Betacarotenos en Una Validacion

8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion

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VALIDACI N DE UN M TODOALIMENTOS, POR CR

DETERMINACI N

GUATEMA

L

LICENCIATU

UN

ANAL TICO PARA LA CUANTIFICACIMATOGRAF A L QUIDA DE ALTA RESN GUAYABA FRESA (Psidium cattleia

CAMPUS CENTRAL

A DE LA ASUNCI N, AGOSTO DE 20

ISA MARÍA ARIAS GONZÁLEZ

CARNET 20038-07

TESIS DE GRADO

RA EN INGENIER A QU MICA INDUSTFACULTAD DE INGENIERÍA

IVERSIDAD RAFAEL LAND VAR

N DE VITAMINA A ENLUCI N Y SU

um sabine)

4

IAL


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TRABAJO PRES

VALIDACI N DE UN M TODOALIMENTOS, POR CR

DETERMINACI N

EL T TULO DE INGENIERA QU M

GUATEMA

L

UN

LICENCIATU

INGENIERÍA

ENTADO AL CONSEJO DE LA FACUL

ANAL TICO PARA LA CUANTIFICACIMATOGRAF A L QUIDA DE ALTA RES

N GUAYABA FRESA (Psidium cattleia

ICA INDUSTRIAL EN EL GRADO ACAD

PREVIO A CONFERÍRSELE

A DE LA ASUNCI N, AGOSTO DE 20

CAMPUS CENTRAL

ISA MAR A ARIAS GONZ LEZPOR

TESIS DE GRADO

IVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR

FACULTAD DE INGENIERÍA

RA EN INGENIER A QU MICA INDUST

AD DE

N DE VITAMINA A ENLUCI N Y SU

um sabine)

MICO DE LICENCIADA

4

IAL


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SECRETARIA GENERAL:

VICERRECTORADMINISTRATIVO:

VICERRECTOR DEINTEGRACIÓN UNIVERSITARIA:

VICERRECTOR DEINVESTIGACIÓN YPROYECCIÓN:

VICERRECTORA ACADÉMICA:

RECTOR:AUTORIDADE

AUTORID

DECANO:

VICEDECANO: I

SECRETARIA:

DIRECTOR DE CARRERA:

TER

NOMBRE DINGRA. ISIS

M

MGT

LIC. RI

DR. CARLOS RAFAEL CABARR S P

DRA. MARTA LUCRECIA M NDEZ G

MGTR. LUIS ESTUARDO QUAN MA

LIC. ARIEL RIVERA IRÍAS

LIC. FABIOLA DE LA LUZ PADILLA BLORENZANA

P. EDUARDO VALDES BARRIA, S. J.DE LA UNIVERSIDAD RAFAEL LAN

ADES DE LA FACULTAD DE INGENIE

GTR. JOSE CARLOS RICARDO VEL

ING. CARLOS ENRIQUE GARCIA BICK

GTR. KAREN GABRIELA MORALES

DR. MARIO RENE SANTIZO CALDERO

A QUE PRACTIC LA EVALUACI N

L ASESOR DE TRABAJO DE GRADU ARACELY LOPEZ CIFUENTES DE GA

TR. MARIA LILIAN PAIZ RAMIREZ

. MIRIAM ESTELA CHAVEZ RAMIREZ

ARDO ANTONIO MONTOYA SEGUR

ELLECER, S. J.

ONZ LEZ DE PENEDO

K

ELTRANENA DE

VAR

ÍA

SCHIPPERS

FORD

ERRERA

N

CIÓN LVEZ


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Dedicatoria

A Dios y la Virgen por ser lo que soy, por darme la voluntad para terminar misestudios con éxito, la fuerza para levantarme en cada caída, la paz en los

momentos difíciles, y la sabiduría para tomar las mejores decisiones.

A mi mami, por su amor, paciencia, apoyo incondicional, por creer en mí, sobre

todo por sus oraciones que me dieron paz cuando más lo necesitaba.

A mi papi por darme ánimos y consejos a lo largo de la carrera. Por su amor, porcreer en mí y ser paciente en todo momento.

A mis hermanas y cuñado, Colocha, Canche, Seca, y Joe, por darme su alegría,

motivación y ser un ejemplo para mí de la perseverancia, la lucha constante y que

todo se puede lograr. A mi Fernandita bella, por darme su sonrisa y alegría,

haciendo mis días más bonitos.

A mi Guapito, por ser parte importante de mi vida, estando a mi lado durante toda

la carrera, compartiendo desvelos, madrugadas, largas horas de estudio y

celebrando cada triunfo. Por todo su apoyo, su amor, alegría y paciencia, te amo!


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Agradecimientos

A las autoridades y personal del Laboratorio CONCALIDAD, por brindarme suconfianza y apoyo para realizar mi trabajo de graduación.

A la Ing.Isis, por su cariño, confianza y apoyo incondicional durante la carrera y la

realización de la tesis, por sus consejos y conocimientos. Sobre todo por ser un

ejemplo para mí de una persona integral en lo profesional y en el personal.

A mis compañeras de trabajo, Lic.Gaby, por su cariño, motivándome todos losdías para finalizar la carrera y la tesis, gracias por sus risas que me alegraban el

día, y todo el apoyo que me brindó, es un gran ejemplo para mí. La Canchita, por

apoyarme en los momentos de estrés, su compañía en las tardes de arduo

trabajo, por su alegría y positivismo ante las dificultades. A Milvis, por toda la

ayuda en la realización de la tesis.

A todos mis amigos que me acompañaron durante la carrera, en los desvelos,

proyectos y triunfos. En especial a Andrea, Chin, y Jorge, por estar pendiente en

todo momento del proceso de la tesis, por su cariño y apoyo.

A toda mi familia y amigos, que de una u otra forma estuvieron pendientes durante

la carrera, motivándome a seguir adelante, creyendo en mí. En especial a la

familia Keller González, Espinoza González, Arias Chupina y Fajardo Galindo. Mil

gracias.


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Resumen Ejecutivo

El presente trabajo titulado: Validación de un método analítico para la

cuantificación de vitamina A en alimentos en cromatografía líquida de altaresolución y su determinación en guayaba fresa (Psidium Cattleianum Sabine),

surgió por la necesidad de validar un método nuevo para cuantificar la vitamina A,

y aportarlo al laboratorio CONCALIDAD. Influyó por ser Guatemala un país con

problemas de deficiencia de Vitamina A, siendo necesario tener metodologías

validadas con rapidez de obtención de resultados, para que las industrias

alimenticias puedan evaluar el contenido de vitamina A de sus productos, y

cumplir así con los requerimientos que establece la FDA.

Para validar la metodología se evaluaron 9 parámetros de desempeño regidos por

la Norma ISO 17025, los cuales fueron: selectividad, linealidad, límite de

detección, límite de cuantificación, rango, robustez, exactitud, precisión e

incertidumbre. Se trabajó con dos materiales de referencia, uno certificado,

Acetato de Retinol, y el segundo una fórmula infantil, el cual no se encuentra

certificado bajo ninguna norma, pero es un alimento controlado por empresas

reconocidas. Se concluyó que el método es válido bajo todos los parámetros de

desempeño, determinando que el procedimiento debe ser trabajado por analistas

con destrezas técnicas que les permitan desarrollar correctamente el método.

La guayaba fresa es un fruto con potencial de crecimiento en Guatemala, por

cultivarse en climas de subtropicales a fríos. La guayaba fresa es más conocida e

incluso fruto autóctono de Uruguay y Brasil, teniendo altas posibilidades de su

industrialización en Guatemala. Como parte de la aportación a la industria, sedeterminó que el contenido de vitamina A en guayaba fresa fue de

39.64±2.73µER/100g este contenido provino únicamente del valor detectado como

retinol, no se analizaron otras fuentes de provitamina A. Se concluyó por medio del

estudio estadístico, que la Guayaba Fresa posee un contenido de vitamina A

mayor que el de Guayaba Blanca. Descriptores: validación, parámetros de

desempeño, vitamina A, metodología y guayaba fresa.


