiente de enraizamiento.

La tasa de multiplicación es el número de ex -plan tes nuevos producidos a partir de unexplan te inicial en un cierto período de tiem -po. Se traduce en la cantidad de explantesobtenidos al final del proceso a partir de unacantidad inicial: TM = No. explantesfinales/No. explantes iniciales. Las tasas demultiplicación varían enormemente de especiea especie (Dodds & Roberts, 1997).

La variabilidad de la respuesta morfogénica invitro, no sólo entre especies del mismo géne -ro, sino también entre genotipos de la mismaespecie (diferentes cultivares o clones), llevafrecuentemente a la necesidad de definirproto colos diferenciados.

Los factores que determinan la multiplicación,que pueden ser manipulados para optimizaresta fase, son: a) la composición del medio decultivo, b) las condiciones de incubación y c)los cuidados en la manipulación del materialdurante los subcultivos.

a) La composición del medio de cultivo. Di -ver sos medios básicos son utilizados en lafase de multiplicación. Es muy común lautilización de la misma composiciónbásica en la fase de establecimiento y lamultiplicación: macro y micronutrientes,vitaminas, inositol, una fuente de carbohi -drato (generalmente sacarosa) y eventual -mente otros compuestos orgánicos comoaminoácidos y substancias químicamente

indefinidas como agua de coco y extractode malta. Las variaciones en la composi -ción de los medios dependerán de la espe -cie, las más frecuentes están relacionadasa la concentración de macronutrientes. Lafuente de nitrógeno del medio básico utili -za da y el balance entre los iones de nitratoy amonio son aspectos que merecen mayoratención. En cultivos de Eucalyptuscitriodora (Grewal et al., 1980) verificaronque al reducir a la mitad las concentra cio -nes de nitrato de amonio y de potasio delmedio MS, ocurrió una duplicación de latasa de multiplicación, y que al doblar laconcentración de cloruro de calcio, estatasa triplicó.

La concentración de sacarosa u otra fuentede azúcar también tiene un marcado efectosobre la multiplicación y crecimiento. Con -cen traciones de 2-4% (p/v) son las máscomunes. Debajo de este rango, puedeocurrir clorosis generalizada en los cultivosy encima, problemas de excesivo potencialosmótico del medio que puede llevar a unadeterioración de los cultivos.

La manipulación de micronutrientes y vita -minas, igualmente indispensables, gene -ral men te no resulta en alteraciones signifi -cativas en la multiplicación.

Respecto a los fitorreguladores, las citoqui -ninas constituyen un grupo indispensablepara la quiebra de la dominancia apical yla inducción de la proliferación de yemasaxilares. La BAP (bencilaminopurina) encon centraciones de 0,1-0,5 mg/l es la cito -quinina más eficaz para promover la multi -plicación en diversas especies, siendo ade -más la más económica de todas (Hasewa -ga, 1980; Hu & Wang, 1983; Zaerr &Mapes, 1985). Complementariamente, lasauxinas son utilizadas para estimular elcrecimiento de las partes aéreas. SegúnLundergan & Janick (1979), citados porHu & Wang (1983), parece que la auxinaen la multiplicación, anula el efecto inhi -bitorio que tienen las citoquininas sobre elelongamiento de los cultivos. Las concen -

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tra ciones de auxina son frecuentementebajas comparadas a la de las citoquininas,para mantener un balance auxina/citoqui -ni na menor que 1. Concentraciones excesi -vas de auxina pueden inhibir la multiplica -ción y favorecer demasiado el enraizamien -to o la formación de callo en detrimento dela multiplicación. Las más utilizadas son elANA, AIB y AIA en concentraciones pordebajo de 0,5 mg/l, aunque el AIA, por sermenos estable en cultivo, puede ser adicio -nado en concentraciones mayores. Lasgibe re linas son usadas en la fase de multi -plicación de algunas especies como lapapa, donde se requiere el elongamientode las partes aéreas para la multiplicaciónde los entrenudos (microesquejes).

El estado físico del medio también tieneinfluencia sobre la multiplicación, mediossólidos o semi-sólidos son más comunesen la fase de micropropagación, aunque enmuchos casos puede utilizarse medios lí -qui dos con mayor eficiencia. Medios semi-sólidos y líquidos pueden traer como resul -tado la vitrificación de los cultivos.

b) Las condiciones de incubación. La fase demultiplicación es evidentemente la máslar ga durante el proceso de micropropa -gación, por lo que una buena definición delas condiciones ambientales para esta fasees importante. La mayoría de los cultivosresponde bien a las condiciones descritasanteriormente, en la fase inicial del cultivo.La luz cumple un papel importante en lamorfogénesis, los cultivos in vitro presen -tan una baja tasa fotosintética, por lo quedeben disponer de una fuente de carbohi -dra tos, normalmente en forma de sacaro -sa. No siempre intensidades luminosasmayores son mejores. Desde el punto devista económico, la optimización de unsiste ma comercial de micropropagaciónrequiere disminución del gasto de energíaeléctrica, que es uno de los principalescomponentes del costo de una planta. Lasintensidades de luz y horas de fotoperiodosmínimos que no limitan seriamente el

desa rrollo son los más indicados. El rangode temperatura óptima para la mayoría delas especies se encuentra entre 20 y 27ºC.Temperaturas por encima o debajo de esterango pueden ser desfavorables para eldesarrollo de algunas especies.

Otro aspecto que debe ser considerado esel microambienrte dentro de los recipientesde cultivo. Los principales factores quedeterminan la calidad del microambienteson los tipos de tapa y frascos utilizados yla cantidad de medio presente en el frasco.El tipo de tapa utilizado tiene gran influen -cia en el desarrollo del cultivo, pues es ésteque va a determinar el nivel de intercambiogaseoso con el ambiente externo. Tapastotalmente herméticas, pueden ser buenaspara evitar la contaminación, sin embargono permiten un intercambio gaseosoadecuado, pudiendo existir un aumento enla acumulación de CO2 y etileno trayendocomo consecuencia una disminución delcontenido de clorofila a lo largo de la incu -bación. El tipo de frasco y la cantidad demedio utilizado son variables que afectandirectamente al volumen de aire sobre elmedio y la profundidad del medio. Estosfactores también afectan la composiciónde la fase gaseosa del frasco y consecuen -temente al crecimiento o desarrollo de loscultivos.

c) Los cuidados en la manipulación del ma -te rial durante los subcultivos. El trata -mien to dado a los explantes durante la fasede multiplicación involucra una serie defactores que afectan al desarrollo de loscultivos. Su mayor influencia se hace sen -tir, en la homogeneidad de las plantas pro -ducidas. Estos factores pueden ser agrupa -dos en tres aspectos: la frecuencia de lossubcultivos, el tipo y tamaño del explantesubcultivado y los cuidados durante elprocedimiento del repicaje. En una primerafase después del repicaje, el explante serestablece del estrés sufrido por el repicajey no crece o multiplica. La fase siguiente secaracteriza por un crecimiento y multiplica -

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ción exponencial, cuando el explante utili -za rápidamente el medio de cultivo. En laúltima fase, el explante inicia un procesode senescencia en función de diversos ti -pos de estrés, tales como deficiencia nutri -cio nal, falta de agua en el medio de culti -vo, acumulación de etileno y otros gases enel frasco y, eventualmente, barreras físicasal crecimiento como la tapa y las paredesdel recipiente. La duración de estas tresfases varía mucho de especie a especie,algunas se recuperan del repicaje inmedia -ta mente y luego del primer o segundo díacomienzan a emitir nuevas brotaciones.Otras requieren de períodos más largos pa -ra mostrar alguna reacción. Igualmente elperíodo de multiplicación puede extender -se por más o menos tiempo, y algunasespe cies no presentan señales de senes -cen cia a menos que el medio se sequecom pletamente dentro del frasco. La fre -cuencia ideal de sub-cultivo sería aquellaen la cual las plantas fuesen repicadasdurante la fase de crecimiento activo de laspartes aéreas, asociando el máximo vigorde crecimiento de los cultivos con la máxi -ma tasa de multiplicación.

El período de incubación más común entrerepicajes es de cuatro semanas. Sin em -bargo, éste puede no ser un intervalo idealpara optimizar la tasa de multiplicación.En algunas especies como las leñosas, quepresentan períodos de adaptación más lar -gos, la multiplicación se inicia en la segun -da o tercera semana, por lo tanto requeri -rán de períodos más largos del multiplica -ción (seis o más semanas).

Las características del explante subcultiva -do representan un segundo aspecto impor -tante, relacionado con la frecuencia derepi caje. Algunos cultivos como la papa,multiplican con una tasa de 1:5 o más pormes, manteniendo un tallo único del cualse retiran segmentos nodales para iniciarlos nuevos subcultivos.

Este sistema es de fácil manipulación, conotros sistemas de proliferación de yemas

axilares y/o adventicias, se forma una tufa(grupo de pequeñas plantas neoformadas)de partes aéreas. Esta tufa puede ser sub -di vidida en: a) explantes conteniendo másde una parte aérea (sub-cultivo en tufas);b) las partes aéreas pueden ser individuali -za das; ambos casos pueden darse en elcultivo de la frutilla; y c) de cada parteaérea pueden ser aislados varios segmen -tos caulinares conteniendo yemas latera -les, como ocurre con el manzano. Para op -tar por uno de estos sistemas, debe tomar -se en consideración la rapidez de la opera -ción (mayor para en el caso de simplesubdivisión); la tasa de multiplicación y lavariabilidad en la respuesta de multiplica -ción de los nuevos explantes en lageneración siguiente.

La posición del explante en el cultivo deorigen y el tamaño del mismo son caracte -rís ticas importantes. El aislamiento de laspartes aéreas, principalmente la subdivi -sión en yemas axilares y apicales, puedeintroducir una fuerte variación de explantea explante como resultado de la posiciónoriginal de la yema en cultivo. Explantesque eran ápices en el cultivo anterior pue -den presentar mayor capacidad de multi -pli cación que aquellos que eran yemaslaterales o segmentos nodales, o tambiénviceversa dependiendo de la especie. En elcaso de la papa, los ápices tienen un desa -rrollo más rápido. La homogeneidad de losexplantes es de fundamental importanciapara la operacionalidad de un sistema demicropropagación. Asimismo, el tamañodel explante inicial es importante, al prepa -rar explantes muy pequeños conteniendouna o pocas yemas apenas ocurren, mu -chas veces, una excesiva demora para elinicio de la fase de crecimiento activo delsubcultivo siguiente, o que reduce drásti -ca mente la tasa de multiplicación.

Es importante hacer una selección de lasanormalidades o deterioraciones de losculti vos como vitrificaciones, hojas secas,callos en la base o ápices necrosados, es

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una medida fundamental para la calidaddel trabajo.

7.4.3. Fase 3: Enraizamiento

La fase de enraizamiento, es la preparación delas plántulas para el establecimiento en elsuelo, es decir, las partes aéreas producidas invitro son transferidas a medio de enraiza -miento para el subsecuente trasplante al suelode las plantas obtenidas. El enraizamiento esuna etapa que puede ser realizada in vitro oin vivo. En el primer sistema, las raíces sonregeneradas en condiciones asépticas y unaplanta completa es trasplantada en substrato.En el segundo sistema, las partes aéreas sonmanipuladas como microestacas y todo elproceso de enraizamiento se da en substratoestéril (aún en condiciones de laboratorio).

La opción por uno de los dos sistemas depen -de fundamentalmente de la calidad de laspartes aéreas obtenidas en la multiplicación,de la especie y del genotipo en cuestión. Otraalternativa es inducir el enraizamiento in vitrode las partes aéreas y trasplantarlas en subs -tra to estéril (en laboratorio). La rizogénesispuede ser dividida en inducción, iniciación, yelongamiento de raíces, que normalmente lle -va una a tres semanas. Las dos primeras -aveces consideradas como una sola- respondeno dependen de la adición de auxina en el me -dio de cultivo, donde el crecimiento y elonga -miento de las raíces es estimulado por la pre -sen cia de auxina. La dificultad de un sistemade micropropagación está en determinar unacondición in vitro, en la cual todas estas fasespuedan ocurrir normalmente y, de preferencia,sin demandar manipulación adicional de unafase a la otra.

Los factores que determinan el enraizamientoson:

a) Influencia del material vegetal. El enraiza -miento de especies herbáceas es general -mente fácil con relación al de especiesleñosas, donde el enraizamiento se tornamás difícil. Este problema se agrava a me -

dida que se utiliza material menos juvenil.La calidad de las partes aéreas provenien -tes de la fase de multiplicación determinaen gran parte, el éxito del enraizamiento.

b) Medio de cultivo. Diversas especies, prin -ci palmente las herbáceas, enraízan en lapresencia de niveles muy reducidos deauxi na, o simplemente en medio básico sinhormonas (Anderson, 1984; Hasegawa,1980). La situación más común es aquellaen la cual las partes aéreas provenientesde multiplicación necesitan de una auxinaexógena para estimular la rizogénesis; aun -que tenores endógenos residuales de cito -quinina pueden dificultar el enraiza mien toen estos casos (Grattapaglia et al., 1987).Los tipos y concentraciones de auxina sonvariables; diversas auxinas solas o en com -bi nación pueden ser utilizadas en el enrai -za miento, variando las concentraciones deacuerdo a la especie o clon. Las auxinasmás comúnmente usadas son: el AIB, elANA y el AIA.

Además de las auxinas, algunos otros com -pues tos son a veces utilizados para elenrai za miento. El carbón activado enconcentraciones de 0,1-2% (p/v) puede serbenéfico en algunos casos. Físicamentesimula las condiciones de oscuridad en lacual las raíces normalmente se desarrollanmejor. Químicamente, el carbón activadotiene efectos diluidos, reteniendo parte delos elementos que componen el medio,fijan do las citoquininas que se encuentranaún en los tejidos de las plantas y absor -biendo compuestos tóxicos inhibidores delenraizamiento. Sin embargo, provoca unamenor disponibilidad de auxina libre, porlo que muchas veces, es necesario aumen -tar la concentración de auxina. Compues -tos fenólicos pueden actuar como cofacto -res de enraizamiento. El Phloroglucinol(PG phloroglucinol), es una sustancia queocasionalmente ha demostrado buenosresul tados. En arracacha, redujo la forma -ción de callo, que ocurría en presencia deAIB (Villarroel, 1997). En otros cultivos, elefec to fue inhibitorio (Zimmerman &

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Fordham, 1985). Una buena disponibili -dad de fuente de energía es indispensablepara la rizogénesis. La concentración desacarosa en el medio de enraizamiento esgeneralmente mantenida en los mismosniveles del medio de multiplicación (entre2 y 3% p/v).

Medios sólidos son utilizados en la granmayoría de las veces para la fase de enrai -za miento, con concentraciones de agarsemejantes a aquellas usadas en micropro -pagación. Medios excesivamente sólidos,con concentraciones por encima de 0,6%de agar pueden llevar a problemas deenrai zamiento. Substratos inertes como lavermiculita pueden ser utilizados con resul -tados superiores a los obtenidos en agar.

c) Condiciones de incubación. Condicionesde temperatura semejantes a aquellasadop tadas en la multiplicación, estimulanun enraizamiento satisfactorio. Alteracio -nes mas frecuentes son hechas en el régi -men de luz. Sometiendo a las partesaéreas a intensidades luminosas reducidaso al oscuro absoluto durante algunos días,correspondiendo a la fase de inducción oiniciación. Otros factores ambientales co -mo la temperatura y la humedad en la salade incubación, pueden influenciar elenraizamiento, pero de una manera menosdrástica. Generalmente la temperaturautilizada coincide con aquella utilizada enla fase de multiplicación. El rango máscomún en el cual enraízan bien la mayoríade las especies va de 20 a 30ºC.

d) Tamaño del explante. Partes aéreas peque -ñas en general no enraízan bien y necesi -tan de una fase intermedia de elongamien -to. Asimismo, la edad y estado de desarro -llo de la planta, la posición del explante so -bre la planta y el cultivar, son factores queinfluyen en el enraizamiento.

7.4.4. Fase 4: Aclimatación

Los explantes recién enraizados son muy sen -si bles a los cambios ambientales, de ma nera

que el éxito o el fracaso de todo el proce sodependen de la aclimatación. La etapa detrasplante involucra la transferencia de laplanta de condiciones in vitro a condiciones invivo en invernadero, donde es sometida a unafase de aclimatación y endurecimiento. Estepasaje es bastante crítico y representa en al -gu nos casos un factor limitante en el procesode micropropagación. Esto se debe básica -men te a los siguientes factores (Grattapaglia &Machado, 1997):

• La planta pasa de una situación de reduci -do flujo transpiratorio debido a la bajainten sidad de luz y elevada humedad rela -ti va a un am bien te que demanda un incre -mento en la tasa de transpiración, quedan -do muy susceptible al estrés hídrico.

• La planta pasa de una condición heterotró -fica, en la cual depende de un suplementoexterno de energía (sacarosa en el medio),para un estado autotrófico, en el cual pre -cisa realizar fotosíntesis para sobrevivir.

• La planta pasa de una condición de altadisponibilidad de nutrientes en el mediohacia otra donde precisa rápidamenteincrementar la absorción de sales; y,

• La planta sale de un estado aséptico haciaun ambiente donde está sujeta al ataquede microorganismos saprófitos y eventual -mente patogénicos.

a) Factores que determinan la aclimatación.De la misma forma que en las otras fases,el éxito de ésta depende esencialmente dela calidad de las plantas provenientes de lafase anterior. En lo que se refiere a la parteaérea, plantas que presentan alguna toxi ci -dad de auxina o deficiencia nutricional,tien den a presentar problemas de senes -cen cia de hojas, lo que compromete lasobre vivencia. Partes aéreas vitrificadas ocon hojas excesivamente pequeñas tam -bién significan un problema, pero que de -ben ser resueltas en la fase de multipli -cación.

Asimismo, plantas con aspecto normal su -fren estrés en función a un cambio brusco

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de humedad relativa. Pre-tratamientos dereducción de humedad relativa en el frascode cultivo pueden ser aplicados paraaumentar la sobrevivencia al trasplante.

El tipo de sistema radicular obtenido en elenraizamiento in vitro, también determinael éxito del trasplante. Raíces aún cortasson más deseables, pues facilitan el lavadoy retirada del medio de cultivo adherido,así como la introducción de la planta alsus trato. En la preparación de las plantaspara el trasplante, después de retirar elme dio y lavar las raíces, se realiza unaelec ción de plantas, agrupándolas portamaño. Esta clasificación es importantepara reducir la competencia de las plantasen la bandeja y permitir un mejor manejodurante la aclimatación y posteriormente laplantación en campo.

Durante el trasplante, el estrés hídrico delas plantas es generalmente el mayor pro -blema. Una planta aparentemente perfectain vitro presenta una serie de deficienciasanatómicas que dificultan el control de latranspiración, permitiendo una rápida pér -di da de agua. Los estomas no son funcio -na les y responden muy lentamente alestrés hídrico; la cera protectora sobre lashojas es mínima o inexistente; la conexiónen el sistema vascular del tallo y de lasraíces adventicias aún es precario parapermitir un flujo transpiratorio adecuado.La manutención de una humedad relativaalta, desde la retirada de las plantas delmedio de cultivo hasta verificarse el iniciodel crecimiento de la planta, es un factorclave para su sobrevivencia inicial.

Se reduce gradualmente la humedad rela -ti va en el ambiente durante las dos o tresprimeras semanas. Los sistemas utilizadospara mantener una humedad alta, depen -den de las condiciones de trabajo. Siste -mas de nebulización intermitentes sonutili za dos para mantener alta humedadrelativa cuando se dispone de recursoseco nó micos. Mientras que simples cober -

tu ras plásticas sobre las bandejas de acli -ma tación y las plantas son también muyútiles y pueden sustituir con eficiencia a lossistemas de nebulización.

El sustrato de trasplante es otro factor bas -tan te crítico en el proceso de aclimatación.Desde el punto de vista físico, éste debetener una buena capacidad de retención dehumedad y no compactarse excesivamen -te, comprometiendo el drenaje y conse -cuen temente la aireación del sistema radi -cular. Químicamente, el sustrato debe serde preferencia inerte de modo de permitirla manipulación de los contenidos de nu -trientes de acuerdo con las necesidades dela especie. Lo ideal es utilizar sustratos dis -po nibles localmente; los sustratos común -mente usados en nuestro medio incluyenmezclas de musgo, arena y cascarilla dearroz. Eventualmente, puede utilizarse ver -miculita o perlita, pero que en términoseco nó micos no son convenientes. Luego dedos a cuatro semanas, es común adicionarfertilizante granulado al sustrato para su -plir las necesidades iniciales de la planta.Normalmente, la fertilización es un factorque se adecúa al manejo de los viveristas.

Otro aspecto que requiere mucho cuidado,es la condición fitosanitaria del ambientede trasplante. La alta humedad relativaque se hace necesaria para la sobreviven -cia de las plantas es extremadamente favo - ra ble al rápido desarrollo de todo tipo demicroorganismo. Sumado a esta condición,la fragilidad de los tejidos poco lignificadosy desprovistos de cutícula, expone a laplanta a la invasión de microorganismossaprófitos y al ataque de patógenos. Losrecipientes o bandejas deben estar limpios,de preferencia lavados en solución de hipo -clorito de sodio, y el sustrato debe serdesin festado, preferentemente con calorhúmedo, en un caldero a vapor.

Todos los cuidados fitosanitarios preventi -vos deben ser realizados en el invernaderodonde permanecerán las plantas. Pulveri -

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za ciones con fungicidas alternando coninsecticidas son medidas muy importantespara evitar principalmente el ataque dehongos causadores de la muerte de plantas(Fusarium) y el ataque de ácaros o pulgo -nes (áfidos). Estos últimos son particular -mente problemáticos, ya que pueden com -prometer la sanidad de lotes enteros deplantas al contaminarlas con virus u otrosmicroorganismos sistémicos.

b) Procedimiento para la aclimatación de lasplántulas in vitro. El procedimiento de acli -ma tación, no es determinante, éste puedevariar conforme a la especie. Plántulas invitro bien enraizadas son seleccionadas ytrasladadas a invernadero. Ya en el inver -na dero, se las retira de los recipientes y selas coloca en un recipiente con agua paralavar los residuos de gelificante. Estasplán tulas deben ser desinfestadas con unasolución débil de fungicida (normalmenteBenomil al 0,2% (p/v) para su posteriorestablecimiento en sustrato estéril, es apar tir de este momento que debe mante -nerse una humedad relativa alta, por loque las bandejas o camas de aclimatación,son cubiertas con plástico. En estas condi -ciones permanecerán por el lapso de 4-6semanas dependiendo de la especie, antesde su trasplante definitivo (en el mismoinvernadero o en campo).

7.5. PRINCIPALES PROBLEMAS DE LAMICROPROPAGACIÓN

7.5.1. Contaminaciones fungosas ybacterianas

Las contaminaciones representan un proble -ma para la mayoría de los laboratorios, y esparticularmente serio por las dimensiones queasume cuando se presenta en grandes labora -torios comerciales. En un estudio de identifi -ca ción de patógenos en cultivos comercialesin vitro, se determinó un 5,3% de contami na -ción provocada por hongos y por encima del10%, por bacterias que en muchos casos pro -

vocaban la muerte de las plántulas. Por obser -va ciones directas al microscopio se pudo veri -fi car la presencia de Verticillum, Rhodotorulay Penicillum (hongos saprófitos) en sus dife -ren tes fases (PROINPA, 1996). Bacteriasendó ge nas de crecimiento lento pueden tenerorigen en el explante inicial, apareciendo algu -nas semanas después del aislamiento. Estecaso no llega a representar un gran problema,ya que en este estado, apenas se cuenta conun número reducido de plantas derivadas delexplante contaminado. El problema se esta -ble ce cuando la contaminación persistente seinstala en cultivos anteriormente limpios, enestados avanzados de multiplicación. Las bac -te rias responsables en general no son patogé -ni cas, pero compitiendo por el medio de culti -vo, comprometen la multiplicación o el creci -miento y posterior enraizamiento de la planta.Una vez establecidas en el cultivo, por ser decrecimiento lento y de difícil visualización (engeneral aparecen en forma de manchas blan -cas o casi transparentes en la base de losexplan tes), ellas pueden ser inadvertidamentetransmitidas de un material a otro. Un factorque favorece la diseminación de estas bacte -rias es su resistencia a las rápidas inmersio -nes en etanol y a las temperaturas normal -men te proporcionadas por el flameo de losinstrumentos. Se han desarrollado métodos dedetección temprana de bacterias, que permi -ten controlar contaminaciones bacterianasantes de que se expresen en los medios decultivo, garantizando la sanidad de embrionesde caña de azúcar (Alvarado et al., 2001).

Mediante aislamientos y cultivos se detectóCurtobacterium pusillum, C. flacumfasiens,Bacillus licheniformis y Erwinia spp. (bacte -rias endógenas) (PROINPA, 1996). Se afirmaque estas bacterias pueden desarrollar linajescada vez más resistentes y adaptados a labo -ra to rios de cultivo de tejidos. Desde el puntode vista práctico, la mejor medida en el casode contaminaciones bacterianas, es el des car -te y autoclavado de los frascos contaminados.Si esto no fuera posible, tratamientos curati -vos pueden ser aplicados, siendo los más co -

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mu nes la aplicación de antibióticos en el me -dio de cultivo (ver capítulo 5). Mientras tanto,en la fase de multiplicación, el mayor enfoquedebe estar dado a las medidas preventivastomadas durante el repicaje.

7.5.2. Oxidación fenólica

Un problema frecuentemente encontrado du -ran te el aislamiento de los explantes, es laoxidación de compuestos fenólicos que sonliberados por las células dañadas con el corte.Las extremidades cortadas se tornan oscurasrápidamente: los productos de la oxidaciónson tóxicos para el resto del explante y sedifun den en el medio de cultivo oscureciéndo -lo. Este problema es particularmente serio enel aislamiento de explantes de especiesleñosas. Los tejidos de estas especies son másricos en compuestos fenólicos, precursores desíntesis de lignina. Algunas técnicas pararedu cir este problema incluyen: la utilizaciónde substancias antioxidantes como ácido as -cór bico, ácido cítrico, PVP (polivinilpirrolido -ne) y carbón activado, ya sea en el medio decultivo o en el último enjuague del proceso dedesinfección; la incubación inicial de los ex -plan tes en oscuridad o bajo intensidad lumi -no sa reducida; la utilización de medios bási -cos más diluidos y la reducción de concentra -ciones de fitorreguladores.

7.5.3. Vitrificaciones

La vitrificación es considerada como uno delos principales problemas en la fase de micro -propagación. El exceso o acumulación de cito -quinina en el medio puede causar la vitrifica -ción, aunque fue demostrado que tambiénpuede ser causa de una interacción con laconcentración del gelificante en el medio.Aumentándose la concentración de gelificanteen el medio, es posible reducir el efecto delBAP, por lo tanto la vitrificación. El Exceso delvapor de agua en la atmósfera del frasco tam -bién es uno de los principales responsables dela vitrificación. La reducción de humedad rela -

ti va es obtenida esencialmente cambiando eltipo de tapa que permita una mayor difusióndel agua. La reducción de la concentración denitrógeno en forma amoniacal en el medioMS, ha sido utilizada como una medida paracombatir la vitrificación de los cultivos(Quoirin & Lepoivre, 1977). El tipo de agentegelificante también puede causar vitrificación.

7.5.4. Variación somaclonal

El cultivo de tejidos puede llevar a la produc -ción de plantas anormales (Karp, 1994). Loscambios se producen particularmente en lasplantas producidas por la regeneración de bro -tes adventicios (con la utilización de citoquini -nas), pese a que la multiplicación de meriste -mas aparenta ser relativamente estable. Lafrecuencia de los cambios depende de lasespecies y del genotipo, de los tejidos a partirde los cuales las plantas adventicias han sidoregeneradas, y de la composición del mediode cultivo in vitro (Smulders, 2005).

Los marcadores moleculares son utilizadospa ra examinar la identidad genética en lospro cesos de micropropagación y de conserva -ción in vitro (Gupta & Varshney, 1999).

7.5.5. Otros

a) Acumulación de citoquinina. El exceso estóxico y compromete el desarrollo de loscultivos. La toxicidad que puede causar lacitoquinina en el medio se caracteriza prin -cipalmente por el excesivo entufamiento(formación de yemas múltiples neoforma -das) y la falta de elongación de los cultivos,reducción del tamaño de las hojas, acorta -miento de los entrenudos, engrosamientoexcesivo de los tallos y vitrificación gene ra -li zada de los cultivos, lo que lleva a proble -mas en la fase de enraizamiento (Lane,1979). Para resolver este problema delefecto residual, en general se hace necesa -ria una fase intermedia de elongamientocon el objetivo de desintoxicar los cultivos.

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Esta fase de elongamiento se caracterizapor la transferencia de los cultivos a mediobásico diluido o no, con concentracionesreducidas o ausencia de citoquinina, antesde individualizar la parte aérea para elenraizamiento. Bajando a la mitad la con -cen tración de BAP en cultivos de bananodurante un ciclo, se duplicó la tasa demultiplicación (PROINPA, 2004). El usodel carbón activado también es un coad -yuvante útil para esta fase, en función desu capacidad de retener concentracionesexcesivas de fitorreguladiores y compues -tos tóxicos que inhiben la morfogénesis(Boulay, 1984).

b) Conclusiones y perspectivas. La micropro -pa gación es, entre otras técnicas de cultivode tejidos de plantas, aquella que más seha difundido y la que tiene mayores aplica -ciones, sin embargo, es necesario enfatizarque el éxito de su acción no sólo dependede los aspectos técnicos, sino también deotros factores. Es evidente que la necesi -dad de equipamientos, reactivos e instala -cio nes son condiciones indispensables pa -ra iniciar cualquier trabajo de micropropa -ga ción. Una condición razonable de trabajopuede muchas veces ser obtenida con unpoco más de creatividad que con recursoseconómicos propiamente. Se debe tenersiempre claro, que la micropropagaciónrepresenta la optimización de un procesode propagación vegetativa, sin introducirvariabilidad genética alguna.

Durante la micropropagación, tres aspec -tos deben ser constantemente observados:

• El valor genético del clon a ser propa -gado. Este debe ser el resultado de porlo menos algún tipo de selección(Grattapaglia & Machado, 1997).

• La variabilidad en el proceso de micro -pro pagación entre diferentes clones dela misma especie. Esto muestra clara -mente, que no existe una “receta” parala propagación in vitro de unadeterminada especie. El “secreto” está

en ajus tar la metodología al clon encuestión.

La búsqueda de alternativas que tornana la micropropagación en un procesobarato, accesible y económicamenteviab le. La embriogénesis somática, elcultivo en medio líquido, el uso de bio -reactores, los usos de suspensionescelulares morfogénicamente activas, eluso de medios mínimos, la eliminaciónde envases de vidrios como recipientespara cultivo, uso de semilla sintética yla robotización de la operación del sub -cul tivo, se encuentran entre las posibi -lidades que se presentan en un futuropróximo para tornar la micropropa ga -ción en un proceso de propagaciónvegetativa por excelencia.

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8.1 INTRODUCCIÓN

A lo largo de los últimos años y debido a situa -ciones climatológicas como el fenómeno de ElNiño en la década de los años 80, Boli via tuvoque establecer para el Altiplano y valles, pro -gra mas de emergencia de importación de se -mi lla debido al efecto drástico de las sequíasen la disponibilidad de semillas en especiesde seguridad alimentaria, además que en esteproceso se introducieron patógenos (principal -men te, virus y bacterias). Con el tiempo, estaszonas se han convertido en los focos de dise -mi nación de enfermedades, tales como lamar chi tez bacteriana de la papa causada porRalstonia solanacearum. Tal es el caso de ladistribución de esta bacteria en los valles deChuquisaca, Tarija y Santa Cruz y Cochabam -ba, reportando los casos en los años 80 y 90(Coca Morante y Garvizu, 1984; Fernandez-Northcote y Alvarez, 1993). Se estima que laenfermedad fue introducida en el país en lasdécadas 70 y 80 a través de las diferentesimpor taciones de papa a Bolivia. Ejemplos si -mi lares han sido reportados en 2008, por Co -ca-Morante, en relación a la introducción y di -se minación de la bacteria causante de la bac -te riosis del palmito al trópico de Cochabamba.

Por otra parte, la opinión generalizada de losagricultores cuando se refieren a variedadesde multiplicación vegetativa y que actualmen -te ya no las cultivan, mencionan el hecho de

que su semilla “está cansada”; la que técnica -men te puede ser explicado por la posible altacontaminación de virus; en este caso, un pro -ce so de limpieza viral, contribuiría a superarestas deficiencias, garantizando la calidad sa -ni taria de la semilla, favoreciendo a recuperarsu potencial productivo y evitando la disemi -nacion de enfermedades a otras zonas libresde éstos.

En este sentido, los virus de papa según Mejía& Vittorelli (1988) pueden ser transmitidos deplantas infectadas a plantas sanas de diversasmaneras: por contacto o transferencia de jugoinfectado (instrumentos de labranza, roza -mien to entre plantas, manipulación de losope radores), por tubérculo semilla infectado,por insectos vectores (áfidos, trips) u otros.Para muchas especies propagadas vegetativa -mente, sean frutales, ornamentales, o alimen -ti cias, la principal fuente de virus es la infec -ción crónica de las mismas plantas. Otro pro -ble ma que afecta a estas especies es la pre -sen cia de microorganismos (hongos y bacte -rias) que al igual que los virus, dañan a laplanta, reducen la producción de las mismasy, peor aún, contaminan los suelos. Un ejem -plo en frutales es la Agalla de corona(Agrobacterium tumefasciens).

Los análisis específicos para las enfermedadesdel cultivo, tales como DAS-ELISA o PCR,aná li sis generales para patógenos utilizando

Capítulo 8Limpieza viral

en especies vegetales

Gino Aguirre V. & Mario Coca Morante

medios de cultivo para el crecimiento de bac -te rias y hongos, métodos específicos para ladetección e identificación de patógenos intra -celulares como virus, viroides y bacterias, per -mi ten visualizar los síntomas más marcadosde la enfermedad; por lo tanto, la precisióndel sistema de detección aumenta. Por otrolado, las plantas enfermas pueden tratarsecon técnicas adecuadas para la eliminaciónde patógenos como la termoterapia o la qui -mio terapia en el caso de virus o a través de laaplicación de antibióticos o desinfectantes enel caso de bacterias.

Para la recuperación del potencial productivode estas especies y que puedan ser multipli -cadas adecuadamente, es primordial la utili -za ción de técnicas que acompañan al cultivode tejidos vegetales in vitro. Una de las for -mas es el desarrollo de plantas madre libresde virus y otro tipo de patógenos (hongos ybacterias) utilizando las técnicas de cultivo demeristemas combinadas con otros métodos afin de asegurar la eliminación viral y la libera -ción de otros patógenos. La estrategia genera -da en Bolivia (Iriarte et al., 2001), y utilizadacon éxito desde la década de los 90, contem -pla diversas etapas, entre las cuales se pue -den mencionar las siguientes:

8.2. SELECCIÓN DEL MATERIALVEGETAL A SANEAR

Las técnicas de limpieza viral, por su elevadocosto (aproximadamente 500 USD porvariedad o entrada) y por el tiempo quedemandan (no menor a un año), no se puedenutilizar en cualquier material vegetal, por loque la meto dología requiere priorizar elmaterial vegetal a ser saneado en base a lossiguientes criterios:

a) Por la importancia económica de la espe -cie a sanear, la misma que debe respondera una demanda de un sector productivoagrí cola, por ejemplo la variedad Imillanegra en papa para el altiplano boliviano ouna variedad de yuca o de banano en el

trópico para una producción comercialprinci palmente.

b) Por la importancia social y cultural, comoes el caso de variedades nativas, quesignifican uno de los pocos sustentos parafamilias campesinas de zonas de altura yque han garantizado desde siempre suseguridad alimentaria, además de signi -ficar un invalorable recurso filogenético.

c) Por la cobertura geográfica que demanda -ría el cultivo de cualquiera de estas espe -cies, que debe significar un beneficio y/oparticipación de varias comunidades.

En el caso de los bancos de germoplasma,donde se conservan y salvaguardan un núme -ro importante de entradas, mismas que cons -ti tu yen nuestra riqueza fitogenética, la necesi -dad de contar con material libre de virus radi -ca en que cada entrada es muy probable quesea devuelta y re introducida a sus zonas deorigen, sea utilizada en programas de mejora -miento o sirva de material madre dentro de unprograma de producción de semilla. En cadauno de estos casos, un material madre librede virus es sencillamente primordial.

8.3 TÉCNICAS DE LIMPIEZA VIRAL

8.3.1. Cultivo de meristemas

Esta técnica consiste en aislar el meristema ysembrarlo en un medio de cultivo adecuadoque posibilite el desarrollo de una plantacompleta (Figura 1).

El término cultivo de meristema por lo generalno es correctamente empleado ya que en lamayoría de los casos se siembra el domomeristemático acompañado por uno o dosprimordios foliares. El domo es una estructurade menos de 0,1 mm de diámetro, muy difícilde extraer con éxito en forma aislada y de lacual resulta frecuentemente complicadoobtener plantas completas (Conci, 2004). Elmeristema apical es definido como un domode tejido localizado en el extremo de la punta

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de un brote con 0,1 mm de diámetro y unalongitud de 0,25 a 0,4 mm; estos tejidoscomprenden células que son anatómicamenteindistinguibles, pero normalmente se agrupaen las zonas arbitrarias como la túnica,cuerpo, células de la madre central, cada unade las dos partes laterales del meristemaconsiderado de frente y yemas de meristemas(Karta, 1981; Pierik, 1987).

8.3.1.1. Distribución de los virus en la planta

El cultivo de meristemas como una técnicapara el saneamiento de clones afectados por

patógenos, especialmente virus, se fundamen -ta en que la distribución en los tejidos de unaplanta no es uniforme, y su concentracióntien de a disminuir progresivamente hacia elmeristema apical del tallo. Esto aumenta laposibilidad de obtener plantas sanas mediantela escisión y el cultivo de meristemas en me -dios nutritivos estériles (Roca y Jayasinghi,1982).

Los virus en la planta no están uniformementedistribuidos. En las infecciones sistémicas al -gu nos están limitados al floema o a pocas cé -

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Figura 1. Diagrama de la región meristemática apical yla región meristemática sub apical con primordios foliares

Fuente: (Mejía & Vitorelli, 1988).

Ápice y esbozos foliares en papa. Meristema y primordia foliares en papa.

lu las parenquimáticas adyacentes; otros invo -lucran a todas, o casi todas, las células de laplanta. Los meristemas suelen tener pocos oningún virus, las razones para que ello ocurra(Conci, 2004) no están esclarecidas comple -ta mente, pero se mencionan como posibleslas siguientes:

• Sistema vascular poco diferenciado. Losvirus son rápidamente transportados a lolargo de toda la planta por el floema y asíse distribuyen sistémicamente.

• Elevada actividad metabólica. Presumible -mente es más difícil para un virus invadircélulas con elevada actividad metabólica,como es el caso de las células meristemáti -cas, donde tiene lugar una activa mitosis.

• Elevadas concentraciones de auxinas. Seha observado que elevadas concentracio -nes de 2,4-D en el medio de cultivo inhi -ben la multiplicación de los virus. Por lotan to se puede suponer que las altas con -cen traciones de auxinas endógenas exis -ten tes en los ápices meristemáticos pue -den producir un efecto similar.

También se pueden obtener plantas libres debacterias y hongos por el cultivo de meriste -mas. Los bacterias que se pueden eliminarson: Pectobaterium (anteriormente Erwinia),Ralstonia solanacearum (anteriormentePseudomonas solanacearum), Xanthomonassp. y Bacillus sp.. Los géneros mas impor -tantes de hongos son: Fusarium, Verticillium,Phialaphora y Rhizoctonia (Lucas, 2004).

8.3.1.2. Factores que determinan el cultivo demeristemas

Los factores que determinan el cultivo de me -ris temas están relacionados principalmente almaterial inicial, por tanto se describen algu -nas consideraciones a tomar en cuenta:

a) Influencia del material inicial

• Tipo y edad del explante inicial. Laselección de un adecuado explante ini -cial determina mejores resultados en laregeneración o formación de plantas in

vitro. Este varía en dependencia de lascaracterísticas morfológicas de las es -pe cies (García y Noa 1998). Es aconse -jable trasladar previamente las plantasa invernadero, con la finalidad de some -terlas a un proceso de cuaren tena, paramejorar las condiciones sani tarias y te -ner la disponibilidad de los explantes amano.

• Tamaño del explante inicial. El tamañode los meristemas es directamente pro -por cional a su regeneración y creci -mien to posterior in vitro. El riesgo deaparición de patógenos en los tejidosvegetales aumenta con el incrementodel tamaño de los explantes iniciales. Amenor tamaño de los explantes, existeuna mayor probabilidad de obtenerplan tas libres de virus, a su vez, la rege -neración de los meristemas en plántu -las es menos probable (Aguirre, 1990).

El tamaño del inóculo es importante puesse tienen meristemas que miden de 0,01 a0,1 mm de diámetro, y ápices de tallo quemiden de 0,1 a 0,3 mm de diámetro;gene ral mente el número de plántulas libresde virus producidas es inversamenteproporcional al tamaño del meristema oápice cultivado (Walkey, 1978 citado porLucas, 2004). Usando este principio, Moriy Ho so kawa (1977) y Logan y Zettler(1985), citados por Helliot, et al. (2004),reportan la obtención del 100% de plantaslibres del CMV en Lilium y Gladiolorespectivamente.

