Cultivo de Tejidos

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

Escuela de Ciencias Agrícolas Pecuarias y del Medio Ambiente

Contenido didáctico del curso Cultivo de Tejidos 203024

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE

ESPECIALIZACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA AGRARIA

CCUULLTTIIVVOO DDEE TTEEJJIIDDOOSS

Revisado en 2013 por:CARLOS PATIÑO TORRESIng. Agrónomo, M.Sc. Ph.D.

BOGOTÁ

2013

PATRICIA ANDREA RODRIGUEZ BURGOS Bióloga, Magíster en Microbiología

Actualizado en 2009 por: DIANA ANGÉLICA CARVAJAL BERNAL

Bióloga, Magister en Biotecnología Molecular

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INDICE DE CONTENIDO

LISTADO DE TABLAS .............................................................................................. 5

LISTADO DE GRÁFICOS Y FIGURAS ..................................................................... 6

ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO ...................... 6

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 7

JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 9

INTENCIONALIDAD FORMATIVA .......................................................................... 10

CONTEXTO TEÓRICO ........................................................................................... 12

METODOLOGÍA GENERAL.................................................................................... 13

SISTEMA DE EVALUACIÓN................................................................................... 14

GUÍA DE ACTIVIDADES ......................................................................................... 15

CONTENIDO DIDÁCTICO UNIDAD 1 ..................................................................... 16

CONTENIDO DIDÁCTICO UNIDAD 2 ..................................................................... 20

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES ..................................................................... 23

CAPITULO 1: Principios, metodologías y técnicas 1 ........................................ 23 Introducción............................................................................................. 23 Lección 1: Historia del cultivo de tejidos vegetales .................................. 23 Lección 2: Consideraciones básicas para el establecimiento y/o

planeación de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales ................ 24 Lección 3: Medios de cultivo ................................................................... 28 Lección 4: Propagación in vitro ............................................................... 34 Lección 5: Callogénesis .......................................................................... 36

CAPITULO 2: Principios, metodologías y técnicas 2 ........................................ 40 Introducción............................................................................................. 40 Lección 6: Cultivo de anteras y polen ...................................................... 40 Lección 7: Obtención y cultivo de protoplastos ........................................ 41 Lección 8: Cultivo de meristemos ............................................................ 44 Lección 9: Cultivo de embriones y de óvulos ........................................... 46 Lección 10: Variación somaclonal ........................................................... 49

CAPITULO 3: Aplicaciones Prácticas ............................................................... 52 Introducción............................................................................................. 52 Lección 11: Bioestadística aplicada al cultivo de tejidos vegetales .......... 52 Lección 12: Cultivo de especies económicamente importantes ............... 54

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Lección 13: Transgénesis........................................................................ 57 Lección 14: Mejoramiento genético ......................................................... 62 Lección 15: Aplicaciones en bancos de germoplasma ............................ 64

Actividades de Autoevaluación de la UNIDAD 1 .............................................. 66 Fuentes Documentales de la Unidad 1 ............................................................ 67

CULTIVO DE TEJIDOS ANIMALES ........................................................................ 68

CAPITULO 4: Principios, metodologías y técnicas 1 ........................................ 68 Introducción............................................................................................. 68 Lección 16: Introducción a la técnica del cultivo celular ........................... 68 Lección 17: Medios de cultivo ................................................................. 69 Lección 18: El laboratorio de cultivo de tejidos ........................................ 73 Lección 19: Tipos de cultivos .................................................................. 75 Lección 20: Aislamiento de células para cultivo ....................................... 77

CAPITULO 5: Principios, metodologías y técnicas 2 ........................................ 82 Introducción............................................................................................. 82 Lección 21: Contaminación ..................................................................... 82 Lección 22: Caracterización y Autenticación ........................................... 84 Lección 23: Cuantificación celular ........................................................... 87 Lección 24: Transfección......................................................................... 91 Lección 25: Células madre ...................................................................... 94 Lección 26: Cultivos celulares de insectos .............................................. 98

CAPITULO 6: Ingeniería de Tejidos ............................................................... 101 Introducción........................................................................................... 101 Lección 27: Materiales en ingeniería de tejidos ..................................... 101 Lección 28: Fundamentos de la ingeniería de tejidos ............................ 104 Lección 29: Biomateriales ..................................................................... 107 Lección 30: Aplicaciones y perspectivas ............................................... 110

Actividades de Autoevaluación de la UNIDAD 2 ............................................ 115 Fuentes Documentales de la Unidad 2 .......................................................... 116

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LISTADO DE TABLAS

TABLA 1.1 COMPARACIÓN DE EFECTOS ENTRE AUXINAS Y GIBERELINAS ....................... 33 TABLA 2.1 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL TRABAJO EN CULTIVOS IN VITRO .................. 69 TABLA 2.2 PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS Y APLICACIONES DE LAS LÍNEAS

CELULARES MÁS COMÚNMENTE USADAS EN BIOTECNOLOGÍA. ............................................... 78 TABLA 2.3 ESPECIES FUENTE PARA EL AISLAMIENTO Y ESTABLECIMIENTO DE LÍNEAS

CELULARES ....................................................................................................................... 79 TABLA 2.4 COMPARACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE AUTENTICACIÓN CELULAR .................... 85 TABLA 2.5 COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN EN CÉLULAS

ANIMALES .......................................................................................................................... 91 TABLA 2.6 ALGUNOS DE LOS POLÍMEROS QUE PUEDEN SER USADOS EN INGENIERÍA DE

TEJIDOS, BASADOS EN ANTIGUOS DISPOSITIVOS BIOMÉDICOS ............................................. 103 TABLA 2.7 CLASES DE BIOMATERIALES .................................................................... 109

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LISTADO DE GRÁFICOS Y FIGURAS

FIGURA 1.1 DIFERENTES ÁREAS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS. ..................... 25 FIGURA 1.2 CÁMARA DE FLUJO LAMINAR. ............................................................................ 26 FIGURA 1.3 ESQUEMA DE UNA CÁMARA DE FLUJO HORIZONTAL ............................................. 28 FIGURA 1.4 SUSTANCIAS QUE SE AÑADEN CON FRECUENCIA A LOS MEDIOS DE CULTIVO

PARA INDUCIR EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO VEGETAL. ............................................ 29 FIGURA 1.5 RESPUESTAS GENERADAS EN LOS CULTIVOS IN VITRO POR LAS AUXINAS Y

CITOCININAS. ............................................................................................................. 32 FIGURA 1.6 PRINCIPIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS Y ALGUNAS VÍAS DE MULTIPLICACIÓN

CLONAL. .................................................................................................................... 35 FIGURA 1.7 CALLOS DE CRISANTEMO. ................................................................................ 36 FIGURA 1.8 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DEL CULTIVO DE CALLO. .................................. 39 FIGURA 1.9 PROCESO GENERAL PARA LA OBTENCIÓN DE PLANTAS HAPLOIDES O

DIHAPLOIDES. ............................................................................................................ 41 FIGURA 1.10 PROTOPLASTOS AISLADOS DE ARABIDOPSIS THALIANA ..................................... 42 FIGURA 1.11 PROCEDIMIENTO PARA AISLAR Y CULTIVAR PROTOPLASTOS .............................. 43 FIGURA 1.12 SISTEMA DE PROPAGACIÓN POR CULTIVO DE MERISTEMOS O YEMAS ................. 45 FIGURA 1.13 PRODUCCIÓN DE PLANTAS LIBRES DE VIRUS A PARTIR DE CULTIVO DE

MERISTEMOS. ............................................................................................................ 46 FIGURA 1.14 CULTIVO DE EMBRIONES DE CEBADA Y DE PALMA ............................................. 47 FIGURA 1.15 OBTENCIÓN DE VARIANTES SOMACLONALES DE PASTO LLORÓN, ERAGROSTIS

CURVULA (SCHRAD.) NEES A PARTIR DEL CULTIVO DE INFLORESCENCIAS. ..................... 51 FIGURA 1.16 SUPERFICIE MUNDIAL DE CULTIVOS BIOTECNOLÓGICOS. ................................... 57 FIGURA 1.17 TRANSFERENCIA DEL DNA-T DE UN PARÁSITO A CÉLULAS VEGETALES. ............. 59 FIGURA 1.18 SISTEMA DE DOS PLÁSMIDOS PARA CREAR UNA PLANTA TRANSGÉNICA. ............. 60 FIGURA 1.19 BIOBALISTICA ................................................................................................ 62 FIGURA 2.1 ESQUEMA DE LA FILTRACIÓN AL VACÍO Y ALGUNAS UNIDADES DE FILTRACIÓN. ..... 72 FIGURA 2.2 DIAGRAMA DE FLUJO DE AIRE EN UNA CABINA DE CLASE II. ................................. 74 FIGURA 2.3 DIAGRAMA DE FLUJO DE AIRE EN UNA CABINA CLASE III. ..................................... 75 FIGURA 2.4 TIPOS DE CULTIVOS. ........................................................................................ 76 FIGURA 2.5 ESQUEMATIZACIÓN DEL MÉTODO DE OBTENCIÓN DE FIBROBLASTOS DE POLLO. .... 80 FIGURA 2.6 ESQUEMATIZACIÓN DEL MÉTODO DE OBTENCIÓN DE HEPATOCITOS DE RATA. ....... 81 FIGURA 2.7 CÉLULAS INFECTADAS CON MICOPLASMA Y TEÑIDAS CON HOECHST 33258. ........ 84 FIGURA 2.9 CARIOTIPO HUMANO CON TINCIÓN TRIPSINA-GIEMSA. ......................................... 86 FIGURA 2.10 ELABORACIÓN DE UNA CURVA DE CRECIMIENTO. .............................................. 89 FIGURA 2.11 FORMACIÓN DE UN LIPOSOMA Y SU ENDOCITOSIS. ............................................ 92 FIGURA 2.12 MICROINYECCIÓN .......................................................................................... 93 FIGURA 2.13 ESTRATEGIA DE OBTENCIÓN DE UN CULTIVO DE CÉLULAS MADRE DE EMBRIÓN. .. 96 FIGURA 2.14 ESTRATEGIA DE OBTENCIÓN DE UN CULTIVO DE CÉLULAS MADRE ADULTAS ........ 98 FIGURA 2.15 PASOS PARA LA PREPARACIÓN DE UN CULTIVO CELULAR DE INSECTOS .............. 99 FIGURA 2.16 DESARROLLO DE BIOMATERIALES POLIMÉRICOS PARA INGENIERÍA DE TEJIDOS. 104 FIGURA 2.17 TIPOS DE ADHESIÓN CELULAR. ...................................................................... 107 FIGURA 2.18 PIEZAS QUE PUEDEN IMPLANTARSE EN EL ORGANISMO HUMANO ..................... 108 FIGURA 2.19 APLICACIÓN DE LA INGENIERÍA DE TEJIDOS CON CÉLULAS AUTÓLOGAS. ........... 111

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El contenido didáctico del curso académico: Cultivo de Tejidos fue diseñado inicialmente en el año 2007 por la bióloga Patricia Andrea Rodríguez Burgos, Magíster en Microbiología, docente de los programas de especialización de la UNAD, ubicado en el CEAD de Pitalito. Patricia es Bióloga con M.Sc. en Microbiología. Se ha desempeñó como tutora de la UNAD en el 2007 y ha sido docente de diversas universidades.

El contenido didáctico ha sido actualizado una sola vez: en el año 2009, desarrollada por la bióloga Diana Angélica Carvajal Bernal, M.Sc. en Biotecnología Molecular, quien se desempeña actualmente como tutora de la UNAD en el CEAD José Celestino Mutis.

La versión del contenido didáctico que actualmente se presenta tiene como características el ajuste a los lineamientos dados por la universidad para el material de soporte para los cursos de la modalidad virtual.

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INTRODUCCIÓN

El curso de CULTIVO DE TEJIDOS pertenece al Programa de Especialización en Mejoramiento y Biotecnología Agraria, adscrito a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Abierta y a Distancia (UNAD). Corresponde al campo de formación de profundización, es de carácter electivo y tiene dos (2) créditos académicos. El curso busca dotar a los estudiantes de la especialización de habilidades en la comprensión de conceptos y técnicas en cultivos de tejidos vegetales y animales así como de los aportes, aplicaciones y potencialidades de estas herramientas a la hora de formular investigaciones e iniciativas en el área de la biotecnología agraria.

El cultivo de tejidos es una herramienta de gran utilidad en la biotecnología. En los vegetales, las técnicas de cultivo de tejidos se han convertido en herramientas poderosas para el mejoramiento de las plantas, y para lograr avances en fitopatología, genética, fisiología y en otras disciplinas. Las técnicas de regeneración de plantas han permitido limpieza de plagas y enfermedades, disminución del tiempo necesario para producción de nuevas variedades, propagación rápida de líneas superiores, implementación de bancos de germoplasma en pequeños espacios y a costos mínimos, propagación masiva de especies en peligro de extinción y la preparación y puesta a punto de plantas para transformación genética, lo que ha contribuido significativamente al progreso de la agricultura. Por su parte, las técnicas de cultivo de órganos y células animales han posibilitado el estudio de ciertos procesos celulares tales como: replicación y transcripción del DNA, síntesis proteica, metabolismo energético, nutrición, infecciones virales, transformación maligna, acción de drogas, toxicidad, secreción de productos especializados, desarrollo embrionario, y para técnicas de modificación genética, selección clonal, reconstrucción tisular, transgenesis entre otras, desde el ámbito biomédico hasta la obtención de especies y razas animales mejoradas.

El curso está dividido en dos unidades didácticas, que se describen a continuación. La primera unidad didáctica consta de 3 capítulos y un total de 15 lecciones, y trata los aspectos concernientes al cultivo de tejidos vegetales. En esta unidad se estudian los principios fundamentales de la micropropagación vegetal, incluyendo su historia y las últimas tendencias en mejoramiento genético, dado que el cultivo de tejidos vegetales se constituye en un puente para llevar las manipulaciones genéticas del laboratorio al campo. Se abordan temas como: principios para el establecimiento de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, técnicas asépticas, cultivo de protoplastos, de meristemos, de embriones y polen, variación somaclonal y transgénesis entre otros. La segunda unidad didáctica

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consta de 3 capítulos y 15 lecciones. Esta unidad trata de introducir al estudiante en el área del cultivo de tejidos animales. En esta unidad se expone el cultivo de tejidos desde el punto de vista del cultivo celular, estudiando las principales técnicas y usos, finalizando con los últimos avances en ingeniería de tejidos. Se tratan temas como: cultivos primarios, mantenimiento de líneas celulares, hibridomas, cultivos en tres dimensiones, cultivos de alta densidad, líneas inmortales, tejidos artificiales.

El curso se desarrollará bajo la metodología de educación a distancia, donde el estudiante es el mayor responsable de su proceso de aprendizaje y por esto debe planificar el tiempo de dedicación para su trabajo independiente, teniendo en cuenta que durante el proceso también tiene a su disposición vías de acompañamiento por parte del tutor y actividades de trabajo en pequeño grupo colaborativo. De esta forma el aprendizaje es dinámico y participativo, al contar con varios actores de flujo de conocimiento: el acompañamiento del tutor y las interacciones y aportes de los compañeros El estudiante encontrará en la Guía didáctica toda la información necesaria para que relacione secuencial y periódicamente su aprendizaje teórico (basado en el modulo) con su aprendizaje experiencial, el cual desarrollará con la ejecución y análisis de los ejercicios descritos en la Guía de Actividades.

Los Criterios de evaluación que deberán tener presentes tanto el estudiante, como tutores y docentes, es el establecido en el reglamento estudiantil. En especial se consideran los enfoques estratégicos complementarios de autoevaluación, coevaluación y heteroevaluación.

Para lograr con éxito la culminación de este curso, el estudiante consultará la bibliografía propuesta para garantizar el acceso a toda la información necesaria y así responder a las exigencias académicas del curso. Es importante resaltar que una vez se finalice la labor de aprendizaje el estudiante podrá relacionar y comprender artículos o trabajos experimentales que tengan que ver con el área de cultivo de tejidos y cultivos celulares, y los usos potenciales de estas herramientas en su desempeño como especialistas en biotecnología agraria.

El cultivo de tejidos vegetales y animales, entendido como el proceso de hacer “crecer” células y tejidos en condiciones de laboratorio se ha constituido en una herramienta esencial en muchos campos del conocimiento, como el análisis de respuestas celulares a factores ambientales, expresión genética, desarrollo de anticuerpos, desarrollo de organismos genéticamente modificados, cultivo de virus, micropropagación de plantas, mejoramiento genético y en general temas relacionados con la biotecnología tanto animal como vegetal. El curso de Cultivo de Tejidos aportará al estudiante la comprensión y aplicación de diferentes postulados biológicos y de manipulación in vitro, necesarios para un mejor desempeño profesional, integrando de manera compacta y funcional, los conocimientos básicos y fundamentales de estas herramientas.

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JUSTIFICACIÓN

El cultivo de tejidos es una herramienta de gran utilidad en la biotecnología. Estas técnicas se basan en la "totipotencialidad celular", capacidad intrínseca en las células vegetales y de factible inducción en las células animales, dadas en cultivos in vitro. Así se obtiene la propagación rápida y masiva de plantas idénticas a la original a partir de cualquier parte aislada de la planta ó en el caso de tejidos animales, la propagación de líneas celulares específicas.

En los vegetales, las técnicas de cultivo de tejidos se han convertido en herramientas poderosas para el mejoramiento de las plantas, y para lograr avances en fitopatología, genética, fisiología y en otras disciplinas. Las técnicas de regeneración de plantas han permitido limpieza de plagas y enfermedades, disminución del tiempo necesario para producción de nuevas variedades, propagación rápida de líneas superiores, implementación de bancos de germoplasma en pequeños espacios y a costos mínimos, propagación masiva de especies en peligro de extinción y la preparación y puesta a punto de plantas para transformación genética, lo que ha contribuido significativamente al progreso de la agricultura.

Por su parte, las técnicas de cultivo de órganos y células animales han posibilitado el estudio de ciertos procesos celulares tales como: replicación y transcripción del ADN, síntesis proteica, metabolismo energético, nutrición, infecciones virales, transformación maligna, acción de drogas, toxicidad, secreción de productos especializados, desarrollo embrionario, y para técnicas de modificación genética, selección clonal, reconstrucción tisular, transgénesis entre otras, desde el ámbito biomédico hasta la obtención de especies y razas animales mejoradas.

El curso de Cultivo de Tejidos aportara al estudiante la comprensión y aplicación de diferentes postulados biológicos y de manipulación in vitro, necesarios para un mejor desempeño profesional, integrando de manera compacta y funcional, los conocimientos básicos y fundamentales de estas herramientas. Permitirá por una parte la familiarización de los conceptos al tener la oportunidad de experimentar con modelos pedagógicos (Talleres de Cultivos de Tejidos) que posibilitarán la aplicación de modelos y métodos de cultivo de tejidos en la producción de plantas y animales mejorados.

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INTENCIONALIDAD FORMATIVA

Formulación de Propósitos

1. Generar en el estudiante la comprensión de los conceptos generales mediante

el análisis de las herramientas de cultivo de tejidos y su aplicación en

problemas científicos.

2. Crear en el estudiante la capacidad de solución de los problemas agrarios

mediante la aplicación de conceptos cultivo de tejidos, con fines

biotecnológicos.

3. Incentivar en el estudiante el sentido investigativo a través del desarrollo de

competencias que le permitan formular y comprender investigaciones en las

que esté implicado el uso de cultivo de tejidos.

Formulación de Objetivos

1. Adquirir el conocimiento teórico necesario, acerca de las técnicas de cultivo de

tejidos vegetales y animales, para ser aplicados a nivel de propagación,

mejoramiento genético y conservación.

2. Desarrollar la capacidad investigativa planeando, analizando y discutiendo

potenciales resultados de una investigación específica durante el desarrollo

del curso

Formulación de Competencias

Cognitivas

El estudiante consigue tener sólidas bases y conocimientos acerca de los temas principales del curso de Cultivo de Tejidos, con énfasis en las principales aplicaciones que pueden beneficiar los sistemas agropecuarios. Posee interés y

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es competente en la investigación científica en el área del Cultivo de Tejidos y particularmente aquella que se relaciona con los sistemas agropecuarios. Profundiza en los aspectos de su interés particular en el área del cultivo de tejidos aplicados a las ciencias agropecuarias.

Comunicativas

Interpretativas: El estudiante desarrolla de habilidad de sustentar efectivamente aspectos relacionados con el cultivo de tejidos, considerando los últimos avances en las aplicaciones de esta herramienta.

Argumentativas: El estudiante adquiere una actitud crítica hacia las aplicaciones de la técnica de cultivo de tejidos que pueden beneficiar la producción en sistemas agropecuarios, así como es capaz de defender su opinión con relación a las prácticas que sustentan el estudio del Cultivo de Tejidos. El estudiante aplica el método científico, a través de habilidades de síntesis, análisis, deducción, y planteamiento de hipótesis. Defiende el compromiso adquirido como estudiante, tomando una posición responsable, honesta y activa frente a situaciones cotidianas en su entorno social.

Propositivas: El estudiante es capaz de cuestionar, proponer aplicaciones de cultivo de tejidos, temas de investigación y discutir procedimientos sobre estudios en Cultivo de Tejidos. Promueve un ambiente sano protegiendo su entorno, tomando decisiones responsables y procurando el bienestar social.

Formulación de Metas

1. El estudiante se apropiara del conocimiento sobre las bases biológicas y

físico-químicas necesarias para el desarrollo de cultivos In vitro, mediante el

estudio y discusión de artículos científicos.

2. El estudiante estará en capacidad de plantear investigaciones biotecnológicas

que requieran las técnicas de cultivos celulares y de tejidos.

3. El estudiante tendrá la capacidad de analizar los conceptos de cultivos In vitro,

aplicados al mejoramiento genético para proponer nuevas alternativas de

investigación

4. El estudiante reconocerá, analizará e interpretará conceptos y técnicas de

cultivo de tejidos en la investigación biotecnológica agrícola, obteniendo una

mirada crítica y actualizada de estas investigaciones.

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CONTEXTO TEÓRICO

En las últimas décadas se han desarrollado técnicas que posibilitan el estudio de las plantas y de los animales a escala celular y molecular. Estas nuevas técnicas conocidas colectivamente como biotecnología, se han convertido en herramientas poderosas para el mejoramiento de las plantas y de los animales, y para lograr avances en patología, genética, fisiología y en otras disciplinas, lo que ha contribuido significativamente al progreso de la agronomía.

El área de cultivo de tejidos se ha convertido en la base para desarrollar y poder aplicar las técnicas para la transformación genética de organismos y brinda la fundamentación práctica para avanzar en estudios de biología celular. En la medida en que se conozcan los procesos celulares que controlan los fenómenos de desdiferenciación y diferenciación celular, crecimiento y cómo influyen la nutrición y los reguladores de crecimiento en el nivel celular, se podrá avanzar aun más en su entendimiento y control, posibilitando de esta manera mayor entendimiento de la biología celular para futuras aplicaciones biotecnológicas.

Este curso está dedicado al cultivo de tejidos de vegetales y animales, temáticas que permitirán que el estudiante de postgrado conozca y profundice en el área de las técnicas de propagación celular, sus aplicaciones en manipulación genética y mejoramiento y perspectivas de futuras aplicaciones.

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METODOLOGÍA GENERAL

Teniendo en cuenta que con este modulo, el estudiante desarrollará habilidades para analizar los principios físicos, químicos y biológicos de los cultivos de tejidos en vegetales y animales además de sus aplicaciones, podrá plantear temas de investigación en desarrollo biotecnológico haciendo uso de estas herramientas, comprendiendo en toda su extensión la aplicabilidad y ventajas o desventajas de las mismas.

En tanto que para la actualización de sus conocimientos, es necesario que, adicional a la teoría, se realicen ejercicios de análisis y lecturas complementarias; los cuales garantizaran una mayor y mejor asimilación y comprensión de las temáticas estudiadas.

Así mismo están definidos espacios, para el control, validación y discusión de dichas prácticas y ejercicios (lo mismo que de los componentes teóricos) en tutoriales, reuniones de pequeños grupos colaborativos, grupos de curso y en una socialización final del proyecto de semestre. La función de estas actividades de interactividad pedagógica, será la de orientar, clarificar y cualificar procesos, tanto teóricos, como prácticos, con el ánimo tanto de coadyuvar en la operacionalización cognitiva del estudiante, como de posibilitar procesos de seguimiento evaluativos (formativos) y finalmente valorativos del aprendizaje.

Para que el estudiante pueda desempeñarse adecuadamente en este proceso, recibirá como recursos, artículos científicos sobre temas específicos y una lista de problemas para ejercitar los conocimientos adquiridos. El estudiante encontrará en la Guía Didáctica toda la información necesaria y pertinente para que relacione permanente y secuencialmente su aprendizaje teórico (basado en el módulo) con el procedimiento de aprendizaje experiencial, los cuales encontrará descritos con precisión en la Guía de Actividades.

Recibirá la información precisa de tiempos, materiales, procedimientos, etc. que le permitan no sólo realizar sus ejercicios de manera oportuna y pertinente, sino que le indicarán cómo y cuándo elaborar y/o presentar los informes y sustentaciones que constituirán las evidencias para la evaluación de su proceso. En este sentido se definen los mecanismos y requisitos específicos para acceder tanto a los momentos de interactividad pedagógica ya mencionados, como a los medios y mediaciones tecnológicas a las que tendrá acceso y necesidad.

Entre los apoyos técnicos y tecnológicos relevantes para este proceso, el estudiante requerirá específicamente del uso computadores y lecturas complementarias el cual permitirá una mayor celeridad y apropiación del proceso de aprendizaje y de sus resultados

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SISTEMA DE EVALUACIÓN

Los Criterios de evaluación que deberán tener presentes tanto el estudiante, como tutores y docentes, es el establecido en el reglamento estudiantil. En especial se consideran los enfoques estratégicos complementarios de autoevaluación, coevaluación y heteroevaluación. Como se mencionó en la metodología general se llevarán a cabo procesos de seguimiento evaluativos (formativos) y finalmente valorativos del aprendizaje.

Como mecanismos de evaluación se cuenta con la heteroevaluación y autoevaluación. En términos generales se evaluarán las actividades de tipo individual descritas en la metodología, en pequeños grupos colaborativos y los de socialización. De todas quedara constancia en el Portafolio Personal de Desempeño (PPD).

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GUÍA DE ACTIVIDADES

Situaciones de reconocimiento

El estudiante podrá relacionar las diferencias, requerimientos básicos y respuestas a factores ambientales que podrá encontrar en cualquier tipo de cultivo in vitro, se generará interrogantes como: ¿Cuáles son los requerimientos mínimos para el crecimiento celular? ¿Qué tipos celulares son los adecuados para un estudio específico? En sus respuestas el estudiante estará en capacidad de entender que existen diferentes métodos de cultivos de tejidos y celulares que permiten la obtención de animales y plantas en laboratorio con potencialidad para ser manipulados.

