Clase 4: Biomoléculas. Función de las proteínas y enzimas · Clase 4: Biomoléculas. Función de...

Curso de Ciencias Básicas Aplicadas

Lic. Yaily Rivero

2017

Clase 4: Biomoléculas. Función de las proteínas y enzimas

Temas de la clase Unidad II: Biomoléculas

2.1- Principales moléculas orgánicas

- Proteínas - Función de las proteínas

Unidad III: Enzimas

• Definición • Acción enzimática • Estructura • Velocidad de acción • Inhibición y sus tipos • Desnaturalización.

-

Bibliografía Clase

Unidad II: Biomoléculas. AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Principios de Bioquímica (4ª edición) - Capítulo 5 pg 157-186. Función de las proteínas. - Capítulo 6 pg 190-232- Enzimas

Unidad 2: Biomoléculas

Proteínas Características

- Las proteínas son polímeros de aminoácidos unidos por enlace covalente.

- Se pueden degradar (hidrolizar) hasta sus aminoácidos constituyentes mediante diversos métodos.

- Veinte son los aminoácidos comúnmente encontrados en las proteínas.


Proteínas Características estructurales de los aminoácidos

- Los 20 aminoácidos son α- aminoácidos.

- Tienen nombre comunes debido a la fuente de la que fueron aislados.

- Tienen todos un grupo carboxilo y un grupo amino unidos al mismo átomo de carbono (el carbono α).

- Difieren uno de otro en su cadenas laterales o grupos R, que varían en estructura, tamaño y carga eléctrica y que influyen en la solubilidad en agua de los aminoácidos.



- El C-1 de un aminoácido es el que corresponde al grupo carboxilo y el C-2 al carbono α.

- En todos los aminoácidos estándar excepto la glicina el carbono α está unido a cuatro grupos diferentes:

- Un grupo carboxilo - Un grupo amino - Un grupo R - Un átomo de hidrógeno -


Proteínas

Aminoácidos Estereoisómeros en los α aminoácidos

La configuración absoluta de los azúcares sencillos y los aminoácidos se especifica mediante el sistema D, L. Los residuos de aminoácidos son exclusivamente L-estereoisómeros.


Proteínas

Aminoácidos Clasificación de los aminoácidos según su grupo R

- Se agrupan en 5 clases basados en las propiedades de polaridad del grupo R - La polaridad del grupo R es la tendencia a interaccionar con el agua a pH biológico (cerca

de pH 7,0) - Varia desde totalmente apolar o hidrofóbico (insoluble en agua) hasta totalmente polar o

hidrofílico (soluble en agua).

Grupos R apolares alifáticos

Apolares e hidrofóbicos


Proteínas


Grupos R aromáticos

Relativamente apolares e hidrofóbicas Tirosina: El OH puede formar puentes de hidrógeno.

Absorben la luz ultravioleta a 280 nm.


Proteínas


Grupos R polares sin carga

Son más solubles en agua. Tienen grupos funcionales que forman puentes de hidrógeno con el agua.


Proteínas


Grupos R polares cargados positivamente (básicos)

Son los aminoácidos más hidrofílicos junto a los cargados negativamente. Son los aminoácidos que en los que los grupos R tienen una carga neta positiva a pH 7,0.


Proteínas


Grupos R polares cargados negativamente (ácidos)

Son los aminoácidos más hidrofílicos junto a los cargados negativamente. Son los aminoácidos que en los que los grupos R tienen una carga neta negativa a pH 7,0.


Proteínas

Aminoácidos Los aminoácidos pueden actuar como ácidos o como bases

- Cuando un aminoácido se disuelve en agua, se encuentra en solución en forma de ión dipolar o switterion.

- Un switterion puede actuar como ácido (dador de protones)

Las sustancias con naturaleza dual son anfóteras


Proteínas

Péptidos

Los péptidos son cadenas de aminoácidos que pueden unirse de forma covalente a través de un enlace peptídico.