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Índice I. Introducción ..................................................................................... 1

1.1 Lo escrito sobre el tema .................................................................. 2 1.2

Resumen Crítico del marco teórico ................................................. 4

1.2.1

Validación de un método analítico ................................................... 4

1.2.2

Verificación ...................................................................................... 4

1.2.3

Propósito de la validación................................................................ 5

1.2.4

Proceso para validar ....................................................................... 7

1.2.5

Requisitos Analíticos ....................................................................... 8

1.2.6

Revisión de los métodos de ensayo ................................................ 9

1.2.7

Selección de los Métodos de Ensayo ............................................ 10

1.2.8 Métodos Normalizados .................................................................. 11

1.2.9

Métodos No Normalizados ............................................................ 12

1.2.10

Métodos Desarrollados por el Laboratorio .................................... 13

1.2.11

Parámetros de desempeño del método ........................................ 13

1.2.12 Cromatografía Líquida de alta resolución (HPLC) ......................... 25

1.2.13

Vitamina A ..................................................................................... 29

1.2.14

Guayaba ........................................................................................ 32

1.2.15

Guayaba Fresa .............................................................................. 35

II. Planteamiento del problema .......................................................... 37

2.1 Objetivos ....................................................................................... 39

2.1.1

Objetivo General ........................................................................... 39

2.1.2

Objetivos Específicos .................................................................... 39

2.2

Hipótesis........................................................................................ 39

2.2.1 Nula ............................................................................................... 39

2.2.2 Alterna ........................................................................................... 39

2.3

Variables ....................................................................................... 39

2.3.1

Variables Independientes .............................................................. 39

2.3.2

Variables Dependientes ................................................................ 40

2.4 Definición de las variables ............................................................. 40

2.4.1

Definición Conceptual ................................................................... 40

2.4.2

Definición Operacional .................................................................. 42

2.5

Alcances y Límites ........................................................................ 44

2.6

Aporte ............................................................................................ 46

III. Método .......................................................................................... 47


10/123

3.1

Sujetos y Unidades de Análisis ..................................................... 47

3.2 Instrumentos.................................................................................. 49

3.3 Procedimiento ............................................................................... 56 3.3.1

Procedimiento para la cuantificación de Vitamina A ...................... 56

3.4

Diseño y Metodología estadística .................................................. 59

3.4.1

Diseño Experimental ..................................................................... 59

3.4.2 Experimentos, tratamientos y repeticiones .................................... 59

3.4.3

Descripción de las unidades experimentales ................................ 61

3.4.4

Variables respuestas ..................................................................... 61

3.4.5

Metodología de análisis ................................................................. 62

IV. Presentación y Análisis de resultados ........................................... 70 4.1 Diagrama del proceso para el método para la cuantificación deVitamina A por HPLC .................................................................................... 70

4.2 Diagrama del proceso de validación ............................................. 73

4.3

Parámetros de Desempeño ........................................................... 75

V.

Discusión ....................................................................................... 80

VI.

Conclusiones ................................................................................. 88

VII. Recomendaciones ......................................................................... 89

VIII.

Referencias bibliográficas ............................................................. 90

IX.

Anexos .......................................................................................... 92

9.1

Muestra de Cálculo ....................................................................... 94

9.2

Glosario ....................................................................................... 103

Índice de Tablas

Tabla No1. Guía de matriz para evaluación de Test de Youden y Steiner ............ 22

Tabla No.2 Matriz para evaluación de Test de Youden y Steiner modificada ....... 23

Tabla No.3 Formas de expresar el contenido de Vitamina A ................................ 32

Tabla No.4 Instrumentos utilizados en la metodología .......................................... 49

Tabla No.5 Materiales utilizados en la metodología .............................................. 51

Tabla No.6 Otros materiales.................................................................................. 55

Tabla No.7 Reactivos ............................................................................................ 55

Tabla No.8 Matriz de evaluación para determinar robustez .................................. 66

Tabla No.9 Selectividad ........................................................................................ 75


11/123

Tabla No.10 Linealidad ......................................................................................... 75

Tabla No.11 Límite de detección y cuantificación ................................................. 76

Tabla No.12 Repetibilidad ..................................................................................... 76 Tabla No.13 Reproducibilidad ............................................................................... 77

Tabla No.14 Sesgo con un valor teórico de 450 µER/100g ................................... 77

Tabla No.15 Rango ............................................................................................... 77

Tabla No.16 Datos calculados para la determinación de la robustez .................... 78

Tabla No.17 Conclusión de la robustez del método .............................................. 78

Tabla No.18 Conclusión de la robustez del método por medio de reproducibilidad yrepetibilidad ........................................................................................................... 78

Tabla No.19 Incertidumbre para la determinación de vitamina A en fórmula infantil .............................................................................................................................. 78

Tabla No.20 Incertidumbre para la determinación de vitamina A en Guayaba Fresa .............................................................................................................................. 79

Tabla No.21 Contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa .................................... 79

Tabla No.21 Datos originales para la determinación de Selectividad y sesgo. ..... 92

Tabla No.22 Datos originales para la determinación de Linealidad y Repetibilidadpor medio de Acetato de Retinol ........................................................................... 92

Tabla No.23 Datos originales para la determinación de Reproducibilidad ............ 93

Tabla No.24 Datos originales para la determinación de Robustez ........................ 93

Tabla No.25 Datos originales para la determinación del contenido de vitamina A enGuayaba Fresa. ..................................................................................................... 93

Tabla No. 26 Repetibilidad de la ecuación de la recta por medio de la curva decalibración. .......................................................................................................... 100

Índice de Figuras y Gráficas

Figura No.1 Elección, desarrollo y evaluación de métodos ................................... 11

Figura No.2 Esquema tiro al blanco para definir exactitud .................................... 18

Figura No.3 Componentes del cromatógrafo líquido de alta resolución ................ 26

Figura No.4 Sistema de inyección manual de muestras ....................................... 27

Figura No.5 Variedades mejoradas de la guayaba ............................................... 34

Figura No.6 Guayaba Fresa .................................................................................. 35

Figura No.7 Diagrama de posibles transformaciones industriales de la Guayaba yGuayaba Fresa ...................................................................................................... 36


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Figura No.7 Diagrama de Ishikawa para evaluar las posibles causas de laincertidumbre del método ...................................................................................... 69

Gráfica No.1 Determinación de la Curva de Calibración, para evaluación de lalinealidad del método ............................................................................................ 76

Figura No.9 Cromatograma de análisis de Guayaba Fresa .................................. 79

Figura No.10 Tabla de datos para la distribución normal t-Student, dos colas ... 106

Figura No.11 Diagrama de Flujo para realizar el procedimiento de validación ... 107

Figura No.12 Cromatograma para la concentración de 10µgER/ml .................... 108

Figura No.13 Cromatograma para la concentración de 7.5µgER/ml ................... 108

Figura No.14 Cromatograma para la concentración de 5µgER/ml ...................... 109


Figura No.16 Cromatograma para la concentración de 1µgER/ml ...................... 110


Figura No.18 Cromatograma para el blanco ....................................................... 111

Figura No.19 Cromatograma para fórmula infantil .............................................. 111


13/123

1

I. Introducción

La validación de un método analítico cuantitativo, se realiza con el propósito degarantizar la veracidad de los resultados que se obtengan de los análisis. Para

garantizarlos se han establecido parámetros que aporten información estadística,

ayudando a concluir si el método analítico es válido o no. En Guatemala el

proceso de normalización comenzó en 1956, con la formación del Instituto

Centroamericano de Investigación (ICAITI), uno de los propósitos era controlar la

calidad de los productos finales por medio de análisis químicos. Luego continuo la

creación de la Comisión Guatemalteca de Normas (COGUANOR) en el año de

1962, con la colaboración del Ministerio de Economía y el Ministerio de Salud En

la actualidad la normalización y el control de calidad de los procesos ha tenido un

auge en todos los sectores empresariales, entes autorizados certifican y avalan

sus procesos aportando a las empresas garantía en sus resultados. En los

laboratorios de ensayo se generó la necesidad de cumplir con los reglamentos

nacionales e implementar sistemas de gestión de calidad como lo dicta la Norma

ISO 17025, la cual solicita dentro de sus requisitos técnicos el uso de métodos

validados.

Para la validación del método cuantitativo de Vitamina A en cromatografía líquida

se analizaron diferentes parámetros, estableciendo los siguientes: linealidad,

selectividad, exactitud, precisión, límite de cuantificación, límite de detección,

rango, robustez e incertidumbre. La Vitamina A se encuentra de forma natural en

diversos alimentos y se adiciona cuando se requiere fortificar. Parte fundamental

de la investigación fue la determinación de la vitamina en un alimento fortificado y

en otro que se encuentre de forma natural. Se analizó una fórmula infantil como

alimento fortificado y material de referencia. Como alimento natural se utilizó la

guayaba fresa (Psidium Cattleianum), fruta de clima subtropical con facilidad de

cultivo en Guatemala, con potencial de ser industrializada por sus características

organolépticas y nutricionales. La validación del método aportó a la industria

alimenticia otra opción garantizada para el análisis de la Vitamina A indicada en

alimentos.


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15/123

3

García (2009) plantea una metodología para la cuantificación de vitaminas en

margarina por no existir; con la metodología planteada logró determinar

únicamente la Vitamina A, debido a que el método no fue apropiado para laVitamina E. Se llevó a cabo por medio de Cromatografía Líquida de Alta

Resolución, y la validación se realizó siguiendo los lineamientos de la FDA

(Federal Drug Asociation). Concluyó que la metodología en estudio es precisa,

reproducible, exacta, lineal, selectiva, robusta bajo los cambios y procesos

realizados, además de determinar el límite de cuantificación de 3.01UI/g de

muestra.


