CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA/USAC

INFORME FINAL

EXTRACCIÓN SUPERCRITICA Y CUANTIFICACION HPLC DE LUTEÍNA Y BETA CAROTENO PRESENTES EN VEGETALES DE

CONSUMO POPULAR

PROYECTO FODECYT No. 49-2006

RODOLFO MARINELI OROZCO CHILEL Investigador Principal

GUATEMALA, DICIEMBRE DEL 2010

AGRADECIMIENTOS La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT- otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT

AGRADECIMIENTOS A la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Escuela de Química, Departamento de Fisicoquímica A la facultad de Agronomía Universidad de San Carlos de Guatemala

INDICE

RESUMEN ………………………………..…………………............................. i SUMMARY………………………………..…………………………………….. ii PARTE I Página I.1 INTRODUCCIÓN..........................................................................................01 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.......................................................03 I.2.1 Antecedentes en Guatemala…………………………..……………04 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación…….…………………….06 I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General....................................................................................07

I.3.1.2 Específicos...............................................................................07 I.3.1.2 Hipótesis……………………………………………………..07 I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Localización……................................................................................08 I.4.2 Medios.................................................................................................08 I.4.2.1 Recursos Humanos..................................................................08

I.4.2.2. Recursos Institucionales..........................................................08 I.4.3 Materiales y Reactivos........................................................................08 I.4.3.1 Trabajo de campo.....................................................................08 I.4.3.2 Trabajo de laboratorio.............................................................08 I.4.4 Periodo de Trabajo de Campo.............................................................09 I.4.5 Muestreo..............................................................................................09 I.4.6 Colecta de material Vegetal................................................................10 I.4.7 Secado..................................................................................................10 I.4.8 Extracción Supercrítica con CO2.........................................................10 I.4.9 Separación de los carotenoides por cromatografía en columna..........10 I.4.10 Identificación y Cuantificación HPLC de luteína y beta caroteno......11

PARTE II II.1 MARCO TEORICO

II.1.1 Alimentos funcionales...........................................................................12 II.1.2 Beneficios de los carotenoides para la salud.........................................12 II.1.3 Estructura química de los carotenoides…………..…………………...13 II.1.4 Distribución de los carotenoides en los alimentos……………………15 II.1.5 Importancia de los carotenoides en la dieta………….………………..15 II.1.6 Niveles de ingesta y recomendaciones………………………………..16 II.1.7 Estabilidad de los carotenodies……………………………………….17

II.1.8 Propiedades fisicoquímicas de los carotenoides………………………17 II.1.9 Beta Caroteno........................................................................................18 II.1.9.1 Propiedades del beta caroteno..............................................19

II.1.3.2 Dosis y toxicidad ...................................................................19 II.1.10 Vitamina “A” .....................................................................................20

II.1.11 Vitamina A y su deficiencia……… ...................................................20

II.1.12 Luteina.................................................................................................21 II.1.12.1 Propiedades de la Luteína ..................................................21 II.1.12.2 Dosis y toxicidad................................................................21 II.1.13 Cromatografía de Fluidos Supercrítico...............................................22 II.1.13.1 Extracción supercrítica con CO2..........................................22 II.1.13.2 Instrumentación………........................................................23 II.1.13.3 Fases estacionarias y Móviles...............................................23 II.1.13.4 Ventajas de la extracción supercrítica..................................23 II.1.13.5 Aplicaciones de la extracción supercrítica……………...…24 II.1.14 Cromatografía HPLC...........................................................................24 II.1.14.1 Instrumentación……………................................................26 II.1.14.2 Inyectores…………………..................................................26 II.1.14.3 Columnas……………………..............................................26 II.1.14.4 Sistemas de inyección de muestras.......................................27 II.1.14.5 Tubos conectores y filtros………………………………….27 II.1.14.6 Medidores de presión y termostátos……………………….28 II.1.14.7 Detectores………………………………..………………...28 II.1.15 Aplicaciones de la Cromatografía HPLC............................................29