Proteínas

Péptidos

- Tripéptidos: tres aminoácidos unidos mediante enlaces covalentes.

- Tetrapéptidos – 4 aa - Pentapétidos – 5 aa

- Oligopéptidos: Pocos aminoácidos - Polipéptidos: Masa molecular inferior a 10 000

Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu


Proteínas

Péptidos

- Existen péptidos y polipéptidos biológicamente activos de una gran variedad de tamaños.


Proteínas

Péptidos

- Los péptidos tienen una composición de aminoácidos característica.


Proteínas

Proteínas

- Algunas proteínas contienen grupos químicos diferentes a los aminoácidos.

Grupo prostético: Se denomina a la parte no aminoácida de una proteína conjugada. - Lipoproteínas – contienen lípidos - Glucoproteínas – glúcidos - Metaloproteínas – metal

específico

- El grupo prostético juega un papel importante en la función de una proteína.


Proteínas

Niveles de estructura de las proteínas

Describe todos los enlaces covalentes que unen los residuos de aa de una cadena polipeptídica

Disposiciones particularmente estable de los aas.

Plegamiento tridimensional de un polipéptido.

Disposición en el espacio de dos o más subunidades polipeptídicas.


Proteínas

Función de las proteínas

Hemoglobina


Proteínas


• Son la base de procesos fisiológicos como: - El transporte de oxígeno - La función inmunitaria - Contracción muscular

• La función de muchas proteínas implica la unión

reversible de otras moléculas (Ligando – sitio de fijación).

• Son flexibles – Cambios conformacionales que permiten un encaje inducido entre la proteína y el ligando.


Proteínas


• Las enzimas unen y transforman químicamente otras moléculas: catalizan reacciones.


Proteínas


• Unión reversible proteína - ligando: proteínas de unión a oxígeno

- Mioglobina y hemoglobina – proteínas más estudiadas. - El oxígeno puede estar unido a un grupo prostético hemo.


Proteínas


• La mioglobina tiene un único grupo de fijación para el oxígeno - Es una proteína de unión a oxígeno

que está presente en casi todos los mamíferos, principalmente en tejido muscular. - Es una proteína de transporte.

- Polipéptido de 153 aa con un grupo hemos.


Proteínas


• Respuesta inmunitaria

Sistemas complementarios

Sistema inmunitario humoral Sistema inmunitario celular

Está dirigido contra infecciones extracelulares (virus y bacterias)

Destruye las células propias infectadas por virus

Base proteica

Anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) 20% de las proteínas de la sangre y producidas por linfocitos B

Linfocitos T citotóxico

Receptores de las células T

Células T cooperadoras

Citoquinas - proteínas señalizadoras solubles


Proteínas


• Sistema complementario entre proteínas y ligandos: el sistema inmunitario y las inmunoglobulinas

- Acción inmunitaria : Leucocitos (glóbulos blancos de la sangre) Macrófagos Linfocitos


Proteínas



Proteínas de reconocimiento del sistema inmunitario: - Anticuerpos – célula B - Receptor - célula T

- Unen de manera específica alguna estructura química concreta distinguiéndola de cualquier otra.

- Antígeno: Cualquier molécula o patógeno capaz de generar una respuesta inmunitaria .

Ej: virus, pared celular bacteriana, proteína individual , etc . El antígeno puede unirse a una serie de anticuerpos diferentes


Proteínas



Los anticuerpos poseen dos sitios idénticos de unión a antígeno


Proteínas



Los anticuerpos poseen dos sitios idénticos de unión a antígeno

ESTRUCTURA DE UNA INMUNOGLOBULINA G


Proteínas



Fagocitosis por un macrófago de un virus unido a anticuerpo


Proteínas


• Principales técnicas que utilizan anticuerpos

- Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA): Cuantificación y caracterización de analitos específicos y/o interaciones moleculares en diversos fluidos biológicos. - Western blot Determinación de niveles relativos de proteínas entre muestras biológicas. Las proteínas provenientes de tejidos o lisados celulares son separadas por electrophoresis en gel de acuerdo a su masa, posteriormente transferidas a una membrana donde las proteínas de interés son reveladas con anticuerpos acoplados a alguna fuente de señal. - Inmunohistoquímica Elucidación de la localización subcellular y tejido-específica de un antígeno en una muestra. Menos cuantitativa que el western blot o el ELISA; sin embargo permite la caracterización de la expresión de proteínas en el contexto del tejido intacto.