El tamaño recomendado es variable y de -pen de del hospedante, de tratamientospre vios (termoterapia, quimioterapia, etc.)y del o los virus involucrados. En algunoscasos no sólo es importante considerar laespecie hospedante, sino también el culti -var, ya que se han detectado notables dife -r encias entre ellos (Aguirre, 1990; Conci2004).

• Características genotípicas. Existe unamarcada influencia del genotipo en el

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éxito del cultivo de meristemas, dondelos porcentajes de establecimiento va -rían no sólo entre especies, sino inclu -sive entre variedades y clones (García &Noa 1998).

• Estación o momento de la extracción.Los meristemas en activo crecimientoson los más recomendados por su altopotencial de desarrollo, situación quefavorece las posibilidades de obtenerplantas libres de virus. Para especiesvegetales con períodos de dormanciadefinidos, los mejores resultados se ob -tie nen cuando los meristemas estándespiertos y comienzan a brotar. Encaso de ser necesario, se recomiendadesper tar el material con pre tratamien -tos; los más usados consisten en some -ter a los explantes a períodos de oscuri -dad y de frío (variable según la especie)y/o al uso de ácido giberélico (Conci,2004). En el caso de tubérculos, esposible inducirlos a brotar de maneranatural, poniéndolos en contacto confrutos que en su proceso de madura -ción, emiten etileno. Asimismo, laadición de citoquininas en el agua deriego en plantas en maceta favorece laemisión de yemas para su posteriorcultivo in vitro.

b) Medios de cultivo. El medio de cultivo esun factor esencial ya que en él juegan unpapel vital los requerimientos nutriciona -les, hormonales y ambientales, específicosde la especie que estemos cultivando; esimportante, por otro lado, que éstos debensean semejantes a los que se tienen encondiciones naturales (Lucas, 2004). Lacomposición del medio nutritivo es com -pleja, ya que un meristema es una porciónmínima de la planta. Cada especie vegetales diferente e incluso distintas variedadesde una misma especie pueden requerir unmedio diferente.

Los medios MS son los más utilizados enespecies herbáceas. Los reguladores sue -len utilizarse en bajas concentraciones

(0,1-0,5 mg/l); normalmente se recomien -da la adición de los tres reguladores de cre -ci miento: la auxina puede ser necesariapara la formación de raíces, auxinas y cito -qui ninas para estimular la división celular;se añaden a veces las giberelinas para lo -grar la elongación del vástago. Los meriste -mas se aíslan sobre medio sólido, aunqueen algunos casos se utilizan medios líqui -dos. El pH por lo general se sitúa entre 5,6y 5,8 (Karta, 1981). Frecuentemente seutiliza vitaminas: vitamina B1, piridoxina,ácido nicotínico, ácido pantoténico, el azú -car habitual en reemplazo de sacarosa (2-6% p/v) (Auge & Boccon 1989); tambiénse incorporan al medio otros componentesorgánicos que favorecen a la regeneraciónde los meristemas como mioinositol y ca -seí na pancreática. En la preparación de losmedios de cultivo para la regeneración demeristemas de camote, oca y papalisa,una previa filtración del azúcar común encarbón activado (Anexo II), adsorbe lastoxi nas presentes en el azúcar y de estama nera se favorece a una mayor regenera -ción de los meristemas (Aguirre, 1990).

c) Condiciones de incubación. La temperatu -ra normal de crecimiento es de 21 a 25ºC;aunque la mayor parte de las plantas bul -bo sas requieren una temperatura másbaja. Temperaturas más altas (35-39°C) seutilizan solamente, para inactivar al virus.Los meristemas se cultivan a 16 horas defotoperiodo de 1.000-3.000 lux, a veces laluz fluorescente se suplementa con algo deluz roja. En ocasiones es necesario utilizaruna irradiación más baja durante losprimeros días después del aislamiento(Jiménez, 1998).

8.3.1.3. Fases del cultivo de meristemas

Según Navarro (1987), Auge & Boccon(1989), Aguirre (1990), Krikorian (1991) yLucas (2004), el proceso de cultivo in vitro demeristemas incluye varias etapas, que son:

• Fase 0. Selección de la planta madre yverificación del estado sanitario.

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• Fase I. Establecimiento del cultivoaséptico.

• Fase II. Propagación de propágalos y subcultivos

• Fase III. Enraizamiento de los propágulosobtenidos.

• Fase IV. Aclimatación..

• Fase VI. Control de virus y verificación delnuevo estado sanitario.

• Fase VII. Multiplicación masiva de lasplantas sanas.

a) Selección de la planta madre y verifica -ción del estado sanitario. Para la mayoríade las plantas propagadas in vitro, el mate -rial inicial es una planta seleccionada porsus características fenotípicas que respon -den al clon o variedad a propagar y por suscondiciones sanitarias y de vigor. Unaprac ti ca común para uniformar el estadofisiológico de los explantes es cultivar lasplantas donadoras en ambientes controla -dos de luz y temperatura y humedad relati -va, con niveles óptimos para el desarrollo(Jiménez, 1998).

Si la planta madre se encuentra enferma,se debe conocer el virus específico presen -te. Pues así las condiciones de cultivovarían, aplicándose termoterapia, quimio -te ra pia o simplemente el cultivo de meris -te mas (Navarro, 1987). El uso de serolo -gía, ELISA o plantas indicadoras permiteconocer el tipo de virus a erradicar y porende la estrategia a utilizar.

b) Establecimiento del cultivo aséptico. Paraefectuar el establecimiento de los explan -tes, se sigue en cámara de flujo laminar elaislamiento del meristema (Navarro,1987), ello de la siguiente manera: se de -be limpiar de forma previa los vástagoscui da dosamente. Se retiran las hojas de losvástagos, siempre que sea posible, y en -ton ces los vástagos (o yemas, si no se hanretirado las hojas) se sumergen durante 30segundos en alcohol de 70% v/v paraelimi nar las ceras presentes en superficie.Lue go se esteriliza durante 10 minutos en

una solución con lejía al 3-10% (v/v), con -te nien do (Tween 20), lavando inmediata -men te y por lo menos en tres oportunida -des con agua destilada y esterilizada.

Con la ayuda de un estéreo microscopio(aumento de 20 - 40 x), se retiran una poruna las hojas restantes y los primordiosfoliares, utilizando en esta operación:bisturíes nº 11, agujas de jeringa u hojasde rasurar cortadas a bisel montadas sobreun mango a presión. El meristema obteni -do con los primordios foliares (de 0,1 a0,2mm de tamaño) se siembra inmediata -mente sobre un medio nutritivo en mediosólido y en tubos de ensayo y se traslada ala cámara de crecimiento.

Los tubos de ensayo conteniendo los me -ris temas se deben revisar periódicamentepara observar el desarrollo de lo que serála futura planta (formación de hojas,yemas, tallo, etc.). Con la finalidad deacelerar el crecimiento, es recomendablecambiar el meristema cada semana a unmedio de cultivo fresco.

c) Fase de propagación de propágalos ysubcultivos. En esta fase se deben separarlos propágulos obtenidos y pasarlos a unmedio fresco para la proliferación de nue -vos brotes y para el desarrollo de los mis -mos. Los subcultivos se hacen de acuerdoa la cantidad de material requerido; cadasubcultivo dura de 4 a 6 semanas (Lucas,2004). La multiplicación puede efectuarsepor proliferación de brotes axilares, brotesadventicios, formación de embrionessomá ti cos, etc., tratando siempre de evitarla formación de callo como paso previo a ladiferenciación. Es frecuente que despuésde dos o más sub cultivos aumente elnúme ro de yemas que se producen a partirde un explante (Conci, 2004).

d) Fase de enraizamiento de los propágalosobtenidos. Fase en la cual se procede alenraizamiento de los propágulos para laobtención de plantas completas; dura nor -malmente cuatro semanas. En algunoscasos, prin ci palmente en plantas herbá -

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ceas, el enraizamiento sucede sin mayorcambio de medio; en otros casos, como enel banano y en frutales de clima templado,es impres cindible utilizar un medio rico enauxinas.

e) Fase de aclimatación. El traspaso decondiciones in vitro a condiciones ex vitroreviste una particular importancia; el ma -yor problema en esta etapa es la deshidra -tación debida a algunas característicasana tó micas de las plantas in vitro (reduci -da cera epicuticular, lentitud de movimien -to estomático, abundantes espacios inter -ce lu lares, dificultades en la conexión entreel tallo y la raíz).

Esta fase reviste un extremo cuidado. Esimprescindible contar con un invernaderode aclimatación y dentro de éste, con áreasaisladas y a prueba de áfidos para evitarcual quier recontaminación. Convienetrans fe rir las plantas a macetas y mante -nerlas con alta humedad relativa durantelos primeros 15 días, o cubrir las plantascon polietileno o recipientes de vidriotrans parente, a modo de cámara húmeda,y descubrirlas progresivamente hastadestaparlas completamente al cabo de 3 ó4 semanas. La etapa de acondicionamien -to a invernadero dura de 6 a 8 semanas(Conci, 2004). Nuestra experiencia indicaque a las cuatro semanas, las plantas yaes tán bien aclimatadas, además de mos -trar un desarrollo adecuado para poder to -mar muestras para la verificación sanitaria.

f) Fase de control de virus y verificación delnuevo estado sanitario. Una vez obtenidaslas nuevas plantas a partir de meristemas,las mismas deben ser evaluadas en rela -ción a su nuevo estado sanitario; para locual, un lote de las mismas se las mantie -ne aisladas durante un mes en condicionesde invernadero, para luego ser indexadashacia virus. No se recomienda efectuarestos indexajes en plantas in vitro, debidoa que la presencia viral puede estar laten -te, corriéndose el riesgo de obtener resulta -dos erróneos.

g) Fase de multiplicación masiva de las plan -tas sanas. Una vez comprobado el nuevoestado sanitario de las plantas, las mismaspueden ser multiplicadas masivamente ypueden ser incorporadas dentro de un sis -te ma formal de certificación de semillas.

8.3.1.4. Aplicaciones del cultivo de meristemas

El cultivo de meristemas es utilizado en lamultiplicación rápida de especies vegetales,para la obtención de plantas libres de patóge -nos, genéticamente idénticas a la planta ma -dre y para la conservación de germoplasma abajas temperaturas, ello a fín de constituir unstock de colecciones genéticas que pueden serutilizadas posteriormente en la propagación ycertificación de plantas sanas.

8.3.1.5. Técnicas complementarias al cultivode meristemas

a) Termoterapia. Para mejorar la eliminaciónde patógenos, técnicas de termoterapiapueden ser utilizadas de manera conjuntacon el cultivo de meristemas, cuando nollega a ser lo suficientemente eficaz sola -mente el cultivo de meristemas (Helliot, etal. 2004).

La termoterapia consiste en la exposiciónde plantas madre infectadas tanto comple -tas, como órganos o fragmentos de ellas atratamientos con temperaturas altas (36-52º C) o bajas (4º C), durante determina -dos períodos de tiempo. Esta técnica pue -de ser utilizada inicialmente en las plantasmadre, previa excisión meristemática, odirectamente en plantas ya establecidas invitro. El principio básico de los tratamien -tos radica en la posibilidad de eliminar lareplicación viral, en la hipótesis de que losvirus son termosensibles, en rangos detem peraturas y tiempos que sólo afectanligeramente a los tejidos vegetales (Nava -rro, 1987; Aguirre, 1990, García & Noa,1998).

Esta práctica no es efectiva para todos losvirus por igual, depende del virus y del hos -

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pe dante. Se ha observado que un mismovirus en distintas especies se inactiva enforma diferente. Generalmente, esta prácti -ca ha resultado más efectiva en virus departí culas alargadas (Aguirre, 1990;Conci, 2004).

La técnica consiste en someter gradual -men te a las plantas, de preferencia invitro, a temperaturas ascendentes, a unran go de 1º C por día, de manera que a losquince días de iniciado el tratamiento, lasplántulas in vitro se encuentren a una tem -peratura igual o superior a los 36º C. Lasplantas son sometidas a esta tempera turaun mínimo de tres a cuatro semanas, pos -te riormente, se obtienen sólo los meris te -mas y se los siembra en tubos de ensayocon el medio de cultivo adecuado (AnexoII).

Actualmente la alternativa de más éxito esel cultivo de meristemas apicales, frecuen -te mente combinado con termoterapia.Cuan do estos métodos son usados, lasplantas no sólo son liberadas de virus, sinotambién de hongos y otros patógenos(Lucas, 2004).

b) Quimioterapia. Es un método que consisteen la aplicación de productos químicos co -mo Ribavirin o Virazole al medio de cultivo,con la finalidad de obtener plantas libresde patógenos y asegurar la obtención dema terial sano. La adición de Virazole endosis de 100 mg/l, en el medio de cultivodurante más de 127 días, condujo a laefectiva erradicación del CMV en cultivosde Nicotiana rustica; sin embargo el creci -miento de tejidos se vió reducido.Simpkins, et al. (1981), citado por Helliot,et al. (2004). La aplicación de estos anti -virales al medio de cultivo en concentracio -nes variables de 10 a 50 mg/l, y en algu -nos casos hasta 100 mg/l, combinándoloscon el cultivo de meristemas permite lapro ba bilidad de obtener plantas libres devirus. Un problema importante con el Vira -zole es su fitotoxicidad, que a su vez de -pen de de la dosis empleada y de la especie

de planta utilizada (Navarro, 1987; Conci,2004).

Debido a que la multiplicación de los virusesta íntimamente ligada al metabolismocelular del hospedante, se podría sustentarque la aplicación de sustancias químicasespecíficas a plantas o tejidos infectadospuede acelerar su metabolismo y podríabloquear el mecanismo de síntesis de losvirus y eliminarlos. Sin embargo el uso delas sustancias quimioterapeuticas a dosiselevadas ha resultado fitotóxica destru yen -do las células de los tejidos tratados oreapa reciendo en plantas (Roca &Jayasinghi, 1982).

c) Electroterapia. La electroterapia consisteen pasar corrientes eléctricas a través delos tejidos infectados del vegetal. Cuantomayor sea la resistencia y más alto el am -peraje, más calor se genera. La producciónde calor es el principal cambio físico oca -sio nado por la corriente y el causante pri -mordial de sus efectos letales. La aplica -ción de pulsos eléctricos para eliminarvirus de tejidos de plantas ha llamado mu -cho la atención. Lozoya –Saldana et al.(1996), citados por Helliot, et al. (2004)reportan la eliminación del PVX a partir dediferentes clones de papa.

Algunos investigadores han obtenido resul -ta dos interesantes en cultivos de importan -cia económica, aplicando este método enespecies como: caña de azúcar (73- 100%de plantas sanas con 5 - 20 volt durante 5minutos); en ajo (53- 100% de plantassanas con 10-20 volt durante 5-30minutos); papa (más de 84% de plantassanas con 5 volt durante 5 minutos)(Hernández et al., 1997 citado porHernandez & Nápoles, 2004).

d) Crioterapia. Para varios cultivos, la criopre -ser vación ha sido usualmente utilizadapara superar limitaciones encontradas enlas estrategias de conservación de germo -plas ma en semillas, in vitro o en campo.La conservación a ultra bajas temperaturas

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(Helliot, et al. 2004), usualmente a - 196ºC , permite una conservación a largo plazode los recursos fitogenéticos, almacenán -do se las plantas en ambientes libres decontaminación.

En 1997, Brison, et al., citados porHelliot, et al. (2004), demostraron porprimera vez que los criotratamientos sonutilizados no solamente para la conserva -ción de germoplasma, sino también para laerradicación viral. La criopreservación per -mitió liberar de virus al 50% de brotes deun lote de plantas de cerezo infestadas conel virus de la viruela del cerezo.

La crioterapia actualmente es una técnicautilizada para inhibir la replicación viral.Consiste en líneas muy generales, endeshi dra tar previamente al explante,sumergiéndolo en una solución de Sorbitol0,5M, con la finalidad de favorecer el pro -ce so de congelamiento a -196 ºC (Helliot,et al., 2004).

La utilización de la criopreservación para laerradicación viral del mosaico del pepinoCMV y del virus del rayado del bananoBSV, fue investigada por Helliot, et al.(2002).

Plantas de banano var. Williams fueronmecánicamente infectadas por CMV y na -tu ral mente infectadas con BSV. Se prolife -ra ron meristemas de las plantas infecta -das, posteriormente los grupos de meriste -mas fueron excisados para ser criopreser -vados. El estado sanitario de las plantasregeneradas in vitro fue verificado median -te el test ELISA. La supuesta limpieza viralfue posteriormente verificada, previa acli -matación de las plantas in vitro. Lafrecuen cia de erradicación viral para CMVy BSV fue del 30 al 90% respectivamente.En comparación, la frecuencia de plantaslibres de virus regenerdas directamente delcultivo de meristemas correspondió a valo -res de 0% y 52% para CMV y BSV respec -ti va mente. Luego de las pruebas serológi -cas correspondientes, se ha concluído que

esta técnica es válida para obtener plantaslibres de virus en banano y plátano (Helliotet al., 2002).

8.3.2. Técnicas avanzadas de diagnósticode virus

En las últimas décadas se han realizado im -por tantes avances en la detección de virus. Ladetección serológica fue ampliamente mejora -da con la aplicación de ELISA (Enzyme linkedimmunoabsorbent assay). En la década de los80, esta tecnología todavía fue mejorada conlos anticuerpos monoclonales y su aplicacióna un gran número de virus que afectan a plan -tas. Así mismo, la hibridización de acido nu -cleí co ha sido utilizado en la detección devirus y viroides. La clonación de ácido nucleí -co de plantas y el desarrollo de métodos dedetección no radioactiva ha incrementado lautilidad de la hibridación de ácido nucleícopa ra la detección de virus. Recientemente eldesarrollo de PCR (Polymerase chain reaction)ha mejorado grandemente la sensibilidad dedetección. Finalmente, La PCR immunocaptu -ra combina los avances de la serología y PCRcomo un método altamente sensible dedetección.

8.4. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

Las técnicas de obtención de plantas libres devirus, son una de las más importantescontribuciones del cultivo de tejidos in vitrohacia la agricultura, al evitar cualquierdiseminación de enfermedades hacia zonaslibres de éstas y al favorecer la difusión dematerial vegetal libre de patógenos, quepueden a su vez demostrar su verdaderopotencial productivo, además de mantener sualta calidad genética.

Asimismo, la conservación de recursos fitoge -néticos debe partir inicialmente de un procesode identificación y de erradicación de enfer -me dades virales dentro de sus colecciones. Esaltamente riesgoso diseminar variedades sin

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antes no haber sido sometidas las mismas aun proceso previo de limpieza viral.

Una de las grandes oportunidades para desa -rro llar nuestra agricultura es que los progra - mas de certificación de semillas impulsadospor el INIAF, necesariamente deben basarseen estas técnicas para garantizar la alta cali -dad genética y sanitaria de su material madre.

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9.1. INTRODUCCIÓN

La reproducción de plantas en nuestro mediose realiza principalmente mediante semillasproducidas por los agricultores y/o empresasespecializadas semilleristas. Este material noes uniforme genéticamente, a consecuenciadel manejo efectuado y en plantas alógamaspor la fecundación abierta que presentan.

La obtención de plántulas con característicasgenotípicas y fenotípicas comunes, se puedenrealizar mediante cultivo de tejidos y cultivoscelulares que posibilitan el mejoramiento y unpuente necesario para llevar a cabo las mani -pu la ciones fenotípicas y genotípicas desde ellaboratorio hasta el campo para la obtenciónde plántulas y/o semillas puras de excelentecalidad. Para este propósito se tienen variastécnicas que el laboratorio puede seguir deacuerdo con la especie a tratar y con los obje -tivos que se pretenda seguir en las investiga -ciones y en la producción masiva.

El Laboratorio de Biotecnología Vegetal de laFacultad de Ciencias Agrícolas, Pecuarias,Forestales y Veterinarias de la UMSS harealizado investigaciones con esta técnica,para lo cual se realizaron dos trabajosexperimentales con la especie Daucus carota(zanahoria), como especie tipo con las tesisde Mary Luz Florero Orellana y María ElenaReyes Alvares en 2001, posteriormente se

realizó también en Saintpaulia ionantha H.Wendl (violeta africana) de Nelson ChávezAlcoba en 2007.

Con estas técnicas se lograron obtener gran -des volúmenes de plántulas genotípicamentey fenotípicamente iguales a la planta madre.

9.2. MULTIPLICACIÓN VEGETATIVA

El método de multiplicación más sencillo espor simple división de la planta, o por esque -jes, que se realizan cortando pequeñas seccio -nes de tallos u hoja y colocándolas en un sus -trato estéril con una temperatura templada de10 a 12º C. Murashige (1962), citado porRoca y Mroginsky (1991).

En la multiplicación clonal o vegetativa deplan tas se utilizan tejidos vegetales que con -serven la potencialidad de multiplicación ydife renciación celular (totipotencia celular)17

para generar nuevos tallos y raíces a partir decúmulos celulares presentes en diversosórganos Krikorian (1985), citado por Roca yMroginsky (1991).

La multiplicación vegetativa comprende desdeprocedimientos sencillos, conocidos de tiem -pos inmemoriales por los campesinos de todoel mundo hasta procedimientos tecnológica -

Capítulo 9Embriogénesis somática

y mutagénesis

Juan Villarroel & Nelson Chávez

17 * Docente FCAFyV; ** Investigador laboratorio

mente avanzados, basados en la tecnologíadel cultivo de tejidos vegetales, mediante loscuales se puede lograr la propagación masivade plantas genéticamente homogéneas,mejoradas y libres de parásitos (Debergh &Zimmerinan, (1998).

9.3. MORFOGÉNESIS

La morfogénesis es el resultado de una organi -zada división y diferenciación celular conpatro nes definidos, que depende básicamentede la actividad y expresión de criterios genes.Tales procesos se relacionan íntimamente conmúltiples factores que son imposibles de defi -nir aisladamente, ya que interactúan en cadafenómeno morfogenético.

La embriogénesis somática y la organogénesisson dos procesos morfogénicos que sucedenfrecuentemente durante el cultivo in vitro deespecies vegetales (Radice, 2008).

a) Embriogénesis directa u Organogénesis.Es la formación de órganos a partir de lostejidos proporcionados por el explante. Laorganogénesis normalmente envuelve laregeneración de yemas a partir de célulasmeristemáticas.

b) Embriogénesis indirecta. Durante este pro -ceso se requiere previamente la formaciónde un tejido desdiferenciado y desorgani za -do al que se denomina callo, a partir deeste se desdiferencia el tejido. La embrio-gé ne sis somática imita a la embriogénesiscigótica que es la formación de embrionesa partir de tejidos somáticos in vitro, deesta manera la embriogénesis somática ycigótica culminan en la formación de unaplanta entera a partir de una célula.

9.4. DIFERENCIA ENTREORGANOGÉNESIS YEMBRIOGÉNESIS

A continuación se detallan tres diferenciasprincipales:

• Los embriones somáticos poseen sistemavascular con conexiones como un sistemade explante inicial, como ocurre en laorganogénesis.

• La estructura formada durante la embrio -gé nesis es bipolar (con eje caulinar yradicular).

• En la organogénesis son formadas yemascaulinares que más tarde darán origen alas raíces adventicias.

9.5. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

La embriogénesis somática es un procesobioló gico a partir del cual una célula o un gru -po de células somáticas transforman y secom portan como un cigoto originando un em -brión (semilla), que posteriormente formaráuna nueva planta.

9.6. CARACTERÍSTICAS DE LAEMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

Es posible la reproducción asexual de plantaspor cultivo de tejidos gracias a que cada unade las células de una planta posee la capaci -dad necesaria como para permitir el creci -mien to y desarrollo de un nuevo individuo, sinque medie ningún tipo de fusión de célulassexuales o gametos. Esta capacidad está dadapor la información genética contenida en elDNA nuclear de cada célula somática y sedeno mina totipotencialidad de la célula. Bási -camente la multiplicación asexual se puederealizar debido a que las células poseen unmecanismo de división mitótico, mediante elcual, los vegetales cumplen sucesivas etapasde crecimiento y desarrollo. La división celularmitótica implica una replicación de los cromo -somas de las células hijas, por lo que lasmismas poseen un genotipo idéntico al de lacélula madre (Reinert et al, 1958; Steward etal, 1958; Bracks-Husemann et al, 1970 cita -do por Roca & Mroginski, 1991).

Las células vegetales crecidas en condicionesasépticas sobre medios de cultivo adicionados

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con reguladores del crecimiento (llamadostam bién hormonas vegetales), pueden divi dir -se dando dos tipos de respuesta. Una desdife -renciación celular acompañada de crecimien -to tumoral, que da lugar a una masa de célu -las denominada callo la cual, si se crean lascon diciones adecuadas es capaz de generarórganos (organogénesis o embriogénesis di -rec ta) o embriones somáticos (embriogénesissomática denominada también embriogénesisindirecta).

Los embriones somáticos mantienen una simi -litud con los embriones cigóticos, sin embargotanto in vivo como in vitro pueden ocurriralgu nas anormalidades en el desarrollo, porejem plo la faciación y la fusión de los cotile -do nes Flick et al, (1983); Thorpe, (1983)citado por Roca & Mroginski (1991).

El embrión somático presenta las siguientescaracterísticas:

• Tiene autonomía frente al tejido generador(protegido generalmente por una epider -mis). Histológicamente se plantea que notiene conexión vascular con el tejido que ledio origen por lo que pueden ser separadosfácilmente de este, mediante agitadoressheiker.

• Es una estructura bipolar con un ápiceradical apical y cotiledones.

• Presenta bandas procambiales entre losápices.

Los embriones somáticos como estructuras bi -po lares presentan un eje apical-radical, aisla -dos por un tejido epidérmico, así mismo no po -seen conexión con el tejido materno. Estas es -tructuras bipolares deben ser capaces de cre cery formar plantas normales (Jimenez, 1998).

La embriogénesis somática es la formación deembriones a partir de células somáticas queno son producto de la fusión de gametos, porlo que cada una de las plántulas que se pro -du cen son fenotípica y genotípicamente idén -ticas a la planta original de la que se deriva.

9.7. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICADIRECTA

La embriogénesis somática directa de acuerdoa Gómez (1999), ofrece la posibilidad deobtener embriones somáticos directamentedesde células aisladas o grupos de células sinla formación de callos, este desarrollo directoes producto de la fusión realizada por la com -posición del medio de cultivo y el origen delexplante. Esto ofrece la posibilidad de generarmuchas aplicaciones como:

• Clonado directo de híbridos comercialesF1, para especies donde el material puedeser vendido como plantas jóvenes paratrasplante a campo.

• Clonado rápido de un material de aprecia -do valor para el mejoramiento, en el estadomás temprano posible de su ciclo de vidadespués del cruzamiento.

• Selección in vitro y mejoramiento de lascaracterísticas fenotípicas y genotípicaspa ra diferentes caracteres de plantas com -pletas en el estado más temprano posiblede su ciclo de vida.

• Generación de plantas jóvenes, clones deespecies fruto del mejoramiento donde ca -da semilla representa un genotipo diferen te.

• Mecanización y automatización de lapropagación micro clonal mediante el usodel sistema de biorreactores.

La embriogénesis somática directa, se produ -ce cuando los embriones se forman directa -men te de las células del explante (por ejemplocélulas epidérmicas).

9.8. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICAINDIRECTA

La embriogénesis somática indirecta segúnGómez (1999), ocurre cuando las células deltejido deben sufrir varias divisiones mitóticasen presencia de una auxina durante la induc -ción del estado de células embriogénicas. Es -

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tas divisiones mitóticas dan lugar a un callo,aunque también pueden obtenerse a partir desuspensiones celulares y protoplastos. Losembriones somáticos pueden ser obtenidosdesde varias fuentes de cultivos tales comohojas jóvenes, inmaduras, inflorescencias,peciolos, entre otros. La reacción del explantepara la embriogénesis está determinada por laedad de éste, así con la concentración deauxinas y citoquininas empleadas.

Existen dos tipos de embriogénesis indirecta,una conocida como embriogénesis somáticade baja frecuencia, en la que el número deca llos con embriones somáticos es mayor,aun que se forman pocos embriones somáticospor callo o en pequeños grupos que se desa -rrollan completamente pasando por los dife -ren tes estados de desarrollo. La otra conocidacomo embriogénesis somática de alta fre -cuen cia, donde los embriones somáticos apa -recen entre las 16 a 20 semanas de cultivo,no se desarrollan completamente y se mantie -nen en estado globular, agrupados en un nú -me ro mucho mayor, aunque estos grupos apa -recen en un número menor de callos (Gómez,1999).

La embriogénesis somática indirecta se produ -ce con la formación de embriones a partir deca llos embriogénicos y que, la gran mayoría delos sistemas que forman embriones somáti cos,lo hacen mediante la llamada ruta indi rec ta.En las dicotiledóneas, por ejemplo las célulastotipotentes siguen patrones de divi sión y danorigen a pro-embriones, las cuales a su vezdan origen a las etapas de corazón torpedo ycotiledonar; en sí, el desarrollo es pro gresivosegún el patrón cigótico normal, Ló pez et al.(1993) citado por Florero (2001).

9.9. FASES DE LA EMBRIOGÉNESISSOMÁTICA (ES)

El proceso de la embriogénesis somática indi -recta de acuerdo a Fujimura & Komamine(1980) citado por Roca & Mroginski (1991) yPérez (1998), pasa por cuatro fases (0, 1, 2,3) reconocidas desde los estadios tempranosde desarrollo (Fig. 1), las cuales fueron obser -vadas en zanahoria (D. carota). En el labora -torio de la FCAPF y V se obtuvieron los mis -mos estadios tanto en zanahoria como envioletas africanas, las que se muestran acontinuación.

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Figura 1. Esquema de fases de la embriogénesis somática

Fuente: Roca & Mroginski (1991).

Durante la fase 0, la célula aislada por conti -nuas divisiones forma los agregados celularesembriogénicos con la presencia de la auxinaen el medio de cultivo; en este tiempo, losagre gados de células formados desde lascélulas aisladas, ganan la habilidad para eldesarrollo de embriones cuando la auxina eseliminada del medio, dando lugar al estadio 1(agregado celular). Este agregado es inducidoa un nuevo medio libre de auxina en el cualocurre una rápida división celular de ciertas

partes del agregado celular, dando origen a lafase 2 (globular). En esta fase se produce unadivisión celular acelerada de ciertas partes delagregado producto de la polarización de lasín tesis de ADN, dando lugar al embrión glo -bular en la fase final (fase 3), prosigue el con -ti nuo desarrollo del embrión al estado de cora -zón, posteriormente al estado de torpedo,denominados así por la apariencia que estospresentan.

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Figura 2. Diferentes formas de células desdiferenciadas en violetas (S. ionantha)

Figura 3. Embriones en estado globular

Figura 4. Embriones en estadio de corazón

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Figura 5. Embrión en estado de torpedo

Figura 6. Embriones en estado cotiledonar

9.10. FACTORES QUE INFLUYEN ENLA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

Los factores que influyen en la embriogénesissomática son: Tipo de explante, genotipo,estado fisiológico, edad de la planta dona do -ra, medio de cultivo, interacción de los regula -dores de crecimiento (auxinas y citoquininas),ambiente, y otros (Radice, 2008).

9.11. INDUCCIÓN MUTAGÉNICA

Con el propósito de observar la acción muta -gé nica en el cambio del color de las flores enSaintpaulia ionantha (violeta africana), serealizó una investigación con la tesis deChávez Alcoba Nelson, en el que se mostró loscambios en los colores de las flores por efectode la inducción mutagénica de la luz ultra -violeta, 2,4-D y la colchicina.

Las mutaciones somáticas se originan me -dian te cambios en las células del individuo envías de desarrollo en diversas partes del vege -tal, en cultivo de tejidos estas variaciones sonmuy frecuentes y aún más cuando se usanagentes mutagénicos, Nodarse et al. (1992).

Al respecto E. Mendoza de Gyves (1994) indi -ca que las mutaciones son esencialmentecam bios imprevistos que tienen lugar en elmaterial hereditario de un organismo, es decir,comprenden todas las alteraciones que no sepueden explicar como consecuencia de la nor -mal recombinación de la unidad hereditaria.Estas alteraciones son la fuente verdadera dela variabilidad genética responsable en últimainstancia de la evolución de todas las formasde vida actuales, una mutación cambia laestructura o la función de un organismo y desu descendencia modificando la naturalezaquímica del material genético o alterando laestructura cromosómica. La mayoría de lasveces, tal mutación es nociva (desventajosa) yel cambio que determina será eliminado porselección natural. De vez en cuando, unamutación puede resultar ventajosa o sea queaumenta la probabilidad de sobrevivencia y de

reproducción de los vegetales que son direc -tamente útiles al ser humano.

La mutación es el cambio en la secuencia debases del ácido desoxirribonucleico (ADN) deun organismo, como fuente primaria de varia -bi lidad genética en las poblaciones. Un agentemutágeno es todo factor capaz de aumentar lafrecuencia de mutación natural, existen diver -sos factores, tanto físicos como químicos,capaces de actuar como agentes mutágenos.En realidad, actuarán como agentes mutáge -nos todos aquellos agentes capaces de alterarel material genético y en particular, aquellosque alteren la secuencia del ADN.

Las mutaciones son fuente de variabilidadgené ti ca en los organismos. La variabilidadcausada por las mutaciones inducidas no esesencialmente diferente de la causada por lasmutaciones espontáneas durante la evolución.El uso directo de las mutaciones es una herra -mienta muy valiosa para el mejoramiento deplantas, particularmente cuando se desea me -jo rar uno o dos caracteres fácilmente identifi -ca bles en una variedad bien adaptada (Suá -rez, 2006).

9.12. TIPOS DE MUTACIONES

Las mutaciones pueden ser espontáneas oindu cidas, las primeras son aquellas que sur -gen normalmente como consecuencia de erro -res durante el proceso de replicación del pro -pio DNA. Tales errores ocurren con unafrecuencia de 10-7 a 10-11.

Las mutaciones inducidas surgen como con -se cuencia de la exposición a mutágenos quí -micos, biológicos o a radiaciones. En cual -quier caso, las mutaciones pueden ser:Puntuales (cuando afectan a un par de bases)o mutaciones que afectan a muchos pares debases. Cuando es puntual, el resultado puedeser una proteína defectuosa (entonces la mu -ta ción se conoce como mutación por cambiode sentido, pues origina la sustitución de unaminoácido por otro), o una proteína incom -

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ple ta (mutación sin sentido, porque la muta -ción ha originado un codón de fin antes detiem po), o bien una proteína normal (muta -ción silenciosa), porque el aminoácido al queha dado origen es el mismo debido a la dege -ne ración del código genético. Estas muta -ciones puntuales son reversibles.

9.13. MUTACIÓN ESPONTÁNEA EINDUCIDA

Según Sánchez (2007) las mutacionespueden ser espontáneas e inducidas:

9.13.1. Mutación espontánea

Se produce de forma natural o normal en losindividuos. Las principales causas de lasmutaciones que se producen de forma naturalo normal en las poblaciones son tres:

• Errores durante la replicación.

• Lesiones o daños fortuitos en el ADN.

• Los elementos genéticos transponibles.

9.13.2. Mutación inducida

Se produce como consecuencia de la exposi -ción a agentes mutagénicos físicos o químicosque producen mutaciones (cambios) en lasecuencia del ADN.

a) Mutaciones Físicas. Las mutaciones resul -tan de la aplicación de agentes físicoscomo radiaciones:

• Las radiaciones electromagnéticascomo los rayos X y los rayos gamma.

• Las radiaciones corpusculares como losrayos α, los rayos β y los flujos deprotones neutrones que generan losreactores nucleares u otras fuentes deradiactividad natural o artificial.

• Factores físicos como los ultrasonidos,los choques térmicos, la centrifugación,etc.

Microsof Encarta (2006), indica que lasradiaciones ionizantes (rayos X, rayoscósmicos y rayos gamma), no ionizantes(sobre todo la radiación ultravioleta)también inducen mutaciones en el DNA;las primeras se originan por los radicaleslibres que reaccionan con el DNA inacti -ván dolo, y las segundas aparecen comoconsecuencia de la formación de dímerosde pirimidina en el DNA, es decir, comoconsecuencia de la unión covalente de 2bases pirimidínicas adyacentes.

Así mismo las mutaciones que afectan amu chos pares de bases pueden ser dele -cio nes (en las que se elimina una regióndel DNA), inserciones (se añaden nuevasba ses), translocaciones (grandes fragmen -tos de DNA se cortan e integran en nuevaslocalizaciones, incluso a veces en diferen -tes cromosomas) e inversiones (en las quela orientación de segmentos particularesdel DNA resulta invertida con respecto alresto del cromosoma).

Los productos más importantes de la ac -ción de la luz UV son dímeros (timina-timi -na; timina-citosina; citosina-citosina) quese forman entre pirimidinas (T-C) adyacen -tes, lo que incrementa enormemente laprobabilidad de que durante la replicacióndel DNA, la DNA polimerasa inserte unnucleótido incorrecto en tal posición.

b) Mutaciones Químicas. Las mutacionesquí mi cas son cambios producidos en elDNA resultado de la aplicación de produc -tos químicos como:

• Los análogos de las bases nitrogenadas.

• El ácido nitroso (HNO2), porque desa -mina ciertas bases nitrogenadas.

• Los alcaloides como la cafeína, la nico -ti na y otros.

• El colchicinum, que produce aloploidias enlas estructuras de las células.

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• 2-4 Diclorofenoxiacetico, provoca cambiosen la estructura de la cromatina, tambiénen cultivos de células humanas.

La sustancia por excelencia utilizada paraindu cir la poliploidía es la colchicina, que esun alcaloide que se encuentra en las semillasy en los bulbos de Colchicum autummnale L.Éste afecta a las células en división de tal for -ma que, a la separación de las cromátidas decada cromosoma no sigue la migración de lasmismas hacia los polos opuestos porque elefecto de la misma es inhibir la formación delhuso acromático. Al no haber movimiento delas cromátidas a los polos no se establecen lascorrientes citoplásmicas que determina la for -mación de la membrana celular que se forma -rá entre las dos células hijas; por lo tanto, lamitosis que se produce bajo la influencia de lacolchicina se denomina c-mitosis dando lugara la duplicación del complemento cromosó -mico completo.

9.14. NIVELES MUTACIONALES

Los niveles mutacionales es una clasificaciónde las mutaciones basada en la cantidad dematerial hereditario afectado por la mutación,descrito como sigue:

• Mutación génica

• Mutación cromosómica

• Mutación genómica

9.14.1. Mutación génica

Las mutaciones pueden ser:

a) Sustituciones de bases. Cambio o sustitu -ción de una base por otra en el DNA.

b) Transiciones: cambio de una purina (Pu)por otra purina, o bien cambio de una piri -midina (Pi) por otra pirimidina. (Mutaciónsilenciosa).

c) Transversiones: cambio de una purina (Pu)por una pirimidina (Pi) o cambio de unapirimidina (Pi) por una purina (Pu).

d) Inserciones o adiciones y deleciones de nu -cleótidos. Se trata de ganancias de uno omás nucleótidos (inserciones o adicio nes) yde pérdidas de uno o más nucleóti dos(deleciones). Tienen como consecuenciacambios en el cuadro o pauta de lecturacuando el número de nucleótidos ganado operdido no es múltiplos de tres.

e) Duplicaciones. Se origina con la repeticiónde un segmento de DNA en el interior deun gen.

f) Inversiones: Se produce cuando unsegmento de DNA del interior de un gen seinvierte, para ello es necesario que se pro -duz can dos giros de 180º, uno para inver -tir la secuencia y otro para mantener lapolaridad del DNA.

g) Transposiciones. Es producida cuando unsegmento de un gen cambia de posiciónpara estar en otro lugar distinto del mismogen o en otro lugar del genoma.

9.14.2. Mutación cromosómica

La mutación que afecta a un segmento cromo -sómico que incluye varios genes, puede darorigen a cambios cromosómicos estructurales;estos son los cambios en la estructura internade los cromosomas, los cuales se puedenagru par de acuerdo a las pérdidas o duplica -cio nes y reparto.

a) Las que suponen pérdidas o duplicacionesde segmentos de cromosoma:

- Delección cromosómica: Es la pérdidade un segmento de un cromosoma.

- Duplicación cromosómica: Es la repeti -ción de un segmento del cromosoma.

b) Las que suponen variaciones en la distribu -ción de los segmentos de un cromosoma:

- Inversiones: Son producidas cuando unsegmento cromosómico de un cromo so -ma se encuentra situado en posicióninvertida.

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- Translocaciones: Son dadas cuando unoo varios segmentos cromosómicos deun cromosoma se sitúan en otro cromo -soma.

9.14.3. Mutación genómica

Cuando la dotación cromosómica normal deun individuo está compuesta por varios geno -mios o juegos completos de cromosomas sedice que es un poliploide. Si los genomios soniguales, el poliploide es un autopoliploide y selo denomina autotriploide, autotetraploide,autopentaploide, n-ploide según el número dejuegos idénticos de cromosomas que tengansus células somáticas (3, 4, 5 ó n). Susnúme ros cromosómicos serán por tanto 3x,4x, 5x, nx, siendo x el número básico antesdefinido. Así mismo si los genomios que com -ponen la dotación cromosómica del poliploideno son iguales, entonces se llama aloploide. Elaloploide reúne en su complemento cromosó -mico dos o más especies diploides. Si unaespecie aloploide está formada por dos geno -mios distintos, se llama alotetraploide (G1 G1G2 G2), si son tres lo genomios, se trata de unalohexaploide (G1 G1 G2 G2 G3 G3 ), etc.

La mutación que afecta a cromosomas com -ple tos (por exceso o por defecto) o a juegoscromosómicos completos. Puede dar origen acambios cromosómicos numéricos como lasproducidas por la colchicina, producto de unaduplicación cromosómica.