16/123

4

1.2 Resumen Crítico del marco teórico

1.2.1 Validación de un método analítico

De acuerdo a la Norma ISO 8502:1994, validación es la confirmación mediante

examen y suministro de evidencia objetiva que se cumplen los requisitos

particulares para un uso específico previsto. Guía EURACHEM, (2005).

De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), consiste en definir una necesidad

analítica para confirmar que el método utilizado tiene la capacidad de desempeño

de acuerdo a la aplicación. En el proceso de validación está implícito que el

equipo, reactivos y materiales se encuentran en especificaciones, además de

estar calibrados, en el caso de los equipos. El analista que realice el estudio

deberá ser técnicamente competente y con los conocimientos suficientes para

tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones que realice durante el

estudio. El método en estudio será el limitante para el proceso, el desarrollo de la

validación es dependiente del método a utilizar.

1.2.2 Verificación

De acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), en algunos casos se puede

realizar una validación menor o verificación cuando se trate de:

- Métodos normalizados.

- Métodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo:

uso en otra matriz.

- Ampliaciones y modificaciones menores de métodos normalizados.Ejemplo: uso en otros analitos.

Se verifican métodos previamente validados, que hayan sufrido alguna alteración

significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser:

cambio de equipo; cambio de componentes de equipo como columnas y

detectores; cambio analista, y cambio de la matriz que contiene la muestra, entre

otros. Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010)


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5

La verificación comprueba que el laboratorio domina el método de ensayo

normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un método

normalizado modificado para la verificación se requiere sólo realizar aquellaspruebas que indiquen que la variación realizada no afecta el ensayo. Guía Técnica

No.1 del ISPCH (2010).

1.2.3 Propósito de la validación

Según la Guía EURACHEM (2005), de forma general hay dos propósitos

principales por los que se debe validar un método: la importancia de las

mediciones analíticas y segundo el deber profesional del químico analítico.

- Importancia de las mediciones analíticas

Alrededor del mundo se realizan millones de mediciones por diversos motivos,

entre ellos se pueden mencionar: evaluación de bienes para propósitos de

comercio; como apoyo a la salud; verificar la calidad del agua o alimentos para el

consumo humano; en análisis forenses de fluidos corporales en investigaciones

criminales, y análisis de minerales en la industria minera, entre otras.

Implícitamente cada aspecto de la sociedad está apoyado de alguna forma por

mediciones analíticas, Guía EURACHEM (2005).

Estas mediciones tienen un costo, además surgen costos de las decisiones

tomadas en base a los resultados de dichas mediciones. Por ejemplo, las pruebas

que muestran que algún alimento no es adecuado para su consumo pueden

resultar en demandas por compensación; pruebas que confirmen la presencia dedrogas prohibidas que podrían ocasionar multas, encarcelamiento o más aún, la

ejecución en algunos países. Claramente es importante determinar el resultado

correcto y ser capaz de demostrar que lo es, Guía EURACHEM (2005).


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6

- El deber profesional del químico analítico

De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), si el resultado de una prueba no es

confiable entonces tiene poco valor y la prueba no debió haberse realizado bajo

ese procedimiento.

Si un cliente pide un trabajo analítico a un laboratorio, se presupone que el

laboratorio es técnicamente competente, con la experiencia y conocimientos para

realizar el trabajo. Regularmente el cliente no posee los conocimientos que ellaboratorio posee, él espera confiar en los resultados reportados y por lo general

sólo los cuestiona cuando surge una controversia. Guía EURACHEM (2005).

De este modo, el laboratorio y su personal tienen una clara responsabilidad de

corresponder a la confianza del cliente proporcionando la respuesta correcta a la

parte analítica del problema y proporcionando resultados que han demostrado ser

adecuados a su propósito.

Esto lleva implícito que las pruebas realizadas son apropiadas para la parte

analítica del problema que el cliente desea resolver y que el informe final presenta

los datos analíticos de tal manera que el cliente pueda entenderlos fácilmente y

sacar conclusiones apropiadas. La validación del método permite a los químicos

demostrar que el método es adecuado. Guía EURACHEM (2005).

Para que un resultado analítico concuerde con el propósito requerido, eldesempeño del método debe validarse y debe estimarse la incertidumbre del

resultado a un nivel de confianza dado. La incertidumbre deberá ser evaluada y

establecida de una forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma

interna y fácil de interpretar. La mayor parte de la información requerida para

evaluarla se puede obtener durante la validación del método.


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7

Parte del conocimiento que debe tener el analista químico y el laboratorio es la

toma adecuada de las muestras, la cual es un trabajo de gran habilidad que

requiere entender el problema con su química asociada. Guía EURACHEM(2005).

Según dicha guía, se debe validar un método cuando sea necesario verificar que

sus parámetros de desempeño son adecuados para el uso en un problema

analítico específico.

Por ejemplo:

- Nuevo método desarrollado para un problema específico.

- Método ya establecido revisado para incorporar mejoras o extenderlo a un

nuevo problema.

- Cuando el control de calidad indica que un método ya establecido está

cambiando con el tiempo.

- Método establecido usado en un laboratorio diferente, diferentes analistas o

con diferente instrumentación.

- Para demostrar la equivalencia entre dos métodos, por ejemplo, entre unmétodo nuevo y uno de referencia.

El alcance de la validación o la revalidación requerida dependerá de la naturaleza

de los cambios hechos al aplicar un método a diferentes laboratorios,

instrumentación, operadores y circunstancias en las cuales el método va a ser

utilizado.

1.2.4 Proceso para validar

El laboratorio que utiliza un método es responsable de asegurar que el método

esté validado adecuadamente y si es necesario llevar a cabo trabajo adicional

para complementar los datos ya existentes, Guía EURACHEM (2005).


20/123

8

Cuando un método ha sido validado por una organización de aprobación de

normas, como la AOAC Internacional, por lo general, el usuario necesitará

únicamente establecer los datos de desempeño del método para su propio uso.

La Guía EURACHEM (2005), menciona que el laboratorio tiene que decidir cuáles

de los parámetros de desempeño del método necesitan caracterizarse con el fin

de validar el método. La caracterización del desempeño del método es un proceso

costoso pero puede restringirse por consideraciones de tiempo y costo.

Al empezar con una especificación analítica considerada cuidadosamente, setiene una buena base sobre la cual planear el proceso de validación, pero se sabe

que en la práctica esto no siempre es posible.

El laboratorio deberá aplicarlo bajo sus condiciones con las restricciones

impuestas, tomando en cuenta las necesidades del cliente, la experiencia

existente sobre el método y la necesidad de compatibilidad con otros métodos

similares que ya estén en uso dentro del laboratorio o en otros laboratorios, Guía

EURACHEM (2005).

Una serie específica de experimentos proporcionará información sobre varios

parámetros, por lo tanto con una planeación cuidadosa puede minimizarse el

esfuerzo requerido para obtener la información necesaria. Guía EURACHEM

(2005).

1.2.5 Requisitos Analíticos

Frente a un problema analítico particular, idealmente, el laboratorio debería

acordar con el cliente una necesidad analítica, la cual definirá los requisitos de

desempeño que un método debe tener para ser adecuado para resolver el

problema analítico.


21/123

9

En respuesta a esta necesidad, el laboratorio puede evaluar si los métodos

existentes son adecuados, si es necesario desarrollar un nuevo método, o

modificar métodos existentes. Guía EURACHEM (2005).

1.2.6 Revisión de los métodos de ensayo

De acuerdo a la OGA-GEC-016, (2007), para cada sector técnico, la alta dirección

debe nombrar a una persona experimentada como responsable de la revisión de

los métodos, con el fin de incluir modificaciones, actualizaciones o desarrollar e

implementar nuevos métodos.

Para confirmar que el método se ajusta al uso previsto en el laboratorio es

necesario determinar su desempeño conforme una combinación de las siguientes

técnicas, según lo establecido en la nota 2 del numeral 5.4.5.2 de la Norma

COGUANOR NTG/ISO/IEC 17025, adoptada por la OGA como un criterio de

acreditación para laboratorios de ensayo y calibración:

- La calibración utilizando patrones de referencia o materiales de referencia.

- La comparación con resultados obtenidos por otros métodos.

- Las comparaciones interlaboratorios.

- La evaluación sistemática de los factores que influyen en el resultado.

- La evaluación de la incertidumbre de los resultados basada en el

conocimiento científico de los principios teóricos del método y en la

experiencia práctica. OGA-GEC-016, (2007).

Aun cuando se haya realizado la validación del método, el laboratorio tendrá que

verificar periódicamente que se cumplen los parámetros de desempeño

documentados por parte de la organización que lo desarrolló, modificó y/o publicó.


