Cap 5 Antimicrobianos 2013

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MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA - Tomo II: Microbiología Ambiental IIManacorda A. M., Álvarez A. S., Pezzullo S. D. & Cuadros D. P. Año 2014

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Capítulo 5

ANTIMICROBIANOS

Objetivos

Verificar el grado de sensibilidad o la resistencia de los microorganismos frente a distintosagentes antimicrobianos.

Reflexionar acerca de los riesgos que implica la posible dispersión de la resistencia a losantimicrobianos en el ambiente.

BunquerIntroducción

Se conoce como antimicrobiano a toda sustancia química que impide el desarrollo de unmicroorganismo o que provoca su muerte. Los agentes que destruyen o matan las bacterias sedenominan bactericidas, mientras que los agentes que inhiben el crecimiento bacteriano se denominanbacteriostáticos.

Los antimicrobianos pueden ser de tres tipos:1. Desinfectantes: son usados para matar microorganismos sobre superficies de objetos o

sistemas inanimados, son demasiado tóxicas para aplicarla directamente a los tejidos.Reducen el número de gérmenes viables, pero no eliminan a los esporulados.

2. Antisépticos: son aplicables a la piel o mucosas de humanos y animales, reducen y controlan lapresencia de gérmenes potencialmente patógenos.

3. Antimicrobianos de uso clínico-terapéutico: son sustancias capaces de controlar la presenciade microorganismos patógenos que han invadido tejidos u organos profundos en humanos yanimales. Se los denomina también como antibiótico, dentro de este grupo se puedenconsiderar dos categorías:

a. Antibióticos: antimicrobianos de origen natural.b. Quimioterápicos: antimicrobianos de origen sintético.

Los antimicrobianos, a diferencia de los desinfectantes y antisépticos, poseen toxicidad selectiva. Estoindica que no afectan a las células del hospedador, sino solo a las células bacterianas que se deseaneliminar, debido a las diferencias existentes entre ellas.

Los antimicrobianos se pueden clasificar de acuerdo a sus mecanismos de acción, ellos son:- Inhibición de la síntesis de la pared celular- Inhibición de la síntesis proteica- Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos- Inhibición de las vías metabólicas- Alteración de la función de la membrana bacteriana

Según el número de especies bacterianas sobre las cuales tiene efecto el antimicrobiano, se clasificanen antibiótico de amplio espectro o de espectro limitado. Los antimicrobianos de amplio espectro soncapaces de actuar sobre una gran cantidad de bacterias gram positivas y gram negativas, como las

cefalosporinas, aminoglucósidos y quinolonas. El grupo de las tetraciclinas (inhibidores de la síntesisproteica) tienen la capacidad de actuar sobre bacterias gram positivas, gram negativas, las rickettsias,clamidias, micoplasmas y espiroquetas.

En cambio, los antimicrobianos de espectro limitado actúan sólo sobre bacterias gram positivas o gramnegativas, sobre cocos o bacilos, sobre bacterias aerobias o anaerobias, etc. Por ejemplo, la penicilinaes activa frente a Streptococcus spp., Neisseria spp., Clostrodium spp. y cocos anaerobios. Elagregado de un grupo amino a la cadena lateral de la penicilina, dio lugar a la ampicilina y permitióextender el espectro de acción a los bacilos gram negativos.


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Muller Hinton caldo

Infusión de carne 300 mlPeptona ácida de caseína 17,5 gr

Almidón 1,5 gr Agua destilada c.s.p 1000 ml

pH final: 7,3 ± 0,2

Muller Hinton agar

Infusión de carne 300 mlPeptona ácida de caseína 17,5 gr

Almidón 1,5 gr Agar 15 gr Agua destilada c.s.p 1000 mlpH final: 7,3 ± 0,1

El procedimiento a seguir es el siguiente (ver fig. 5.1):

Preparar una serie de tubos con caldo Muller Hinton con los cuales se prepararán las sucesivas

diluciones, con concentraciones crecientes del antibiótico a evaluar. El volumen final requerido encada tubo es de 1 ml.

El antibiótico de referencia pueden ser obtenido comercialmente. Se debe conocer la potenciavalorada (en porcentaje o µg/mg) y la fecha de vencimiento. El almacenamiento de la droga debehacerse según las recomendaciones del laboratorio productor.

Preparar el inóculo. La preparación de la suspensión bacteriana es crítica porque una variación ensu densidad puede alterar el punto final de la prueba. El inóculo debe contener 5 x 10 5 UFC/ml,equivalente al patrón 0,5 de la escala Mc Farland.

Usar un tubo que contenga la suspensión del microorganismo a probar, en caldo sinantimicrobiano como control de inóculo.

Dentro de los 15 minutos de preparado el inóculo adicionar a cada tubo de dilución de antibiótico yal tubo control del inóculo, 1 ml de la suspensión bacteriana por debajo del menisco, para noproducir salpicaduras. Mezclar suavemente.