Situaciones de profundización

El estudiante conceptualizará que los factores bioticos y abioticos presentes en un medio de cultivo pueden ser manipulados y controlados para la obtención de líneas celulares especificas o respuestas celulares deseadas según los objetivos de investigación. Además analizará el manejo de estas metodologías para futuros proyectos o líneas de investigación de su interés.

Situaciones de transferencia

El estudiante estará en capacidad, de proponer hipotéticamente una investigación en el área de biotecnología agraria en la cual sea necesario emplear herramientas de cultivos de tejidos. También realizará talleres y análisis de artículos para realizar la identificación de sus conocimientos.

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CONTENIDO DIDÁCTICO UNIDAD 1

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Nombre de la Unidad CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Introducción En esta unidad se presentarán los principios básicos de la micropropagación vegetal, desde su historia hasta las últimas tendencias en mejoramiento genético, dado que el cultivo de tejidos vegetales se constituye en un puente para llevar las manipulaciones genéticas del laboratorio al campo. Se abordan temas como: principios para el establecimiento de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, técnicas asépticas, cultivo de protoplastos, de meristemos, de embriones y polen, variación somaclonal y transgénesis entre otros. El cultivo de tejidos vegetales puede ser definido como un grupo muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La historia del cultivo de tejidos, las necesidades básicas de un laboratorio que se dedique a estas técnicas, los medios nutritivos de cultivo e iniciaremos el estudio de la propagación in vitro serán tratados en esta unidad. Además, se estudiarán los diferentes sistemas de cultivo que existen para la micropropagación vegetal como son el cultivo de anteras y polen, la obtención de protoplastos, el cultivo de meristemos y el cultivo de óvulos; también se tendrá en cuenta la variación que se da en los materiales sometidos a cultivo in vitro y las potencialidades de esta. Se revisarán las aplicaciones del cultivo de tejidos tales como la micropropagación o clonación in vitro de plantas, la obtención de materiales mejorados mediante selección in vitro u otras técnicas y la conservación de germoplasma vegetal mediante criopreservación o almacenamiento en condiciones de mínimo crecimiento, así como gracias a las técnicas de ingeniería genética, ha sido posible la transferencia directa de genes a las plantas.

Justificación Las técnicas de cultivo de tejidos vegetales se han convertido en unas herramientas imprescindibles para el mejoramiento de las plantas, y para lograr avances en fitopatología, genética, fisiología y en otras disciplinas. Las técnicas de regeneración de plantas permiten la limpieza de plagas y enfermedades, la disminución del tiempo necesario para

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producción de nuevas variedades, la propagación rápida de líneas superiores, la implementación de bancos de germoplasma en pequeños espacios y a costos mínimos, así como la propagación masiva de especies en peligro de extinción y la preparación y puesta a punto de plantas para transformación genética, lo que ha contribuido significativamente al progreso de la agricultura. De esta manera se ha convertido en una herramienta clave para el buen desarrollo de la seguridad alimentaria mundial.

Intencionalidades Formativas Entender el desarrollarlo de los métodos en cultivo de tejidos, los avances que se han logrado en cuanto a la formulación de medios nutritivos y la micropropagación.

Analizar los principales sistemas de cultivo de tejidos y células vegetales, y las consecuencias que acarrea el cultivo in vitro en las condiciones genéticas de las plantas.

Comprender las principales aplicaciones del cultivo de tejidos mostrando el aporte que estas técnicas han dado para el desarrollo de la biotecnología agrícola.

Denominación de capítulo 1 Principios, metodologías y técnicas

Denominación de Lección 1 Historia del cultivo de tejidos vegetales

Denominación de Lección 2 Consideraciones básicas para el establecimiento y/o planeación de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

Denominación de Lección 3 Medios de cultivo

Denominación de Lección 4 Propagación in vitro

Denominación de Lección 5 Callogénesis

Denominación de capítulo 2 Principios, metodologías y técnicas 2

Denominación de Lección 6 Cultivo de anteras y polen

Denominación de Lección 7 Obtención y cultivo de protoplastos

Denominación de Lección 8 Cultivo de meristemos

Denominación de Lección 9 Cultivo de embriones y de óvulos

Denominación de Lección 10 Variación somaclonal

Denominación de capítulo 3 Aplicaciones prácticas

Denominación de Lección 11 Bioestadística aplicada al cultivo de tejidos vegetales

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Denominación de Lección 12 Cultivo de especies económicamente

importantes

Denominación de Lección 13 Transgénesis

Denominación de Lección 14 Mejoramiento genético

Denominación de Lección 15 Aplicaciones en bancos de germoplasma

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CONTENIDO DIDÁCTICO UNIDAD 2

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Nombre de la Unidad CULTIVO DE TEJIDOS ANIMALES

Introducción En esta unidad se expondrá el cultivo de tejidos desde el punto de vista del cultivo celular, estudiando las principales técnicas y usos, finalizando con los últimos avances en ingeniería de tejidos. Se tratarán temas como: cultivos primarios, mantenimiento de líneas celulares, hibridomas, cultivos en tres dimensiones, cultivos de alta densidad, líneas inmortales, tejidos artificiales. Los cultivos de células animales tienen aplicación, como técnicas únicas o complementarias de otras, en un gran número de líneas de investigación. De esta forma han sido fundamentales para numerosos avances científicos alcanzados en distintas ramas de las ciencias biomédicas y biológicas. Así por ejemplo, las técnicas de cultivo celular permiten el estudio de las propias células, su metabolismo, el control del ciclo celular, la modulación de la expresión génica, el cultivo de virus, la clonación y el estudio de numerosos aspectos relacionados con el cáncer y su diagnóstico, por citar sólo algunos ejemplos. La ingeniería de tejidos es una disciplina de diseño y construcción de órganos y tejidos para restaurar la función de tejidos perdidos, basada en los principios de la biología molecular del desarrollo y morfogénesis, guiada por la bioingeniería. La ingeniería de tejidos es un área multidisciplinaria que integra principios de ingeniería y de ciencias de la vida, para el desarrollo de sustitutos biológicos, biomiméticos o bioinspirados para la restauración, reparación, regeneración, reemplazo, modificación y ensamblaje de tejidos u órganos funcionales.

Justificación Las técnicas de cultivo de órganos y células animales han posibilitado el estudio de ciertos procesos celulares tales como: replicación y transcripción del DNA, síntesis proteica, metabolismo energético, nutrición, infecciones virales, transformación maligna, acción de drogas, toxicidad, secreción de productos especializados, desarrollo embrionario, y para técnicas de modificación genética, selección clonal, reconstrucción tisular, transgénesis entre otras, desde el ámbito biomédico hasta la obtención de especies y razas animales mejoradas.

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Intencionalidades Formativas Conocer los antecedentes del desarrollo de los

cultivos celulares y comprender las exigencias fisiológicas necesarias para el establecimiento de cultivos de tejidos animales.

Entender las principales limitantes en los cultivos celulares, los métodos para su reconocimiento y cuantificación, y analizar algunas de las aplicaciones del cultivo celular.

Presentar la disciplina de la ingeniería de tejidos como una nueva área de investigación que aún tiene mucho que aportar.


Denominación de Lección 16 Introducción a la técnica del cultivo celular

Denominación de Lección 17 Medios de cultivo

Denominación de Lección 18 El laboratorio de cultivo de tejidos

Denominación de Lección 19 Tipos de cultivos

Denominación de Lección 20 Aislamiento de células para cultivo


Denominación de Lección 21 Contaminación

Denominación de Lección 22 Caracterización y Autenticación

Denominación de Lección 23 Cuantificación celular

Denominación de Lección 24 Transfección

Denominación de Lección 25 Células madre

Denominación de Lección 26 Cultivos celulares de insectos

Denominación de capítulo 6 Ingeniería de Tejidos

Denominación de Lección 27 Materiales en ingeniería de tejidos

Denominación de Lección 28 Fundamentos de la ingeniería de tejidos

Denominación de Lección 29 Biomateriales

Denominación de Lección 30 Aplicaciones y perspectivas

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CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

CAPITULO 1: Principios, metodologías y técnicas 1

Introducción

El cultivo de tejidos vegetales puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser células, tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. En este capítulo veremos la historia del cultivo de tejidos, las necesidades básicas de un laboratorio que se dedique a estas técnicas, los medios nutritivos de cultivo e iniciaremos el estudio de la propagación in vitro.

Lección 1: Historia del cultivo de tejidos vegetales

Desde hace más de 100 años, en las investigaciones de fisiología vegetal se ha utilizado la técnica de cultivo de tejidos, órganos y células vegetales, que consiste en cultivar en medios nutritivos adecuados y en forma aséptica, ápices de raíz y de tallo, primordios de hoja, primordios o partes inmaduras de flores, frutos inmaduros, órganos aislados, embriones maduros o inmaduros, segmentos de órganos de tallo y hoja y algunas veces ovarios, óvulos, anteras y polen.

Los primeros intentos en esta técnica fueron realizados por Sacks (1860) y Knops (1861), quienes observaron que los principales nutrientes de las plantas superiores eran sustancias inorgánicas, y prepararon una solución nutritiva que las contenía. En 1922, Haberlandt y Kotte cultivaron ápices radiculares de chícharo y maíz en un medio enriquecido con sales orgánicas, glucosa, peptona, asparagina y varios aminoácidos, partiendo de la idea de obtener condiciones alimenticias semejantes al del floema. Con la misma idea, Robbins (1922) enriquece el medio de cultivo con glucosa, agar y sales inorgánicas para el cultivo de ápices radiculares de varias especies. El trabajo pionero fue el de White (1934) con cultivo de ápices de raíz de tomate (Licopersicum esculentum) en un medio líquido conteniendo sales inorgánicas, extracto de levadura y sacarosa, en donde obtuvo un crecimiento activo.

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1937 White descubre la importancia de la vitamina B para el crecimiento de

las raíces, importancia que comparte con la auxina AIA (ácido indolacético). Nobecourt y Gautheret en Francia, al igual que White en Estados Unidos (1939), reportan un crecimiento indefinido en tejido de raíz, donde se observa la formación de callosidades sembradas en un medio semisólido. Caplin y Steward (1948) dieron a conocer el efecto tan pronunciado que ejerce la leche de coco en células aisladas de raíces de zanahoria, donde observaron crecimiento de células diferenciadas. Años más tarde, usando la leche de coco en combinación con 2, 4-D promueven la división celular en especies cuyo desarrollo fue muy difícil.

Murashige y Skoog (1962) desarrollaron un medio nutritivo con el que lograron un crecimiento rápido en tejidos de tabaco. En la actualidad, las sales inorgánicas de ese medio de cultivo se usan con bastante éxito en casi todas las especies. Desde el año 1970 se ha realizado un gran número de investigaciones enfocadas a estudios de embriogénesis, organogénesis, hibridación, diferenciación, fitopatología, citología, mutagénesis, producción de metabolitos secundarios y más recientemente, estudios de transformación genética y mejoramiento asistido por marcadores moleculares.

Lección 2: Consideraciones básicas para el establecimiento y/o planeación de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

En la planeación y organización de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales deben tomarse en cuenta, principalmente, las condiciones de asepsia en las que se debe trabajar, así como su funcionalidad por lo cual se puede dividir en áreas separadas según las funciones que se desarrollen en el laboratorio (Figura 1.1). Un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales no es muy distinto de cualquier otro laboratorio de investigación; la diferencia principal estriba en las condiciones de asepsia que se requieren, entendiéndose como asepsia el conjunto de métodos destinados a preservar de gérmenes infecciosos a los cultivos in vitro.

Para lograr un buen control aséptico en un laboratorio de este tipo, el trabajo debe realizarse en diferentes áreas o salas separadas. En la sala de lavado se lleva a cabo la limpieza de la cristalería, que puede incluir además de una lavadora de cristalería, una estufa u horno para el secado de la misma, o en su defecto un fregadero amplio. Debe tener agua caliente y fría, y es aconsejable que posea agua de muy buena calidad, puede ser de desionizador y/o destilador. En esta sala se puede instalar el autoclave para esterilización y también puede contar con un lavadero destinado solamente para el material contaminado, el cual se lleva a la zona de lavado una vez ha sido pasado por el autoclave de material contaminado.

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Figura 1.1 Diferentes áreas de un laboratorio de cultivo de tejidos. Fuente: Roca y Mroginski, 1993

En la sala de preparación de medios y material vegetativo se prepararán los medios de cultivo que serán utilizados en las diferentes fases de desarrollo de los inóculos, al igual que el material vegetativo del cual se tomará el inoculo seleccionado. Debe contar con espacio para gabinete, en los cuales se guardara el material de vidrio y de plástico además de los reactivos. Debe contar con equipos como: balanza gramera y analítica, cronómetro, potenciómeto (medición de pH), refrigerador, congelador, e instalación de gas. También puede contar con incubadora o cámara de crecimiento.

En la sala de siembra y disección se deben tener los máximos cuidados de asepsia, para lo cual se emplean cámaras de flujo laminar de aire (Figura 1.2), utensilios estériles, cubrebocas, cubrecabezas y aire filtrado en la sala; además se debe contar con filtración, microscopio estereoscópico, lupa con lámpara, instalación eléctrica, instalación de gas, gabinetes, instrumentos de disección, lámpara de luz ultravioleta. Las cámaras de flujo laminar deben ubicarse en un lugar alejado de las puertas, con un mínimo de corriente de aire, para prolongar la vida útil de los filtros.

En la sala de incubación deben tenerse muy en cuenta las instalaciones eléctricas, pues las diferentes fases del crecimiento de los inóculos necesitarán diferentes fotoperiodos, temperatura, intensidad lumínica, etcétera. No deben faltar: Aire acondicionado y filtrado, control de temperatura, anaqueles para incubación que preferentemente deben construirse en seis niveles, con 50 cm entre cada nivel. Es conveniente la colocación de los balastros de los bombillos fuera de la sala, un reloj por nivel, termostatos separados para temperatura de día

ALMACÉN

PREPARACION

TRANSFERENCIA

INCUBACIÓN

IN VITRO

OFICINA

BAÑO LAVADO

ESTERILIZACIÓN

OBSERVACIÓN Y EXAMEN TERAPIA Y CONTROL

FITOSANITARIO

CRECIMIENTO IN VIVO

(INVERNADERO) CUARENTENA IN VIVO

CRECIMIENTO IN VIVO (CASA DE MALLA)

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y de noche, apagado automático de temperatura de emergencia para cada sala, lámparas de 2.4 m de longitud, cuando sea posible de luz fría o Gro Lux para 1 000 y 3 000 lux (usar 1 lámpara/60 cm de ancho del anaquel por 1 000 lux), lámparas Power Groove para 10 000 y 30 000 lux (usar 1 lámpara/60 cm de ancho del anaquel por 10 000 lux), y fotoperiodo programable. Esta área debe contar también con un espacio para cultivos en agitación y para cultivos estáticos en oscuridad. Debido al calor generado, pueden necesitarse algunos ventiladores extra en el cuarto o sala. Las áreas de siembre e incubación idealmente son las más alejadas de la entrada y flujo de personas para tratar de evitar contaminaciones.

Figura 1.2 Cámara de flujo laminar. Fuente: Pierik, 1993

En el almacén se guardan los reactivos y la cristalería en existencia. El material debe mantenerse en condiciones de baja humedad relativa y en un lugar no caliente y de preferencia oscuro. El área de observación y examen debe contar con microscopios, estereoscopios, lupas y el material o mobiliario necesario para realizar las observaciones periódicas de los cultivos, tanto en medios semisólidos como en líquidos.

Cuando el laboratorio se dedica a la producción de material elite o producción de material certificado, debe poseer el área de cuarentena. En esta área se debe proteger a las plantas de los insectos, debe estar separada de las demás áreas pero cercana al área de control fitosanitario. En el área de control fitosanitario se realizan las pruebas (serológicas, moleculares, biológicas o microbiológicas) necesarias para comprobar la sanidad vegetal, principalmente de las enfermedades causadas por virus, bacterias y hongos.

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También conocida como área de crecimiento, en el invernadero se lleva a

cabo el endurecimiento de las plantas, el cual se puede realizar gradualmente en macetas o bandejas. Las condiciones del invernadero son importantes, pues es en este lugar donde las plantas se pueden recontaminar o sufrir daños por insectos, roedores, etcétera. Lo más adecuado e indispensable en un invernadero sería: Regulación de luz, tanto en intensidad como en fotoperiodo, regulación de temperatura, control de humedad, pisos de concreto, aire filtrado, exclusión de insectos (mosquiteros), sistema de nebulización, fertilización e irrigación automática, área de almacenamiento para los implementos del invernadero, mezclas de suelos estériles.

Técnicas de esterilización y manipulación asépticas

En un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales las condiciones de esterilidad son de fundamental importancia porque todos los medios empleados contienen nutrientes, los cuales facilitan el crecimiento de muchas bacterias y hongos. El crecimiento abundante de ellos arruinaría el crecimiento de los tejidos vegetales, el cual es mucho más lento. Por lo tanto, el material vegetativo se desinfesta superficialmente antes de iniciar un cultivo in vitro, y todo el manejo de los tejidos se hace en condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar de aire, en áreas específicas para este propósito. Todos los medios, instrumentos y recipientes de cultivo deben esterilizarse para matar las células vegetativas, esporas y otras estructuras reproductivas de los microorganismos causantes de la contaminación de los cultivos.

El método más común de esterilización es el de vapor húmedo, empleando autoclaves que actúan con vapor a presión. En los laboratorios grandes las autoclaves son automáticas o semiautomáticas, eléctricas o de gas, y las hay de tipo horizontal o vertical (Figura 1.3). Generalmente el tiempo empleado para una buena esterilización es de 15 minutos a una presión de 15 lb/in2 (1 kg/cm2) y a una temperatura de 120-121°C. Algunos constituyentes termolábiles del medio de cultivo, como vitaminas, reguladores de crecimiento, urea, etc., deben ser esterilizados empleando un filtro millipore, pues el tipo de membranas de estos filtros retiene a los microorganismos, lográndose un filtrado estéril.

El material vegetativo contiene en su superficie una abundante microflora que debe ser eliminada por medio de una desinfección antes del corte del inóculo. En general se usan soluciones de hipoclorito, de calcio o de sodio, en concentraciones de 0.1 a 2 y 2 a 10%. Usualmente, antes de poner el material vegetativo en contacto con el agente desinfectante, se sumerge en etanol al 70% durante 30 segundos, con lo cual se eliminan las grasas de las hojas y se permite una mejor penetración del agente. La mayoría de los blanqueadores comerciales contienen un agente humectante, pero se recomienda emplear unas gotas de alguno de ellos como detergente líquido, por ejemplo "Tween". Los agentes

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desinfectantes son posteriormente eliminados por varios lavados con agua destilada y esterilizada.

El trabajo se realiza en un área estéril, proporcionada por una cámara de flujo laminar de aire que se ubica en un área independiente, y es esterilizada previamente con luz UV. Una cámara de flujo laminar es un receptáculo en forma generalmente prismática con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde está la superficie de trabajo. La esterilidad de la zona de trabajo se consigue al circular en el interior de la cámara una corriente de aire que ha sido microfiltrada. Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cámara de flujo sin pasar previamente por los filtros, la presión interior es ligeramente superior a la presión exterior, con lo cual el aire siempre circula de dentro hacia fuera y nunca al revés. Existen dos tipos de cámaras de flujo laminar: cámaras de flujo horizontal y cámaras de flujo vertical. En las primeras el flujo se produce desde el fondo de la cámara hasta el frente, de forma que las partículas se mueven horizontalmente a la superficie de trabajo (Figura 1.9). En las segundas, el flujo se produce desde el techo hacia la superficie de trabajo de forma que las partículas se mueven perpendicularmente a ella.

Figura 1.3 Esquema de una cámara de flujo horizontal Fuente: http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/Micropropa/Micvegetal.htm

Lección 3: Medios de cultivo

El crecimiento y desarrollo in vitro de una planta está determinado por factores complejos como la constitución genética de la planta, los nutrientes (agua, macro y micro-elementos, y azúcares), los factores físicos (luz, temperatura, pH, concentraciones de O2 y CO2) y algunas sustancias orgánicas como reguladores,

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/Micropropa/Micvegetal.htm

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vitaminas, etc. La constitución genética es un factor decisivo, pero no es uno los factores que puedan ser estandarizados en laboratorio. Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta y los factores físicos influyen prácticamente en todo tipo de procesos: absorción de agua, evaporación, fotosíntesis, respiración, crecimiento, floración, etcétera. El cuarto factor son las sustancias orgánicas al que pertenecen los reguladores. Los reguladores, en parti-cular las auxinas y citocininas, regulan el desarrollo de los órganos (regeneración) sobre partes de plantas (explantes), cultivados in vitro. La regulación del crecimiento y desarrollo de una planta es un proceso complicado, que depende del genotipo y del medio ambiente, y las interacciones entre genotipo, nutrientes, reguladores y factores ambientales. Un explante, aislado in vitro que crece y se desarrolla, necesita muchas sustancias (figura 1.4). Las sustancias orgánicas, y mezclas poco definidas y extrañas de sustancias que las plantas necesitan in vitro, no son necesarias en el cultivo in vivo, es decir, una planta in vitro es heterótrofa.

Figura 1.4 Sustancias que se añaden con frecuencia a los medios de cultivo para inducir el crecimiento y desarrollo vegetal. Fuente: Pierik, 1993

En términos básicos, para el cultivo in vitro se necesitan: agua, macro y micro-elementos, azúcar como fuente de carbono, y frecuentemente dos grupos de reguladores (auxinas y citocininas). En la actualidad los medios nutritivos se hacen casi siempre a partir de una mezcla de sustancias sintéticas. La elección de un medio depende de la especie con la que se trabaja, la edad de la planta, la edad del órgano, el tipo de órgano que se cultiva, entre otros. Cuando las necesidades nutritivas de una planta no son conocidas, se puede utilizar la mezcla

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de macro- y micro-nutrientes de Murashige y Skoog (1962), siempre que la planta no sea sensible a una alta concentración salina.

Composición

Agua. Representa el 95% del medio, debe ser destilada, y en el caso de trabajar con protoplastos, células o meristemos, se debe utilizar agua bidestilada. Para asegurarse de que se produce un agua destilada de buena calidad, y de forma eficaz, se debe limpiar el aparato de destilación de forma periódica, para evitar los depósitos sobre las paredes, antes de su uso el destilador debe aclararse con agua desionizada. En los últimos años se ha utilizado también agua purificada por osmosis inversa; este sistema se combina con otros métodos como desionización, destilación y filtración. El mejor lugar para almacenar el agua son recipientes de polietileno.

Gelificantes. Cuando se trabaja con medios semisólidos, debe utilizarse un gelificante para darle la consistencia adecuada. Este debe ser no reactivo y no digerible por el tejido vegetal. Los gelificantes más utilizados son el agar y el Gelrite (marca comercial de Merk). El agar es un derivado de un alga marina que aunque se trata de un producto natural, se lava y purifica durante su elaboración. Generalmente se utiliza a una concentración de 0,6-0,8%. Cuando se cultivan protoplastos o células aisladas se utiliza un agar de gran pureza como la agarosa. El Gelrite es un agente gelificante altamente purificado. Se puede usar a una concentración de aproximadamente la mitad de la que se usa para el agar; para el cultivo de tejidos vegetales se recomienda una concentración del 0,2%.

Fuente de carbono. Los tejidos in vitro tienen una capacidad fotosintética muy baja o nula, por lo que se les debe proveer de una fuente de carbono orgánico. Generalmente se usa una concentración de 1-5% de sacarosa. También se pueden utilizar glucosa y fructosa. La sacarosa (azúcar) que se vende en los supermercados resulta generalmente adecuada pues se trata de un producto purificado. La sacarosa además de servir como fuente de carbono, tiene un papel importante como regulador osmótico del medio de cultivo.

Nutrición mineral. Después de los azúcares, los minerales constituyen el grupo más importante de sustancias nutritivas en el cultivo in vitro. Existe una gran cantidad de posibilidades para las mezclas de macro y micronutrientes, siendo uno de los más usados el de Murashige y Skoog (1962). Los macroelementos que pueden ser incluidos en los medios son N, P, K, Ca, Mg, S, y microelementos son Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I, que deben estar en una proporción adecuada según la planta elegida. Generalmente se utilizan soluciones madre concentradas para la preparación de los medios nutritivos, las cuales se deben almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad.

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Vitaminas. Se pueden usar dos vitaminas, la tiamina (vitamina B1) que

parece ser la única realmente necesaria para el desarrollo de las plantas, y el mioinositol (una vitamina B).

Otro factor que se debe tener en cuenta es el pH. Se supone que el pH en el rango 5,0-6,5 es apto para el crecimiento, con un máximo alrededor de 6,0. El pH varía con el autoclavado, si se parte de un pH en el rango 5,0-7,0, generalmente sufre un descenso de 0,3-0,5 unidades.

Preparación

Los medios nutritivos se deben preparar como se indica a continuación: Se coloca un matraz sobre la unidad calefactora. Si se quiere preparar 600 ml de medio nutritivo, se deben calentar 550 ml de agua. Se añade la cantidad de azúcar necesaria (mientras se realiza esta operación, se debe retirar el matraz de la manta calefactora). Añadir los macro y micro-nutrientes y luego las auxinas y/o citocininas u otros componentes. Mezclar las sustancias bien, hasta su completa disolución y hacer hervir el medio. Añadir el agar necesario, utilizando un embudo, teniendo cuidado de que después de cada adición no se formen grumos o espuma. También se puede mezclar previamente en un vaso, el agar con agua fría, y posteriormente añadir esta mezcla al medio. El agar no se debe añadir al agua, cuando ésta está hirviendo, ya que, en este caso, se puede producir un recocido del medio de efectos negativos. Se ajusta el pH (con papel tornasol o potenciómetro) y se lleva al volumen final. Con este medio se llenan los recipientes elegidos.

Reguladores de crecimiento vegetal

El término "regulador del crecimiento vegetal", define a los compuestos orgánicos distintos de los nutrientes, que en pequeñas cantidades estimulan, inhiben o modifican procesos fisiológicos en las plantas. El crecimiento en las plantas es un proceso dinámico, complejo y está rigurosamente controlado; actualmente se reconoce que la mayor parte (si no la totalidad) de la actividad fisiológica de las plantas está mediada por los reguladores del crecimiento, los cuales son sustancias mensajeras, la mayoría de las veces activas en muy pequeñas cantidades, y que pueden influir en múltiples procesos, totalmente distintos al mismo tiempo y en partes diferentes de la planta. Los reguladores de crecimiento vegetal se clasifican en cinco tipos básicos dependiendo de su estructura química y su efecto fisiológico: los promotores del crecimiento incluyen a auxinas, citocininas y giberelinas; los inhibidores del crecimiento como el ácido abscísico; y el etileno. También se han aislado y estudiado otras substancias, que podrían ser consideradas como reguladores, como por ejemplo las poliaminas, jasmonatos, ácido salicílico y los brassinoesteroides.

