Facultad de Ciencias Biolgicas Departamento de Ciencias Biolgicas BIO156 - 2010

Caries y Enfermedad periodontal

Clase 05 Enfermedad Periodontal

Dr. Mauricio Bittner O.

w.bittner@uandresbello.edu

Microbiologa de la enfermedad periodontalEnca Sana Gingivitis

Enfermedades de la enca. Gingivitis

PeriodontitisGingivitis

Inducida por la placa

Dependiente slo de la placa Modificada por factores sistmicos Modificada por medicamentos Modificada por la desnutricin De origen bacteriano especfico De origen viral (herpes) De origen fngico (eritema lineal) De origen gentico (fibromatosis) Manifestaciones de enf. sistmicas Lesiones traumticas

NO inducida por la placa

Desarrollo de la lesin periodontalLesin inicial: Dentro de los primeros 4 das de acumulacin de placa. Inflamacin aguda Las clulas inflamatorias ocupan entre un 5% y 10% del tejido conjuntivo gingival Lesin temprana: Despus de 7das de acumulacin de placa. Predominan linfocitos y macrfagos. Las clulas inflamatorias ocupan entre un 15% del tejido conjuntivo gingival. Destruccin temprana de colgeno. Lesin establecida: Tiempo variable. Predominan clulas plasmticas. Formacin del saco periodontal.

Enfermedad periodontalSe clasifican de acuerdo a: El grado de progresin de la enfermedad (crnica, agresiva) La distribucin de la lesin (localizada, generalizada) Grupo atareo (juvenil, adulta) En asociacin con desrdenes sistmicos o del desarrollo

Enfermedad periodontalSano Gingivitis

Modificaciones a los postulados de Koch

?

Periodontitis

Socransky postul las siguientes modificaciones para determinar los patgenos periodontales:i) La mayora de las bacterias blanco deben estar asociados a la periodontitis. ii) La eliminacin de las bacterias blanco resulta en la detencin de la progresin de la enfermedad. iii) Debe ser posible determinar la respuesta del hospedero frente a las bacterias blanco. iv) Si es posible, la patogenicidad debera ser demostrada en un modelo animal adecuado. v) Debera ser determinado un nico mecanismo de patogenicidad.

Conformacin bacteriana subgingivalLa placa supragingival contiene muchos compuestos bioactivos (cidos orgnicos, compuestos asufrados, enzimas proteolticas PAMPs, etc. Estos compuestos difunden hacia la superficie del epitelio gingival aumentando el flujo de fluido crevicular gingival y fluido inflamatorio del tejido periodontal. Este nuevo suministro de nutrientes modifica el ecosistema adyacente a la enca inflamada. Las bacterias proteolticas de la placa se expanden, lo que acelera el dao tisular

Conformacin bacteriana subgingival

Conformacin bacteriana subgingivalExisten ms de 500 especies capaces de colonizar la placa subgingival Ribotipificacin

Conformacin bacteriana subgingivalLa Placa Subgingival de puede dividir en tres:i) Adherida al diente: Predominan Streptococci orales y Actinomyces spp., pero existen mayor proporcin de anaerobios estrictos (Veillonella, Peptostreptococcus, Eubacterium y Fusobacterium). Asociada a la caries radicular, ya que se relaciona directamente con la placa supragingival. Zona donde existe una mayor mineralizacin de la placa: por precipitacin de sales a pH alcalino. Presencia de grandes cantidades de bacterias con la capacidad de cristalizacin intracelular (Actinomyces spp., Corynebacterium matruchotii)

Se han descrito ms de 100 especies presentes en la microflora subgingival que no son cultivables Se estima que existen unas 300 especies desconocidas

Actinomyces spp.

C. matruchotii

Conformacin bacteriana subgingivalLa Placa Subgingival de puede dividir en tres:ii) Asociada al epitelio: No es bien conocida su composicin, pero estara constituida por especies con la capacidad de unirse a superficies blandas. Esta adhesin bacteria/clulas se debe principalmente a la presencia de fimbrias especficas. Principalmente a Gram negativos y bacilos mviles. Prevotella nigrescens / Prevotella intermedia. Porphyromonas gingivalis, Capnocytophaga spp., Fusobacterium spp., Aggragatibacter actinomycetemcomitans, etc. Estn asociados a la invasin del tejido conectivo.