22/123

10

Para esta verificación el laboratorio puede utilizar, por ejemplo, muestras

inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices más

representativas. También tiene que tomar en cuenta los resultados obtenidos delas auditorías internas y externas de sus sistemas de gestión, dejando registro de

las verificaciones, OGA-GEC-016, (2007).

En el documento de la OGA-GEC-016, (2007), menciona que la documentación

referente a la modificación, actualización, validación y verificación del método

debe incluir registros de la determinación de los parámetros de desempeño,

limitaciones de su aplicabilidad, procedimientos para control de calidad, calibracióny control de documentos. Estos registros deben estar disponibles a solicitud de los

miembros del equipo evaluador durante las visitas en sitio, ya sea de evaluación

para la acreditación, seguimiento o reevaluación.

Los procedimientos y responsabilidades para el desarrollo, validación, verificación

e implementación de los métodos deben ser descritos en detalle dentro de la

documentación del sistema de calidad del laboratorio.

1.2.7 Selección de los Métodos de Ensayo

Es responsabilidad del laboratorio utilizar los métodos apropiados para el

propósito, según el alcance requerido. Estos métodos pueden ser normalizados,

no normalizados o desarrollados por el propio laboratorio.

El laboratorio, de común acuerdo con el cliente, puede seleccionar los métodos

utilizando su propio criterio o utilizar aquellos métodos normalizados vigentes en el

país. Si el método es normalizado debe demostrar que éste corresponde a la

última edición, a menos que sea apropiado o posible el uso de una versión anterior

del método. Guía EURACHEM,(2005).


23/123

11

Adicionalmente se debe establecer un sistema para evaluar la factibilidad de

implementar los posibles cambios introducidos en las nuevas versiones del

método, determinando las diferencias en cuanto a equipo, formación del personal,instalaciones, y demás aspectos necesarios para la ejecución del ensayo.

Figura No.1 Elección, desarrollo y evaluación de métodos

Fuente: Guía EURACHEM,(2005)

1.2.8 Métodos Normalizados

Las normas de calidad y regulaciones frecuentemente requieren el uso de

métodos normalizados. A la vez, el uso de métodos normalizados es deseable en

situaciones en las que el método será ampliamente utilizado; sin embargo,

algunas veces el laboratorio puede contar con un método propio más adecuado

para el propósito. Los métodos normalizados deben ser utilizados por el

laboratorio exactamente como están descritos.


24/123

12

1.2.9 Métodos No Normalizados

Los métodos no normalizados deben estar apropiadamente validados para poderutilizarlos, ya sean éstos desarrollados por un tercero o resultado de la

modificación de un método normalizado. En el caso de modificaciones, es

necesario demostrar que éstas no tienen una repercusión sobre la calidad de los

resultados.

De acuerdo a la guía OGA-GEC-016, (2007), el laboratorio debe desarrollar un

procedimiento de ensayo que incluya al menos la siguiente información, previo a la

utilización de un nuevo método:

- La identificación apropiada.

- El alcance.

- La descripción del tipo de objeto a ensayar o a calibrar.

- Los parámetros o magnitudes a ser determinados y los rangos

correspondientes.

- Los aparatos y equipos, incluyendo los requisitos de desempeño técnico.

- Los patrones de referencia y materiales de referencia requeridos.

- Las condiciones ambientales requeridas y cualquier período deestabilización necesario.

- La descripción del procedimiento, incluyendo: La colocación de marcas de

identificación, manejo, transporte, almacenamiento y preparación de ítems

la verificación a realizar antes de comenzar el trabajo, la verificación que el

equipo está trabajando apropiadamente y, cuando sea necesario, ajustar y

calibrar el equipo antes de cada uso, el método de registro de las

observaciones y los resultados, las medidas de seguridad a observar.- Los criterios o requisitos para la aprobación o el rechazo.

- Los datos a ser registrados y el método de análisis y presentación.

- La incertidumbre o el procedimiento para estimarla.

Además, la documentación del método debe incluir las especificaciones

principales resultantes de la validación. OGA-GEC-016, (2007).


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13

1.2.10 Métodos Desarrollados por el Laboratorio

Cuando sea el caso, el laboratorio debe demostrar que tiene un plan en el que seincluye la evaluación de su capacidad en cuanto a personal, equipo y demás

recursos que le permitan desarrollar métodos propios. Los métodos desarrollados

por el laboratorio deben estar adecuadamente validados, documentados y

autorizados antes de su uso. Cuando sea posible, se debe emplear material de

referencia con una matriz equivalente a la de la muestra, o bien debe utilizarse un

método de ensayo normalizado alterno, preferiblemente de diferente principio de

medición, para comparar los resultados. OGA-GEC-016, (2007).

1.2.11 Parámetros de desempeño del método

Son las propiedades, características o capacidades cuantificables del método que

indican su grado de calidad, se pueden incluir: exactitud, exactitud relativa,

desviación, desviación positiva, desviación negativa, efecto matricial, repetibilidad,

precisión intermedia, reproducibilidad, especificidad, límite de detección, límite de

cuantificación, linealidad, rango, sensibilidad, robustez y otras característicasrelacionadas con los resultados obtenibles por el método, OGA-GEC-016, (2007).

- Selectividad o Especificidad

De acuerdo al Instituto Nacional de Chile (2010), “La selectividad es el grado en

que un método puede cuantificar o cualificar al analito en presencia de

interferentes.” Generalmente los interferentes se encuentran en la matriz de

análisis. La prueba de selectividad puede diseñarse de acuerdo al método, en el

caso de cromatografía la resolución entrega información sobre la selectividad del

método, en el caso de espectrofotometría el espectro de absorción o un espectro

de masas entrega información al respecto, en especial cuando es comparado en

presencia de una interferencia.


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14

Una prueba de Selectividad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo

de tres reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estándares de

concentración conocida del analito de interés. Guía Técnica No.1 del ISPCH(2010).

Se deben comparar las lecturas obtenidas para cada caso, y observar si existen

variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estándares o

muestras con analito. Si se encuentran diferencias significativas deberán ser

identificadas y en lo posible eliminadas. Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).

- Linealidad

De acuerdo en la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), “La linealidad es la

capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, de dar

una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad

del analito que se habrá de determinar en la muestra de laboratorio.”

Para determinar el rango lineal se puede realizar mediante una gráfica deconcentración versus respuesta, donde la respuesta en el caso de cromatografía

corresponde al área identificada. La función determinada por la regresión de la

gráfica se conoce como Función Respuesta o Recta de calibrado, luego de

establecido el rango, se determina la Curva de calibración, que incluirá los valores

analizados desde el valor cero.

La curva de calibración se debe realizar cada vez que se trabaje el método, con

diferentes puntos, incluyendo blanco y el material de referencia de concentración

conocida. Se recomienda abarcar valores cercanos al cero y valores superiores al

valor de interés. El número de puntos a analizar deberá ser establecido por el

analista de acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).


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Generalmente el criterio de aceptación cualitativo que se usa para determinar la

linealidad es el coeficiente de correlación: El coeficiente de correlación indica el

grado de relación entre la variable concentración X y la variable respuesta Y de lacurva de calibración. El valor máximo de 1 indica una correlación positiva perfecta

entre X,Y con una pendiente positiva. Cuando r = 0, no existe correlación alguna,

independencia total de los valores X,Y.

De acuerdo a la Guía Técnica No. 1 del ISPCH (2010), en la práctica si r tiene un

valor cercano a uno 1, esto significa que existe correlación con una probabilidad

elevada. Para una curva de calibración o trabajo, es recomendable que elcoeficiente de correlación obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el

caso de trazas se admite un valor igual o mayor que 0.99.

Adicionalmente como un mejor indicador se puede realizar una evaluación de

curva de calibración global, haciendo repeticiones de la curva en las mismas

condiciones, realizando una evaluación estadística de prueba t-Student.

Se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad, de t para el nivel de confianza

requerido del 95% (α = 0.05), dos-colas, en este caso para un “n” que depende de

los niveles de calibración.

Se desea probar si existe entonces una correlación significativa: La hipótesis nula

H0 es que no existe correlación entre X,Y . Si el valor observado de tr es mayor que

tcrítica, se rechaza la hipótesis nula H0, siendo la correlación lineal significativa con

la probabilidad calculada. Fuente Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).

H0: r=0, El coeficiente de correlación obtenido procede de una población cuya

correlación es cero.

H1: r≠0, El coeficiente de correlación obtenido procede de una población cuya

correlación es distinto de cero.


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16

Se rechaza la hipótesis nula, las variables están relacionadas.

