Benaim G. Acta Cientif Venezol REV 2004

7/23/2019 Benaim G. Acta Cientif Venezol REV 2004

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La CA2+-ATPasa de la membrana plasmáticacomo enzima clave en la homeostasisintracelular del calcio. Estimulación por etanol y otros efectores

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Gustavo Benaim

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REVISION (BIOLOGIA CELULAR)

Acta Científica Venezolana, 55: 304-314, 2004

LA Ca2+-ATPasa DE LA MEMBRANA PLASMATICA COMOENZIMA CLAVE EN LA HOMEOSTASIS INTRACELULAR DEL

CALCIO. ESTIMULACION POR ETANOL Y OTROS EFECTORES

Gustavo BenaimLaboratorio de Señalización Celular y Bioquimica de Parasitos

Centro de Biociencias. Instituto de Estudios Avanzados (IDEA) y Laboratorio de Biofísica.Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.

Apartado 47114. Caracas, Venezuela.e-mail [email protected]

Recibido: 27/05/04; Revisado: 06/07/04; Aceptado: 23/11/04

RESUMEN: La Ca2+

-ATPasa de la membrana plasmática (PMCA) es una enzima clave en la regulación de la concentración basal de Ca2+

.Hemos demostrado que el etanol estimula la actividad de la Ca

2+-ATPasa y el transporte de Ca

2+ asociado. Cuando el etanol y la

calmodulina (CaM) esta presentes simultáneamente, el efecto estimulatorio es aditivo, lo cual apoya que estos efectores actúan a través dedistintos mecanismos. Mediante el uso de isoformas diferentes de la Ca

2+-ATPasa se demostró que la variante PMCA2CI resultó ser mas

sensible al efecto del etanol. Es Interesante resaltar que esta es la isoforma mas predominante en cerebro, cerebelo y tejido nervioso. Porotra parte, el fosfatidiletanol se forma mediante la transfosfatidilación de ciertos fosfolípidos cuando el etanol está presente, por unareacción que es catalizada por la fosfolipasa D. Este fosfolípido se acumula en la membrana de las células de mamífero luego del consumode alcohol. Hemos demostrado que el fosfatidiletanol también estimula a la bomba de calcio de la membrana plasmática. Este fosfolípidoincrementa la afinidad de la enzima por Ca

2+ en mayor medida que la que se obtiene en presencia de CaM u otro fosfolípido acídico natural.

Los esfingolípidos han sido reconocidos recientemente como importantes segundos mensajeros, actuando en varios sistemas encombinación con el Ca

2+. En vista del hecho que la PMCA es estimulada por etanol, y tomando en cuenta que los esfingolípidos poseen

grupos hidroxilo libres, decidimos estudiar el posible efecto de la ceramida y la esfingosina sobre esta bomba de calcio. Demostramos quela ceramida estimula a la Ca

2+-ATPasa de una manera dosis-dependiente y de forma aditiva a la CaM y al etanol, cuando se compara con

estos dos efectores añadidos separadamente. La ceramida afecta tanto la afinidad de la enzima por el Ca2+

, como su Vmax. Mas aún, esteesfingolípido también estimula el transporte de Ca

2+ en vesículas invertidas de eritrocitos. Por lo contrario, la esfingosina, la cual se ha

reportado en varios sistemas que actúa de manera antagónica a la ceramida, mostró un efecto inhibitorio sobre la Ca2+

-ATPasa. Estainhibición también se observó en presencia de CaM. Estos resultados tomados en conjunto sugieren que la ceramida y la esfingosinaactúan antagónicamente sobre la PMCA, lo cual coincide con el efecto opuesto que estos esfingolípidos poseen frecuentemente endiferentes sistemas. Palabras clave: Ca

2+-ATPasa; calmodulina; etanol; esfingolípidos; ceramida.

THE PLASMA MEMBRANE Ca2+

-ATPase AS A KEY ENZYME IN THE INTRACELLULAR CALCIUMHOMEOSTASIS. STIMULATION BY ETHANOL AND OTHER EFFECTORS

ABSTRACT: The plasma membrane Ca2+

-ATPase (PMCA) is a key enzyme in the regulation of the intracellular Ca2+

concentration. Studiesfrom this laboratory have shown that ethanol stimulates the Ca

2+-ATPase activity and its associated Ca

2+-transport. When ethanol and

calmodulin (CaM) were present simultaneously, the stimulatory effect was additive, supporting that these two effectors act through differentmechanisms. The use of different isoforms of the Ca

2+-ATPase showed that the variant PMCA2CI was more sensitive to the effect of

ethanol. Interestingly, this is the predominant isoform in brain, cerebellum and nervous tissues. On the other hand, phosphatidylethanol isformed by transphosphatidylation of phospholipids when ethanol is present, a process catalyzed by phospholipase D. This phospholipidaccumulates in the plasma membrane of mammalian cells after ethanol consumption. It was demonstrated that phosphatidylethanol alsostimulates the plasma membrane calcium pump. The phospholipid increases the affinity of the enzyme for calcium to a larger extent than inthe presence of calmodulin or other natural acidic phospholipids. Sphingolipids have been recently recognized as important secondmessengers acting, in many systems, in combination with Ca