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Auxinas. Las auxinas son un grupo de compuestos derivados comúnmente

del triptófano, sintetizados por generalmente por los ápices, y están implicados en varios eventos relacionados al crecimiento y diferenciación celular. En muchos casos, estas otras sustancias son índoles, muy relacionados químicamente con el AIA (ácido indol acético). De forma natural, las concentraciones más altas de auxinas se encuentran en los ápices de crecimiento. Se ha comprobado que las auxinas actúan de modo diverso en el crecimiento por alargamiento celular, como es incrementando el contenido osmótico de la célula y la permeabilidad al agua, reduciendo la presión de la pared o aumentando la síntesis de RNA, proteínas específicas (enzimas) y aun de la misma pared, lo que provoca un aumento en la plasticidad de la pared celular, que trae como consecuencia su extensión y con ello un crecimiento por alargamiento. Actualmente se conocen y utilizan varios compuestos sintéticos con actividad auxínica, como los ácidos fenoxiacéticos, que son utilizados como herbicidas. Otro ejemplo de auxina artificial es el 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), el ácido naftalenacético (ANA) y el ácido 4-amino-3,5,6-tricloropiridin-2-carboxílico (Picloram).

Citocininas. Las citocininas generalmente son derivados de la adenina y son sintetizadas en tejidos jóvenes y raíces. Poseen dos propiedades útiles en el cultivo de tejidos vegetales: estimulan la división celular y rompen la latencia de las yemas axilares haciéndolas brotar. Las citocininas, combinadas con auxinas, estimulan la división celular en plantas, interactuando en la determinación de la ruta que seguirá la diferenciación celular. Las respuestas que pueden esperarse de un tejido ante un balance de auxinas/citocininas se muestra en la figura 1.5, pero pueden presentarse variaciones notables entre especies y tejidos. En general, las citocininas están ampliamente difundidas en las plantas. Las citocininas naturales más comunes son la zeatina, la isopentiladenina (2iP) y el ribósido de zeatina. Las citocininas sintéticas benciladenina (BA) y cinetina (6-furfuril-aminopurina) son las más utilizadas en los cultivos in vitro.

Figura 1.5 Respuestas generadas en los cultivos in vitro por las auxinas y citocininas. Fuente: Martin et al, 1999

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Giberelinas. Las giberelinas son un grupo de reguladores del crecimiento,

formadas de diterpenos. La primera giberelina purificada y estructuralmente identificada fue el ácido giberélico (GA3); posteriormente se han aislado todas las demás (más de 40), tanto de plantas superiores como de hongos. Las giberelinas se encuentran presentes en muchas partes de las plantas, pero se encuentran principalmente en las áreas de crecimiento activo, como en embriones o tejidos meristemáticos. La elongación producida por las giberelinas no es igual a la producida por las auxinas, ni actúan de la misma forma en diferentes partes de la planta. Pero se pueden obtener resultados sinérgicos al hacer aplicaciones de los dos reguladores al mismo tiempo. En la tabla 1.1 se realiza una comparación de los principales efectos producidos por estos reguladores de crecimiento.

TABLA 1.1 COMPARACIÓN DE EFECTOS ENTRE AUXINAS Y GIBERELINAS

EFECTOS PRINCIPALES AUXINAS GIBERELINAS

Transporte polar Sí No

Estimula la formación de callo Sí No

Estimula el alargamiento celular No Sí

Estimula la iniciación radicular Sí No

Retarda la abscisión foliar Sí No

Estimula el crecimiento de plantas de tipo enano No Sí

Estimula la germinación de las semillas No Sí

Inhibe las yemas laterales Sí No

Induce partenocarpia en frutos sí sí

Fuente: Hurtado, 1987.

Ácido abscísico (ABA). Es un compuesto derivado del ácido mevalónico y se caracteriza por inhibir muchos fenómenos de crecimiento en las plantas superiores. La biosíntesis del ABA tiene lugar en frutos, semillas, raíces, hojas y tallos. Este regulador está implicado en numerosos procesos de gran importancia en el desarrollo de los vegetales, como: regulación de la apertura estomática, dormición de yemas y semillas, abscisión de hojas y frutos, inhibición de la síntesis de RNA y proteínas, inhibición del crecimiento de muchas partes de la planta (hipocótilos, radículas, hojas, raíces, etc).

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Lección 4: Propagación in vitro

Propagación clonal in vitro

Actualmente el código oficial de la nomenclatura de las plantas cultivadas define la palabra clon como: "un conjunto genéticamente uniforme de individuos (que pueden ser de naturaleza quimérica) originalmente derivados de un solo individuo mediante propagación asexual; por ejemplo, por medio de estacas, divisiones, injertos o apomixis obligada. Los individuos propagados a partir de la mutación perceptible de una yema forman un cultivar diferente de la planta progenitora".

Existen varias vías generales para realizar la multiplicación clonal, entre ellas están:

- Multiplicación de brotes de yemas terminales, axilares o laterales.

- La organogénesis directa. Formación de brote adventicio o de raíz en el explante de un órgano extraído de una planta.

- La organogénesis indirecta. La formación del brote adventicio o de la raíz ocurre en este caso en el callo.

- La embriogénesis somática. Los embriones pueden formarse directamente en explante primario, o indirectamente de las células cultivadas en suspensión o en un medio semisólido

- Los órganos de perennidad, formados en cultivos asépticos. Como microtubérculos en papa y ñame.

- El microinjerto

- El cultivo de embriones y esporas

En la figura 1.6 se muestra esquemáticamente algunas de estas vías y también puede apreciarse que la respuesta de un tejido al cultivo in vitro depende de la interacción entre el explante, el medio y las condiciones del cultivo.

La propagación in vitro se puede dividir en cinco etapas, que pueden sobrelaparse entre sí, las cuales son: iniciación o establecimiento, multiplicación (de brotes), enraizamiento, endurecimiento (adaptación paulatina a condiciones de invernadero), y etapa inicial, que comprende la selección de la planta madre y la selección de una modalidad de pretratamiento para volver funcional la estrategia que se adopte.

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Figura 1.6 Principios del cultivo de tejidos y algunas vías de multiplicación clonal. Fuente: Martin et al, 1999

Micropropagación

El concepto original de cultivo de tejidos vegetales se ha extendido modernamente para abarcar tanto el cultivo aséptico de tejidos como el de células y órganos, dentro de un grupo de técnicas que se fundamentan en varios principios. Entre estos principios, los más importantes son la plasticidad y la totipotenciaIidad celular. Las plantas deben adaptarse a muchas condiciones ambientales, debido a su naturaleza sésil y sus largos tiempos de vida. Esta plasticidad les permite a las plantas modificar su metabolismo y desarrollo de acuerdo a las necesidades impuestas por el ambiente. Es así como tienen la capacidad de iniciar división celular en cualquier tejido (a partir de unas pocas células o una pequeña parte del tejido), y regenerar órganos completos.

Se llama explante al órgano, tejido o segmento de tejido vegetal que va a ser utilizado para iniciar un cultivo. Existen diferentes factores que determinan el éxito en los sistemas de micropropagación, como son la elección del explante, la elección del medio y condiciones del cultivo y las condiciones asépticas. El estado

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fisiológico de la planta que dona el explante (planta madre) influye significativamente en su capacidad morfogenética. Asimismo, se ha observado que la edad fisiológica del explante tiene gran influencia en la morfogénesis. Se sabe que mientras más joven y menos diferenciado esté el tejido que se va a sembrar, mejor será la respuesta in vitro. El medio de cultivo junto con el explante determinarán las respuestas que se obtendrán del mismo, por lo cual es un paso muy importante la elección del medio más adecuado. También es crucial considerar las condiciones físicas del cultivo (luz, fotoperiodo, temperatura y humedad) pues contribuyen a la respuesta que se obtenga del explante.

Lección 5: Callogénesis

Se le denomina tejido calloso a una masa amorfa de células vegetales poco diferenciadas y de rápida proliferación. En condiciones naturales este tejido aparece como un mecanismo de cicatrización cuando se presentan heridas o en tumores (agallas) inducidos por organismos fitopatógenos. La aparición natural de tejido calloso se da como consecuencia de un cambio en los niveles endógenos de reguladores del crecimiento, principalmente auxinas y citocininas.

Se puede definir el callo en cultivo de tejidos como un tejido obtenido por medio del aislamiento de órganos o tejidos diferenciados, los cuales posteriormente son llevados a una desdiferenciación celular, presentando estas células una proliferación continua, acelerada y de apariencia desorganizada, que da origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa celular puede presentar diferentes tipos morfológicos, los cuales varían según la apariencia externa, textura y composición celular, pero por lo general son heterogéneos en su composición celular. La coloración de este tejido también varía, aun derivando de la misma especie (se pueden presentar callos que carecen de pigmentación, mientras otros pueden ser de diferentes tonos de verde, amarillo, café o rojo) (figura 1.7). El tipo y grado de pigmentación está influenciado por factores nutricionales y ambientales, y se manifiesta por la presencia de clorofila, carotenos, antocianinas, etc.

Figura 1.7 Callos de crisantemo. A. Callo amarillo embriogénico. B. Callo friable blanco. C. Callo friable rojo. D. Callogénesis y caulogénesis. Fuente: Teixeira da Silva y Fukai, 2003.

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El callo está generalmente constituido por una alta proporción de células en

las que las vacuolas son predominantes, similares a las células del parénquima; el callo también contiene pequeñas zonas de células en división. Estas zonas de división de células diferenciadas o desdiferenciadas generalmente se presentan dando origen a las masas amorfas de tejido aparentemente desorganizado.

Una de las propiedades importantes del tejido calloso es la llamada friabilidad, esta se puede definir, como la tendencia de las células a separarse unas de otras, por cual un callo friable es aquel que se disgrega con facilidad. Desde el punto de vista morfogénico, la característica más importante del callo es la totipotencialidad de sus células, ya que, en general, con un manejo adecuado de las condiciones nutricionales, hormonales y ambientales, tienen la capacidad de desarrollar brotes, raíces, embriones, etc., los cuales pueden llegar a formar plántulas completas.

Un serio problema asociado con este tejido es el daño o modificación de la citología nuclear de las células durante el cultivo. Se pueden presentar aberraciones cromosómicas, mutaciones puntuales y diferentes tipos de ploidías, así como irregularidades cariocinéticas. Estas anormalidades generalmente se incrementan conforme aumenta la edad de cultivo, además de que la proporción con la que se presentan tales cambios está relacionada con la composición del medio y con la especie vegetal con la que se esté trabajando; sin embargo, los cambios cromosómicos pueden ocurrir a partir del inoculo inicial. Esta inestabilidad cromosómica es el obstáculo principal en la utilización del callo en estudios de genética y fitomejoramiento vegetal.

Inducción del tejido calloso

La inducción del callo a partir de una porción vegetal sucede cuando el inoculo ya estéril se pone en contacto con un medio de cultivo que induzca y mantenga un crecimiento y una división celular continuas. Dependiendo del inoculo, la proliferación del callo se puede iniciar casi a partir de cualquier órgano vegetal (hoja, raíz, polen, embriones, semillas, etc.) o sus partes. En general, los callos derivados de embriones y plántulas tienen un mayor potencial para la morfogénesis. También es importante el estado fisiológico y la edad de la planta donadora del callo, siendo recomendable utilizar plantas jóvenes y con crecimiento activo, aunque se pueden obtener buenos resultados con plantas adultas. El tamaño y la forma del inoculo generalmente no son cruciales, aunque es recomendable utilizar fragmentos de tejidos que contengan gran número de células (5.0 a 10.0 mm2), pues con ello se incrementa la posibilidad de éxito en el cultivo.

Por sí mismos los vegetales tienen un potencial endógeno para la formación del callo, pues en su medio natural, al sufrir una lesión en un órgano, ésta es reparada por este tejido. De especie a especie se presenta una variación en esta

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capacidad, misma que se refleja en la respuesta in vitro a la inducción del callo, encontrándose así tejidos para los que la inducción del callo necesita de una auxina o un regulador del crecimiento relacionado; otros requieren sólo una citocinina o un suplemento, tanto de auxina como de citocinina, o bien, sólo responden en presencia de extractos de complejos naturales en el medio. En general, las auxinas y los reguladores del crecimiento más usados en la iniciación y mantenimiento del cultivo de callo son el ácido indol-3-acético (AIA), ácido naftalen acético (ANA) y el ácido 2, 4-diclorofenoxiacético (2,4-D), encontrándose para cada especie, una auxina o un regulador del crecimiento y una concentración óptima para la inducción y mantenimiento del callo.

Mantenimiento del tejido calloso

Por lo general, el callo toma de 3 a 8 semanas para alcanzar el tamaño suficiente para efectuar un subcultivo, transfiriéndose en éste pequeñas piezas de tejido (50 a 150 mg) a medio nuevo. Es importante transferir fragmentos de tejido visiblemente sano (sin contaminación por hongos ni bacterias, sin necrosis, etc.), y cuando esté establecido, es necesario cambiarlo a medio nuevo con una frecuencia que varíe de 2 a 6 semanas, ya que la falta de transferencia lleva irremediablemente al debilitamiento, intoxicación y muerte del tejido. Esto es debido a que el crecimiento y la multiplicación celular son tan intensos que provocan el gasto de los nutrientes del medio, y la acumulación de metabolitos de desecho celular puede llegar a ser tan alta que se vuelven tóxicos para el tejido.

Un callo puede formar brotes, raíces, embrioides, etc., o simplemente continuar proliferando como callo, dependiendo de las cantidades relativas de auxinas y citocininas suministradas. Cuando la proporción de citocininas con respecto a las auxinas es mayor se inician yemas de brote. Proporciones similares de los dos grupos hormonales pueden producir el incremento del callo; un balance a favor de las auxinas inducirá el inicio de primordios radiculares. Esto es norma general, pero no siempre se cumple. Por otra parte, los efectos sinergéticos de las hormonas pueden ser modificados por otros factores, como son los constituyentes del medio (azúcar, vitaminas, aminoácidos, etc.) y las condiciones físicas (ilumi-nación, consistencia del medio, etc.), aunque siempre se manifestará como factor dominante el balance hormonal.

El cultivo del callo se puede dividir en las etapas siguientes (figura 1.8):

a) Inducción, donde las células del inóculo inicial comienzan su crecimiento.

b) Proliferación celular y aumento de masa celular.

c) Inducción de la diferenciación, donde se obtienen meristemos, tanto apicales

como radiculares, embrioides, tejido vascular, etc.

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d) Envejecimiento y pérdida de la capacidad de crecimiento acelerado.

Figura 1.8 Representación esquemática del cultivo de callo. Fuente: Pierik, 1993 (modificado)

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Introducción

La utilización de cultivos de tejidos in vitro tiene aplicaciones en estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica, producción de compuestos útiles, incremento de la variabilidad genética, propagación, obtención de plantas libres de patógenos y conservación de germoplasma. Es necesario conocer las metodologías por las cuales se pueden realizar estas actividades, teniendo en cuenta que la elección del tipo de explante y el sistema de cultivo que se emplee son factores cruciales. En el presente capitulo continuaremos estudiando los diferentes sistemas de cultivo que existen para la micropropagación vegetal como son el cultivo de anteras y polen, la obtención de protoplastos, el cultivo de meristemos y el cultivo de óvulos; también se tendrá en cuenta la variación que se da en los materiales sometidos a cultivo in vitro y las potencialidades de esta.

Lección 6: Cultivo de anteras y polen

Una de las aplicaciones más interesantes del cultivo de tejidos vegetales es la generación de plantas haploides mediante el cultivo de anteras y polen mediante la inducción de la embriogénesis a partir de microesporas o de granos de polen inmaduros. Al contener la mitad del número cromosómico, las plantas haploides pueden emplearse en programas de fitomejoramiento para seleccionar características deseables, o bien, para desarrollar líneas homocigóticas para la producción de híbridos en especies incompatibles entre sí.

Los granos de polen de las angiospermas son el producto del proceso llamado microesporogénesis, que abarca toda la secuencia del desarrollo, desde la célula madre hasta la maduración del grano de polen.

Para la obtención de plantas haploides pueden utilizarse como explantes las anteras completas o bien las microsporas aisladas. Existen diferentes factores que determinan la respuesta de estos tejidos así como la eventual regeneración de plantas a partir de ellos. En cuanto al estado fisiológico y edad de la planta donadora de las anteras o microsporas, las plantas madre deben ser vigorosas y estar libres de cualquier tipo de estrés ambiental o problema fitopatológico. Salvo en muy raras ocasiones, el polen maduro no responde al cultivo, por lo que debe ser colectado en cierto estadio de desarrollo antes de su maduración. Por lo gene-ral el polen colectado durante la primera división mitótica de las microsporas uninucleadas es el que tiene una mayor capacidad de desarrollo in vitro. Se recomienda así mismo realizar un pretratamiento, el más recomendable es con frío, es decir, colocar los botones a 5-8°C por 7-10 días. Este tratamiento con frío

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tiene un efecto sincronizador en el desarrollo del polen lo cual resulta benéfico al momento de obtener el cultivo.

Para la inducción de la embriogénesis pueden cultivarse directamente las anteras aisladas en un medio con agar o en un medio líquido, provocándose la embriogénesis dentro de la antera, o puede aislarse el polen de la antera, mecánica o naturalmente, y se cultiva en un medio líquido. Las plántulas haploides emergen de las anteras cultivadas entre tres y ocho semanas después. En la figura 1.9 se muestra el procedimiento general para la obtención de plantas haploides o dihaploides. Se ha establecido que la célula generativa es la más importante para la androgénesis. Es importante determinar el número cromosómico de las nuevas plantas formadas, ya que dependiendo del desarrollo que haya conducido a la formación de embrioides puede existir una variación considerable en los niveles de ploidía. Se pueden originar plantas diploides heterocigóticas a partir de tejido de antera o a partir del desarrollo de las células madre de la microespora.

Figura 1.9 Proceso general para la obtención de plantas haploides o dihaploides. Fuente: Martin et al, 1999.

Lección 7: Obtención y cultivo de protoplastos

El protoplasto es la unidad homeostática básica de la célula en la que no está involucrada la pared celular (Figura 1.10). El aislamiento y fusión de protoplastos es importante en el cultivo de tejidos vegetales, ya que permite

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estudios de fitomejoramiento y de hibridación somática, así como estudios básicos de embriología vegetal. Una de las características que hacen importante el cultivo de protoplastos es que, por estar aislado del conjunto de células, cada protoplasto puede ser usado como un sistema celular individual. Los protoplastos han sido aislados a partir de múltiples especies y de casi todas las partes vegetales, siendo la mejor fuente las hojas en estado juvenil y con un crecimiento activo.

Figura 1.10 Protoplastos aislados de Arabidopsis thaliana Fuente: http://genetics.mgh.harvard.edu/ausubelweb/labmembers/index.html

La operación fundamental en el aislamiento de los protoplastos es la remoción de la pared celular sin causar daño. Para ello existen en la actualidad dos métodos, el mecánico y el enzimático. En el método mecánico se sumerge el tejido en una solución hipertónica, provocando plasmólisis, se secciona el tejido y se liberan los protoplastos. Así se evita el daño metabólico causado por el uso de enzimas, pero se obtiene una cantidad pequeña de protoplastos, además de que se segregan desechos citoplásmicos de las células dañadas por el corte.

El procedimiento más usado para aislar protoplastos es el método enzimático, y consiste en tratar al tejido con una mezcla de enzimas degradantes de la pared, que en general son celulasas, hemicelulasas y pectinasas, con estabilizadores osmóticos. Presenta varias ventajas como son la de obtener un mayor número de protoplastos por unidad de tejido y el impedimento de que las células se rompan, como sucedería con el método mecánico, con lo cual se evita la intoxicación causada por los desechos de la degradación celular.

Después del aislamiento los protoplastos son suspendidos en medios de cultivo apropiados (generalmente líquidos) para mantener su viabilidad e integridad estructural. Estos medios de cultivo están constituidos por los mismos elementos que los cultivos celulares normales; sin embargo, es necesario adicionarles estabilizadores osmóticos, como azúcares alcohólicos (manitol y/o

http://genetics.mgh.harvard.edu/ausubelweb/labmembers/index.html

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sorbitol). En la figura 1.11 se presenta un método general para el aislamiento y cultivo de protoplastos.

Figura 1.11 Procedimiento para aislar y cultivar protoplastos Fuente: Martin et al, 1999

Los protoplastos son muy utilizados en una técnica denominada fusión de protoplastos en donde se produce un híbrido somático cuando se fusionan las membranas de dos o más células. Se puede dar por fusión espontánea, que se presenta durante la fase de aislamiento, pudiendo presentarse células alodiploides aun antes de la fusión inducida, y se presenta cuando el aislamiento se efectuó durante el proceso de división, siendo más probable cuando éstos provienen de cultivos celulares con una división rápida. La fusión inducida por su parte requiere de un agente inductor, como nitratos, mezclas de sales, soluciones de polietilénglicol, gelatina, fosfolípidos, etc. Una de las razones por las que los protoplastos libres en el medio no se fusionan es la polaridad de la membrana, por lo que existe una repulsión entre célula y célula. Un requerimiento primario para la fusión es la reducción de este rechazo para que los protoplastos se acerquen entre sí y las membranas celulares entren en contacto íntimo. De todos los agentes inductores de la fusión, el polietilénglicol (PEG) es el más usado, e induce, en altas concentraciones, una adhesión tan fuerte de agregados celulares que estas células pierden su forma esférica, apreciándose alargadas y constreñidas.

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Las células hibridas obtenidas de la fusión pueden ser cultivadas e

inducidas a la división, regenerándose plantas a partir de ellos. Pero debido a que las células verdaderamente híbridas crecen mezcladas con las demás células, es necesario valerse de herramientas genéticas y/o de biología molecular para identificarlas. La técnica de fusión de protoplastos fue muy prometedora en sus comienzos, pero fue desplazada por las técnicas de ingeniería genética que permiten la transferencia de material genético con mayor control. Aún así, el aislamiento y cultivo de protoplastos sigue siendo un campo importante dentro del cultivo de tejidos vegetales.

Lección 8: Cultivo de meristemos

En los primeros estadios del desarrollo embrionario vegetal la división celular tiene lugar en todo el organismo, pero a medida que el embrión se desarrolla y se transforma en una planta adulta la adición de nuevas células se restringe a ciertas partes de la misma, mientras que el resto de la planta se especializa en otras actividades específicas. Estos grupos de células que retienen su actividad embrionaria durante toda la vida de la planta se denominan meristemos. Los meristemos incluyen meristemos de raíz, de tallo (principales y laterales) e intercalares, así como también el engrosamiento de meristemos primarios y meristemos secundarios, como lo son el felógeno y el cambium. El meristemo apical de tallo da lugar a diversos tipos de células, tejidos y órganos.

Los meristemos apicales han sido los inóculos más efectivos para la producción de plantas completas en una amplia gama de cultivos económicamente importantes. Si se cultivan en un medio adecuado, los meristemos pueden regenerar plántulas completas más rápidamente que los tejidos de otras fuentes; las plantas regeneradas usualmente retienen las características genéticas de los progenitores, lo que se debe a la naturaleza diploide de las células meristemáticas. Además, dado que los meristemos son tejidos no diferenciados, entonces el paso de desdiferenciación celular se obvia en estos casos y se va directamente a la diferenciación celular (figura 1.12).

Algunas de las ventajas de este tipo de cultivo son:

- Es un sistema ideal para la propagación clonal, pues ofrece la máxima estabilidad genética.

- El sistema es relativamente sencillo y muy similar en todas las especies vegetales y no requiere demasiada experimentación para hallar las condiciones adecuadas, sin embargo el crecimiento puede ser lento.

- Al combinarlo con otras técnicas (termo o quimioterapia) permite la obtención de plantas libres de patógenos.

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- Es el sistema ideal para la conservación in vitro de germoplasma.

Y algunas de las principales desventajas son:

- Alta sensibilidad a la esterilización superficial, donde los tejidos pueden resultar lesionados.

- En las plantas leñosas, los meristemos producen gran cantidad de compuestos fenólicos que pueden afectar el medio y las condiciones de cultivo.

- Se puede presentar vitrificación.

Figura 1.12 Sistema de propagación por cultivo de meristemos o yemas Fuente: Martin et al, 1999

El cultivo de meristemos se ha empleado ampliamente por propagadores comerciales, debido al potencial morfogenético que tienen los meristemos y otros tejidos de la planta en la producción masiva de brotes de especies económicamente importantes. La multiplicación masiva produce material vegetal in vitro por la iniciación de brotes adventicios, bulbos, tubérculos, embriones asexuales o por crecimiento de brotes de yemas axilares a partir de meristemos.

En muchas especies es deseable producir plantas libres de virus, hongos y bacterias, para ser liberadas comercialmente, lo cual puede lograrse con tratamientos con calor de varios órganos in vitro, o de plantas compuestas, así como con la aplicación de productos químicos. Actualmente la alternativa de más

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éxito es el cultivo de meristemos apicales combinada con termoterapia, o aplicación de altas temperatura, y la quimioterapia, o aplicación de productos químicos al medio de cultivo. En la figura 1.13 se muestra un esquema representativo de cómo se puede llevar a cabo un programa de producción de plantas libres de virus a nivel comercial. La selección de la planta madre es muy importante, ya que las plantas que se van a obtener son idénticas al progenitor (propagación asexual). Si la planta madre se encuentra enferma, sería deseable conocer el virus específico presente, pues así las condiciones de cultivo varían, aplicándose termoterapia, quimioterapia o simplemente cultivo de meristemos. El tamaño del inoculo también es importante, pues se tienen meristemos que miden de 0.01 a 0.1 mm de diámetro, y ápices de tallo que miden de 0.1 a 3.0 mm de diámetro; generalmente el número de plántulas libres de virus producidas es inversamente proporcional al tamaño del meristemo o ápice cultivado.

Figura 1.13 Producción de plantas libres de virus a partir de cultivo de meristemos. Fuente: Hurtado, 1987. (modificado)

Lección 9: Cultivo de embriones y de óvulos

El cultivo de embriones consiste en el aislamiento y crecimiento, in vitro, en condiciones estériles, de un embrión inmaduro, con el fin de obtener una planta viable (Figura 1.14). Existen dos tipos de cultivo de embriones. El cultivo de embriones inmaduros que se originan en semillas no acabadas de madurar, y que se utiliza sobre todo para impedir el aborto embrionario (muerte prematura del embrión), y obtener una planta viable. Este tipo de cultivo es difícil, en parte porque se necesita una ardua disección, y también porque se necesita un medio

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nutritivo complejo. El cultivo de embriones maduros que se encuentran en semillas maduras es un tipo de cultivo relativamente fácil, y se utiliza para eliminar la inhibición de germinación de las semillas. Suele ser suficiente en estos casos el uso de un medio nutritivo simple, con agar, azúcar y minerales. Debido a que los embriones son a veces difíciles de diseccionar se pueden realizar cultivos de ovario o de óvulos, cuyo medio de cultivo es mucho menos complicado que el que se necesita para el cultivo de embriones. Recientemente se ha introducido el término más general, de cultivo de embriones en óvulos, en lugar de cultivos de óvulo, ovario y óvulo fertilizado.