PARTE III III RESULTADOS ..............................................................................................30 III.1 Discusión de Resultados......................................................................33 PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES..........................................................................................35 IV.2 RECOMENDACIONES.................................................................................36 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................37 IV.4 ANEXOS……………………………………………………………………40 IV.4.1 Cromatogramas HPLC de los vegetales de estudio.......................... 40 IV.4.2 Colecta de los vegetales de estudio....................................................45 IV.4.3 Secado de los vegetales …………….............................................46 IV.4.4 Molienda y pesado de los vegetales secos.........................................46 IV.4.5 Equipo de extracción supercrítica con CO2.......................................47 IV.4.6 Separación de los carotenoides por cromatografía en columna.........48

IV.4.7 Cuantificación HPLC de luteína y beta caroteno................................49 IV.4.8 Fichas agrotecnológicas......................................................................50

IV.4.8.1 Agrotecnología del cultivo de acelga...................................50 IV.4.8.2 Agrotecnología del cultivo de berro......................................53 III.4.8.3 Agrotecnología del cultivo de brócoli...................................55 III.4.8.4 Agrotecnología del cultivo de espinaca................................57 III.4.8.5 Agrotecnología del cultivo de hierba mora...........................60

PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO.............................................................................63

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RESUMEN

Los carotenoides son los responsables de la coloración de un gran número de alimentos vegetales y animales. La luteina y el beta caroteno, son dos de los carotenoides más abundantes en las hojas verdes de los vegetales. El interés por estos compuestos se ha incrementado desde un punto de vista nutricional.

El propósito de este estudio fue la cuantificación de luteína y beta caroteno en los vegetales: Espinaca (Spinacia oleracea L), Brócoli (Brassica oleracea var Italica

Plenck), Hierba mora (Solanum nigrum), Berro (Nasturtium officinales) y Acelga (Beta vulgaris var Cicla.). Estos vegetales fueron seleccionados tomando en cuenta su consumo diario en la dieta de la población guatemalteca, y que son muy populares porque ofrecen al consumidor una opción barata, de fácil obtención y como una fuente de carotenoides en forma natural.

Los vegetales de estudio fueron colectados en forma fresca, en los campos de producción del departamento de Chimaltenango. Los extractos de estos vegetales, se realizaron con el equipo de extracción supercrítica con CO2, a una presión de 1300 psi y una temperatura de 35 oC. Utilizando 40g de material vegetal seco y 50 ml de cosolvente etanol grado analítico.

Los carotenoides se aislaron, aplicando 1 ml del extracto etanolico en una columna cromatográfica de vidrio 1 X 50 cm que contenía sílica gel 60 G, empacada con acetato de etilo. La luteina y el beta caroteno, se colectaron en las fracciones 1 y 2 de color amarillo. Utilizando como fase móvil acetato de etilo grado analítico. La cuantificación por HPLC, se realizó con un cromatógrafo líquido Shimadzu LC-20 AT Prominence. Utilizando como fase móvil agua:metanol (50:50) isocrática, a 35 oC en una columna Altima Rp-18, 250mm X 4.6 mm y 5 um de diámetro del relleno. Los estándares utilizados en la calibración y cuantificación, fueron: beta caroteno (sigma chemicals) 95 % de pureza y estándar de luteína (spectrum) 86.6 % de pureza.

Los vegetales de estudio que contienen de 4 a 10 mg/100g de betacaroteno son acelga y berro. Los vegetales que contienen de 10 a 50 mg/100g de luteína son brócoli, hierba mora y espinaca. Estos vegetales pueden consumirse como alimento funcional ya que son fuente importante de carotenoides en forma natural.

ii

SUMMARY

Carotenoids are responsible for the colour of a great number of both vegetable and animal foods. The lutein and beta carotene, are two of the most abundant carotenoids, they are found in green leafy vegetables. The interest in these compounds has increased from a nutritional point of view.