2+. In view of the fact that the PMCA is stimulated by ethanol, and since

sphingolipids possess free hydroxyl groups, the study of the possible effect of ceramide and sphingosine on this calcium pump was

undertaken. It was shown that ceramide stimulates the Ca2+

-ATPase in a dose-dependent manner, and additively to the activation observedin the presence of CaM or ethanol, when compared to any of these effectors alone. Ceramide affects both the affinity for Ca

2+ and Vmax of

the enzyme. Furthermore, this second messenger also stimulates Ca2+

transport in inside-out plasma membrane vesicles from erythrocytes.Conversely, sphingosine, a reportedly antagonist to ceramide in many systems, showed an inhibitory effect on the Ca

2+-ATPase activity. This

inhibition was also observed on the CaM-stimulated enzyme. Taken together these results suggest that ceramide and sphingosine actantagonistically on the PMCA. This is in accordance with the frequently reported opposite effect of these sphingolipids in different systems.Key Words: Ca

2+-ATPase, calmodulin; ethanol, sphingolipids, ceramide.

INTRODUCCION

El calcio es probablemente el mas importante entretodos los mensajeros intracelulares, en los mecanismosde traducción de señales en las células eucarióticas. Su

función como mensajero está garantizada por lacapacidad de la célula de mantener, en virtud de susdiferentes mecanismos homeostáticos, unaconcentración citoplasmática de este catión 4 órdenes demagnitud por debajo de su concentración extracelular

18.



Ca2+

-ATPasa de la membrana plasmática 305

Como catión bivalente es además atraído fuertementehacia el interior de la célula en virtud de la diferencia depotencial eléctrica transmembrana negativa en el interior.

Así, este ión esta separado de su potencial de equilibrioelectroquímico que predice la ecuación de Nernst, unas10.000.000 de veces, si este catión se distribuyerapasivamente a través de la membrana. Este valor seencuentra muy por encima que el de cualquier otro ión

presente en la célula. Este hecho implica que la aperturade un canal de calcio en la membrana plasmática,producto de una interacción con una señal específica,conllevaría a una entrada rápida de este catión, lo cualde hecho constituye la base de su acción como segundomensajero.

En este sentido cabe preguntarse porque es el calcio,entre todos los iones disponibles en la naturaleza, el queha sido seleccionado evolutivamente como el masimportante mensajero intracelular. Volviendo a laelevadísima diferencia con respecto a su potencial deequilibrio electroquímico, probablemente el primerproblema que tuvo que afrontar la célula durante su

evolución, con respecto a este catión es su muy bajasolubilidad, en comparación a otros iones, aunada a sugran abundancia en el agua de mar, donde se originó lavida. De esta manera, si no fuera excluido, el calcioprecipitaría en el interior celular, fundamentalmente conlos abundantes fosfatos y los ácidos orgánicos, lo cualimposibilitaría los procesos que se llevan a cabo en elcitoplasma. La solución fue mantener una membranamuy impermeable al calcio y simultáneamente diseñarmecanismos de transporte altamente específicos, tantopara su exclusión activa hacia el medio extracelularcomo para su almacenamiento en organelos específicos.Posteriormente en la evolución, dado que la célula tuvo

que invertir una cantidad importante de energía enmantener este elevado gradiente electroquímico decalcio, toma ventaja de dicho gradiente, y de otraspropiedades químicas de este elemento y lo transformaen el catión señal por excelencia.

Aunque esto es solo un teoría, parece concebible enfunción de las características de este particular catión ytomando en cuenta los otros hechos mencionados eneste contexto.

Regulación intracelular de calcio

Tomando en cuenta lo anterior no es de extrañar que

la célula posea hasta 7 mecanismos diferentes paramantener la concentración citoplasmática de calcioiónico [Ca

2+]i a nivel submicromolar

7,18. A nivel de los

organelos, están presentes en el retículo endo (sarco)plasmático y la mitocondria. El primero presenta unaCa

2+-ATPasa (SERCA), o bomba de Ca

2+, con alta

afinidad por Ca2+

, pero con baja capacidad para eltransporte del mismo, mientras que la mitocondria por locontrario, posee un uniporte electroforético energizadopor el gradiente electroquímico de protones en lamembrana interior mitocondria, el cual presenta una altacapacidad de transporte pero una muy baja afinidad por

este catión7,18

. Ambos presentan también mecanismosde salida de Ca

2+. La mitocondria excluye al catión

gracias a un intercambiador Na+/Ca

2+, (o en algunos

casos H+/Ca

2+), el cual es electroneutro, mientras que la

salida de calcio del retículo endo(sarco)plasmático selogra a través de canales altamente regulados: Un canalde rianodina, mucho mas abundante en elsarcoplasmático, y un canal de sensible a IP3 mas

importante en el retículo endoplasmático15, en el cual seinduce la liberación cuando se produce este mensajeropor la acción de la diferentes fosfolipasas C sobre elfosfatidilinositol (4,5) bisfosfato, lo cual conlleva atambién a la liberación del diacilglicerol, otro fundamentalsegundo mensajero, que a su vez estimula la proteínaquinasa C, con importantes implicaciones en losmecanismos de señalización celular