Es importante aclarar el concepto de muta -ción silenciosa, una mutación silenciosa escual quier alteración en la secuencia de nu -cleó tidos del DNA que no produce cambio enel fenotipo estudiado. Imaginemos que la ca -rac terística externa o fenotipo analizado essim plemente la función de un enzima, es evi -den te que existen mutaciones en la secuenciade nucleótidos del DNA que no producencam bios en la secuencia de aminoácidos,pero también hay mutaciones en el DNA queproducen cambios en la secuencia de amino -áci dos que no alteran la función del enzima

analizado. Ambas tipos de mutaciones sonsilenciosas ya que ninguna altera la funcióndel enzima.

9.14.4. Especificidad mutacional

La especificidad mutacional significa que mu -chos agentes mutágenos tienden a producirun determinado tipo de mutación, porejemplo:

• Etilmetanosulfonato (EMS): produce fun -da mentalmente transiciones GC, AT.

• Nitrosoguanidina (NG): produce esencial -mente transversiones GC, TA.

• Luz ultravioleta (UV): produce transicionesy transversiones.

• Colchicina: produce duplicaciones cromo -só micas

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10.1. CONSERVACIÓN DEGERMOPLASMA

La gran mayoría de las especies cultivadas sehan originado en ocho centros de origen don -de se conserva la mayor diversidad genética.Bolivia está ubicada dentro de uno de estoscentros de origen y en su intrincada geografía,que ha dado origen a innumerables microcli -mas, se han diversificado de manera parti cu -lar numerosas especies de importancia econó -mica mundial y especialmente local.

Los recursos genéticos son la base de la ali -men tación de la humanidad, suplen la mayo -ría de necesidades (incluyendo el vestido y elrefugio) y se utilizan en la industria para fabri -car combustibles, medicinas y otros productos(Jaramillo & Baena, 2000). Por lo tanto, sonrecursos estratégicos para el desarrollo de to -do país, ya que se relacionan con la satisfac -ción de necesidades básicas del hombre y conla solución de problemas severos como elham bre y la pobreza. Sin embargo, a pesar dela invaluable importancia económica, produc -ti va y cultural de estos recursos, ellos están enriesgo de erosionarse y hasta de desaparecer.Las causas son diversas, como cambios en elambiente y en los hábitos alimentarios, des -trucción de hábitats naturales, sustitución devariedades nativas, cambios en las prácticasagrícolas y otras.

En consecuencia, es de fundamental impor -tan cia el desarrollar estrategias integrales parala conservación de los recursos genéticos par -ti cularmente en los países poseedores de grandiversidad como Bolivia.

La conservación de recursos genéticos puedeser a nivel in situ en sus hábitats naturales, exsitu fuera de sus hábitats naturales bajo con -di ciones controladas, o bien combinando demanera complementaria los métodos ex situ ein situ. La selección de uno o un conjunto demétodos depende de las necesidades, los re -cur sos disponibles y de la(s) especie(s) obje -tivo (Jaramillo & Baena, 2000).

La conservación in situ de especies agrícolasse realiza fortaleciendo la conservación en loscampos de agricultores donde se cultivan des -de tiempos ancestrales en zonas cuyas carac -terísticas medioambientales y socioculturalesson favorables al mantenimiento y evoluciónde la diversidad genética, tanto cultivada co -mo silvestre (García et al., 2003). La conser -vación in situ es dinámica en relación a lanaturaleza semi-estática de la conservación exsitu, porque mantiene el potencial evolutivode las especies y las poblaciones (RamanathaRao, 2001).

La conservación ex situ es la conservación degenes o genotipos fuera de su ambiente deocu rrencia natural, para uso actual o futuro

Capítulo 10Conservación in vitro de

especies vegetales

Ximena Cadima & Carmen L. Villarroel

(Jaramillo & Baena, 2000). Se aplican dife -ren tes técnicas de conservación que varían deacuerdo a la especie objetivo. Para las espe -cies vegetales que se propagan vía semillabotánica y son ortodoxas (es decir soportan ladisminución del contenido de humedad de lasemilla sin perder su viabilidad), la forma deconservación es por semilla en contenedoresalmacenados a bajas temperaturas. Las espe -cies de propagación vegetativa o de semillarecalcitrante (que no soportan la disminucióndel contenido de humedad), deben conser var -se clonalmente para lo cual se utilizan cam -pos de cultivo o también técnicas de cultivode tejidos.

Brevemente, la conservación ex situ puederea li zarse en forma de (Ramanatha Rao,2001):

• Plantaciones en campo

• Colecciones en invernaderos

• Colecciones de semilla y/o polen a bajastemperaturas

• Colecciones de ADN

• Jardines botánicos

• Colecciones in vitro

10.2. CONSERVACIÓN IN VITRO

Una gran cantidad de especies vegetales nopueden ser conservadas por semilla, y parava rias otras incluso la conservación por tu -bérculos, rizomas, raíces o árboles resultacomplicado. En este sentido, para algunasespecies la conservación in vitro es la únicaopción disponible (Ramanatha Rao, 2001).Las colecciones de campo a menudo estánexpuestas al ataque de enfermedades o adver -sidades climáticas severas, que ponen enriesgo las colecciones de germoplasma. Unaalternativa valiosa para complementar estascolecciones es la conservación in vitro (Hor,2001).

En general, las técnicas de cultivo de tejidosse aplican para apoyar procesos de manejo yaprovechamiento de germoplasma en forma

más eficiente, como ser: la recuperación de lasanidad de las plantas, la producción de semi -lla, la micropropagación masiva de materialvegetal, y la conservación de “semilla” pormayor tiempo y de manera menos costosa.

Estas técnicas son particularmente impor tan -tes para especies de propagación vegetativa ycuando la intención es mantener uniformidad,calidad genética y fitosanitaria.

Normalmente, la conservación in vitro es con -si derada parte fundamental de las estrategiasde conservación ex situ de colecciones degermoplasma (Cadima & Rojas, 2004; Cadi -ma et al., 2004). Las primeras experienciassobre conservación in vitro reportadas en Bo -li via datan de la década del 90 en papa yotros tubérculos andinos (Cadima et al.,1996; Cadima, 1996), que sirvieron de basepara la aplicación posterior en diferentes culti -vos en el país. Actualmente, se utilizan técni -cas de cultivo de tejidos para conservar clo -nal mente colecciones de germoplasma de di -fe rentes especies en laboratorio (papa y otrostubérculos andinos, yacón, arracacha, achira,banano, frutilla, manzano, durazno, uchuva,pasifloras, especies forestales leñosas, plantasmedicinales, entre otros) (PROINPA, 2008;Coca et al., 2007; Rojas, 2005; Coca et al.,2004; Ugarte, 2004; Paz, 2004).

El cultivo de tejidos es una técnica comple -men taria de la conservación ex situ, porquepermite salvaguardar material con riesgo deperderse en campo, adicionalmente, permiterecuperar la sanidad de las plantas las cualesse mantienen limpias in vitro, permitiendo suaprovechamiento para producir semilla de altacalidad cuando es requerida para mejorar suconservación en campo debido a problemasde degeneración, o bien para la devolución oreposición de variedades saneadas a comuni -dades ya sea por demanda o porque se hayanperdido en sus zonas de producción(PROINPA, 2008).

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10.2.1. Definición de conservación in vitro

Conservar in vitro consiste en aplicar técnicasde cultivo de tejidos para controlar el creci -mien to de las plantas viables, ya sea redu -cien do o deteniéndolo, a través de la manipu -la ción de los componentes del medio decultivo y/o las condiciones de almacenamiento(Jaramillo & Baena, 2000).

10.2.2.Géneros (cultivos) que se puedenconservar in vitro

Utilizando técnicas de cultivo de tejidos esposi ble conservar in vitro un amplio rango deespecies en diversos tipos de muestra comoplantas completas, semillas, retoños, yemas,ápices caulinares, meristemas, óvulos, em -briones, células en suspensión, protoplastos,anteras, polen y ADN. En el Cuadro 1 semuestra un resumen de los cultivosreportados por Roca et al. (1991) que sonconservados bajo condiciones in vitro.Engelmann (1991) menciona que las técnicasde cultivo de tejidos se aplican en más de1.000 especies.

10.2.3.Ventajas y limitaciones de laconservación in vitro

Las ventajas de la conservación in vitro enrelación a una conservación in vivo se listan acontinuación:

• Permite ahorro de espacio y tiempo. Porejemplo alrededor de 900 accesiones de lacolección in vitro de papa custodiada porla Fundación PROINPA se mantienen enmenos de 4 metros cuadrados, en tantoque en el campo se requieren al menos 5mil metros cuadrados.

• Permite el almacenamiento de diferentesespecies en un solo ambiente. Por ejemplo,en el caso de las colecciones de tubérculosy raíces custodiadas por PROINPA, esposible su almacenamiento in vitro en unmismo ambiente, en cambio en campo serequieren condiciones de puna paratubérculos y yungas para raíces.

• El cultivo in vitro permite conservarespecies vegetales en peligro de extinción(Pierik, 1990).

• En condiciones in vitro se elimina el riesgode ataque de factores bióticos y abióticosque normalmente ocurren in vivo.

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Fuente: modificado de Roca et al. (1991).

Cuadro 1. Géneros que se pueden conservar in vitro

• El costo de mantenimiento es inferior acualquier otro sistema ex situ. Los costosde implementación in vitro son altos, perolos de mantenimiento en el largo plazo sonmenores a cualquier otro sistema ex situ.

• El intercambio de material es más fácil.Por cuanto cada planta se almacena enpequeños envases (como tubos de ensa -yo), se facilita el movimiento de materialde un lugar a otro.

• El movimiento de germoplasma entrepaíses o de centros internacionales hacialas entidades de investigación nacionaleses mucho más seguro debido al mínimoriesgo que implican las plantas in vitro, dellevar enfermedades u otros patógenos deun lugar a otro.

• Permite el almacenamiento de plantas queno pueden reproducirse por semilla ocuyas semillas son difíciles de germinar(Pierik, 1990).

• Disponibilidad permanente de material ge -né tico. Las técnicas in vitro permiten plani -ficar la producción, haciendo posible tenermaterial disponible en cualquier momentodel año (Pierik, 1990).

• Material almacenado libre de enfermeda -des. El establecimiento in vitro implica elmanejo de material sano, lo cual puedeincrementarse aplicando técnicas como delimpieza viral.

• Almacenamiento bajo condiciones quelimitan el crecimiento. Con las técnicas invitro es posible retardar el crecimiento deuna forma eficaz, con lo que se disminuyeel número de subcultivos necesarios(Pierik, 1990).

• Permite al fitomejorador contar con mate -rial libre de patógenos, listo para sumultiplicación masiva, que puede llegar avolúmenes importantes en periodos detiempo mucho más reducidos.

Además de las ventajas, también se encuen -tran algunas limitaciones de la conservación

in vitro que pueden ser superadas o dismi nui -das de acuerdo a los recursos disponibles yla(s) especie(s) objetivo(s):

• Los materiales, equipos y reactivos, soncos tosos y generalmente hay que impor tar -los. Esto es particularmente importante almomento de establecer un laboratorio, opara reponer o mantener los equipos daña -dos u obsoletos.

• Existe riesgo de perder material, cuandoocurre un corte de fluido eléctrico. Laconservación in vitro es dependiente de unsuministro permanente de energíaeléctrica. Para disminuir los riesgos decortes de energía, es necesario contar conun doble sistema de suministro de fluidoeléctrico.

• Puede existir inestabilidad genética. Estoes relevante para algunas especies mássus ceptibles a mutaciones que otras. Sinembargo el riesgo es manejable al dismi -nuir el número de subcultivos con la con -ser vación in vitro.

• Eventual pérdida de potencial regenerativo.Podría suceder en caso de malformacioneso modificaciones del explante durante elalmacenamiento in vitro, como por ejem -plo ocurrencia de vitrificaciones, formaciónde callos o dormancia permanente de losmeristemas.

• Se debe contar previamente con personaladecuadamente capacitado tanto en lastécnicas de laboratorio como en el manejode la documentación, ya que un error en elmanipuleo causaría una desacreditación ypérdida de confiabilidad del laboratorio ydel sistema de conservación in vitro

10.2.4.Requerimientos para laconservación in vitro

Los requerimientos para la conservación invitro son muy semejantes a los de la micro -pro pagación (Pierik, 1990; Engelmann,1991; Hor, 2001):

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• Aptitud del explante para ser introducido ymultiplicado in vitro. Es importante elegirel explante más adecuado para facilitar elproceso de introducción y multiplicación invitro previa a la conservación. Si elexplante responde bien a estos procesos,entonces se incrementa la probabilidad deque tenga éxito durante el proceso deconservación in vitro.

• Mantener la viabilidad y el potencial rege -nerativo del material. Para ello los explan -tes más adecuados son los meristemos,ápices, yemas axilares y embrionescigóticos.

• Mantener la estabilidad genética. Para ellolos explantes más adecuados son los me -ris temos, ápices, yemas axilares y embrio -nes cigóticos.

• Garantizar la ausencia de enfermedades.Durante el proceso de establecimiento ymultiplicación in vitro previos a laconservación, se debe garantizar que losexplan tes y plántulas regeneradas esténcomple tamente libres de enfermedades(particu lar mente sistémicas).

• Debe existir una baja probabilidad de dañoo muerte del material. Las condiciones delmedio y del medio ambiente deben combi -narse para disminuir los riesgos de pérdidadel material conservado.

• Elegir el envase más apropiado para lacon servación. El tipo de envase puedejugar un rol muy importante en la etapa deconservación. Son utilizados normalmentetubos de ensayo de diferentes tamaños deacuerdo a la especie objetivo (por ejemplode 16 x 100 mm con tapas color neutropara papas, 25 x 150 mm para yacón), obien frascos de vidrio o plástico (tipo Ma -gen ta) para plantas de mayor desarrollo.Lo importante es que el envase debepermitir un adecuado intercambio gaseoso,reducir los riesgos de contaminación y noocupar mucho espacio en las cámaras deconservación.

• Documentación y sistematización de lainfor mación. Todo el proceso in vitro debeestar debidamente registrado y documen -tado en una base de datos, para permitiruna adecuada toma de decisiones sobre elmanejo del material en las diferentesetapas del proceso.

10.3. PROCEDIMIENTOS PARAINHIBIR O FRENAR ELDESARROLLO IN VITRO

Básicamente existen dos alternativas para laconservación in vitro: crecimiento lento parala conservación a corto y mediano plazo decolecciones activas, y la criopreservación parala conservación a largo plazo de coleccionesbase (Hor, 2001). Se indican a continuaciónalgunos procedimientos disponibles paraestos fines:

10.3.1.Conservación a corto y medianoplazo

• Cambiando la composición del medio nu -tri tivo. Haciendo cambios en los compo -nen tes del medio de cultivo se puede yasea esti mu lar el crecimiento o bien retardarel desarrollo de las plántulas para el casode una conser vación in vitro.

• Deshidratación, disminuyendo el potencialosmótico (con el uso de manitol o sorbitol).El potencial osmótico de un medio nutritivoresul ta de sumar los potenciales osmóticosde sus constituyentes (minerales, azúca -res, agar o phytagel, etc.). Cuando elpoten cial osmótico es bajo, el crecimientoy orga nogénesis son reducidos comoconse cuen cia de la imposibi li dad deabsorción de agua. El potencial os mó ticode los me dios nutritivos utilizados paracultivo in vitro puede bajarse por la adiciónde mani tol o sorbitol, que son sustanciasfisioló gicamente inactivas (Pierik, 1990).

• Modificando los gases del medio ambiente.Esto se logra disminuyendo la presión

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atmos férica, por ejemplo a través de lareduc ción de la presión del oxígeno porsusti tu ción de otro gas como el nitrógeno.Tam bién disminuyendo la cantidad deoxígeno colocando una capa de aceitemineral so bre los tejidos (Engelmann,1991).

• Uso de inhibidores como ABA (Acido abs -cí sico) y carbón activado (Engelmann,1991).

• Almacenamiento a bajas temperaturas queprovocan la inhibición del crecimiento delas plántulas in vitro. Para especies dehábitats fríos y templados se recomiendatemperaturas entre 2 a 15º C, y entre 8 a15º C para especies tropicales y subtro -picales.

• Otros procedimientos menos frecuente -men te utilizados pero citados porEngelmann (1991) son la encapsulación oel uso de semillas sintéticas (revestimientode embriones somáticos con perlas de algi -nato) y desecación parcial de tejidos (ca -llos y embriones somáticos). Dehmer(2008, comunicación personal18) men cio -na también la conservación in vitro de pa -pa a través de microtubérculos por un pe -río do de 12 a 15 meses aplicado rutinaria -mente en la colección de papa del IPK deAlemania.

10.3.2. Conservación a largo plazo

• El único procedimiento disponible para laconservación a largo plazo, es la criopre -servación donde el material se congela ennitrógeno líquido (-196º C) y se detienecom pletamente el crecimiento (Engel -mann, 1991; Hor, 2001).

• De acuerdo a la disponibilidad de recursosy la(s) especie(s) objetivo(s), y para tenermejores resultados, se pueden combinar

dos o más de los procedimientos arribaindicados.

10.3.3.Ventajas de la conservación in vitroa bajas temperaturas

De acuerdo a Pierik (1990), algunas ventajasde la aplicación de bajas temperaturas para laconservación in vitro son:

• Se frena el crecimiento y desarrollo de unaforma natural:

- Crecimiento inhibido a bajas Tº.

- Completamente detenido por congela -ción.

• Se limita el número de subcultivos:

- A bajas Tº 1-2 subcultivos.

- 0 subcultivos material congelado.

• Disminuye el riesgo de mutaciones.

• Es fácil planificar la producción porque haydisponibilidad de material todo el año.

• Material haploide puede ser conservado abajas Tº (se vuelve diploide a Tº másaltas).

• Material rejuvenecido in vitro se mantienejuvenil durante el almacenado en frío.

10.4. BANCO GENÉTICO IN VITROACTIVO

La conservación de un banco genético in vitroactivo se realiza a corto y mediano plazo: 1-3años. Los métodos elegidos para este findeben permitir minimizar la división celular yel crecimiento, pero incrementando la longe -vidad de las plántulas sin provocar cambiosgenéticos (Hor, 2001).

10.4.1. Etapas para el establecimiento deun banco genético in vitro activo

El procedimiento para la implementación deun banco in vitro activo incluye el estableci -miento, el saneamiento de las plantas, la se -

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18 Dr. KLAUS J. DEHMER. Curator Gross LuesewitzPotato Collections, Head IPK Branch Station NorthLeibniz Institute of Plant Genetics and Crop PlantResearch (IPK). Genebank Department / GLKS.

lec ción y preparación de los medios de cultivomás adecuados, el establecimiento de lascondiciones físicas de conservación, las labo -res de mantenimiento durante la conserva -ción, el monitoreo de la estabilidad genéticadel material conservado, y la documentación ysistematización de la información durantetodo el proceso in vitro.

a) Establecimiento in vitro. El proceso para laconservación in vitro se inicia con el esta -ble cimiento de los explantes a condicionesin vitro. El procedimiento es el mismo quepara el caso de la micropropagación. Esimportante resaltar el cuidado que se debetener en la desinfección de los explantes almomento de establecer para evitar proble -mas de contaminación posteriores. Sonrecomendables los explantes obtenidos deinvernadero donde se aplica una pre-desin -fección a las plantas. Entre las solucionesdesinfectantes más utilizadas están:NaOCl, CaOCl.

b) Saneamiento de las entradas. Es altamen -te recomendable conservar in vitro mate -rial libre de enfermedades. Durante el pro -ce so de establecimiento y desinfección delos explantes se eliminan particularmentehongos y bacterias, pero si el materialestu vie ra infectado de virus, entonces seprefiere la aplicación de técnicas adiciona -les como la termoterapia y/o cultivo de me -ristemas para limpiar de virus o al menosdisminuir la concentración de las partícu -las virales en las plantas antes de suconservación.

c) Medios de cultivo. Se utilizarán los mediosde cultivo apropiados para cada etapadurante el proceso de conservación in vitrode acuerdo a la(s) especie(s) objetivo. Parala etapa misma de conservación se cam -biará la composición del medio nutritivo.Son comunes los cambios en la cantidadde sales minerales y/o azúcar (por ejemplola mitad de la solución de sales del medioestándar, altas concentraciones de azúcar),el uso de ácido abscísico, la disminucióndel potencial osmótico del medio añadien -

do manitol o sorbitol, entre otros(Westcott, 1981b; Engelmann, 1991;Cadima et al., 1996; Cadima, 1996;Sarkar & Naik, 1998).

d) Condiciones físicas para la conservaciónin vitro. En la cámara de conservación, esrecomendable aplicar una reducción en laintensidad lumínica (por ejemplo 1.000 –1.500 lux para el caso de tubérculosandinos, 1.000 lux para banana),combinado con bajas temperaturas (porejemplo 6-8 °C para conservación amediano plazo de tubérculos y raícesandinas) y un fotoperio do de 16 horas.Aunque de acuerdo a Engelmann (1991)la necesidad de inten si dad lumínica no esestándar y puede va riar de una especie aotra, y la tempe ratura de conservacióntambién dependerá de la sensibilidad alfrio de la(s) especie(s) obje tivo, porejemplo la yuca y la palma aceite ra noresisten temperaturas menores a 18ºC.

e) Labores de mantenimiento. Una vez trans -feridos los explantes al medio de cultivo deconservación apropiado, es recomendablemantener el material en la cámara decreci miento normal hasta que desarrollenlas raíces. Tal como menciona Engelmann(1991), la presencia del sistema radicularincrementa las capacidades de sobrevi ven -cia de las plántulas en conservación. Sinembargo este mismo autor también men -cio na que algunas veces es mejor trasladarel material inmediatamente a las condicio -nes de conservación para evitar la ocurren -cia de necrosis y producción de componen -tes fenólicos. Esto deberá ser evaluado pa -ra el caso de las especies con alta tenden -cia a la fenolización, como algunos tubér -cu los y raíces (oca y yacón en particular),y frutales. Antes de llevar a la cámara deconservación se deben sellar los envasescon parafilm para evitar una mayordesecación del medio de cultivo.

Durante la etapa misma de conservación, esnecesario realizar un seguimiento y monitoreo

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del material conservado controlando lossiguientes aspectos:

• Condiciones de la temperatura y humedadde la cámara de conservación.

• La iluminación (focos en buen estado),intensidad lumínica y número de horas luz.

• Estado del material en conservación, quedebe ser evaluado periódicamente (porejemplo cada mes) monitoreando el creci -miento de las plántulas, yemas viables,formación de raíces, etc. Plántulas bajolargos periodos de conservación po dríanpresentar anormalidades fenotípicas comovitrificación, formación de callos, ta llosfláci dos, raíces engrosadas, etc., debi do auna limitada nutrición de las plántulas porefecto de las condiciones de estrés a lasque están sometidas (Sarkar et al., 2005);esto puede variar, sin embargo, por laespecie y la variedad, por ejemplo, se haobservado que en papa, algunos materia lespueden presentar anormalidades des puésdel año en conservación, aunque espe ciescomo S. x curtilobum y S. x juzpeckzukiialtamente tolerantes a las bajastemperaturas en campo, también resultaronser las más vigorosas in vitro a bajastemperaturas (Westcott, 1981a). Especiestropicales son generalmente sen si bles abajas temperaturas y pueden sufrir dañosfisiológicos durante largos períodos enconservación (Engelmann, 1991). Espe ciesarbóreas como las palmeras han reportadoplántulas vigorosas después de 12 añosbajo conservación (Litz et al., 2004).

• Medio nutritivo, verificar la cantidad demedio y controlar la presencia de agentescontaminantes.

10.4.2.Renovación o refrescamiento delmaterial (transferencia acondiciones de crecimiento normal)

Normalmente se conservan varios envasescon varias plantas de cada accesión/variedad,se recomienda eliminar los que presentenconta minación, y renovar (cambiar a condicio -

nes de crecimiento normal) las plántulas quepresenten síntomas de degeneración o muchoestrés. Para ello se debe retirar el material decondiciones de conservación, sembrar en unmedio de multiplicación y dejar crecer en lacámara de crecimiento normal hasta su recu -peración. Si fuera necesario, realizar variossubcultivos hasta obtener plántulas vigorosascon suficientes yemas/brotes, ya sea para dis -tri bución del material, transferencia a condi -ciones in vivo, o bien para reingresar a condi -ciones de conservación.

10.4.3. Monitoreo de la estabilidadgenética

Si bien las condiciones establecidas para laconservación in vitro debe asegurar en loposible la estabilidad genética del materialconser va do, es necesario hacer unaverificación pe rió dicamente. Para esto esposible la aplica ción de diferentes técnicascomo la electroforesis de isoenzimas o bienherramien tas de la biología molecular(RAPDs, ISSRs, SSRs, RFLPs, DNAfingerprinting) (Landsmann & Uhrig, 1985;Harding, 1991; Angel et al., 1996; Harding &Benson, 2001; Mercado, 2008).

10.4.4.Documentación y sistematizaciónde la información

Para un adecuado manejo del material bajocondiciones in vitro, es fundamental contarcon un sistema de registro y documentaciónde la información generada durante el proce -so. Se debe tener especial cuidado con lasfechas de cambio de estado en las diferentesetapas in vitro, por ejemplo, las fechas deestablecimiento, de limpieza viral, de ingresoa conservación (las veces que suceda), derenovación, de pérdida del material (muertedel explante), de transplante a condiciones invivo, de distribución, entre otros. El almacena -miento de la información en una base de da -tos y su procesamiento permitirán contar conlas herramientas necesarias para la toma dedecisiones correctas de manejo del germo -plas ma.

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10.5. BANCO GENÉTICO IN VITROBÁSICO

Es evidente que un sistema de conservaciónin vitro a mediano plazo puede acarrear pro -ble mas de inestabilidad genética. Asimismo,resulta aún costoso (en términos económicosy de laboreo) para mantener bancos de ger -mo plasma que cuentan con un sinnúmero deaccesiones. Por lo tanto, lo más aconsejablees contar con un pool genético que representetoda la variabilidad de la especie, constituyen -do un banco genético básico. El pool genéticoes crioconservado sin riesgo de erosión genéti -ca, durante períodos de tiempo indefinidos,con poco o ningún mantenimiento (Panis &Lambardi, 2005).

La técnica de crioconservación consiste en lle -var material biológico, desde su temperaturafisiológicamente normal, hasta temperaturasultra bajas por inmersión de los explantes ennitrógeno líquido (–196ºC) y nuevamentesometiéndolos a su temperatura normal, sincausar daño (Abdelnour, 1992). La criocon -ser vación se constituye en un sistema ideal dealmacenamiento a largo plazo, bajo condicio -nes de alta estabilidad genética y con un míni -mo de mantenimiento, donde se puede conse -guir una supresión total del crecimiento de lasplantas, debido a que los procesos biológicoscesan (Doods & Roberts, 1990; Abdelnour,1992). Otras ventajas de este método de al -ma cenamiento, son los bajos costos de labory mantenimiento y el reducido espacio reque -rido. Además se constituye en una técnicavaliosa para conservar material generado enlaboratorio, como embriones somáticos, callosy suspensiones celulares (Abdelnour, 1992;Panis & Lambardi, 2005).

10.5.1. Requisitos para la crioconservación

Es importante considerar el grado de organiza -ción del material a congelar. En general seconsidera que a mayor organización del tejido,mayor su estabilidad (p.e. meristemos, em -brio nes cigóticos y somáticos, suspensiones

celulares y protoplastos). Los requisitos másimportantes para crioconservar un tejido son:la habilidad de cultivar y multiplicar el mate -rial in vitro; la habilidad de los tejidos pararesistir los pretratamientos y crioprotectores yla habilidad del tejido para regenerarse des -pués del congelamiento (Abdelnour, 1992).

10.5.2. Etapas de la crioconservación

De acuerdo a Abdelnour, (1992) y Panis &Lambardi, (2005), las etapas de la criocon -servación incluyen la selección y aislamientodel material, el pretratamiento y crioprotec -ción, el congelamiento y almacenamiento, y eldescongelamiento y recuperación del mate -rial.

a) Selección y aislamiento del material. Laprimera etapa en este proceso, es la selec -ción y aislamiento del material a utilizar.Recientes avances en la técnica de cultivode tejidos, han incrementado enormemen -te la variedad de órganos y tejidos que hansido probados para el almacenamiento ennitrógeno líquido. Es posible congelar ade -más de meristemas apicales y laterales,embriones cigóticos y somáticos, callos,suspensiones celulares y polen.

b) Pretratamiento y crioprotección. La segun -da etapa consiste en el pretratamiento ycrioprotección, donde se induce cierto gra -do de deshidratación, preparando a lascélulas y órganos a resistir a las siguientesetapas del proceso; la función principal esevitar la formación de cristales de hielodurante los procesos de congelamiento ydescongelamiento; tales cristales puedencausar daños irreversibles en las célulascomo lesiones en las paredes o rupturas demembrana. El pretratamiento consiste enla utilización de sustancias crioprotectorastipo DMSO, PEG o glicerol. También sepueden usar sustancias como azúcares(glu cosa) y aminoácidos, el tipo y concen -tra ción de estos productos deben serajustados para cada material vegetal yespecie.

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c) Congelamiento y almacenamiento. Unavez concluidas estas etapas del proceso, seprocede al congelamiento y almacena -mien to en nitrógeno líquido. El congela -mien to puede realizarse de varias formas,puede ser rápido, congelando directamenteel material en nitrógeno líquido. El conge -la miento lento se logra de modo gradual,donde la disminución de la temperaturaoscila entre 0,1 a 3ºC/min, lo que favoreceque los cristales de hielo se formenextracelularmente; generalmente el mate -rial se congela hasta –40ºC en un congela -dor y luego se pasa al nitrógeno líquido;también se ha reportado el congelamientoescalonado y el uso de un congelador case -ro antes del almacenamiento definitivo.

d) Descongelamiento y recuperación del ma -te rial. La última etapa consiste en el des -con gelamiento y recuperación del material,cuando éste es requerido para su utiliza -ción. El descongelamiento en la mayoría delos casos, se lleva a cabo en forma rápidautilizando un baño de agua a 40ºC por 1-3 minutos, también se ha utilizado eldescongelamiento a temperatura ambientey por corrientes de aire caliente.

En todo este proceso, es importante una etapade recuperación, donde el material es some -tido a tratamientos para asegurar su creci -mien to. El lavado o dilución de los crio protec -tores y finalmente el cultivo en medio normalde crecimiento, para la regeneración del mate -rial, donde es importante realizar pruebas deviabilidad para evaluar el éxito del proceso.

10.6. CONCLUSIONES

En las dos últimas décadas, las tecnologías deconservación de plantas han sidodesarrolladas rápidamente abriendo unabanico de posibilidades para la conservacióna mediano y largo plazo de recursos genéticosvaliosos de muchos cultivos y especiesforestales.

Las técnicas de conservación de germoplasmabasadas en el almacenamiento de ápices omeristemas, bajo condiciones que permitensólo mínimas tasas de crecimiento, han sidoampliamente difundidas. En Bolivia, son va -rios laboratorios que ya aplican rutinariamenteeste método de conservación.

La técnica de crioconservación ha sido men -cio nada como la más recomendable para lacon servación a largo plazo de especies vege -tales de propagación vegetativa. De los prime -ros emprendimientos de enfriamiento lento,las investigaciones se han dirigido hacia técni -cas más fáciles y más reproducibles las cualespermiten una completa vitrificación de loslíquidos extra e intra celulares, a través de lainmersión directa de los explantes en nitróge -no líquido. En Bolivia se han dado los prime -ros pasos para ajustar esta técnica en papa(PROINPA, 2008) y en passifloras (Aguilar etal., 2007).

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11.1. DIVERSIDAD MICROBIANA DELSUELO

En los suelos agrícolas donde existen plantas,también se forman comunidades microbianas,que abarcan una gran variedad de géneros yespecies. Esta biota simbionte obligada ofacultativa, está asociada al reciclaje denutrientes, a la generación de fitohormonas, alaumento y/o aceleración del desarrollo; almejoramiento de la resistencia, al estrésambiental y a la supresión de patógenos desuelo o entomopatógenos (Sturz et al. 2000).

Eso demuestra la necesidad de estudiar yconocer las asociaciones de microorganismos-plantas, para comprender los beneficios quesuministran los microorganismos alcrecimien to de la planta y a la producción dealimentos.

Las ventajas naturales de simbiosis debenexplorarse en las plantas cultivadas en suhábitat natural para detectar oportunidadesde mejora en la productividad del cultivo apartir de la funcionalidad de los microorga -nismos. Este tipo de estudio permitiríadesarrollar líneas de producción biotecno -lógicas contribuyendo a una agriculturasaludable. En general, estos actúan como

promotores de crecimiento (reciclandonutrientes y produciendo reguladores decrecimiento vegetal) o como agentes decontrol de enfermedades o ambos, por tanto,la producción agrícola puede ser mejoradoincorporando estos microorganismos al suelo.

11.2. LA DIVERSIDAD MICORRICICA

Se han descrito alrededor de 200 especies,clasificados en cuatro órdenes: Glomerales,Diversisporales, Paraglomerales yArchaeosporales; 11 familias y 17 géneros(Schübler y Walker, 2010; NCBI, 2010).Históricamente muchas especies de estephylum se han descrito y nombrado con baseen la morfología de sus esporas, pero se havisto que no es suficiente para conocer suverdadera filogenia, recientemente se estárecurriendo al análisis de los genes paracircunscribir los taxa (Schübler y Walker,2010).

Con base en registros fósiles se calcula que elorigen de los microscópicos hongosGlomeromycota, ocurrió o hace aproxima -damente 600 millones de años, por otra parteesporas e hifas de hongos Glomales fuerondescubiertas en rocas que datan de hace 460millones de años en el período Ordivicico

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Capítulo 11La Diversidad Microbiana y los Servicios

Ambientales de las Micorrizas a laAgricultura

Noel Ortuño, Fátima Rojas, Deyby Felipez

(Redecker et al., 2000), se maneja lahipótesis de que fueron un valioso instru men -to de las plantas al inicio de la colonizacióndel ambiente terrestre.

Los hongos, micorrizas arbusculares (MA)pertenecen al phylum Glomeromycota(Shübler et al., 2001) son poco conocidos porla mayoría de las personas, pero de granimportancia para los ecosistemas terrestres.El término micorriza hace referencia a laasociación simbiótica entre raíces de plantas yhongos, es llamada mutualista porque tantolos hongos como la planta hospedera se bene -fician. El hongo simbionte recibe carbohidra -tos de la planta ya que el es incapaz derealizar fotosíntesis y, a cambio, brinda a laplanta varios beneficios reflejados en sucrecimiento como se describe posterior mente.

El nombre micorriza proviene del términogriego “mykos” = hongo y del vocablo latino“rhiza” = raíz. Esta asociación es benéfica,tanto para el hongo, como para la planta. Elhongo coloniza el interior de la raíz y, pormedio de la red externa de hifas, sirve depuente para obtener nutrientes minerales yagua que no están al alcance del sistemaradicular de la planta. Por otro lado, la planta,a través de la fotosíntesis, proporcionaalimento al hongo (Crovetto, 1992). Estasimbiosis se establece de forma natural con lamayoría de las plantas terrestres y algunas delas especies, principalmente árboles, depen -den totalmente de esta simbiosis (Marchio,1947). Estas asociaciones o simbiosis fuerondescritas por el patólogo forestal alemán A. B.Frank, utilizando el término micorriza en1885 (Benzing, 2001). Sin embargo, laexistencia de las micorrizas data de hace almenos 370 millones de años (Coyne, 2000).

Los primeros estudios realizados en AméricaLatina para entender mejor la simbiosis raíz –hongo se desarrollaron en Colombia y Cuba enla década de los años 80. Para Rivera et al.(2003), el estudio llevado a cabo en Colombiapor Sieverding en 1990, es uno de los máscompletos y de mayor aporte para

comprender mejor las asociacionesmicorrízicas. Sieverding (1990), estudió elmanejo de las especies nativas, encontrandoque las especies de MA son específicas de unsitio y poseen comportamientos diferentesfrente a distintas prácticas agronómicasutilizadas (Rivera et al., 2003). A partir dediversos análisis concluyó que la utilización demicorrizas en la agricultura para finesproductivos sería menos complicado mediantela inoculación de cepas eficientes y nosiempre con cepas nativas (Rivera et al.,2003).

11.2.1. Plantas simbiontes

En cuanto a plantas simbiontes, alrededor del80% de las plantas que presentan lasimbiosis en cuestión, forman el tipo deasociación endomicorrízica conocida comomicorriza arbuscular (MA) reportándose enmás de 200 familias y más de mil géneros deplantas, distribuidas en el grupo de lasBriofitas, Pteridofitas, Angiospermas yGimnospermas (Malloch et al., 1980; Azconet al., 1980) y las familias de cultivosprincipales, Leguminoseae y Gramineae(Sainz et al., 1984). También el hospedanteinfluye sobre la colonización micorrízica yproducción de esporas, siendo generalmentelas plantas con elevadas demanda de fósforocomo las leguminosas, o con pobre sistemaradicular (cebolla, papa), las que respondenmejor a la micorrización, de tal manera quelas plantas con pocos o cortos pelos radicalesdependerán más de la formación demicorrizas que las dotadas de pelos biendesarrollados (Azcón, 1980).

Se menciona también que las gramíneas sonmenos micorrizadas que las leguminosas,debido a que poseen un sistema radical mejordesarrollado, que les permite obtener másfácilmente los nutrientes del suelo y hacerlasmenos dependientes de las micorriza (Sainz,1984). Como señala Ribeiro (2005) lasgramíneas forrajeras presentan menorrespuesta a las MA respecto a las leguminosas

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y, entre éstas, también se observandiferencias.

En un estudio realizado por Giovannetti et al.,(1988), al inocular con Glomus monosporumlas plantas de trébol, vid, cebolla y pastoheno, que se caracterizan por la diversidad enla morfología y la extensión linear de sussistemas radiculares encontraron a los 4meses de la inoculación, la mayor respuestaen la colonización y producción de esporas enplantas de vid y trébol, y la más baja en pastode heno. Esto prueba la correlación inversaentre la colonización de MA y plantas queposeen escasos o cortos pelos radicales, quees la cuarta característica de las plantassimbiontes más sobresalientes en estetrabajo.

Sin embargo, cuando plantas de trébol fueroninoculadas con los hongos Gigaspora giganteay Glomus mosseae en invernadero, por unperíodo de 10 semanas, no se presentó lainfección con ninguno de los dos simbiontes,en cambio Gigaspora Gigantea y Glomusfasciculatum mostraron una infecciónmoderada en plantas de maíz, al igual queGlomus calospora en sorgo (Grada, 1979).

Los reportes anteriores ponen de manifiestoque el comportamiento del desarrollo de lainfección y la producción de esporas esinfluenciado por la especie de plantahospedante y la especie de hongo micorrízicoy no necesariamente las plantas con escasospelos radiculares, son las que tienen unamayor respuesta a los endófitos MA.

Los resultados obtenidos luego de inocularplantas de maíz, pasto bahía, sorgo y soyacon Glomus claroideum, Glomus etunicatum,Glomus mosseae y Gigaspora margarita,confirman lo antes mencionado, ya que lasoya, que se caracteriza por la presencia depocos pelos absorbentes, no fue apta paraobtener una adecuada esporulación paracualquiera de las especies de hongos MA. Encambio, el maíz después de 12 semanas de lainoculación, presentó la mejor respuesta a la

producción de esporas, siendo superado a las14 semanas por el pasto bahía, el cual mostróincrementos de 100-5 19% en las dosúltimas semanas de incubación (Guzmán,1991). También la cebolla se reporta comohospedante altamente susceptible a lamicorrización y productor de esporas,obteniendo resultados satisfactorios conGlomus macrocarpus var. geosporus, Glomusfaciculatus. Gigaspora margarita y Gigasporagigantea (Gonzales, 1983).

La edad de la planta también es un factorimportante en el desarrollo de MA, comomuestra un estudio hecho por Guzmán(1991), con tres especies: fríjol, grama ysorgo, muestra que a la cuarta semanadespués de la siembra la colonización fueigual para los 3 hospedantes, en la sexta elsorgo fue superado por la grama y el fríjol,mostrando este último su máximo valor(61.60%); en la octava semana, lacolonización decreció para el fríjol, y la gramaregistró su valor más alto (9.1.73%), lomismo que el sorgo (6 1.68%), sin embargono existió diferencia del fríjol con el sorgo,pero, sí con la grama; a la décima semana elfríjol mostró los valores más bajos fueampliamente superado por el sorgo y lagrama.

11.3. TIPOS DE MICORRIZAS

Las micorrizas (MA) son capaces de crecerdentro de las raices sin causar síntomas deuna enfermedad, el hongo coloniza las raicescon sus hifas, formando arbúsculos con loscuales mantiene un intercambio bioquímicocon la planta. Esta simbiosis altamenteespecializada anteriormente se le llamó"micorriza vesículo arbuscular" porque algunoshongos de los glomeromycoticos formanestructuras de almacenamiento dentro de lascélulas corticales llamadas vesículas.

En 1969 se definió tres tipos de micorrizasbasándose en la interrelación espacial de lashifas filamentosas del hongo y las células de

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las raíces de la planta: ectomicorrizas,endomicorrizas y ectendomicorrizas. Estaclasificación se mantiene vigente en laactualidad.

Las ectomicorrizas (Figura 1) se limitan casipor completo a especies arbóreas de hojaperenne, donde la simbiosis se establecegeneralmente de forma natural. Son visibles a

simple vista ya que las hifas se aglomeranalrededor de la raíz formando un mantofúngico que provoca modificacionesmorfológicas en la raíz (Rivera et al., 2003).A partir de esta estructura, las hifas seintroducen entre las células de la corteza sinpenetrarlas formando la llamada red de Hartigque es su característica más importante. Deesta manera crecen en los espaciosintercelulares sin llegar a penetrar al interiorde la célula (Coyne, 2000).