Figura 1.14 Cultivo de embriones de cebada y de palma Fuente: Pierik, 1993 y http://www.cesaf.uchile.cl/cesaf/n11/2.html

Los factores de los que depende el desarrollo de una planta viable, a partir de un embrión, incluyen:

1. Genotipo y estado de desarrollo del embrión en el momento del aislamiento: Cuanto más desarrollado esté un embrión in vivo, más fácil resulta su cultivo in vitro.

2. Las condiciones de crecimiento de la planta madre: La mejora del desarrollo de la planta madre, en condiciones controladas en un fitotrón, generalmente produce un mejor desarrollo del endospermo, y, por consiguiente, mejor crecimiento de los embriones aislados.

3. Composición del medio nutritivo: Los embriones inmaduros tienen unas necesidades mucho más críticas, en cuanto a la composición del medio nutritivo, que los embriones maduros. Sin embargo, tanto los embriones maduros como los inmaduros necesitan macro y microelementos, y azúcar. Los embriones maduros se cultivan generalmente sobre un medio con sacarosa al 2-3%; mientras que los

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embriones inmaduros tienen un mejor comportamiento con concentraciones más elevadas (8-12%).

4. Factores ambientales: En algunas ocasiones, las necesidades de oxígeno de los cultivos de embriones son superiores a las concentraciones que normalmente se encuentran en el aire. A veces los embriones aislados necesitan ser cultivados en la oscuridad, durante 7-14 días, pudiendo luego ser transferidos a la luz, para permitir la formación de clorofila. Normalmente se utiliza una temperatura relativamente alta (22-28 °C) para el crecimiento y un tratamiento de frío (4 °C) puede ser necesario para romper la dormición.

Aplicaciones del cultivo de embriones

Las aplicaciones prácticas más importantes del cultivo de embriones se indican a continuación:

1. Eliminar la inhibición (absoluta) de germinación de las semillas en algunas especies.

2. Germinación de semillas de plantas parásitas: la cual resulta imposible in vivo sin la presencia del huésped.

3. Acortar el ciclo de mejora: Existen muchas especies que presentan dormición seminal, la cual frecuentemente se localiza en la cubierta de la semilla y/o en el endospermo. Aislando los embriones se puede producir una germinación inmediata.

4. Producción de haploides: Como se estudió en la lección de cultivo de anteras, es posible obtener plantas haploides a través del cultivo de óvulos y ovarios. En algunos caso, inclusive es posible la obtención de haploides al realizar cruces híbridos, pues en estos cruces uno de los juegos de cromosomas es eliminado dado que son incompatibles, así el embrión hibrido es haploide de una de las especies involucradas en el cruce, pero este embrión sobrevive solo gracias al cultivo in vitro, de lo contrario sería abortado.

5. Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad: En el caso de cruces interespecíficos, intergenéricos, y en el caso de cruces por ejemplo entre diploides y tetraploides, el endospermo puede no desarrollarse o hacerlo muy pobremente. El resultado es el aborto embrionario in vivo, que puede ser evitado exclusivamente por el cultivo de embriones. El cultivo de embriones se emplea también en los cruces entre diploides y tetraploides (que producen triploides con un endospermo muy poco desarrollado).

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6. Propagación vegetativa: Los embriones se utilizan como un material ini-

cial, para la propagación vegetativa, por ejemplo en las Gramíneas y Coníferas. Los embriones responden muy bien, debido a que se trata de un material juvenil.

Lección 10: Variación somaclonal

Es un hecho que ocurren modificaciones genéticas en las células y los tejidos cultivados in vitro. Muchas de estas modificaciones se manifiestan como mutaciones heredables a las progenies de las plantas regeneradas. Este fenómeno se conoce como variación somaclonal. Las observaciones hechas indican que esta variación, que se recupera en las plantas regeneradas, resulta tanto de las diferencias genéticas que preexisten en las células somáticas del explante como de efectos inducidos por los componentes del medio de cultivo.

A diferencia de otros procesos de variación genética, se ha encontrado variación somaclonal en la progenie del 15% de las plantas regeneradas; la tasa de ocurrencia de mutaciones espontáneas, por ejemplo, es sólo de una en un millón. La variación somaclonal es superior también al mejoramiento por mutaciones inducidas puesto que en las plantas regeneradas que derivan de células individuales, la ocurrencia de mosaicos es mínima. La regeneración de plantas actúa como un filtro que elimina casi todos los cambios deletéreos.

Es necesario entender los mecanismos que dan lugar a la inestabilidad genética durante el cultivo de tejidos, por razones de orden práctico. En primer lugar, la variación somaclonal es deseable para aumentar la ocurrencia de variabilidad en el mejoramiento de plantas; es además importante donde la uniformidad de las plantas obtenidas del cultivo de tejidos sea esencial, como en la micropropagación rápida; es importante, en tercer lugar, para la conservación del germoplasma in vitro.

Varios análisis han revelado un amplio espectro de eventos mutacionales que ocurren durante el cultivo de tejidos. Son ellos, por ejemplo, los mutantes que obran como clásicos mutantes mendelianos; los cambios genéticos que afectan caracteres controlados por familias multigenicas y que influyen en determinados rasgos poligénicos; y los cambios que resultan de la aparición de elementos trasponibles. La poliploidía y la aneuploidia, por su parte, son variantes que ocurren frecuentemente a consecuencia de reordenamientos cromosómicos, tales como duplicaciones, deficiencias, traslocaciones, y otros intercambios.

El origen de la variación no siempre es claro, y puede diferir entre una planta y otra. El reordenamiento cromosómico es considerado el principal mecanismo que genera la variación somaclonal; puede deberse también a un

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entrecruce (crossing over) somático, a un intercambio de cromátidas hermanas, a una alteración de los nucleótidos por metilación, a una perturbación de la replicación del DNA por culpa de un depósito de nucleótidos alterados, o también al silenciamiento o activación de genes por mutaciones ocurridas en regiones no codificadas.

Uno de los mayores beneficios de la variación somaclonal es la obtención de variabilidad genética en cultivares agroeconómicamenté útiles, la cual se ha obtenido tradicionalmente recurriendo a la hibridación. Los somaclones pueden enriquecerse durante el cultivo in vitro con las siguientes características: resistencia a enfermedades y a herbicidas, y tolerancia al estrés químico o ambiental. Además, la introgresión de genes de cultivares silvestres en especies cultivables es posible a juzgar por el reordenamiento de cromosomas observado hasta ahora en las plantas regeneradas in vitro. En la figura 1.15 se muestra un resumen del proceso de selección de somaclones de pasto llorón del cual se seleccionaron plantas promisorias por su potencial como forrajeras.

Niveles de detección de la variación somaclonal

Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones genómicas generadas por cultivo in vitro reviste interés desde un punto de vista práctico, ya que estas podrían ser fuentes de material para seleccionar caracteres de interés y desde un punto de vista teórico, ya que pueden posibilitar la realización de estudios básicos acerca de la variación y el posible control de la misma.

1. Marcadores morfológicos: Se realizan exámenes visuales y se utiliza un analizador de imágenes para observar la diferenciación entre fenotipos normales y aberrantes de plantas regeneradas.

2. Marcadores fisiológicos: A nivel fisiológico, es posible detectar y seleccionar variaciones en cultivo de células y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de pH variables, entre otros.

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Figura 1.15 Obtención de variantes somaclonales de pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias. A) Formación de callos, B) Evidencia de morfogénesis en masa de callo. C) Células embriogénicas y D) embriones somáticos de los callos. E) Embriones bipolares y F) organogénesis observadas en los callos. G) Plántula completa. H) Plantas fértiles llevadas a campo (I). J) Cromosomas en el ápice radical de la planta donadora de explante. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a partir de la anterior L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando variación. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas. Fuente: Echenique et al, 2004.

3. Marcadores citogenéticos: El estudio del cariotipo permite detectar cambios en el número y estructura de los cromosomas.

4. Marcadores bioquímicos: Entre los marcadores bioquímicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las isoenzimas, cuya variación se puede detectar mediante patrones electroforéticos.

5. Marcadores moleculares: Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar inestabilidad genética debido a su amplia cobertura del genoma ya que no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenológicos de las plantas. Solamente para mencionar algunos de los marcadores utilizados para medir la variación somaclonal, están: los RAPDs y los AFLPs.

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CAPITULO 3: Aplicaciones Prácticas

Introducción

Entre las aplicaciones del cultivo de tejidos se pueden mencionar la micropropagación o clonación in vitro de plantas, la producción de compuestos naturales de alto valor, la obtención de materiales mejorados mediante selección in vitro u otras técnicas y a la conservación de germoplasma vegetal mediante criopreservación o almacenamiento en condiciones de mínimo crecimiento. Por otro lado, el cultivo de tejidos vegetales, junto con las técnicas de ingeniería genética, han hecho posible la transferencia directa de genes a las plantas. Esto último ha abierto una inmensa gama de posibilidades tanto para el mejoramiento de las plantas cultivadas, como para la obtención de nuevos productos a partir de ellas.

Lección 11: Bioestadística aplicada al cultivo de tejidos vegetales

La bioestadística (la estadística aplicada a problemas biológicos) es muy útil, pues por medio de ella se pueden recolectar datos, ajustándolos lo mejor posible a la realidad, eliminando o reduciendo todas las fuentes de error, aplicando el método científico (observación, experimentación, hipótesis, prueba de error y deducción), las matemáticas y los principios y leyes de las probabilidades. En general, las técnicas estadísticas más empleadas en experimentos llevados a cabo en laboratorios de cultivo de tejidos vegetales son las que se refieren a los modelos de diseños experimentales, los modelos de regresión lineal (simple o múltiple) y las técnicas usadas en estadística no paramétrica.

Los modelos de diseños experimentales se utilizan en la planeación de experimentos donde se estudian variables cualitativas y cuantitativas, las cuales proporcionan una cantidad máxima de información concerniente al problema en investigación. El diseño de un experimento es la secuencia completa de pasos que aseguran que los datos apropiados se obtendrán de modo que permitan un análisis objetivo que conduzca a deducciones válidas con respecto al problema establecido. Esta definición implica que la persona que lo formule debe entender claramente los objetivos de la investigación propuesta. En la mayoría de los experimentos se involucran varios tratamientos; en estos casos el investigador estará interesado en las comparaciones específicas entre las medias del tratamiento. Para realizar estas comparaciones entre medias existen varios mé-todos: la diferencia mínima significativa (DMS), la prueba de Duncan y la prueba de Tukey.

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Los diseños experimentales básicos que se utilizan en el cultivo de tejidos

vegetales son el diseño completamente al azar y el diseño de bloques completos al azar; cada uno puede utilizarse con arreglos factoriales.

Diseño completamente al azar

En este, los diferentes tratamientos son asignados aleatoriamente a todas las unidades experimentales. El requisito para este diseño es que las unidades experimentales sean homogéneas y las ventajas son: el análisis de datos es simple, pueden utilizarse diseños no balanceados, el número de repeticiones esta limitado únicamente por el número de unidades experimentales disponibles y hay una cierta tolerancia a la pérdida de datos.

La manera de analizar estadísticamente los datos de un experimento de este tipo es el análisis de varianza (ANOVA). En éste se prueba una hipótesis nula (Ho) que postula que el efecto de todos los tratamientos es igual, contra una hipótesis alternativa (Ha) que postula que al menos uno de los tratamientos es estadísticamente diferente al resto de ellos. El resultado final da un valor de F que nos permite aceptar o rechazar la hipótesis nula. Si en el ANOVA se rechaza la hipótesis nula, esto nos dice únicamente que estadísticamente al menos uno de los tratamientos es diferente, pero no nos da ningún dato sobre la relación entre los tratamientos. Para comparar los tratamientos unos con otros, se utilizan pruebas complementarias como la diferencia mínima significativa (DMS), la prueba de Duncan y la prueba de Tukey las cuales son sencillas y pueden ser consultadas en cualquier texto de estadística. Algunos ejemplos típicos de la aplicación del diseño completamente al azar en el cultivo de tejidos vegetales son:

• Se desea conocer el efecto de diferentes niveles de reguladores de crecimiento sobre el número de brotes producidos por segmentos nodales de una especie vegetal X.

• Se prueban medios básales con una concentración fija de un regulador de crecimiento con el fin de determinar cuál de ellos promueve una mayor formación de raíces en segmentos de tallo de una especie vegetal Y.

En estos casos, los explantes son homogéneos. El ANOVA nos indicaría si hay al menos un tratamiento diferente, y la DMS u otra prueba similar, cuál de ellos es el mejor y cuáles son iguales o diferentes entre sí. Las fuentes de variación son únicamente los tratamientos y el error experimental.

Diseño de bloques al azar

Cuando se tienen unidades experimentales que no son homogéneas, se debe recurrir al diseño de bloques al azar. Para ello se deben reunir entre sí las

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unidades experimentales parecidas para formar con ellas grupos llamados bloques. Luego, los tratamientos deben asignarse al azar dentro de cada bloque. En este diseño las fuentes de variación son los tratamientos, los bloques y el error experimental. El ANOVA nos indica si hay efecto entre los diferentes tratamientos y los diferentes bloques. Un ejemplo de un experimento de bloques al azar sería el siguiente: se desea probar el efecto de seis combinaciones de IBA y AIA en la producción de brotes adventicios en hoja, cotiledón e hipocotilo de tomate. En este caso, se forman los bloques, uno con cada tipo de explante, y luego se asignan al azar los seis tratamientos dentro de cada bloque.

Cuando se desea probar la posible interacción entre dos o más factores, debe recurrirse a un experimento de tipo factorial, que puede realizarse sobre un diseño completamente al azar o sobre uno de bloques al azar. Por ejemplo, se desea conocer el efecto de cuatro auxinas y tres temperaturas de incubación en el enraizamiento de segmentos de tallo de manzano. El diseño debe probar el efecto de las auxinas, el efecto de las temperaturas y la posible interacción entre las diferentes auxinas con las temperaturas de incubación. Éste sería un experimento factorial con diseño completamente al azar. Suponiendo que en ese mismo ejemplo se quisieran probar al mismo tiempo tres variedades de manzano, se podría tratar entonces de un experimento factorial con diseño de bloques al azar, siempre y cuando se formara un bloque con cada variedad. El análisis de este tipo de experimentos suele resultar más complicado y se sugiere evitarlos substituyéndolos de ser posible por una serie de experimentos más sencillos.

En ocasiones lo que se desea evaluar es la posible relación entre una o más variables dependientes con una sola variable independiente. Por ejemplo, el aumento de biomasa y la producción de pigmentos (variables dependientes) en tejido calloso, en relación con los niveles de auxina (variable independiente) en el medio de cultivo. En este caso se utiliza el procedimiento estadístico conocido como regresión. La regresión puede ser lineal o no lineal dependiendo de la relación entre las variables y puede ser simple o compuesta dependiendo del número de variables que se prueban.

Lección 12: Cultivo de especies económicamente importantes

El cultivo de tejidos no sólo permite la producción masal de plantas, sino que también posibilita el estudio y caracterización de la biología del desarrollo de las mismas. Dependiendo del objetivo planteado es posible clonar individuos utilizando cultivo de ápices o meristemos, o bien buscar aumentar la variabilidad genética por medio del cultivo de callos, suspensiones celulares o protoplastos (vistos en lecciones anteriores).

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La técnica de micropropagación es una excelente herramienta que ha sido

ampliamente utilizada para la propagación a gran escala de especies econonómicamente importantes, ya que no sólo permite la obtención de miles de individuos a partir de un genotipo “elite” seleccionado, sino que también permite la multiplicación de plantas raras o en peligro de extinción, resguardando la estabilidad genética de las mismas. Algunos géneros y especies de plantas ornamentales que se han cultivado in vitro a partir de diferentes explantes son:

- Cultivo de meristemos: Ghypsophyla, Chrysantemum, Maranata sp., Gladiolus, Iris sp., Pelargonium, Saintpaulia spp.

- Ápices: Diphaenbachia, Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp.,Rosa L., Iris sp.

- Yemas o segmentos nodales: Dianthus, Bignoniaceae, Nierembergia, Jacaranda mimosifolia, Bougainvillea, Blandfordia sp., Anthurium sp. Bromeliaceas, Maranta sp., Campanula sp., Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp., Mediocactus coccineus, Zinnia elegans, Rosa L., Gardenia, Chrysantemum, Gladiolus, Impatiens, Iris sp., Saintpaulia spp.

- Pecíolos: Rhododendron sp., Anthurium sp., Gerbera sp., Chrysantemum.

- Discos de hojas: Rhododendron sp., Bromeliaceas. Begonia sp., Gardenia. Chrysantemum, Saintpaulia spp.

- Lámina: Saintpaulia spp.

- Escamas: Lilium

- Bulbos o Segmentos de bulbos: Sego lily, Narcissus

- Rizomas: Cymbidium

- Cotiledones: Zinnia elegans.

- Semillas: Cattleya sp., Mammillaria sp., Orchidea, Saintpaulia spp.

- Embriones inmaduros: Alstroemeria sp., Orchidea spp.

- Anteras: Saintpaulia spp.

- Segmentos de pétalos: Chrysantemum.

- Segmentos de inflorescencia: Chrysantemum, Saintpaulia spp..

La lista precedente es apenas una muestra de la gran diversidad de explantes que se utilizan para la multiplicación in vitro de plantas.

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En plantas de importancia para la agricultura tropical también se han

realizado grandes esfuerzos, como algunos ejemplos tenemos:

- Yuca: eliminación de virus (mosaico africano de la yuca ACMD, virus del mosaico común de la yuca CCMV, Mosaico caribeño CMD y virus X de la yuca CsXV principalmente) por termoterapia de tejidos apicales y posterior micropropagación de los materiales libres de virus. Y propagación in vitro de clones de yuca que poseen características deseables.

- Papa: para eliminación de patógenos (virus, hongos y bacterias) se ha empleado el cultivo de meristemos y para la producción de semilla certificada.

- Plátano: mejoramiento y eliminación de patógenos por cultivo de meristemos.

- Frutales: en cítricos se ha realizado con éxito microinjertación para obtener material libre de virus.

- Arroz: mejoramiento por cultivo de anteras y callogénesis.

- Caña de azúcar: variabilidad somaclonal e inducción de mutantes para obtener nuevas variedades, también se ha empleado cultivo de meristemos apicales y axilares, cultivo de anteras y cultivo de protoplastos.

El cultivo de meristemos es uno de los métodos más eficaces para la eliminación de virus, más aún si se lo combina con termoterapia y/o métodos químicos; es de gran aplicación en el campo de los cultivos intensivos tanto ornamentales como hortícolas. Como la mayoría de los cultivos se multiplican asexualmente, las enfermedades virales suelen ser un problema importante. La elección errónea de un material, por error o desconocimiento, provocaría la diseminación de estas enfermedades, con las consecuentes pérdidas económicas.

El cultivo in vitro también puede ser fuente de variabilidad genética. La producción de plántulas por regeneración a partir de callos, suspensiones celulares o protoplastos, puede dar origen a individuos que presentan algún rasgo diferente respecto de la planta madre. Esto también puede lograrse utilizando mutágenos durante el cultivo in vitro asociados con una presión de selección conferida por factores tales como pH, salinidad, toxinas y baja temperatura. Las plantas regeneradas luego de estos tratamientos pueden mostrar características que difícilmente se puedan obtener por otra vía. La inducción de variantes somaclonales tiene especial significado en la floricultura debido a la constante búsqueda de nuevas variedades, seleccionándose las variantes prometedoras y estables e incorporándolas a los programas de mejoramiento.

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Lección 13: Transgénesis

El reciente surgimiento de las técnicas de ingeniería genética de plantas ha abierto una gama muy amplia y prometedora de posibilidades para el mejoramiento genético de las especies cultivadas por el hombre, creando lo que se supone será una nueva revolución en la agricultura. El nacimiento de estas técnicas ha sido posible gracias a dos hechos fundamentales. El desarrollo de la llamada tecnología del DNA recombinante que da la posibilidad de aislar, manipular y transferir genes, y por otro lado, el avance de los sistemas de cultivo de tejidos vegetales discutidos en los capítulos anteriores, que dan la posibilidad de controlar hasta cierto punto los procesos morfogenéticos in vitro y regenerar plantas completas partiendo de una sola célula. La transformación genética de plantas consiste en introducir al genoma de éstas nueva información genética que les confiera características diferentes. La fuente de esta nueva información puede ser cualquier organismo vivo por lo que no existen barreras taxonómicas cuando se utiliza esta metodología, siendo el único requisito el que la información a introducir esté colocada bajo el control de señales reguladoras reconocibles por la planta. Esta metodología ha pasado ya de ser utilizada únicamente con fines de investigación a tener una aplicación práctica inmediata en la agricultura. Para el año 2006 se reportaron 22 países con cultivos transgénicos (recientemente llamados cultivos biotecnológicos) ,102 millones de hectáreas cultivadas en todo el mundo y mas de 10 millones de agricultores que los emplean (Figura 1.16).

Figura 1.16 Superficie mundial de cultivos biotecnológicos. Fuente: James, 2006. Situación global de los cultivos transgénicos 2006. ISAAA http://www.agrobio.org/admin/documentos/biotecnologia/0//Situacion%20global%20de%20los%20cultivos%20%20GM%20comercializados%202006.pdf

El proceso que se sigue para obtener una planta transgénica consta de dos fases: Primero se introduce la información genética a una o varias células mediante

http://www.agrobio.org/admin/documentos/biotecnologia/0/Situacion%20global%20de%20los%20cultivos%20%20GM%20comercializados%202006.pdf

http://www.agrobio.org/admin/documentos/biotecnologia/0/Situacion%20global%20de%20los%20cultivos%20%20GM%20comercializados%202006.pdf

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sistemas que se discutirán más adelante, y posteriormente se regenera una planta completa a partir de cada célula transformada. De acuerdo a esto, la recuperación de plantas transformadas depende de la frecuencia de introducción de los nuevos genes a las células vegetales, y de la capacidad de estas células para formar plantas completas bajo los sistemas de cultivo in vitro.

El objetivo final de esta técnica desde un punto de vista práctico, es la introducción de nueva información que le confiera ventajas a la planta, y por lo tanto, la haga más productiva. Sin embargo, al introducir esta nueva información, o bien durante las fases previas que se requieren para el desarrollo de los sistemas de transformación, es muy conveniente la introducción simultánea de genes que produzcan fenotipos claramente identificables en las plantas transformadas para ser utilizados a manera de marcadores. Estos genes (llamados marcadores de selección) suelen codificar para enzimas que confieren resistencia a algún antibiótico o herbicida que normalmente mata o retarda el desarrollo de tejidos no transformados, por lo que resulta relativamente sencillo seleccionar aquellos tejidos que han sido transformados. Otro tipo de genes llamados reporteros, producen actividades enzimáticas específicas en los tejidos transformados que son fácilmente detectables y cuantificables. De los tipos de genes antes mencionados, algunos de los más utilizados son: aacC3 y aacC4, que confieren resistencia a gentamicina; cat, resistencia a cloranfenicol y actividad enzimática detectable; Gfp (Green Fluorescent Protein), proteína verde fluorescente, que emite fluorescencia al ser excitada con luz de 470 nm; gus, con actividad enzimática detectable; hpt, que confiere resistencia a higromicina; y nptll, confiere resistencia a kanamicina y neomicina, y tiene actividad enzimática detectable.

También se han desarrollado sistemas alternativos interesantes de selección positiva; en este caso la selección no se basa en la eliminación de las células no transformadas al aplicar un agente selectivo, sino que se dan las condiciones para que solo las células que han adquirido el gen foráneo puedan desarrollarse. Por lo que respecta a los sistemas de transformación genética pertenecen básicamente a dos tipos, aquéllos que se valen de procesos biológicos para la introducción del DNA y aquéllos que lo hacen por medios físicos.

Sistemas biológicos

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena aerobia Gram negativa que causa el trastorno conocido como "agalla de la corona" que afecta a muchas especies de dicotiledóneas. Esta enfermedad se caracteriza por la producción de tumores en el tejido vegetal atacado. De manera natural, el mecanismo de patogenicidad se basa en la transferencia de información genética al genoma de la planta infectada. Esta información se localiza en un megaplásmido (alrededor de 200 Kb) llamado plásmido Ti (inductor de tumores) dentro del cual se encuentra una región conocida como DNA-T (DNA transferible) que es el que se inserta y expresa en el genoma de la planta. Los productos de la

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expresión de este DNA en la planta son enzimas involucradas en la biosíntesis de auxinas, citocininas y opinas. Además de estos genes, el DNA-T contiene las llamadas secuencias borde, que son secuencias de 25 pb muy similares entre sí (repeticiones directas imperfectas) que delimitan al DNA-T y son imprescindibles para su transferencia. Estos bordes son los únicos elementos en cis que se requieren para la transferencia del DNA-T al genoma de la planta.

A diferencia de otros elementos genéticos móviles, el DNA-T no codifica por sí mismo a los productos que permiten su transferencia, éstos están codificados por otra región del mismo plásmido Ti, llamada región vir o de virulencia. La región vir contiene 6 operones, y los genes dentro de la misma poseen un sistema de regulación muy fino y sólo se expresan en presencia de compuestos excretados por células vegetales heridas. Los compuestos fenólicos producidos por la célula vegetal herida como la acetosiringona, ácido sinapínico o ácido cafeico atraen por quimiotaxis a la bacteria y luego inducen la expresión de los genes vir (figura 1.17).

Figura 1.17 Transferencia del DNA-T de un parásito a células vegetales. Fuente: Lehninger et al, 2004 (modificado)

Una característica muy importante del DNA-T es que sus genes pueden ser cortados y substituidos por otros sin que esto afecte al sistema de transferencia. De esta forma se construyen los llamados plásmidos desarmados, los cuales no inducen la aparición de tumores pero sí permiten la transferencia de otras características deseables. Existen dos tipos fundamentales de vectores para transformación con A. tumefaciens; el primero de ellos lo constituyen los llamados vectores cointegrativos, en los que la información genética a introducir a la planta se cointegra al plásmido Ti, por lo que el DNA-T y la región vir se encuentran en

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un mismo megaplásmido. El otro tipo de vectores son los llamados binarios, en los cuales los productos de la región vir actúan en trans, ya que el DNA-T se encuentra en un plásmido y la región vir en otro ya sea silvestre o desarmado (Figura 1.18).