15. También se ha

identificado otra Ca2+

-ATPasa diferente a las anteriores(PMR1), la cual está presente en el sistema de golgi y en

vesículas secretoras de insulina en las células β delpáncreas

29. Sin embargo, en estas últimas células su

función parece estar mas asociada a la secreción de la

hormona29

que a la regulación intracelular del Ca2+

.Los mecanismos presentes en diferentes organelos

están limitados por la capacidad de éstos comocompartimientos, por lo que a largo plazo, son losmecanismos ubicados en la membrana plasmática losresponsables de la alta asimetría en la distribución delcalcio entre el interior y el exterior celular

7. Existe varios

tipos de canales muy bien regulados a través diversosmoduladores que permiten la entrada de Ca

2+ siguiendo

su gradiente de potencial electroquímico, tantodependientes de ligandos como dependientes de voltaje,cuya descripción no está en los alcances de estarevisión. Entre los mecanismos de exclusión, existe un

intercambiador Na

+

/Ca

2+

, el cual extruye Ca

2+

del interiorcelular utilizando como energía la disipación delgradiente electroquímico de Na

+existente entre el

citoplasma y el exterior celular 25

. Este intercambiadorpresenta una estequiometría de 3Na

+/Ca

2+, siendo muy

importante en células excitables donde los cambios en laconcentración basal del Ca

2+ pueden ser bastante

elevados25

. De acuerdo a esto, su afinidad por el Ca2+

esrelativamente baja, en comparación con su capacidadrelativa de transporte, la cual es alta. Por otra parte, laCa

2+-ATPasa (o bomba de calcio) de la membrana

plasmática presenta una relativamente baja capacidadde transporte pero una alta afinidad por el Ca

2+,

compatible con la concentración citoplasmática de estecatión cuando la célula esta en reposo7,20. A diferenciade el intercambiador Na

+/Ca

2+, esta enzima es

extremadamente ubicua, habiéndose identificado entodas las células eucariotas estudiadas hasta elpresente, desde mamíferos hasta plantas, y desdehongos hasta parásitos

12.

La visión en conjunto de todos estos diferentesmecanismos permiten concluir que su presenciasimultanea en una célula no es redundante, ya que cadamecanismo presenta ubicación espacial, afinidad ycapacidad diferente, lo que garantiza que en conjuntoson capaces de mantener la homeostasis intracelular de



306 Benaim

Ca2+

tanto en reposo, como luego de una señal queeleve subitamente su concentración.

La Ca2+

-ATPasa de la membrana plasmática

Desde el punto de vista estructural y funcional, la Ca2+

- ATPasa de la membrana plasmática (definidageneticamente como PMCA) es diferente a la Ca

2+-

ATPasa presente en el retículo endo(sarco)plasmático(SERCA), ya que su peso molecular es de 138.000 Da

16,

mientras que la del retículo está entre 109.000 y 115.000Da

18. Ambas proteínas han sido secuenciadas,

encontrándose muy poca homología secuencial. Dehecho, las únicas secuencias comunes entre ambasproteínas son las correspondientes al sitio defosforilación por el ATP y el sitio de unión de nucleótidos.Estos dos sitios son característicos de todas las bombasiónicas del tipo ¨P¨, así definidas por la formación de unintermediario fosforilado (un aspartil-fosfato) durante su

ciclo catalítico18. La estequiometría de estas dos bombasiónicas también es distinta. La Ca

2+-ATPasa de la

membrana plasmática transporta un átomo de Ca2+

porcada molécula de ATP que hidroliza, mientras que laenzima del retículo transporta 2 átomos por molécula de

ATP18

. Otra diferencia fundamental lo constituye elhecho de que la enzima de la membrana plasmáticapuede perder hasta el 40 % de su masa y todavía sercapaz de transportar calcio de una manera ATP-dependiente

2,17. De hecho, en experimentos mediante

proteólisis parcial de la proteína y reconstitución enliposomas, hemos demostrado que un fragmento de81.000 Da. es capaz de mantener la función de hidrólisis

de ATP y el transporte de Ca2+

asociado2

. Este hechosugiere que alrededor del 40 % de la masa de la enzimaesta comprometida en su regulación

17, a diferencia de la

bomba del retículo la cual es muy pobremente regulada.Es interesante mencionar que aunque la Ca

2+-ATPasa

de la membrana plasmática es altamente ubicua entrelos organismos eucariotes como se mencionóanteriormente, existen diferencias interesantes entreestas bombas de calcio en distintos organismos. Porejemplo, la Ca

2+-ATPasa del parásito patógeno

Trypanosoma brucei , causante de la enfermedad delsueño, aunque tiene un peso molecular aparente similara la enzima homóloga de humanos y comparte otrascaracterísticas con ésta

8, es inhibida por la pentamidina,

droga de uso generalizado en la cura de la dolenciaantes mencionada, mientras que esta droga no tieneningún efecto sobre la Ca

2+-ATPasa de humanos

8. Lo

mismo puede decirse del efecto de cristal violeta (ovioleta de genciana) sobre esta enzima en Trypanosomacruzi

26. Estos estudios apuntan hacia la búsqueda de

diferencias entre esta enzima en distintostripanosomatidios, con respecto a la estructura homólogade mamíferos, con el objeto de establecer diferenciasrelevantes desde el punto de vista terapéutico, en eldesarrollo de drogas contra las enfermedades causadaspor estos parásitos

12.