Las ectendomicorrizas son muy limitadas.Presentan características tanto de lasectomicorrizas como de las endomicorrizas.

Las endomicorrizas, por otro lado, son las másimportantes y las de mayor difusión. Seencuentran en la mayoría de los cultivosagrícolas y hortícolas (Coyne, 2000). Lasendomicorrizas, llamadas también micorrizas

arbusculares son simbiontes obligados, ya queno pueden ser cultivadas en ausencia de laplanta huésped (Xoconostle y Medrano,2002). No son visibles a simple vista, parapoder visualizarlas es necesario hacerlomediante un microscopio óptico donde sepuede observar las diferentes estructuras delhongo colonizando la raíz (Figura, 2).

Los hongos micorrícicos (MA) que forman estetipo de micorrizas son Zygomicetos yFicomicetos del orden Glomales. Los génerosson Paraglomus, Archaeospora, Glomus,Sclerocystis, Acaulospora, Entrophospora,Scutellospora y Gigaspora (Benzing, 2001).

La formación de MVA se inicia a partir de unaespora germinada, hifas o una raíz colonizadapresente en el suelo que infecta a las zonaspilíferas de la raíz. De esta manera, bajocondiciones adecuadas de humedad ytemperatura, se inicia la colonización sin laformación del manto fúngico (Pritchell,1990). Una vez que el hongo ingresa en lascélulas epidérmicas de la raíz se forma unahifa especializada llamada apresorio que lesirve de sostén en la fase primaria depenetración de la raíz. La hifa de penetraciónavanza longitudinalmente a través de los

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Figura 1. Ecto micorrizas simbiontes con lasplantas perennes.

Figura 2. Endomicorrizas simbiontes de plantasanuales.

espacios intercelulares o ingresa directamenteal interior de la célula donde finalmente seforman los arbúsculos y vesículas en algunoscasos (Rivera et al., 2003). En la Figura 3 sepuede observar las diferentes fases delproceso de formación de la simbiosis.

El nombre de MVA se debe precisamente a laformación de las vesículas y arbúsculos. Lasvesículas son las hifas que penetran en lasparedes de las células epidérmicas de la raízy crecen en el interior de las células corticales,son órganos de almacenamiento, seencuentran llenos de lípidos, importantes parala alimentación del hongo. Los arbúsculos nopenetran en el interior de la membranacelular; en este órgano se realiza elintercambio de nutrientes captados por lashifas (Crovetto, 1992).

11.4. SINERGISMO CON OTROSMICROORGANISMOS

Las endomicorrizas no son tan específicas,pero es obvio pensar que la incidencia deestos microorganismos no es la misma paratodas las especies. Se ha determinado que elcomportamiento de las (MA) es modulado pordiversos factores ambientales, que pueden

ajustar su comportamiento. Existe evidenciade que estas asociaciones presentan“especificidad ecológica” lo cual consiste enla posibilidad de encontrar en un inóculomixto o bajo condiciones nativas un tipo parti -cular de MA que colonice preferentemente aun hospedante (Mc Gonigle y Fitter, 1990).

Esta preferencia se debe principalmente a lascondiciones del suelo que puede existir dondeestá anclada la planta principalmente enrelación con otros microorganismos (Rabatin yStinner, 1989) en su versión sobre lainteracción de micorrizas arbusculares conmicro invertebrados del suelo (ej. Lombrices,nematodos) concluyen que tienen un efectoneto positivo en las poblaciones de MA ycontribuyen a su distribución espacial. Porotro lado Garbaye (1994), menciona queexisten efectos estimulatorios de los procesosde germinación de las esporas y crecimientode MA con bacterias endófitas de los génerosPseudomonas, Corynebacterium yStreptomyces.

También existe evidencia de bacteriaspromotoras del crecimiento como Pseudo -monas putida (cepa F-44) actúan sinergísti -camente con algunas especies de hongos MA;el efecto es mayor si son inoculadossimultáneamente a la siembra, el hongo esfavorecido en una mayor producción deesporas, aspecto que podría considerarse enla producción de inóculo de MA (Sieverding,1991). También se han observadointeracciones positivas con asociaciones debacterias solubilizadoras de P tal como loreporta Young (1990).

Existe una relación positiva con rizobacteriasestimuladoras del crecimiento vegetal en lacolonización rizosferica, en el presente casoAzospirillum brasilense + Glomus clarumfueron más efectivas cuando están juntas, queindividualmente, también se encontró que lamicorrizica se incrementó con la presencia deAzotobacter sp. Por otra parte se demostróque la inoculación de Pseudomonasfluorescens en tomate, estimula la

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Figura 3. Endomicorrizas vesiculo arbusculares1. Rizodermis (epidermis), 2. Córtex,

3.Endodermis, 4. Vesícula, 5. Arbúsculo.

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colonización micorrizica en la raíz eincrementa la producción del cultivo (Terry,2006).

11.5. IMPORTANCIA EN LA NUTRICIÓNVEGETAL

El uso de MA en la agricultura se ha extendidogracias a los múltiples beneficios que leproporcionan al cultivo.

Las micorrizas son microorganismos quemejoran la nutrición de planta. Al aumentar lasuperficie de absorción de nutrientes,aumenta la capacidad de las raíces paraobtener nutrientes, especialmente Fósforo,pero también Potasio, Nitrógeno, Calcio,Magnesio, Zinc, Cobre, Boro y Molibdeno(Rivera et al., 2003). Mejoran así aspectosmorfológicos y de crecimiento: mayor altura,mayor número de frutos por planta, mayordiámetro de tallo, mayor área foliar, etc. Deesta manera, aseguran cosechas con altosrendimientos.

La inoculación con micorrizas comerciales encultivos de importancia económica se haextendido en la actualidad en América Latina.Países como Cuba, Chile, México, Colombia,Ecuador han realizado numerosos estudioscon el objetivo de observar el efecto benéficode estos microorganismos en los cultivos.Particularmente se ha trabajado con hortalizascomo tomate, cebolla, ajo, papa; cereales:maíz, trigo, soya, arroz y algunos frutales.

En nuestro país, a partir de 1997 en eldepartamento de Santa Cruz se empieza aintroducir estos microorganismos a sistemasagrícolas de altos insumos con grandes áreasde producción como: soya, trigo, maíz,obteniendo cosechas con rendimientossuperiores al testigo no inoculado. Losresultados obtenidos se muestran en el cuadro4.

Cuadro 4. Resultados de la inoculación demicorrizas (G. fasciculatum) en diferentes

cultivos. Santa Cruz-Bolivia

Cultivo Área HMA Testigo Incremento

--ha-- ----t ha-1---- ---%---

Maíz 150 2,92 2,16 35,1

Maíz 150 3,12 2,51 24,3

Trigo 50 3,19 2,75 16,0

Trigo 50 3,12 1,82 71,4

Soya 150 2,73 1,94 40,7

Soya 150 2,20 1,78 23,5

Soya 750 2,93 2,32 26,3

Fuente: Rivas y Ortuño, 2008.

11.6. BENEFICIOS PARA LAAGRICULTURA

Las micorrizas arbusculares (MA) son otrosbioinsumos utilizados para combatirpatógenos del suelo. Las micorrizas sonhongos del suelo que pueden llegar aestablecer asociaciones mutualísticas, talescomo la simbiosis, con las raíces de lasplantas. Las raíces micorrisadas alcanzanmayor superficie de exploración, aumentandoasí la absorción de agua y de nutrientes de laplanta. Otra de las funciones que cumplenestos hongos benéficos es la protección de lasraíces contra el ataque de patógenos delsuelo, creando una barrera mecánica a travésdel manto de hifas que forman y generandocompetencia por nutrientes y espacio (Aguilar,1990).

11.6.1.Beneficios de las micorrizas en elcrecimiento de las plantas

La importancia de esta simbiosis en eldesarrollo de las plantas se entiende al teneren cuenta que la raíz es el puente entre laplanta y el suelo y que, a su vez, el micelio delhongo micorrizógeno es el puente entre la raíz

y el suelo. En consecuencia, la micorriza,como órgano de absorción y translocacion deagua y nutrientes, es una de las mássobresalientes adaptaciones de la raíz paradesenvolverse adecuadamente en el ambienteedáfico (Guerrero, 1996).

Durante la simbiosis, las plantas hospedantesreciben nutrientes minerales del suelotomados por el hongo (principalmentefósforo), mientras que éste obtienecompuestos de carbono derivados de lafotosíntesis (Brundrett et al., 1996).

Esta mejor condición nutricional conlleva unsignificativo aumento en el crecimiento de lasplantas que poseen esta asociación (plantasmicótrofas), especialmente en aquellos suelosdonde estos nutrientes son escasos. Otrosbeneficios de la asociación micorrízica son laprotección contra patógenos radicales(Newsham et al., 1995) y la mayor toleranciaal déficit hídrico (Ruíz et al., 1995).

Según Coyne (2000), existen datos quedemuestran que dos especies Glomus tienenun contenido de nutrientes considerablementemás elevado en la planta que el desprovistode micorriza. Con excepción del Fe, Glomusfasciculatum presenta un nivel de adquisiciónde nutrientes superior al que Glomusmonosporus, lo que demuestra que distintassimbiosis entre planta y micorriza presentandistintas capacidades de adquisición denutrientes.

El papel de las micorrizas en la absorción defósforo del suelo puede resumirse de lasiguiente manera: las plantas con micorrizasabsorben y acumulan más fósforo que lasplantas sin micorrizas. Existe una mejorexplotación de fósforo del suelo, puesto que elárea y el volumen de las raíces aumenta, enprimer lugar, porque las raíces son más sanas(mejor alimentadas) y, en segundo lugar,porque las hifas de los hongos actúan comouna extensión de la raíz. Las micorrizasaumentan la disponibilidad del fósforomediante una serie de mecanismos como la

excreción de fosfatasas, ácido carbónico yácido orgánico, así como mediante laextensión de la superficie de las raícesexpuestas al fósforo (Coyne, 2000).

Entre los beneficios observados de lasmicorrizas en las plantas se tienen(Benzing, 2001):

1) Mejoran el crecimiento de la planta alaumentar la superficie de absorción deagua y nutrientes (principalmente P,aunque también Ca, K, Zn, Cu).

2) Mineralización y solubilización denutrientes por la producción de ácidos yenzimas.

3) Facilitan un mejor aprovechamiento delFósforo y del Zinc de los fertilizantes.

4) Tolerancia a condiciones de estrés comobaja humedad, las plantas micorrizadasse recuperan más rápido delmarchitamiento y hacen un uso eficientedel agua absorbida.

5) Estimulan la fijación del nitrógeno en lasplantas noduladas, aumentando el flujode fósforo a través de sus raíces.

6) Menor susceptibilidad al ataque depatógenos mejorando su nutrición ycompitiendo con microorganismospatógenos por el espacio en las raíces delas plantas.

7) Inmovilizan algunos metales pesadoscomo el Zinc, Cadmio y Manganeso.

8) Mejoran la estructura del suelo ayudandoa la formación de agregados.

La correlación entre el uso del agua laeficiencia y la tolerancia a la sequía mostróque AM hongos inoculación proporciona 30%más de agua de plátano después de 40 díasde estrés y AM hongos inoculados micro-propaga plátano proporcionado montón másgrande que hizo las no inoculadas encondiciones de granja en un Oxisol. Estosresultados indican que la inoculación conHongos MA podría ser un enfoque útil y

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práctico hacia un sistema de producciónsostenible del banano.

11.7. FACTORES DEL SUELO QUEAFECTAN EL DESARROLLO DELAS MICORRIZAS

Para introducir MVA en la agricultura esimportante conocer en que condicionesambientales se lleva a cabo una efectivamicorrización.

La temperatura tiene un papel importante enel desarrollo de las micorrizas. La temperaturaóptima para el crecimiento de los miceliososcila entre los 18°C y los 27°C para lamayoría de las especies, aunque en algunoscasos la simbiosis se llevó a cabo atemperaturas mayores 33-34ºC (Pritchell,1990).

El pH óptimo para el desarrollo de micorrizasoscila entre 5,8 y 7,5, pero puede variar deacuerdo al tipo de suelo, planta y el tipo dehongo. Respecto a la humedad del suelo, éstadebe ser mediana, ya que en suelos muyhúmedos o inundados el crecimiento deesporas disminuye considerablemente(Benzing, 2001).

Cuando hay poca agua disponible para elcrecimiento de las plantas, sus raíces formanalianzas con los microorganismos del sueloque la ayudan a promover su crecimiento(Marasco et al., 2012).

Es conocido que las relaciones simbióticasentre las plantas y comunidades microbianasdel suelo son críticas para la salud de lasplantas. Aunque los efectos de la sequía enlas plantas son bien conocidos, se sabe pocoacerca de cómo la falta de agua afecta a lasbacterias alrededor de las raíces.

En este estudio, los investigadores cultivaronplantas de pimiento en condiciones de agualimitada y se analizaron las especies debacterias alrededor de las raíces de las

plantas. Ellos encontraron que el estrés porsequía enriqueció las comunidadesmicrobianas con bacterias capaces deaumentar la fotosíntesis de las plantas y laproducción de biomasa de hasta un 40% encondiciones limitadas de agua.

Según los autores los resultados destacan quelas plantas completamente funcionales nopueden ser considerados organismosindividuales más, sino más bien un meta-organismo que incluye a la planta y sumicrobioma. Esto promueve las funcionesesenciales como la resistencia al estréshídrico. La promoción de la resistencia a lasequía por bacterias puede tener importantesaplicaciones, por ejemplo, en la retención delos altos rendimientos de las plantas, inclusoen presencia de una menor irrigación.

Las plantas de cultivo sufren menos de lospatógenos específicos transmitidos por elsuelo, debido a las actividades de distintosmicroorganismos del suelo. Sin embargo, parala mayoría de las relaciones entre losmicrobios del suelo y las plantas, losmecanismos implicados en el control de lospatógenos son desconocidos.

Un análisis genómico funcional de los suelos(metagenómica) mediante un PhyloChip queanalizó el microbioma de la rizósfera dediferentes que permitieron identificar losgrupos clave de bacterias y los genesimplicados en la supresión de un hongo queataca la raíz de las plantas.

El análisis identificó más de 33.000 especiesde bacterias y archaeas, y particularmente lasProteobacteria, Firmicutes y Actinobacteriaconsistentemente asociadas con la supresiónde la enfermedad de hongo. También losmiembros de las Proteobacteria demostrarontener actividad antimicrobiana mediante lasíntesis de péptidos no ribosomales.

En otras palabras, las plantas aprovechan delmanojo de bacterias que poseen en sus raícespara enfrentar las enfermedades.

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11.8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASAguilar, V.F. 1990. Mezclas y desinfección de suelo y

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12.1. INTRODUCCIÓN

La región andina se caracteriza por su elevadadiversidad biológica que contribuye a la segu -ri dad alimentaria, por la presencia de muchoscentros de origen y domesticación ricos enendemismos y propicios para el desarrollo deuna amplia variabilidad genética en poblacio -nes autóctonas de especies vegetales. La re -gión andina también se caracteriza por la grandiversidad de condiciones ecológicas en espa -cios muy reducidos, así como por las condi -cio nes sumamente limitantes. El poblador an -dino logró manejar esta diversidad ecológica,así como sus posibilidades, habiendo domes -ti ca do más de 40 especies alimentarias, mu -chas de las cuales están adaptadas a las con -di ciones extremas de sequía, frío y humedadde ciertas zonas.

En la región altiplánica, Solanum tuberosum,Ullucus tuberosus, Oxalis tuberosa,Tropaeolum tuberosum, Chenopodiumquinoa, Chenopodium pallidicaule, Lupinusmutabilis son los ejemplos de especies do -mes ticadas más representativas de ladiversidad de especies domesticadas. En losvalles se domesticaron Zea mays, Capsicumspp., Ipomoea batatas, Amaranthus caudatusy diversas frutas. Las tierras bajas tambiénfue ron centros de domesticación denumerosas especies vegetales, como Arachishypogaea, Manihot spp., Zea mays,

Capsicum, Gossypium, Nicotiana tabaccum,Bixa orellana y varios tipos de calabazas yfrutas. Estas son sólo algunas de las especiesdomes ticadas en estas zonas. Un grannúmero de especies alimentarias autóctonashacen parte de la dieta de poblaciones localesde la región andina.

Aunque parte del germoplasma de estos culti -vos ha sido recolectado y conservado en ban -cos de germoplasma (semillas y coleccionesde campo), aún falta completar y manejarcolec ciones para muchas especies. Además,los cultivos andinos poseen un inmenso po -ten cial para el mejoramiento y promoción denuevas especies a través de la ampliación dela base genética de las colecciones, la intro -gre sión genética a partir de acervos foráneos yel desarrollo y producción de nuevos materia -les a partir de estas especies poco difundidasy potencialmente promisorias.

El manejo de recursos fitogenéticos incluyeva rias actividades como la prospección, la co -lec ta, la caracterización, la evaluación, la con -ser vación y el intercambio de germoplasma anivel nacional e internacional. El seguimientocientífico de todos estos componentesgarantiza una valoración promisoria de losrecursos genéticos y su utilización enprogramas de me jo ramiento varietal.Mediante técnicas biotecnológicas es posiblelograr un desarrollo más eficiente de las

Capítulo 12La aplicación del cultivo de tejidos en lamultiplicación y conservación de los

Recursos FitogenéticosJean Pierre Baudoin

actividades mencionadas, proporcionando asínuevas alternativas para utilizar los recursosgenéticos. La biotecnolo gía, por medio de lagenética molecular y el cul ti vo de tejidos o decélulas in vitro ofrece nuevas herramientaspara alcanzar esas me tas y racionalizar losusos de los recursos fito ge néticos. Enparticular, el cultivo in vitro con tri buye dediferentes maneras al uso sosteni ble de losrecursos genéticos.

En la actualidad se utilizan abundantementelas técnicas de cultivo de tejidos para la mi -cro pro pagación de clones selectos y para con -se guir material de plantación libre de patóge -nos; se utiliza cultivo de anteras y de micros -poras para la obtención de haploides y a fin defacilitar y acelerar el mejoramiento genético.Una porción grande de la variabilidad genéticapara caracteres económicamente importantes,ocurre en el germoplasma silvestre o en espe -cies relacionadas. Tradicionalmente, la identi -fi ca ción de genes que controlan esos caracte -res en el germoplasma silvestre, y su utiliza -ción en el pre-mejoramiento ha encontrado di -fi cultades. La hibridación interespecífica ayu -da da por el cultivo in vitro de embriones seestá convirtiendo en una alternativa para latransferencia de caracteres útiles entre espe -cies relacionadas, pero sexualmente incompa -ti bles, o que presentan absorción temprana deembriones. Sin embargo, el objetivo del pre -sen te capítulo es destacar el papel del cultivoin vitro en la preservación y el manejo de losrecursos filogenéticos.

12.2. CONTRIBUCIÓN DEL CULTIVO INVITRO EN LA CONSERVACIÓNDE LOS RECURSOSFITOGENÉTICOS

Las estrategias de conservación de germo -plas ma dependen principalmente de las ca -rac terísticas biológicas de éstos, de los recur -sos humanos e infraestructura disponibles ydel número de accesiones. Existen dos estra -te gias generales de conservación de germo -

plas ma: in situ (ecosistemas y hábitats natu -ra les) y ex situ (bancos de germoplasma desemilla, colecciones de campo, jardines botá -ni cos y colecciones in vitro), estos métodos noson mutuamente excluyentes sino más biencomplementarios.

Si las semillas ortodoxas pueden ser conser va -das sin mayores dificultades con baja tem pe -ratura y baja humedad relativa en bancos degermoplasma, existen sin embargo otras espe -cies denominadas recalcitrantes cuyas semi -llas pierden su viabilidad en un corto períodode tiempo al ser conservadas por métodoscon vencionales debido a sus elevados conte -ni dos de humedad. En paralelo, existen espe -cies que producen semillas después de un lar -go tiempo (plantas perennes) o producen se -mi llas de alto grado de heterocigosidad debidoa su naturaleza alógama o no producen semi -lla botánica verdadera, teniendo como alter -na tiva de reproducción órganos vegetativos(tu bérculos, rizomas, bulbos o semillas aga -micas). Los recursos genéticos de estas espe -cies son generalmente conservados como co -lec ciones de campo o a través de medios massofisticados como la conservación in vitro.

Precisamente, las dificultades derivadas delas colecciones de campo (elevados requeri -mientos de espacio y mano de obra, riesgo deinfestación con plagas y enfermedades, dañoprovocado por catástrofes naturales y pérdidade la integridad genética de las accesiones) yla preservación de especies recalcitrantes hanpermitido desarrollar metodologías como laconservación in vitro de germoplasma, enten -diéndose por cultivo in vitro al conjunto detécnicas mediante las cuales un explante, esdecir, una parte de la planta (órgano, tejido,célula o protoplasto) se cultiva asépticamenteen un medio nutritivo bajo condiciones de luzy temperatura controlada.

El cultivo in vitro de especies vegetales nacecon los estudios pioneros de Haberlandt alprin cipio del siglo XX. El cultivo de los diferen -tes órganos de las plantas se ha ido desarro -llan do a fin de lograr tres fines: la micropro -

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pagación vegetativa, la conservación de ger -mo plasma y generar una herramienta pararecortar los diferentes pasos de un programade mejoramiento genético, ya sea por mediode la regeneración de nuevas plantas o deestructuras indiferenciadas (masas celulares ocallos).

En el caso de la conservación de germoplas -ma, las principales finalidades del cultivo invitro son la preservación de la integridad ge -né ti ca de cada entrada de la colección (seevita la segregación de las semillas sexuales)y el mantenimiento altamente seguro de losrecursos al quedar eliminados los riesgos depérdidas por causa del medio ambiente; comoes una técnica axénica, no hay detrimentos odaños por plagas o enfermedades y no existepeligro de infecciones por patógenos ni pla -gas. Sin embargo, como siempre, existe lapro babilidad de contaminación debido a hon -gos o bacterias ambientales, necesitando deun monitoreo específico del material en con -ser vación a fin de mantener bajo cierto nivelde control los explantes.

En el manejo de los recursos fitogenéticos, lautilización del cultivo in vitro empieza directa -mente a partir de la recolección del germo -plas ma en el terreno para reducir las dificul -tades prácticas de colectas de germoplasma,especialmente en especies cuyo traslado ha -cia los bancos de germoplasma causadeterioros por daño mecánico y/o ataques deplagas y enfermedades. Lo anterior, esencial -mente con siste en esterilizar explantes delmaterial colectado para posteriormentedepositarlos en medios de cultivo estériles através de un pro ce dimiento simple que sólorequiere equipo rudimentario. La técnica hasido utilizada exito samente en algodón(Gossypium spp.), cacao (Thebroma cacao),vides (Vitis spp.) y algunas forrajeras. Eltraslado de material in vitro desde el sitio decolecta es especial mente conveniente paraespecies alógamas, especies con semillas dereducido poder germi nativo, especies consemillas recalcitrantes y aquellas de reproduc -ción vegetativa.

Pero es principalmente para la conservaciónde los materiales colectados que las técnicasdel cultivo in vitro han sido objeto de esfuer -zos de investigación. Las técnicas de conser -va ción por cultivo in vitro se empezaron aapli car en los años 80 y actualmente se utili -zan de forma sistemática en la conservación eintercambio de germoplasma de varias espe -cies como raíces y tubérculos, árboles frutalesy otras.

Entre las ventajas que presenta la manuten -ción in vitro de germoplasma destacan: con -servación de un gran número de plantas enes pacios pequeños; mayor control sobre elestado fitosanitario de las plantas; reducciónen los tiempos de multiplicación; facilidad deintercambio de material genético debido a susanidad e incremento de la tasa de multiplica -ción de germoplasma valioso.

12.3. CONSERVACIÓN A CORTO,MEDIANO Y LARGO PLAZO

El cultivo in vitro comprende una sucesión depasos: (i) desinfección, disección y extraccióndel tejido de la planta (ii) determinación deuna técnica adecuada y establecimiento de lacolección in vitro (iii) recuperación del tejidoviable de la fase de conservación a través deltrasplante a macetas (iv) regeneración deplantas.

Diversos órganos o tejidos pueden conservar -se in vitro, pero usualmente se dividen losma teriales vegetales iniciales en dos catego -rías: diferenciados y no diferenciados. En lostejidos diferenciados, el cultivo se deriva demeristemas provenientes de yemas y brotes ode meristemas adventicios derivados del culti -vo in vitro. Esta técnica incluye la micropropa -ga ción en la forma de cultivo de tallos, de ho -jas, de raíces, de microtubérculos y de em -brio nes. En los tejidos no diferenciados se cul -ti van callos o células en suspensión en mediossólidos o líquidos. Dentro del marco de la con -ser vación del germoplasma se debe mantenerla composición genética de cada entrada,

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razón por la cual se utiliza preferentemente losmeristemas. El cultivo de meristemas es apro -piado para la conservación porque que nosola mente el meristema tiene una estabilidadgenética muy alta, sino porque además tieneun potencial de propagación alto y de facili -dad de saneamiento. Al contrario, el cultivo decélulas somáticas, no meristemáticas y las deorigen germinal presentan con frecuenciaines tabilidad citogenética (euploidia, aneu -ploi dia, alteraciones cromosómicas), sobretodo cuando se prolonga el estado in vitro.

En las técnicas convencionales de los meriste -mas, el objetivo es obtener un crecimientocon ti nuo de los explantes a tasas normales, através de sub-cultivos sucesivos de meriste -mas en medios frescos. Cada sub-cultivoaumenta la posibilidad de pérdidas debido aaccidentes o contaminación microbiana.

La conservación del germoplasma in vitropue de realizarse a corto-mediano plazo y alargo plazo mediante métodos criogénicos. Laalternativa a utilizar dependerá del progresode la capacidad tecnológica, infraestructuradisponible, objetivos de conservación y lanaturaleza de las especies a conservar.

12.4. CULTIVO IN VITRO DECRECIMIENTO LENTO

La conservación in vitro a corto y medianoplazo necesariamente requiere de subcultivosperiódicos, actividad que generalmente difi -cul ta su conservación. Para prolongar el perío -do de conservación in vitro, aumentando deesta forma los tiempos requeridos entre lossu cesivos subcultivos, se han desarrolladomé to dos que permiten retardar el crecimientode los explantes y así prolongar el tiempo re -querido entre los sucesivos subcultivos. Esosmétodos llamados «cultivo in vitro de creci -mien to lento o a tasas mínimas» se basan enla reducción del crecimiento mediante dife ren -tes métodos: modificación de nutrientes delmedio de cultivo, uso de reguladores o inhibi -dores de crecimiento, reducción de la tempe -

ra tura de incubación, desecación y cambio dela concentración de gases atmosféricos, re -duc ción de tensión de oxigeno, defoliación debrotes y manipulación de la presión osmóticade los medios de cultivo, tamaño de los enva -ses o tubos, intensidad de luz y fotoperiodo.La temperatura interacciona con casi todosesos factores.

En resumen, el crecimiento y desarrollo puedeser reducido agregando o modificando losmedios de cultivo en dos formas básicas:gene ran do estrés (principalmente osmótico) outili zando reguladores de crecimiento parareducir la elongación y multiplicación celular.

Diferentes investigaciones fueron conducidasen varios cultivos ecológicamente diferentes,po niendo en evidencia principios o tenden -cias. La reducción de la temperatura disminu -ye el crecimiento de los cultivos, pero ésta de -pende del cultivo. También se reduce el creci -miento privando al medio de ciertos nutrientesinorgánicos y orgánicos. El crecimiento varíasegún el contenido total del nitrógeno, elbalance Carbono/Nitrógeno y el contenido desa ca rosa. Los reguladores de crecimientoactúan en forma antagónica al ácidogiberélico, redu cien do la elongación ymultiplicación celular. El ácido abscísico esretardante del crecimien to. La concentraciónosmótica del medio es otro factor importante.Los azúcares-alcoholes (sorbitol, manitol) noasimilables por las plan tas, son sustanciasque generan estrés osmó ti co y reducción delcrecimiento de los explan tes. El uso de carbónactivado combinado con baja concentraciónosmótica del medio permi te aumentar eltiempo de conservación. En condiciones debaja temperatura se necesita reducir laintensidad de la luz. Cada especie tiene unóptimo de conservación in vitro y se debediseñar el protocolo más adecuado para cadaespecie. Desafortunadamente en algu noscasos esos factores combinados varían con lavariedad y el tiempo de conservación.

Cabe recalcar que esos métodos pueden oca -sio nar alteraciones no deseables para la con -

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ser vación del germoplasma. Por ejemplo, lascélulas de plántulas bajo estrés son de menortamaño, con vacuolas muy pequeñas y en me -nor número. Por otro lado, los reguladores decrecimiento pueden producir condiciones dese nescencia que limitan el rango de concen -tra ción de esas sustancias químicas. El otroproblema es la reacción diferente de genotiposdel banco de germoplasma debido a una con -di ción hormonal no igual entre los explantes.Otra alternativa es reducir la temperatura am -bien tal de la cámara de crecimiento in vitrohasta los límites en que se logre la mayor lon -ge vidad de las plántulas. El principio es la re -duc ción del sistema metabólico de la plantadebido a la alta sensibilidad de enzimas, hor -monas y reguladores, al efecto de las tempe -raturas.

Protocolos que permiten la efectiva conserva -ción de germoplasma in vitro han sido desa -rro llados para aproximadamente 37.600acce siones en el mundo. Si bien el cultivo invitro elimina los problemas asociados con laconservación en campo, su éxito es función dela eficiencia de la micropropagación y de lamanutención de la integridad genética de lascolecciones.

Ciertas propiedades del cultivo in vitro re du -cen la fidelidad de los sistemas demanutención in vitro de germoplasma. Lavariabilidad asociada al cultivo in vitro sedenomina variación somaclonal, es decir,alteraciones genéticas de los materialesconservados in vitro res pecto a la plantamadre, situación no desea da desde el puntode vista de la conserva ción de germoplasma.Algunas de estas varia cio nes son heredablesmientras que otras son epigenéticas, de tiporeversible y no hereditaria. La variaciónsomaclonal puede ser atribui da a diversosfactores como la especie, los me dios decultivo, los reguladores de creci mien to, el tipode explante y el número de re pi cajesrequeridos entre subcultivos. Por lo tanto, esimportante manejar los factores que inducenvariación somaclonal y evaluar posi bles

alteraciones, utilizando análisis citológi cos y/omoleculares en los materiales conservados invitro. La variabilidad asociada al cultivo invitro puede ser parcialmente mi ni mizadautilizando ápices meristemáticos, los cualesposeen células con un menor grado dediferenciación y genéticamente más esta bles.El riesgo de cambio genético en este tipo dematerial es mucho menor que cuando seemplean “callos” o estructuras desorganiza -das. La elección del explante y el monitoreode las colecciones son importantes a fin dede tectar posibles variantes en relación al ma -te rial original, el cual puede ser efectuado me -diante marcadores moleculares.

12.5. CRIOPRESERVACIÓN OSUSPENSIÓN TOTAL DELCRECIMIENTO Y METABOLISMO

Actualmente, debido a los inconvenientes delos métodos antes descritos, se han derivadocrecientes recursos a la búsqueda de otrosmé todos de conservación a largo plazo, comola criopreservación. El desarrollo de métodosde conservación de germoplasma a tempera -turas criogénicas ha surgido como una nuevaalternativa de conservación a largo plazo (co -lec ción base) para un gran número de espe -cies. La criopreservación se basa en la reduc -ción y subsecuente detención de las funcionesmetabólicas y la división celular de los tejidosvegetales debido a la disminución de su tem -pe ratura al nivel del nitrógeno líquido (-196°C), manteniendo así la viabilidad de los mate -riales conservados por periodos indefinidos detiempo.

El proceso de criopreservación comprendediferentes pasos:

• aislamiento y deshidratación del tejido• enfriamiento• congelación• almacenamiento• descongelamiento• recuperación y crecimiento de plantas

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Una etapa muy crítica es la formación de cris -ta les de hielo intra y extracelular. Durante elproceso de congelación se inicia la formaciónde cristales de hielo en la solución extracelulardel tejido, produciendo un desequilibrio ter -mo dinámico, perdiéndose agua desde el inte -rior de las células hacia los cristales de hieloubicados al exterior. El equilibrio se produceformándose hielo intracelular, lo que mata lascélulas. El éxito del proceso depende de la ve -lo cidad y evolución del enfriamiento y conge -la ción. Si el enfriamiento es lento, toda elagua congelable sale de la célula producién -dose daño por deshidratación, aumento de laconcentración osmótica interna y desinte gra -ción de la membrana celular. Si el enfriamien -to es rápido, el agua congelable no sale de lacélula por falta de tiempo y se forman cristalesintracelulares. El enfriamiento moderadocontro la la salida del agua de la célula asícomo la deshidratación y congelamientointracelular, debido al contenido suficiente dela célula. El control de la rapidez delenfriamiento se ejerce hasta ciertatemperatura límite, después de la cual ya noexiste peligro. Las temperaturas lími te y lastasas de enfriamiento deben ser investigadaspara cada especie. A fin de supe rar elproblema de la formación de hielo, se pue deusar agentes crioprotectores, como gli ce rol,sorbitol y manitol; el objetivo es de reem pla -zar el agua de la célula por criopro tec tores.Según las especies, varias técnicas han sidousadas para evitar el daño causado por elcongelamiento: reducción rápida de la tempe -ratura mediante inmersión directa del explan -te en nitrógeno líquido, enfriamiento lento ycontinuo hasta una cierta temperatura (- 40°C) y posterior inmersión en nitrógeno líquido.

El descongelamiento de los tejidos es otra eta -pa crítica. El método más eficiente es poneren baño maría a 40° C por algunos minutoshasta que el hielo se transforme en agua. Du -rante el descongelamiento, se produce la hi -dra tación del ambiente intra y extracelular. Siel descongelamiento es lento, en presencia demicrocristales, estos se cristalizan forman do

cristales de hielo más grandes, produciendo ladestrucción de organelos y membranas celula -res. Si la deshidratación es extrema, el des -con ge la miento tiene que ser más lento paraprevenir una plasmólisis masiva. Después deldescongelamiento, se debe cambiar el conte -nido del medio debido a la presencia de sus -tancias tóxicas provenientes de las necrosis delas células.

Una exitosa criopreservación depende denume rosos factores como el tipo y condiciónfi siológica del explante, los crioprotectoresem plea dos, la rapidez del proceso de congela -miento y descongelamiento, la temperatura demanutención y la estrategia de recuperaciónde los tejidos, entre otros. Varias técnicasexis ten para reducir o eliminar estos proble -mas: pretratamientos con crioprotectores, en -fria miento y descongelamiento rápido o lento,reducción o absorción de las sustancias tóxi -cas que se generan de las células muertas deltejido criopreservado, etc.

Esta metodología ha sido utilizada en aproxi -madamente cien especies a nivel mundial, loque permite suponer que en un futuro cercanose convertirá en la metodología de conserva -ción más eficaz, segura y de bajo costo. Lostejidos más apropiados para criopreservar sonvarios como granos de polen, protoplastos,semi llas, yemas invernales, meristemas,embrio nes cigóticos y somáticos, cultivos ensus pensión y callos. Las primeras investi -gaciones en criopreservación identificaron losmeriste mas de tallos como lo más conve -niente. Actual mente se demostró que loscultivos de embriones tienen ventajas y unbajo riesgo de variación somaclonal,particularmente los embriones cigóticos ysomáticos de tamaño pequeño. Otrainnovación de la técnica es la aplicación de lavitrificación. Los tratamientos se basan en unenfriamiento muy rápido, cau sando lavitrificación interna de los solutos den tro delas células, evitándose la formación de hielointracelular.

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12.6. INTEGRIDAD Y ESTABILIDAD ENCULTIVO IN VITRO

El objetivo básico de los bancos degermoplas ma de propagación clonal es el demante ner la identidad genética de cadaaccesión. Desde el punto de vista del cultivode tejidos, está ampliamente demostrado quemientras más directa sea la regeneración deuna nueva plántula, la probabilidad devariación es mu cho menor. Sin embargo,variaciones epigené ti cas, puntuales yquimeras pueden ocurrir en cualquiermomento, particularmente en los ban cos degermoplasma clonales in vitro a medianoplazo usando bajas temperaturas y/oreguladores de crecimiento. Esto significa unapresión de selección sobre el material y unaposibilidad de variación genética. Resulta quees necesario desarrollar programas de evalua -ción de la integridad genética de los materia -les conservados in vitro. La comprobación dela integridad genética requiere observacionesmorfológicas, comprobando los materialesman tenidos in vitro con los materiales seme -jan tes multiplicados en los terrenos. Existentambién pruebas bioquímicas, moleculares ycromosómicas para comprobar la integridadgenética y reducir el riesgo de variación soma -clonal.

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13.1. INTRODUCCIÓN

El mantenimiento de colecciones de plantasmediante el empleo de las técnicas de cultivoin vitro ha sido y es un método estándar deconservación que contribuye a la preservaciónde la diversidad genética en los cultivos y re -pre senta una práctica alternativa al manteni -mien to de colecciones de campo, las cualesde forma general ocupan grandes áreas, lasque son muy vulnerables y difíciles de mante -ner, encontrándose siempre bajo los riesgosde fenómenos naturales, plagas y enfermeda -des que pueden causar su desaparición.

Los trabajos relacionados con la micropropa -gación y la conservación in vitro de plantasincluyen una serie de riesgos donde las plan -tas micropropagadas podrían sufrir ciertasmo di ficaciones en el genoma y producir plan -tas in vitro diferentes a la planta original. Paraevitar en lo posible estos cambios, es necesa -rio la estandarización de un protocolo de con -ser vación para la especie, tanto los nutrientesdel medio de cultivo y las condiciones medio -ambientales donde se establece el cultivo invitro. En consecuencia, ello también implica,el establecimiento de un protocolo de monito -reo de posibles inducciones o generación denuevos variantes.

13.2. CONSERVACIÓN IN VITRO DEGERMOPLASMA

En cualquier especie cultivada es muy impor -tante conservar toda la variabilidad y tambiéna las especies silvestres relacionadas paraman tener su nivel de diversidad genética pre -sente. Comúnmente, las técnicas mas útilespara almacenar las entradas de los cultivareso especímenes silvestres son métodos dealmacenamiento en frio o a temperaturas ultrabajas, porque demandan espacios pequeños,costos relativamente bajos, eliminando pro -ble mas externos que afectan la conservaciónin situ (Peredo et al., 2008).

La conservación de los recursos fitogenéticosmediante técnicas de cultivo in vitro se realizahaciendo cambios en el ambiente de cultivopara reducir el crecimiento o desacelerar y/osuprimir totalmente el crecimiento de las célu -las y tejidos. Con ello lo que se persigue esextender lo máximo el tiempo de renovación orefrescamiento de la entrada o, extenderlo in -de finidamente. La conservación en frio in vitroreduce el crecimiento de la planta, minimi -zando los gastos y el tiempo de consumo delos protocolos, como el incremento del tiempode los intervalos de subcultivo. Estos tiemposde subcultivo varían según los protocolos yespecies entre 1 y 2 años.

Capítulo 13Conservación in vitro y evaluación

de la estabilidad genética

Raúl Blas Sevillano, Carmen L. Villarroel & Gino Aguirre

En consecuencia hay dos sistemas básicos deconservación del germoplasma in vitro, unomediante la limitación del crecimiento hastatasas mínimas, llamada en frío, y otro me -dian te la supresión total del crecimiento y delmetabolismo celular, conocido también comocriopreservación (Roca et al., 1993).

En ese afán, son numerosas las sustanciasque han sido empleadas en los medios decultivo para reducir el ritmo de crecimiento delas plantas, entre las que pueden citarse elmanitol, sorbitol, ácido acetil salicílico (ASA) yotras. Sin embargo, tanto la sustancia comosu concentración, estarán en dependencia dela especie y dentro de éstas, los genotipos aconservar, así como las condiciones de tempe -ratura, intensidad luminosa, fotoperiodo yotros factores a los cuales son conservadas lasplantas, por lo que resulta de gran importan -cia probar, en cada laboratorio cuál es la sus -tan cia idónea y qué dosis emplear para lograrlos mejores resultados.

En este sentido, existen esfuerzos en los estu -dios sobre la fisiología de las plantas conser -va das in vitro para lograr mejor respuesta enel desarrollo y su mantenimiento de la identi -dad genética (Cárdenas & Villegas, 2002). Elcrecimiento de los explantes en un ambientepequeño y controlado, llevaría a la generaciónde algunos problemas diferentes a los queocurren cuando una planta se desarrolla en unambiente natural. Por ejemplo, en general, enplántulas in vitro se generan hojas de aparien -cia translúcida, húmeda y vidriosa, conocidacomo hiperhidratación. Esto significa conocerel efecto de los solutos del medio del cultivoque tienen en el potencial osmótico, debido aque pueden ocasionar que los explantes invitro absorban mayor cantidad de agua y ocu -rra hiperhidratación de tejidos (Cárdenas &Villegas, 2002). Entre las principales causasde la hiperhidratación están el potencial os -mó tico y la concentración del agar en el mediodel cultivo. En consecuencia, conforme el po -ten cial osmótico es más negativo y se cambiael potencial matricial del medio, la hiperhidra -

ta ción disminuye como consecuencia de unamenor absorción de agua, además el explantetiene un contacto menos eficiente con elmedio, lo que dificulta la disponibilidad de losmacro y micronutrientes del medio, depen -dien do de la concentración del agar (George,1993, citado por Cárdenas & Villegas, 2002).