Proteínas


• Principales técnicas que utilizan anticuerpos

- Inmunocitoquímica Estudia la distribución subcellular de proteínas usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Permite una major resolución especial que la inmunoistoquímica al realizarse en células en cultivo, que cuentan con un ambiente menos complejo que los tejidos. - Citometría de flujo Mide la fluorescencia emitida por anticuerpos marcados que se unen a células específicas dentro de una población compleja de células, permite determinar parámetros celulares como tamaño y expresión de marcadores intracelulares y de superficie. - Inmunoprecipitación Permite el aislamiento y purificación de proteínas y complejos proteicos utilizando anticuerpos inmovilizados en una fase sólida que capturan a los antígenos presentes en una muestra.


Proteínas


• Diseños de ELISA

ELISA directo

Anticuerpo primario acoplado a una enzima (E) reacciona directamente con el antígeno (Ag)


Proteínas



ELISA indirecto

Anticuerpo secundario acoplado a una enzima (E) tiene especificidad por el anticuerpo primario que reconoce al antígeno (Ag).

La señal es amplificable dado que a un anticuerpo primario se pueden unir varios secundarios marcados.

Es el formato más usado.


Proteínas



ELISA sándwich

El antígeno (Ag) se une a un anticuerpo de captura adsorbido a la superfice de la placa.

La detección puede ser directa o indirecta


Proteínas


• Algunas enfermedades animales que pueden diagnosticarse por ELISA

- Brucelosis - Diarrea Viral Bovina - Clamidiosis - Leptospirosis - Neosporosis - Paratuberculosis - Salmonelosis


Proteínas


• Leptospirosis

- Enfermedad altamente contagiosa y de distribución mundial - Afecta a animales y humanos - Resulta de la infección con la espiroqueta Leptospira - Dos especies: L.interrogans y L.biflexa. - Entres sus variantes la Leptospira interrogans serovar hardjo (L.hardjo) es la causa

de una alto número de casos de leptospirosis bovina. - La técnica de ELISA permite la detección precoz de manera sensible y específica de

la enfermedad a gran escala.

Micrografía de barrido de Leptospira interrogans.


Proteínas


• Ejemplo de un protocolo de diagnóstico de Leptospirosis en bovinos


Proteínas



Técnicas con anticuerpos


Proteínas


• Interacciones proteicas moduladas por energía química: actina, miosina y motores moleculares.

Las principales proteínas del músculo son la actina y la miosina.


Proteínas



Contracción muscular

Los filamentos gruesos de miosina se deslizan a lo largo de los filamentos delgados de actina.


Proteínas



Mecanismo molecular de la construcción muscular

Unidad III: Enzimas

Unidad 3: Enzimas • Definición • Acción enzimática • Estructura • Velocidad de reacción • Inhibición y sus tipos • Desnaturalización.

Unidad 3: Enzimas

Definición

Unidad 3: Enzimas

- La mayoría de las enzimas son proteínas

Si se desnaturaliza o disocia una enzima en sus subunidades.

Se suele perder la actividad catalítica

Siempre se destruye su actividad catalítica

Su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa.