Regulación de la Ca2+

-ATPasa por la calmodulina

La Ca2+

-ATPasa de la membrana plasmática esestimulada por la calmodulina (CaM), una proteína de16.700 bien conservada evolutivamente y cuya ubicuidaden las células eucarióticas es paralela a la de bomba decalcio. De hecho, se podría postular que ambasproteínas han coevolucionado en los eucariotes con el fin

de garantizar el funcionamiento del Ca2+ como señal. Así, cuando el calcio se eleva intracelularmente,producto de la apertura de un canal voltaje-dependienteo ligando-dependiente, este catión se une a la CaM lacual cambia su conformación y modifica la actividad delas enzimas “blanco”, lo cual a su vez desencadena lareacción de la célula ante la señal. Posteriormente, elcomplejo Ca

2+-CaM, estimula a la bomba de calcio de la

membrana plasmática, conllevando a la disminución dela concentración del Ca

2+ citoplasmático a su nivel de

reposo, preparando así a la célula para responder a unanueva señal

7,18. La CaM presenta 4 sitios de unión para

el calcio los cuales son altamente cooperativos. La unión

del calcio a la proteína incrementa su contenido de α-hélice, concomitantemente con su hidrofobicidad

14. La

conformación de la proteína depende estrictamente decuantos átomos de calcio estén enlazados, lo cual latransforma en un “sensor” de la concentracióncitoplasmática de Ca

2+. De esta manera puede reconocer

diferentes enzimas de acuerdo a la concentración deCa

2+ intracelular presente en un momento dado.

También se ha postulado que la apocalmodulina(proteína en ausencia de Ca

2+), es capaz de reconocer

ciertas enzimas blanco14

. La estructura de la CaM hasido conservada evolutivamente entre los diferenteseucariotas

6,14. Sin embargo, la CaM de los

tripanosomatidios presenta como excepción 17sustituciones aminoacídicas con respecto a la proteínade humanos

14. Mas recientemente, se ha demostrado

que la CaM fosforilada por diferentes proteínas-quinasascambia su función con respecto a ciertas proteínasblanco

13,14, lo cual incrementa mas aún su plasticidad

como molécula reguladora. Todas estas característicasle permiten a la CaM un espectro de acción muy amplio,en los mecanismos de traducción de señales.

Con respecto a la Ca2+

-ATPasa, la CaM incrementatanto su Vmax como su afinidad por el calcio y por el

ATP4,7,20

. La proteólisis parcial de la enzima mediantetripsina

1,2o calpaína

35simula el efecto de la CaM, lo cual

ha permitido elaborar un modelo mediante el cual la CaMremovería una compuerta auto-inhibitoria de la enzimapermitiendo así un mayor acceso de los sustratos (Ca

2+ y

ATP) al sitio activo1,2,7,17

.La actividad de la enzima también puede ser

incrementada mediante su auto-agregación, lo cualpermite sugerir que la enzima podría presentar unatransición de monómero a dímero

23. Los solventes

orgánicos como el dimetilsulfóxido y los poli-alcoholes(etilenglicol, glicerol) también simulan el efectoestimulatorio de la CaM

3,4, lo cual sugiere que también

actúan removiendo la mencionada compuerta auto-inhibitoria

7 (Figura 1).



Ca2+


Figura 1. Modelo de interacción de la Ca2+

-ATPasa de la membrana plasmática con la calmodulina y con solventes orgánicos como elDMSO. Ver explicación en el texto (Redibujado de Benaim, G. 1993, con autorización).


-ATPasa por otros efectores

La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática tambiénpuede ser estimulada por fosfolípidos acídicos y ácidosgrasos poli-insaturados de cadena larga

18. De hecho, se

ha postulado que la proporción de fosfatidilserinapresente en la cara interna de la membrana plasmáticaes suficiente para estimular al 50% de la actividad de laenzima.

El efecto de los fosfolípidos acídicos es más notablesobre la afinidad de la enzima por el Ca

2+, la cual se

incrementa por encima del valor alcanzado cuando esestimulada por la CaM

18. También puede ser estimulada

mediante fosforilación por diferentes proteínas quinasas,como por la proteína-quinasa A

19 y por la proteína-

quinasa C36.Respecto a la estimulación por la proteína quinasa C,

esta ocurre el mismo sitio de unión de la CaM, por lo queambos efectores actúan sobre la bomba de calcio de unamanera excluyente, por lo que sus efectos sobre laenzima no son aditivos. De esta manera, cuando laenzima ha sido fosforilada por la proteína quinasa C, nopuede unir CaM. De acuerdo con esto, cuando la enzimatiene enlazada a la CaM, el sitio de fosforilación por laquinasa esta protegido por la interacción

36. Los iones

monovalentes, como el Na+ y el K

+, también regulan la

actividad de la Ca2+

-ATPasa31,32

.