Figura 1.18 Sistema de dos plásmidos para crear una planta transgénica. Fuente: Lehninger et al, 2004 (modificado)

La forma en la que se realiza la transformación genética mediante este sistema es cocultivando a los explantes vegetales con una cepa de A. tumefaciens modificada de acuerdo a las características que se quieran introducir. Después de este cocultivo se procede a la regeneración de plantas a partir de los tejidos vegetales presuntamente transformados. Usualmente al tiempo de la regeneración se aplica una presión de selección de acuerdo a los marcadores utilizados para favorecer el desarrollo de los tejidos transformados en detrimento de los que no lo están.

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Agrobacterium rhizogenes es otra bacteria cuyo mecanismo de

patogenicidad está basado en la transferencia de genes al genoma de la planta infectada. En este caso el trastorno que produce es conocido como raíz pilosa, por el aspecto que tiene la planta infectada. Esta bacteria posee un plásmido llamado Ri que se asemeja al plásmido Ti de A. tumefaciens. Los virus son otro sistema biológico natural para la transferencia de material genético en plantas. Este sistema presenta algunos inconvenientes como por ejemplo el hecho de que la mayoría de los virus vegetales son de RNA. A pesar de lo anterior, subsiste la investigación tendiente a la utilización de algunos virus para la transferencia de genes a plantas, como es el caso del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) y el Virus del Enanismo del Trigo (WDV).

Sistemas físicos

La transformación de protoplastos es un método donde la remoción de la pared celular elimina la mayor barrera que impide la entrada de la nueva información genética, y así los protoplastos vegetales son células ideales para la introducción de DNA extraño. Por otro lado, al tratarse de células individuales y al poder cultivarse en altas densidades se facilita enormemente el proceso de selección. Desgraciadamente, la obtención y manipulación de protoplastos son muy complicadas y en muchas especies se carece de sistemas para la regeneración de plantas completas a partir de ellos. En cuanto a la introducción de DNA extraño en protoplastos, el método más común es el que se basa en un tratamiento con polietilenglicol, pero actualmente es poco utilizado debido a la aparición de sistemas más eficientes y a la dificultad para trabajar con protoplastos. Otro método para la transformación de protoplastos es la electroporación, basado en una permeabilización reversible de la membrana causada por la aplicación de un impulso eléctrico fuerte y de muy corta duración. Esta técnica es por lo general más eficiente que la primera, pero al igual que ésta tiene la desventaja de que la expresión de los genes introducidos suele ser transitoria ya que la frecuencia de integración al genoma es muy baja.

La transformación mediante bombardeo con microproyectiles o biobalística se basa en bombardear al tejido vegetal con microproyectiles de oro o de tungsteno (cubiertos con el DNA a introducir) y acelerados a alta velocidad de tal manera que penetren la pared celular y eventualmente lleguen al núcleo, todo esto sin llegar a matar a la célula bombardeada (figura 1.19). Una de las mayores ventajas de este sistema es que no está restringido a un rango de hospederos naturales como Agrobacterium, por lo que con su uso fue posible la transformación de monocotiledóneas como el maíz.

Los métodos más utilizados son la transformación con Agrobacterium y el bombardeo con partículas. Uno de los factores que limitan la aplicación de ambos sistemas es la necesidad de regenerar el tejido transformado mediante organogé-nesis o embriogénesis somática, lo cual con algunas especies es al menos hasta

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el momento muy difícil. Una alternativa es la transformación de meristemos, los cuales resultan sencillos de regenerar en prácticamente todas las especies. La principal desventaja es la producción de quimeras debido a que las plantas formadas no tienen un origen unicelular.

Figura 1.19 Biobalistica Fuentes: http://www.ptf.okstate.edu/helios.html y http://www.xtec.es/~jcarrasc/transgenicas.htm

Lección 14: Mejoramiento genético

El fitomejoramiento consiste en la introducción de características útiles en las plantas por medio de técnicas tradicionales como las de Mendel, que son dispendiosas y consumen mucho tiempo para seleccionar y establecer las características deseables en un cultivar; pero actualmente, gracias a la tecnología del DNA recombinante, se ha podido introducir en los cultivares características que antes era imposible de lograr.

El cultivo de tejidos vegetales se ha convertido en el eje sobre el cual giran las nuevas tecnologías de mejoramiento genético de las plantas y un mejor conocimiento de los procesos genéticos y fisiológicos de estas. Como se ha visto, es posible mediante el uso de diferentes estrategias la introducción de genes extraños en el genoma de una planta y la regeneración de plantas completas que expresen y sean capaces de transmitir a la progenie las características adquiridas. Cuando se habla de aplicaciones prácticas de esta tecnología, es necesario buscar genes que confieran características deseables y hagan más productivo un cultivo. Algunas de las características que se podrían manipular mediante la transformación genética y el cultivo de tejidos son las siguientes:

1. Resistencia a virus: Una de las aplicaciones más estudiadas de la ingeniería genética de plantas. Sin duda, el sistema que ha dado mejores resultados hasta el momento es la basada en la inserción en el genoma de la planta del gen que codifica para la proteína de la cápside del virus contra el que se

http://www.ptf.okstate.edu/helios.html

http://www.xtec.es/~jcarrasc/transgenicas.htm

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desea dar protección. Con esta metodología se han logrado obtener plantas resistentes a virus fitopatógenos como TMV, AIMV, TSV, CMV y PVX.

2. Resistencia a insectos: Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo que produce una proteína insecticida que ha sido utilizada por muchos años como un pesticida biológico seguro contra varias plagas de insectos. Con el desarrollo de la ingeniería genética de plantas fue posible aislar e insertar en el genoma de diferentes plantas este tipo de proteínas insecticidas dando como resultado plantas resistentes en mayor o menor medida al ataque de ciertos grupos de insectos, lo cual es, sin duda alguna, una característica agronómica de gran valor. Por otro lado, se ha explorado también la posibilidad de utilizar algunas proteínas inhibidoras de proteasas y amilasas presentes en algunas semillas para conferir resistencia contra el ataque de insectos.

3. Resistencia a hongos: La manipulación genética en plantas presenta opciones para conferir resistencia ante el ataque de hongos; para esto se ha visto la posibilidad de utilizar genes como el de la quitinasa o la glucano endo-1,3-B-glucosidasa, cuyos productos actúan sobre las paredes celulares de los hongos.

4. Resistencia a herbicidas: Actualmente se encuentra muy extendido el uso de herbicidas en el control de las malezas que compiten con las plantas cultivadas; sin embargo, estos pesticidas suelen dañar también en mayor o menor medida a éstas últimas. Una de las aplicaciones explotadas ha sido la inserción de genes que confieren resistencia a herbicidas, lo cual permitirá al agricultor un mejor sistema para el control de malezas sin dañar con esto al cultivo. En este sentido, se han generado plantas resistentes a glifosato, sulfonilureas, imidazolinonas, fosfinotricina, bromoxinilo y triazina.

5. Cambios en la calidad y fisiología de maduración del fruto: La calidad nutricional de los frutos o semillas, es otra propiedad que puede ser modificada. En este caso la estrategia más obvia es la inserción de genes que codifican para proteínas de alto valor nutritivo y que puedan compensar de algún modo las deficiencias en cuanto a aminoácidos esenciales de la planta en cuestión. Otras características también pueden ser manipuladas, como por ejemplo el con tenido y balance de ácidos grasos o azúcares. Otro aspecto de gran interés es la manipulación de la fisiología de maduración del fruto que puede lograrse alterando las vías metabólicas del etileno o bien las enzimas involucradas en procesos asociados como por ejemplo las que tienen que ver con el ablandamiento del fruto.

6. Alteración de la resistencia al estrés ambiental: El estrés ambiental es sin duda uno de los factores que más limitan la producción agrícola. Recientemente se ha vislumbrado la posibilidad de alterar la resistencia al estrés ambiental de las plantas cultivadas mediante la inserción de genes específicos.

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Como vemos, el advenimiento de nuevas técnicas moleculares y de

ingeniería genética de plantas ha facilitado el análisis genético de caracteres de interés agronómico y la selección asistida por marcadores moleculares.

Lección 15: Aplicaciones en bancos de germoplasma

Sin duda, uno de los problemas más serios que enfrenta actualmente la humanidad es la rápida desaparición de especies animales y vegetales debido al mal uso que desde hace mucho tiempo se les ha dado a los recursos naturales, así como a las presiones derivadas de la sobrepoblación en la mayoría de las regiones del planeta. Actualmente la conservación del germoplasma vegetal debe verse como una actividad que nos permita preservar nuestro patrimonio de la biodiversidad. De allí surge la necesidad de conservación de especies silvestres amenazadas, muchas de las cuales aún no son conocidas en cuanto a sus propiedades y posible aprovechamiento. Por otra parte, se requiere un esfuerzo importante para conservar aquellos genotipos de plantas cultivadas que actualmente se ven amenazados al haberse dejado de utilizar por haber sido substituidas por variedades mejoradas. De hecho, las tendencias actuales del fitomejoramiento, como la selección sobre la base de la uniformidad y para fines muy definidos, han llevado a la pérdida de una cantidad considerable de germoplasma vegetal.

Las plantas cultivadas se pueden agrupar de acuerdo a su uso como germoplasma en los siguientes tipos:

1. Cultivares modernos. Genotipos muy productivos, adaptados a regiones de reducida extensión y características ecológicas bien delimitadas, generalmente vulnerables ante las plagas o cambios ambientales. Actualmente no están amenazadas, pero pueden ser substituidos en cualquier momento.

2. Cultivares caducos. Genotipos que ya no son utilizados por haber sido desplazados por otros mejorados.

3. Cepas reproductoras. Genotipos que nunca llegaron a utilizarse de manera intensiva pero que sirvieron de progenitores de los cultivares modernos.

4. Razas locales o cultivares criollos. Selecciones locales de especies cultivadas en muchas regiones que tienden a substituirse por cultivares modernos.

5. Formas silvestres de especies cultivadas.

6. Especies silvestres relacionadas con las cultivadas.

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De los tipos anteriores, a excepción del primer grupo, todos están en peligro

inmediato de desaparecer o ya han desaparecido. Por ejemplo, a principios de siglo se cultivaban en la India unos 30 000 genotipos diferentes de arroz, mientras que en la actualidad se cultivan alrededor de 50 variedades. En Turquía existían unas 100 variedades de betabel, pero actualmente sólo se cultiva una, importada de Alemania. En Latinoamérica se ha perdido la mayoría de los cultivares criollos de maíz y otras especies al ser substituidos. El hecho de que un cultivar sea substituido por otro puede considerarse como normal o incluso benéfico, ya que las nuevas variedades presentan muchas ventajas, pero lo que debe evitarse es la pérdida total de la variabilidad genética existente cuando se substituyen los materiales criollos con las variedades mejoradas. Por citar sólo un ejemplo, Zea diploperennis, especie silvestre relacionada con el maíz, es resistente a 4 de las 7 principales plagas que dañan a este cultivo, por lo que tiene un enorme interés para el mejoramiento del maíz. Sin embargo esta especie ya se había dado por extinta en 1920 y afortunadamente fue redescubierta en 1978.

Los biotecnólogos vegetales no sólo se han preocupado por el problema de la conservación del germoplasma, sino que han establecido alternativas prometedoras para contribuir a solucionarlo. En ese sentido, se han desarrollado algunos sistemas de conservación in vitro de germoplasma vegetal. La conservación a mediano plazo, también conocida como almacenamiento en condiciones de crecimiento mínimo, que consiste en mantener el material in vitro de tal manera que se retarde su crecimiento con la finalidad de incrementar lo más posible el tiempo entre subcultivos; esto puede lograrse incubando a baja temperatura, usando medios pobres en nutrientes, utilizando osmóticos para reducir la disponibilidad de agua, o con inhibidores del crecimiento. La conservación a largo plazo utiliza el método llamado criopreservación, que consiste en conservar los tejidos congelados a temperaturas extremadamente bajas (usualmente -196 °C) por tiempo indefinido.

En general, las ventajas de la conservación in vitro de germoplasma vegetal son las siguientes:

• Altos índices de multiplicación. A partir de poco material almacenado puede generarse un número ilimitado de plantas en relativamente poco tiempo.

• Los costos de mantenimiento son realmente muy bajos debido a que el mantenimiento requerido es mínimo.

• El material almacenado está completamente libre de patógenos.

• Los bancos de germoplasma in vitro no pueden ser afectados por fenómenos ambientales.

• El material puede intercambiarse incluso a grandes distancias de manera muy fácil y sin restricciones fitosanitarias.

• La variación genética del material es mínima si se elige el sistema de cultivo adecuado (meristemos o yemas).

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Actividades de Autoevaluación de la UNIDAD 1

En esta sección usted evaluará diversos aspectos de la actividad académica desarrollada en la unidad. Esta actividad tiene una valoración cualitativa de acuerdo a la siguiente escala: No satisfactorio, Satisfactorio, Supera lo esperado. En cada punto además de asignar la categoría correspondiente, dará una breve explicación de su respuesta.

Autoevaluación de su trabajo individual. Usted describirá de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeño en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo individual y colaborativo.

Evaluación del desempeño de los compañeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participación de sus compañeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciación

Evaluación del material usado en la actividad de la unidad: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo de esta unidad fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado.

Desempeño del rol del tutor. Debe dar su autoevaluación del tutor respecto a compromiso, responsabilidad, calidad, pertenencia, atención al estudiante, retroalimentación de trabajos y relaciones interpersonales.

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Fuentes Documentales de la Unidad 1

Cañas, M. (1993). Metodologías in vitro de Vegetales. Bucaramanga. Ediciones Universidad Industrial de Santander.

Doyle, A., Griffiths, J.B. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York. John Wiley and Sons.

Echenique, V., Rubinstein, C., Mroginski, L. (2004). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Buenos Aires. Ediciones INTA.

Helgason, Ch. D., Millar, C.l. eds (2005). Basic Cell Culture Protocols. Methods in Molecular Biology No 290. Totowa. Humana Press.

Hurtado, D., Merino, M.E. (1987). Cultivo de Tejido Vegetales. México. Editorial Trillas.

Lentini, A., Martinez, C., Roca, W. (1997). Cultivo de anteras de arroz en el desarrollo de germoplasma. Palmira. Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT.

Lodish, H., Baltimore, D., Berk, A., Lawrence, S., Matsudaira, P., Darnell, J. (2004). Molecular Cell Biology. Fisfth edition. New York. Scientific American Books.

Montoya, D., Sastoque, L.A. (2004). Biotecnología para no biotecnologos: memorias. Bogotá. Universidad Nacional de Colombia.

Perea, M. ed. (2001). Biotecnología agrícola: un enfoque hacia el mejoramiento de plantas. Bogotá. Editora Guadalupe Ltda.

Perez, E.M., Ramirez, R., Nuñez, H.G., Ochoa, N. (1999). Introducción al Cultivo de Tejidos Vegetales. México. Ediciones Universidad Autónoma de Aguascalientes.

Pierik, R.L.M. (1990). Cultivo in vitro de las Plantas Superiores. Madrid. Ediciones Mundi-Prensa.

Roca, W., Mroginski, L.A. (1991). Cultivos de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. Palmira. Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT.

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CULTIVO DE TEJIDOS ANIMALES


Introducción

El cultivo de tejidos animales ha tenido un gran desarrollo en los últimos cien años, gracias al desarrollo de la técnica aséptica y al conocimiento acumulado acerca de la fisiología, el metabolismo y los requerimientos nutricionales de las células. En este capitulo se estudiarán las bases de este desarrollo y se profundizará en las metodologías y requerimientos básicos para la implementación y establecimiento de cultivos celulares.

Lección 16: Introducción a la técnica del cultivo celular

En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. Los objetivos al principio fueron el estudio de las células, su crecimiento, requerimientos para su crecimiento, cómo y cuando dejan de crecer. Estos estudios aún tienen gran interés científico, por ejemplo, en investigaciones relacionadas con el ciclo celular, control de crecimiento en células tumorales y modulación de expresión genética. Otra área de gran interés se centra en la biología del desarrollo. Dado que el cultivo celular es adecuado para el estudio del desarrollo y diferenciación, las líneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro son objeto de intensos estudios. Por último existen cierto tipo de investigaciones que no podrían realizarse sin el cultivo de células, como los trabajos en transgénesis.

Teniendo lo anterior en mente, es necesario conocer también las ventajas y desventajas al trabajar con cultivos in vitro (las cuales se resumen en la tabla 2.1), por lo que se deben tomar con precaución la validez de los resultados obtenidos in vitro respecto a lo que pueda observarse in vivo. Sin embargo actualmente se están realizando gran cantidad de estudios de validación de modelos in vitro dentro del desarrollo de los métodos alternativos a la experimentación animal.

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TABLA 2.1 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL TRABAJO EN CULTIVOS IN VITRO

VENTAJAS DESVENTAJAS

Control preciso del medio ambiente

pH, temperatura, presión osmótica, O2, CO2, hormonas, factores de crecimiento, etc

Técnica sensible

Crecimiento celular lento, problemas de contaminación, métodos especializados y personal altamente capacitado

Caracterización y homogeneidad

Las células de una línea continua son homogeneas en morfología y composición, se pueden obtener replicas idénticas.

Inestabilidad

Las líneas celulares continuas pueden tornarse inestables (dotación cromosómica). Necesidad de técnicas especiales para mantener la estabilidad.

Economía

En el uso de reactivos o drogas que deben estar en contacto con las células. Orden de miligramos.

Cantidad y costo

El costo de producción de 1g de tejido en cultivo es 10 veces mayor al obtenido del animal. Limitación en producción.

Motivaciones éticas

Alternativa válida en muchas ocasiones para evitar el sacrificio de animales de investigación.

Validez del modelo in vitro

Pérdida de la organización espacial del tejido origen. Pérdida de interacciones celulares. Ausencia de componentes sistémicos implicados en homeostasis in vivo.

Lección 17: Medios de cultivo

Para cultivar células in vitro, el ambiente debe ser lo más parecido posible al esperado in vivo. Son factores ambientales importantes el substrato sobre el que crecen las células, el medio que las rodea y la temperatura. La composición completa de un medio que permita el crecimiento en cultivo de células de mamífero puede parecer muy complejo y existe gran número de distintos medios disponibles pero, básicamente, cualquier medio de cultivo está constituido por un medio nutriente mínimo tamponado e isotónico que contiene sales inorgánicas, una fuente de energía y aminoácidos, además de varios suplementos. Para la mayoría de las líneas celulares los suplementos son relativamente pocos, el principal de los cuales es el suero o un sustituto del suero.

La selección y preparación del medio adecuado es un aspecto importante del cultivo celular. Los distintos tipos de medio se caracterizan por sus diferencias en los componentes básicos, como los aminoácidos y las sales, y en su concentración.

El medio basal de Eagle (BME) es uno de los medios definidos como originales. Se utiliza normalmente para células adherentes (formadoras de

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monocapas) como las células HeLa y algunas células primarias. Posteriormente se han desarrollado otros medios a partir del BME, como el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el que consiste en medio BME con una mayor cantidad de vitaminas y aminoácidos y se emplea para una amplia gama de líneas celulares de mamífero. El medio esencial mínimo (MEM) se desarrolló para células de mamífero formadoras de monocapa con mayores exigencias que las satisfechas por el BME. Se utiliza de forma generalizada, principalmente para células primarias de mamífero, pero también para muchas líneas celulares establecidas.

En la composición de muchos medios de cultivo se incluyen altas concentraciones de Ca2+ y Mg2+ pues estos cationes divalentes son necesarios para la adherencia de proteínas situadas sobre las células formadoras de monocapa, pero los medios para el cultivo de células en suspensión no necesitan concentraciones tan elevadas.

Para permitir el crecimiento celular, los medios básicos precisan la adición de suplementos como la glutamina y el suero. La glutamina es la fuente principal de carbono para la mayoría de las células en cultivo y genera precursores para posteriores biosíntesis y para la producción de proteínas. También actúa, junto con la glucosa (y a veces con el piruvato sódico), como fuente de energía mediante la ruta del ciclo de Krebs. El suero contiene una mezcla importante pero poco definida de compuestos favorecedores del crecimiento (por ej., polipéptidos, hormonas, lípidos, metales traza). Se ha producido un suplemento similar al suero, sin embargo, el suero sigue siendo utilizado por la mayoría de los que trabajan con cultivos celulares, normalmente en forma de suero fetal bovino.

Los medios carentes de suero son cada día más utilizados. El medio Iscoves suele utilizarse como base para la preparación sin suero; se trata de una modificación del DMEM al que se añaden suplementos (por ej., albúmina sérica bovina, transferrina y lípidos de semilla de soja). El medio Iscoves fue desarrollado para el cultivo de células hibridas y linfocitos murinos. Entre los nuevos medios sin suero se encuentran el AIM V de Gibco y el «Medio sin suero y sin proteínas para hibridomas» de Sigma. Sin embargo, el empleo de medios sin suero para distintos tipos celulares necesita de la adición de suplementos extra específicos para las células empleadas que, en muchos casos, no se han determinado con precisión.

Preparación de Medios

Para la correcta preparación de medios de cultivo es crucial tener una fuente de agua de muy alta calidad, tipo bidestilada o tridesdilada y desionizada. Existen sistemas automatizados de purificación de agua como Millipore incluyen una filtración por carbón, una desionizacion de alta calidad y una filtración. Las botellas o frascos para contener medio deben ser del tipo fabricado por Schott o Pyrex, con marcas indicadoras del contenido y tapas de rosca para boca ancha, y

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deben estar perfectamente lavadas, sin restos de detergente. Así mismo, se debe emplear una cabina de flujo laminar para garantizar un ambiente libre de contaminantes.

Medios líquidos: Las botellas con agua pura se esterilizan en autoclave. Se debe disponer de soluciones esterilizadas por filtración (filtro de 0,2 µm), de: 1M NaOH, 1M HCl y bicarbonato 7.5% y agua pura estéril. Debe añadirse la cantidad necesaria del medio concentrado 10X a la botella que contiene agua. Antes de completar el volumen final de la dilución se debe ajustar la concentración final de bicarbonato dependiendo del medio y el pH. En este momento se añade agua pura hasta alcanzar el volumen final requerido, teniendo en cuenta el volumen de glutamina y antibióticos que falten por añadir. El medio puede conservarse en esta etapa a 2-4°C o bien se añaden los suplementos.

Medios en polvo: La reconstitución de los medios en polvo requiere una esterilización por filtración, excepto si se utiliza medio en polvo esterilizable en autoclave. Las unidades y sistemas de filtración van desde los simples filtros que se colocan sobre la botella, hasta los sistemas de presión positiva que incorporan vasijas de presión y filtros de gran capacidad (Figura 2.1). Como primer paso se llena un recipiente grande hasta el 80-90% del volumen final deseado con agua estéril bi o tridestilada o desionizada, se pone en agitación con un agitador magnético, mientras se añade lentamente el medio en polvo. A continuación se añade el bicarbonato sódico y se ajusta el pH. Si se utiliza un sistema de filtración con presión positiva, el pH debe ajustarse a 7,0. Si el medio es muy rojo, es necesario añadir ácido (en forma de 1M HCl). Por último, debe añadirse agua pura, hasta alcanzar el volumen final deseado. Puede llevarse a cabo una prueba de esterilidad colocando las botellas con medio en una estufa a 37°C durante toda la noche y después se conservan a 2-4°C. Antes de utilizar el medio, hay que añadir los suplementos.

Medios esterilizables en autoclave: Solo un reducido número de medios se presentan en forma esterilizable en autoclave en la actualidad; esto es posible gracias a la no inclusión de los elementos termolábiles, que se añaden después de la esterilización. El polvo se disuelve en agua pura y se ajusta a pH 4,5 (necesario para estabilizar la solución durante la esterilización en autoclave, pero el pH exacto debe comprobarse en las instrucciones que acompañan al medio). Añadiendo agua pura se alcanza el volumen final (con excepción del volumen necesario para el tampón que se añade después de la esterilización), se dispensa y se esteriliza a 121°C, 103,5 kPa durante 15 min. Tras la esterilización, se añade la solución tampón de forma aséptica y se reajusta el pH a un valor de 7,0-7,2. Para determinar los volúmenes precisos, se deben seguir las instrucciones del fabricante.

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Figura 2.1 Esquema de la filtración al vacío y algunas unidades de filtración. Fuente: http://www.biophysica.com/filter.htm, http://docencia.udea.edu.co/cen/tecnicaslabquimico/02practicas/practica07.htm

Suplementos

Después de preparar el medio básico, deben añadirse otros suplementos, que incluyen:

L-glutamina: aminoácido imprescindible para las células en cultivo. Se encuentra en forma líquida estéril o en polvo. El polvo debe reconstituirse con agua bi o tridestilada, se filtra con un filtro desechable en alícuotas y se conserva a -20°C. La glutamina en solución es lábil y tiene una vida media relativamente corta, especialmente a 37°C. El medio al que se haya incorporado glutamina debe conservarse de forma rutinaria a 4°C, hasta 2 semanas.

Antibióticos: son utilizados por muchos laboratorios. Algunas células pueden resultar afectadas negativamente por los antibióticos, pero la gentamicina, penicilina y estreptomicina son aditivos frecuentes en los cultivos celulares. Las concentraciones activas habituales son: penicilina 100 unidades/ml; estreptomicina 100 µg/ml; y gentamicina 50 µg/ml.

Suero: el suero todavía se utiliza, a pesar de la creciente popularidad del medio sin suero. Habitualmente se emplea a una concentración del 10% (v/v). El suero fetal bovino es el más utilizado, aunque debido a las diferencias entre lotes resulta interesante comprobar la eficacia de un suero nuevo sobre el crecimiento celular. En el caso de algunos tipos celulares, pueden emplearse otros tipos de suero, como el de ternero recién nacido, de caballo o humano.

Hepes: El Hepes es un sistema alternativo de tampón que puede utilizarse en un sistema cerrado, es decir, sin CO2. Los medios con Hepes normalmente contienen 25 mM de Hepes.

http://www.biophysica.com/filter.htm

http://docencia.udea.edu.co/cen/tecnicaslabquimico/02practicas/practica07.htm

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Lección 18: El laboratorio de cultivo de tejidos

Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura básica en la cual se disponga de áreas independientes para llevar a cabo la preparación y esterilización de medios y reactivos, un espacio independiente para el proceso de lavado y preparación de material y un área destinada exclusivamente al trabajo con cultivos celulares. Dentro de la infraestructura física básica se debe contar con sistemas de refrigeración y congelación, incubadoras, centrífugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar. Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plástico y de vidrio y con sistemas de esterilización apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material utilizados. La atmósfera del laboratorio de cultivo celular debería encontrarse a una presión ligeramente superior a la del exterior para evitar la entrada de aire que pudiera contaminar los cultivos, además de contar con buena iluminación.