El potencial osmótico es uno de los compo -nentes del potencial del agua. Al aumentar laconcentración de la solución, la presión osmó -tica también aumenta. La concentración totalde las sales de un medio de cultivo determinael potencial osmótico del medio. Este se obtie -ne de la suma de los potenciales osmóticos delos componentes, donde influyen no sólo lospesos sino también el grado de disociación delas sales que lo constituyen. Lo mismo sucedecon los azúcares. El efecto que tienen losazúca res y los micro y macronutrientes en elpo ten cial osmótico es diferente en losdistintos medios de cultivo. El crecimiento yorganogé nesis del cultivo in vitro se detendríasi el poten cial osmótico fuera más negativoque aproxi ma damente -3x105 Pa = -3 bar (=-0.3 MPa), por que se impide la absorción delagua (Pierik & Steegmans, 1975; citado porCárdenas & Villegas, 2002). Por ello, se hanhecho muchos esfuerzos en el mundo enestandarizar medios de cultivo y el ambientepara diferentes cultivos. Así por ejemplo, en elCentro Internacional de la papa (CIP) se hanestablecido los protocolos de conservación delos tubérculos y raíces andinas incluyendopapa y camote (Cuadro 1), los que actual -men te se encuentran disponibles para su apli -cación en diferentes bancos de germoplasma,particularmente en la región andina. Como seobserva en el Cuadro 1, el agente osmóticomás utilizado es el sorbitol. Para el caso de lasespecies de arracacha, achira y yacón, lospro to colos de conservación in vitro aún no es -tán bien establecidos. Considerar estos aspec -tos que generan estrés en los explantes en elproceso de conservación in vitro de germo -plasma, son esenciales para reducir en lo po -si ble cambios potenciales de la identidadgené ti ca del germoplasma in vitro.

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Cuadro 1. Composición del medio de cultivo para la conservación in vitro de raíces y tuberosasandinas incluyendo papa y camote

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Sorbitol

El sorbitol es un poliol o alcohol de azúcar,conocido también como glucitol. Fue identi fi -ca do por primera vez cuando se aisló del frutodel fresno de montaña en 1872. En la natura -le za es un glúcido principal producido por lafotosíntesis en las hojas adultas de ciertasplan tas de las familias Rosaceae yPlantaginaceae y en los frutos como las

peras, las manzanas, las cerezas y los duraz -nos, etc. En la actualidad, el sorbitol, cuya fór -mu la empírica es C6H14O6, se produce indus -trialmente mediante la hidrogenación catalíti -ca de soluciones de D-glucosa (Figura 1). Lapresión osmótica ejercida por las solucionesde sorbitol es superior a la de las solucionesde sacarosa con una sustancia seca similar,razón por la cual se utiliza en los medios decultivo in vitro para reducir el proceso de

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asimilación de minerales y agua por lasplántulas. Las soluciones de sorbitolestabilizan las fór mulas más eficazmentecontra el deterioro microbiológico que susequivalentes de sacarosa. En contraste con losazúcares, el sorbitol es absorbido portransporte pasivo. Esto, origina menoresporcentajes de absorción. Además, la lentaabsorción y el complejo metabolismo delsorbitol implica que tiene menos valor calóricoque los azúcares normales.

Por otro lado, la preservación a ultra baja tem -peratura, o llamado también criopreservación,es el proceso en el cual células o tejidos soncongelados a muy bajas temperaturas, gene -ral mente entre el punto de ebullición del nitró -ge no líquido (-196 ºC). Esta baja temperaturadisminuye las funciones vitales de una célulao un organismo y puede mantenerlos en con -di ciones de vida suspendida por mucho tiem -po, con ello se reemplaza la rutina de subcul -ti vos. A esas temperaturas, cualquier activi -dad biológica, incluidas las reacciones bioquí -mi cas que producirían la muerte de una célu -la, quedan efectivamente detenidas. Para ello,es necesaria la utilización de un criopreser -van te, que es un compuesto químico que per -mite la mantención de un tejido o de célulaspor mucho tiempo cuando se las mantiene abaja temperatura. Los criopreservantes se ca -ta lo gan de acuerdo a la velocidad para pene -trar los tejidos, el grado de protección al cris -tal de agua que confieren y por la toxicidadquí mica que pueden tener sobre las células. Elgrado de protección a las células está directa -

mente vinculado al grado de asociación quetengan con el agua molecular. A mayor afini -dad, menor el agua disponible para la cristali -zación dañina.

Además, estos productos se utilizan en con -junto con los medios nutritivos líquidos queconforman las mezclas congelantes. Lasconcentraciones criopreservantes son lamen -ta ble mente tóxicas para el tejido a temperatu -ra ambiente, por lo cual, en el procedimientode congelado, se deben respetar ciertos tiem -pos de exposición del material a 4° C, paraque el producto protector penetre el tejido sinalcanzar los niveles tóxicos referidos, antesdel inicio del proceso de congelamiento pro -pia mente del explante. En el mismo sentido,cuando se procede a la técnica de desconge -lado, previo al uso del material, se debe some -ter a un lavado minucioso con medios nutriti -vos a concentraciones decrecientes del crio -pre servante, para su total eliminación evitan -do de esa forma los efectos tóxicos. Los crio -pre ser vantes más usados son: Dimetil-sulfó xi -do (DMSO), es muy tóxico a temperatura am -biente, pero si se aplica a baja temperatura esel que posee mejor resultado; Polivinil pirroli -dona (PVP), que no tiene un movimiento rápi -do tisular (a través de los tejidos), por lo quese utiliza mucho en embriones; Glicerol, muyutilizado para mantener enzimas entre los -5a 4º C sin congelar; etilenglicol, propa nodiol,entre otros. Además se ha observado que laglucosa, la trealosa y otros glúcidos puedenactuar como criopreservantes natu rales.

Figura 1. Proceso de obtención industrial y estructura química del sorbitol

En los protocolos de criopreservación de layuca y papa, el criopreservante usado es elDMSO (Gonzales-Arnao et al., 2008), estedisolvente seria el menos tóxico, razón por lacual su uso es bastante generalizado. El dime -til sulfóxido (DMSO, CH3SOCH3) es un líquidoorgánico sin color que contiene sulfuro, usadocomo disolvente orgánico industrial, criopre -ser vante y como un medicamento (reduce eldolor y la inflamación). Por su propiedad deatra vesar rápidamente la epidermis y lasmem bra nas celulares el DMSO sirve tambiéncomo acarreador de drogas o venenos. El usode DMSO como criopreservante tiene elobjeti vo de prevenir la muerte celular cuandoellas son enfriadas. También, el DMSO esusado en PCR (reacción en cadena de lapolimerasa) pa ra evitar la formación deestructuras secun darias tanto en el DNAblanco y en los inicia dores. La adición deDMSO es beneficioso cuando el DNA moldeposee regiones ricas en GC y forma potentesestructuras secundarias del DNA que puedeprovocar que la polime ra sa se detenga. ElDNA con regiones ricas en GC puedeocasionar una ineficiente separa ción de lasdos cadenas del DNA, por lo tanto la adiciónde aditivos en estos casos es benefi cio sa,pues el DMSO interfiere en la formación deenlaces de hidrógeno entre ambas cadenas(Chakrabarti & Schutt, 2001; Musso et al.,2006). Sin embargo, el uso de DMSO en PCRincrementaría la tasa de mutación.

Técnicas de criopreservación existen paraalre dedor de 100 especies vegetales. Aunquelos efectos de los criodaños sobre el genomason en general desconocidos, el polimorfismode DNA acumulativo son el resultado delproceso conjunto de cultivo-criopreservación-re ge neración (Harding, 2004). Sin embargo,va rios factores pueden causar variaciónsomáti ca, como la exposición de los tejidos alos es tre ses físicos, químicos y fisiológicos.Estos factores generarían criodaños quetendrán efec tos en el genoma. Otros factorestradicio nal mente descritos que pueden causarvaria ción somaclonal son la fuente del

explante, la edad del cultivo y el genotipo(Peredo et al., 2008).

Por ello, es recomendable estimar la integri -dad genética de las plantas sobrevivientes delalmacenamiento criogénico para determinar siellas son los tipos verdaderos luego de la crio -preservación. Esta estimación puede ser reali -zada al nivel fenotípico, histológico, citológico,bioquímico y molecular.

13.3. VARIACIÓN SOMACLONAL

El cultivo in vitro puede ser muy estresantepara las células vegetales e involucra procesosmutagénicos durante el establecimiento delexplante, la inducción de callo, la formaciónde embriones y la regeneración de plantas.Este proceso denominado variación somaclo -nal por Larkin y Scowcroft (1981), involucracambios en las plantas regeneradas y en algu -nos casos en sus progenies. Estas variaciones,son los resultados tanto de las diferenciasgenéticas que preexisten en las células somá -ticas del explante como de efectos inducidospor los componentes del medio de cultivo.

Además, en la conservación de germoplasmain vitro se debe tener en cuenta que los ex -plan tes utilizados son yemas apicales o axila -res, las que son completadas en su desarrolloy promovidas en un medio de cultivo estanda -riza do según la especie y variedad (Cuadro 1).Este crecimiento y desarrollo del explante ocu -rre gracias al proceso de división mitótica, elloimplica la replicación del genoma en cadadivi sión. Aunque esta replicación del DNA esde alta fidelidad por los mismos procesos decontrol durante la división celular, ocurre cam -bios en los nucleótidos por la ineficiencia delcontrol de las DNA polimerasas 1/1010

(Reece, 2004). Esto junto con el medio estre -sante puede generar aun cambios más altosen proceso de conservación in vitro.

El término variación somaclonal es un términoamplio que engloba diferentes fenómenos quecausan variación genética o epigenética, que

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pueden ser reflejados en cambios fenotípicosen las plantas regeneradas. Al mismo tiempose debe asumir que la probabilidad del cam -bio está distribuido en forma al azar a lo largodel genoma. Aunque se han reportado la exis -tencia de ciertas regiones del genoma con ma -yor susceptibilidad a la mutación. Los cam -bios no genéticos se denominan como la va -ria ción epigenética.

La variación epigenética

La variación epigenética hace referencia, enun sentido amplio, al estudio de todos aque -llos factores no genéticos que intervienen enla determinación de la ontogenia. El términofue acuñado por Waddington (1942) parareferirse al estudio de las interacciones entregenes y entorno que producen los organismos.Por otro lado, Holliday (1994), definió la epi -ge nética como “el estudio de los mecanismosde control espacial y temporal de actividad delgen durante el desarrollo de organismos com -plejos”. La herencia epigenética resulta de latrasmisión de información que no depende desecuencias de las bases nitrogenadas del DNAa través de la meiosis o mitosis. La informa -ción epigenética modula, por tanto, la expre -sión de los genes sin alterar la secuencia deDNA. Los tres principales tipos de informaciónepigenética son:

a) Metilación de la citosina del ADN: La me -ti la ción es la adición de un grupo metilo (-CH3) a una molécula. Aquí la metilaciónconsiste en la transferencia de grupos me -ti los a algunas de las bases citosinas (C)del DNA situadas previa y contiguamente auna guanina (G). El grupo metilo es trans -fe rido desde S-adenosilmetionina a unapo si ción C-5 de citosina por una DNA-5me tiltrasferasa. Puesto que la metilaciónes fundamental en la regulación del silen -cia miento de los genes, puede provocar al -te raciones en la transcripción genética sinnecesidad de que se produzca una altera -ción en la secuencia del DNA, siendo unode los mecanismos responsables de laplas ticidad fenotípica. También pueden ser

metilados los productos de los genes, esde cir, las proteínas, regulándose asítambién su función.

b) Marca o impronta genética (imprinting):Esto se refiere a genes que puedenmodificar su funcionamiento sin necesidadde un cambio en la secuencia del DNA.Este cambio en su forma de manifestarseque tienen los genes “imprintados” estágeneralmente relacionado a su origenparental. Un gen imprintado se manifiestade una manera cuando su origen espaterno y de otra cuando proviene delgameto materno. Parece ser que existe unmecanismo celular que de algún modo“marca” o deja una impronta sobre todoslos genes “imprintables” de acuerdo alsexo del individuo.

c) Modificación de histonas: Incluye acetila -ción, metilación y fosforilación (Watson etal., 2004).

La metilación puede ser inducida en cultivo detejidos estresados, vitrificados. El estado es -tre sado puede activar DNA metilasas específi -cos que resultarían en dominios altamenteme ti ladas dentro del genoma como una res -puesta adaptativa, especialmente en las con -di ciones de alto estrés osmótico durante lacrio protección (Harding, 2004).

13.4. ESTABILIDAD GENÉTICA

En general, el objetivo de la conservación exsitu, como por ejemplo la de conservación invitro es mantener la fidelidad genética de ca -da una de las entradas conservadas. Sin em -bar go, se ha reportado que el cultivo de teji -dos induce la variación genética, a esta varia -ción se le conoce como variación somaclonal.Este aspecto es muy importante para lasbases de la misma micropropagación, ya queel objetivo principal del proceso es el mante -nimiento de la fidelidad genética de los rege -ne rantes, como por ejemplo durante la micro -propagación de genotipos selectos. Se hanpro puesto muchos factores que influencian el

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tipo y la frecuencia de variación somaclonal,tales como el medio utilizado, fuente delexplan te, edad de la planta, y el genotipo utili -zado. La técnica de micropropagación queutili za como explante yemas laterales o apica -les, es uno de los extensamente usados en sis -te mas de micropropagación y es consideradala más segura para garantizar la estabilidadgenética de las plantas obtenidas (Martins etal., 2004). Este tipo de explantes son los quese utilizan en la conservación in vitro de lostubérculos y raíces andinas, tales como en lassiguientes especies: papa, oca, olluco (o pa -pa li sa), mashua (o isaño), arracacha y yacón.Sin embargo, es importante considerar que lamicropropagación puede involucrar alteracio -nes relacionadas con el daño de la célula yDNA, incluyendo estrés oxidativo causado porel uso de agentes oxidativos en la esteriliza -ción de los explantes primarios y en las heri -das de los tejidos tanto en el inicio del cultivoo en los subcultivos (Cassells & Curry, 2001).

13.5. MONITOREO DE LA ESTABILI -DAD GENÉTICA Y EPIGENÉTICA

La estabilidad genética de las entradas micro -propagadas o conservadas in vitro y otras for -mas de conservación ex situ se pueden reali -zar considerando diferentes tipos de marcado -res, entre ellos: los marcadores morfológicos,citogenéticos, bioquímicos y moleculares.

Los marcadores moleculares, que están basa -dos en el DNA proporcionan una forma efi -cien te de tamizar mutaciones inducidas en elcultivo de tejidos, ya que estos no son afecta -dos por los factores ambientales (Peredo etal., 2009). Desde este punto de vista, unaaproximación basada en el análisis al azar delgenoma parece apropiada; a la fecha, no hayun solo ensayo apropiado desarrollado paraestimar la variación somaclonal. Algunas delas técnicas usadas en la detección de lavaria ción genética son marcadores basados enla reacción en cadena de la polimerasa (PCR)tales como los marcadores RAPD (RandomAmplified Polymorphic DNA - Fragmentos

poli mór ficos de DNA Amplificados al Azar),ISSR (Inter Simple Sequence Repeat ó intermicrosatélites), AFLP (Amplified FragmentLength Polymorphism - Fragmentos Polimórfi -cos de DNA Amplificados), SSR (Simplesequence Repeats - Secuencias simplesrepeti das o microsatélites). De las cuales, losmas útiles serian RAPD y AFLP, particular -men te la última, que puede muestrear la va -ria bilidad al azar de muchos loci a lo largo delgenoma. Por ello, como ejemplo, se desarrollabrevemente estas dos técnicas.

13.5.1. Marcadores RAPDs

La técnica de RAPD detecta polimorfismo dela secuencia de los nucleótidos en una pruebabasada sobre la amplificación de DNA usandoiniciadores sintéticos cortos (generalmente de10 bases). En esta reacción, se utiliza un úni -co iniciador, y este se ancla al DNA genómicoen 2 sitios diferentes sobre las hebras opues -tas del DNA molde. Si estos sitios de anclajeestán dentro de una distancia amplificableentre los dos sitios de anclaje, un producto deDNA discreto se produce a través de amplifi -ca ción termocíclica. La presencia de cada pro -ducto de amplificación identifica homologíacompleta o parcial de la secuencia de nucleó -ti dos, entre el DNA genómico y el oligonucleó -tido iniciador en cada final (terminal) del pro -ducto amplificado. Fragmentos amplificados(0,5 - 5 kb) son separados por electroforesisen geles de agarosa y el polimorfismo es de -tec tado como la presencia o ausencia de frag -men tos de un tamaño particular (Figura 2).

El polimorfismo RAPD es el resultado delcam bio de una base de nucleótido que alterael sitio de anclaje del iniciador, o una insercióno deleción dentro de la región amplificada.Los polimorfismos son usualmente evidencia -dos por la presencia o ausencia de un produc -to de amplificación de un solo locus, esto sig -ni fica que la técnica RAPD tiende a proveersola mente marcadores dominantes (Figura 3).Las ventajas de marcadores RAPDs son queellos pueden ser bastante polimórficos, simple

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Figura 2. Diagrama de obtencion de los marcadores RAPDs

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provisto de una metodología rigurosamenteestan darizada con los controles necesaria men - te adheridos. El ensayo es no radioactivo,requiriendo solamente cantidades nanogramosde DNA, y es aplicable a un amplio rango de

especies. Las desventajas incluyen informa ciónlimitada acerca de la estabilidad ambien tal delpolimorfismo y las bases moleculares deRAPDs.

Figura 3. carácter codominante de los marcadores RAPD

13.5.2. Marcadores AFLPs

AFLPs son fragmentos de DNA (80 - 500 pb)obtenidos por restricción con endonucleasas yamplificadas por PCR. La técnica involucratres etapas: (a) restricción del DNA y ligaciónde los oligonucleótidos adaptadores; (b) am -pli ficación selectiva de los grupos de los frag -mentos de restricción; (c) análisis de gel delos fragmentos amplificados (Figura 4). Laam plificación PCR de los fragmentos de res -tric ción se logra usando el adaptador y se -cuen cias de sitios de restricción como sitios

blan cos para el anclaje del iniciador. La ampli -ficación selectiva se logra por el uso de inicia -dores que extienden dentro de los fragmentosde restricción, amplificando solamente estosfragmentos flanqueados. Usando este méto -do, grupos de los fragmentos de restricciónpueden ser visualizados por PCR sin conocerla secuencia de nucleótidos. El método permi -te la co-amplificación específica de númerosaltos de los fragmentos de restricción. gene -ralmente 50 - 500 fragmentos de restricciónson amplificados y detectados sobre geles depoliacrilamida (Vos et al., 1995).

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Polimorfismo obtenido con latécnica AFLP en el cultivo dearracacha.

Fuente: Adaptado de De Viene, 1998.

Figura 4. Principio de la técnica AFLP

Estos marcadores fueron desarrollados paradetectar diferencias entre los genotipos. Apesar de las especificidades de cada una delas técnicas, las ventajas de tales como: suamplio rango de tamizado del genoma, el altonúmero de marcadores obtenidos en cadareacción y la confiabilidad para diferentes ge -nomas, sin la necesidad de hacer un conoci -miento previo sobre el perfil de estas podero -sas técnicas multilocus en el estudio de esta -bi li dad genética luego del cultivo de tejidos,hacen que en diferentes estudios estos marca -dores hayan sido una ayuda exitosa en labúsqueda de puntos de mutación en plantasderivadas de cultivo de tejidos y conservadasin vitro.

Por otro lado, se están desarrollando marca -do res para detectar variación epigenética. Re -cientemente, en la evaluación de la variaciónsomaclonal han sido utilizadas otras técnicasbasadas en las secuencias de los transposo -nes como el polimorfismo amplificado deinter-retrotransposon (Inter-RetrotransposonAmplified Polymorphism, IRAP) y el Polimor -fismo Amplificado De Microsatélite Retro -trans poson (REMAP). La dispersión, presenteen todas las partes del genoma y la abun -dancia de los retrotransposones en el genomade plantas provee una excelente base para de -sa rrollar el sistema de marcadores. Ellos con -tie nen secuencias largas, definidas y con ser -va das, las que pueden ser usadas para clo narmarcadores específicos y las secuencias flan -queantes.

Además, miembros de replicación activa de lafamilia de retrotransposones pueden producirnuevas inserciones en el genoma, lo que origi -na ría nuevo polimorfismo. La activación delretrotransposon relacionados con los procesosdel estrés, como los que se producen duranteel cultivo in vitro ha sido ampliamente des cri -to (Grandbastien, 2004). La activación tam -bién ha sido asociada con el decrecimien to dela tasa de metilación del genoma con respectoal cultivo in vitro (Liu et al., 2004), tal comofue reportado para H. lupulus (Peredo et al.,2006). Sin embargo, el planteamiento hipoté -

tico sobre las variaciones de metilación delDNA no solamente sería por la activación delos elementos transponibles, sino también ba -jo los mecanismos de inducción de mutagéne -sis del cultivo de tejidos como las alteracionesfenotípicas debido a la activación del gen, osilenciamiento del gen, eventos de ruptura delos cromosomas y cambios en la secuencia.Actualmente, varios métodos para medir laestabilidad de los niveles de metilación sondisponibles, incluyendo metilación global, mé -to dos de secuencia específica basada en mo -di fi caciones del bisulfito del DNA, y el poli -mor fismo amplificado de metilación sensitiva(Methylation Sensitive Amplified Polymor -phism, MSAP). MSAP es una técnica basadaen AFLP que usa metilación sensitiva isosqui -zo meros. MSAP ha sido ampliamente utiliza -da para estimar la estabilidad epigenética enplantas micropropagadas (Smykal et al.,2007).

Perazzo et al. (2000) realizaron análisis devariación somaclonal en diferentes entradasde papa (Solanum tuberosum L). Para ello,uti li zaron 20 entradas de conservación invitro mantenidas de tres a cinco años sin sub -cultivo y 18 entradas criopreservadas por unaño. En el análisis utilizaron 23 descriptoresmorfológicos y todas las entradas fueron com -paradas con clones originales para verificar siellas correspondían al tipo original parentalverdadero. Las 20 entradas conservadas invitro también fueron analizadas utilizando 14loci microsatélites altamente polimórficos ylos perfiles de amplificación obtenidas fueroncomparadas con los perfiles de sus respecti -vos clones originales mantenido en campo.Seis entradas mostraron variaciones en dife -ren tes caracteres morfológicos, cuatro entra -das de conservación in vitro (en frío) y dos decriopreservación. En el análisis con microsaté -lites (SSR) se observaron variaciones remarca -bles de los alelos en cinco entradas, de lascuales, cuatro entradas fueron encontradasdiferentes del clon parental original tanto poranálisis morfológico como molecular, y unaentrada mostró diferencia a nivel molecularsin ninguna diferencia morfológica.

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Estos resultados sugieren cambios somaclo -na les, pero los autores interpretaron que pro -ba blemente estas variaciones serían debido ala mala identificación de las entradas durantela gestión del banco de germoplasma de lapapa. Sin embargo, existen reportes de varia -ciones somaclonales en otros cultivos como elcaso del plátano, observadas usando técnicasde isoenzimas y RAPD (El-Dougdoug et al.,2007).

Peredo et al. (2008) analizaron la estabilidadgenética y epigenética de clones conservadosin vitro y criopreservados en el lúpulo(Humulus lupulus L.). Para estimar la estabi -lidad genética utilizaron las técnicas de RAPDy AFLP, las cuales revelaron que no habíaninguna variación cuando compararon con loscontroles conservados en el invernadero y losrespectivos clones conservados in vitro y crio -preservación. La estabilidad epigenética fueevaluada utilizando la técnica de MSAP yrepor taron que alrededor de 36% de los locifueron polimórficos cuando fueron compara -dos clones conservados in vitro y criopreser -va dos con los respectivos clones parentalesmantenidos en el invernadero. Los responsa -bles de esta variación epigenética serían lasvariaciones en los patrones demitilación ymetilación.

A pesar del poder de cada una de las técnicasmoleculares mencionadas previamente, noexiste una sola técnica ideal o suficiente,toma da como única para la estimación de lavariación. Una combinación de varias técnicasdebe ser usada para evaluar las plantasmicropropagadas.

13.6. ESTRATEGIAS PARA REDUCIRVARIACIÓN SOMACLONAL

Criopreservación y almacenamiento en frio (invitro), son las técnicas más utilizadas parasatisfacer los requerimientos de la conserva -ción del germoplasma por largos periodos.Para ello, el cultivo de tejidos continúa con surol fundamental en el desarrollo de la técnica

de conservación de germoplasma y particular -mente en la criopreservación. Pero también,quedan muchos retos científicos con respectoa la detección de la variación genómica en lasplantas recuperadas luego de la conservaciónin vitro y/o criopreservadas.

Actualmente, existen diferentes aproxima cio -nes para la estimación de las variacionessomaclonales, tales como:

a) el análisis fenotípico, los cuales se realizanpara un grupo de especies cultivadasimpor tantes, a través de los descriptoresmorfológicos,

b) las técnicas citológicas disponibles paradetectar varios tipos de inestabilidadcromosómica, que incluyen análisis depoliploidía, aneuploidía, y otras anormali -dades mitóticas,

c) los perfiles bioquímicos de los metabolitos,proteínas (isoenzimas) son útiles paracomparar plantas recuperadas de la crio -preservación o conservación in vitro con elmaterial parental original por el cambio delos patrones de expresión del gen,

d) el análisis de la secuencia de DNA genó -mi co se realiza usando técnicas de hibrida -ción (DNA-DNA) y técnicas de PCR y,

e) el análisis de variación epigenética encromatina y la metilación de las secuenciasde DNA, encontrándose en diferentes espe -cies de plantas cambios luego de la crio -pre servación, lo que sugiere alteración delos patrones de expresión del gen.

Para garantizar en lo posible el desarrollo clo -nal por división mitótica, se deben usar ex -plan tes diferenciados lo que comprendeestruc turas organizadas como yemas apicales,yemas laterales, o embriones. Estos ya estánprogramados genéticamente para desarrollarplantas tipo verdaderas o idénticas al original.Con ello, se reduciría drásticamente potencia -les mutaciones y la inducción de variación enplantas regeneradas sería mínima. Esta formade propagación de las plántulas in vitro parasu conservación debe ir con una estandariza -

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ción adecuada para cada especie de los nu -trien tes, aminoácidos, y reguladores osmóti -cos como el sorbitol.

Por lo tanto, es importante determinar en lasplantas conservadas por estos métodos dealma cenamiento, el verdadero tipo original yla estabilidad genética como la epigenética.Para ello son esenciales el establecimiento delas técnicas de monitoreo usando marcadoresmorfológicos complementados con los marca -do res moleculares que diferencien cambiosgenéticos y epigenéticos.

13.7. BIBLIOGRAFÍACárdenas A. & Villegas. 2002. Potencial osmótico del

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14.1. INTRODUCCIÓN

Entre los cultivos “olvidados” en los Andesdestaca la achira (Canna edulis) que seconsidera como uno de los primeros cultivosdomesticados en la Región Andina. Es fácil decultivar y se desarrolla muy bien produciendorizomas subterráneos, comestibles y algunasveces, muy grandes. El valor de este cultivo sebasa en la calidad de sus granos de almidónque se consideran los más grandes reportadosy se pueden ver a simple vista, siendo tresveces más grandes que el almidón de papa.Este almidón sometido a cocción es brilloso ytransparente, y no opaca como el de papa,maíz o el arrowrot (Maranta arundinacea).Este almidón cocinado es muy digestible ytiene características muy importantes paraniños, inválidos, ancianos y personas conproblemas de digestión.

14.2. ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN

Evidencias arqueológicas muestran que elrizo ma de achira (Canna edulis) fue utilizadodesde la época pre-hispánica, encontrándoserizomas crudos, cocidos y sus representacio -nes en la cerámica de la cultura Wari 100 a700 d.C. y de la cultura Chimu (JaroslowSoukup, 1979). En excavaciones realizadasen la Huaca Prieta del Valle de Chicaza seencontraron restos arqueológicos de achira

per te necientes al período temprano pre-cerámico (Gade, 1966). También en el centroceremonial y ritual de la cultura Nazca deCahuachi (se halla aproximadamente a 30Km al Sudeste de la actual ciudad de Nazca),se encontró representación de rizomas deachi ra en su cerámica (Piacenza, 1993). Portodas estas evidencias arqueológicas, lingüís -ti cas, culturales y de la variabilidad genéticaexistente podría decirse que Sudamérica escentro de origen de la achira (Vavilov, 1951).

La achira jugó un rol importante en la agricul -tura prehispánica, su cultivo fue intensivo y sedistribuyó desde Venezuela hasta el Norte deChile, en los valles sub-tropicales de los An -des y en el Amazonas (Gade, 1966). Es cono -ci da desde tiempos muy remotos por los anti -guos peruanos con los nombres de achira osumaj achira, cultivada en gran escala entiem pos de los incas, donde se le dio diferen -tes usos en la alimentación, medicina y en susrituales religiosos.

Seminario y Ruiz (1999) señalan que la achi -ra es de origen sudamericano, hallazgos ar -queo lógicos en el Perú demuestran que su cul -ti vo data de 2.500 años a.C. (Gade, 1966).Los incas la cultivaron hace once siglos.

Actualmente, la achira es conocida y se culti -va en Quenstand, Australia y Vietnam. En esteúltimo donde se estima se cultiva de 20.000

Capítulo 14Micropropagación y Conservación de

Achira (Canna edulis)

Eva Dancé Sifuentes, María de Lourdes Tapia & Rosario Lucero

a 30.000 Ha, hay una gran demanda enalmidón de achira, el cual es utilizado en lafabricación de fideos transparentes, muypopulares en el sudeste de Asia. Estos fideosson 100% almidón gelatinizado de achira conalto contenido de amilasa y con alta visco si -dad a temperaturas empleadas para elaborarpastas, lo que permite una mayor facilidad demanipular geles calientes en comparación conotros almidones (Hermann, 1994).

14.3. TAXONOMÍA

Según Montaldo (1967), la achira pertenece ala familia Zingiberacea. Sin embargo, la ma -yo ría de los autores (Barret, 1930; Gutiérrez,1953; Pérez, 1947; Standley, 1937; y Val ver -de, 1966), presentan la siguiente clasifica -ción:

Reino VegetalSubreino FanerógamasDivisión AngiospermaeClase MonocotiledóneasOrden ScitaminalesFamilia CannaceaeGénero CannaEspecie Canna edulis

Según Standley (1937), esta familia se carac -te riza por presentar un solo género, el cual esmuy abundante en especies (Gade, 1966), enAmérica Tropical y con pocas especies en Áfri -ca, Asia y Europa.

Seminario y Ruiz (1999), corroboran quetaxo nó micamente la achira pertenece al ordende las Escitamineas, familia Cannaceae, en lacual se han descrito más de 100 especies.Las Cannas son cultivadas como flores predi -lectas de jardín y algunas especies como laCanna edulis para la obtención de almidón.

14.4. MORFOLOGÍA

León (1987) describe la Achira como unaplan ta monocotiledonea, de porte herbáceo y

que se propaga vegetativamente. Existe ciertaconfusión en la denominación de los tallossub terráneos, mientras unos autores lesdenominan rizomas (Montalvo, 1991; Leiva,1964), otros los reconocen como cormos(León, 1972).

Seminario y Ruiz (1999), indican que la achi -ra presenta las siguientes características gene -rales: rizomas abundantes, esféricos, cilíndri -cos o en forma de trompos, miden de 5 a 20cm de largo por 3 a 12 cm de ancho. En susuperficie presentan surcos transversales quemarcan la base de las escamas que los cu -bren; de la parte inferior del rizoma salen ge -ne ral mente las raicillas blancas y cilíndricas, ydel ápice el seudo tallo, las hojas y el vástagofloral. Los tallos son de 0.40 a 2.5 metros dealtura, están cubiertos por las vainas envol -ven tes de las hojas; los pecíolos son general -men te oblongos, ovales, oblongo elípticos de0 a 70 cm de largo y de 5 a 30 cm de ancho.Las flores tienen racimos laxos, simples o bi -fur cados de color amarillo, rojo; son rojas pordentro y por fuera anaranjadas, son zigomor -fas y con dos brácteas en la base; el cáliz tie -ne tres sépalos, la corola tres pétalos de colorintenso, los estambres son petaloides de unco lor rojo vistoso, uno de ellos lleva las ante -ras funcionales y otro forma el labelo. Los fru -tos son cápsulas de tres celdas con gran canti -dad de semillas esféricas de color negro y muyduras.

14.5. ECOLOGÍA DE LA ACHIRA

La achira se cultiva principalmente en los va -lles cálidos desde los 1.000 hasta los 2.900msnm (Arbizu, 1994). Esta altitud comprendevalles interandinos y valles hacia la costa, condiferentes tipos de suelo desde los más fértiles(Valles interandinos de Santa, Urubamba, Tar -ma, etc.) hasta los suelos susceptibles a laerosión y pérdida de fertilidad a lo largo de lacosta. La achira se cultiva en menor intensi -dad en los valles cálidos de los andes desde elcentro al sur del Perú en las zonas bajas dePuquio del departamento de Ayacucho; en

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Coris, departamento de Huancavelica; enSan dia Puno; en Marcapata y Quispicanchis,departamento de Cuzco.

Según su hábito de cultivo, es un monocultivoen la región de Pauza, mientras que en lasdemás zonas se cultiva en asociación conotros cultivos como: cebolla, orégano, hinojo,ruda, culantro, col, arracacha, camote, yacón,caña de azúcar (Arbizu, 1964). En la regiónde Pauza se cultivan tipos blancos, verdes ymorados claro.

14.6. USOS DE LA ACHIRA

El almidón de la achira constituye una granfuente de materias primas para las más varia -das industrias, las cuales van desde los pega -men tos hasta el área de los alimentos. SegúnArbizu (1994) la achira se utiliza principal -men te para la producción de almidón indus -trial y para la preparación de mazamorras,panes, bizcochos, galletas. Las raíces de laAchira se comen asadas o cocidas. De susrizomas o cormos se obtiene la harina “almi -dón” con la que se preparan galletas, paneci -llos y dulces, pues contiene 4% de azúcar. Delalmidón se prepara un budín que se usa comoalimento para bebés y personas convalecien -tes. Los tallos tiernos son comestibles y losrizomas pueden utilizarse como alimento delganado.

En la industria farmacéutica se utiliza comorelleno en la elaboración de drogas en pasti -llas, que sirven para la tos seca, infeccionesde la piel, cefaleas, reumatismos, ulceras(Dancé, 2001).

En la industria textil se usa para almidonarprendas y lograr que luzcan de mejor aparien -cia y para lograr adhesión en las fibras queconstituyen las telas (Seminario, 1999).

En la actualidad, la Comunidad EconómicaEuropea ha centrado su atención en el uso depegamentos naturales derivados especialmen -te de plantas. El almidón de achira gracias a

sus propiedades, es una alternativa que se havenido explotando dentro de estas industrias,debido a que no presenta toxicidad y no esobstáculo en el reciclaje del papel. Además,da mejores acabados al papel (Seminario,2004). Las semillas se usan para la elabora -ción de rosarios y collares. Por la belleza desus flores la mayoría son ornamentales.

La parte aérea de la achira y el bagazo resul -tante de la extracción de almidón, no sólocons tituyen importantes fuentes de materiaorgánica para el suelo, sino que también sonutilizados como forraje, los mismos que sonpreferidos por cabras y cerdos (Dancé, 2001).

14.7. CULTIVO IN VITRO DE ACHIRA

Los primeros trabajos de cultivo in vitro enAchi ra fueron realizados en Ecuador en laEstación Experimental de Quito, se utilizaronyemas axilares o apicales, el tamaño del ex -plan te es de 4-8 mm; la desinfección que me -jor resultado dio fue un enjuague con etanol al75% por 30 segundos, lejía 25% + Twen 20por 15 minutos y lavados sucesivos con aguadestilada estéril, los explantes fueron implan -ta dos en medio de cultivo MS 1/2 + 3% desucrosa + 0,4% Agar, con 4 ppm BAP + 0,5ppm ANA y pH 5,7; los explantes dieron 1,03brotes y su tamaño promedio de 10,22 mmcon un sistema radicular bien desarrollado enun período de 10 semanas (Landázuri,1996). En el Instituto de Biotecnología de laUNALM se utilizan como explantes ápicesmeristemáticos de hijuelos jóvenes de plantasmadres de Achira.

La predesinfección de los explantes consisteen trasladar los hijuelos más jóvenes, previa -mente seleccionados, al laboratorio para suintroducción in vitro, donde se procede alcorte de hojas y raíz inutilizables, sometién -dolos a un lavado general con un detergentelíquido al 1%, se enjuaga en agua destilada yluego se procede a reducir los explantes a 5cm de longitud.

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14.8. DESINFECCIÓN YESTABLECIMIENTO DE LOSEXPLANTES

Una vez realizada la predesinfección, loshijue los se sumergen en alcohol al 70% por30 segundos, se realizan dos enjuagues conagua destilada estéril y se sumergen losexplan tes en NaOCl (0,5% por 10 minutos) +

Twen 20 (3 gotas). Inmediatamente se proce -de a enjuagar en tres oportunidades con aguadestilada esterilizada. Posteriormente se redu -cen los explantes a un tamaño aproxima do de0,5 cm, se sumergen en una solución anti -oxidante de ácido cítrico a 0,25 gr/100 ml deagua durante 5 minutos y se los siembra en elmedio de cultivo.

Figura 1. Explantes de achira 30 días después del establecimiento

El medio de cultivo para la fase de inicio,multiplicación y enraizamiento utilizado en el

Laboratorio de Biotecnología de la FCAPFyVde la UMSS es el siguiente:

Luego de la fase de establecimiento, losexplantes son transferidos al medio demultiplicación, el cual tiene una mayorconcentración de citoquininas para de estamanera estimular la formación y multipli -cación de brotes. El período de formación debrotes es de 30 días aproximadamente.

El período de multiplicación desde el iniciohasta el enraizamiento puede durar 10semanas. Las condiciones de incubaciónadecuadas son de 22 a 29º C, con unaintensidad de luz de 2.000 a 3.000 lux y unfotoperiodo de 16 horas de luz y 8 deoscuridad.

Cuadro 1. Multiplicación o proliferación de brotes laterales

La emisión de raíces generalmente no requierela adición de auxinas, habiéndose observadola presencia de éstas directamente en losfrascos en la fase de multiplicación.

Figura 2. Proliferación de brotes en achira

14.9. ACLIMATACIÓN

La fase de aclimatación se desarrolla en inver -nadero, es posible someter a las plantas a unproceso de endurecimiento previo abriendolos frascos ligeramente tres a cuatro díasantes de la aclimatación.

El sustrato que se utiliza debe ser previamentedesinfestado, las plantas en esta fase son muysusceptibles a deshidratarse, por lo que serecomienda regar con una solución fungicidainmediatamente después del transplante y cu -brir el conjunto con un plástico transparente.

Una vez finalizado el transplante a condi cio -nes de invernadero, se debe cubrir las bande -jas con un material que garantice una altahumedad interna y permita un porcentaje deluminosidad del 50%. El tiempo que las plan -tas deben permanecer en invernadero es de30 días, luego, las plantas están listas paraser transplantadas a campo.

Una alternativa interesante que favorece elproceso de aclimatación, es efectuar una últi -ma multiplicación en frascos conteniendo sus -trato inerte embebido en el medio de cultivo,de esa manera se favorece a un mejor endure -

cimiento de las plántulas. Similares técnicashan sido utilizadas exitosamente en la acli -matación de banano (Aguirre, comunicaciónpersonal).

14.10. CONSERVACIÓN PORCRECIMIENTO MÍNIMO

En experiencias preliminares en el Laboratoriode Biotecnología de la FCAPFyV, se utilizaronbrotes de plántulas de achira provenientes dela fase de multiplicación, con la finalidad deminimizar el crecimiento y desarrollo fisioló gi -co normal en condiciones in vitro. La intensi -dad luminosa evaluada fue de 1.000 a 1.500lux; a una temperatura de 21º C y un fotope -rio do de 16 horas luz y 8 de oscuridad. Enestas pruebas, sometiendo a los explantes atemperaturas de 8º C, se observó un totalnecrosamiento en los explantes evaluados.

El medio de conservación utilizado fue el MSal 50% de concentración, con diferentes nive -les de sorbitol (20, 40, y 60 gr/l) y diferentesconcentraciones de reguladores de crecimien -to.

Las diferentes pruebas han permitido generarinformación valiosa para poder conservar amediano plazo colecciones in vitro de esta raízandina.

14.11. BIBLIOGRAFÍA

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15.1. INTRODUCCIÓN

El género Passiflora de la familia Passiflora -ceae, contiene más de 400 especies distribui -das en el continente americano. En Bolivia sehan encontrado alrededor de 60 especies(Vásquez, 1998). A pesar de que muchas deestas especies son permanentemente utiliza -das en el ámbito local, ninguna ha sido some -tida a mejoramiento. Estas plantas poseenuna diversidad genética única y característicasde rusticidad como resistencia o tolerancia acondiciones adversas de clima, suelo, enfer -me dades y plagas. Los frutos son consumidoslocalmente como frutas, bebidas y en postres(Guzmán, 1999) y poseen un importante usopotencial que podría ser ampliado por la utili -zación de material élite o mejorado genética -mente.

El Centro de Investigaciones Fitoecogenéticasde Pairumani (CIFP), posee una colección depasifloras de fruto comestible pertenecientes alas especies: Passiflora mollissima, P.tarminiana (ambas tumbo) y P. ligularis(granadilla), además de muestras de las espe -cies silvestres: P. pinnatistipula, P.umbillicata, P. amethystina, P. naviculata, P.mandonii, P. morifolia, P. quadrangularis y P.caerulea.