Estimulación por etanol y por fosfatidiletanol

A pesar de que el alcohol se ha consumido por todaslas civilizaciones desde que se conoce la historia delhombre, aún se desconoce el mecanismo mediante elcual ejerce su efecto farmacológico. Menos se sabe delas razones que convierten a un individuo en alcohólico ya otros no. Tampoco se sabe mucho acerca de losmecanismos de transmisión de señales que en últimainstancia definen el estado de ánimo de los sereshumanos. Sin embargo, existen evidencias recientes queseñalan al calcio como responsable de alguno de estosfenómenos. Así, se ha reportado en estudios realizadospor un grupo de psiquiatras en pacientes maníaco-depresivos, que durante la fase maníaca, laconcentración de calcio intracelular es menor quedurante la fase depresiva. Inclusive, el tratamiento conlitio en individuos bipolares, revierte a los pacientes auna distribución normal de las concentraciones de calciointracelular. No es difícil concebir que, como el calcioregula la liberación de neurotransmisores, unaperturbación en los mecanismos homeostáticosresponsables del mantenimiento de las concentracionesbásales intracelulares de este catión, podría serresponsable de algunas de estas manifestacionesclínicas.

En este particular, hemos obtenido evidencias de queel etanol y otros alcoholes alifáticos de cadena corta

Proteólisis controlada

Dominio autoinhibitorio CaM

Solvente orgánico

C a

2 + - A T P a

s a

Estimulación por CaM

Estimulación por solventes orgánicos

Proteólisis controlada

Dominio autoinhibitorio CaM

Solvente orgánico

C a

2 + - A T P a

s a

Estimulación por CaM

Estimulación por solventes orgánicos



308 Benaim

estimulan la Ca2+

-ATPasa de eritrocitos humanos, tantoen su forma purificada como sobre la enzima in situ

10. El

transporte de calcio en vesículas invertidas de eritrocitoshumanos también es estimulado por el etanol de unamanera dosis-dependiente, lo cual permite inferir queetanol podía estimular esta actividad in vivo

10. El

mecanismo de acción de este alcohol es distinto al dela CaM, ya que su efecto es aditivo con el modulador

proteico natural, tanto con respecto a la velocidadmáxima de la enzima, como sobre su afinidad por el Ca

2+

y ATP10

. El efecto del etanol sobre la Ca2+

-ATPasa estotalmente revertido al lavar las membranas mediantecentrifugación en un medio sin alcohol, lo cual sugiereque el efecto inducido por el etanol sobre la Ca

2+-

ATPasa en condiciones farmacológicas, puede serrevertido una vez que el alcohol haya sido eliminado

22.

Por otra parte, siguiendo con este mismo estudio, sedemostró que el efecto del etanol no se confina a laCa

2+-ATPasa de eritrocitos, sino que es capaz de

estimular también a la enzima homóloga de Leishmaniamexicana

9, lo cual sugiere que este efecto podría ser

mas general, ya que la Ca2+

-ATPasa de la membranaplasmática es una enzima, que además de ser ubicua encélulas eucarióticas

5,6, está bastante conservada

evolutivamente11,17

.Otros resultados de nuestro laboratorio han

demostrado que el fosfatidiletanol es capaz de estimular

la actividad de la Ca2+-ATPasa a niveles mayores queotros fosfolípidos naturales

34, tanto en la enzima

purificada de eritrocitos humanos como sobre la enzimain situ

22(Figura 2). También hemos demostrado que este

efecto es extrapolable al transporte de Ca2+

, en vesículasinvertidas de eritrocitos humanos

34. Este efecto es

interesante, ya que este fosfolípido se acumula en lamembrana cuando el etanol esta presente, mediante unproceso de transfosfatidilación mediado por la fosfolipasaD

28, en el cual el alcohol sustituye al agua, formándose

un fosfatidilalcohol en lugar de ácido fosfatídico.

Figura 2. Efecto de concentraciones crecientes de fosfatidiletanol sobre la actividad de la Ca2+

-ATPasa de fragmentos de membrana.

La concentración de Ca2+

libre utilizado fue 10 µM. Control (); 5% (v/v) etanol (). Tomado de Cervino y Benaim, 2002, conautorización).

0 100 200 300 400 5000

10

20

30

40

Concentración de fosfatidiletanol, g/ml)

A c t i v i d a

d E s p e c í f i c a

( n m o l e

s P i / m g . m

i n )

0 100 200 300 400 5000

10

20

30

40

Concentración de fosfatidiletanol, g/ml)

A c t i v i d a

d E s p e c í f i c a

( n m o l e

s P i / m g . m

i n )



Ca2+


La acumulación de fosfatidiletanol se ha reportado queocurre luego de una ingesta alcohólica, presentando unatasa de degradación muy lenta

28. De hecho, se ha

postulado que parte del efecto del etanol en humanospuede ser atribuido a la acumulación en la membrana defosfatidiletanol

28.