Autoclaves y hornos de aire caliente

Estos equipos se utilizan para eliminar contaminantes potenciales (por ejemplo bacterias) del material empleado en el cultivo celular, como botellas, instrumentos de vidrio o agua para los medios. Las autoclaves pueden ser de muchos tipos pero sus principios básicos son los mismos. Una vez se cierra el autoclave, se introduce vapor en el sistema, ya sea de forma directa desde una fuente externa o bien mediante agua hirviendo desde una fuente interna. La temperatura y la presión aumentan hasta el nivel seleccionado, normalmente 121°C y 15 lb/in2 (103,5 kPa) y se mantiene durante 15 min. Las bacterias, hongos y sus esporas, virus y micoplasmas no sobreviven a esas condiciones, ya que se desnaturalizan proteínas. Por otro lado, los hornos de aire caliente son equipos que calientan el aire interior hasta una temperatura dada (180°C) y la mantienen durante el tiempo requerido (1 hora para condiciones de esterilización). La inactivación por calor seco tiene menor eficacia y se necesita una temperatura más alta y un mayor tiempo que los requeridos cuando se utiliza una autoclave.

Cabinas para cultivo celular

Las cabinas garantizan la existencia de un ambiente controlado para el cultivo de tejidos. En el diseño de las cabinas se consideran dos principios: proteger el cultivo celular del operador (es decir, mantener un ambiente estéril) y proteger al operador del cultivo celular (en situaciones de riesgo de infección potencial), y se pueden clasificar en:

Cabinas de flujo laminar: no ofrecen protección al operario, pues al aire estéril fluye desde el interior. No se deben emplear en cultivos que representes riesgo potencial a los seres humanos.

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Cabinas de Clase I: ofrecen protección al operario y en menor medida al

cultivo celular. El aire fluye desde el frontal abierto (pasado el operario) sobre el cultivo celular, y sale por la parte alta de la cabina. Estas cabinas están en áreas de trabajo estériles especialmente diseñadas (es decir, el aire estéril es absorbido al interior de la cabina), y los usuarios utilizan un vestuario especial de protección.

Cabinas de Clase II: ofrecen protección al operario y al cultivo celular. El aire filtrado entra atravesando el techo de la cabina, desciende sobre el cultivo celular y recorre la zona inferior del área de trabajo (Figura 2.2). Además, entra aire desde la mitad abierta del frontal pasado el operario y desciende a través de la rejilla situada delante de la zona de trabajo.

Cabinas de Clase III: Se emplean para trabajar con organismos altamente patógenos. En ellas, el trabajador está separado del material de trabajo por una barrera física completa (figura 2.3). Esto se logra normalmente mediante la sustitución del frontal abierto por vidrio o perspex, con un par de guantes protectores de alta resistencia incorporados, a través del cual se accede a la zona de trabajo.

Figura 2.2. Diagrama de flujo de aire en una cabina de Clase II. Fuente: Morgan & Darling, 1995

Incubadoras

La mayoría de los distintos tipos de células animales necesitan para su crecimiento óptimo una temperatura de 37°C en un medio a pH 7,0-7,2. La naturaleza de los subproductos del metabolismo celular tiende a convertir el medio en más acido de lo deseable, por lo que se utiliza un sistema tampón que puede

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ser con un aporte de CO2 y bicarbonato, o si se prefiere usar incubadoras secas y sin gas, se emplean sistemas tampón alternativos como el ácido morfolinopropano sulfónico (Mops) o el ácido N-2-hidroxietilpiperacina-N'-2-etanosulfonico (Hepes).

Figura 2.3 Diagrama de flujo de aire en una cabina Clase III. A. Soporte para los guantes. B. Ventana. C. Filtro HEPA de salida. D. Filtro HEPa de entrada. E. Doble puerta. Fuente: http://web.princeton.edu/sites/ehs/biosafety/livevirusworker/decontamination.htm

Lección 19: Tipos de cultivos

En cultivo de tejidos animales se puede hablar de tres tipos: cultivo de órganos, explantes primarios y cultivos celulares. En la figura 2.4 se ilustran los tres tipos de cultivos y sus diferentes modos de cultivo.

1. Cultivo de órganos: Implica que la arquitectura característica del tejido in vivo se mantiene al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios.

2. Explantes primarios: Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan solamente las células de la periferia del explante.

http://web.princeton.edu/sites/ehs/biosafety/livevirusworker/decontamination.htm

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3. Cultivo celular: Supone una disgregación celular ya sea por medios

enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica negativa se pierde la hetereogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea. En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagación, así como por las ventajas en la cuantificación, caracterización y repetibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con importantes éxitos.

Figura 2.4 Tipos de cultivos. A. cultivo de órganos sobre un disco de filtro o sobre una rejilla de acero inoxidable en medio de cultivo. B. Cultivo de explantes en frasco y representación del crecimiento periférico. C. Desagregación enzimática y mecánica para generar una suspensión celular que formará una monocapa. Fuente: Freshney y Vunjak-Novakovic, 2006

Tipos de cultivos celulares

Las líneas celulares se pueden dividir en dos tipos principales: adherentes (células en monocapa) y no adherentes (células en suspensión). Las células adherentes se fijan al material plástico de un frasco o placa y por tanto tienen que desprenderse de esa superficie antes de utilizarlas. Las células adherentes derivan de órganos como el músculo, hígado, células nerviosas, riñón, etc. Las células en suspensión normalmente no se fijan a la superficie del recipiente de

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cultivo. Las características de las células en cultivo (in vitro) suelen depender de su procedencia en el animal (in vivo). Por ejemplo, prácticamente todos los cultivos en suspensión derivan de células inmunitarias o de precursores de las mismas; in vivo circulan por el torrente sanguíneo y no tienden a fijarse (como los linfocitos B y T).

Las células que crecen en cultivo, ya sean adherentes o en suspensión, suelen clasificarse en primarias, inmortales o transformadas. Las células primarias son aquellas recientemente aisladas y por lo general tienen una duración limitada en cultivo. Las células inmortales y las transformadas presentan ambas la propiedad de crecer de forma ilimitada en cultivo. Las líneas celulares transformadas son células que derivan de tumores o que han sido manipuladas de algún modo y presentan un nuevo fenotipo transformado. Normalmente, se utiliza el medio RPMI1640 para el cultivo de células en suspensión y el DMEM para líneas adherentes.

Líneas celulares continuas

Las líneas celulares continuas están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de células que se derivan de tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario mediante transfección con oncogenes, o con tratamiento con carcinogénicos, por lo que les confiere un nuevo fenotipo. Este tipo de cultivo tiene la característica de crecer de manera indefinida. También, las células animales son capaces de secretar proteínas funcionalmente activas, gracias al correcto empaquetamiento y las modificaciones post-transcipcionales necesarias para ello, que no se obtienen en sistemas bacterianos ni de levaduras. En la tabla 2.2 se hace un resumen de las principales líneas celulares empleadas en investigaciones biotecnológicas.

Lección 20: Aislamiento de células para cultivo

Para el aislamiento y manipulación de células se deben seguir protocolos estrictos y técnicas de asepsia. En el caso de elección de una línea celular se debe tener en cuenta que tipo celular es de interés para la investigación, tipos de tejidos o especies óptimas, grado de homogeneidad necesitado, longevidad de la línea, características estructurales y funcionales para su mantenimiento. La principal razón para utilizar líneas celulares es que su manejo es más sencillo que el de las células primarias, pues crecen continuamente y puede obtenerse un mayor número de células, también son más fáciles de obtener y existe una información relativamente abundante sobre ellas. En la tabla 2.3 se muestran algunas fuentes de células con sus ventajas y desventajas.

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TABLA 2.2 PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS Y APLICACIONES DE LAS LÍNEAS CELULARES

MÁS COMÚNMENTE USADAS EN BIOTECNOLOGÍA.

LÍNEA CELULAR

CARACTERÍSTICAS APLICACIONES

CHO dhfr- Células ováricas de hamster chino; morfología epitelial

Producción de proteínas recombinantes

Sf9

Células de tejido ovárico de pupa de Spodoptera frugiperda; rápido crecimiento, alto nivel de expresión de proteínas

Proteínas recombinantes empleando el sistema de expresión de baculovirus, insecticidas

Schneider-2 Línea celular de Drosophila melanogaster

Proteínas recombinantes: α1 antitripsina

COS1/COS7 Riñón de mono verde africano Para soportar el crecimiento de virus recombinantes SV40

NIH/3T3 Embrión de ratón, inhibición por contacto, morfología de fibroblastos

Producción de IGF-1

Hela Carcinoma de cerviz humano, morfología epitelial

Estudios virales

J558L Mieloma de ratón Producción de anticuerpos recombinantes –CD4-Ig

Vero Riñón de mono Vacunas virales: polio, virus hemorrágicos

Mieloma Líneas celulares inmortales (NSO, Sp2/0-Ag14))

Usadas para producir hibridomas y anticuerpos recombinantes

Hibridoma

Líneas hibridas estables que retienen las características de inmortalidad de los mielomas y los diferentes patrones plasmáticos de fusión celular

Producción de anticuerpos monoclonales

WI-38 Células de pulmón de feto humano, morfología de fibroblastos, células diploides,

Vacunas virales - rhinovirus

BHK 21 Fibroblastos de riñón de hamster sirio Vacunas virales, enzimas

MDCK Riñón de perro cocker spaniel, morfología epitelial

Virus animales (SVEV, VSV, vacunas, adenovirus, reovirus, infecciones caninas por hepatitis)

GH3 Tumor de pituitaria de rata Wistar-Furt

Producción de hormonas de crecimiento y prolactina

293 Línea celular de riñón de embrión humano transformada

Aislamiento y transformación

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TABLA 2.3 ESPECIES FUENTE PARA EL AISLAMIENTO Y ESTABLECIMIENTO DE LÍNEAS

CELULARES

ESPECIE VENTAJAS DESVENTAJAS

Humano Pertinencia e importancia en el ámbito biomédico

Disponibilidad

Longevidad limitada principalmente para células normales

Roedores

Rápida disponibilidad

Barato

Fuente de manipulaciones

Limitado para células normales. Muchas líneas transformadas presentan cambios cariotípicos

Aves

Disponibles en estados tempranos de desarrollo

Barato

Fuente para manipulación de tejidos

Citogenética compleja

Virus endógenos

Longevidad limitada para células normales

Bovinos

Tamaño

Barato

Rápida disponibilidad

Cambios cariotípicos

Infección viral con diarrea viral bovina

Ahora bien, en el caso en el que no existan cepas celulares caracterizadas, ni disponibles comercialmente o en bancos celulares, se deberá optar por realizar cultivos primarios o secundarios de corto tiempo, y en este caso se debe plantear todo el procedimiento, desde la elección del modelo animal, el tipo celular, la técnica de obtención (embriones, tejido sanguíneo o biopsia), el medio y condiciones de cultivo. A continuación veremos los principales métodos a la hora de aislar células para cultivos primarios.

Cultivo primario

Las células primarias se consideran más similares a las células in vivo. Las células pueden aislarse a partir de sangre completa, órganos (hígado, corazón, riñón, etc.) u organismos completos (embriones de pollo). Cada tejido, órgano u organismo presenta sus propios problemas particulares. La diversidad de las preparaciones y orígenes de las células es muy alta.

Los cultivos celulares primarios son generalmente más complejos en relación con sus requisitos de crecimiento que las líneas celulares establecidas. La gama de suplementos requeridos por las distintas células primarias para satisfacer su crecimiento es enorme y entre ellos se encuentran los factores de adherencia, colágeno (tipos I, II y IV), fibronectina y gelatina, y poli-L-lisina. Entre las hormonas y los factores de crecimiento se encuentra la insulina, factor de crecimiento II similar a la insulina (IGF-II), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrofagos (GM-CSF), suplemento para crecimiento de células endoteliales (ECGS), hormona

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paratiroidea, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de epidermis (EGF), hormona estimulante de los folículos (FSH), factor de cre-cimiento de nervios (NGF), estrógenos y testosterona. Cada tipo de célula primaria requiere su propia mezcla de factores particulares.

Las líneas celulares primarias humanas crecen durante un tiempo variable pero finito en cultivo; tras ese tiempo, entran en senescencia y mueren. Algunos tipos celulares humanos son fáciles de conseguir, como la sangre humana que puede obtenerse de voluntarios (linfocitos y monocitos), o de cordón umbilical (linfocitos del cordón, células endoteliales venosas y células musculares lisas). En ocasiones, puede disponerse de otros tipos celulares, como los de prepucio (fibroblastos) y piel (fibroblastos). Sin embargo, muchos otros tipos celulares son imposibles de obtener excepto en circunstancias excepcionales (por ejemplo, hígado, riñón, bazo, tiroides, páncreas normales). Ejemplos de cultivos celulares primarios se esquematizan a continuación (Figuras 2.5 y 2.6). El primero tiene poca necesidad de factores de adherencia o de suplementos promotores del crecimiento (fibroblastos de embrión de pollo). Y el otro tipo celular no prolifera en cultivo (hepatocitos de rata).

Figura 2.5 Esquematización del método de obtención de fibroblastos de pollo.

Aislamiento de Fibroblastos de Pollo

10 – 12 embriones de pollo

(Huevos fértiles – 10 días de incubación)

Desinfección superficial con etanol 70%

Rompimiento del huevo por el polo ancho y

extracción del embrión

Separación de la cabeza y el cuerpo del embrión

Extracción de órganos inertes

Lavados de los embriones En solución salina de Hank

En presencia de solución salina de Hank

Trituración en trozos pequeños En presencia de solución salina de Hank

Adición de tripsina y agitación suave Digestión enzimática y mecánica

Obtención de líquido sobrenadante

Centrifugación: Las células se encuentran en el pellet Adición de solución salina de Hank y suero fetal

Filtración de la solución celular en tamiz de 200 µm

Centrifugación y resuspensión en medio de cultivo

Conteo y siembra en frascos con medio de cultivo

(DMEM + suero, u otros medios básicos) Hasta 30 pases o subcultivos

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Figura 2.6 Esquematización del método de obtención de hepatocitos de rata.

Recomendaciones básicas para el aislamiento de células

Los cultivos celulares deben ser monitoreados con frecuencia, por ejemplo el color del medio puede indicar cambios de pH, un color amarillo puede indicar una concentración muy alta de CO2, o bien un sobrecrecimiento de las células; un medio de color rojo/púrpura intenso indica un aporte de gas inadecuado, ya sea porque las tapas de los frascos no fueron debidamente aflojadas o porque el suministro de CO2 se ha terminado; por otra parte si el medio esta turbio, es probable que haya una contaminación.

Los cultivos adherentes deben ser examinados con un microscopio invertido con óptica de contraste de fases. Las células adherentes deben expandirse en forma de tapiz sobre el soporte de plástico. Normalmente, las células son inhibidas por contacto y dejan de crecer al hacerse confluentes, es decir cuando no hay substrato entre ellas. Habitualmente, las células deben subcultivarse antes de que sean totalmente confluentes. Las células en suspensión no deberían verse adheridas al sustrato normalmente (aunque en algunos casos puede inducirse su adhesión) y las células sanas aparecen redondeadas y con membranas lisas, a diferencia de las células adherentes. La elaboración de una curva de crecimiento permite familiarizarse con la concentración celular relativa y su correspondiente grado de confluencia tanto para células adherentes como para células en suspensión.

Aislamiento de Hepatocitos de Rata

Perfusión del hígado con medio sin Ca +EDTA

Segunda perfusión con medio + colagenasa + iones Ca

Disecación del hígado de la cavidad abdominal

Traspaso de hígado a tampón de bicarbonato + CaCl2 1mM

Trocear el hígado con tijeras

Retirar la suspensión celular y filtrar (tamiz de 100 µm)

Centrifugación (50g x 5´)

Las células de interés se encuentran en el pellet

Múltiples lavados de las células por centrifugación

Ultimo lavado en el medio elegido para el cultivo

Determinación de viabilidad con azul

de tripano

Cultivo en medio + suero + antibióticos y/o aa Formación de una monocapa

Recambios diarios de medio

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Introducción

Los cultivos de células animales tienen aplicación, como técnicas únicas o complementarias de otras, en un gran número de líneas de investigación. De esta forma han sido fundamentales para numerosos avances científicos alcanzados en distintas ramas de las ciencias biomédicas y biológicas. Así por ejemplo, las técnicas de cultivo celular permiten el estudio de las propias células, su metabolismo, el control del ciclo celular, la modulación de la expresión génica, el cultivo de virus, la clonación y el estudio de numerosos aspectos relacionados con el cáncer y su diagnóstico, por citar sólo algunos ejemplos.

Lección 21: Contaminación

Si la contaminación se define como un componente en el sistema del cultivo celular que ejerce un impacto negativo en el cultivo o en su uso, los contaminantes de un cultivo celular se pueden agrupar en tres categorías: físicos, químicos y biológicos. Las fuentes y consecuencias de la contaminación son únicas para cada tipo celular y para cada contaminante. Algunas recomendaciones esenciales para la técnica básica de manipulación estéril incluyen el empleo de pipeteadores y pipetas automáticas; el trabajo se debe realizar en un ambiente estéril, en una cabina de flujo laminar o en el área de influencia de un mechero bunsen, manteniendo el orden dentro de la cabina; los recipientes abiertos deben mantenerse tan poco tiempo como sea posible; ante cualquier duda limpiar con alcohol 70 % o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable, o reemplazarlo si es posible. De todas formas las precauciones a tomar son muchas y la única forma de aprender es practicar bajo supervisión.

A continuación se listan los tres diferentes tipos de contaminación que se pueden presentar así como algunas recomendaciones para evitarlas.

1. Contaminantes físicos. Son fenómenos externos que afectan al cultivo celular, tales como: temperatura, radiación, irradiación y vibración. La exposición del medio, de los componentes del medio y de los cultivos celulares a la radiación, irradiación y temperaturas extremas pueden elicitar respuestas metabólicas en los cultivos celulares, como la sincronía del ciclo celular, reducción de la tasa de crecimiento y muerte celular. Para evitar el impacto del medio ambiente físico en los cultivos celulares, por ejemplo, se debe ubicar las incubadoras en un lugar donde la temperatura permanezca razonablemente constante, alejadas de equipos que puedan crear vibración como las centrifugas. El medio, los componentes del

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medio y los cultivos celulares pueden ser guardados en sitios específicos del laboratorio en donde se minimice la exposición a la luz y a temperaturas extremas entre otros. Los medios no se deben guardar en neveras que tengan puertas de vidrio o translucidas, ni cerca de radioisótopos.

2. Contaminantes químicos. La contaminación química puede provenir de diversas fuentes, y no siempre da como resultado un efecto negativo como la toxicidad, se podría dar el caso de que el contaminante estimule el crecimiento si uno de los elementos del medio o el suplemento llegara a estar contaminado con un factor estimulante como una hormona. Sin embargo, uno de los contaminantes químicos más probables o comunes son los residuos de jabón o detergente, que quedan en el material después del lavado. Las fuentes de contaminación química pueden ser los contenedores y materiales de plástico, los reactivos (deben ser de la más alta pureza), el agua (puede contener impurezas como iones de metales, compuestos orgánicos, endotoxinas bacterianas), el suero (existe muchas variación entre lotes) y los suplementos. Los nutrientes esenciales como los aminoácidos pueden ser tóxicos para un cultivo celular si se presentan en concentraciones que exceden el rango óptimo para el crecimiento celular.

3. Contaminantes biológicos. La contaminación biológica de un cultivo celular puede ser el resultado de un único organismo que se introduce al cultivo y es capaz de replicarse. Esta contaminación puede ser en forma de otras líneas celulares, insectos, artrópodos, protozoarios, mohos, levaduras, virus, bacterias y micoplasmas. Existen muchos test y técnicas para determinar los diferentes tipos de contaminación biológica. Para confirmar la identidad de una línea celular se pueden realizar análisis cariotípicos y de isoenzimas. Se pueden realizar tests de esterilidad de los medios para detectar bacterias y hongos. Para detectar contaminación por micoplasmas se necesita de una batería mayor de ensayos además del test de esterilidad. Existen varios ensayos in vitro e in vivo para determinar si una línea celular determinada se encuentra libre de virus contaminantes. Estos procedimientos incluyen el empleo de anticuerpos de hamsters, ratas y ratones, ensayos de transcriptasa reversa, hemaglutinación y ensayos de hemabsorción. La identificación de un contaminante biológico es crucial a la hora de validar resultados. En general el empleo de una buena técnica aséptica y test de control de calidad para prevenir la contaminación por micoplasmas pueden prevenir la contaminación por cualquier otro contaminante biológico.

Las especies más comunes de micoplasmas que se han encontrado en cultivos de células humanas son: Mycoplasma orale, M. fermentans y M. salivarium. Los micoplasmas alteran el metabolismo del cultivo celular, activando una cascada de eventos metabólicos que dan como resultado niveles alterados de proteínas y de síntesis de RNA y DNA. En general la contaminación por micoplasmas puede generar múltiples cambios en la línea celular que inevitablemente ocasionaran errores en los experimentos.

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Como prevención y control, el primer paso es determinar la existencia de la

contaminación. Para esto se deben eliminar los antibióticos del cultivo celular para determina la existencia de contaminación bacteriana o por micoplasmas. Se debe seguir una técnica aséptica muy rigurosa y que todo el personal encargado del manejo de los cultivos la siga. Los reactivos y medios deben ser de la mejor calidad y su preparación debe ser muy cuidadosa. Se deben tener cultivos maestros preferiblemente congelados y que estén certificados de estar libres de contaminantes. Para que en el caso de encontrar contaminación, se puedan reemplazar los cultivos.

Para la detección de contaminantes biológicos existen métodos directos e indirectos. En los métodos directos se emplean líneas celulares, que hacen crecer en medios con todos los suplementos a excepción de los antibióticos y por un tiempo prolongado para permitir el crecimiento del contaminante. Después se evalúa el crecimiento de la línea celular y se hacen extracciones que se pueden revisar al microscopio o con colorantes especiales como el Hoechst 33258, que permiten evaluar la presencia de micoplasmas (Figura 2.7). En los métodos indirectos se encuentran: La PCR (reacción en cadena de la polimerasa), tinciones de fluorocromos de DNA, ELISA, pruebas de DNA, microscopia electrónica y ensayos bioquímicos. Los métodos indirectos detectan concentraciones de 104

micoplasmas por ml, pero estos métodos varían en su capacidad de detectar un amplio rango de especies.

Figura 2.7 Células infectadas con micoplasma y teñidas con Hoechst 33258. Las células presentan fluorescencia extranuclear debida a la presencia del DNA de micoplasmas en el citoplasma. Fuente: Doyle & Griffiths, 1998.

Lección 22: Caracterización y Autenticación

La investigación y desarrollo con líneas celulares requiere de un conocimiento preciso de la pureza y la especie del origen de la línea celular que se empleará en la investigación. Esto se puede lograr con el monitoreo constante de

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la línea para evaluar la posible contaminación con otras células y para determinar las características que autentican la línea celular. Debido a los múltiples desarrollos de la investigación farmacéutica, biomédica y biotecnológica, el conocimiento y certificación de una línea celular es de gran importancia para todas las conclusiones y resultados que se deriven de estas investigaciones. En la tabla 2.4 se hace una comparación gruesa de las características de las técnicas de autenticación más comunes.

TABLA 2.4 COMPARACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE AUTENTICACIÓN CELULAR

Análisis citogenético

Análisis por isoenzimas

Perfiles de DNA fingerprinting

Determinación de especie a

Rápida identificación de una línea celular

Detección de variación en una línea celular

Reconocida por autoridades regulatorias

?b

a : ampliamente usado

b?: bajo consideración

Análisis citogenético

La examinación del contenido cromosomal de una línea celular es un método directo de confirmar la especie de origen de la línea celular, y para determinar si existen aberraciones en el número y morfología de los cromosomas. Para preparar un cultivo para un análisis citogenético, este debe ser incubado con colcemid (o colchicina) por 2 horas aproximadamente, suspendido, centrifugado, resuspendido en solución hipotónica y fijado en una solución de metanol-ácido acético (carnoy). Las células fijadas son goteadas en láminas portaobjetos para obtener cromosomas en metafase. Las láminas se pueden teñir con una variedad de técnicas, cada una de las cuales aporta información diferente. Estas técnicas incluyen la tinción con Giemsa, bandeo con tripsina-Giemsa, tinción con mostaza de quinacrina, bandeo C, bandeo con Hoechst 33258, Bandas G-11, y FISH.

La tinción de metafases con Giemsa se emplea para contar el número de cromosomas y determinar la ploidia. Se deben examinar al menos 100 metafases

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por cultivo. El bandeo con tripsina-Giemsa permite asignar todos los cromosomas al cariotipo (Figura 2.8). Otros métodos de tinción tienen aplicaciones más específicas. Por ejemplo, la mostaza de quinacrina muestra rápidamente la presencia del cromosoma Y humano. El bandeo C, localiza los centrómeros, mientras que el Hoechst 33258 y el bandeo G-11 se emplean para estudios particulares de híbridos interespecies.

Figura 2.8 Cariotipo humano con tinción tripsina-Giemsa. Se muestran los cromosomas normales y los marcadores cromosomales. Fuente: Mather & Barnes, 1998.

La técnica FISH es particularmente poderosa, es un método altamente especializado empleado para reunir el análisis citogenético con determinación de la ploidia, aneuploidia, identificación de marcadores cromosomales, detección de deleciones y detección de fragmentos de cromosomas especie-específicos en células hibridas. El FISH es particularmente usado en el análisis de translocaciones cuando el segmento translocado no se puede determinar por las técnicas comunes de bandeo.

Análisis por isoenzimas

El análisis por isoenzimas es usado para la determinación de líneas celulares y para la detección de contaminantes en una línea dada. Las isoenzimas son enzimas que exhiben polimorfismos inter e intraespecies, y cada especie posee un patrón de movilidad electroforética definida para sus isoenzimas. Este

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método ofrece la facilidad de ser rápido y ser altamente sensible. Ciertas proteínas analizadas isoenzimáticamente pueden sufrir modificaciones post-transcripcionales, las cuales varían con el tipo celular. Esto ofrece una característica adicional y es que pueden servir como marcadores del tipo de tejido origen en un estado de desarrollo dado.

DNA fingerprinting

El método de DNA fingerprinting se basa en la existencia de regiones de secuencias dispersas e hipervariables repetidas en tandem a lo largo del genoma. Polimorfismos en estas regiones le otorgan a las especies la existencia de múltiples alelos diferentes, cada uno poseedor de una secuencia repetida en tandem con sus propias características. Las secuencias con varias repeticiones de un tamaño de 15 pb se conocen con el nombre de “minisatelites” (o VNTRs por variable number of tandem repeats). Las secuencias son repeticiones en tandem más cortas (1 a 5 pb) se conocen como “microsatelites” (o STRs por short tandem repeats).