Las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas enzimáticas son esenciales para su actividad catalítica

Si se descompone una enzima en sus aminoácidos constituyentes

Unidad 3: Enzimas

Generalidades

Unidad 3: Enzimas

Definición

Proteínas formadas por células

Aceleran velocidad de reacciones

Disminuyen energía de activación

Específicas con el sustrato

No sufren modificación durante la reacción

ENZIMAS

Unidad 3: Enzimas


- Tienen masas moleculares igual que otras proteínas que van desde 12000 hasta 1 millón.

- Algunas enzimas requieren para su actividad cofactores o coenzimas

Cofactores

Iones inorgánicos

Unidad 3: Enzimas


- Algunas enzimas requieren para su actividad tanto una coenzima como uno o varios iones metálicos.

Moléculas orgánicos o metalorgánicas

Coenzimas

Unidad 3: Enzimas

Unidad 3: Enzimas


Grupo prostético: una coenzima o ión metálico unido covalentemente o de manera muy fuerte a la proteína enzimática.

Unidad 3: Enzimas

Unidad 3: Enzimas

Nomenclatura

Agregando el sufijo - ASA al sustrato sobre el que actúa la enzima Ej. Ureasa Urea → 2NH3 + CO2

ADN polimerasa → polimerización de nucleótidos en la síntesis de ADN

Unidad 3: Enzimas

- Clasificación internacional de las enzimas

Cada enzima tiene : - Un número clasificatorio de cuatro apartados - Nombre sistemático que identifica la reacción catalizada

Ej. ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa 6-fosfato ATP:glucosa fosfotransferasa 2- nombre de la clases (transferasa)

7- subclase (fosfotransferasa) 1- fosfotransferasa con un grupo hidroxilo como aceptor 1- D-glucosa como aceptor del fosfato

EC: 2.7.1.1

(transferencia de un grupo fosfato del ATP a la glucosa)

Unidad 3: Enzimas


Unidad 3: Enzimas


Comité de Nomenclatura de la Internacional Union of Biochemistry and Molecular Biology

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

Unidad 3: Enzimas

Unidad 3: Enzimas

Cómo funcionan las enzimas?

- Una enzima proporciona un ambiente específico dentro del cual una reacción determinada puede transcurrir a mayor velocidad.

Fijación de un sustrato al sitio activo de una enzima. La mancha roja en la superficie de la enzima corresponde a algunos aminoácidos claves del sitio activo

La reacción catalizada enzimáticamente tiene lugar en el sitio activo.

- La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa la enzima se denomina sustrato.

- La superficie del sitio activo de la enzima está revestida con residuos aminoácidos cuyos grupos sustituyentes se unen al sustrato y catalizan la transformación química.

Unidad 3: Enzimas


Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios

E+S ↔ ES ↔ EP ↔ E+P

REACCIÓN ENZIMÁTICA SENCILLA

Unidad 3: Enzimas

Especificidad enzimática: especificidad de sustrato

Unidad 3: Enzimas

Especificidad enzimática: especificidad de función

Unidad 3: Enzimas



Equilibrio de reacción

Velocidad de reacción

≠

Un catalizador, aumenta la velocidad de reacción

No modifica el equilibrio

Unidad 3: Enzimas



Cualquier reacción se puede describir mediante un diagrama de coordinación de reacción

S↔P Describe los cambios energéticos durante la reacción en forma de energía libre G

El punto de partida se denomina estado basal

Es la contribución a la energía libre del sistema de una molécula promedio (S o P) bajo un conjunto de condiciones dadas.

Unidad 3: Enzimas




S↔P

Energía de activación: Es la diferencia entre los niveles de energía del estado basal y del estado de transición.

Estado de transición: Es una barrera energética entre S y P requerida para que la reacción tenga lugar en cualquiera de las dos direcciones.

Unidad 3: Enzimas




S↔P La velocidad de una reacción refleja esta energía de activación: una energía de activación más elevada corresponde a una reacción más lenta. La velocidad de reacción puede aumentarse: - incrementando la

temperatura. - Adición de un catalizador

Unidad 3: Enzimas


Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios.