Los hallazgos anteriores nos han permitido postularque la combinación del etanol con el fosfatidiletanol

formado a partir de éste, podría tener un efectosinergístico sobre la activación de la Ca

2+-ATPasa y el

consecuente transporte de calcio. Este efecto se observamas sobre la afinidad de la enzima por el Ca

2+, lo cual

permite especular que cuando la enzima se encuentraestimulada por ambos efectores, podría disminuir laconcentración basal del catión por debajo a la que sealcanza en presencia de por ejemplo, CaM. De estamanera, esto podría conllevar a que a la célula le seríamas difícil alcanzar un nivel umbral en la [Ca

2+]i luego de

una señal adecuada, respondiendo mas tardíamente,con los consecuentes posibles efectos que esto podríaocasionar en los mecanismos de transmisión de señales.

Más recientemente hemos encontrado que el efectodel etanol es diferente entre las distintas isoformas de laenzima presentes en humanos

21. Así, hemos observado

que el etanol tiene un efecto diferencial sobre cuatroisoformas diferentes de la Ca

2+-ATPasa de membrana

plasmática (PMCA1CI, PMCA2CI, PMCA4CI yPMCA4CII)

21. Estas isoformas son producto de 3 genes

diferentes y difieren en cuanto a estructura y en algunasde sus propiedades

20. Asimismo, estas isoformas se

encuentran expresada de manera diferencial en losdistintos tejidos

33. Las isoformas PMCA1CI y PMCA4CII

se encuentran expresadas en las membranas de todaslas células eucariotas estudiadas hasta el momento, la

isoforma PMCA4CI se encuentra principalmente entejidos musculares tales como corazón y estomago,mientras que la isoforma PMCA2CI se encuentraexpresada principalmente en células nerviosas, cerebroy cerebelo

20,33.

Para realizar este estudio, las 4 isoformas fueronexpresadas mediante un sistema de sobre-expresión através de baculovirus. Para ello, baculovirusrecombinantes conteniendo el cDNA para cada una delas isoformas fueron utilizados para infectar una líneacelular de insectos (Sf9). Posterior a la expresión, lasproteínas de interés fueron caracterizadas tanto desde elpunto de vista bioquímico como funcional

21. Las 4

isoformas resultaron ser estimuladas por el etanol en unaforma dosis-dependiente, observándose igualmente entodas ellas un efecto aditivo del alcohol sobre laestimulación obtenida por la CaM. Sin embargo,existieron diferencias significativas entre las mismas encuanto a la concentración del alcohol a la cual sealcanzó el máximo efecto estimulatorio (Figura 3).

En este sentido, ha sido muy interesante observar quela isoforma mas sensible al etanol es la PMCA2CI

21, la

cual como se mencionó está ubicada fundamentalmenteen cerebro, cerebelo y tejido nervioso

33. La dosis de

etanol con la cual se alcanza el máximo de estimulaciónen esta isoforma está precisamente en el rango

farmacológico27

, fácilmente adquirible en la sangre luegodel consumo excesivo de alcohol.

Estos resultados nos permiten sugerir que el efecto deletanol en humanos podría deberse a la estimulación deltransporte de calcio a nivel de estos tejidos, con laconsecuente disminución en la concentracióncitoplasmática de este catión. Esto tendríaconsecuencias en la liberación de ciertos

neurotransmisores, ya que es bien conocido que estefenómeno esta regulado por los niveles de calcio en lascélulas de estos tejidos.

Como se mencionó anteriormente, se ha encontradoen estudios con pacientes maníaco-depresivos, unacorrelación entre la concentración de calciocitoplasmático y el estado anímico. Específicamente,durante la crisis maníaca, los pacientes presentaron unamenor concentración de Ca

2+ citoplasmático en los

eritrocitos, que durante la crisis depresiva. El estado deanimo durante la crisis maníaca se asemeja al inducidopor la intoxicación etílica, en cuanto a la manifestaciónde un cuadro eufórico. Aún cuando esta relación es

hasta el presente especulativa, es perfectamentefactible, y merece ser investigada con detalle en elfuturo.

En otro orden de ideas, recientemente también hemosadelantado con respecto a la identificación del sitio deinteracción de la bomba de calcio con el etanol.

Durante el estudio del efecto del etanol sobre lasdiferentes isoformas de la Ca

2+-ATPasa, pudimos

observar que dos de las isoformas, las cuales sonproductos de un mismo gen, las isoformas PMCA4CI yPMCA4CII, se comportaron de manera diferencial con eletanol

21. Estas isoformas únicamente difieren en cuanto

a la secuencia en la porción C-terminal de la proteína.

Estos hallazgos sugieren que esta región de la enzimapudiera ser importante para el mecanismo de acción deletanol. Con el objeto de verificar esta posibilidad,estudiamos el efecto del etanol sobre dos formastruncadas de la enzima originadas a partir de la isoformaPMCA4CII. Una de las formas truncadas carece de los

44 aminoácidos hacia la región C-terminal (PMCA∆44),mientras que la otra forma presenta una truncación de

139 aminoácidos (PMCA4∆139) hacia esta mismaregión. Estas formas truncadas fueron expresadasmediante el mismo sistema descrito anteriormente

21.