Conformacin bacteriana subgingivalLa Placa Subgingival de puede dividir en tres:

iii) No adherida o flotante: Se dispone entre la placa adherida al diente y la adherida al epitelio. No necesitan adherirse, slo establecen uniones dbiles. Microflora similar a la de la placa adherida al epitelio. Compuesta principalmente por Gram negativos y bacilos mviles. Porphyromonas, Prevotella spp., Fusobacterium, Selenomonas, Aggregatibacter, Eikenella y Treponema denticola (hacia el fondo donde al Eh es ms negativo). Inducen y aceleran el proceso inflamatorio.

Fusobacterium

Capnocytophaga

Progresin de la enfermedadi) Inicialmente la enfermedad periodontal se manejaba eliminando la placa bacteriana. ii) Posteriormente se determin que microorganismos como bacterias eran responsables de la patologa. iii) En un comienzo la estrategia para determinar el o los agentes etiolgicos consista en comparar la composicin microbiana de la placa subgingival entre sitios sanos, gingivitis y periodontitis. iv) En la actualidad, con el desarrollo de la biologa molecular, las metodologas de diagnstico, tratamiento y estimacin de riesgo futuro se basan en el seguimiento y cuantificacin de factores de virulencia.Hoy en da es posible determinar el nmero de ciertos patgenos periodontales, as como las propiedades de toxinas y enzimas destructoras de tejidos.

Progresin de la enfermedadEnzimas proteolticas extracelulares: i) Pueden degradar protenas de la matriz extracelular. ii) Pueden degradar inhibidores de proteinasas de la matriz del hospedero. iii) Pueden activar metaloproteinasas de la matriz del hospedero. iv) Pueden inducir citoquinas pro-inflamatorias involucradas en la destruccin tisular y reabsorcin sea. v) Pueden alterar las defensas del hospedero: a) degradando receptores celulares b) degradando protenas del complemento c) degradando anticuerpos y ciertas citoquinas

Progresin de la enfermedad

Identificacin de Ag bacterianos y eptoposComo los antgenos son usualmente protenas asociadas a las superficies bacterianas una de las estrategias para identificarlas es caracterizar extractos de la superficies o protenas secretadas de un determinado patgeno

Utilizacin de:

a) genmica: secuenciacin de genomas completos y estudios de la regulacin gentica de potenciales factores de virulencia.

Lipopolisacrido Lpidos de ME Fimbrias Flagelo - Cpsulas - etc.

Treponema denticola (2.843.201 pb)

Identificacin de Ag bacterianos y eptoposb) protemica: anlisis de protenas de superficie o secretadas mediante electroforesis uni o bidimensionales. Tamao Utilizacin de:

Complejos microbianos en la Placa SubgingivalActinomyces spp. V. parvula A. odontolyticus

S. mitis S. sanguis S. oralis Streptococcus spp. S. gordonii S. intermedius

C. gracilis

S. castellatus E. corrodens C. gingivalis C. sputigena C. ochracea C. consisus A. actino. a

C. rectus P. intermedia P. nigrescens M. micros F. nuc. nucleatum F. nuc. polymorphum F. nuc. vincentii F. periodonticum E. nodatum S. noxia

P. gingivalis T. forsythia T. denticola

C. showae

Punto isoelctrico

A. actinomycetemcomitans b

Complejos microbianos en la Placa Subgingival

Segn estudios epidemiolgicos y en modelos animales1.- Aggregatibacter actinomycetemcomitans 2.- Porphyromonas gingivalis 3.- Tannerella forsythia (ex Bacteroides forsythus) 4.- Treponema denticolaGram negativo Capnoflico Bacterias Gram Negativas anaerobias estrictas

Prevotella intermedia/nigrescens, Eikenella corrodens, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Fusobacterium nucleatum, Micromonas micros y Streptococcus intermedius

Microbiologa de la Periodontitis Agresiva

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)

Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Cocobacilo Gram negativo, No formador de esporas, Inmvil, Anaerobio facultativo Microaeroflico y Capnoflico

Lipopolisacrido (LPS), Leucotoxina, Cdt, Fimbrias

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores de adherencia: Protena Aaei) Adherencia a clulas epiteliales

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores de adherencia, invasin y evasin del sistema inmune: Protena ApiAi) Adherencia a clulas epiteliales ii) Invasin de clulas epiteliales iii) Resistencia al suero*