Se acepta la hipótesis nula, las variables no están relacionadas.

tcrítica se determina por medio de las tablas para un nivel de confianza del 95%

para grados de libertad n-2, por conocer el valor de la media y de la desviación

estándar.

||√ 2 1

Fuente: Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).

Dónde:

tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlación

| r | = Valor absoluto del coeficiente de correlación

n–2 = Número de grados de libertad

r2 = Valor del coeficiente de determinación

- Límite de detección (LDD)

De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), bajo la AOAC, el límite de detección

es: “El menor contenido que puede medirse con una certeza estadística razonable.

O bien el menor contenido de analito, si está presente, que será detectado y que

puede ser identificado”.

Este parámetro de desempeño ha sido utilizado cuando el método estudiado

abarca concentraciones pequeñas a niveles de trazas, aunque también es un

parámetro necesario para determinar el límite de detección. Dado a su

funcionalidad existen confusiones debido a que no existe actualmente un acuerdo

universal sobre la terminología aplicada.


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17

El término límite de detección no es aceptado ampliamente aunque se usa en

varios documentos sectoriales. La ISO utiliza como un término general “valor

mínimo detectable de la variable de estado definida”. Fuente: Guía EURACHEM(2005). De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005). El límite de detección no existe

criterio de aceptación, ya que depende del propósito de la metodología empleada,

pero se puede determinar con la muestra en concentración cercana al blanco.

El primer paso para determinar el límite de detección es calcular el valor crítico, el

cual se determina con un nivel de confianza del 95%, con grado de libertad infinito,

el cual es de 1.645. ∑ ! " 2 " #$2% "

LC=Valor crítico

LOD=Límite de detección

S=Desviación estándar

&=Media'=Datos obtenidos de cada lectura- Límite de cuantificación

“El “límite de cuantificación“(LDC) estrictamente es la concentración más baja del

analito que puede ser determinada con un nivel aceptable de precisión de

repetibilidad y veracidad. También se define por diversas convenciones como la

concentración del analito correspondiente al valor del blanco de muestra más 5, 6

ó 10 desviaciones estándar de la media del blanco.” Fuente: Guía EUROCHEM

(2005).


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18

- Exactitud

De acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010) (Pág. 39), Bajo el manual

del Codex Alimentarius, define la exactitud como el grado de concordancia entre el

resultado de un ensayo y el valor de referencia. El término “exactitud” está

aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una combinación de

componentes aleatorios y un componente común de error sistemático o sesgo.”

Al ser aplicado a un método de ensayo, la exactitud se refiere a la combinación de

veracidad y precisión. Se puede ejemplificar de acuerdo a la Fig.No.2, los círculos

equivalen al rango en que se espera el valor de referencia, y los puntos a los

resultados analíticos. Mientras más veraz y preciso sea, el método tendrá una

exactitud alta. EURACHEM (2005).

Figura No.2 Esquema tiro al blanco para definir exactitud



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Dado que la exactitud depende de dos variables, dentro del plan de validación

debe establecerse la forma de evaluación. Para analizar la veracidad se puede

determinar el sesgo o el porcentaje de recuperación, mientras que la precisión pormedio de repetitibilidad y reproducibilidad.

- Sesgo

De acuerdo a Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010) es la diferencia entre la

expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una medición y el valor

verdadero. En la práctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valor

verdadero. El sesgo es el error sistemático total en contraposición al error

aleatorio.

Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material

fortificado o material control. Se debe medir un analito de concentración conocida

y se determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media

del valor obtenido.

- Recuperación

De acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), es la fracción de la

sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del análisis, al ser

analizadas muestras fortificadas y sin fortificar. La recuperación permite ver el

rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso de extracción y la

cantidad del analito existente en la muestra original. Por lo cual, la recuperación

esta intrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la muestra.

Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres

niveles. Se debe considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de

calibración del método, el LDD y el LMP (Límite máximo permitido) establecido. De

manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor información

posible respecto a la capacidad de recuperación del método, en cuanto a estos

valores críticos.


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- Precisión

La precisión podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. El

grado de precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y se

calcula como desviación estándar de los resultados (Referencia: Manual Codex

Alimentarius 18º Ed.)

a) Repetibilidad:

Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde

los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método en

ítems de análisis idénticos en el mismo laboratorio por el mismo operador

utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo. Se puede

determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones

(mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de

tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la desviación

estándar (S) y el porcentaje de coeficiente de variación (CV%). Guía Técnica No.1

del ISPCH (2010).

b) Reproducibilidad:

Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones

donde los resultados de los análisis se obtienen con el mismo método en ítem

idénticos de análisis en condiciones diferentes ya sea de laboratorio, diferentes

operadores, usando distintos equipos, entre otros. Se puede determinar por medio

del coeficiente de Horwitz, o el valor de HorRat. El valor de HorRat es la razón del

coeficiente de variación de las réplicas dentro del coeficiente de variación de

Horwitz. Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010)

- Rango

De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), es necesario determinar el intervalo de

concentraciones del analito o los valores de la propiedad relacionada, sobre los

cuales el método puede aplicarse. Esto se refiere al intervalo de concentraciones o

a los valores de la propiedad relacionada, de las disoluciones medidas.


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En el extremo inferior del intervalo de concentración, los factores limitantes son los

valores del límite de detección y/o cuantificación, depende del método para que

estos sean el extremo inferior del rango.

Otra forma de establecer el rango es la siguiente: en el extremo superior del

intervalo de concentración, las limitaciones serán impuestas por varios efectos que

dependen del sistema de respuesta del instrumento. El rango se puede determinar

por medio de la curva de calibración, la cual contendrá los puntos necesarios para

evaluar la linealidad del método, además de evaluar la menor concentración a la

que se pueda obtener resultados precisos, y la concentración mayor que se tomecomo valor límite máximo. Guía EURACHEM (2005).

- Robustez

La Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), menciona que la robustez es una medida

de la capacidad del método analítico de no ser afectado por variaciones pequeñas

pero deliberadas de los factores del método.

Este parámetro de desempeño proporciona una indicación de la fiabilidad del

procedimiento en un uso normal, optimiza el método analítico desarrollado o

implementado por el laboratorio, para describir bajo qué condiciones analíticas se

pueden obtener a través de este método resultados confiables.

Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus

resultados frente a una modificación de las condiciones analíticas. Entre las

condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran: analistas,equipos, reactivos, pH, temperatura, tiempo de reacción, estabilidad de la muestra

y otros, Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).

Para poder determinar qué factores afectan al método se aplica el Test de Youden

y Steiner, el cual permite evaluar el efecto de siete variables con sólo ocho análisis

de una muestra.


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Inicialmente se deben identificar aquellos factores del método que posiblemente

afectarían los resultados finales obtenidos a través de este, Guía Técnica No.1 del

ISPCH (2010).

Ejemplo de factores que pueden afectar: temperatura, composición de fase móvil o

soluciones reactivas, pH de solución, tamaño de celda espectrofotométrica, flujo

gas acarreador, split, y otros. Para estudiar la robustez se procede a exponer a

cada factor a un estudio variable, cada variable se estudia mediante un valor alto

(A, B, C) y otro bajo (a,b,c). Los factores a estudiar no deben ser necesariamente

siete; puede considerarse un número menor de variables.

Tabla No1. Guía de matriz para evaluación de Test de Youden y Steiner

Valor de la

variable1 2 3 4 5 6 7 8

A,a A A A A a a a a

B,b B B B b B b b B

C,c C c C c C c C c

D,d D D D d d d D D

E,e E e E e e E e E

F,f F f F F F f f F

G,g G g G G g G G g

Resultado Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8


Se deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias

entre la variable de mayor valor versus la de menor valor:

∑ ( ∑ )* + , + , +- , +. +/ , +0 , + , +* Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).


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De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido,

cuanto mayor sea la diferencia de los resultados entre el valor mayor y el valormenor, mayor influencia tendrá dicha variable en el método analítico.

Como criterio de aceptación para la robustez del método se considera que la

diferencia entre el valor alto y el valor bajo sea superior a la raíz cuadrada de dos

de la desviación estándar del método (S), es decir:

3∑ ( ∑ )

* 4 √2

Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).

- Test Youden y Steiner modificado para tres variables

Cuando no se puedan evaluar 7 variables se puede realizar con menos variables,

en el caso de esta investigación se realizaron con 3 variables.

Tabla No.2 Matriz para evaluación de Test de Youden y Steiner modificada

ExperimentoFactores

ResultadosA B C

1 + + + Y1

2 - + - Y2

3 + - - Y3

4 - - + Y4

Fuente: Zagal.E, Sadzawka. A. (2009).

Para calcular la diferencia entre cada factor se realiza de la misma manera,

únicamente que con n=2. + , +-2


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- Incertidumbre

De acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), es el parámetro asociado al

resultado que caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden

ser atribuidos al mesurando. Es importante para un método validado o verificado

por el laboratorio, se realice la determinación de las diferentes fuentes o

componentes de la incertidumbre de la medición presentes:

- Muestreo

- Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, entre otros.