Cuando se ensayó el efecto del etanol sobre la actividad

enzimática de la isoforma PMCA4∆44 se observó que el

etanol estimuló a esta proteína de manera similar alefecto observado sobre la isoforma nativa PMCA4CII.Por el contrario, cuando se determinó el efecto del

etanol sobre la forma truncada PMCA4∆139 el etanol notuvo ningún efecto sobre la actividad de la enzima

21.

Estos resultados demuestran que la región relevante enla Ca

2+-ATPasa para el efecto del etanol está ubicada

entre estos 95 aminoácidos diferentes entre las dosformas truncadas.

Estos estudios merecen ser continuados con el objetode caracterizar la secuencia de aminoácidos responsabledel efecto del etanol en esta enzima.



310 Benaim

Figura 3. Efecto del etanol sobre la actividad hidrolítica de las distintas isoformas expresadas de la Ca2+

-ATPasa. La concentración de

Ca2+

libre fue 10 µM. (A) isoforma PMCA1CI, (B) isoforma PMCA2CI, (C) isoforma PMCA4CI y (D) isoforma PMCA4CII. (○) representa la

curva de control y (●) en presencia de 5 µg/ml CaM. El 100 % de actividad para la isoforma PMCA1CI corresponde a una actividad

específica de 1.40 nmolPi/mg.min, para la isoforma PMCA2CI es de 4.36 nmolPi/mg.min, para la PMCA4CI es de 6.19 nmolPi/mg.min ypara la PMCA4CII es de 7.95 nmolPi/mg.min. (Tomado de Cervino y col. 1998, con autorización).


-ATPasa por otros lípidos naturales

El efecto del etanol sobre la actividad hidrolítica de ATP y sobre el transporte de calcio asociado es mayorque el reportado hasta el presente mediante el uso deotros efectores naturales o artificiales

10,34, lo cual índica

que la bomba de calcio de la membrana plasmática debeser estimulada fisiológicamente mediante otrosmecanismos desconocidos hasta el presente. En estesentido nos propusimos identificar la posible existenciade estos efectores naturales. Entre los candidatos quedecidimos estudiar, tomando en cuenta suscaracterísticas físico-químicas y su estructura molecular(compuestos anfifílicos con grupos "hidroxilo" libres) seencuentran los esfingolípidos. Estos compuestos cuyafunción era bastante oscura en el pasado (de ahí sunombre), han sido reconocidos recientemente como unimportante grupo de segundos mensajeros, involucradosen procesos celulares tan relevantes como laproliferación celular, la diferenciación y la muerte celular

programada, mejor conocida como apoptosis30

. Laceramida se forma a partir de la esfingomielina poracción de una esfingomielinasa, y a su vez estransformada en esfingosina por una ceramidasa. Ambosesfingolípidos presentan dos grupos “hidroxilo” libres(Figura 4) y a su vez, ambos son susceptibles de serfosforilados a través de quinasas específicas, las cualeslos transforman en ceramida-1-P y esfingosina-1-P, los

cuales constituyen a su vez otro grupo de señales confunciones diferentes a sus precursores

30. A pesar de la

importancia que han revestido recientemente este nuevogrupo de señales, poco se sabe respecto a sumecanismo de acción, y menos aún respecto a surelación con otros mensajeros, en particular con el Ca

2+.

Utilizando como sistema de estudio a la Ca2+

-ATPasapurificada de eritrocitos humanos, demostramos que laceramida tiene un notable efecto estimulatorio sobre laactividad de esta enzima

24. Este efecto es aditivo al

obtenido en presencia de CaM, y curiosamente tambiénal obtenido en presencia de etanol, lo cual indica que

0 1 2 3 4 5 60

100

200

300

400

0 1 2 3 4 5 6

0

100

200

300

400

0 2 4 6 8 10 120

100

200

300

400

0 2 4 6 8 10 12

0

100

200

300

400

Et-OH, % (v/v) Et-OH, % (v/v)


A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a ,

( % )

A c t i v i d a d C a 2 +

- A T P a s a ,

( % )


( % )

A c t i v i d a d C a 2 + -

A T P a s a ,

( % )

PMCA1CI PMCA4CII

PMCA4CIPMCA2CI

0 1 2 3 4 5 60

100

200

300

400

0 1 2 3 4 5 6

0

100

200

300

400

0 2 4 6 8 10 120

100

200

300

400

0 2 4 6 8 10 12

0

100

200

300

400




( % )

A c t i v i d a d C a 2 +

- A T P a s a ,

( % )


( % )

A c t i v i d a d C a 2 + -

A T P a s a ,

( % )

PMCA1CI PMCA4CII

PMCA4CIPMCA2CI



Ca2+


actúan a través de mecanismos distintos (Figura 5). Elefecto observado se manifiesta también en unincremento significativo en la afinidad de la enzima por elCa

2+. En este estudio también ensayamos el efecto de

este esfingolípido sobre la expresión funcional de laCa

2+-ATPasa, el transporte de Ca

2+, encontrando que es

capaz de estimular la acumulación del catión envesículas invertidas de eritrocitos humanos

24, también de

una manera aditiva a la CaM (Figura 6). La esfingosina,

a diferencia de la ceramida, tiene un marcado efectoinhibitorio sobre la actividad de la Ca

2+-ATPasa, tanto en

presencia como en ausencia de CaM, compatible con elfrecuente efecto antagónico que estos dos esfingolípidospresentan entre si en diferentes sistemas

30. Por otra

parte, ni la ceramida-1-P, ni la esfingosina-1-P mostrarontener efecto sobre la actividad de esta enzima

24. Estos

estudios permiten enlazar a la Ca2+

-ATPasa con los

esfingolípidos en la red de transmisión de señales.