Estas muestras se conservaron primeramenteen forma de semillas en el banco de germo -

plas ma del CIFP en una cámara a 0ºC y aque -llas que lograron aclimatarse a las condicionesde Pairumani, fueron también conservadas encampo. Debido a que algunas especies delgénero Passiflora muestran dificultad de ger -mi nación cuando son desecadas (Guzzo et al.,2003) y conservadas, se propuso la conserva -ción in vitro como alternativa para mantenerla colección de germoplasma.

Dada la amplia distribución geográfica de lasaccesiones y el poco conocimiento de la varia -bilidad genética en este grupo de plantas, estacolección ha sido evaluada mediante marca -dores moleculares RAPD e ISSR. Entre acce -siones de la misma especie se mostró bajo ni -vel de polimorfismo, sin embargo se encontróun alto nivel de polimorfismo entre especies.Estos resultados permitirán trazar estrategiasde conservación y utilización de estos recur -sos, así como planificar nuevas colectas(Guevara et al., 2007).

El cultivo de tejidos vegetales permite la con -servación de material en condiciones in vitrocomo una alternativa útil de conservación exsitu para aquellas especies de semillas recal -citrantes o intermedias y de reproducción ve -ge tativa. Se la puede utilizar como un sustitu -to y/o como complemento de la conservaciónen campo, ya que ofrece mayor seguridad yfácil acceso e intercambio del germoplasma(Withers, 1993). Algunas limitaciones que

Capítulo 15Cultivo in vitro de Pasifloras

Teresa Ávila, Sara de la Barra, Nidia Coca, Noemí Aguilar & Janett Céspedes

restringen el acceso a este tipo de metodolo -gías son el nivel tecnológico, el costo y la ne -ce si dad del desarrollo de protocolos particula -res para cada especie e incluso para varieda -des dentro de una misma especie (Van derHurk, 1999).

Como resultado de las investigaciones realiza -das en el CIFP se proponen los siguientes pro -tocolos para el establecimiento, multiplica -ción, conservación in vitro y crioconservaciónde passifloras.

15.2. ESTABLECIMIENTO IN VITRO

Las pasifloras son establecidas a partir deembrio nes (Figura 1). Las semillas son desin -fectadas de acuerdo a la siguiente metodolo -gía de trabajo (Ávila et al. 2004a; Avila et al.2004b; Avila et al. 2004d):

Remojar las semillas en el insecticida-acari -cida Vertimax (1ml/litro de agua) durante 15minutos, seguido de cinco enjuagues conagua destilada.

En la cámara de flujo laminar, sumergir lassemillas en hipoclorito de sodio al 1% durante15 minutos, luego proceder a enjuagarlascinco veces durante 3 minutos con aguadestilada esterilizada.

Luego de la desinfección, las semillas se re -mo jan en agua estéril por 24 horas y poste -rior mente se extrae el embrión y se lo colocaen el medio de cultivo.

El cultivo de embriones permite un mayorporcentaje de germinación (41%) comparadocon el 13% de las semillas, además de acor -tar el periodo necesario para la germinación,de más de cinco meses en la semilla a unasemana con los embriones. Se estudió tam -bién la escarificación de las semillas, con laque no se obtuvieron buenos resultados.

El medio de cultivo optimizado para el esta -ble cimiento in vitro de las pasifloras tiene lasiguiente composición (por litro): sales mine -

ra les Murashigue y Skoog (MS) diluidas a lamitad de la concentración, vitaminasGamborg, 5 g de carbón activo, 200 mg decaseí na hidrolizada, 1 mg de GA3, 20 g desaca rosa y 2 g de phytagel. Los medios decultivo que contienen sales minerales enterasno dan lugar a plantas germinadas, solamentelos me dios con sales diluidas a la mitad de lacon centración dan lugar a plantas germina -das, sin embargo el medio que contiene car -bón activo permite además el desarrollo de lasmismas.

Se observa también una influencia de la espe -cie en el establecimiento in vitro, los embrio -nes de tumbo (P. mollissima) germinan apartir de la primera semana, pero los embrio -nes de granadilla (P. ligularis) germinan apartir de la quinta semana de puestos encultivo.

Figura 1. Establecimiento in vitro de lacolección

15.3. MULTIPLICACIÓN IN VITRO–MICROPROPAGACIÓN

Se optimizaron medios para las diferentes es -pe cies (Avila et al. 2004a; Avila et al. 2004b;Avila et al. 2004c; Avila et al. 2004d), quepermitan obtener una adecuada brotación dela yema y desarrollo y enraizamiento de laplántula (Figura 1).

Los medios de cultivo tienen como base: salesminerales de MS, vitaminas de Gamborg, 20g de sacarosa, 200 mg de caseína hidrolizada

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y 7 g de agar. En el cuadro 1 se observan los otros componentes de los medios y en el cuadro 2se observan los medios optimizados para cada especie.

Cuadro 1. Composición de los medios de cultivo para micropropagación

Cuadro 2. Medios de cultivopor especie

La especie P. ligularis muestra problemasdurante la micropropagación, las plantaspresentan poco desarrollo, tienen pocasyemas y además pierden las hojas, estaspresentan una mejor respuesta con el mediode cultivo propuesto por Quoirin & Lepoivre(1977) más la adición de sulfato ferroso.

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15.4. ACLIMATACIÓN DE LASPLÁNTULAS

Las plantas son aclimatadas en laboratorio einvernadero para su posterior transplante alcampo. De acuerdo con las investigacionesrealizadas para probar diferentes metodolo -

gías con el fin de evitar que las plántulas sedeshidraten y se contaminen con hongos delambiente, se propone la siguiente metodolo -gía de aclimatación (CIFP, 2006; CIFP, 2007).

Uso de envases de plástico con tapa, tierraesterilizada en autoclave, riego con agua

Figura 1. Multiplicación de pasifloras

estéril y asperjado periódico con Benlate al0,1%. Los envases deben destaparse paraevitar el desarrollo de hongos, a partir delsegundo día y por periodos que vanincrementándose a partir de cinco minutos.

Las plantas son mantenidas por 15-30 díasen estas condiciones (Figuras 2 y 3) y luegodestapadas en condiciones de laboratorio porotros 7 días, para luego ser llevadas alinvernadero.

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15.5. CONSERVACIÓN IN VITRO

Se ha estudiado el efecto del sorbitol y elmanitol en distintas concentraciones, sobre elcrecimiento de los explantes y la viabilidad delos mismos, durante y luego del proceso deconservación por nueve meses (Avila et al2004c; CIFP 2007; CIFP 2008; Coca et al.,2005 y Coca et al., 2007).

El medio más adecuado para la conservaciónde las especies: P. mollissima, P. morifolia, P.pinnatistipula y P. tarminiana es el que con -tie ne por litro: sales minerales MS, vitaminas

Gamborg, 200 mg de caseína hidrolizada, 2 gde carbón activo, 20 g de sacarosa y entre 10a 20 g de sorbitol, de acuerdo a la especie. Seutiliza la misma concentración de reguladoresde crecimiento que para la multiplicación deacuerdo a cada especie. Este medio permiteretardar el crecimiento de las plantas, lascuales presentan entrenudos cortos y yemasnumerosas (Figura 4). Al final de los nuevemeses, las yemas son viables en un medio demultiplicación. El medio que contiene unacombinación de sorbitol y manitol no muestrabuenos resultados.

Figura 4. Conservación in vitro

Figuras 2 y 3. Aclimatación en laboratorio

15.6. CRIOCONSERVACIÓN

Se ha desarrollado protocolos de crioconser -vación de pasifloras a partir de semillas y deápices utilizando diferentes metodologías, conla finalidad de minimizar las manipulacionesque se realizan para la conservación in vitro.Los protocolos optimizados se presentan acontinuación (Aguilar et al. 2007a y Aguilaret al. 2007b):

15.6.1. Crioconservación de semillas

Se determinó que el contenido óptimo de hu -me dad de las semillas debe ser de alrededordel 5%, para que estas no sufran daños du -ran te su exposición al nitrógeno líquido. Lassemillas son deshidratadas utilizando silicagelen el interior de recipientes de plástico concierre hermético, para posteriormente serintroducidas, dentro de crioviales, al nitrógenolíquido.

Para el descongelamiento, los crioviales sedejan a temperatura ambiente por tres horas yluego las semillas se colocan en el interior deenvases de plástico con cierre hermético, conuna atmósfera saturada de vapor de aguadurante 24 horas. Posteriormente se sumer -gen en agua con 500 ppm de ácido giberélico(GA3) durante 48 horas para proseguir con elcultivo de embriones.

Las semillas que no son deshidratadas sufrendaños durante la exposición al nitrógeno líqui -do, en las especies P. mollissima y P. tarmi -niana no se obtienen embriones germinadosluego de la crioconservación cuando estos noson deshidratados. P. pinnatistipula presentaun contenido de humedad inicial más bajo, loque permite que algunos embriones de estaespecie germinen luego de la crioconserva -ción. Todas las plantas desarrolladas a partirde embriones obtenidos de las semillas crio -con servadas, muestran morfología y creci -mien to normal (Figura 5).

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Figura 5. Plantas desarrolladas a partir de semillas crioconservadas:A) P. mollissima, B) P. tarminiana, C) P. pinnatistipula

15.6.2. Crioconservación de ápices porvitrificación

La crioconservación de ápices se realiza utili -zan do plantas provenientes de micropropa -gación. Los ápices (1 a 1,5 mm) son pre-cultivados en un medio de multiplicaciónadicionado con 0,3 M de sacarosa.

Los ápices se introducen en el crioval conte -niendo un medio líquido adicionado con 2 Mde glicerol y 0,4 M de sacarosa, durante 20minutos. Los ápices son sumergidos en unmedio líquido conteniendo 24% v/v deglicerol, 13,5% v/v de etilenglicol, 13,6% dedimetilsulfóxido (DMSO) y 0,4 M de sacarosa,durante 150 minutos para posteriormente serintroducidos al nitrógeno líquido.

A B C

Después de la crioconservación, el desconge -la miento se realiza sumergiendo los criovialesen agua destilada estéril a 40º C por 2 – 3minutos y lavados en una solución con 1,2 Mde sacarosa. Los ápices son entoncescultivados en un medio que contiene: salesminerales MS 1/2, vitaminas Gamborg, 2 g decarbón activo, 200 mg de caseína hidrolizaday 1,5 mg de GA3 y 20 g de sacarosa. Losápices deben incubarse a 25º C, los primeros10 días en oscuridad y posteriormente a 600-700 lux, con un fotoperiodo de 16 horas luz.En estas condiciones, los ápices dan lugar aplantas normales (Figura 6).

15.7. CRIOCONSERVACIÓN DEÁPICES POR ENCAPSULACIÓN-DESECACIÓN

Se encapsulan los ápices en cuentas dealginato al 3% y éstos son desecados en elflujo laminar. Estos ápices luego de suexposición al nitrógeno líquido, no presentangerminación, sin embargo se mantienen vivosy mostrando color verde hasta 30 días decultivo (Figura 7).

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Figura 6. Ápices luego de ser crioconservados, a los 30 días de cultivo:A) P. mollissima B) P. tarminiana

Figura 7. Ápices encapsulados de P. mollissima después de 30 días de cultivo:A) Sin exposición al nitrógeno líquido B) Con exposición al nitrógeno líquido

A B

A B

15.8. BIBLIOGRAFÍA

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16.1. INTRODUCCIÓN

Physalis peruviana, conocida como chilto,uchuva, chilto chilto o capuli, es una especieoriunda de la región andina. Se encuentra enlas estri baciones occidentales de la cordillerade los Andes, desde Venezuela hasta Chile,inclu yendo el Perú, entre los 600 y 2.000msnm. Esta especie es muy importante porlos usos fito terapéuticos que tiene (diurético,antipiré tico, vermífugo y antiespasmódico).También es utilizada en la alimentacióndebido a que los frutos de esta especie sonconsumidos por el ser humano; se puedencomer directamente o en forma de dulce,también se elaboran mer meladas por lo quepresenta una intere san te oferta comercial. Lauchuva o chilto chil to puede ser una planta decobertura, prote giendo terrenos de la erosión,tiene un crecimiento vigoroso, extensiónrápida en el suelo y fuerte sistema radical.

En la región andina es un cultivo de consumointerno y de exportación principalmente enColombia, Ecuador y Perú. En Bolivia pese acompartir su centro de origen, crece espontá -neamente en los valles interandinos y meso -tér micos sin que se haya cultivado, su aprove -chamiento es mínimo, sin embargo al presen -tar características potencialmente favorables einteresantes, se hace necesario rescatar ypromocionar su uso.

El cultivo in vitro de tejidos aplicado al chiltoes una alternativa interesante para la conser -va ción y el intercambio de germoplasma; con -virtiéndose en una técnica para la conserva -ción de valiosos genotipos, y evitando así, lapérdida de material debido a peligros ambien -tales como plagas, enfermedades, factores cli -má ticos adversos, y a errores humanos. Portodas estas razones se vió por convenienteaprovechar las ventajas que ofrece el cultivode tejidos in vitro para su multiplicación ycon servación in vitro, como parte de un traba -jo de fin de estudios en la Especialidad deRecursos Fitogenéticos.

16.2. DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA YMORFOLÓGICA DE CHILTOPHYSALIS PERUVIANA

La uchuva o chilto pertenece a la familiaSola naceae, género Physalis. El géneroPhysalis incluye más de 100 especies herbá -ceas entre perennes y anuales (Flores et al.,2000). La más utilizada es la especiePhysalis peruviana Linneo por su fruto conalto contenido de azúcares. Otras especiescomo P. angulata y P. mínima son usualmenteutilizadas como comestibles en el sureste deAsia (Bernal & Correa, 1998).

La especie P. peruviana L., que fue descritapor Linneo de la América Tropical, se

Capítulo 16El cultivo in vitro en chilto(Physalis peruviana)

Katty Rojas, Gino Aguirre & Ximena Cadima

encuentra en los Andes, desde Colombiahasta Chile (Cárdenas, 1989), incluyendoobviamente Bolivia. Es una planta herbáceade un metro de alto (Figura 1a), muy velludaque prefiere los rastrojos y lugares más omenos sombreados. Sus hojas son alternas,muy pecioladas, peludas, ovadas, de baseobtusa o truncada, ápice acuminado; losbordes son enteros, crenados en parte; 2-7cm de largo, 1,5-5,5 cm de ancho (Romero &Castañeda, 1991).

Según Cárdenas, 1989, es una planta baja demenos de 1 m de talla, de hojas cordiformesy pubescentes (Figura 1b). Las flores midenalgo mas de 1 cm. de diámetro, amarillas conmanchas oscuras en la base de la corola ybayas lisas, esféricas amarillo verdosas de

más o menos 1 cm de diámetro (Cárdenas,1989). El peciolo alcanza hasta 2,5 cm delongitud. El cáliz es verde, velloso, venas mo -ra das salientes; la porción soldada tiene formacilíndrica y la libre es triangular (Figura 1c).

La corola está íntegramente soldada, amarilla,de cinco puntos morados en el fondo, glabrapor dentro, una línea de pelos por fuera yciciolados los bordes. Tiene anteras oblongas,polen amarillo, y su ovario empotrado en undisco (Popenoe et al., 1989).

El fruto es una baya carnosa, globosa u ovoidey posee una piel acre resinosa (Figura 1d),aproximadamente 2 cm de diámetro de oloragradable; pulpa jugosa, de buen sabor quecontiene numerosas semillas pequeñas, esta

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Figura 1. Planta de P. peruviana. a) frutos tiernos, b) hojas y flores, c) Flor, y d) fruto maduro

a b

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encerrado en el cáliz acrescente que tieneforma de vejiga y es globoso (Romero yCastañeda, 1991). Los frutos del chilto estánrodeados del cáliz muy desarrollado ymembranoso que los cubre por entero,quedando un espacio apreciable entre estos(Cárdenas, 1989). P. peruviana presentacomo fruto una especie de bolsa que haoriginado el nombre de “motojo bobo embol -sado” que se da a esa planta en Santa Cruz dela Sierra – Bolivia (Cárdenas, 1989).

16.3. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DEP. PERUVIANA

P. peruviana es una hierba ruderal común enclimas fríos (Pérez & Arbeláez, 1975). EnBoli via crece espontáneamente en los vallesmesotérmicos sin que se haya cultivado nun -ca (Cárdenas, 1989 citado por Bernal y Co -rrea, 1998). P. peruviana es una especie quecrece en los Yungas en la región de Coroico a1.700 msnm (Girault, 1987), también se hareportado su presencia en Cochabamba, enlos valles de Independencia y Morochata,conocida con el nombre de chilto chilto.

De Luca (2004) presenta nombres comunesconocidos en el territorio boliviano: Camama -bú, Motojobobo embolsado (Santa Cruz), Chil -to (La Paz); Iva vau (Yuqui), Shubsi (Yura -caré), Maigochi (Chácobo); Yahua jababa(Cavineño); Chajiki (Ignaciano); Muchii(Trinitario); Notimorr (Chiquitano).

16.4. USO E IMPORTANCIAECONÓMICA DE P. PERUVIANA

P. peruviana puede ser consumida cruda ymuy rara vez en la confección de dulces. Ex -cep cionalmente aparece en el mercado de fru -tas para la fiesta de Corpus Christi (Cárdenas,1989). El fruto se usa mucho para hacer dul -ce con almíbar, es rica en vitamina C. El valorde este cultivo radica en sus aptitudes medici -nales; purifica la sangre y elimina la albúminade los riñones. También se ha señalado que

reconstruye y fortifica el nervio óptico, es unamedicina eficaz en el tratamiento de las afec -ciones de la garganta. Es calcificador de pri -mer orden y pueden consumirlo los diabéticos.

Empleando frutos de P. peruviana y el coci -miento de las hojas como diurético y antias -má tico; es útil para la depresión nerviosa ypara curar la tuberculosis. Los frutos son co -mes tibles y de sabor agradable, contienen unaceite, por lo que son utilizados como vermí -fu go, y en forma de infusión son utilizadoscontra la tosferina de los niños (Bernal &Correa, 1998). El fruto de P. peruviana es unafuente excelente de pro vitamina A (3.000 U.I. de caroteno por 100 g.), vitamina C y ade -más contiene complejo B (tiamina, niacina yvitamina B 12). La proteína y los volúmenesde fósforos son excepcionalmente altos parauna fruta, pero los niveles del calcio son bajos(Popenoe et al., 1989).

La infusión de ocho frutos maduros y macha -cados de capulí en un frasco conteniendo 1litro de agua hirviente, detiene la diarrea,fortifica el estómago, expulsa gases, tonificalos ner vios y calma los latidos del corazón.Reduce la inflamación de la vejiga, hígado,testículos, alivia la inflamación de los riñonesy las vías urinarias, elimina el ácido úrico ycura el reumatismo (De Luca, 2004).

Es una planta que sirve como pionera paracampos recientemente creados y todavía sinvegetación y con robustez, habilidad de adap -tación y predestinada para áreas marginales.Es una planta que se puede sembrar en aso -cia ción con más cultivos que se adapten a suscondiciones de temperatura y latitudinales,como tubérculos, maíz, fréjol entre otros(Flores et al., 2000).

16.5. PROPAGACIÓN

16.5.1. Reproducción Sexual

El método más utilizado para propagar tradi -cio nalmente el capulí o chilto es por vía sexualo por semilla. Este tipo de propagación puede

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proporcionar plantas con mejor anclaje, másvigorosas, con raíces mas fuertes que resistenmejor las condiciones adversas del suelo perola heterogeneidad del material es muy amplia,tanto genotípica como fenotípicamente, lle -gan do esto último a alterar la producción y launiformidad deseada en frutos de exportación.Sin embargo, para que la propagación sexualpor semilla tenga éxito se deben tener encuenta las características de la planta madre,del fruto y de la semilla (Angulo, 1998).

La desinfección de la semilla se debe realizarcon fungicidas. Otra forma de desinfectar lasemilla es mediante su inmersión en agua a50° C por 25 minutos y luego pasarla por unasolución de sulfato de cobre al 1,5%. La semi -lla una vez desinfectada puede ser inmediata -mente sembrada o puede almacenarse refrige -ra da en un recipiente de vidrio sellado(Valderrama, 2002).

16.5.2. Reproducción asexual

La uchuva, se puede propagar asexualmentepor esquejes, in vitro o por injerto. Estos siste -mas de propagación vegetativa permiten obte -ner plantas (clones) de excelentes característi -cas en producción, resistencia y calidad defrutos; cuando provienen de plantas madresbien seleccionadas, y lo más importante esque se logra tener un material homogéneo enel cultivo (Flores et al., 2000).

a) Propagación in vitro. El cultivo de tejidoses una herramienta de gran utilidad en labiotecnología. Esta técnica se basa en la“totipotencia celular”; capacidad de unacélula vegetal de formar una planta com -ple ta bajo ciertas condiciones químicas yfísicas, dadas en el cultivo in vitro. Así seobtiene la propagación rápida y masiva deplantas idénticas a la original a partir detrozos de tejidos, ápices meristemáticos oincluso células aisladas. Inicialmente seusó esta técnica para la multiplicación ma -si va de plantas élites o micropropagación ytambién en la obtención de clones libres de

virus (Tapia, 2001). En el caso de P.peruviana, los brotes se desarrollan in vitrocon gran rapidez en condiciones adecua -das de temperatura e iluminación (Vera -mendi & Arregui, 2001).

16.6. CONSERVACIÓN IN VITRO DEGERMOPLASMA

La conservación in vitro a corto o medianoplazo necesariamente requiere de subcultivosperiódicos, actividad que generalmente difi -cul ta su conservación, aún cuando se handesarrollado métodos que permiten retardar elcrecimiento de los explantes y así prolongar eltiempo requerido entre los sucesivos subculti -vos (Lundergran & Janick, 1979; Oka y Niino,1997). La técnica más desarrollada para laconservación in vitro es la del cultivo de ápi -ces cuyos procesos se pueden sumar comosigue (Cadima, 1996):

a) Selección del material adecuado.

b) Aislamiento de individuos sanos.

c) Desarrollo de métodos de aislamiento delmeristema.

d) Optimización de las condiciones de cultivopara la regeneración de las plantas a partirde meristemas.

e) Almacenamiento de cultivares bajo condi -ciones de mínimo crecimiento (Inhibidoresde crecimiento, bajas temperaturas), ocriopreservación usando nitrógeno líquido

f) Recuperación del tejido viable de la fase deconservación.

g) Regeneración, crecimiento y propagaciónde las plantas.

Metodología

a) Almacigado de Semillas de P. peruviana

Con el propósito de obtener un materialhomogéneo listo para establecerlo in vitro,el protocolo sugiere almacigar las semillasde P. peruviana en un invernadero. Parainducir a una germinación en un menor

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tiempo se deben remojar las semillas enuna solución con 1,5 g/l de ácido giberé -lico, por 24 horas antes del almacigado. Aldía siguiente se colocan las semillas a unadistancia de 3x4 cm en el substrato, secubre la semilla con dos veces su tamaño,regando inicialmente el substrato conDhytane (2,5 g/ l). Finalmente el substratose cubre con paja y todo el conjunto con unplástico para evitar la pérdida de hume -dad. Siete a diez días después, se realizanlas primeras evaluaciones y conteo de lassemillas que llegaron a germinar y de esamanera se determina el porcentaje degerminación con la siguiente fórmula:

% de Germinación = (Nº de semillas ger -mi nadas/ Nº de semillas sembradas) x100.

b) Establecimiento in vitro

El establecimiento in vitro de P. peruvianase realiza a partir de plantas de las dife -rentes variedades que se pretende conser -var y que se encuentran ya sembradas eninvernadero. Se realiza inicialmente unadesinfección en alcohol al 70% (30 segun -dos), luego un lavado en agua destiladaesterilizada y posteriormente una inmer -sión en hipoclorito de sodio al 0,8% (3minutos) y tres enjuagues consecutivos enagua destilada estéril (cada uno de tresminutos). Luego se colocan los esquejes enun medio de cultivo de establecimiento. Elproceso se realiza en condiciones asépticasen una cámara de flujo laminar.

c) Multiplicación masiva

Una vez obtenidas las plántulas provenien -tes del establecimiento in vitro, se procedea una multiplicación clonal de las plántulaspor medio de esquejes, siendo colocadosen un medio de multiplicación (cuadro 1).Cada 10 días se mide en mm el tamaño delas plántulas y se cuenta el número deyemas con la finalidad de evaluar la tasade multiplicación.

Cuadro 1. Reactivos utilizados y condicionespara la preparación del medio de cultivo deestablecimiento y multiplicación para P.

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d) Conservación in vitro

• Ingreso a condiciones de Conservación

Los explantes en proceso de multipli -cación son transferidos a medios deconservación con presencia de agentesosmóticos (Manitol y/o Sorbitol),retardando su crecimiento, intensidadluminosa 1.000 a 1.500 lux y unfotoperiodo de 16h/8h (luz/oscuridad).

Cuadro 2. Medios de cultivo empleados para laconservación in vitro de P. peruviana.

(Laboratorio de Biotecnología FCAPFyV –UMSS, 2004)

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• Cámara de Crecimiento

Las plántulas sometidas a diferentesmedios de conservación (tratamientos)se mantienen bajo condiciones de luz ytemperatura controladas:

- Intensidad lumínica: 1.000 – 1.500lux.

- Temperatura: 20 a 24 ºC.

Se realizan revisiones periódicas tantode la cámara como del material en con -servación, considerando los siguientesfactores:

- Condiciones de temperatura.

- Iluminación.

- Estado del material en conservación(viabilidad de los explantes, senes -cen cia de las hojas, contaminación,presencia o ausencia de raíces).

- Medio nutritivo.

• Introducción a conservación

a) Evaluaciones de las variables de res -puesta. Una vez introducidos losexplantes de P. peruviana a condi -ciones in vitro, se realizan las eva -lua cio nes de las variables de res -pues ta cada mes. La toma de datosse realiza llenando la siguiente tabla:

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Cuadro 3. Parámetros de evaluación de P. peruviana bajo conservación in vitro

Se identifica el tubo de ensayo con losdiferentes medios de cultivo, registrando la

variedad y el número de muestras /variedad.

Figura 3. Parámetros de evaluación realizados en los tubos de ensayo

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16.7. MULTIPLICACIÓN IN VITRO

Debido a que la micropropagación es un pro -ce so que tiende hacia una progresión geomé -trica, dos factores inciden de manera determi -nan te en el volumen de producción: el factorde multiplicación y la velocidad de crecimien -to. La tasa de multiplicación promedio para P.peruviana en el medio de cultivo utilizado hasido de 1:4 en un período de 30 días.Salaues, 1998 indica que esta informaciónpermite determinar el volumen de producción,debido a que el factor de multiplicación es elnúmero base de una progresión; con un FM de5 en 5 generaciones se tendrán 3.125 des -cen dientes. Veramendi & Arregui (2001) afir -man que en P. peruviana, los brotes se desa -rro llan in vitro con gran rapidez en condicio -nes adecuadas de temperatura e iluminación.

Sobrevivencia de las plántulas

La sobrevivencia de las plántulas es una delas características más importantes en conser -vación in vitro donde se busca una técnicaque asegure un alto valor de supervivencia yotras características favorables en conserva -ción (Cadima, 1996), utilizando el cultivo invitro como un sistema de conservación de ger -moplasma se puede actuar sobre dos factores:las condiciones ambientales de la cámara decultivo y la composición del medio de cultivo(Veramendi & Arregui, 2001). Para la conser -va ción in vitro de tejidos vegetales se hanempleado diferentes factores, de los cuales elmás utilizado es la modificación del medio decultivo con distintos agentes osmóticos, comoel manitol, la adición de benzilaminopurina(cuya función está estrechamente relacionadacon el mantenimiento de la viabilidad durantela conservación) y el carbón activado que eli -mina o reduce a niveles muy bajos la oxida -ción fenólica (Roca et al.,1992), aspecto queincide negativamente en el proceso de con -servación. La modificación del medio de culti -vo y la reducción de la temperatura y/o la ilu -mi nación son los factores más importantes enel control del crecimiento.

En investigaciones realizadas por Rojas,(2005), en cuatro variedades de P. peruviana(V1 = uvilla, Colombia; V2 = Cereza, Colom -bia; V3 = Capulí, Cbba.-Bolivia y V4 = Capulí,La Paz-Bolivia), el porcentaje de sobrevivenciade las plántulas fue mayor al 60% durante unperiodo de 5 meses, al ser sometidas a dife -ren tes concentraciones de: MS (2,3 y 4,6 g/l),Manitol (20, 40 y 60g/l) y Sorbitol (20, 40 y60g/l). El tratamiento con 2,3 g/l MS+40 g/lManitol presentó el mayor porcentaje de so -bre vivencia de las plántulas (> al 80%) paralas cuatro variedades. Resultados similares seobtuvieron en el Banco de Germoplasma delLaboratorio de Recursos Genéticos y Biotec -no lo gía de la Universidad Mayor de San Mar -cos en Lima, Perú con un promedio del 67%de sobrevivencia a los 6 meses de conserva -das in vitro de algunas solanáceas (variedadesde papa), con un medio de cultivo que conte -nía 40g/l de Manitol, 30g/l de sucrosa; de lamisma manera Villarroel et al., (1999) deter -minaron para la conservación in vitro de raí -ces y tubérculos Andinos el uso de medioscon teniendo la mitad de MS (2,3 g/l) con laadición de Manitol (40 g/l), en el caso de lapa pa y, sorbitol (40 g/l) en el caso de tubércu -los menores y yacón, actualmente son los me -dios de conservación in vitro que se utilizanen el banco Nacional de Tubérculos y Raícesandinas que custodia PROINPA.

En relación a la presencia de raíces, las altasconcentraciones de inhibidores de crecimiento(60 g/l de manitol o de sorbitol), independien -te mente de la concentración de sales MS,inhiben en cierto grado el desarrollo radicular.Se puede afirmar que a mayor concentracióndel inhibidor existe una menor presencia deraíces, resultados corroborados por Tapia(2001) y el IPGRI (2004), quienes mencio -nan que el Manitol y el Sorbitol son sustanciasque tienen poder inhibidor en los brotes regu -lando su desarrollo y retrasan el crecimientode las plantas a nivel apical y radicular,pudiendo ser utilizados con buenos resultadosen protoco los de Conservación in vitro deRecursos Fitogenéticos.

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El uso combinado de MS y de los inhibidoresde crecimiento (Manitol o Sorbitol) proporcio -nan condiciones más adecuadas para la con -ser vación que su aplicación en forma indivi -dual, influyendo en los porcentajes de sobrevi -vencia de las plántulas y en la presencia deraíces.

En relación a la altura de planta, número dehojas y número de nudos, Rojas (2005) ob -ser va que a mayor concentración de inhibi -dores de crecimiento hay menor altura deplanta, número de nudos y número de hojas;al respecto Cadima (1996) indica que la adi -ción de retardante de crecimiento al medio decultivo reduce notablemente el desarrollo dela plántula y Espinoza et al. (1992) mencio -nan que los reguladores de crecimiento de ti -po hormonal influyen en la tasa de crecimien -to de los cultivos, actúan antagónicos al ácidogiberélico y por ende, reducen la elongación ymultiplicación celular. Siendo indiferente laconcentración de MS, lo recomendable es uti -li zar la concentración mas baja (2,3 g/l MS),para reducir costos, Villarroel et al. (1999)han determinado el uso de medios adecuadospara la Conservación in vitro de algunasespecies, conteniendo de 2,3 g/l MS (tanto demacronutrientes como de micronutrientes)con la adición de Manitol (40 g/l), en el casode solanáceas y Sorbitol (40 g/l) en el caso detubérculos menores y yacón.

Otros agentes no metabolizables como el Ma -ni tol y el Sorbitol, son prácticamente no asimi -lables por las plantas; estas sustancias redu -cen el crecimiento más que el desarrollo (en -tre nudos cortos, pero en cuanto al número denudos entre plantas bajo estrés osmótico yplan tas sin estrés, no hay diferencia significa -tiva) y posiblemente sean mas efectivos que lasucrosa en la limitación de crecimiento de loscultivos. Cadima (1996) indica que es impor -tante considerar que en un proceso de conser -va ción, lo que nos interesa es la presencia deentrenudos cortos, con abundantes nudos, de -bi do a que en los nudos se hallan las yemasque darán lugar a nuevas plantas, lo cual esfundamental para el siguiente paso de la con -

ser vación que es la regeneración de nuevasplantas.

Según Barceló et al. (1992), la presencia fo -liar es un aspecto importante a ser considera -do en la conservación in vitro debido a que supresencia incrementa los mecanismos biosin -té ticos tales como la velocidad de fotosíntesisy los contenidos de almidón, proteínas y ácidoribonucleico, también aumentan los niveles dediversos radicales libres y de las reaccionesque estos originan.

Existe un efecto varietal debido a que cadavarie dad se comporta de manera diferente alser sometidas al mismo tiempo a diferentescon centraciones de MS y Manitol, esto escorroborado por Tapia (2001) quien dice quelas dificultades en este tipo de estudio sepresentan bajo condiciones de conservaciónen la cual los genotipos reaccionan de diferen -te forma. Cuando una gran colección de ger -mo plasma debe ser mantenida in vitro, elobje ti vo de los estudios debe desarrollarse enfunción a los medios de conservación quesean aplicables a un gran rango de genotipos.Otras características comunes son el uso deretardadores de crecimiento como ácido absí -ci co, manitol o sorbitol (Veramendi & Arregui,2001).

16.8. BIBLIOGRAFÍA

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17.1. INTRODUCCIÓN

Los bosques sudamericanos de Polylepis seencuentran considerados como los ecosiste -mas boscosos más amenazados (Renison etal., 2004). La kewiña se utiliza como com -bus tible y en construcciones de la región pu -ne ña. En varias zonas sufre acelerados proce -sos de erosión, por deslizamiento de taludesanexos a carreteras y caminos rurales, espe -cial mente relacionados con la actividad mine -ra. Especie vulnerable, clasificada en estacategoría bajo el nombre de Polylepis besseriHieron en la lista de especies amenazadas dela flora de Bolivia (Meneses et al., 2005).

Así, ésta es una especie estratégica de LosAndes por sus usos. Presenta problemas demultiplicación vía semilla y erosión genética.Si bien se han hecho grandes avances en laestrategia de aprovechamiento sostenible ycon servación de los recursos forestales, aúnresta mucho que hacer, especialmente en loque concierne a la aplicación de las biotec -nologías. El objetivo del capítulo es mostrar eldesarrollo de protocolos de micropropagacióna partir de árboles seleccionados de Kewiña(Polylepis besseri Hieron).

17.2. INFORMACIÓN GENERAL YDESCRIPCIÓN DE KEWIÑA

17.2.1 Descripción taxonómica

IOPI (2007) realiza la siguiente descripcióntaxonómica de la kewiña:

Clase: Magnoliopsida.

Orden: Rosales.

Familia: Rosaceae.

Nombre científico: Polylepis besseriHieron.

Nombre vernacular: Kewiña (Bolivia),Queñual (Perú), Queñua (Bolivia, Perú),

Capítulo 17La aplicación del cultivo de tejidos enespecies forestales andinas Kewiña

(Polylepis besseri Hieron)

Cecilia Ugarte Ballón1

Fig. 1. Kewiña, Parque Nacional Tunari.

1 Laboratorio de Biotecnología Forestal “Aliso” BASFOR/ESFOR.

Qiwuña (Bolivia, Perú), Lampaya (Bolivia),Yagual (Colombia, Ecuador), Tabaquillo(Argentina).

Sinónimos: Polylepis besseri var.abbreviata Bitter, Polylepis besseri subsp.longipedicellata Bitter, Polylepis cristagalliBitter, Polylepis cristagalli var. longirace -mosa Bitter, Polylepis incana subsp.brachypoda Bitter, Polylepis incana subsp.incarum Bitter, Polylepis incana subsp.subtusalbida Bitter, Polylepis pallidistig -ma Bitter, Polylepis racemosa var. lanataKuntze, Polylepis racemosa var. tomentosaKuntze, Polylepis rugulosa Bitter, Polylepissubquinquefolia Bitter, Polylepis tenuirugaBitter, Polylepis triacontandra Bitter.

17.2.2. Descripción morfológica

a) Forma de crecimiento

Borter (1994) indica que Polylepis besseriHieron es de lento crecimiento. Los árbolesson tolerantes al viento, a bajas tempera -turas, radiación solar elevada y a la sequíamoderada. Prospera en algunos de los másduros ambientes tropicales. En función delos factores ambientales, la especie puedevariar de arbustos y árboles de pequeñorango de altura de 3 a 10 m, con un pro -me dio de 7 m comúnmente bajo, con unacorona de 4 m de diámetro, P. besseri tam -bién crece de una forma más erecta, la for -ma ahuecada con un sólo tronco alcanzan -do un máximo diámetro altura pecho, DAPde 45 cm. Esta especie posee una cortezacastaña con abundante ritidoma que seexfo lia continuamente (Hensen, 1995).Co mo una importante fuente primaria de lamateria orgánica, P. besseri es importanteen la formación y protección de los suelosen zonas climáticas de escasa vegetación(Borter, 1994).

La kewiña normalmente crece en altitudesentre los 3.000 a 4.000 msnm en laszonas con precipitaciones que van de 300a 1.200 mm (Borter 1994). Estos árboles

crecen en las elevaciones más altas quecualquier otro árbol en el mundo; sobrevi -ven en alturas como 5.200 msnm en lasladeras del Nevado Sajama, en Potosí,Bolivia. Como un árbol siempre verde tienebaja tolerancia al fuego, P. besseri esaltamente susceptible a las presiones de laexpansión de la agricultura y el consumode leña (Killeen et al., 1993).

b) Distribución geográfica de la especie

La distribución del género está restringidaa los corredores andinos de América delSur desde el norte de Venezuela, al sur conel norte de Argentina y Chile. (Fjeldsa &Krabbe 1990). En Bolivia esta especie estádistribuida en los departamentos de LaPaz, Cochabamba, Oruro, Chuquisaca yTarija (Simpson, 1993).

c) Importancia y usos de la Kewiña

Alternativamente, la paleobotánica y laevidencia histórica sugiere que los bosquesde Polylepis besseri eran mucho másamplios, y que la quema, el pastoreo yotras presiones antrópicas han reducido engran medida su área durante los últimos3.000 años, en particular durante los últi -mos varios cientos de años (Fjeldsa &Kessler 1996, Fjeldsa & Krabbe 1990).Debido a su posición única como árbolesde crecimiento en la zona más alta de losAndes, P. besseri es un género sumamenteimportante, tanto ecológicamente como enla calidad (Ledesma, 1994, Ridgley &Tudor 1989). P. besseri proporciona unarara fuente de gran altura, como hábitatforestal, donde varias especies de avifaunase basan en exclusiva (Fjeldsa & Krabbe,1990, Ridgley & Tudor, 1989). Los usostradicionales son: carbón, madera deconstrucción, herramientas, arados, le ña,utensilios de cocina, conservación, me jo rade suelo y protección contra heladas yviento, ruedas de los molinos hidráulicos,silvicultura urbana, medicinal (resfríos),instru mentos musicales y tintes para lasprendas de vestir (Patterson, 1998).

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d) Formas de propagación de la especie

Las semillas tienen una baja tasa degerminación (2 a 15%), no satisfactoriacon tratamientos pregerminativos conoci -dos. Debido a que la tasa de germinacióndisminuye rápidamente en el almacena -mien to, la producción a partir de semillaestá limitada a que sólo se pueda lograr através del almacigo en sustratos de arena ycon alto contenido de materia orgánica,inmediatamente después de su recolec -ción. (Patterson, 1998). Naturalmenteplántulas germinadas pueden ser extraídasy transportadas en pequeñas bolsas deplástico rociadas con agua a una almaci -gue ra cercana, en la que puedan ser tras -plan tadas a las bolsas para su futuro desa -rrollo (Fossati, 1996).

17.3. MICROPROPAGACIÓN

17.3.1 Recolección de material vegetal

El material vegetal es recolectado de árbolesseleccionados, de lugares con sombra (menosoxidación), brotes tiernos, brotes apicales orebrotes.

17.3.2. Desinfección y establecimiento

Para la fase de desinfección se aplica formolal 37% durante 20 minutos.

a) Establecimiento -Fase I

Se utiliza el medio de base enriquecidocon sales minerales de Q&L (Quoirin yLepoi vre, 1977), 0,4 mg/l de AG3, 0,5mg/l de TDZ, vitaminas de Walkey(1972), sacaro sa 2,5% + 1% de carbónactivo, agar 0,7% y ajustado a un pH de5,5. Bajo este procedimiento, se hanobtenido hasta un 80% de explantes libresde contaminación.

17.3.3. Multiplicación y enraizamiento

a) Multiplicación -Fase II

El medio base debe ser enriquecido con0,4 mg/l de AG3 en ausencia de carbónactivo, lográndose un coeficiente demultiplicación de 1/7.

b) Enraizamiento -Fase III

Se utiliza el medio 664 (Druart, 1987),presentando un 80% de los explantesenraizados.

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Fig. 2. Árbol seleccionado.

Fig. 3. Rama recolectada.

Fig. 4. Establecimiento de segmentos nodales.

Fig. 5. Multiplicación de explantes.

c) Aclimatación - Fase IV

Los plantines producidos requieren necesa -ria mente una etapa de pre aclimatación envermiculita, por un lapso de 15 días.

Esta etapa se realiza primeramente en vi -ve ro, para luego ser transferidos a bolsasen pleno aire luego de 45 días, presentan -do una sobrevivencia del 70%, a los tresmeses.