Se incuba a 35 ºC durante 16-20 horas. Se controla la aparición de turbidez, la cual es producto del desarrollo

Interpretación de los resultados:La CIM es la menor concentración de antibiótico que inhibe completamente el desarrollo bacteriano,detectado por la falta de turbidez del caldo. Los tubos con menor concentración de antibiótico serán losque permitirán el desarrollo de los microorganismos, y a medida que la concentración aumente se irádeteniendo ese crecimiento. Comenzando a observar desde la menor dilución de antibiótico, el primertubo que no presente desarrollo microbiano será considerado el que tiene la menor concentración deantibiótico que ha producido la inhibición del crecimiento. A partir de determinar la concentración queinhibe el desarrollo de la cepa estudiada, se puede continuar el proceso para determinar laconcentración de produce la muerte de los microorganismos.

Concentración Letal Mínima (CLM)

La Concentración Letal Mínima (CLM) que es aquella que no sólo inhibe el desarrollo sino que tiene unefecto letal sobre los microorganismos. Para ello se emplean los tubos que no presentaron crecimientovisible en la determinación de la CIM y se los subcultiva en placas con agar Muller Hinton sinantibiótico, incubando a 35 °C durante 16-20 hs. La menor concentración de la droga que no originecrecimiento bacteriano en el subcultivo se interpreta como CLM (ver Fig. 1)


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Fig. 5.1: Evaluación de la CIM y CLM de un antimicrobiano mediante el método de dilución

2. Determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos: Método de difusión con disco.

Es una prueba de cuantitativa para evaluar la sensibilidad de una cepa bacteriana frente a la acción deuno o varios antimicrobianos.

El método se basa en la difusión del antimicrobiano incorporado en una cantidad preestablecida en unsoporte, el cual se ubica sobre un medio sólido. En este medio sólido (agar) se desarrolla elmicroorganismo a evaluar. El soporte donde se coloca el antimicrobiano suele ser un disco de papel.Estos soportes deben ser inertes y permitir vehiculizar el antimicrobiano sin producir alteraciones en elmismo. Estos discos se pueden preparar o adquirir comercialmente.

El disco aplicado sobre el medio de cultivo sólido genera un gradiente de concentración decreciente amedida que se aleja del centro. La interacción del antimicrobiano con el crecimiento delmicroorganismo puede dar como resultado zonas de inhibición. La sensibilidad del microorganismoestará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del disco.

El tamaño de la zona de inhibición (halo) dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y lacarga de sustancia en el disco, sino también del espesor de la capa de agar, su pH y composición, dela capacidad de difusión del antimicrobiano en ese medio, de la temperatura, del tamaño y fase decrecimiento del inóculo. Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán sercontrolados cuidadosamente.

El procedimiento a seguir es el siguiente (ver fig. 5.2):


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Preparar las placas de Petri con el medio de cultivo. Distribuir 30 ml de agar Muller Hinton enplacas de 100 mm de diámetro, el objetivo es alcanzar una altura del medio de cultivo de 4 mm.Una inadecuada altura puede producir variaciones significativas en el diámetro de los halos deinhibición, provocando errores en la interpretación de los resultados. Las placas puedenconservarse por un período de hasta una semana, teniendo el cuidado de mantenerlas

refrigeradas (2 a 8 °C) y selladas para evitar la deshidratación. Preparar el inóculo bacteriano. A partir del cultivo puro preparar una suspensión en caldo MullerHinton con una turbidez equivalente al patrón 0,5 de la escala Mc Farland. La densidad del inóculoes uno de los factores más importantes en la realización de la técnica.

Sembrar las placas que contienen el agar Muller Hinton, dentro de los 15 minutos de lapreparación de inóculo. La transferencia se realiza con hisopo estéril, el mismo se sumerge en elinóculo y luego se lo presiona contra las paredes del tubo para eliminar el exceso de líquido. Sedistribuye el inóculo de manera homogénea, hisopando la superficie en tres direcciones diferentes.

Se deja reposar la placa sembrada entre 3 - 5 minutos de modo que se absorba el exceso dehumedad de la superficie del agar.

Aplicar los discos de antimicrobianos sobre la superficie de las placas inoculadas con una pinzaestéril, aplicándole una leve presión. Los discos deben ser retirados anteriormente del refrigeradorpara que en el momento de ser aplicado tenga temperatura ambiente. En cada placa de 100 mm

de diámetro no deben aplicarse más de 6 discos, los cuales deben estar ubicados a una distanciade, por lo menos, 24 mm entre los centros de cada uno de ellos. Incubar las placas, invertidas, a una temperatura de 35 ± 2 °C, durante 18-20 hs. Observar y medir los diámetros de inhibición (mm) y consultar los puntos de corte para determinar

la sensibilidad (ver tabla 5.1).