The purpose of this study was the quantification of lutein and beta carotene in the vegetables such as spinach (Spinacia oleracea L), bróccoli (Brassica oleracea), berry herb (Solanum nigrum), cress (Nasturtium officinales) and beet (Beta vulgaris var.). These vegetables were selected on the basis that they are commonly eaten in the diary diet by Guatemalan population are very popular because offer the consumers an option of an inexpensive, easily obtainable and source of carotenoids in natural form.

The vegetables studied, were obtained from production land that was reap fresh, in the production lands of Chimaltenango department. The vegetable extracts were obtained with supercritical CO2 equipment, used 1300 psi presion and 35 oC of temperature. Dry vegetables samples of 40 g were used for the extraction and 50 ml of ethanol analytic grade like cosolvent.

The isolation of carotenoides were applicated 1ml to ethanolic extract in a column chromatography in a 1 X 50 cm glass column using silicagel 60 G, packed with etyl acetate. Lutein and beta carotene were collected in the first two fractions (1 , 2 ) of yellow color. The movil phase was ethyl acetate analityc grade. The quantification was made by HPLC Shimadzu LC-20 AT Prominence. The isocratic movil phase was methanol:water (50:50) at 35 oC in an Altima Rp-18 column, 250 mm X 4.6 mm whit a particle size 5 um. The standars used for calibration and quantification were: Beta carotene 95% (sigma chemicals) of purity and luteine 86.6 % of purity (spectrum).

The vegetables beet and cress studied contained 4 – 10 mg/100g of betacarotene and the vegetables broccoli, spinach and berry herb conatained 10 – 50 mg/100g of luteine. Theses vegetables can be consumed to source functional dietary of carotenoids in natural form.

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PARTE I I.1. INTRODUCCIÓN

En los últimos años, el estudio de los carotenoides ha cobrado importancia por las diversas funciones beneficiosas en la salud y por su aplicación industrial. La importancia nutricional de los carotenoides se debe al hecho de que algunos poseen actividad provitamínica A, la cual sigue siendo objeto de estudio en la actualidad. No obstante, el interés por estos compuestos isoprenoides se haya multiplicado no solo en Latinoamérica, sino a nivel mundial, se debe a diversos estudios en los que se concluye que son compuestos antioxidantes y beneficiosos para la prevención de diversas enfermedades, como ciertos tipos de cáncer (43-45), trastornos oculares y vasculares, etc. Así, el interés actual en los pigmentos carotenoides desde un punto de vista nutricional es claro, tal que los artículos de revisión en los que se discute las propiedades antioxidantes y beneficiosas para la salud de los humanos son numerosos, así como aquellos que tratan sobre la biodisponibilidad de los mismos.

En la actualidad el término provitamina A se usa para todos los carotenoides que presentan actividad de β-caroteno. Nutricionalmente el carotenoide provitamínico más importante es el β-caroteno, que se definía hasta hace poco como el que tenía 1/6 de la actividad de retinol. En la actualidad, el comité que fija los niveles de ingesta de referencia (Dietary Reference Intake Committee) considera que un equivalente de retinol equivale a 12 µg de β-caroteno o a 24 µg de otros carotenoides provitamínicos.

La molécula de β-caroteno es, una estructura doble de retinol y teóricamente, su división debería dar lugar a dos moléculas de retinol. Los carotenoides ingeridos con los alimentos se absorben en menor grado que los carotenoides puros, por lo que los factores de conversión van a depender de la procedencia de los carotenoides. Así, por ejemplo, se considera que 2 µg de β-caroteno en solución oleosa equivalen a 1µg de retinol.