Protena EmaAi) Adherencia a colgeno

Polisacrido PGA (NAG)i) Autoagregacin

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores de adherencia e invasin: Fimbria flp-1 y operon tadi) Adherencia a clulas epiteliales ii) Adherencia a la pelcula adquirida y superficies abiticas iii) Formacin de Biopelculas iv) Invasin de clulas epiteliales mediante receptores especficos

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores de adherencia y co-agregacin:

Operon pilABCD: Pili Tipo IV y competencia PilA unin a DNA

Generan un alto ttulo de anticuerpos. Adems anticuerpos especficos inhiben adhesin>>>Vacuna?!

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores que modulan el sistema inmune: Leucotoxina (LtxA)Protena de 116 KDa anclada a la superficie del membrana externa de la bacteria y secretada (LFA-1: CD11a CD18)

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores que modulan el sistema inmune: Lipopolisacrido (LPS)Serotipificacin en base al Antgeno O: Mediante Anticuerpos y PCR: a f. b y c ms prevalentes en Chile. activacin de la va alternativa del complemento.

Destruccin de linfocitos va apoptosis

Destruccin de linfocitos va formacin de poros y necrosis

Desgranulacin de neutrfilos Liberacin de MMP8

Desregulacin de la respuesta inmune!!!

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores que modulan el sistema inmune: Lipopolisacrido (LPS)

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores que modulan el sistema inmune: Lipopolisacrido (LPS)

Lpido A: activacin de la va clsica del complemento.

Citoquinas: IL-8 IL-1 TNF (Factor de necrosis tumoral ) PGE2 (Prostaglandina E2)

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores que modulan el sistema inmune: Proteasas

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)Factores que modulan el sistema inmune:

Aa estimula TH1

A. actinomycetemcomitans posee: i) serina proteasas ii) proteasas que degradan IgG (todas), IgA e IgM Desregulacin de la respuesta inmune Degradacin de fibringeno y colgeno

RANKL

Caries y Enfermedad periodontal

Enfermedad periodontalSano Gingivitis

?

Periodontitis

Microbiologa de la periodontitis crnica

Treponema denticola

Espiroqueta Gram negativa, Asacaroltico, Mvil, Anaerobio estricto

Lipopolisacrido, lpidos Msp, Enzimas proteolticas extracelulares, Flagelo

Treponema denticolaFactores de adherencia e invasin: Protena Msp (major surface protein)i) (53 KDa): se une a fibringeno, fibronectina y laminina unin de la bacteria a clulas del hospedero. Promueve la destruccin de clulas epiteliales (mecanismo desconocido), formacin de poros? ii) (64 KDa): se une a complejos de quimiotripsinas y a fibroblastos gingivales. a) Poseen efecto citotxico sobre: Fibroblastos gingivales Linfocitos Clulas epiteliales Eritrocitos

Treponema denticolaFactores de adherencia e invasin: FlageloPermite un movimiento tipo atornillador. Esto le permite moverse en microambientes muy viscosos (FCG), penetrar el epitelio gingival y tejido conectivo.

b) Aumentan la respuesta inflamatoria: Promueven la desgranulacin de PMN (colagenasas, gelatinasas) y metaloproteinasas de la matriz (MMP-8 y MMP-9)

El flagelo est compuesto por tres filamentos: FlaA (38 KDa) FlaB1 (35KDa) FlaB2 (35 KDa) FlaB3 (34 KDa)

Treponema denticolaFactores que modulan el sistema inmune: Enzimas proteolticas extracelulares. Trepolisina o Dentilisinai) hidroliza: fibringeno, transferrina, gelatina, colgeno tipo IV, IgG e IgA. ii) degrada: bradiquinina, sustancia P y angiotensinas I y II. iii) degrada: inhibidores de proteasas como 1-antitripsina, antitrombina III, etc. iv) induce: apoptosis en clulas epiteliales.La habilidad de degradar protenas de la matriz, protenas regulatorias de proteasas y de la respuesta inmune contribuye a la destruccin incontrolada del tejido periodontal y progresin de la enfermedad"

Treponema denticolaFactores que modulan el sistema inmune: Enzimas proteolticas extracelulares. CistalisinaHidroliza protenas y libera: i) piruvato: utilizado como fuente de energa ii) NH3: alcaliniza el medio. iii) H2S: es txico para glbulos rojos y otras clulas presente en el epitelio (mal olor).