- Sesgos Instrumentales: Las debidas a las características de los equipos

utilizados para realizar las medidas tales como: resolución, magnitudes de

influencia.

- Analista: las debidas a la serie de mediciones: variaciones en

observaciones repetidas bajo condiciones iguales.

- Condiciones de medición: las debidas al certificado de calibración: en él se

establecen las correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un

valor de k (factor de cobertura) determinado, en las condiciones decalibración.

- Método (por ejemplo, al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo, las

constantes), pesada, alícuota, efectos computacionales. Guía Técnica No.1

del ISPCH (2010

Para este fin se deberá realizar una evaluación de las incertidumbres tipo A y B

que están presentes en el método:

- Evaluación de incertidumbre tipo A: evaluación de un componente por un

análisis estadístico de los valores de mediciones obtenidos en condiciones

de medición definidas. Ejemplo: realizar varias mediciones en condiciones

de repetibilidad.


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- Evaluación de incertidumbre tipo B: evaluación de un componente

incertidumbre de la medición realizada por otros medios distinto a los deltipo A. Ejemplos: La evaluación basada en la información, obtenidos a partir

de un certificado de calibración. Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).

1.2.12 Cromatografía Líquida de alta resolución (HPLC)

De acuerdo a Skoog (2007), la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) esel tipo de cromatografía de elución más versátil y ampliamente utilizado. Los

químicos la emplean para separar y determinar especies químicas de diversos

materiales orgánicos, inorgánicos y biológicos. En cromatografía líquida, la fase

móvil es un disolvente líquido que contiene la muestra como mezcla de solutos.

Hay diferentes tipos de cromatografía líquida, que suelen clasificarse según el

mecanismo de separación o el tipo de fase estacionaria:

1. Cromatografía de reparto o de líquido-líquido.

2. Cromatografía de adsorción o de líquido-sólido.

3. Cromatografía de intercambio de iones o iónica.

4. Cromatografía de exclusión molecular.

5. Cromatografía de afinidad.

6. Cromatografía quiral.


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Figura No.3 Componentes del cromatógrafo líquido de alta resolución

Fuente: Skoog. (2007)

- Instrumentación

a) Bomba

De acuerdo a Skoog (2007), la bomba debe cumplir ciertos requisitos: capacidad

para generar presiones de hasta 6000 psi, salida libre de pulsos, velocidad de flujo

de 0.1-10ml/min, reproducibilidad relativa de los flujos de 0.5% o menor y

resistencia a la corrosión por diversos disolventes.

Skoog (2007), menciona que existen tres tipos de bombas: de tipo jeringa

impulsada con tornillo, las bombas de vaivén u oscilantes y las bombas

neumáticas o de presión constante. Las de tipo jeringa producen una salida no

pulsada cuya velocidad de flujo se controla con facilidad, de baja capacidad de

250ml, por lo tanto no son apropiadas con cambios en los disolventes.


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Las bombas de vaivén son las más utilizadas. Consisten en una pequeña cámara

cilíndrica que se llena y se vacía con el movimiento oscilante de un pistón. El

movimiento de la bomba produce un flujo pulsado que debe atenuarse después.Una de sus ventajas es que tiene un volumen interno pequeño, una presión de

salida alta hasta de 10,000psi, fácil adaptación a la elución en gradiente y una

velocidad de flujo constante, Skoog (2007).

La bomba neumática tiene una forma más sencilla y cosiste en un recipiente

plegable que contiene un disolvente que puede presurizarse con un gas

comprimido; son sencillas, de bajo costo y no generan pulsos, pero tienen unacapacidad y una salida de presión limitadas, su velocidad de bombeo si depende

de la viscosidad del disolvente, y no son adaptables a la elución en gradiente,

Skoog (2007).

- Sistema de inyección manual de muestras

El más utilizado se basa en un bucle de muestras, existen intercambiables con

diferentes tamaños que varían de 5 a 500µL.

Figura No.4 Sistema de inyección manual de muestras

Fuente: Skoog (2007)

- Columnas

Usualmente se elaboran con tubos de acero inoxidable, o tubos de vidrio o Tygon

para aplicaciones de baja presión. La mayoría tienen una longitud de 10-30 cm y

diámetro interno de 2-5 mm, y con empaques de partículas de 3-10 µm.


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El empaquetamiento más común se prepara con partículas de sílice, que se

sintetizan por aglomeración de partículas submicrónicas de sílice en condiciones

que producen partículas más grandes y de diámetro muy uniforme.

Las partículas resultantes suelen cubrirse con películas orgánicas finas, que se

enlazan química o físicamente con la superficie. También existen columnas

empacadas de alúmina, de polímeros porosos o resinas de intercambio iónico,

Skoog (2007).

Para asegurar que los líquidos que ingresen a la columna estén libres decontaminantes o partículas que desgasten la columna, se colocan precolumnas,

en las cuales su composición de empaquetamiento es similar a la de la columna

analítica, pero con un tamaño de partícula mayor para minimizar la caída de

presión. Skoog (2007).

Además, para asegurar y obtener mejores cromatogramas se puede mantener

constante la temperatura de la columna a unas décimas de grado Celsius. Para

esto los cromatógrafos tienen incluidos calentadores para asegurar la temperatura.

- Detectores

Características de un detector: debe ser pequeño y compatible con el flujo de

líquido, el tipo de detector depende de la naturaleza de la muestra. Existen

diferentes tipos de detectores: están los detectores por absorbancia, fluorescencia,

electroquímico, índice de refracción, conductividad, espectrometría de masas,

FTIR, dispersión de luz, actividad óptica entre otros. Skoog (2007). Encromatografía líquida los más utilizados son por absorción de radiación ultravioleta

o visible, siendo algunos con lámpara de deuterio o de filamentos de tungsteno

con filtros de interferencia.


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Existen dos tipos de cromatografía muy importantes, los cuales dependen de la

polaridad de la fase móvil y de la fase estacionaria. Se encuentra la cromatografía

en fase normal, donde la fase estacionaria es polar y la fase estacionara es nopolar. En la cromatografía en fase reversa ocurre lo contrario, la fase estacionaria

es no polar, en muchos casos hidrocarburos, mientras que la fase móvil es un

disolvente relativamente polar como el agua, metanol, acetonitrilo o

tetrahidrofurano. Skoog (2007).

1.2.13 Vitamina A

De acuerdo a Gil (2010), la vitamina A es un nutriente de gran importancia. Su

deficiencia es la causa más común de enfermedades oculares como la

xeroftalmía, que puede llevar a la ceguera, principalmente a niños de países en

vías de desarrollo. Debido a esto y al mayor riesgo de padecer infecciones, la

deficiencia de esta vitamina es responsable del aumento de la morbilidad y la

mortalidad infantiles.

Además, es antioxidante provocando un efecto protector frente a los procesos de

oxidación celular mediados por radicales libres implicados en la aparición de

enfermedades crónicas como el cáncer, aterosclerosis, cataratas e incluso

envejecimiento.

La vitamina A está implicada en un gran número de procesos fisiológicos, por lo

que es necesario que sus requerimientos se cubran adecuadamente, Gil (2010).

De acuerdo a la FDA, el valor diario recomendado es de 5,000 UI, o bien 1,500µgER, para la población a partir de los 3 años de edad. RTCA 67.01.60:10.

Según Gil (2010), la vitamina A es un término genérico que se utiliza para describir

a los compuestos que presentan la actividad biológica del retinol, como los

retinoides y los carotenoides con actividad provitamínica A.


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La vitamina A fue la primera vitamina en ser definida; en 1915 la vitamina fue

denominada por McCollum y Davis “factor liposoluble A”, atribuyéndole como

propiedad principal la estimulación del crecimiento. En 1920 Drummond le asignóel término “Vitamina A”, aunque no fue aislada hasta 1937 por Morton.

De acuerdo a Gil (2010), en 1930 Moore mostró que la molécula del beta caroteno

presentaba actividad vitamínica A y desde entonces hasta ahora han sido

numerosas las funciones fisiológicas que se le han atribuido, tanto al beta

caroteno como al resto de compuestos englobados en la denominación de

vitamina A.

Los retinoides con actividad vitamínica A se encuentran en la naturaleza en tres

formas: alcohol (retinol), aldehído (retinal o retinaldehído) y el ácido (ácido

retinóico). Además del todo trans-retinol, otros cinco isómeros (7-cis, 9-cis, 11-cis,

13-cis y 9,13-cis-retinal) tienen actividad vitamínica A pero menor a los isómeros

trans, Gil (2010).