Debido a la presencia en su molécula de un cromóforo principalmente en una cadena de dobles enlaces conjugados proporcionan a frutos y verduras colores característicos (amarillos, anaranjados y rojizos). Están presentes en todos los tejidos fotosintéticos, junto con las clorofilas, así como en tejidos vegetales no fotosintéticos, como componentes de cromoplastos, que pueden ser considerados como cloroplastos degenerados. Los carotenoides siempre acompañan a la clorofila en una relación de tres a cuatro partes de clorofila por una parte de carotenoide. Estos pigmentos se encuentran en frutas y vegetales amarillos y en los cloroplastos de tejidos verdes, donde están enmascarados por la clorofila hasta que el tejido envejece. Los dobles enlaces conjugados presentes en los carotenoides son los responsables de la intensa coloración de los alimentos que contienen estos pigmentos. Así, por ejemplo, los colores naranja de la zanahoria y rojo del tomate, se deben a la presencia de β-caroteno y licopeno, respectivamente. Otros compuestos más saturados y de estructura similar son incoloros, como el fitoeno y fitoflueno que también se presentan en algunas plantas comestibles.

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Los carotenoides son compuestos liposolubles, altamente insaturados que se encuentran en los vegetales de color amarillo, anaranjados y en los cloroplastos de las hojas verdes, formando parte del sistema de biosíntesis a partir de la energía de la luz. Las funciones más importantes para la salud, son su actividad como pro vitamina A, sus propiedades antioxidantes y para el tratamiento de ciertas enfermedades crónicas. Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia, que se dividen en dos tipos básicos: los carotenos, que son hidrocarburos (beta caroteno) y las xantofilas, sus derivados oxigenados (luteína).

En la dieta humana los carotenoides (provitamina A y no provitamina A) son nutrientes fundamentales, debido a su efecto sobre la salud y el funcionamiento inmune atribuido principalmente a su capacidad antioxidante. Las plantas constituyen una opción para proveer diversos tipos de carotenoides, su cantidad y disponibilidad biológica se modifica con la variedad, parte de la planta, estado de maduración, localización geográfica, clima, manejo en la cosecha, almacenamiento y el procesamiento. En relación con todo ello, resulta claro afirmar que las funciones y efectos de estos pigmentos se deben a sus propiedades físicas y químicas, las cuales son consecuencia de su estructura química.

Los carotenoides mayoritarios en los vegetales son la luteina y el beta caroteno, cada uno de ellos tienen diversas propiedades y funciones para la salud. La luteina desempeña una función muy importante en la protección de la mácula del ojo, se considera uno de los carotenoides más potentes que puede prevenir procesos oxidativos, tumorales y cancerígenos, mejora el sistema inmune y la comunicación celular. El beta caroteno es una fuente importante de provitamina A, que una vez ingeridas se convierte en vitamina A en las células hepáticas. Esta vitamina es importante en la formación y protección de las membranas mucosas, piel, dientes, huesos y para el normal crecimiento de las células corporales en particular los epitelios. También cumple una función vital en la visión, particularmente la nocturna.

En éste estudio se separaron y cuantificaron el beta caroteno y la luteína presentes en diferentes especies vegetales que son consumidos diariamente por la población guatemalteca, ya que en estudios preliminares se ha reportado un alto contenido de luteína y beta caroteno en los vegetales. Es necesario utilizar técnicas modernas que permitan separarlos e identificarlos de forma rápida y segura, una de ellas es la extracción con fluidos supercríticos con CO2 y la cromatografía HPLC que nos permiten separarlos, identificarlos y cuantificarlos por sus respectivos tiempos de retención y las áreas correspondientes de cada carotenoide, comparada con los estándares de cada carotenoide.

Los vegetales de estudio son: acelga, berro, brócoli, hierba mora y espinaca.

Estos vegetales fueron seleccionados por ser de consumo popular, fácil adquisición, bajo costo, por sus ciclos cortos de crecimiento ( 60 y 90 días ) y por ser cultivados durante todo el año; siendo de importancia económica, comercial y como alimento funcional en la población guatemalteca.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Guatemala se caracteriza por su gran diversidad natural y además por ser un

país agrícola ya que un alto porcentaje de la población, en especial rural se dedica al cultivo de vegetales y verduras. Sin embargo no se han aprovechado al máximo el cultivo de estos productos, debido a la falta de conocimiento y de tecnología que permita el desarrollo económico de la población en especial las personas campesinas del sector agrícola.