Interpretación de los resultados:Se deben observar los diámetros de los halos de inhibición (ver fig 5.3). La lectura se realiza con reglay debe ser sobre la base de la placa, para ello debe estar iluminada con luz reflejada. Las zonas deinhibición deben ser circulares y no observarse colonias aisladas, caso contrario deberá repetirse elensayo.

A partir de esta lectura, de acuerdo a la medida de los diámetros de los halos se podrá categorizar almicroorganismo como sensible, con sensibilidad intermedia o resistente al antimicrobiano. Para ello sedeberán consultar las Tablas CLSI “Puntos de corte para la interpretación de las pruebas desensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión” específica para el microorganismo que seesté evaluando.Las categorías se asignan de acuerdo a la respuesta de la cepa bacteriana frente a cadaantimicrobiano, y se detallan a continuación:

Sensible: el microorganismo inhibe su desarrollo por la presencia del antimicrobiano en la dosisaplicada en el disco. Esto implica que una infección debida a este microorganismo puede serapropiadamente tratada con la dosis del antimicrobiano recomendada para esemicroorganismo.

Resistente: el microorganismo continúa desarrollándose en presencia del antimicrobiano en ladosis aplicada en el disco. Por lo tanto, este microorganismo no es inhibido por talconcentración de antimicrobiano, pudiendo sugerir un mecanismo de resistencia específico,

como por ejemplo la producción de β-lactamasas.

Sensibilidad intermedia: estos microorganismos podrían ser inhibidos por concentracionesmayores, mientras que las dosis puedan elevarse.


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Fig. 5.2: Esquema para realizar la técnica de antibiograma por el método de difusión en disco.

Fig. 5.3: Antibiograma de una cepa perteneciente a la familia Enterobacteriaceae.


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Tabla 5.1: Puntos de corte para la interpretación de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianospor el método de difusión correspondiente a Enterobacteriaceae (adaptado de CLSI Table 2 A

Enterobacteriaceae M2-Disk Diffusion January 2006)

Antimicrobiano Disco (carga µg)Diámetro en mm

Resistente Intermedio Sensible

Penicilinas (inhibidor de la síntesis de la pared celular) Ampicilina 10 ≤ 13 14 -16 ≥ 17

Piperacilina 100 ≤ 17 18 - 20 ≥ 21

Carbenicilina 100 ≤ 19 20 - 22 ≥ 23

Combinación β-lactámico/ inhibidor de β-lactamasa (inhibidor de la síntesis de la pared celular)

Amoxicilina/clavulánico 20/10 ≤ 13 14 - 17 ≥ 18

Ampicilina/sulbactama 10/10 ≤ 11 12 - 14 ≥ 15

Piperacilina/taxobactama 100/10 ≤ 17 18 - 20 ≥ 21

Cefalosporinas de 1°, 2°, 3° y 4° generación (inhibidor de la síntesis de la pared celular)

Cefazolina 30 ≤ 14 15 - 17 ≥ 18

Cefalotina 30 ≤ 14 15 - 17 ≥ 18

Cefepima 30 ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 Cefoxitina 30 ≤ 14 15 - 17 ≥ 18

Cefotaxima 30 ≤ 14 15 - 22 ≥ 23

Ceptacidima 30 ≤ 14 15 - 17 ≥ 18

Carbapenemes (inhibidor de la síntesis de la pared celular)

Ertapenem 10 ≤ 15 16 - 18 ≥ 19

Imipenem 10 ≤ 13 14 - 15 ≥ 16

Meropenem 10 ≤ 13 14 - 15 ≥ 16

Monobactames (inhibidor de la síntesis de la pared celular)

Aztreonam 30 ≤ 15 16 - 21 ≥ 22

Aminoglucósidos (inhibidor de la síntesis proteica)

Gentamicina 10 ≤ 12 13 - 14 ≥ 15 Amicacina 30 ≤ 14 15 - 16 ≥ 17

Estreptomicina 10 ≤ 11 12 - 14 ≥ 15

Tetraciclinas (inhibidor de la síntesis proteica)

Tetraciclina 30 ≤ 14 15 - 18 ≥ 19

Anfenicoles (inhibidor de la síntesis proteica)

Cloranfenicol 30 ≤ 12 13 - 17 ≥ 18

Quinolonas (inhibidor de la síntesis de ácidos nucleicos)

Ácido nalidíxico 30 ≤ 13 14 - 18 ≥ 19

Inhibidores de la vía del folato (inhibidor de vías metabólicas)

Trimetoprima- sulfametoxazol 1,25/23,75 ≤ 10 11 - 15 ≥ 16

Sulfonamidas 250 ≤ 12 13 - 16 ≥ 17

Trimetoprima 5 ≤ 10 11 - 15 ≥ 16

Bibliografía


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