Reacción catalizada por enzima y sin catalizar

La catálisis aumenta las velocidades de reacción disminuyendo las energías de activación

Unidad 3: Enzimas


Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios.

Cualquiera enzima que cataliza la reacción S→P también cataliza la reacción P→S. Su única misión es acelerar la interconversión de S y P. La reacción alcanza el equilibrio de una manera mucho más rápida, cuando está presente la enzima adecuada, ya que incrementa la velocidad de la reacción

Unidad 3: Enzimas


Las velocidades de reacción y los equilibrios tienen definiciones termodinámicas.

S↔P El equilibrio viene descrito por una constante de equilibrio, Keq

Keq = [P] [S] ΔG´°=-RTlnKeq

- R: Constante de los gases (8,315J/mol*K) - T: Temperatura absoluta , 298K (25°C)

La constante de equilibrio es un reflejo directo de la variación de energía libre estándar global de la reacción.

Unidad 3: Enzimas



S↔P

La velocidad de una reacción viene determinada por la concentración de reactivo y por la constante de velocidad representada como k

V=k[S]

Ecuación de velocidad

Reacción de primer orden

En esta reacción de primer orden, la velocidad sólo depende la concentración de sustrato.

K: (s-1)

Unidad 3: Enzimas



V=k[S1] [S2]

Reacción de segundo orden – depende de la concentración de dos compuestos

K: (M-1S-1)

Unidad 3: Enzimas

Reacción enzimática con dos sustratos

Unidad 3: Enzimas

Cinética enzimática

Unidad 3: Enzimas


La concentración del sustrato afecta a la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas

Curva de saturación de una reacción enzimática donde se muestra la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.

Unidad 3: Enzimas


La concentración del sustrato afecta a la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas

constante de Michaelis-Menten (Km), que viene a ser la concentración de sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad máxima.

Para encontrar la máxima velocidad de una reacción enzimática, la concentración de sustrato se incrementa hasta que se obtiene una tasa constante de formación de producto . La saturación ocurre porque, cuando la concentración de sustrato aumenta, disminuye la concentración de enzima libre, que se convierte en la forma con sustrato unido (ES). A la máxima velocidad (Vmax) de la enzima, todos los sitios activos de dicha enzima tienen sustrato unido, y la cantidad de complejos ES es igual a la cantidad total de enzima

Vmáx: punto más allá del cual se dan incrementos pequenísimos de velocidad con el incremento de la [S]

https://es.wikipedia.org/wiki/Constante_de_Michaelis-Menten




Unidad 3: Enzimas

Definiciones importantes

Unidad 3: Enzimas

Las enzimas catalizan la reacción bajando la energía requerida para pasar de sustrato a producto

Unidad 3: Enzimas

Unidad 3: Enzimas

Factores que afectan la actividad enzimática

* TEMPERATURA

T óptima en humanos = 37°C – 37,5°C

T óptima= T en la que se obtiene la máxima actividad enzimática

Unidad 3: Enzimas


* pH

pH óptimo para enzimas intracelulares = 7,0

pH = 1-6 : enzimas digestivas - Pepsina

pH = 8- 12: enzimas de la cavidad oral - amilasas

Unidad 3: Enzimas


* Concentración de enzima

Unidad 3: Enzimas


* Concentración de sustrato

Unidad 3: Enzimas Inhibidores

Reducen o detienen la actividad catalítica de una enzima, bloqueando o distorsionando el sitio activo.

Unidad 3: Enzimas

Inhibición de la actividad enzimática

INHIBICIÓN COMPETITIVA

El inhibidor tiene estructura similar al sustrato.

Los dos compiten por el sitio activo de la enzima.

Unidad 3: Enzimas


INHIBICIÓN COMPETITIVA

Unidad 3: Enzimas


INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

El inhibidor se une a la enzima en un sitio diferente al sitio activo.

Esta unión ocasiona cambios conformacionales en la estructura de la enzima y no es capaz de unirse al sustrato.

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