Uno de los grandes problemas que afectan a la población guatemalteca es la

desnutrición, por lo cual es importante, promover el consumo de alimentos de bajo costo y de alto contenido nutricional que puedan proveer beneficios al organismo y que contribuyan al mejoramiento y mantenimiento de una buena salud de toda la población. Dentro de los alimentos que pueden aportar nutrientes esenciales e importantes por sus diversas funciones en el organismo están los compuestos llamados carotenoides. La mayoría de estos compuestos se encuentran de forma natural en la mayoría de vegetales de color verde, por lo cual resulta de vital importancia conocer el contenido de beta caroteno y luteína presentes en diversas especies vegetales que se cultivan en el país.

La insuficiencia de vitamina A en la dieta de la población guatemalteca es

deficiente y continua siendo un problema de salud. Por lo cual es importante buscar y promover el consumo de vegetales como alimentos que nos proporcionan de forma natural los niveles recomendados en la dieta alimenticia del betacaroteno y de la luteína.

La mayoría de carotenoides se caracterizan por su fácil oxidación y descomposición en presencia de la luz y el calor, por lo cual es necesario, desarrollar y aplicar metodología analítica moderna que nos ayude a la separación e identificación de beta caroteno y luteína sin la descomposición química de los mismos. Es por esto que se diseño y ensambló el equipo de extracción supercrítica con CO2, el cual nos permitió extraer de forma rápida y segura los cartotenoides de estudio (beta caroteno y luteína).

Este estudio es pionero y contribuirá con el desarrollo tecnológico de nuestro

país, así como también nos permitirá aprovechar al máximo los cultivos vegetales del sector agrícola de nuestro país; brindándole un valor agregado a los productos agrícolas ya que una vez extraídos sus carotenoides de forma pura se podrán comercializar o exportar de forma segura y permitirá mejorar las condiciones de vida de nuestra población.

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I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA

En Guatemala, se han realizado algunos estudios con respecto a los carotenoides, (Chávez C., 1995) estudio la variación del contenido de vitamina A, en acelga cruda, sometida a diversos tipos de almacenamiento y cocción. Puedo determinar que el contenido de vitamina A disminuye con la temperatura y el calor, así como también con un mayor tiempo de almacenamiento.

(Molina K., 1997) determinó el contenido de carotenoides pro vitamina A, en diferentes variedades de musáceas. Con base en los resultados obtenidos recomienda el consumo de plátano verde, ya que la ingesta de 50g satisface aproximadamente el 40% de las recomendaciones diarias para un niño. Las variedades maduras a pesar de tener un contenido menor de carotenoides, satisfacen el 8 % y el 12 % respectivamente, de dichas recomendaciones.

(Ramos E., 1999) validó un método para determinar el perfil de carotenoides por cromatografía HPLC. Los alimentos que proporcionan mayor cantidades de carotenoides para aislar patrones fueron: espinaca, papaya y zanahoria. Los porcentajes de recuperación oscilan entre 85 y 95% para vegetales y entre 70 y 80% para frutas. La sensibilidad del método indica que los límites de detección van de 0.0016 a 0.0089 mg/100 gramos de alimento, y los límites de cuantificación están entre 0.019 y 0.12 mg/100g de alimento.

De igual manera, Chandler L. (1987), indican que los vegetales verdes y frescos, son moderadamente altos en ß-caroteno (0,5-14,6 mg/100 g) y muy altos en xantofilas, principalmente luteina y sus 2,3 - esteroisómeros (63,0 g/100 g) y que la cocción reduce diferencialmente el contenido de los mismos.