La cistalisina hidroliza puentes dislfuro, por lo tanto, inactiva inmunoglobulinas, citoquinas, etc, desregulando la respuesta inmune. "

Tannerella forsythia ex Bacteroides forsythus

Tannerella forsythiaFactores de virulencia:Se sabe muy poco de sus factores de virulencia porque es muy difcil de cultivar en el laboratorio. LPS Parecido al de P. gingivalis (reacciones cruzadas en ensayos de ELISA) Enzimas proteolticas extracelulares Enzimas tipo tripsina: Serina proteasas (70 KDa y (81 KDa) Cistena proteasa hemoltica PrtH (48KDa)

Bacilo fusiforme Gram negativo, Sacaroltico, Anaerobio estricto, Requiere cido N-acetilmurmico

Lipopolisacrido, Enzimas proteolticas extracelulares,

Otros antgenos

Protena tipo GroEL BspA (protena de superficie). Ttulo elevado de anticuerpos en pacientes con periodontitis crnica. Se unira a CD14 y TLR-4?! y a fibringeno.

Porphyromonas gingivalis (PG)

Porphyromonas gingivalis (PG)

Cocobacilo Gram negativo, No mvil, Asacaroltico Anaerobio obligado

Cpsula, Lipopolisacrido, Fimbrias, Enzimas proteolticas extracelulares, Hemaglutininas.

Porphyromonas gingivalis (PG)Factores de adherencia, invasin y evasin del sistema inmune: Cpsula: Antgeno capsular KSerotipificacin: K1, K2, K3, K4, K5, K6 y K(-) Cpsula de PG: i) aumenta la invasividad ii) inhibe la adherencia de los fibroblastos del ligamento periodontal al diente iii) resistencia a la fagocitosis iv) disminuye la activacin de la va alterna del complemento v) aumenta la hidrofobicidad de la bacteria

Porphyromonas gingivalis (PG)Factores de adherencia e invasin Fimbriasi) Son altamente antignicas tanto en pacientes con periodontitis agresiva como con periodontitis crnica. ii) Altos niveles sricos de IgA e IgG (isotipo IgG3). iii) Esta compuesta por fibrillas de una protena de 43 KDa codificada por el gen fimA iv) De acuerdo a su antigenicidad son clasificadas en serotipos: Tipo I, II, III, IV y V Tipo I: adhesin e invasin de clulas epiteliales orales y fibroblastos

La invasin estimulara la expresin de receptores ICAM-1, VCAM-1, Selectinas P y E. Reclutamiento de linfocitos aumentando la inflamacin.La inmunizacin con pptidos fimbriales protege de la prdida de hueso en un modelo murino.

Porphyromonas gingivalis (PG)Factores que modulan el sistema inmune: Lipopolisacrido (LPS) Es el antgeno de superficie ms importante de PG. (IgG2)

Porphyromonas gingivalis (PG)Factores que modulan el sistema inmune: Lipopolisacrido (LPS)Las modificaciones del LPS de PG son importantes en la respuesta del hospedero: IL-1 IL-6 Fibroblastos gingivales IL-8 IL-13 IL-5 IL-10 Linfocitos Th2

Antgeno O: tetrasacridos fosforilados i) Rha-P (1-3) Gal-P (1-3) Glc-P (1-4) GlcNAc-P ii) Glc-P (1-4) Rha-P (1-3) GalNAc-P (1-3) Gal-P

El LPS de P. gingivalis induce la reabsorcin sea estimulando clulas mieloides (macrfagos) y no-mieloides (fibroblastos). Adems bloquea la inmunidad adquirida estimulando clulas de la lnea linfoide (Th2)

Porphyromonas gingivalis (PG)Factores que modulan el sistema inmune: Enzimas proteolticas extracelularesPG posee una gran cantidad de proteasas extracelulares, pero las ms importantes son las denominadas gingipain (gingipainas), que poseen el 80 % del total de la actividad proteoltica y el 100% de la actividad proteoltica tipo tripsina de esta bacteria. Cistena Proteasas Gingipain R (arg-gingipain) Gingipain K (lys-gingipain) Gingipain R rgpA rgpB Gingipain K