17.4. BIBLIOGRAFÍA

Borter P. 1994. Silvicultura, usos y problemas de 17especies Forestales de importancia ecológica ysocioecónomica en los valles interandinos deCochabamba. Programa de repoblamientoforestal. Cochabamba, Bolivia: CORDECO- IC -COTESU.

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Fig. 6. Enraizamiento de explantes.

Fig. 7. Pre aclimatación de plantines.

Fig. 8. Aclimatación de plantines.

18.1. INTRODUCCIÓN

Casi todas las especies endémicas en Bolivia,adyacentes a los caminos comprendidos entrelos Yungas de Cochabamba y La Paz, presen -tan la destrucción de su hábitat (Vásquez &Ibish, 2000); haciendo que especies nativasse encuentren en riesgo de extinción en zonasgeográficas con mucha presión antrópicadebido a procesos de colonización. En estasituación se encuentran muchas especies deorquídeas nativas y endémicas de la zona delChapare de Cochabamba.

Algunos investigadores sostienen que la com -po sición genética es esencial para la conser -va ción (Loeschcke et al., 1994); debido a quepuede faltar diversidad genética para reprodu -cirse o sobrevivir, existiendo de esta manerapérdida potencial de poblaciones o especies(Demauro, 1993).

Knudson (1922; citado por Menacho, 2004),demostró que las semillas de orquídeas erancapaces de germinar asimbióticamente invitro. Por lo tanto la multiplicación de orquí -deas por protocormos (in vitro) permite incre -mentar el número de individuos y mantener lavariabilidad genética en cada especie median -te el repoblamiento de las regiones donde sonnativas. De esta manera se disminuye la pre -sión indiscriminada a dichas especies, promo -viendo la conservación y uso sostenible de lasmismas.

En este sentido, el presente capítulo muestrael rol del cultivo de tejidos en la multiplicaciónin vitro de orquídeas, como una alternativapa ra evitar una mayor pérdida de estasespecies en sus zonas de origen. Además, lasorquídeas tienen un alto valor ornamental; sumultiplicación in vitro y posterior comerciali -za ción podría significar una actividad econó -mica sostenible para los pobladores de estaszonas altamente influenciadas por el ecoturis -mo, siendo a la vez una actividad comprome -tida con la conservación del medio ambiente.

18.2. ORQUÍDEAS ENDÉMICAS DEBOLIVIA

Actualmente se registran alrededor de 1.350especies de orquídeas en Bolivia de las cuales400 son especies endémicas, siendo la mayo -ría epifitas. Se encuentran en mayor propor -ción especies endémicas de Lepanthes, Pleu -ro thallis y Masdevallia (Menacho, 2004).

El porcentaje más alto de especies endémicasde orquídeas se registra entre 2.500 y 3.000msnm (Vásquez & Ibisch, 2000). Parece lógi -co que el endemismo aumente con la alturaporque los valles disectados promueven lafragmentación y separación geográfica depoblaciones (Ibisch et al., 1996).

Los Yungas de Bolivia es una región biogeo -gráficamente distinta que tiene su propia

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Capítulo 18Multiplicación in vitro de

orquídeas nativas bolivianas

Claudio Vázquez, Gino Aguirre, Cecilia Ugarte, Juan Villarroel & Jazmín Yamashiro

historia evolutiva mostrando patrones dediver sidad y endemismo únicos a nivel mun -dial (Vasquez & Ibisch, 2000), entre las espe -cies de orquídeas endémicas de esta zonaencontramos a Góngora ileniana.

El género Góngora se encuentra actualmenteconstituido por más de 60 especies. Es unode los géneros de orquídeas cuyos miembrosno son fáciles de distinguir. Se trata de plantasepífitas con inflorescencias colgantes, con flo -res de tamaño medio; espectacular o por lome nos extraño es el tamaño del labelo, y suestructura es muy compleja (Gerlach &Heider, 2001).

Los mismos autores mencionan que en lospaíses donde existen plantas del géneroGóngora, la taxonomía carece de investigaciónprofunda. En Bolivia existen por lo menos

cuatro especies, tres de éstas pertenecen a lasección Góngora, con pétalos arqueados, lasflores tienen cuernos y representan la especiemás grande de Bolivia. La cuarta secciónTruncata, se distingue por los pétalos rectos,la base del labelo en forma de bolsa y laausencia de cuernos en la misma.

La Góngora ileniana es una planta epifita, conpseudobulbos agregados ovoideos, longitudi -nal mente surcados, de 8,5 cm de largo y 6cm de ancho, el ápice bifoliado, cuando jóve -nes revestidos con dos vainas escariosas, eva -nes centes. Sus hojas son elíptico lanceoladas,agudas hasta cortamente acuminadas, haciala base atenuadas y pecioladas, lámina con 7nervios pronunciados, unos 45 cm de largo y16 cm de ancho (Gerlach & Heider, 2001).Ver Figura 1.

Especie endémica de Bolivia. Recientementedescubierta, encontrándose una sola plantade esta especie el año 1999 por H. Heider,cerca de Cristal Mayu, a 26,5 km de VillaTunari (Chapare, Cochabamba), quedando suhábitat destruido por la mano humana en tansólo un año (Gerlach & Heider, 2001). Laecología de la especie es en el subdosel deselva primaria húmeda. Sus polinizadores deG. ileniana pertenecen al Género Eufrisea sp.(Heider & Reichl, 2001).

18.3. ORQUÍDEAS NATIVAS DEBOLIVIA

En Bolivia, de acuerdo a Vásquez (1995), ladistribución de la mayoría de las orquídeas seencuentra en la zona de los bosquesmontañosos húmedos y parte de la Ceja deMonte con neblina.

Vásquez & Ibisch (2000), mencionan que lamayoría de las especies conocidas se hanregistrado en el Departamento de La Paz,seguido por Cochabamba y Santa Cruz.Siendo las laderas Nor-orientales de los Andeslas que albergan la mayoría de las especies,

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Fuente: G. Gerlach & H. Heider (2000)

Fuente: Vázquez (2006).

Figura 1. Góngora ileniana, flor y planta adulta

creciendo en los Yungas superiores einferiores, y en los bosques de neblina de laCeja de Monte.

18.3.1. Epidendrum ssp.

Del griego epi, sobre y dendrom, árbol; enalusión al hábito de la mayoría de las especiesde vivir sobre los árboles (Cavero et al.,1991).

Epidendrum (Figura 2), es uno de los mayoresgéneros dentro de las Orchidaceae, con 800especies distribuidas por todo el continenteamericano (Dressler, 1993). Encontrándoseen Centro y Sud América (Cavero et al.,1991). En el Perú se reportan 263 especies(Cavero et al., 1991), existiendo pocainformación en Bolivia.

La mayoría son epífitas, sin embargo, algunasson litófitas o terrestres. Generalmentepresentan un tallo en forma de caña quepuede llegar a medir hasta 2 m. de longitud.La inflorescencia es un racimo terminal, conun número variable de flores según la especie.Muy escasos individuos originan suinflorescencia lateralmente. Las flores son decolor, tamaño y aroma muy variados (Caveroet al., 1991).

Figura 2. Epidendrum ssp., flor y planta adulta.

18.3.2. Huntleya meleagris

El género Huntleya incluye 10 especies(Dressler, 1993). Puede ser fácilmentediferenciada de las demás especies deOrchidaceae por la presencia de inflorescenciauníflora y hojas flabeladas dísticas.

Huntleya meleagris (Lindl), es una plantaepifita de 50 cm de altura. Tallo entumecidoen pseudobulbo. Hojas flabeladas, dísticas,vaina foliar 3-9,5 x 2,5 cm; la hoja destiñeligeramente, 25-37 x 1,5-4,2 cm,oblanceolada, con nervaduras longitudinalessalientes, sésil sobre la vaina, ápice agudo(Menini et al., 2004). Ver Figura 3.

Figura 3. Huntleya meleagris, flor.

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Fuente: PlantSystematics.org

Fuente: Vázquez (2006).

Fuente: Peixoto (2000).

18.4. LAS ORQUÍDEAS EN BOLIVIA.IMPORTANCIA YCONSERVACIÓN

18.4.1. Importancia biológica

Bolivia está entre los diez países con mayordiversidad biológica en el mundo debido a laexistencia de una variedad de ecosistemas(Decreto Supremo 25458, 1999 y Collantes,1995).

Se considera que por lo menos 18.000 a20.000 especies de plantas son nativas deBolivia. La familia con mayor riqueza deespecies es la Orquidaceae. Actualmente másde 1.300 especies pertenecientes a 186 gé -ne ros han sido clasificadas, sin embargo,considerados los porcentajes actuales de des -cu brimiento de los bosques Andinos y próxi -mos a los Andes se espera, que el número deorquídeas en Bolivia pueda exceder a las2.000 (Boletín de la FAN & la SBB, 1998).

18.4.2. Importancia de la conservación degermoplasma

Los procesos de colonización que sedesarrollan desde hace varios años en la zonadel Chapare, han provocado la transformaciónde los ecosistemas, para usos agrícolas,pecuarios, industriales y asentamientosurbanos y rurales. Los usos actuales, causanperturbaciones en ecosistemas, por ser unazona de altos índices de endemismos ydiversidad.

La gran diversidad y endemismo se da enorquídeas, pteridófitos, araceas y bromelias yse consideran como las más diversas a nivelmundial (Kessler; et al. 2001). Las semillasde las orquídeas son pequeñísimas, encon -trán dose millones de semillas en sus cápsu -las, siendo extremadamente especializadasporque han evolucionado para ser fecundadaspor insectos específicos, y necesitan de unhongo llamado micorriza para su germinaciónsimbiótica (Vásquez & Ibisch, 2000). La

investigación desarrollada por Knudson(1922; citado por Menacho, 2004), demostróque dichas semillas eran capaces de germinarasimbióticamente in vitro, incrementandoenormemente las posibilidades de aumentarsu población.

El cultivo de tejidos vegetales permite laconservación de material en condiciones invitro como una alternativa útil deconservación ex situ. Se la puede utilizarcomo un sustituto y/o como complemento dela conservación en campo, ya que ofrecemayor seguridad, fácil acceso y movimientodel germoplasma (Van Der Hurk, 1999).

Aceves (2000) realizó trabajos de conserva -ción in vitro en Tuxtlas-México cuyo resultadofundamental fue la disminución de la presiónsocial sobre el medio y los recursos naturales,a través de la generación alternativa deempleos e ingresos. Se establecieron empre -sas sociales de mujeres, orientadas a la pro -duc ción y comercialización de plantasornamentales de importancia económica yecológica.

En la Fundación Ceiba para la ConservaciónTropical en la Reserva Orquideológica “ElPahuma”, al noroccidente de Quito-Ecuadorse reproducen especies raras y únicas deorquídeas para incrementar su número tantoen el medio natural de la reserva como ensitios fuera de ella (como jardines botánicos yotros programas de conservación), cultivansemillas de especies únicas u ornamentalespara la exportación en frascos. Todas lasganancias provenientes de la venta deespecies de orquídeas, son reinvertidas en lareserva y en otros proyectos de conservación(McKendrik, 2000).

En Latinoamérica, los estudios muestranavances en trabajos de investigaciónbiotecnológica con especies de orquídeasendémicas y/o en peligro de extinción yplantas nativas con valor comercial,realizando programas de conservación ymanejo sostenible de dichas especies.

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Entre las experiencias nacionales sobre laconservación de especies nativas deorquídeas, la Fundación Amigos de laNaturaleza (FAN) realiza la conservación encolecciones vivas, bancos de semillas y cultivode tejidos enfocados a contar con losprotocolos establecidos para la propagaciónde especies nativas o amenazadas además deespecies con alto potencial ornamental parasu comercialización. De la misma manera elLaboratorio de Biotecnología de la Facultad deCiencias Agrícolas Pecuarias y Forestales,perteneciente a la Universidad Mayor de SanSimón, realiza investigaciones para establecerprotocolos in vitro de especies nativas yendémicas.

18.5. PROCEDIMIENTO PARA ELESTABLECIMIENTO YMULTIPLICACIÓN IN VITRO DEORQUÍDEAS (Góngora ileniana,Epidendrum ssp. y Huntleyameleagris) MEDIANTEPROTOCORMOS

El material vegetal utilizado en estaexperiencia fueron semillas provenientes decápsulas maduras y verdes de las especies deorquídeas arriba mencionadas bajo elsiguiente procedimiento:

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18.5.1. Zona de recolección del materialvegetal

La zona de colecta estuvo ubicada entre los17°00’ de latitud sur y 64°20’ de longitudoeste y 17°50’ de latitud sur y 64°80’ delongitud oeste, corresponde a la ProvinciaBiogeográfica del Acre-Madre de Dios(Navarro & Ferreira, 2000), Sector Amazónicodel Pie de Monte Andino, Distrito Biogeográ -fico Amazónico del Chapare (Navarro, 2002).

Presenta un bioclima pluvial, termotropicalinferior húmedo, hasta hiperhúmedo (Navarro& Ferreira, 2000), con temperaturas mediasanuales de 24,2° C y temperaturas mínimas ymáximas del mes más frío de 15 y 25° Crespectivamente, cuya amplitud térmica anualno es mayor a los 5° C, con una precipitaciónmedia de 3.180 mm (Bruckner et al., 2000).La estación lluviosa comprende de diciembrea marzo, y la época seca de junio aseptiembre.

A B

Fuente: Aguirre (2006) Fuente: Vázquez (2006)

18.5.2. Método de secado yalmacenamiento

En el laboratorio de Biotecnología de laFacultad de Agronomía, se procedió alalmacenamiento del material colectado. Las

cápsulas verdes fueron guardadas en papelfiltro (dos semanas), teniendo el cuidado deno almacenarlas en fundas plásticas debido alos procesos de transpiración y pudrición,ubicándolas en un lugar fresco con bastanteaireación (refrigerador). Ver Figura 4.

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Figura 4. (A) Cápsula verde. (B) Cápsula verde deshidratada de H. meleagris.

Las semillas de cápsulas maduras se dejaronsecar a temperatura ambiente en unahabitación. Una vez que las semillasestuvieron secas, se las almacenó en frascos

cerrados dentro del refrigerador (4-5 °C),evitando la transpiración y por ende lapudrición de las semillas (Figura 5).

Figura 5. (A) Cápsula madura vista interna Epidendrum ssp. (B)Semillas en frasco de vidrio

AB

Fuente: Vázquez (2006) Fuente: Aguirre (2006)

18.5.3. Fases para la multiplicación in vitrode orquídeas

a) Fase I: Desinfección y establecimiento

• Preparación de medios de cultivo. Lapreparación de medios de cultivo fue enbase a las sales de Murashige & Skoog (MS1962), adicionando compuestos orgánicos(Tiamina 0,4 mg/l y Acido nicotínico 0,5mg/l) y utilizando como solidificante el agar

a 6 g/l. Concluida la preparación de losmedios de cultivo, se los esterilizó enautoclave a 121o C de temperatura y 15p.s.i. (1,1 kg/cm2) de presión durante 20minutos.

• Desinfección de semillas provenientes decápsulas maduras. Se elaboraron peque -ños sobres de papel filtro, colocándose alinterior de ellos pequeñas cantidades desemillas, para luego doblar y sellar los

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Figura 6. (A) Semillas colocadas a sobres de papel filtro.(B) Semillas engrapadas dentro del papel filtro

Figura 7. (A) Sobres de semillas en proceso de desinfección con Hipoclorito de Sodio.(B) Semillas desinfectadas listas para su siembra.

sobres con grapas. Se sumergieron en aguadestilada por 5 minutos, luego, fuerontrasladados a un recipiente con solucióndesinfectante (Hipoclorito de sodio al 1 y al5%, más una gota de detergente). Los

sobres se mantuvieron durante 5 y 10minutos en ambas concentraciones, agi -tán dose continuamente. Ver Figuras 6, 7 y8.

Figura 8. (A) Apertura de los sobres antes de la siembra.(B) Siembra en frascos con medios de cultivo.

Fuente: Aguirre (2006)

AFuente: Aguirre (2006)

B



B



B

• Desinfección de semillas provenientes decápsulas verdes. Con la ayuda del bisturí,se removió cuidadosamente la flor muertade la cápsula; se la cepilló y jabonó, para

introducirla por 10 minutos en unasolución de hipoclorito de sodio al 1%(enjuagándose con agua destilada por lomenos tres veces). Ver Figura 9.

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En la cámara de flujo laminar, la cápsula fuesumergida en alcohol al 96% y se pasórápidamente por el fuego. La cápsula fuetransferida a una caja petri, cortándoselalongitudinalmente. Las semillas se

esparcieron sobre el medio de cultivopreparado para esta fase y contenido enfrascos de vidrio. Por último los frascos fueronsellados. Ver Figura 10.

Figura 10. (A) Corte longitudinal de la cápsula.(B) Semillas esparcidas en el medio nutritivo.

Figura 9. (A) Limpieza de la cápsula con cepillo e inmersión en hipoclorito de sodio al 1 %.(B) Enjuague de la cápsula en agua destilada.

(C) Inmersión en alcohol al 95 %, y flameado al mechero.

b) Fase II. Germinación de semillas. Duranteel desarrollo de la germinación in vitro, seevaluó: la contaminación, número de se -ma nas a la presencia de protocormos, ynúmero de semanas a la presencia deplántulas.

• Contaminación en la germinación desemillas. El porcentaje de semillascontaminadas de cápsulas maduras dela especie H. meleagris. fue mayor84,87%, en comparación a G. ileniana.36,47% y Epidendrum ssp. 32,11%



BFuente: Aguirre (2006)

C



B

(Pr<0,0001) y (Pr<0,0001) respecti -vamente. Esto puede deberse al tamañode semilla, donde H. meleagris poseeun tamaño de semilla extremadamentepequeño haciéndolo quizás bastantesusceptible a la contaminación.

• Número de semanas en formarprotocormos. Durante las primerassemanas no se observaron cambios enlas semillas, hasta que empezaron ahincharse, y adquirieron un coloramarillo intenso, que cambió de verdeclaro a verde oscuro, formándose losprotocormos. Al respecto Arditti (1967)y Pierik (l982) describen que elembrión absorbe agua a través de latesta aumentando de volumen, inician -do la división celular y rompiendo lacubierta seminal para formar elprotocormo.

El número de semanas que tardaron enllegar las tres especies a un estado deprotocormo, fue una media de ochosemanas en Medios Completos MS(Espinosa y Aguirre, 2002), obtuvieronprotocormos de Rhychostele a las 12semanas en KC, mientras que Serna(1999) tuvo en un promedio de 13semanas protocormos de la especiesCattleya ssp. (Híbrido) y Cymbidium ssp.(Híbridas) en medio MS, observándose queestas especies requieren concentracionesde sales completas para su mejordesarrollo.

• Número de semanas en formarplántulas. Luego de formarse elprotocormo se diferencian los órganos(el meristemo del vástago y en ladoopuesto los rizoides), comenzando unperíodo de crecimiento intenso (Arditti,1967 y Pierik, l982) por variassemanas o meses, dependiendo de laespecie, hasta producir raíces y hojas(McKendrich, 2000).

Figura 11. (A) Protocormo con hojas iniciales.(B) Primeras hojas y rizoides.

(C) Hojas verdaderas y primeras raíces. (D)Plántula con hojas y raíces.

Experiencias similares de Serna (1999), enCattleya ssp. y Cymbidium ssp. indican quedesarrollan hojas y raíces iniciales desde lasiembra, a la sexta semana en MS completo(con 0,5 mg de glicina, piridoxina, tiamina, A.nicotínico; 100 mg de m-inositol; 2 mg deBAP y ANA). Mauro et al. (1994) indica quelas plántulas in vitro de híbridos son vigorosasy precoces (Figura 11).

c) Fase III. Trasplante de plántulas. Lassemillas luego de germinar y formar losprotocormos, empiezan a formar plántulas,las cuales al estar en una densidad muyalta dentro los frascos, requieren ser cam -biadas a nuevos frascos para disminuir laden sidad y proveerles de los nutrientesrequeridos para un mejor desarrollo (Figura12).

• Tamaño de plántulas. Tanto la especieG. ileniana como Epidendrum ssp.,generaron gran cantidad de plántulaspor frasco, en cambio H. meleagrispresentó muy poca cantidad, siendotrasplantadas las tres especies a nuevosmedios nutritivos. Rivera (1998), hacereferencia que la permanencia de lasplantas por más tiempo del indicado en

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A B C D

Fuente: Vázquez (2006)

• Preaclimatación. Una vez que lasplántulas alcanzan 3 a 5 cm, y lasraíces muestran un buen desarrollo yson trasladadas a invernadero paracolocarlas dentro de un microtunel. Sinabrir las tapas de los frascos quecontienen las microplántulas se lesquita el parafilm, dejándolas por unasemana en el microtunel.

Concluido este periodo, los frascos sedestapan y se extraen las plantas.Posteriormente se quita el agar de las raíces

con agua y finalmente, se procede altransplante en los sustratos correspondientes.

Las plantas son evaluadas en el mismoambiente durante tres a cuatro meses. Seadiciona fertilizante foliar, insecticidas yfungicidas para prevenir problemasnutricionales, fitosanitarios y de plagas.

• Aclimatación. Luego del tiempotranscurrido las plántulas están aptaspara ser trasladadas a envases másgrandes, para su mayor desarrolloradicular y foliar en invernadero.

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el medio de cultivo, puede generarplántulas débiles y elongadas.

d) Fase IV. Aclimatación de plántulas.

• Preparación de sustratos. En esta fasese emplearon dos sustratos de prueba(Cuadro 1). Los pedazos de turba

mineralizada fueron aproximadamentede 4 mm de diámetro, y los pedazos decarbón vegetal de 1-1,5 cm, que semezclaron con tierra vegetal en lasproporciones indicadas en el cuadro 1.Del mismo modo se mezcló el helechoarbóreo (Dicksonia sellowiana) concarbón y tierra vegetal.

Figura 12. (A) Plántulas listas para ser trasplantadas.(B) Plántulas transplantadas en menor densidad.

Cuadro 1. Mezcla de sustratos y proporciones


AFuente: Vázquez (2006)

B

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Figura 12. (A) Vitro plántulas preaclimatadas. (B) Vitro plántula aclimatada.

Es importante mencionar que el sustrato conturba mineralizada es una opción a laextracción indiscriminada del helecho arbó -reo. Siendo Dicksonia sellowiana (helechoarbóreo) el componente del sustrato másrecomendado por Silva (1986), y Mckendrik(2000), mencionando que es lo suficiente -men te poroso, ideal para que sus raíces esténen contacto con el aire y los extremosterminales que presentan una coloraciónverde (velamen) puedan realizar fotosíntesis.

Por otro lado, el no esterilizar el sustratoproporciona el mayor porcentaje de plántulasaclimatadas en comparación al sustratoesterilizado (Pr<0.0001). Al respecto Caneva(1984) menciona que las especies sonepifitas, y en su ambiente natural éstas sedesarrollan sobre otras plantas sin serparásitas, produciendo su propio alimento dela microflora y fauna existente (viviendo ensimbiosis con hongos del género micorriza).

Figura 24. (A) Epidendrum spp. a las 4 semanas de preaclimatación.(B) Epidendrum spp. a los 21 meses de establecimiento en invernadero.



B



B

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• Devolución a sus zonas de origen. Laexperiencia realizada contempló tantoel uso de técnicas de laboratorio paragarantizar la multiplicación de plantascomo la devolución de las plantasobtenidas en laboratorio a sus zonas deorigen, con la finalidad de podergenerar una estrategia sostenible deproducción de plantas, la misma que sepretendió realizarla de manera conjuntacon los comunarios.

La experiencia inicial mostró alternativas parapoder lograr esta producción sostenible, sinembargo, a la hora actual, requiere aún undecidido compromiso de parte de loscomunarios para poder ser parte de unprograma conjunto de protección de estariqueza ornamental dentro de característicasque garanticen sus sostenibilidad.

18.6. CONCLUSIONES YPERSPECTIVAS

El trabajo realizado en laboratorio permitióobtener plántulas in vitro por protocormos deorquídeas, siendo el mejor medio de cultivopara Epidendrum spp. y Góngora ileniana elMS completo con Tiamina (0,4 mg/l) y Ácidonicotínico (0,5 mg/l). En Huntleya meleagris,

el mejor medio de cultivo fue el mismo mediodiluido al 50%. El mejor sustrato deaclimatación de Epidendrum ssp. y G.ileniana fue la mezcla de carbón vegetal,tierra negra y Dicksonia sellowiana sinesterilizar.

La estrategia de trabajo pretendió concebirotras opciones de aprovechamiento de labiodiversidad, promoviendo el desarrollo delas comunidades con un uso sostenible de susrecursos naturales; en ese sentido, lasplántulas in vitro obtenidas, una vezaclimatadas, fueron entregadas a loscomunarios de “El Palmar”. Esta experienciarequiere aún un acompañamiento al procesocon la finalidad de incidir en la propiacomunidad sobre la importancia de unaconservación a largo plazo de esta riquezagenética a través de estrategias quegaranticen el uso sostenible de las orquídeas.

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Figura 25. (A) Góngora ileniana a las 4 semanas de preaclimatación. (B) G. ileniana a los 4 meses deaclimatación. (C) G. ileniana a los 21 meses de establecimiento en invernadero.



BFuente: Vázquez (2006)

C

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19.1 INTRODUCCIÓN

La investigación es importante para eldescubrimiento, el aprendizaje y el desarrollode prácticas nuevas y eficientes. Aunque esverdad que algunos avances científicos hanresultado de una manera casual y afortunada,la mayoría de los descubrimientos se hacenutilizando un enfoque experimentalsistemático, en el cual se definen tratamientosque son evaluados en condicionescontroladas. Durante estos experimentos, setoman datos, y estos se evalúan utilizandoalgún tipo de análisis estadístico para evaluarla efectividad de cada tratamiento y resolver ocorregir el problema de estudio.

Este capítulo pretende ser una introducción alos elementos básicos de la investigación encultivo de tejidos vegetales in vitro. Másespecíficamente, pretende demostrar el usode varios diseños experimentales y métodosestadísticos utilizados para analizar einterpretar datos, así como hacer algunasconsideraciones para presentar resultadosmediante tablas y gráficos. El objetivoprincipal de este capítulo es mostrar losmétodos estadísticos más apropiados paraanalizar resultados de investigaciones encultivo in vitro de tejidos vegetales eincrementar su confiabilidad.

En general, el capítulo asume que el lectorposee conocimientos básicos de Estadística yDiseños Experimentales, por lo que no sedefinen explícitamente muchos conceptosbásicos.

19.2. PRÁCTICAS ASOCIADAS A LAINVESTIGACIÓN CIENTÍFICA

19.2.1.Establecimiento de la hipótesis y delos objetivos experimentales

La investigación comienza revisando lo que sesabe acerca del problema. Se deben leerlibros y artículos de investigación publicados yesta información se debe combinar con elconocimiento que se tiene de experienciasprevias. Se utiliza esta base para formular unahipótesis y objetivos experimentales quepuedan ser evaluados objetivamente.

La hipótesis más utilizada en investigación invitro es la “hipótesis nula”. Esta hipótesisindica que todos los tratamientos provocaránuna respuesta similar en todos los tejidosvegetales sometidos a dichos tratamientos. Elrechazo de la hipótesis nula a través deanálisis estadístico implica que los tejidosexperimentales reaccionaron de formadiferente a los tratamientos utilizados. Losprocedimientos estadísticos para probar

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Capítulo 19Elementos prácticos de estadística y

diseño experimental para investigación encultivo in vitro de tejidos vegetales

Sergio Daniel Moreira Ascarrunz Ph.D.

hipótesis de investigación se discutirán másadelante en el capítulo.

19.2.2 Selección del diseño experimental

Una vez que la hipótesis y los objetivosexperimentales se hayan definido, se puedenseleccionar los principales componentes delexperimento. Éstos incluyen la selección detratamientos y materiales de apoyo requeridospara el experimento. Los materiales de apoyoson elementos necesarios para el experimentopero que no son tratamientos experimentales.En estudios de cultivo de tejidos vegetalesestos materiales pueden ser recipientes decultivo, componentes del medio, tipo yconcentración de reguladores de crecimiento,estado de solidificación del medio, ambientede crecimiento (fotoperiodo e intensidad deluz), o cualquier otro elemento importantepara el crecimiento del explante. Losmateriales de apoyo no deben interferir conlos efectos de los tratamientos sobre lostejidos vegetales. El conocimiento deexperimentos previos, exitosos o no, proveeinformación útil para seleccionar tratamientosy materiales de apoyo.

19.2.2.1 Tratamientos, factores y niveles

Los tratamientos son condiciones claramentedefinidas, cuyos efectos pueden ser medidos ycomparados experimentalmente en condicio -nes controladas (Cox & Reid, 2000;Montgomery, 2001). Ejemplos de tratamien -tos utilizados en investigación in vitro incluyenrecipientes de cultivo (tubos, magentas,frascos, etc.) y sus contenidos (formulacionesde sales del medio de cultivo, tipo oconcentración de reguladores de crecimientovegetal, etc.), condiciones ambientales fueradel recipiente de cultivo (temperatura, fuentede luz, calidad, intensidad, fotoperiodo, etc.),o factores inherentes al explante (genotipo,tamaño o edad del explante, edad o etapa demaduración de la planta madre, pre-acondicionamiento, etc.). Se puede elegir

probar un factor de tratamiento a la vez oprobar varios factores simultáneamente (porejemplo, genotipo y concentración dereguladores de crecimiento). Este último casoes bastante popular en estudios in vitro puesmuchos factores suelen interactuar unos conotros. Adicionalmente, se puede ahorrartiempo y materiales al conducir unexperimento en lugar de dos (Compton,1994). Sin embargo es importante darsecuenta de que los experimentos en los que seprueban dos o más factores a la vez suelentornarse muy voluminosos y difíciles demanejar, requiriendo mucho más esfuerzo porparte del investigador. Adicionalmente, esimportante que los tratamientos y los nivelesde los tratamientos sean escogidos de acuerdoa los objetivos experimentales e incluyan unamplio rango de respuestas. Esto esimportante para que el nivel óptimo pueda serfácilmente identificado.

Una vez que los tratamientos y los materialesde apoyo hayan sido seleccionados se puedenelegir unidades experimentales, unidadesobservacionales y el diseño experimental.

19.2.2.2 Unidades Experimentales y unidadesobservacionales

Por definición, una unidad experimental (UE)es la unidad más pequeña que recibe unmismo y único tratamiento (Cox & Reid,2000). En la mayoría de los experimentos decultivo de tejidos la UE es el recipiente decultivo. La unidad observacional (UO) es elobjeto que está siendo observado o medido(Compton, 2011). Los explantes son la UOmás común en estudios de cultivo de tejidosporque la mayor parte de los investigadoresestán interesados en descubrir tratamientosque optimicen su desarrollo y desempeño. Sinembargo, un explante puede ser consideradoa la vez una UE y una UO en casos en los queexista un solo explante por recipiente de culti -vo (Compton & Mize, 1999). El número deUEs requeridas por tratamiento se determinauna vez que la UE y las UO son elegidas.

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La replicación o repetición ocurre cuando másde una UE es evaluada para cada tratamientoy es necesaria para estimar los efectos de lostratamientos y el error experimental(Compton, 2011; Montgomery, 2001). Elnúmero de repeticiones o réplicas portratamiento se basa en el grado devariabilidad esperado y en la medida en la queel investigador desea detectar los efectos delos tratamientos (Compton, 2011). Lamayoría de los investigadores se basan en laexperiencia previa y en revisión de literaturapara determinar el número de réplicas autilizarse ya que réplicas insuficientes puedenreducir la capacidad de los procedimientosestadísticos para detectar diferencias entretratamientos. También se puede utilizar lasiguiente ecuación (Lyman Ott & Longnecker,2001) para determinar el número derepeticiones del experimento que se estáplanificando:

Donde r es el número de repeticiones a sercalculado; Za/2 es el valor de la distribuciónestándar para el nivel de confianza deseado(si el nivel de confianza deseado es de 95%,el valor de z será 1.96); s es un estimador dela variabilidad, usualmente obtenido deexperiencias anteriores o experimentos piloto(valor mayor-valor menor/4); y E es el nivel deprecisión deseado y decidido por el investi -gador (se expresa en unidades de la variablede respuesta). En general, se puede afirmarque por lo menos se requieren tres réplicaspor tratamiento para poder calcular medias ymedir el error.

19.2.2.3. Diseños experimentales

Las unidades observacionales se asignanaleatoriamente para replicar las UEs y sonluego transferidas a las condiciones experi -mentales utilizando un diseño experimentalespecífico. Un diseño experimental es un

método utilizado para asignar aleatoriamenteUEs replicadas de manera tal que se limite elsesgo del experimentador y los efectos defactores que no son tratamientos sobre lasUOs. Los diseños experimentales máscomúnmente usados en investigación in vitroson el diseño completamente aleatorizado, eldiseño de bloques completos aleatorizados, eldiseño de bloques incompletos aleatorizados yel diseño de parcelas divididas (Compton,2011). Al elegir un diseño experimental esimportante examinar los materiales de apoyoy la población de interés para identificarposibles variaciones y escoger así un diseñoque sea simple de emplear, eficiente paramedir los efectos de los tratamientos y losresiduales y que se ajuste a los objetivosexperimentales (Compton & Mize, 1999).

Diseño Completamente Aleatorizado (DCA)

El diseño completamente aleatorizado (DCA)es el más comúnmente utilizado en investi -gación in vitro porque es fácil de usar y tieneun esquema de aleatorización sin un patróndeterminado. Esto permite a los investigado -res maximizar el número de réplicas y utilizarya sea el mismo o diferente número deréplicas (Compton, 2011). Esto es importanteporque números diferentes de réplicas ocurrenusualmente en estudios de cultivo de tejidosvegetales debido a contaminación o muerte delos explantes. Estadísticamente, este diseñoes el más eficiente porque permite a losinvestigadores maximizar los grados delibertad (gl) del error, lo que es importantepara detectar diferencias entre tratamientosdurante el análisis estadístico (Compton,2011; Compton & Mize, 1999). Sin embargo,este diseño tiene algunos problemas. Unadesventaja del DCA es que las UEs deben serhomogéneas para que el análisis de datos seaefectivo. Las situaciones en las que las UEs olas UOs sean altamente heterogéneasincrementan la variabilidad en el experimentoy disminuyen las posibilidades de que lasdiferencias entre tratamientos seandetectadas durante el análisis estadístico(Compton & Mize, 1999; Compton, 2011).

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Diseño de Bloques Completos Aleatorizados(DBCA)

Las desigualdades o inconsistencias en losfactores ambientales en la sala de crecimien -to, diferencias entre plantas madres u hojas apartir de las cuales se obtuvieron explantes ovariabilidad entre el personal técnico sonfactores que no son tratamientos pero queintroducen variabilidad al experimento. Losdiseños experimentales que ubican a las UEsreplicadas en unidades similares (bloques) seutilizan cuando hay un gran grado devariabilidad entre UEs. Cuando se utilizanbloques, solamente los factores que sonmedibles pueden ser objeto de “bloqueo”(Compton, 2011). Por otro lado, es imposibletener la absoluta seguridad de si se va arequerir o no “bloqueo” cuando se está dise -ñando un experimento. Se puede determinarla necesidad de “bloqueo” conduciendo unpequeño experimento preliminar y hacerpruebas para el “bloqueo” en el análisisestadístico. Lo más realista es medir laeficiencia del “bloqueo” en relación al DCA(ER) después de haber realizado el experi -mento. Esta medición se hace con la siguienteecuación Lyman Ott & Longnecker, 2001):

Donde ER es la eficiencia relativa del bloqueo,b es el número de bloques utilizados en elexperimento, t es el número de tratamientosutilizados, CMB es el valor del cuadradomedio del factor bloque en el ANVA y CME esel valor del cuadrado medio del error en elANVA. Si el valor de ER resulta mucho mayora 1, indica que el bloqueo fue eficiente y quemuchas más repeticiones hubieran sidonecesarias si se utilizaba simplemente el DCA.Por el contrario, si el valor de ER es muycercano a 1, indica que el bloqueo no fueeficiente y que se redujeron gl del error sinningún beneficio, lo que restaría sensibilidadal ANVA.

El diseño de bloques completos aleatorizados(DBCA) agrupa las réplicas de cadatratamiento en bloques. Esto crea un altogrado de uniformidad entre tratamientosdentro de un bloque y reduce la variación nodebida a tratamientos. Es importante quetodos los explantes en un bloque sean tanuniformes como sea posible para que eldiseño sea efectivo. Explantes de la mismahoja o de la misma planta madre usualmentetienen similar habilidad de regeneración, ycada hoja puede constituirse en un bloque(Compton, 2011). Usar el DBCA en este casomaximizaría la uniformidad dentro de losbloques al utilizar la uniformidad presente encada hoja.

Diseño de Bloques IncompletosAleatorizados (DBIA)

Existen situaciones en las que existe muypoco material inicial para producir el númerode explantes necesarios para establecerbloques completos y que cada bloquecontenga una réplica de cada tratamiento. Enestos casos, el diseño de bloques incompletosaleatorizados (DBIA) puede ser la mejoropción (Compton & Mize, 1999). Como en elcaso del DBCA este diseño utiliza el “bloqueo”para mantener la homogeneidad pero en estecaso no todos los tratamientos estánpresentes en cada bloque. El número debloques, de réplicas, y el número de vecesque cada par de tratamientos aparecen juntosen un mismo bloque se determina con lassiguientes ecuaciones (Compton, 1994; Cox &Reid, 2000):

Donde k es el número de tratamientos en cadabloque, b es el número de bloques, t es elnúmero total de tratamientos, r es el númerode veces que se repite cada tratamiento y � esel número de veces que cualquier par detratamientos aparecen en el mismo bloque.

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Aunque el DBIA es un excelente diseño paraestudios in vitro, usualmente se prefiere elDBCA si es que existe una cantidad adecuadade material vegetal para formar bloquescompletos (Mize, et al., 1999).

Diseño de Parcelas Divididas (DPD)

Otro diseño que utiliza el “bloqueo” es eldiseño de parcelas divididas (DPD). Estediseño es más utilizado cuando se examinansimultáneamente dos factores de tratamientocon diferentes grados de variación (Lyman Ott& Longnecker, 2001; Montgomery, 2001). ElDPD utiliza dos niveles separados dealeatorización para cada factor. El factor detratamiento con el grado de variabilidad másgrande se asigna a las parcelas grandes,llamadas parcelas principales, y el factor detratamiento con menos variación es asignadoa las sub parcelas. Las parcelas principalespueden ser completamente aleatorizadas odispuestas en bloques. Comúnmente, lashojas más jóvenes completamente expandidasson las más competentes para la organogé -nesis de brotes. Esta circunstancia hace quemuchas veces los investigadores tengan queutilizar hojas de varias plantas madresdiferentes para obtener suficiente material deexplantes para los experimentos. Esto usual -mente introduce variabilidad adicional en elexperimento (Compton, 2011). Pese a que elDPD es el diseño experimental más eficientecuando se examinan dos factores de trata -miento con diferentes grados de influenciasobre la respuesta de los explantes, suestableci miento, la toma de datos, así como elanálisis de datos y la interpretación son máscomplicados que para los otros diseños.

19.3. SUBMUESTREO

Muchos investigadores encuentran que esbeneficioso cultivar múltiples explantes en unmismo recipiente de cultivo. Esto economizarecursos y tiempo pero conduce a unasituación en la que múltiples mediciones sehacen para cada réplica (recipiente de

cultivo). Estadísticamente, esto se conocecomo sub muestreo o “medidas repetidas”(Compton & Mize, 1999). El sub muestreo noes un diseño experimental sino unamodificación que puede ser utilizada concualquiera de los diseños discutidospreviamente. El sub muestreo se puedeutilizar con cualquiera de los diseños descritospreviamente. Cultivar múltiples explantes enun mismo recipiente de cultivo no soloeconomiza recursos y espacio sino quetambién maximiza el número de UOs yminimiza la variación asociada con losexplantes al hacer múltiples medidas porrecipiente (Compton, 2011). Una desventajadel sub muestreo es que el análisis estadísticoes ligeramente más complicado encomparación a cuando no se utiliza (Compton& Mize, 1999).

19.4. REPETIBILIDAD

Cualquier experimento debe ser realizado másde una vez para confirmar la validez de losresultados. Sin embargo, los investigadoresusualmente se preguntan cuántas veces sedebe repetir un experimento. La mayoría delos estadísticos y de los investigadorespiensan que un experimento se debe conducirpor lo menos dos veces para validar losresultados (Compton, 2011). El número deveces que un experimento será conducidodebe decidirse durante la planificación y antesde la primera vez que se conduzca elexperimento. Repetir un experimento nogarantiza un resultado similar ni aun si seutilizaran las mismas plantas madre.Adicionalmente, el tiempo puede serintroducido como un factor que no estratamiento si han ocurrido cambios en lafisiología de la planta madre al incrementar suedad o al entrar a otra fase de crecimiento.Ambos casos pueden ocasionar diferencias enlos resultados experimentales entre diferentesrepeticiones o “corridas” del experimento. Losinvestigadores tienen generalmente dosopciones cuando se obtienen diferencias entredos corridas: Se puede repetir todo el

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experimento desde un inicio (todas lascorridas), lo que puede ser costoso; o sepuede examinar cada corrida como un bloqueo una parcela principal. La mejor opción seríaobservar primero los datos de las dos corridasy determinar si existen tendencias similares.Si las tendencias son similares no deberíarepetirse el experimento, pero las circuns -tancias que causaron las diferencias deberíanser examinadas y explicadas. Si los resultadosobtenidos de las dos corridas son contrastan -tes, el experimento debería repetirse. Sipersistieran las diferencias entre corridasdebería examinarse la posibilidad de efectosestacionales sobre los resultados. La decisiónde qué hacer si se observan diferencias entrecorridas del experimento debe hacersedurante la fase de planificación del mismo.