Figura 4. Diagrama de la ruta de síntesis y degradación de los esfingolípidos. Las enzimas principales involucradas están señaladas.

O

OHCH2OH

NH

OHCH2OPO3

-H2

NH

O

OHCH2OPO3

-H2

+NH3

Ceramida-1-fosfato

Esfingomielina

O

NH

OHCH2OPO3

-CH2CH2 N(CH3)3+

Ceramida

esfingomielinasa

OHCH2OH

+NH3

Esfingosina

Esfingosina-1-fosfato

ceramidasa

esfingosina quinasa

ceramida quinasaO

OHCH2OH

NH

OHCH2OH

NH

OHCH2OPO3

-H2

NH

O

OHCH2OPO3

-H2

+NH3

Ceramida-1-fosfato

Esfingomielina

O

NH

OHCH2OPO3

-CH2CH2 N(CH3)3+

Ceramida

esfingomielinasa

OHCH2OH

+NH3

Esfingosina

Esfingosina-1-fosfato

ceramidasa

esfingosina quinasa

ceramida quinasa



312 Benaim

Figura 5. Efecto de concentraciones crecientes de ceramida sobre la actividad de la Ca2+

-ATPasa purificada de eritrocitos humanos. La

concentración de Ca2+

libre utilizado fue 10 µM. Control (○); Calmodulina (●).5% (v/v) etanol (); 5% (v/v) etanol mas calmodulina ().Modificada con permiso de C. Colina, V. Cervino y G. Benaim, (2002) Biochem. J. 362: 247-251. The Biochemical Society

Figura 6. Transporte de Ca2+

inducido por ceramida en vesículas de eritrocitos humanos. El transporte de Ca2+

se determinó mediante Arsenazo III en un espectrofotómetro de doble longitud de onda (675-685 nm) en vesículas invertidas de eritrocitos humanos. Eltransporte de Ca

2+ se evidencia como una disminución en la señal debida a la disminución del Ca

2+ extravesicular, luego de su captura a

través de la bomba. La adición del ionóforo de Ca2+

A-23187 conlleva a la liberación del catión, lo cual demuestra que había sidoacumulado en las vesículas. (). Modificada con permiso de C. Colina, V. Cervino y G. Benaim, (2002) Biochem. J. 362: 247-251. TheBiochemical Society.

0

2

4

6

0 10 20 30 40 50

Concentración de ceramida, (µM)

( µ m o l e s P i / m

g . m

i n )

0

2

4

6

0 10 20 30 40 50


g . m

i n )

A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a

0

2

4

6

0 10 20 30 40 50

Concentración de ceramida, (µM)


g . m

i n )

0

2

4

6

0 10 20 30 40 50


g . m

i n )

A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a

CaCl 2

2.5 µM

Ceramide

CaM

100 sec

ATP

A23187

CaCl 2

2.5 M

Ceramida

CaM

100 seg

ATP

A-23187

CaCl 2

2.5 µM

Ceramide

CaM

100 sec

ATP

A23187

CaCl 2

2.5 M

Ceramida

CaM

100 seg

ATP

A-23187



Ca2+


Como continuación de este estudio, masrecientemente hemos obtenido resultados que apoyanque el diacilglicerol, otro lípido con un grupo “hidroxilo”libre, también es capaz de estimular la Ca

2+-ATPasa,

incluso a niveles superiores a los alcanzados por otrosefectores naturales, reproduciendo parcialmente elefecto del etanol sobre esta enzima

37. Como se

mencionó anteriormente, el diacilglicerol es un

importante segundo mensajero que se forma mediante laactivación de receptores por ciertas hormonas yneurotransmisores, lo cual conlleva a la hidrólisis delprecursor fosfatidilinositol 4,5, -bisfosfato

15 y a la

producción simultanea del promotor de la liberación de

Ca2+

del retículo endoplasmático, el inositol-(1,4,5) tris-fosfato. Los resultados obtenidos hasta el presenteindican que el efecto del diacilglicerol sobre la actividadde la enzima es aditivo respecto a la estimulación por laCaM y por la proteína quinasa C, lo cual constituiría unavía alterna de regulación de la Ca

2+-ATPasa.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por el FONACIT(Proyecto S1-1999000058 y Proyecto de Grupo G-2001000637) y por el C.D.C.H-U.C.V. PI-03-33-4798/00.

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Benaim G. Acta Cientif Venezol REV 2004

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