Porphyromonas gingivalis (PG)Factores que modulan el sistema inmune: Gingipain: (Modificaciones post-traduccionales)

kgp

Porphyromonas gingivalis (PG)Factores que modulan el sistema inmune: Gingipain: (Modificaciones post-traduccionales)

Porphyromonas gingivalis (PG)Efecto sobre los componentes del complemento (reclutamiento de PMN, evasin de la opsonizacin Activacin de Metaloproteinasas y fagocitosis) Degradacin de los receptores de de la Matriz, MMP (aumentando PMN (evasin de la actividad actividad proteoltica del antibacteriana y fagocitosis) hospedero) Degradacin de citoquinas (desregulacin de la reaccin inflamatoria local) Activacin de la va de la Calicrena/Quinina (generacin de fluido crevicular gingival)

Gingipains

Estimulacin de la sntesis de MMP por los fibroblastos gingivales (aumento local de la actividad proteoltica)

HA: dominio hemaglutinina /adhesina. Posee el mayor poder antignico

Degradacin de pptidos antibacterianos (evasin de la Des-regulacin de la coagulacin actividad antibacteriana) y las vas fibrinolticas (liberacin de trombina, reabsorcin sea y tendencia al sangramiento)

Prevotella intermedia/nigrescens

Fusobacterium nucleatumFusobacterium nucleatum: subsp. nucleatum subsp. vicentii subsp. polymorphumF. nucleatum mejora la unin de P. gingivalis en clulas del hospedero. Agrava la prdida de hueso alveolar e induce una mayor respuesta inflamatoria en comparacin con la mono infeccin en modelo murino. Efecto sinrgico en la destruccin de tejido blando en un modelo murino.

Bacilo Gram negativo, Anaerobio estricto, Algunas especies presentan pigmentos negros

Lipopolisacrido, Hemaglutininas, -lactamasas

Hiptesis de la placa ecolgicaInflamacin reducida Respuesta Inflamatoria Acumulacin de placa Inflamacin aumentada FCG bajo Alto Eh Cambios Ambientales FCG alto Bajo Eh Predominio G(+) Anaerobios Facultativos Cambio Ecolgico Predominio G(-) Anaerobios Obligados

Caries y Enfermedad periodontal

Reduccin de la placa

Los microorganismos son necesarios, pero no suficientes para el desarrollo de la Enfermedad Periodontal. El rol de la respuesta inflamatoria del hospedero es un determinante crtico de la susceptibilidad y severidad de la Enfermedad Periodontal.

Medios de cultivo1.- AGAR SANGRE HEMINA-MENADIONA: Tripticasa sangre de cordero hemina menadiona (Factor X) Flora anaerbica total del surco

Monitoreo de las enfermedades infecciosas asociadas a la Placa Dental

2.- AGAR TSBV: Tripticasa levadura - suero de Caballo bacitracina - vancomicina Especies de Aggregatibacter (AA) 3.- AGAR BRUCELLA BACTEROIDES : Agar cristal violeta sangre de caballo eritrocitos humanos hemolizados Especies de Bacteroides (Tannerella) 4.- AGAR COLUMBIA : Agar casena digerida pancretica extracto de levadura extracto de carne almidn de maz cloruro de sodio hemina menadiona Especies de Porphyromonas y Prevotella, adems de flora anaerbica total

Agar Sangre Hemina-Menadiona

Agar TSBVMicroflora subgingival total

Microflora subgingival total

Colonias de Porphyromonas gingivalis

Aggregatibacter actinomycetemcomitans Catalasa (+)

Monitoreo Periodontalndice de hidrgeno sulfuradoComo la microflora periodontal es eminentemente proteoltica, se detecta un sub producto del metabolismo proteico que es el hidrgeno sulfurado. Se utilizan trozos de papel filtro embebidos en sub acetato de plomo.

Test de BANADetecta hidrlisis del sustrato N-BENZOIL-DL-ARGININA-2-NAFTILAMIDA (BANA) Esta hidrlisis la realizan slo las bacterias que poseen TLE (proteasas tipo tripsina) Treponema denticola Porphyromonas gingivalis Tannerella forsythia Se realiza con tarjetas (perioscan) que contienen los reactivos en las cuales se coloca la muestra subgingival o de saco periodontal.