Los carotenos y en especial, los beta-carotenos son capaces de inhibir la fotocarcinogénesis por radiación ultravioleta en animales, mediante un mecanismo de atrapamiento de oxígeno que disminuye la oxidación y ruptura de las cadenas de queratina del estrato córneo de la piel, e impide que dicha radiación penetre a capas más profundas y afecte las células diana (Di Mascio, 1992.)

El interés en el estudio de los carotenoides ha incrementado en salud pública a partir de la década de los 80 porque estudios epidemiológicos han asociado el consumo de vegetales crucíferos, especies y variedades del género Brassica, mostaza, brócoli, col, coliflor, col de brucelas y nabo, con la disminución de un 30 a un 50% en la incidencia de varios tipos de cáncer (Bushway, 1985).

El papel del β -caroteno en la prevención de enfermedades coronarias ha sido objeto de una serie de estudios que proporcionan unos datos a veces contradictorios, por lo que se postula que dicha prevención se debe más al consumo de alimentos ricos en β -caroteno que a dicho pigmento en particular. Por lo que respecta al efecto en el estatus antioxidante de fumadores, se ha comprobado que la suplementación con una combinación de β-caroteno y vitaminas C y E aumenta los niveles plasmáticos de antioxidantes y la actividad de enzimas antioxidantes en fumadores varones con hiperlipemia (Hof, 2000).

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Se ha demostrado que el retinol, el ß-caroteno, la ß-criptoxantina, zeaxantina, luteina, capsorulina, capsantina, el licopeno y el capsantol están involucrados en la protección de la mucosa gástrica a nivel celular También han sido propuestos como protectores contra los ataques cardíacos e inhibidores de úlceras (Bendich, 1989)

En trabajos similares Bushway (1986) destacan varios estudios que han demostrado la inhibición del cáncer en líneas celulares y la regresión de tumores en animales de laboratorio por los carotenoides. Inicialmente se atribuyó a los carotenoides con actividad de vitamina A, principalmente el µ y ß-caroteno Sin embargo, varias de estas frutas y vegetales contienen cantidades substanciales de xantofilas, carotenoides sin actividad vitamínica.

En un grupo de ancianos se compararon los niveles de carotenoides en sangre y la tasa de infecciones respiratorias, observándose menor incidencia de estas infecciones en aquellos que tenían más carotenoides. Universidad de Wageningen (Holanda) en el British Journal of Nutrition)

La mayoría de los estudios sobre la actividad antioxidante de los carotenoides se han llevado a cabo in vitro, aunque en los últimos años el número de ensayos in

vivo ha aumentado considerablemente. Aproximadamente un 26% y un 34% de la vitamina A consumida por hombres y mujeres, es proporcionada por los carotenoides provitamínicos

Como se puede observar, en la actualidad son muchos las investigaciones que se han realizado con respecto a las propiedades antioxidantes y antitumorales de los carotenoides, por lo que continuamente se están aportando nuevas evidencias al respecto. Cabe señalar que la mayoría de los estudios sobre la actividad antioxidante de los carotenoides se han llevado a cabo in vitro, aunque en los últimos años el número de ensayos in vivo ha aumentado considerablemente (Q. Su, 2002)

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I.2.2 JUSTIFICACION DEL TRABAJO DE INVESTIGACION

Guatemala se caracteriza por ser un país agrícola y muchas de las personas que viven en los departamentos y ciudad capital, consumen en su dieta diaria diversos vegetales, por lo cual es de vital importancia conocer los niveles de beta caroteno y luteína que se ingieren en los vegetales de consumo popular y con ello aprovechar los beneficios que cada uno de ellos aporta a la salud.

El estudio de los carotenoides es de vital importancia por sus diversas

propiedades y beneficios en la salud, su actividad como provitamina A, debido a su papel como antioxidantes, protección de problemas visuales, prevención de algunas enfermedades crónicas. Los carotenoides son un grupo muy importante de compuestos químicos que son sintetizados desde la primera etapa de formación de la mayoría de las frutas. También son biosintetizados por bacterias, algas, hongos y plantas, pero no por animales superiores; los cuales tienen que ingerirlos en los alimentos para acumularlos en su organismo.