Se han descrito muchos métodos para el DNA fingerprinting de líneas celulares. Uno de estos involucra el análisis por RFLPs (restriction fragment length polymorphism) y la técnica de Southern blot usando multilocus de sondas VNTRs, que se unen a diferentes regiones hipervariables distribuidas en distintos cromosomas. Otra alternativa es el empleo del análisis por RFLPs de un solo locus polimórfico (SLP) y las sondas que detectan un único VNTR polimórfico de un único loci. Otro método rápido para la obtención de DNA fingerprinting en líneas celulares humanas involucra la amplificación por PCR de locus polimórficos o de múltiples VNTRs o SRTs, el procedimiento se conoce como AmpFLP (amplified fragment length polymorphism).

Lección 23: Cuantificación celular

A la hora de realizar estudios comparativos y en muchos de los pasos del cultivo celular es necesario cuantificar la población celular. Clásicamente, este conteo se realiza en un microscopio con una cámara de conteo (hemocitómetro) y en presencia de un colorante vital (por ejemplo, el azul de tripano) para distinguir las células viables de las muertas. Pero estas tinciones llegan a ser subjetivas y el conteo no da una idea de la relación tamaño/masa. También existen contadores automatizados de células (células totales) en cultivos celulares que no forman agrupaciones en las suspensiones celulares. Otro método que se emplea es el conteo de núcleos luego de disolver los citoplasmas, método usado generalmente en los cultivos que forman agrupaciones celulares, en las cuales las células son inaccesibles (por ejemplo en matrices) o en donde es difícil la tripsinización de los substratos. Si la viabilidad es el factor importante a medir, se puede emplear la

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técnica de contar las células que son capaces de dividirse empleando el método del índice mitótico.

Cuando el conteo directo no es posible, como en una monocapa o en células inmobilizadas en matrices, se deben tomar medidas indirectas. Ejemplos de esto son el consumo de glucosa y oxigeno, o de otros metabolitos como ácido láctico, ácido pirúvico y dióxido de carbono. Un parámetro ampliamente usado es la medición de la concentración de lactato deshidrogenada, ya que ésta es liberada al medio a medida que las células mueren.

Conteo con hemocitometro

La cámara Neubauer, también conocida como hemocitómetro, consta de un cubreobjetos de cuarzo y un portaobjetos de un grosor mayor a los de uso común. En la parte superior del portaobjetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno transversal central. En la parte superior e inferior del canal transversal están grabadas dos rejillas de 9 mm2 de superficie, las cuales están a su vez subdivididas en una cuadrícula más pequeña. Usando el objetivo de 10X de un microscopio óptico, se enfoca de forma que en el campo se cubra un cuadrado cuya área corresponda a 1 mm2. El área del cuadro central es de 1 mm2 y se encuentra subdividida en 25 cuadrados. Una vez se ha contado el número de células de uno de estos cuadrados, el número de células en 1 ml de suspensión es ese valor multiplicado por 104. Para realizar el conteo celular se debe preparar una suspensión homogénea de células mediante agitación suave del frasco de cultivo. Se extrae un pequeño volumen de la suspensión y se mezcla con suavidad con un volumen igual de tripano azul al 0,5% (w/v) en un tubo pequeño. Para determinar la viabilidad del cultivo celular, puede repetirse el recuento sin utilizar azul de tripano y se comparan las dos cifras para obtener el porcentaje de células vivas.

Curva de crecimiento

Es importante elaborar una curva de crecimiento para determinar las características de crecimiento de las células que se están cultivando. Son sencillas de realizar y dan información sobre la frecuencia de los pases, además de que permiten predecir el número de células viables disponibles para necesidades futuras. Las células en suspensión deben diluirse a 1 x 105/ml y subcultivarse a tres frascos en el día 0. Cada uno de esos cultivos debe contarse diariamente, durante al menos 5 días. Se debe anotar la concentración celular y el tiempo en horas. Las células adherentes deben subcultivarse a 1 x 105 para una placa de 90 mm. Se preparan tres cultivos para cada día durante 5 días, es decir, cultivos que se inician en el día 0. Esto se debe a que las células adherentes tienen que tripsinizarse, por lo que, cada cultivo solo puede emplearse una vez. De nuevo, durante 5 días se cuentan tres cultivos diarios, y se registra la concentración

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celular y el tiempo en horas. En la figura 2.9 se ilustra la elaboración de curvas de crecimiento de células adherentes y en suspensión.

Figura 2.9 Elaboración de una curva de crecimiento. A. para células en suspensión y B. para células adherentes. Fuente: Morgan & Darling, 1995

Las curvas de crecimiento se pueden realizar utilizando papel estándar para graficas pero es más sencillo emplear papel semilogarítmico (es suficiente con dos o tres ciclos). El gráfico puede presentar una fase de eclipse inicial en la que el crecimiento celular es escaso, y posteriormente la concentración se incrementará de forma logarítmica (fase exponencial), apareciendo en forma de línea recta. Tras varios días, la tasa de incremento celular se frena y en ocasiones ya no aumenta (fase de meseta) e incluso puede comenzar a disminuir. La figura 2.10 presenta un ejemplo de una curva de crecimiento típica. El tiempo de duplicación del cultivo, una vez calculado para una línea celular, permite predecir la concentración celular probable en cualquier momento futuro. Las células deben subcultivarse antes de que alcancen una concentración en la que se frene el crecimiento, por lo que es importante determinar las curvas de crecimiento de todas las líneas celulares.

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Figura 2.10 Curva de crecimiento típica de un cultivo celular Fuente: Morgan & Darling, 1995

Ensayo MTT

Es un método colorimétrico sensible y de cuantificación, se emplea para determinar viabilidad, proliferación y activación celular. Este ensayo está basado en la capacidad de la enzima mitocondrial deshidrogenasa que en las células vivas convierte el substrato amarillo hidrosoluble 3-(4,5-dimetiltiazol -2) -2-5- dimetil bromuro tetrazolium (MTT) en un producto de formazan de color azul oscuro, cuya cantidad es directamente proporcional al número de células vivas.

Ensayo del Rojo Neutral (NR)

El rojo neutral (3-amino-7-dimetil-2.metilfenazina hidrocloridrato) es soluble en agua, es un colorante supravital que se acumula en los lisosomas de las células viables. La acumulación de NR en los lisosomas ocurre por la unión de NR a las cargas acidas fijas, así como a los polisacáridos en la matriz de los lisosomas. En las células dañadas o muertas el NR no es retenido en las vacuolas citoplasmáticas y la membrana citoplasmática no actúa como una barrera para mantener el NR dentro de la célula.

Ensayo LDH

La medición de lactato deshidrogenasa (LDH) de los sobrenadantes de un cultivo da un valor cuantitativo de la pérdida de viabilidad celular. La actividad de LDH puede ser medida como la reducción de piruvato a lactato. La reducción es seguida por la oxidación de NADH a NAD+ la cual puede ser seguida espectrofotométricamente a 360 nm.

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Lección 24: Transfección

La transfección es la introducción de DNA extraño en células eucariotas receptoras, en términos generales es la contrapartida de las técnicas de transformación en células procariotas. Una célula transfectada representa el resultado de la combinación de disciplinas que van de la biología molecular, la microbiología y la biología celular hasta el cultivo celular. Las técnicas de transfección celular, han permitido en gran medida, ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de aproximaciones experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la selección de líneas celulares modificadas, entre otras.

Los métodos de transfección se pueden clasificar en químicos, físicos y biológicos. Los métodos químicos se basan en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a través de las membranas (lipofección). Los métodos físicos se basan en hacer entrar las moléculas a las células por la fuerza, para esto existen técnicas especializadas como la microinyección y la electroporación. Los métodos biológicos se valen de vectores virales (transducción) y de vectores bacterianos (bactofección). En la tabla 1.6 se encuentran resumidas algunas ventajas y desventajas de los métodos de transfección.

TABLA 2.5 COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN EN CÉLULAS ANIMALES

MÉTODO VENTAJA DESVENTAJA

Transfección química

Altamente efectivo en cultivos celulares

Sin limitaciones en tamaño de transgen

Relativamente simple

Rápido y repetible

Limitado en términos de aplicaciones clínicas

Algunas formulaciones son costosas

Dependencia del tipo celular

Transfección física

Alta eficiencia en la transferencia

Sin limitaciones en tamaño de transgen

No dependiente del tipo celular

Disponible para aplicaciones clínicas

Requerimiento de instrumentos especializados

Transducción

(vectores virales)

Alta eficiencia en la transferencia de genes

Posibilidad de marcaje célula-específico

Clonaje complejo

Costoso

Necesita condiciones de bioseguridad

Se puede provocar respuesta inmune en mamíferos

Bactofección

(vectores bacterianos)

Alta eficiencia en la transferencia de genes

Necesita condiciones de bioseguridad

Se puede provocar respuesta inmune en mamíferos

No se ha estudiado completamente

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Métodos químicos

Estos métodos tienen como ventaja, frente a los otros métodos, su simplicidad, facilidad de producción y su relativa baja toxicidad.

1. Método del fosfato cálcico: Se realiza una mezcla de DNA con iones calcio, con una subsiguiente adición de fosfato a la mezcla y la presentación de la solución final a las células en cultivo. En esta situación co-precipitan el DNA y los iones calcio formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. La eficiencia de transfección puede ser mayor al 50% dependiendo del tipo celular y del tamaño y calidad del precipitado que se forma.

2. Método del DEAE dextrano: Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las moléculas de DNA a través de interacciones electrostáticas formando complejos. Cuando estos complejos son adicionados a las células, se unen la membrana plasmática que está cargada negativamente y son internalizados por endocitosis. La eficiencia de la transfección por este método es alta, reportándose eficiencias mayores al 80%.

3. Lípidos catiónicos: Se basa en la formación de un complejo entre lípidos catiónicos y DNA el cual tiene afinidad por la membrana y así ocurre la entrada del DNA en el citosol (figura 2.11). Existen un gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por ej. DOTMA). Se obtienen buenas eficiencias de entre el 70 y el 90% de las células de la placa.

Figura 2.11 Formación de un liposoma y su endocitosis. Fuente: http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpintro.html

4. Polímeros catiónicos: Los polímeros catiónicos son un grupo de moléculas altamente solubles en agua. Algunos de los polímeros catiónicos

http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpintro.html

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usados en transfección son polilisina, espermitina e histona. Como en el caso de los lípidos catiónicos se forman complejos con el DNA. Los complejos formados entre el polímero y el DNA se llaman poliplexos, que cuando son adicionados a las células en cultivo, son tomados por las células. Comparados con los lípidos cationes, la mayor desventaja que presentan es la relativamente alta toxicidad.

Métodos físicos

Estos métodos se basan en la introducción mecánica de moléculas al interior de la célula.

1. Microinyección directa: Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos. Permite la introducción mecánica de soluciones en el interior de la célula mediante una micropipeta que se controla con la ayuda de un micromanipulador bajo un microscopio (Figura 2.12).

Figura 2.12 Microinyección Fuente: http://transgenese.crchul.ulaval.ca/knockout.htm

2. Electroporación: La electroporación es una técnica que se basa en la aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto, tiempo durante el cual las células despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, DNA,...). Esta técnica se aplica a millones de células a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones).

http://transgenese.crchul.ulaval.ca/knockout.htm

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Transducción

La transducción se puede definir como el proceso de transferencia genética desde una fuente donadora a una célula receptora mediante partículas virales, que pueden ser bacteriófagos u otros agentes virales. Un ejemplo de lo anterior es la transfección mediada por retrovirus. Los retrovirus son virus cuyo material genético está compuesto por RNA. La transferencia de genes mediada por vectores retrovíricos aprovecha la capacidad del virus para infectar a la célula hospedadora e integrarse en su genoma al mismo tiempo que se impide que el virus se replique en la célula infectada.

Bactofección

La transferencia de plásmidos de DNA a célula eucariotas mediada por bacterias o bactofección, es una técnica reciente y novedosa en la cual una bacteria transportadora de un plásmido es introducida a la célula a transformar, posteriormente libera el plásmido y es parcial o totalmente destruida. Este método no es ampliamente usado pero se hacen esfuerzos para mejorar los resultados obtenidos a través de ella. Mediante esta metodología se ha logrado expresar en las células transfectadas proteínas antígenos, toxinas y enzimas.

Lección 25: Células madre

La capacidad de multiplicarse es inherente a toda célula viva. Sin embargo, en organismos complejos como los mamíferos, integrados por una gran variedad de células, esta capacidad se manifiesta de muy diversas formas y con grados distintos. En este sentido, las llamadas células madre se definen por ser capaces de dividirse generando nuevas células madre y, además, poder diferenciarse, en el curso de su multiplicación, lo que da lugar a distintos tipos celulares. Así ocurre con las células madre más conocidas, las de la médula ósea, que son las encargadas de originar diariamente en el organismo, tipos celulares tan dispares como los glóbulos rojos, los leucocitos o las plaquetas mediante el proceso biológico conocido como hematopoyesis. No obstante, existen otras muchas células madre, tanto en los tejidos del organismo adulto como, especialmente, en el embrión a lo largo de las diferentes etapas de su desarrollo.

La facultad de multiplicación y diferenciación de las células madre, independientemente del grado en que la posean, se puede materializar no sólo en el organismo adulto o embrionario, sino también en cultivos en condiciones de laboratorio. Por ello se han desarrollado metodologías para cultivar células madre de manera controlada, para inducir su diferenciación con el objeto de generar tipos celulares distintos, que pudieran servir para la regeneración de tejidos u órganos dañados por procesos patológicos. Al menos en teoría, son muchas las

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enfermedades cuyo tratamiento podría beneficiarse del empleo de esta “terapia celular”, si bien conviene aclarar que nos encontramos en los primeros estadios de este tipo de investigaciones y que aún queda mucho por conocer.

Está bien establecido que no todas las células madre tienen el mismo potencial de generación de tipos celulares distintos, lo que permite diferenciar entre células madre totipotentes, pluripotentes y multipotentes.

1. Células madre totipotentes: Se dan sólo en fases muy tempranas del desarrollo embrionario y son capaces de generar cualquier tipo celular. Además son capaces de generar las membranas y tejidos, como la placenta, que soportan el desarrollo del feto, por lo que serían capaces de originar un organismo completo, y de ahí que se les otorgue la propiedad de la totipotencia.

2. Células madre pluripotentes: En fases posteriores del desarrollo embrionario las células del embrión pierden el carácter totipotente y solamente pueden producir células madre de tipo pluripotente, capaces de originar cualquier tipo de células del organismo adulto, pero no de generar un organismo completo. Existe un caso muy especial de células madre pluripotenciales provenientes de estadios tardíos del desarrollo embrionario. Son las llamadas células madre germinales y se pueden obtener a partir de las células primitivas de las crestas germinales de fetos abortados.

3. Células madre multipotentes: Las células madre se pueden encontrar en algunas localizaciones en el organismo adulto siendo capaces, en determinadas condiciones, de generar algunos tipos celulares. Su plasticidad es menor por lo que poseen una cierta multipotencia.

De acuerdo con lo anterior, conviene resaltar que las células madre pueden proceder del embrión (células madre embrionarias) o del organismo adulto (células madre adultas). Las primeras son las responsables de generar los más de doscientos tipos celulares distintos presentes en el organismo adulto. A lo largo del desarrollo embrionario existe una gradación en cuanto a la posible potencialidad de generación de tipos celulares por parte de las mismas, que va de la totipotencia a la pluripotencia en diverso grado. Por el contrario, las segundas cumplen una función biológica determinante al ser las responsables del recambio de las células dañadas en el mismo y, por lo tanto, de la preservación de la integridad y la función del tejido en que se encuentran.

Las células madre embrionarias se caracterizan por su capacidad de multiplicación indefinida, que les permite además generar una progenie de células especializadas de muy distintos tipos. No están diferenciadas a término, sino que, tras completar un proceso de división y dependiendo del ambiente en que se produce su multiplicación, las células hijas pueden permanecer como células

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madre o iniciar un proceso de diferenciación. La posibilidad de conocer los procesos que gobiernan la diferenciación celular, para generar tal variedad de fenotipos celulares, es la base del interés científico de los estudios con células madre embrionarias. Sólo a partir de ese conocimiento cabe pensar en dirigir estos procesos para originar cultivos celulares, o cultivos de tejidos in vitro, que pudieran sustituir in situ a los tejidos dañados por procesos patológicos, desarrollando las correspondientes aplicaciones médicas de estas investigaciones.

Hay varias fuentes de obtención de células madre embrionarias pluripotentes. La primera de ellas son los teratocarcinomas o carcinomas embrionarios que no tienen un origen estrictamente embrionario. Se trata de tumores gonadales que contienen una amplia variedad celular, representativa de las células derivadas de las tres capas celulares que forman un embrión. La segunda fuente de obtención son los embriones generados por fecundación de un óvulo con un espermatozoide. Se han cultivado células madre embrionarias procedentes de blastocistos de ratón y de blastocistos humanos. Las células así cultivadas parecen tener la capacidad de poder mantenerse en cultivo indefinidamente. También es posible obtener células pluripotentes a partir de tejidos de fetos abortados. Si se quiere obtener un cultivo o línea celular de células madre embrionarias (figura 2.13), el proceso comienza aislando, con técnicas de microcirugía, la masa celular interna del embrión. Esta masa de células se coloca sobre un soporte de vidrio o plástico donde existe un líquido rico en los nutrientes que necesitan las células para multiplicarse y crecer. Conforme las células van dividiéndose y aumenta su número, se va repitiendo el proceso. Así al final se obtiene una línea celular de células embrionarias.

Figura 2.13 Estrategia de obtención de un cultivo de células madre de embrión. Fuente: www.smartplanet.es/articulos.php?id=9-4-4

http://www.smartplanet.es/articulos.php?id=9-4-4

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Se ha abordado la posibilidad de emplear células madre embrionarias para

llevar a cabo tratamientos de enfermedades en animales de experimentación. Utilizando un modelo animal, se ha puesto de manifiesto cómo las neuronas dopaminérgicas, derivadas de células madre embrionarias, pueden funcionar adecuadamente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. También se ha descrito la corrección de la diabetes en ratones con diabetes experimental con células productoras de insulina derivadas de cultivos de células madre embrionarias. Conviene destacar que todos estos experimentos se consideran preliminares, requieren la inmunodepresión de los ratones para evitar los problemas de rechazo inmunitario y son objeto de controversia.

En cuanto a las células madre adultas, existe en el adulto una generación de células con una cierta plasticidad. Son éstas las células somáticas que merecen el nombre de células madre adultas. Éstas dan lugar a células especializadas mediante la generación de otras con especialización intermedia llamadas progenitoras. Las células progenitoras están determinadas para originar un tipo celular concreto, en función de la situación en la que se encuentran en relación con células vecinas. Por ejemplo, las células progenitoras del intestino están situadas en la base de las criptas intestinales. Estas células se dividen con gran frecuencia pero permanecen como un grupo de reserva para dar lugar a células del intestino. Por tanto, las células madre adultas no poseen el grado de indefinición funcional de las células madre embrionarias debido al ambiente celular vecino.

El conjunto de tejidos adultos conocidos en donde se encuentran células madre se incrementa de forma continua. Actualmente incluye la médula ósea, sangre periférica, cerebro, columna vertebral, pulpa dental, vasos sanguíneos, músculo esquelético, epitelio de la piel y del sistema digestivo, cornea, retina, hígado y páncreas. Las células madre adultas son escasas dentro de los tejidos que las albergan siendo ésta una de las razones que hacen difícil su identificación, aislamiento y purificación. Por ejemplo, en la médula ósea una de cada diez mil células es madre hematopoyética.

En cuanto al cultivo de células madre adultas en condiciones de laboratorio, resulta difícil, hasta ahora, mantenerlas en condiciones de proliferar en estado indiferenciado durante largos periodos de tiempo. No obstante existen ya excepciones, como las células precursoras mesenquimáticas de la médula ósea, que se pueden mantener en crecimiento durante más de ciento veinte generaciones. En la figura 2.14 se esquematiza el método para la obtención de un cultivo de células madre adultas de un ratón.

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Figura 2.14 Estrategia de obtención de un cultivo de células madre adultas Fuente: www.smartplanet.es/articulos.php?id=9-4-4

Finalmente, también existen las llamadas células madre fetales, que se obtienen del cordón umbilical y poseen características similares a las células madre adultas. En el siguiente link se puede observar una grabación de la obtención de células madre fetales en una institución colombiana pionera en la

investigación en células madre: http://www.bancodecelulas.com/p-vmuestra.htm

Lección 26: Cultivos celulares de insectos

El establecimiento de líneas celulares de insectos y arácnidos se ha hecho rutinario, mientras que las de invertebrados de otros taxones no han producido líneas celulares de mayor éxito. Hasta hoy día, se han establecido más de 400 líneas celulares de cerca de 100 especies de insectos que representan las especies económicamente más importantes.

Los factores para desarrollar un cultivo celular de insectos son complejos. El primero de ellos, es el tamaño reducido, que en las especies de insectos más pequeños hace casi imposible el logro de un cultivo celular. Otro problema es que los insectos generalmente se encuentran en medios relativamente sucios o expuestos a muchos agentes potenciales de contaminación. Este problema se puede solucionar al mantener un cultivo o una colonia de insectos bajo condiciones controladas. Otro punto a considerar para el desarrollo de líneas celulares de insectos es el medio de cultivo. Aunque comercialmente existen formulaciones de medio para insectos como: Grace, TC-100 , ExCell 401, SF-900 e Insect-Xpress, dada la cantidad de especies y líneas celulares que se pueden obtener, todavía existen limitantes a este respecto y para cada cultivo en especial se deben hacer ensayos hasta logar la mejor formulación y los suplementos necesarios como péptidos o suero.

http://www.smartplanet.es/articulos.php?id=9-4-4

http://www.bancodecelulas.com/p-vmuestra.htm

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En general para iniciar cultivos primarios se recomienda contar con células

embrionarias, para lo cual disponer de una colonia de insectos es el medio más sencillo. Por ejemplo los huevos se pueden desinfectar con una solución de etanol al 70%, seguida por enjuagues con agua destilada estéril. A continuación los huevos pueden ser disgregados físicamente con un homogenizador en medio de cultivo, y las células en suspensión se transfieren a una placa de cultivo con medio para que inicien una monocapa. Otro método para la obtención de células embriónicas es el tratamiento con soluciones clorinadas con una posterior disgregación celular a través de métodos enzimáticos (tripsina, colagenasa, hiluronidasa y elastasa) y métodos físicos. En la figura 2.15 se muestra el esquema de un procedimiento de obtención de células embrionarias de insecto.

Figura 2.15 Pasos para la preparación de un cultivo celular de insectos Fuente: Vlak et al, 2002.

El crecimiento de las células de insectos es lento. Durante las primeras semanas de crecimiento se debe ir reemplazando el medio, pero se deben recobrar por centrifugación las células que pudieron ser extraídas en el medio viejo. Los cultivos se deben monitorear en microscopio invertido de contraste de fases. Cuando el cultivo alcanza el 80% de confluencia se puede realizar un subcultivo. Para desprender las células del plato de cultivo en el procedimiento de subcultivo, se puede emplear la fuerza mecánica (bombeo) de una pipeta, el

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enfriamiento del cultivo a 4ºC durante 20 minutos seguido de bombeo con pipeta, tratamientos enzimáticos, o un rayador de células, que no es más que un tubo estéril diseñado para estos propósitos. De la misma manera que cualquier otro cultivo celular, en los cultivos de insectos de debe tener precaución de la contaminación y muy especialmente de la contaminación cruzada con otras líneas celulares.

En la autenticación de líneas celulares de insectos se emplea comúnmente el análisis por DNA fingerprinting y especialmente el análisis por isoenzimas. Dado que el análisis cariológico en insectos es complejo ya que algunas especies presentan diferentes ploidias, incluso haploidía (himenópteros) este análisis no es rutinario para caracterizar líneas celulares de insectos, aunque no se descarta que el cultivo celular se pueda emplear como una herramienta para el análisis cariotípico de insectos. Además de la autenticación celular, las líneas deben ser monitoreadas periódicamente para contaminantes, el primer método para esto es el no empleo de antibióticos en el medio, de esta forma si un agente bacteriano llega a penetrar en el cultivo podrá desarrollarse y será detectado rápidamente. Para otros contaminantes como virus y micoplasmas existen test comerciales, y es recomendable chequear los cultivos periódicamente. Por estas razones el importante mantener un stock congelado de las líneas celulares que se manejen, para que en el caso de hallar contaminantes en el cultivo se pueda retomar el cultivo desde el stock.

Los cultivos celulares de insectos se utilizan, comúnmente, como sustratos para el aislamiento e identificación de arbovirus. Sin embargo, existe en la actualidad una amplia gama de aplicaciones de esta técnica en investigaciones biomédicas y tecnológicas, entre las cuales sobresalen: la expresión de genes exógenos a partir de moléculas de DNA recombinante para el análisis de procesos genéticos de regulación, los cuales son difíciles de medir en el organismo entero; los estudios de cocultivos con parásitos; los estudios de entomopatógenos, reguladores del crecimiento o de compuestos bioquímicos usados contra insectos; la detección y dosis de entomopatógenos o sus toxinas de muestras ambientales; la respuesta hormonal in vitro; la fisiología celular, y el aislamiento y la caracterización de bioinsecticidas.

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CAPITULO 6: Ingeniería de Tejidos

Introducción

La ingeniería de tejidos es una disciplina de diseño y construcción de órganos y tejidos para restaurar la función de tejidos perdidos, basada en los principios de la biología molecular del desarrollo y morfogénesis, guiada por la bioingeniería. La ingeniería de tejidos es un área multidisciplinaria que integra principios de ingeniería y de ciencias de la vida, para el desarrollo de sustitutos biológicos, biomiméticos o bioinspirados para la restauración, reparación, regeneración, reemplazo, modificación y ensamblaje de tejidos u órganos funcionales.

Lección 27: Materiales en ingeniería de tejidos

La investigación en el trasplante de órganos se ha beneficiado con el uso de las técnicas de cultivo celular y de tejidos. En las décadas pasadas se han dado grandes avance en el campo de los trasplantes principalmente por las nuevas técnica quirúrgicas y los agentes inmunosupresores. Desafortunadamente, todos los procedimientos de trasplante tienen un problema común: la demanda de tejidos viables u órganos de donadores excede la oferta. Este problema se ha pronunciado cada vez más, debido al crecimiento de la población y a que los tratamientos frente a las enfermedades cada vez son mejores y así se producen más candidatos para el trasplante de órganos o reparación de tejidos. De este modo, el trasplante o la transfusión se han convertido en la única esperanza de vida para muchos pacientes. Los dilemas éticos alrededor de la disponibilidad del trasplante de órganos humanos son frecuentemente debatidos.

Una posible solución a las deficiencias de órganos y tejidos es el desarrollo de métodos mejorados para la ingeniería de tejidos. En ingeniería de tejidos, los substitutos de órganos y tejidos son construidos en el laboratorio (por ejemplo por combinación de células vivas con componentes artificiales) para su subsecuente introducción en un paciente.