Las formas con mayor actividad fisiológica son el retinal y el ácido retinoico. En los

vegetales no existe como tal, pero sí sus provitaminas o precursores carotenoides,

de los cuales existen más de 500, siendo el más importante el β-caroteno. En la

conversión del β-caroteno en vitamina A, ocurren reacciones de oxidación-

reducción, transformándose en retinal, luego en retinol, para finalmente

almacenarse en el hígado como palmitato. En teoría, la ruptura enzimática de los

dos carbonos centrales en la mucosa intestinal liberaría dos moléculas de retinal,

sin embargo en la práctica esta transformación no se logra totalmente y sólo sealcanza el 50% de efectividad, Badui (2006).

Otros carotenoides con actividad provitamínica A son el alfa caroteno, el gama

caroteno y la beta criptoxantina., Gil (2010). Los carotenoides pueden ser

clasificados en dos grandes grupos, según su estructura:


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- Carotenoides con estructura de hidrocarburos o carotenos, que no

contienen oxígeno.

- Xantofilas u oxicarotenoides, que contienen grupos carboxilo y/o hidroxilo

en sus grupos constituyentes. Gil (2010).

Gil (2010), menciona que tanto los retinoides como los carotenoides son

liposolubles, y por lo tanto solubles en la mayor parte de solventes orgánicos.

En cuanto a las propiedades físicas, la mayoría de las formas de vitamina A son

compuestos cristalinos con un punto de fusión relativamente bajo y debido a su

estructura presentan un espectro de absorción característico que se utiliza para su

identificación.

Por sus propiedades fisicoquímicas, esta vitamina es estable al tratamiento

térmico moderado así como a los agentes reductores y al medio alcalino. Sin

embargo, es muy sensible a la luz, la oxidación, la isomerización y lapolimerización, debido a su estructura de dobles enlaces conjugados. En general,

los ésteres son más estables que las formas alcohólicas y los carotenoides son

menos estables que los retinoides, Gil (2010).

- Fuentes de alimentación

La vitamina preformada se encuentra únicamente en alimentos de origen animal,

ya sea en sitios de almacenamiento, como el hígado, o relacionada con la grasa

de la leche y los huevos; en concentraciones altas se puede encontrar en el aceite

de bacalao y de pez hipogloso. Mahan y Escott.(2001).

Los carotenoides de provitamina A se encuentran en verduras oscuras, o de hojas

amarillas naranja y en frutas, los colores más intensos se relacionan con mayores

concentraciones de carotenoides.


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En el mundo la mayor pare de vitamina A alimentaria la aportan carotenoides. Las

zanahorias, sopas de verduras, vegetales de hojas verdes y mixtas, espinaca,

ensalada verde, jugo de naranja, camote, estofado de res y el melón constituyenlas 10 fuentes máximas de provitamina A. Mahan y Escott (2001).

Tabla No.3 Formas de expresar el contenido de Vitamina A

Compuesto Peso molar g ER/µg µg/ER

Retinol 286.5 1 1

Acetato de retinol 328.5 0.873 1.15Palmitato de retinol 524.8 0.546 1.83

Fuente: Bonifaz (2004)

1.2.14 Guayaba

De acuerdo a Geilfus (1994), su nombre científico es Psidium guajava, de la

familia de las Mirtáceas. La guayaba es originaria de los trópicos americanos,

donde es muy común encontrarla cultivada o en forma silvestre; se ha difundido a

todos los países tropicales y subtropicales, donde es uno de los frutos más

comunes; existen plantaciones comerciales en India, Brasil, Florida, Sudáfrica y

California, entre otros.

El árbol de este fruto es pequeño, de 8 a 9 m de alto como máximo, su tronco

crece de forma irregular con corteza lisa, color marrón que se desprende en

placas. Las hojas son alargadas de 8-18 cm de largo, con nervaduras

pronunciadas.

La flor es blanca, de 2.5 cm de ancho; el fruto redondo, alargado o en forma de

pera; mide entre 2.5-10 cm de largo, es amarillo-verde cuando madura. La pulpa

firme, generalmente de color amarillo, encierra una masa jugosa, amarilla o rosada

con numerosas semillas, según Geilfus (1994).


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Según indica Geilfus (1994), la guayaba se utiliza comercialmente en forma de

jaleas, mermeladas, dulces y demás conservas. La pulpa adquiere a veces un

color rojo al cocinarse. También se preparan bebidas enlatadas, sorbetes, heladoso tartas. La madera de su árbol es adecuada para herramientas, además de ser

utilizada como leña y en preparación para carbón. Las hojas tienen propiedades

medicinales en particular contra la diarrea y la gastroenteritis.

Geilfus (1994), menciona que la guayaba es una de las frutas tropicales más

importantes en la nutrición; su contenido en vitamina C varía entre 23mg/100g y

500mg/100g, las variedades comunes contienen en promedio 2 a 5 veces másvitamina C que la naranja. También es rica en calcio, fósforo, hierro, vitamina A y

niacina; contiene entre 9 y 29% de carbohidratos según las variedades.

Las variedades silvestres reproducidas por semillas tienen generalmente frutos

pequeños, ácidos, y son los más apreciados para mermeladas, por su alto

contenido en pectina. Existen numerosas variedades mejoradas, reproducidas por

acodo o injerto. Se agrupan a menudo en guayabas rosadas y guayabas blancas.

La guayaba se adapta a una gran variedad de climas, desde tropical húmedo

hasta mediterráneo. Necesita entre 1000 y 4500 mm de lluvia anual para un

crecimiento normal; resiste hasta 6 meses de sequía.

Un clima húmedo todo el año favorece las enfermedades y reduce la producción,

es preferible el clima húmedo con estación seca, según Geilfus (1994). Se puede

encontrar hasta cerca de 2000 metros sobre el nivel del mar, pero la produccióncomercial se limita a 1000 metros.

Se adapta a toda clase de suelos, desde arcilloso y compacto hasta arenoso;

prefiere los suelos ligeramente ácidos. Los suelos calizos no convienen. Gracias a

su sistema de raíces profundas se desarrolla bien en suelos pobres, soporta

sequías prolongadas y resiste inundaciones periódicas.


46/123

Se propaga por semilla

año. O bien por acodo

reproducir variedades mmás, y se retira un ani

proceso de germinación

Los árboles de semilla e

3 años. Las variedades

árbol (60 a 500 unidade

inferior. Hay una o dosGeilfus (1994).

Figura No.5 Variedades

34

, las cuales conservan su poder germi

s, el cual es el método más fácil y

ejoradas, donde se escogen ramas de 1llo de corteza de 2.5cm de ancho, y l

adecuado. Geilfus (1994).

mpiezan a producir en 2 ó 3 años, los ac

mejoradas pueden producir de 20 a 60

), mientras los árboles de semilla llegan

cosechas al año dependiendo del clima

mejoradas de la guayaba

Fuente: Geilfus (1994)

nativo durante un

ás utilizado para

cm de diámetro oego se sigue un

odos o injertos en

kilos de fruta por

a una producción

, según menciona


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1.2.15 Guayaba Fres

Le corresponde el nomblas Mirtáceas, conocida

Peruana. Es originaria

llevaron a China, lueg

“Guayaba china”. Se cul

y Centroamérica, según

Además Geilfus (1994)

arbusto, el cual puede ll25 pies de alto. Posee h

medir 3cm de diámetro,

La Guayaba Fresa es

guayaba común. Se ad

sobre el nivel del mar,

suelos superficiales, y cr

Figura No.6 Guayaba Fr

35

a

re científico Psidium Cattleianum, pertenbajo otros nombres como: Guayaba ja

de Uruguay y Brasil, se cree que lo

emigró a Europa, donde fue otorga

tiva en el Mediterráneo, Hawaii, Florida,

Geilfus (1994).

, menciona que la guayaba fresa cr

gar a ser decorativo en los jardines de ojas brillosas y verde oscuro, generalme

e color rojo o incluso amarillas.

una especie subtropical, más resiste

pta bien a las zonas montañosas a pa

se cultiva de preferencia en clima sec

ece mejor en suelos arcillosos.

esa

Fuente: Propia (2014)

ece a la familia deponesa, Guayaba

s portugueses la

o el nombre de

California, México

ce en forma de

ido a su altura dente el fruto llega a

te al frío que la

tir de 700 metros

, no se adapta a


48/123

36

Se determinaron 204 compuestos en el concentrado del aroma de la guayaba

fresa, en mayor cantidad: etanol, alfa-pineno, (Z)-3-hexenol, (E)-beta-cariofileno y

ácido hexadecanóico. Investigaciones han determinado que el extracto de la hojacontiene metabolitos secundarios que tienen propiedades antimicrobianas.

En un estudio con el extracto de la hoja se comprobó al aplicar el extracto en

concentración elevada, que el Streptococcus mutans que creció en biofilm ya no

estaban con vida, según Lim (2012).