19.4.1. Selección de datos y planificacióndel análisis estadístico

Los datos obtenidos deberían ayudar a evaluarlos efectos de los tratamientos de acuerdo alos objetivos experimentales. Si se tomandatos inapropiados es poco probable que elinvestigador pueda evaluar la respuesta delexplante y cumplir los objetivosexperimentales. Por lo tanto, es importantediscutir durante la fase de planificación concolegas y estadísticos qué observacionesdeberían tomarse.

La mayoría de los investigadores examinandetenidamente la literatura relevante ycombinan la información obtenida conexperiencias previas para determinar quéobservaciones tomar durante losexperimentos. El número y porcentaje deexplantes que producen brotes, el número debrotes por explante (o explantes en unamisma caja Petri) y longitud de los brotes sonobservaciones que la mayoría de losinvestigadores tomarían para evaluar lacompetencia de los explantes. Sin embargo,para obtener la mayor cantidad deinformación del proyecto el investigadorpuede decidir tomar observaciones

adicionales tales como el número y porcentajede explantes que han producido callos, lacantidad de callo producida por explante(medida por peso o por volumen) y el nivel deploidía de los regenerantes así comoobservaciones histológicas periódicas de losexplantes durante el experimento paraestablecer el modo de regeneración de brotes(directa o indirecta).

Las observaciones hechas durante elexperimento se anotan en hojas de datos parafacilitar el procesamiento de los datos. Estaactividad puede conducir a errores si estashojas no están bien organizadas. Diseñar lashojas de datos de la forma en la que lasobservaciones se introducirán a unacomputadora ayuda a evitar errores durante latranscripción de los datos. Muchos softwaresestadísticos organizan e imprimen hojas dedatos para ser usadas por los investigadores(Compton, 2006) (Ver Anexo). Las hojas dedatos deberían diseñarse durante laplanificación para asegurarse de que elinvestigador está considerando observacionesque efectivamente midan el efecto de lostratamientos.

La naturaleza de los datos influye en el tipo deprocedimiento estadístico que se deberáutilizar. La mayoría de las observacioneshechas en experimentos de cultivo de tejidosvegetales resultan en datos que puedenclasificarse como continuos (longitud debrotes, longitud de raíz o tamaño de embrión),datos de conteo (número de brotes, embrioneso protocormos por explante o callo); datosbinomiales (porcentaje de respuesta o de norespuesta), o datos multinomiales (categoríastales como brote, raíz, callo o sin respuesta)(Mize, et al., 1999). Por consiguiente, losmétodos estadísticos utilizados para evaluarlos efectos de los tratamientos varían paracada tipo de dato (Compton, 2006).Esquematizar las fuentes de variación y losgrados de libertad durante la planificaciónpuede ayudar a identificar los procedimientosmás apropiados para el tipo de dato obtenido

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y los objetivos experimentales. La mayoría delos investigadores usan el Análisis de Varianza(ANVA) para evaluar los datos. El ANVA esadecuado para analizar datos continuos perono para analizar datos de conteo, binomialeso multinomiales sin una manipulación previa.

19.4.2. Conducción del experimento

La experimentación puede comenzar una vezque se ha terminado y revisadocuidadosamente la planificación. El sesgopersonal se debe evitar en todas las fases delexperimento. Al establecer un experimento elsesgo se puede evitar utilizando la estructuradel diseño experimental (Mize, et al., 1999).No se deben cortar todos los explantes de unmismo tratamiento a la vez. Se debendisponer los recipientes de cultivo de acuerdoal esquema de aleatorización seleccionado ycolocar los explantes en el recipiente deacuerdo al diseño.

También es importante evitar cualquiercircunstancia que introduzca error en elexperimento. Muchos errores ocurren cuandoel investigador se cansa. El tiempo requeridopara cada fase del experimento se debeestimar durante la planificación. Los trabajosexigentes se deben escalonar para evitarcansancio. Lo errores también ocurren cuandose transfieren los explantes a medio fresco. Sedeben ordenar cuidadosamente los recipientesde cultivo (tanto los nuevos como los que seestán usando) en la cámara de flujo laminarde tal manera que se reduzcan lasoportunidades para cometer errores. Se debeser cuidadoso al etiquetar cada recipiente conla información correcta. Si se utilizan códigos,el detalle de los códigos se debe anotar en elcuaderno de laboratorio. Siempre se debe serconsciente de que hay muchas maneras deintroducir errores debido al operador duranteel experimento. Se deben tomar lasprecauciones necesarias para asegurar unaexperimentación segura, con precisión yexactitud.

19.4.3. Toma de datos

Al igual que al establecer un experimento, sedebe utilizar la estructura del experimento alrealizar observaciones y tomar datos. Porejemplo, se deben tomar los datos de lasréplicas en un bloque antes de pasar alsiguiente bloque. Esto ayuda a evitar el sesgo.Se debe ser meticuloso al tomar datos ytomarse el tiempo necesario para estaactividad. Un procedimiento de toma de datospoco cuidadoso introduce inconsistencias yerrores a los datos. Es recomendable tenerdescansos durante la toma de datos paraevitar el cansancio y los errores que seintroducen a causa de este. Muchasobservaciones son agotadoras para la vistapor lo que es muy importante descansarperiódicamente durante la toma de datos.

Las hojas de datos completadas deben serrevisadas para encontrar errores. Entradaserróneas de datos conducen a una incorrectaevaluación de los tratamientos y a unainterpretación incorrecta (Mize, et al., 1999).Es necesario asegurarse de que los datos decada tratamiento caigan dentro de límitesesperados. Los datos fuera de estos límites sedenominan “valores atípicos” y puedendeberse a errores en la lectura, toma otranscripción de los datos, o pueden servalores obtenidos de tejidos vegetales conproblemas inherentes o mutaciones genéticas.Estos valores atípicos pueden descartarse. Sinembargo, se debe actuar con mucho cuidadoal eliminar datos ya que esto puede introducirinintencionadamente un sesgo, lo que puedeafectar el resultado del experimento, ademásde comprometer éticamente el estudio. Sepueden utilizar varios procedimientosestadísticos para detectar valores atípicos yson de utilidad para reducir el sesgo aleditarlos (Lyman Ott & Longnecker, 2001).Los códigos de los tratamientos se debenexaminar mientras se revisan los datos y no sedebe asumir que estos códigos fueronintroducidos correctamente. Los erroresasociados con la entrada de códigos se

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pueden examinar calculando la media de lasvariables codificadas. La edición de los datosse puede facilitar imprimiendo las hojas dedatos y revisándolas cuidadosamente. Este esun trabajo laborioso y que demanda muchotiempo pero vale la pena el esfuerzo.

El almacenamiento de datos previo al análisisestadístico merece una mención aparte. Lomás recomendable para almacenar los datosobtenidos es construir una base de datos.Para esto se debe utilizar programas desoftware específicamente diseñados para estefin (conocidos como sistemas de manejo debases de datos o SMBD). El más conocido esMicrosoft Access, que no es de acceso libre,pero cuenta con opciones de acceso libre talescomo Open Office Base (www.openoffice.org)) y Libre Office Base (www.libreoffice.org).Estos sistemas son básicamente sistemasrelacionales, que relacionan tablas entre sí.Estos sistemas permiten recolectar, almace -nar, ordenar y exportar datos, además demuchas otras funciones. Es recomendableutilizar estas herramientas, y no las máscomúnmente usadas (como Microsoft Excel)debido a que permiten manejar fácilmentegrandes cantidades de datos; permiten filtrar,ordenar y actualizar datos con facilidad;ayudan a reducir los errores e inconsistenciasal ingresar los datos y hacen más eficiente eluso del tiempo. La base de datos tambiéndebe ser planificada en base al tipo de datosy a los objetivos experimentales, tratandosiempre de incluir en la base de datos lamayor cantidad de datos posible.

19.5. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓNDE DATOS

Los datos se deben analizar estadísticamentee interpretar tal como se planificó. Como semencionó antes, la naturaleza de los datosinfluye en los resultados y en la interpretacióndel análisis estadístico. Los investigadoresdeben elegir el procedimiento de análisis másadecuado para las observaciones tomadas ypara los objetivos experimentales. Al analizar

los datos, se conduce primero un análisisgeneral para determinar si existen diferenciasentre los niveles de los tratamientos.Posteriormente se realiza un análisis de lasmedias de los tratamientos si se detectandiferencias en el análisis general (Compton,1994; Mize, et al., 1999; Compton, 2011).

19.5.1. Análisis de datos continuos

Los datos continuos se distribuyen normal -mente y los tratamientos tienen varianzassimilares (Mize, et al., 1999). Por esto, elANVA es adecuado para analizar este tipo dedatos. Durante el ANVA, el valor de cadaobservación se sustrae de la media general.Las diferencias entre estos valores sonconsideradas errores aleatorios (residuales) yse utilizan para el análisis (Mize, et al.,1999). Se crea un mode lo que identifica lasvariables dependientes (observacionesregistradas) y las variables independientes(tratamientos, interacciones entre trata -mientos) basado en el diseño experimentalutilizado. La influencia de las variablesindependientes sobre las variables depen -dientes se prueba de acuerdo al modelo. En elANVA se genera una tabla resumen quemuestra los resultados del modelo probado(Lyman Ott & Longnecker, 2001; Mason, etal., 2003). Esta tabla incluye las fuentes devariación, los grados de libertad (gl), lassumas de cuadrados (SC) el cuadrado mediodel error (CME), el estadístico F (F) y lasestimaciones de la probabilidad (p) de que unresultado similar se obtenga la siguiente vezque se conduzca el experimento bajocondiciones similares (Compton, 2011).

Los valores de p iguales o menores a 0.05 seconsideran significativos. Este nivel ha sidoescogido por la mayoría de los investigadoresporque el 0.05 indica que se obtendría unvalor similar el 95% de las veces que elexperimento sea repetido, lo que se traduceen un alto nivel de confianza para el resultado.Otra razón para seleccionar el 0.05 es que lamayoría de las revistas científicas exigen que

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los investigadores hagan sus pruebas a estenivel de significancia.

El ANVA para experimentos en los que seutilizan bloques se realiza de manera distintaa cuando se utiliza el DCA. Cuando se utilizael DBCA, se debe especificar el bloque en elmodelo (Compton, 1994). Al especificar losbloques en el modelo se instruye al ANVAseparar la variación asociada con los bloquesdel error experimental, lo que resulta enmenor valor del CME y un mayor valor de Fpara el tratamiento. Esto incrementa lasensibilidad del ANVA incrementando laprobabilidad de detectar diferencias entretratamientos al segregar variación no asociadaa los tratamientos.

El ANVA es un poco más complicado cuandose utiliza un DBIA. Esto se debe a que setienen que generar dos modelos. Uno similaral del DCA y otro para generar un valor autilizarse en los bloques incompletos. Losvalores calculados para tratamientos ybloques incompletos se utilizan para construirla tabla de ANVA, calcular el valor de F yobtener el valor asociado de p para lostratamientos.

El ANVA es el método preferido por la mayoríade los investigadores porque es fácil derealizar, se puede utilizar para evaluar datosobtenidos de virtualmente todos los diseñosexperimentales y genera un valor del CME quees considerado el mejor estimador del errorexperimental (Mize, et al., 1999). El ANVAprovee un buen análisis general ya que midecon precisión como se relacionan lostratamientos unos con otros, siempre que seutilice bajo las circunstancias apropiadas.

19.5.2. Análisis de datos de conteo

Los datos de conteo no se distribuyennormalmente porque las varianzas de lostratamientos son iguales a la respuestapromedio de los tratamientos (Quinn &Keough, 2002). Debido a su distribución, los

datos de conteo deben analizarse utilizando laregresión de Poisson (Mize, et al., 1999).Este método estadístico es el más adecuadopara analizar datos de conteo porque utilizaun valor logarítmico de la media de lascuentas, lo que normaliza los datos durante elanálisis. La regresión de Poisson calcula uncoeficiente que se divide por el error estándarpara determinar, a través del estadístico z, siel modelo es significativo.

Muchos investigadores utilizan el ANVA paraanalizar datos de conteo. Desafortuna -damente esto no es confiable cuando losvalores de conteo observados son menos de10 (n<10) (Mize, et al., 1999). Debido aque el número de órganos regenerados porexplantes en estudios de organogénesisadventicia y de embriogénesis es típicamentebajo (menor a 10), usualmente está más quejustificado el uso de la regresión de Poisson.En experimentos en los cuales se regeneranmás de 10 órganos por explante (por ejemplo,micropropagación utilizando brotes apicales),tanto el ANVA como la regresión de Poissonpueden dar resultados similares (Mize, et al.,1999). Sin embargo, en general se consideraque el ANVA no debería utilizarse paraanalizar datos de conteo independientementede cuan grandes sean estos valores (Compton,2011). Por consiguiente, puede considerarseen el mejor interés del investigadortransformar los datos de conteo en todas lassituaciones.

19.5.3. Análisis de datos binomiales

Los datos de respuesta (también conocidoscomo datos binomiales) describenobservaciones relacionadas a la habilidad delos explantes de responder a un tratamientodado. Estos datos se generan para evaluar lainfluencia de los tratamientos en la capacidadde regeneración y tienen una distribuciónbinomial que ocasiona que las varianzas delos tratamientos sean dependientes del “éxito”de los explantes (Mize, et al., 1999). Losporcentajes calculados en estas observaciones

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usualmente se consideran importantes porquelos investigadores están interesados enidentificar tratamientos que optimicen larespuesta de los explantes. La capacidad deoptimizar la respuesta de los explantes setraduce directamente en incrementos deganancias para negocios de cultivo de tejidosvegetales, plantas de micropropagación, oinvestigadores en biotecnología interesados enusar la tecnología de ADN recombinante parainsertar transgenes en tejidos vegetales.

Muchos investigadores utilizan el ANVA paraanalizar datos de respuesta. Esto es desafortu -nado porque, como se explicó anteriormente,el ANVA asume que los datos estánnormalmente distribuidos y que las varianzasde los tratamientos son iguales. Debido a quelas varianzas de los tratamientos en datos derespuesta son dependientes del “éxito” de larespuesta, los resultados del ANVA no sonconfiables. La regresión logística es elprocedimiento estadístico más adecuado paraanalizar datos de respuesta ya que elprocedimiento no produce estimacionesseparadas del error experimental, sino quecalcula un coeficiente especial y un valor deerror estándar para llegar a un estadístico deprueba (estadístico z) que determina lasignificancia estadística (Mize, et al., 1999).

Antes de analizar datos de respuesta esimportante determinar si existen tratamientosen los cuales la respuesta no ha variado. Estousualmente ocurre cuando todos o ninguno delos explantes responden al tratamiento. Estosvalores deben ser cambiados o eliminadosantes del análisis (Mize, et al., 1999). Si setoma la decisión de cambiar los valores, losvalores de 0 (cero) se deben cambiar a valoresligeramente superiores (0.000001) y losvalores de 100% se deben reducir ligera -mente (0.999999). Es importante decidirdurante la planificación si estos valores seránalterados o eliminados. También se debeindicar si se eliminaron tratamientos o sealteraron valores cuando se estén escribiendolos reportes o los manuscritos del estudio.

19.5.4. Análisis de experimentos con submuestreo

La mayoría de los investigadores cultivanvarios explantes en un recipiente de cultivo(sub muestras) para ahorrar tiempo yrecursos, pero analizan los datos como si nose hubiera utilizado el sub muestreo. Estaacción es incorrecta porque el sub muestreoreduce la variación introducida en elexperimento al cultivar múltiples explantespor recipiente (Compton & Mize, 1999). Sepueden utilizar dos métodos para analizarobservaciones hechas cuando se utiliza el submuestreo. Las observaciones de cada explanteen un recipiente se pueden combinar,obteniendo un solo valor por recipiente. Enesta situación, el modelo usado en el análisisgeneral (ANVA) se escribiría como si no sehubiera utilizado el sub muestreo (Compton,2011). Un método alternativo sería hacer lasobservaciones de cada explante en unrecipiente de cultivo y anotarlasindividualmente. Sin embargo, el modelodebe ser escrito de manera tal que los gl y laSC asociados al sub muestreo esténseparados del error experimental . Estemétodo es el preferido por investigadores quedesean documentar la variación asociada conlos explantes. Si el error de sub muestreo noes separado en esta situación, los gl, la SC yel CM del error terminarán “inflados”,resultando en un valor más pequeño de F paralos tratamientos de interés, lo que reduce laprobabilidad de que se detecten diferenciasentre tratamientos. El sub muestreo se puedeutilizar con un solo factor, con experimentosfactoriales y con cualquiera de los diseñosexperimentales discutidos previamente.

19.6. MÉTODOS DE COMPARACIÓNDE MEDIAS

Una vez que se ha obtenido un valorsignificativo en la prueba estadísticapreliminar (ANVA, regresión de Poisson oregresión logística), el investigador debedilucidar diferencias específicas entre

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tratamientos. Esto no es un problema cuandoexisten solamente dos tratamientos pues laprueba general por si sola es suficiente paradeterminar diferencias estadísticas. Sinembargo, la mayoría de los investigadoresprueban más de dos tratamientos, lo querequiere un análisis posterior. La forma másfácil de comparar medias de tratamientos esordenarlas en orden ascendente odescendente y escoger el mejor tratamientoignorando cualquier procedimiento estadísticoo cualquier variación entre UEs o UOs(Compton, 2011). Es importante considerarvariaciones en los tratamientos al compararmedias porque las medias por si solas puedenno representar con precisión como las UOsrespondieron a los tratamientos. Existenmuchos procedimientos de separación demedias que toman en cuenta la variacióndentro del tratamiento, que incluyen al ErrorEstándar de la Media (EEM), las pruebas decomparación múltiple y las pruebas de rangomúltiple, los contrastes ortogonales y elanálisis de tendencias.

19.6.1. Error estándar de la media (EEM)

El Error Estándar de la Media (EEM) seobtiene al dividir el desvío estándar muestralpor la raíz cuadrada del número deobservaciones para ese tratamiento (LymanOtt & Longnecker, 2001). Cuando la mayoríade los investigadores utilizan los valores delEEM para propósitos de separación demedias, usan las medias de los tratamientosjunto con sus respectivos EEM y lasdiferencias calculadas entre valores pareados.Los tratamientos se declaran diferentes si losvalores colectivos de los tratamientospareados no se sobreponen. Muchosinvestigadores usan los valores del EEM paracomparar medias de los tratamientos. Alhacer esto se presentan problemas porque lamayoría de los investigadores utilizan losvalores del EEM para comparar las medias detratamientos muy separadas al ser ordenadas.Este uso del EEM sobreestima las diferencias

entre tratamientos y viola el supuesto delANVA de que las varianzas de los tratamientosson iguales (Mize, et al., 1999). Esto noproduce resultados útiles porque los valoresdel EEM se incrementan con el valor numéricode los datos y no reflejan con precisión lavarianza poblacional (tratamientos con valoresgrandes tienen mayores EEM que aquelloscon valores pequeños). Al usar valores delEEM para comparar medias de tratamientos,se debe calcular un valor de EEM a partir delCME del ANVA o de los valores del EEMobtenidos a partir de la regresión de Poisson ode la regresión logística (Mize, et al., 1999).Este uso del EEM tiene mayor probabilidad detener resultados realistas. Sin embargo, losprocedimientos de comparación de mediasque utilizan la varianza muestral usualmenteproveen información más útil.

19.6.2.Pruebas comparación múltiple ypruebas de rango múltiple

Las pruebas de comparación múltiple y laspruebas de rango múltiple son procedimientosestadísticos que utilizan la varianza muestralen una fórmula para calcular un valornumérico para comparar medias detratamientos de un solo factor fijo. Las mediasson ordenadas de forma ascendente odescendente y se calcula la diferencia entrelas medias comparadas. El valor calculado secompara con el valor crítico computado por elestadístico de comparación de medias. Si lasdiferencias entre las medias comparadasexcede el valor estadístico computado, lostratamientos se consideran estadísticamentediferentes. Alternativamente, si la diferenciaentre medias de los tratamientos comparadoses igual o menor al valor estadísticocomputado, los tratamientos se consideransimilares (Mize, et al., 1999). Al presentarlas medias en una tabla o gráfico, a lasmedias designadas como diferentes se lesasignan letras diferentes, mientras que a lostratamientos declarados similares se lesasigna la misma letra.

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La mayoría de los investigadores usan lostérminos pruebas de comparación múltiple ypruebas de rango múltiple de maneraintercambiable. Sin embargo, estas difieren enel método para hacer comparaciones. Laspruebas de comparación múltiple utilizan elmismo valor crítico para comparar mediasadyacentes y no adyacentes, mientras que laspruebas de rango múltiple emplean diferentesvalores críticos para comparar mediasadyacentes y no adyacentes (Compton,1994). Las pruebas de rango múltiple seconsideran más precisas que las pruebas decomparación múltiples porque se utilizanvalores diferentes para comparar medias queestán más alejadas al estar ordenadas,haciendo menos probable cometer errores alcomparar medias más distantes. Ejemplos depruebas de comparación múltiple son laprueba de Bonferroni, la prueba de ladiferencia mínima significativa de Fisher(DMS), la prueba de Scheffé, la prueba de ladiferencia honestamente significativa de Tukey(DHS) y la prueba de la K-razón de Waller-Duncan (Waller-Duncan). Ejemplos depruebas de rango múltiple son la nuevaprueba de rango múltiple de Duncan(NPRMD), la prueba múltiple F de Ryan-Einot-Gabriel-Welsh (FREGW), la prueba derango múltiple de Ryan-Einot-Gabriel-Welsh(QREGW) y la prueba de Student-Newman-Keuls (SNK). La NPRMD es considerada unade las mejores pruebas de comparación demedias que pueda usarse. Sin embargo, suprocedimiento no se encuentra disponible entodos los softwares estadísticos (Compton,2011).

Normalmente, solamente se utiliza unaprueba de comparación para compararmedias de los tratamientos. La DMS esconsiderada por muchos estadísticos como elprocedimiento de comparación de mediasmás liberal, es decir, el más tendiente adeclarar a las medias como diferentes. Estomuchas veces conduce a los investigadores adeclarar medias que son similares comodiferentes. Esto usualmente ocurre con

medias que están apartadas una de la otra alser ordenadas (la más alta contra la másbaja). Por esta razón, no se debe utilizar laDMS a menos que los tratamientos seanconsiderados diferentes mediante una pruebageneral (ANVA, etc.). La DHS de Tukey seconsidera más conservadora que la DMS yproduce resultados más confiables.

Los resultados de las pruebas de comparaciónde medias se deben presentar ya sea en tablaso en gráficos de barras ya que los tratamientosno están relacionados. Si se usan gráficos debarras las letras asignadas a tratamientosespecíficos se deben posicionar sobre cadabarra.

Las pruebas de comparación múltiple y laspruebas de rango múltiple se deben utilizarsolamente cuando los tratamientos no estánrelacionados (Quinn & Keough, 2002;Compton, 2011). En estudios de cultivo detejidos vegetales, estos son tratamientos enlos que se prueban diferentes reguladores decrecimiento, diferentes genotipos, diferentesrecipientes de cultivo, diferentes agentessolidificantes, etc. Estos procedimientos nodeben utilizares para comparar medias detratamientos que están relacionados, porejemplo, diferentes concentraciones delmismo regulador de crecimiento, del mismoantibiótico, del mismo agente de solidificacióndel medio, de carbón activado, etc.(Compton, 1994; Mize, et al., 1999).

Las pruebas de comparación múltiple y laspruebas de rango múltiple se pueden utilizarpara datos de conteo y datos binomiales. Sinembargo, estos datos deben normalizarseprimero. Los datos de conteo e puedennormalizar utilizando la transformación de laraíz cuadrada (Compton, 1994). Para datosbinomiales típicamente se utiliza latransformación del arco seno. Una vez que sehan calculado los resultados de los datostransformados, los datos se conviertennuevamente a la escala original para supresentación (Compton, 2011).

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19.6.3. ontrastes ortogonales

Los procedimientos de comparación múltipleson los más comúnmente utilizados por losinvestigadores para detectar diferencias entremedias de tratamientos. Sin embargo, existenprocedimientos de comparación de mediasque dan resultados más válidos. El contrasteortogonal es un procedimiento en el cual sehacen comparaciones entre tratamientos concaracterísticas similares (Compton, 1994;Mize, et al., 1999). En estudios de cultivo detejidos vegetales, estos tratamientos puedenser reguladores de crecimiento con similaractividad, reguladores naturales versussintéticos, etc. Los contrastes ortogonalesdifieren de las pruebas de comparación demedias en que se pueden comparar más dedos tratamientos en una prueba. Sin embargo,el número de comparaciones que se puedenhacer está restringido por el número de gradosde libertad de los tratamientos. Los contrastesse realizan usualmente como parte delprocedimiento de ANVA (Compton, 1994).Los contrastes se escriben especificando lostratamientos o grupos de tratamientos que sedesea comparar y el ANVA calcula los gl, lasSC y los CM de la comparación. Se calcula unestadístico F dividiendo el CM de cadacontraste por el CME y se determina el nivelde significancia (valor de p). Se utiliza un glpara cada comparación.

Los resultados de los contrastes ortogonalesusualmente se presentan en una tabla quecontiene los cálculos del ANVA. Las mediasde cada contraste se pueden incluir en unatabla o presentarse en el texto con las mediasy los valores de p para cada contraste.

Los contrastes ortogonales se pueden utilizarpara analizar datos de conteo o binomialessiempre que los datos sean transformadospreviamente al análisis (Compton, 2011). Lainformación que se obtiene de los contrastesortogonales es muchas veces mucho más útilque la que resulta de las pruebas decomparación múltiple o de las pruebas de

rango múltiple. Los contrastes ortogonales sonsubutilizados en estudios de cultivo de tejidosvegetales posiblemente porque losinvestigadores no han sido expuestos alconcepto o porque su utilidad no ha sidocompletamente comprendida (Compton,2011).

19.6.4. Análisis de tendencias

El análisis de tendencias es el método másefectivo para analizar datos de tratamientosque consisten en varios niveles de un mismofactor (diferentes concentraciones del mismoregulador de crecimiento) o incrementos en eltiempo (Compton, 2011). Con estostratamientos, el objetivo primario esidentificar una dosis o un período de tiempoque estimule una respuesta óptima delexplante. Se prueban modelos que identificantendencias específicas (lineal, cuadrática,cúbica) de forma escalonada desde el mássimple (lineal) hasta el más complejo (cúbicoen la mayoría de los casos). El proceso sedetiene cuando se encuentre un valor detendencia no significativo, y la últimatendencia significativa se considera la quemejor se ajusta a los datos. El análisis detendencia utiliza los valores de SC, t y R2 paraindicar tendencias significativas. Lastendencias se pueden probar a través deanálisis de regresión o contrastes polinómicosen el ANVA (Compton, 1994).

El análisis de tendencias y los contrastespolinomiales pueden utilizarse para evaluarlos niveles óptimos de los tratamientos inclusosi esos niveles no fueron directamenteprobados pero se encuentran dentro loslímites de los tratamientos probadosexperimentalmente (Compton, 1994. Losvalores predichos pueden obtenerse utilizandoinformación generada a partir de los análisis,permitiendo a los investigadores estimar losefectos de los tratamientos que no fueronevaluados.

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El análisis de tendencias se puede utilizarpara evaluar datos de conteo y binomialessiempre que los datos sean transformadospreviamente al análisis. Tal como en losprocedimientos de comparación de medias,los datos se convierten nuevamente a laescala original para su presentación.

19.7. CONCLUSIONES

Es importante recordar que cualquier proyectode investigación bien concebido debe serplanificado cuidadosamente antes de quecomience su implementación. Esto ayuda aasegurar que el experimento responda a laspreguntas de investigación deseadas y esto asu vez incrementa la calidad de lainvestigación. Es necesario asegurarse deminimizar el sesgo, la fatiga y los erroresdurante el curso de la experimentación. Estosfactores conducen a resultados mentirososque llevan a conclusiones erróneas. Se debeutilizar el diseño experimental mientras seconduce el experimento y al tomar y analizarlos datos. Esto ayuda a evaluar objetivamente,sin sesgo y con precisión las diferencias entrelos tratamientos. Utilizada apropiadamente, laEstadística es una herramienta valiosa para elinvestigador científico, permitiéndole publicarresultados experimentales con confianza.

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A1. 1. CONCEPTOS BÁSICOS PARA LAPREPARACIÓN DESOLUCIONES

A continuación se dan algunos conceptos básicospara realizar cálculos y preparación de solucionesconcentradas:

Solución. Es una mezcla homogénea de dos omás componentes, o mezcla de soluto ysolvente.

Soluto. Es aquel componente que se encuentraen menor cantidad.

Solvente. Es aquel componente que se encuentraen mayor cantidad y que generalmentedetermina el estado de agregación de lasolución. Si el solvente es H2O, lassoluciones se llaman acuosas.

Algunos solutos, generalmente compuestosorgánicos, no se disuelven en agua y requierendisolventes orgánicos como alcohol, éter y otros.

Formas de expresar la concentración

La concentración representa la cantidad de solutoque se encuentra en una determinada cantidadde solvente o solución. Se conocen diferentesformas de expresar la concentración; las másutilizadas en laboratorio son:

(%) Porcentaje en peso, en volumen y peso

(x) Fracción molar

(ppm) Partes por millón

(M) Molaridad

(N) Normalidad

(m) Molalidad

A continuación se hace una breve descripción decada una de las concentraciones enunciadas.

Porcentaje (%)

Los porcentajes más utilizados son expresados enmasa y generalmente no se especifica el nombre,se sobreentiende.

a) Porcentaje masa

Representa la cantidad de soluto (g) en 100 gde solución

% = Masa de soluto*100/ Masa solución

Ejemplo:

2% de azúcar representa 20 g de azúcar porcada litro de medio nutritivo

b) Porcentaje volumen

Representa el volumen de soluto en 100volúmenes de solución (ml)

% = Volúmenes de soluto*100/ volúmenes desolución

Ejemplo:

Leche de coco al 5% representa 50 ml deleche de coco adicionada a 950 ml de agua

c) Porcentaje peso-volumen

Representa la masa de soluto (g) en 100volúmenes de solución (ml)

% = Masa de soluto*100/ volumen de solución

Ejemplo:

Solución de agar 0,8% (peso-volumen)

Se pesan 8 g de agar, se disuelve y se enrasaen un matraz aforado de 1 litro

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Anexo I

A1.2. DILUCIÓN DE SOLUCIONESPORCENTUALES

Si se quiere diluir una solución porcentual en otrasolución porcentual, se utilizan las fórmulas:

m1 c1 = m2 c2 (% masa)

V1 C1 = V2 C2 (% volumen)

m1, m2 = masa de la solución 1 y 2

V1 V2 = volumen de la solución 1y 2

c1 c2 = concentración porcentual

Ejemplos:

Preparar 100 ml de alcohol al 70% a partir dealcohol al 96%

V1 (%)1 = V2 (%)2

100 ml*70=V2*96

V2=72,9 ml alcohol al 96%

Se miden 72,9 ml de alcohol al 96% y se añadeagua hasta la marca en un matraz aforado de100 ml o en una probeta graduada de 100 ml,de esa manera se obtiene 100 ml de alcohol al70%.

Preparar 100 ml de hipoclorito de sodio (Na ClO)al 2%, a partir de hipoclorito de sodio al 5,5%.

V1 (%)1 = V2 (%)2

100 ml*2%=V2*5,5%

V2 =36,4 ml de NaClO al 5,5%.

Se miden 36,4 ml de hipoclorito de sodio al5,5% y se completa con agua hasta la marca enun matraz aforado de 100 ml.

A1.3. PARTES POR MILLÓN (ppm)

Generalmente se utiliza en unidad de masa, peropuede ser también en volumen o peso a volumen.

Representa partes (masa o volumen) en unmillón de partes (masa o volumen).

Se puede expresar en: g/Tm, mg/kg o mg/l

Ejemplo:

Preparar 100 ml de una solución alcohólicade AIB (ácido indol butírico) de concentración100 ppm.

AIB: C4H6O6

100 ppm equivale a 100 mg/kg ó 100mg/l

A1.4. CONCENTRACIÓN MOLAR OMOLARIDAD (M)

Representa el número de moles de soluto que seencuentran en 1 litro de solución.

Número de moles (n) = masa/ peso molecular

La molaridad (M) se expresa en mol/l. Parasoluciones diluidas, donde la cantidad de solutoses muy pequeña, se utiliza también la concen -tración en milimoles/litro (mM) ó micromoles/litro(µM).

1 mol = 1.000 milimoles = 1.000.000micromoles

1M = 1.000 mM= 1.000.000µM

Para preparar una solución de una determinadamolaridad, se utiliza la siguiente fórmula:

M = masa soluto (g)/PM soluto (g/mol)* Vsolución (litros)

Ejemplo:

a) Preparar soluciones de BAP (Benzilaminopu -rina) (C12 H11 O5) de concentración 1µM y2,5µM y luego convertirlas a mg/l.

Peso molecular (BAP)= 225 g/mol

Solución 1 M de BAP contiene 225 g BAP enun litro de solución

Solución 1 µM de BAP contiene 0,225 mg BAPen 1 litro de solución

Solución 2,5 µM contiene 0,5625mg BAP en 1litro de solución

Como se observa, la conversión a mg/l ya no esnecesaria, ya que la concentración en micromo -les (µM) es equivalente a mg/l.

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b) Se ha preparado una solución de CaCl2* 2H2O con 440 mg/l. ¿Cuál es su concentraciónexpresada en milimoles/litro (mM)?

PM CaCl2 * 2H2O = 147 g/mol

Número milimol (mM) = 440 (mg/l)/147(mg/milimol)

Equivale a 2,99 milimolar (mM).

A1.5. DILUCIONES

Para diluir una concentración molar, se reempla -za en la siguiente ecuación:

V1M1=V2M2

V1 y V2= volúmenes de solución 1 y 2 (litro)

M1 y M2= molaridades de las soluciones (mol/l)

Ejemplo:

Preparar 100 ml solución de formol (aldehídofórmico) CH2O de concentración 0,1M apartir de una solución 1M.

0,1 (litros)*0,1M=V*1M

V=0,01 litros.

Se miden 10 ml de formol 1M y se añade aguahasta la marca en un matraz aforado de 100 ml.

A1.6. CONCENTRACIÓN NORMAL(NORMALIDAD) (N)

Representa el número de equivalentes gramo desoluto que se disuelve en 1 litro de solución.

Número de equivalentes (Neq.) se calcula:

Neq = masa soluto/ peso equivalente (PEq)

PEq, peso equivalente, para los solutos secalcula: PEq = PM/ Valencia

Al dividir entre valencia se toma en cuenta losiguiente:

Para ácidos: valencia es el número de átomos dehidrógeno.

Para bases: valencia es el número de gruposoxhidrilo (OH-).

Para sales: valencia es el producto entre lavalencia del metal y su subíndice.

Si se quiere preparar soluciones normales, secumple la siguiente fórmula:

N= masa soluto (g) * Valencia (eq/mol)/ PMsoluto (g/mol)* Volumen (litro)

Así mismo, si la concentración de soluto espequeña, se utiliza mili equivalentes (MEq) y milinormalidad (mN).

N= 103 mN

Para diluir una dilución normal se utiliza lasiguiente ecuación:

N1V1= N2V2

N1 y N2 = normalidades de las soluciones 1 y2.

V1 y V2 = volúmenes de las soluciones 1 y 2.

a) Calcular una solución de hidróxido de sodio(NaOH) al 1N y luego diluir a 0,5 N. El PMNaOH = 40g/mol.

Para preparar 1 litro solución NaOH 1N, se pesan40g NaOH y se añade agua hasta la marca en unmatraz aforado de 1.000 ml.

Dilución. A partir de la solución concentrada(1N) se pueden obtener otras más diluidas, porejemplo 0,5 N, 0,1N, en base a la siguientefórmula:

V1 N1 = V2 N2

Para preparar 100 ml de solución 0,5 N:

V1 *1N=100ml * 0,5 N

V1 = 50ml de solución 1N

Se miden 50 ml solución 1N y se completa con50 ml H2O enrasando hasta la marca en unmatraz aforado de 100 ml.

b) Calcular una solución de ácido clorhídrico(HCl) de concentración 1N y luego diluir a0,5N.

En la etiqueta de la botella del reactivo (HCl) seleen las características: d = 1,19 g/ml,

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porcentaje 37%(m/m). Para preparar 1 litro desolución de HCl se necesitarán 36,45 g HCl.Como es líquido, es más cómodo medir suvolumen y no masa.

36,45g *100/37 = 98,51 g ácido 37%.

D = m/V => V = m/d

V = 98,51 g / 1,19 g /ml

V HCl = 82,78 ml.

Se miden 82,78 ml HCl y se añade H2O hasta lamarca en un matraz aforado de 1.000 ml.

Para diluir el HCl 1N a 0,5N y 0,1N se empleala misma fórmula:

V1 N1= V2 N2

Para preparar 100 ml de solución 0,5 N de HCla partir de sol 1N:

V1*1N=100 ml * 0,5N

V1= 50 ml sol. HCl 1N

Se miden 50 ml solución HCl 1N y se añadeagua hasta la marca en un matraz aforado de100 ml.

Importante:

Si se tiene una solución molar y se requiere unasolución normal o a la inversa, es muy útil en lapráctica la siguiente ecuación:

M*valencia=N

M-concentración molar

N-concentración normal

Cuando la valencia es 1(NaOH, HCl, etc.), lasdos concentraciones son idénticas.

A1.7. CONCENTRACIÓN MOLAL OMOLALIDAD (m)

Representa el número de moles de soluto en 1kgde solvente. Para calcular el número de moles, seutiliza la siguiente relación:

n = m/PM

Y para calcular la masa de solvente se utiliza lasiguiente fórmula:

mSolvente = mSolución - msoluto

Fórmula:

M1C1 = M2C2 M1M2 = masa de disolvente

C1C2 = conc. molales

Ejemplo:

Preparar una solución acuosa de glucosaC6H12O6, 2 molal (2m) a partir de 36 g de lamisma.

PM glucosa = 180 g/mol

Número moles (n) = 36 g/180 (g/mol)

n = 0,2 moles

La solución 2 molal (2m), contiene 2 moles porkg disolvente (agua)

Por lo tanto con la cantidad dada se puedenpreparar 136 g solución (100 g disolvente y 36g de soluto).

A1.8. SALES HIDRATADAS

Para la preparación de los diferentes medios decultivo, suele ocurrir que el laboratorio posea lasal pero con una diferente hidratación; tal es elcaso del sulfato de manganeso monohidratado odel sulfato de manganeso tetrahidratado, se tratade la misma sal pero con presencia de aguadiferente.

El proceso es el siguiente:

1. MnSO4.4H20

PM MnSO4 = 55 + 32 + 4*16 = 151 g/mol

4 H2O = 4*18 g/mol = 72 g/mol

PM MnSO4 . 4H2O = 151 + 72 = 223 g/mol

223 g —————u 151 g MnSO4 ( sal anhidra)

2.230 —————u X

X = 1510 g MnSO4

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2. MnSO4.H20

PM MnSO4. H2O = 151 + 18 = 169 g/mol

169 g ————————u 151 g MnSO4

1,690 g ———————u X

X = 1,510 g MnSO4

Conclusión: 2.230 g de MnSO4 .4H2O esequivalente a 1.690 g MnSO4 . H2O.

BIBLIOGRAFÍA

BLANCO PRIETO, 1983. Manual de LaboratorioQuímica, Ediciones Librería Cervantes,Salamanca.

WHITTEN K, GAILEY K y R DAVIAS, 1998. QuímicaGeneral, Editorial Mc Graw Hill, 5ta Edición,México.

LOPEZ SOLANAS, V. 1991. Técnicas de Laboratorio,Editorial EDUNSA, Barcelona.

SIENKO Y, PLANE R. 1990. Química Teórica yDescriptiva, Edición Aguilar S.A. – Madrid.

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A2.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES CONCENTRADAS, MEDIO (Murashige &Skoog, 1962)

(En base al protocolo del laboratorio de Fitopatología de la FSAGX – Bélgica, 1990).

• M1: Macro elementos

Enrasar a 1litro y tomar 100 ml /l de medio MS. Conservar en refrigerador.

• M2: Micro elementos

(+) Utilizar una de las dos fuentes de Manganeso.Enrasar a 1litro y tomar 10 ml /l de medio MS. Conservar en refrigerador.

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os Anexo II

A2.2. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES CONCENTRADAS, MEDIO (Murashige &Skoog, 1962)

• M3: Quelatos de hierro

Luego de preparada la solución, dejar en reposo dos o tres días a temperatura ambiente. Conservar enrefrigerador. Enrasar a 1 litro y tomar 10 ml /l de medio MS.

• M4: Vitaminas

Enrasar a 1litro y tomar 10 ml /l de medio MS. Conservar en refrigerador una cuarta parte, el resto,congelar hasta su utilización, descongelando sólo una parte.

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A3.1. FORMULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Formulación de medios de MS, B5, WH.

MS= Murashige & Skoog, 1962; B5 = Gamborg et al.; (1968) ; Wh = White, (1943). Con modificaciones de Yeoman et al.,1977 y Singhy et al., 1981.Fuente: Mroginski y Roca (1991); Thorpe (1981)

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os Anexo III

A3.2. PESO MOLECULAR DE LOS COMPONENTES DE MEDIOS DE CULTIVO

• Macro elementos

• Micro elementos

• Carbohidratos

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• Factores de crecimiento

• Reguladores de crecimiento

Fuente: Jona y Menine (1987), Complementación: M. Calle y G. Aguirre, Laboratorio de Biotecnología FCAPFyV – UMSS, 2009.

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