La ingeniería de tejidos es una disciplina en evolución, razón por la cual una definición precisa de esta disciplina es difícil de dar, pero se puede describir como: La aplicación de principios y métodos de ingeniería y ciencias de la vida a través del entendimiento fundamental de la relación entre estructura y función en tejidos normales y patológicos para el desarrollo de substitutos biológicos con el fin de restaurar, mantener o mejorar la función del tejido.

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Como en el desarrollo de nuevas drogas y órganos artificiales, el diseño de

nuevos métodos para ingeniería de tejidos puede ser mejorado con el uso de materiales sintéticos que son integrados con componentes biológicos de una forma racional. Frecuentemente, estos materiales son polímeros. Actualmente para los reemplazos implantables de cartílago, hígado, o tejidos nervioso se emplean combinaciones de polímeros sintéticos y células vivas.

Varios nuevos polímetros se han desarrollado desde 1930, incluyendo poliamidas, poliesteres y polietileno. El uso de polímeros como material biomédico se ha expandido recientemente. Como en el empleo de catéteres, materiales empleados en diálisis, marcapasos, corazones artificiales, bombas para extraer los excesos de líquido cerebroespinal entre otros.

Actualmente, muchos dispositivos médicos involucran biomateriales poliméricos (Tabla 2.6). Polímeros muy variados en presentaciones y formas son introducidos a pacientes alrededor del mundo cada día. Muchos de estos son comunes: catéteres, capas de marcapasos y lentes de contacto. En algunos casos, estos polímeros artificiales han permitido el paso de tecnologías revolucionarias, como la cadera artificial y el corazón totalmente artificial. Aún así, todavía falta mucho trabajo por ejemplo la cadera artificial es un reemplazo pálido del material natural, y los pacientes no sobreviven por largos periodos de tiempo con los corazones artificiales.

El desarrollo de mejores materiales y vías de empleo de estos traerá mejoras en la salud humana. El entendimiento de los mecanismos moleculares de la interacción celular con materiales sintéticos ha avanzado rápidamente. Este conocimiento ha dado herramientas para un desarrollo más racional de materiales y el rol de estos materiales en el reemplazo de tejidos y en la regeneración. Se pueden considerar las interacciones celulares con polímeros desde varios niveles de complejidad (Figura 2.16). En una dimensión se pueden estudiar, características tales como la adhesión celular y la propagación. En dos dimensiones se pueden considerar la forma y la orientación de las células, también como los patrones de migración celular y crecimiento y la respuesta de las células a los gradientes de superficie. Las estructuras en tres dimensiones dan la oportunidad de estudiar la interacción celular.

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TABLA 2.6 ALGUNOS DE LOS POLÍMEROS QUE PUEDEN SER USADOS EN INGENIERÍA DE

TEJIDOS, BASADOS EN ANTIGUOS DISPOSITIVOS BIOMÉDICOS

MATERIAL APLICACIÓN TÍPICA

Polidimetilsiloxano, elastómeros de silicona (PDMS)

Prótesis de pecho y testiculares

Catéteres

Dispositivos de liberación de fármacos

Válvulas del corazón

Bombas para hidrocefalia

Poliuretanos (PEU)

Corazones artificiales y dispositivos ventriculares

Catéteres

Marcapasos

Poli(tetrafluoroetileno) (PTFE)

Válvulas del corazón

Injertos vasculares

Prótesis faciales

Bombas para hidrocefalia

Catéteres y suturas

Polietileno (PE) Prótesis de cadera

Catéteres

Polisulfona (PSu) Válvulas del corazón

Prótesis penianas

Poli(metil metacrilato) (pMMA)

Cemento óseo para fijación de fracturas

Lentes intraoculares

Dentaduras

Poli(2-hidroxietilmetacrilato) (pHEMA) Lentes de contacto

Catéteres

Poliamidas Membranas de diálisis

Suturas

Poli(vinil cloruro) (PVC) Membranas de plasmaféresis

Bolsas de sangre

Poliestireno (PS) Envases para cultivo de tejidos

Poli(vinil pirrolidona) (PVP) Substitutos de sangre

Poli(etilen teraftalato) (PET) Corazones artificiales

Colágeno Piel artificial

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Figura 2.16 Desarrollo de biomateriales poliméricos para ingeniería de tejidos. Los biomateriales para ingeniería de tejidos son caracterizados por evaluación de adhesión celular y propagación (Nivel 1), migración y crecimiento celular (Nivel 2), y agregación celular y organización de tejido (Nivel 3). Fuente: Saltzman, 2004

Lección 28: Fundamentos de la ingeniería de tejidos

En general en el cultivo de tejidos hay varios tipos de investigación, que se enfocan en estudios de:

1. Actividad intracelular: enfocados a la replicación y transcripción del DNA, síntesis de proteínas, metabolismo tanto energético como de medicamentos, ciclo celular y la apoptosis.

2. Flujo intracelular: de RNA, translocación de complejos receptores de hormonas, el transporte en la membrana, y flujo de calcio.

3. Interacción con el ambiente: infección, citotoxicidad, carcinogénesis, la acción de medicamentos.

4. Interacción célula-célula: morfogénesis, cinética de la proliferación celular, cooperación metabólica, adhesión celular y movilidad.

5. Genética: análisis del genoma en condiciones normales y patológicas, manipulación genética, transformación e inmortalización.

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6. Productos y secreciones celulares: estudios relacionados con

biotecnología, diseño de biorreactores, cultivo de productos celulares.

Existen varios conceptos o fundamentos a tener en cuenta en el estudio de la ingeniería de tejidos, como son el crecimiento y diferenciación celular, la mecánica celular y tisular, y la adhesión y migración celular.

Crecimiento celular y diferenciación

La expansión en tamaño de una región de tejido, frecuentemente llamada crecimiento, es crítica para el desarrollo embriónico y para la reparación de tejidos. El crecimiento de un tejido generalmente ocurre por el incremento en el número de células, pero a lo largo de la vida puede ocurrir a través de otros mecanismos; por ejemplo, incremento en el volumen celular o extracelular. El crecimiento en un órgano o tejido puede involucrar múltiples mecanismos, pero en general, la proliferación celular (por divisiones secuenciales) es el mecanismo más importante para el crecimiento de un tejido.

La división celular y la proliferación celular son muy importantes para el crecimiento de un tejido. De acuerdo a como se de la división celular, si es para el desarrollo o la reparación de un órgano, las células se diferenciarán en fenotipos que son esenciales para la función del tejido maduro.

Agentes solubles (citocininas, factores de crecimiento, hormonas, etc.) influencian la tasa de crecimiento y el patrón de diferenciación de las células. Las interacciones receptor-ligando son esenciales en la regulación de la división celular y en la diferenciación. El cultivo celular por fuera de los organismos vivientes (in vitro) es una herramienta poderosa de la biología moderna. En muchos casos, el crecimiento celular in vitro y la diferenciación pueden ser controlados y analizados para determinar el factor de crecimiento limitante. Este análisis es mucho más difícil de realizar en células creciendo in vivo, debido al mayor número de elementos desconocidos o impredecibles.

Mecánica celular y de tejidos

La mecánica es una rama de la física que tiene que ver con la acción de las fuerzas sobre la materia. En la ingeniería de tejidos se puede encontrar la mecánica en varios escenarios. Frecuentemente, las propiedades mecánicas de los materiales biológicos de reemplazo deben replicar el tejido normal, por ejemplo: el uso limitado de un tejido de hueso desarrollado que no puede soportar la presión que si soporta su contraparte natural. Además, las propiedades mecánicas de las células y de las adhesiones célula-célula pueden determinar la arquitectura de un tejido durante el desarrollo. Este fenómeno puede ser explotado, dado que la forma final de los tejidos desarrollados por ingeniería de

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tejidos depende de las fuerzas encontradas durante su ensamblaje y maduración. Finalmente, los mecanismos de las células individuales (y las interacciones moleculares que las restringen) son determinantes importantes del crecimiento celular, del movimiento y de la función de un organismo.

Adhesión celular

La superficie externa de una célula consiste en una bicapa de fosfolípidos que lleva una cubierta rica en carbohidratos llamada glicocálix. Los grupos ionizables del glicocálix, como el ácido siálico contribuyen a dar carga negativa a la superficie celular. Muchos de los carbohidratos que forman el gricocálix están unidos a proteínas asociadas a membrana. Cada uno de estos componentes (bicapa fosfolípida, cubierta rica en carbohidratos, proteínas asociadas a membrana) poseen diferentes características fisicoquímicas y abundancia, por lo tanto cada componente ejerce una influencia en las interacciones celulares con el medio externo a través de diferentes vías.

Las células pueden adherirse a las superficies. Desde que el crecimiento y función de tejidos derivados de células requería estar acompañado de un substrato para su anclaje y propagación, los eventos alrededor de la adhesión celular se volvieron objetos de estudio fundamental. Además, las fuerzas de las adhesiones celulares son determinantes importantes para la tasa de migración celular, la cinética de la agregación célula-célula y la magnitud de las barreras de tejido para el transporte de células y moléculas. La adhesión celular es por lo tanto, una consideración mayor en el desarrollo de métodos y materiales para la liberación celular, la ingeniería de tejidos y la regeneración celular. El mecanismo más estable y versátil para la adhesión celular involucra la asociación específica de las glicoproteínas de superficie, llamadas receptores, y las moléculas complementarias en el espacio extracelular, llamadas ligandos. Los ligandos pueden existir libremente en el espacio extracelular, pueden estar asociados a la matriz extracelular o pueden estar unidos a la superficie de otra célula (Figura 2.17). La adhesión célula-célula puede ocurrir por adhesiones homofílicas de receptores idénticos en diferentes células, por uniones heterofílicas por un receptor y un ligando expresados en la superficie de diferentes células, o por asociación de dos receptores con una conexión intermediaria. La adhesión célula-matriz generalmente ocurre por uniones heterofílicas de un receptor y un ligando anclado a un elemento insoluble en la matriz extracelular.

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Figura 2.17 Tipos de adhesión celular. Fuente: Saltzman, 2004

Migración celular

La migración celular es crucial para la vida de los organismos unicelulares o multicelulares. La migración en organismos unicelulares puede ocurrir con flagelos o cilios (ej: E. coli o un paramecio), o a través de movimientos lentos sobre superficies (como lo hace la ameba). En los organismos multicelulares, la migración de una población celular particular es a menudo un componente de un comportamiento multicelular complejo que incluye la invasión tumoral y metástasis, embriogénesis, angiogénesis y respuesta inmune. En ambos casos, la velocidad y patrones de migración son determinados por la naturaleza de las células y por químicos presentes en el medioambiente. Dado que la migración es crítica para la formación o regeneración de tejidos, un claro entendimiento de la dinámica de la migración celular puede conllevar a mejores capacidades para el diseño de materiales y procesos para la ingeniería de tejidos.

Lección 29: Biomateriales

Los biomateriales se pueden definir como materiales biológicos comunes tales como piel, madera, o cualquier elemento que remplace la función de los tejidos o de los órganos vivos. En otros términos, un biomaterial es una sustancia farmacológicamente inerte diseñada para ser implantada o incorporada dentro del sistema vivo. El desarrollo de biomateriales ha experimentado espectaculares

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avances en los últimos años; en la siguiente figura (2.18) se esquematizan las piezas que están disponibles para reparar el cuerpo humano.

Figura 2.18 Piezas que pueden implantarse en el organismo humano Fuente: www.aecientificos.es/empresas/aecientificos/documentos/Biomateriales.pdf

Debido a que los biomateriales restauran funciones de tejidos vivos y órganos en el cuerpo, es esencial entender las relaciones existentes entre las propiedades, funciones y estructuras de los materiales biológicos y los biomateriales. El éxito de un biomaterial o de un implante depende de tres factores principales: propiedades y biocompatibilidad del implante, condiciones de salud del receptor, y habilidad del cirujano que realiza el implante.

http://www.aecientificos.es/empresas/aecientificos/documentos/Biomateriales.pdf

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Los requisitos que debe cumplir un biomaterial son:

1. Ser biocompatible, es decir, no debe provocar rechazo en el organismo.

2. No ser tóxico, ni carcinógeno, y químicamente inerte y estable (no presentar degradación en el tiempo).

3. Tener una resistencia mecánica, densidad y peso adecuados.

4. Tener un diseño de ingeniería perfecto; esto es, el tamaño y la forma del implante deben ser los adecuados.

5. Ser relativamente barato, reproducible y fácil de fabricar y procesar para su producción en gran escala.

Atendiendo a la naturaleza del material artificial con el que se fabrica un implante, se puede establecer una clasificación en cuatro grupos: metálicos, cerámicos, poliméricos y compuestos de ellos; en la tabla 1.8 se muestran algunas de las ventajas, desventajas y aplicaciones para los cuatro grupos de materiales.

TABLA 2.7 CLASES DE BIOMATERIALES

CLASE VENTAJA DESVENTAJA EJEMPLO

Polímeros:

Silicón, Teflón, Dacrón, Nylon

Elásticos, fáciles de fabricar, baja densidad

Baja resistencia mecánica, degradación con el tiempo

Suturas, arterias, venas, nariz, orejas, mandíbulas, dientes, tendones

Metales:

316, 316I.S.S., aleaciones de titanio, aceros de bajo contenido de carbón

Resistencia a esfuerzos de alto impacto, alta resistencia al desgaste

Baja biocompatibilidad, corrosión en medios fisiológicos, alta densidad, pérdida de propiedades mecánicas con tejidos conectivos suaves

Fijación ortopédica: tornillos, clavos, alambres, placas, barras intermedulares, implantes dentales

Cerámicas:

Oxidos de aluminio, aluminatos de calcio, óxidos de titanio, carbonos

Buena biocompatibilidad, resistencia a la corrosión, inerte

Fractura ante esfuerzos de alto impacto, difícil fabricación, baja resistencia mecánica, inelásticos, alta densidad

Prótesis de cadera, dientes, dispositivos transcutáneos

Compuestos:

Cerámica-metal, carbón-otro material

Buena compatibilidad, inerte, resistencia a la corrosión, alta resistencia a los esfuerzos

Carecen de consistencia en la fabricación del material

Válvulas cardiacas, uniones óseas, marcapasos

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Los usos quirúrgicos de los biomateriales son múltiples, por ejemplo, para

implantes permanentes en el sistema esquelético muscular, para uniones en las extremidades superiores e inferiores o como miembros artificiales permanentes; en el sistema cardiovascular, como corazón, arterias y venas; en el sistema respiratorio, en laringe, tráquea y bronquios, diafragma, pulmones y caja torácica; en sistema digestivo, esófago, conductos biliares e hígado; en sistema genitourinario; en los sentidos: lentes y prótesis de córneas, oídos y marcapasos carótidos; e implantes cosméticos maxilofaciales.

Las propiedades requeridas de un material para aplicaciones médicas varía de acuerdo con la aplicación particular. Debemos considerar que las pruebas fisicoquímicas de los materiales para implante in vivo son difíciles, si no imposibles. Las pruebas in vitro deben ser realizadas antes del implante. La fabricación y el uso de los materiales depende de sus propiedades mecánicas, tales como resistencia, dureza, ductibilidad, etcétera.

Lección 30: Aplicaciones y perspectivas

Las células empleadas en ingeniería de tejidos son de origen animal o humano, pueden ser aisladas de su ambiente natural o manipuladas genéticamente. Las células empleadas pueden ser:

1. Autólogas: tomadas del individuo que será el receptor final.

2. Alogénicas: tomadas de otro individuo de la misma especie.

3. Xenogénicas: células provenientes de otra especie.

Las células autólogas tienen la ventaja de no presentar respuesta inmune (Figura 2.19), pero la desventaja de no poderse cultivar durante largos periodos de tiempo mientras las alogénicas si. Por su parte, las alogénicas si presentan respuesta inmune la cual es necesario tratar con tratamientos de inmunosupresión, lo cual con el tiempo se puede traducir en problemas graves para el receptor. Las células xenogénicas se obtienen fácilmente, se logran cultivar durante largos periodos y en grandes cantidades, pero presentan el inconveniente de la respuesta inmune que pueden causar.

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Figura 2.19 Aplicación de la ingeniería de tejidos con células autólogas. Fuente: Stock & Vacanti, 2001

Un tipo de células que han traído la atención de un gran número de investigadores son las células stem (células madre, estudiadas anteriormente) por la capacidad de regenerarse a sí mismas y bajo ciertas características especiales de cultivo se pueden especializar en diferentes tipos de células.

El nuevo campo de la Ingeniería de tejidos tiene como reto proporcionar opciones que se asemejen a los tejidos naturales tanto funcional como estructuralmente y que puedan ser completamente integrados en el tejido vecino, continuando con el desarrollo después de la implantación in vitro. Miles de personas de todas las edades ingresan cada día en hospitales, obligadas por el malfuncionamiento de algún órgano vital. Muchas morirán al faltar donaciones de trasplantes. Pero un nuevo planteamiento, fascinante, podría revolucionar el tratamiento de pacientes urgidos de estructuras vitales nuevas: la creación de tejidos u órganos artificiales, los llamados neoórganos. Un ingeniero de tejidos inyecta o deposita en una herida o un órgano que requiera regeneración una molécula, por ejemplo, un factor de crecimiento. Esta molécula moviliza las células del paciente hacia la herida e insta su transformación en un tipo celular concreto, que regenere el tejido. Más ambicioso es el trasplante de células, del propio paciente o de un donante, cultivadas de antemano e incorporadas en una estructura tridimensional de polímeros biodegradables, como los que se utilizan para hacer suturas reabsorbibles. La estructura entera se trasplanta a la herida; aquí, las células se dividen y reorganizan para formar tejido nuevo. Al mismo tiempo, se van desintegrando los polímeros artificiales, hasta que solo queda formado un producto completamente natural, un neoórgano.

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Ingeniería de tejidos de cartílago

La ingeniería de tejidos en el área del cartílago articular surgió por la necesidad de nuevos tratamientos para las lesiones de esta estructura que tiene una escasa capacidad de auto-reparación, pero más que repararlo es necesario regenerarlo. Los tratamientos en este sentido incluyen restauración del tejido, reemplazo con aloinjertos o prótesis, mejoramiento con osteotomías para disminuir esfuerzos, y resecado de la superficie lesionada. La ingeniería de tejidos en el área del cartílago se centra y especializa en el primer tipo de tratamiento, ya que ofrece nuevas posibilidades en el estudio de procesos de condrogénesis y solución a problemas terapéuticos.

Desde el punto de vista terapéutico en la categoría de restauración, los esfuerzos en cuanto a reparación de cartílago se centraban en manipular o estimular la respuesta reparativa propia de las células, con estímulos eléctricos, farmacológicos (corticoides, ácido hialurónico, factores de crecimiento) o con agentes bioactivos (citocininas y biomateriales). Desde el punto de vista regenerativo, los esfuerzos se han orientado a producir una nueva superficie articular transplantando condrocitos, células condrogénicas (pluripotenciales indiferenciadas) y/o tejidos que tengan el potencial de generar nuevo cartílago. Los biomateriales en la ingeniería de tejidos son entonces más útiles como matrices que como simples materiales de soporte. Las células necesitan una estructura a la cual puedan adherirse, el cual también utilizan como medio de transporte dentro del tejido en formación.

Ingeniería de tejidos de piel

La ingeniería de tejidos en piel surgió por las limitaciones relacionadas con los autoinjertos, cuyas limitaciones más importantes incluyen la necesidad de crear un área donante que trae los dolores de una nueva cirugía, tiene el riesgo de infección, cicatrización y una baja recuperación. Una de las alternativas que se han generado, es el cultivo de autoinjertos de piel con los cuales se pueden realizar cubrimientos permanentes de grandes sitios afectados. El problema que presenta esta alternativa es que se necesita mínimo tres semanas de cultivo del injerto. Una alternativa es el uso de injertos alogénicos (aquellos tomados de la misma especie pero no propios), estos presentan la ventaja de no necesitar biopsias del paciente, ser fácilmente criopreservados y almacenados. También se está trabajando con matrices extracelulares acelulares, las cuales mantienen la membrana basal intacta (Alloderm ®), las cuales son ventajosas al ser inmunológicamente inertes. Otras membranas empleadas son las preparadas a partir de colágeno y condroitin-6-sulfato, a las cuales se les adiciona una base de silicona (Integra®). Entre los análogos de piel últimamente reportados se encuentra el EpiDex™, el cual es un análogo generado in vitro a partir de pelo del paciente. Las ventajas que presenta esta alternativa es primero el fácil aislamiento de células precursoras para queratinocitos epidermales a partir de

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folículos del cuero cabelludo, segundo la capacidad que presentan estas células para proliferar independientemente de la edad del donante de folículos.

Como se puede observar, se han realizado varios acercamientos para obtener sustitutos completos de piel. Algunos de los parámetros que se estudian actualmente son la frecuencia de colonización versus la infección, ya que con esto se pueden determinar pautas en el cultivo y en el tratamiento antibacterial tanto durante como después de implantado el sustituto.

Implantes celulares

En 1994, cierto paciente que sufría un dolor intenso y persistente se convirtió en uno de los primeros voluntarios sometidos al ensayo de un método terapéutico radicalmente nuevo. Mientras yacía anestesiado, el cirujano adoso un tubito de plástico en la columna vertebral. El tubo, sellado, media cinco centímetros de longitud y era fino como alambre de clip; contenía células de bovino secretoras de una mezcla de analgésicos. De este modo, las secreciones celulares rezumarían a través de los poros del tubo, para difundirse luego por la medula espinal. Entre tanto, los nutrientes y el oxigeno pasarían del liquido cefalorraquídeo a la capsula, para alimentar a las células. El tubito impediría también la entrada de macromoléculas. Se evitaría así que las células y los anticuerpos del sistema inmunitario (de un tamaño notable ambos) establecieran contacto con las células bovinas y las destruyeran al reconocer su carácter foráneo. A través de ese medio se buscaba aliviar el sufrimiento, lo que se conseguía al cortar el flujo de señales de dolor que transitaban de la medula a los centros cerebrales de detección. El ensayo fue un éxito, por lo cual se repitió en otros pacientes y justificó la realización de una prueba más ambiciosa, para evaluar por vía directa el control del dolor.

Este primer ensayo abrió las puertas a un nuevo campo de experimentación, conocido como tratamiento con células encapsidadas, terapia biohíbrida o inmunoaislamiento.

Porque supera limitaciones importantes de los implantes de células libres, la terapia de inmunoaislamiento despierta especial atracción. Lo mismo que las libres, las células encapsuladas en membranas se hacen cargo de funciones cruciales que correspondían a las lesionadas o perdidas, pueden suministrar analgésicos y otros elementos "extra" e incluso facilitar la terapia génica, segregando las proteínas codificadas por los genes que se hayan introducido en las células. Por el contrario, las células libres están expuestas al reconocimiento del sistema inmune, salvo que procedan de los mismos pacientes. El bloqueo mecánico contra los ataques inmunitarios, que se consigue a través de la encapsulación de las células insertas dentro de membranas plásticas, haría innecesario el empleo de inmunosupresores, que predisponen a las infecciones, cáncer (linfomas) y disfunción renal. El recurso a células animales paliaría la

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escasez de donaciones de tejidos. Así mismo, las células implantadas dentro de un envase plástico pueden retirarse si fuera necesario, tarea mucho más compleja con las células libres.

Los sistemas de encapsulación, aunque polimórficos en su presentación, incluyen todos los mismos ingredientes básicos: las células (capaces de segregar productos útiles), una matriz donde se unen las células y una membrana semipermeable. Estos sistemas se pueden encontrar en forma de micro y macrocápsulas. El formato más práctico parece ser el de las macrocápsulas preformadas, unas unidades inicialmente vacías que se cargan con la matriz y todas las células necesarias para el tratamiento. Algunas macrocápsulas son discos del tamaño de una moneda, otras tienen una forma y tamaño similares a un ojal. Las macrocápsulas para uso en humanos acostumbran adoptar la forma de un tubo sellado, o capilar, de varios centímetros de longitud y diámetro comprendido entre los 500 y 1000 micrómetros. Su principal limitación es el número de células que pueden contener: hasta unos cinco millones en un tubo y entre 50 y 100 millones en un disco u hoja plana. Esas cifras son adecuadas para muchas aplicaciones, pero no para todas. Si se hacen más largas es más probable que se doblen, lo que facilita su rotura.

En los sistemas de encapsulación, al principio de usaban células primarias, pero debido a su escasez y dificultad de cultivo se empezaron a hacer ensayos de encapsidación de líneas celulares, cuya utilidad quedo bien clara en las pruebas animales que se comenzaron a realizar en los años 90. El éxito con las líneas celulares abrió también la puerta a la utilización de células genéticamente manipuladas. En otras palabras, la técnica de inmunoaislamiento se convirtió de la noche a la mañana en una nueva vía de la terapia génica.

No se ha resuelto todavía si las líneas celulares candidatas a encapsulación deben provenir de animales o de humanos. Las células primarias, tomadas directamente de donantes, abran de ser, casi con toda certeza, de animales, ante la escasez de donaciones de tejidos humanos. Algunos investigadores prefieren líneas derivadas de animales porque las células que se escapen de un implante, al ser extrañas al receptor, se encontraran con una destrucción inmediata por parte del sistema inmunitario.

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Actividades de Autoevaluación de la UNIDAD 2

En esta sección usted evaluará diversos aspectos de la actividad académica desarrollada en la unidad. Esta actividad tiene una valoración cualitativa de acuerdo a la siguiente escala: No satisfactorio, Satisfactorio, Supera lo esperado. En cada punto además de asignar la categoría correspondiente, dará una breve explicación de su respuesta.

Autoevaluación de su trabajo individual. Usted describirá de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeño en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo individual y colaborativo.

Evaluación del desempeño de los compañeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participación de sus compañeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciación

Evaluación del material usado en la actividad de la unidad: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo de esta unidad fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado.

Desempeño del rol del tutor. Debe dar su autoevaluación del tutor respecto a compromiso, responsabilidad, calidad, pertenencia, atención al estudiante, retroalimentación de trabajos y relaciones interpersonales.

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Fuentes Documentales de la Unidad 2

Doyle, A., Griffiths, J.B. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York. John Wiley and Sons.

Helgason, Ch. D., Millar, C.l. eds (2005) Basic Cell Culture Protocols. Methods in Molecular Biology No 290. Totowa. Humana Press.

Lodish, H., Baltimore, D., Berk, A., Lawrence, S., Matsudaira, P., Darnell, J. (2004). Molecular Cell Biology. Fisfth edition. New York. Scientific American Books.

Mather, J., Barnes, D. eds. (1998). Animal Cell Culture Methods. San Diego. Academic Press.

Montoya, D., Sastoque, L.A. (2004). Biotecnología para no biotecnologos: memorias. Bogotá. Universidad Nacional de Colombia.

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