La madera es compacta, pesada, durable y resistente. Se utiliza para trabajos detorno, mangos de herramientas, carbón y leña. El árbol es indispensable para la

siembra mixta en la reforestación de las zonas recuperadas y protegidas en Brasil

de acuerdo a Lim (2012).

Figura No.7 Diagrama de posibles transformaciones industriales de la Guayaba y

Guayaba Fresa

Fuente:FAO (2006)


49/123

37

II. Planteamiento del problema

En Guatemala luego del surgimiento de la Ley del Sistema de la Calidad en el año2005 con el apoyo del Ministerio de Economía y Salud, aunado a las exigencias

del comercio internacional, los laboratorios de ensayo vieron la necesidad de ser

acreditados bajo la Norma ISO 17025, “Requisitos Generales para la competencia

de los laboratorios de ensayo y calibración”, norma para la cual se encuentra en

proceso de acreditarse el Laboratorio CONCALIDAD. En Guatemala actualmente

hay 18 laboratorios acreditados bajo esta norma, de los cuales solamente uno

tiene una metodología de vitamina A validada para azúcar, OGA (2014).

Dentro de sus requisitos la norma solicita que los métodos utilizados sean

validados, la validación es necesaria al implementar una nueva metodología

dentro de un laboratorio de ensayo. Dependiendo de la procedencia de la

metodología así será el grado de validación. Una metodología desarrollada por el

laboratorio, deberá cumplir con una validación completa, evaluando todos los

parámetros de desempeño que el método requiera.

La Norma establece evaluar nueve parámetros de desempeño para su validación,

siendo éstos: selectividad, linealidad, límite de detección, límite de cuantificación,

precisión, exactitud, rango, robustez, e incertidumbre garantizando que los

resultados del método sean confiables. Estos podrían variar de acuerdo al grado

de validación y también de lo que la metodología requiera. Para este proceso se

pueden utilizar diferentes materiales de referencia, los cuales garantizarán que la

metodología empleada es apta para el propósito final, una vez estos materialessean confiables y de preferencia certificados. Esta investigación aportará una guía

de referencia en la elaboración de validaciones de métodos cuantitativos para

alimentos, siendo funcional para diferentes procesos, ya sea gravimétricos o

cromatográficos.


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38

Luego de validar el método, se procedió a determinar el contenido de Vitamina A

en Guayaba Fresa (Psidium Cattleianum), debido a que no existen antecedentesnutricionales en el país. Por ser un fruto poco conocido, no existen datos de

consumo y producción en el país, esta investigación es una iniciativa para la

explotación e investigación de la Guayaba Fresa.

Además, la deficiencia en vitamina A ha sido uno de los problemas de mal

nutrición en Guatemala, por lo tanto se han implementado planes de fortificación,

como la Ley General de Fortificación de Alimentos, para contrarrestar la faltavitaminas, como es el caso de la vitamina A. Dada esta necesidad de fortificar los

alimentos, es necesario también realizar análisis confiables que comprueben el

contenido final de vitamina.

Por lo tanto ¿Es válido en los nueve parámetros establecidos en el plan de

validación, el método planteado para el análisis cuantitativo de la Vitamina A

(Retinol) en alimentos? De ser válido ¿Cuál es el valor de Vitamina A presente en

la Guayaba Fresa?


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39

2.1 Objetivos

2.1.1 Objetivo General

- Validar un método analítico por Cromatografía Líquida de Alta Resolución

con detector Ultra Violeta (HPLC/UV).

2.1.2 Objetivos Específicos

- Montar un método analítico para la cuantificación de la Vitamina A (Retinol)

en alimentos.

- Determinar la validez del método analítico propuesto por medio de los

siguientes parámetros estadísticos: selectividad, linealidad, límite de

detección, límite de cuantificación, precisión, exactitud, rango, robustez e

incertidumbre.

- Determinar el contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa.

- Comparar el contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa y Blanca.

2.2 Hipótesis

2.2.1 Nula- La Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A mayor o igual que la

Guayaba Blanca.

2.2.2 Alterna

- La Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A menor que la

Guayaba Blanca.

2.3 Variables

2.3.1 Variables Independientes

- Tiempo de saponificación

- Tiempo de desgasificación

- Composición de fase móvil

- Analista

- Diluciones del estándar de referencia


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40

2.3.2 Variables Dependientes

Parámetros estadísticos para validar el método analítico:

- Selectividad- Linealidad

- Límite de detección

- Límite de cuantificación

- Precisión

- Exactitud

- Rango

- Robustez

- Incertidumbre

- Contenido de Vitamina A en el material de referencia

- Áreas de respuesta del estándar de referencia

2.4 Definición de las variables

2.4.1 Definición Conceptual

- Tiempo de saponificación: magnitud física que permite ordenar la secuenciade los sucesos, estableciendo un pasado, un presente y un futuro. Su

unidad en el Sistema Internacional es el segundo. Real Academia Española

(2014).

- Tiempo de desgasificación: magnitud física que permite ordenar la

secuencia de los sucesos, estableciendo un pasado, un presente y un

futuro. Su unidad en el Sistema Internacional es el segundo. Real Academia

Española (2014).- Composición de fase móvil: magnitud que expresa la cantidad de una

sustancia por unidad de volumen. Su unidad en el Sistema Internacional es

el mol por metro cúbico (mol/m3). Real Academia Española (2014.)

- Analista: persona calificada con capacidades técnicas para realizar análisis

del área que este especializado. Persona que hace análisis químicos o

médicos. Real Academia Española (2014).


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41

- Diluciones del estándar de referencia: acción de diluir con el fin de disminuir

la concentración de una disolución añadiendo disolvente. Real Academia

Española.

Parámetros estadísticos para validar un método analítico:

- Selectividad: la selectividad es el grado en que un método puede cuantificar

o cualificar al analito en presencia de interferentes. Guía No.1 del ISPCH

(2010).

- Precisión: grado de concordancia entre resultados obtenidos en mediciones

repetidas de un mismo objeto o de objetos similares, bajo condicionesespecificadas. Guía No.1 del ISPCH (2010).

- Exactitud: grado de concordancia entre el promedio de un número infinito

de resultados y un valor de referencia. Guía No.1 del ISPCH (2010).

- Linealidad: la linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de

un determinado intervalo, de dar una respuesta o resultados instrumentales

que sean proporcionales a la cantidad del analito que se habrá de

determinar en la muestra de laboratorio. Guía No.1 del ISPCH (2010).

- Rango: intervalo de concentraciones de analito dentro del cual se puede

considerar al método validado. EUROCHEM (2005).

- Límite de detección (LDD): “el menor contenido que puede medirse con una

certeza estadística razonable. O bien el menor contenido de analito, si está

presente, que será detectado y que puede ser identificado”. Guía

EURACHEM (2005).

- Límite de cuantificación (LDC): “el límite de cuantificación (LDC)

estrictamente es la concentración más baja del analito que puede serdeterminada con un nivel aceptable de precisión de repetibilidad y

veracidad”. EUROCHEM (2005).

- Robustez: es una medida de la capacidad de un método para mantenerse

sin cambios ante pequeñas pero deliberadas variaciones en sus

parámetros. EUROCHEM (2005).


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- Incertidumbre: parámetro que caracteriza la dispersión de los valores que

podrían ser razonablemente atribuidos al mensurando. EUROCHEM (2005).

- Contenido de Vitamina A en Material de Referencia: unidades equivalentesde Retinol presentes por gramo del material de referencia. Gil. (2010.)

- Áreas de respuesta del estándar de referencia: integración electrónica en

donde un dispositivo digitaliza la señal analógica proporcionada por el

detector, detecta el comienzo y el final de cada pico cromatográfico, integra

digitalmente el área bajo la curva y corrige automáticamente la línea base.

Conceptos fundamentales de cromatografía (2014).

2.4.2 Definición Operacional

- Tiempo de saponificación: tiempo que se llevó a cabo la reacción de

saponificación de las muestras, por medio de una solución de etanol e

hidróxido de potasio, se varió para el análisis de robustez.

- Tiempo de desgasificación: tiempo en el cual se colocaron los frascos de

fase móvil en el baño ultrasónico para permitir la extracción del oxígeno

disuelto en la solución, variando para el análisis de robustez.

- Composición de fase móvil: cantidad en mililitros de metanol, propanol, yagua para la realización de la fase móvil, la cual se varió para el análisis de

robustez.

- Analista: técnico competente que realizó las repeticiones necesarias junto

con el técnico titular para determinar la reproducibilidad del método,

variable tomada para evaluación de robustez.

Parámetros estadísticos para validar método analítico.

- Diluciones del estándar de referencia: seis diferentes diluciones que se

realizaron para determinar la linealidad del método.

- Selectividad: interferencias que puede tener el método de análisis de

Vitamina A, utilizando una muestra de referencia.

- Linealidad: capacida

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