Los carotenoides mayoritarios en los vegetales verdes son la luteína y beta caroteno. Pero la concentración de cada uno ellos, esta influenciada por el tipo de especie vegetal, las formas de cultivo y por las condiciones climáticas. Además estos son sensibles a la luz, el calor, el oxígeno, los ácidos y en algunos casos a los álcalis. Por esto es conveniente conocer la concentración de cada uno de ellos en diferentes especies vegetales y en diferentes épocas de cultivo (seca y lluviosa). El beta caroteno y la luteína, son pigmentos vegetales que una vez ingeridos, se transforman en el hígado y en el intestino delgado en forma de vitamina A, tienen además actividad antioxidante que inhibe la aparición del cáncer, especialmente en el pulmón, boca y estómago. Así como también en la prevención de enfermedades coronarias.

La extracción de los carotenoides con CO2 en estado supercrítico es

totalmente inocuo, en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico se convierte en un disolvente muy potente, sirviendo de elemento separador eficaz totalmente limpio. Sus principales ventajas radican en la fácil separación de sustancias; las bajas temperaturas en el proceso que permite no dañar al producto; ser un elemento no inflamable, no corrosivo, no tóxico, no cancerígeno; su capacidad selectiva y la no generación de residuos evitando la contaminación ambiental por diversos compuestos tóxicos.

La aplicación de esta técnica nos permitió separar de forma selectiva el beta

caroteno y luteína presentes en los vegetales de estudio: Acelga, espinaca, berro , brócoli y hierba mora. La cuantificación HPLC de éstos carotenoides en cada especie vegetal, nos permitirá recomendar el consumo en la dieta diaria de estos vegetales, logrando los beneficios que cada uno aporta a la salud en forma natural. Además con los resultados obtenidos en esta investigación se podrá darle un valor agregado a los diversos vegetales cultivados en nuestro país. Ofreciendo la oportunidad de comercializar la venta de beta caroteno y luteína en forma pura, que puede beneficiar la salud y economía de los agricultores que se dedican al cultivo de diversos vegetales estas especies de estudio y de otras que son fuente potencial de pro vitamina A.

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1.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS I.3.1 OBJETIVOS I.3.1.1 OBJETIVO GENERAL

Extraer con fluidos supercrítico la luteina y el beta caroteno en los vegetales: espinaca (Spinacia oleracea L), brócoli (Brassica oleracea var. Italica), hierba mora (Solanum nigrum), berro (Nasturtium officinales) y acelga (Beta

vulgaris var Cíclica)

I.3.1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

I.3.1.2.1 Separar por cromagrafía en columna los carotenoides: luteína y beta caroteno presentes en los extractos supercríticos de cada especie vegetal.

I.3.1.2.2 Cuantificar la luteina y el beta caroteno por cromatografía HPLC.

I.3.1.2.3 Establecer la variabilidad del contenido de luteina y beta caroteno en los diferentes periodos de cosecha (invierno y verano) de cada vegetal estudiado

I.3.1.2.4 Aprovechar el consumo de los carotenoides en forma natural para la salud y alimentación.

I.3.1.2.5 Obtener información a efecto de un mejor aprovechamiento de estos vegetales como suplemento alimenticio.

I.3.2 HIPOTESIS El contenido de los carotenoides luteína y beta caroteno en vegetales de consumo popular puede variar según la especie vegetal y la época de cosecha.

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1.4 METODOLOGIA I.4.1. Localización Las muestras frescas de los vegetales de estudio: espinaca, acelga, hierba mora, berro y brócoli, fueron colectadas en los campos de producción del departamento de Chimaltenango ubicado a 15° 38´ N y 90° 15´, altura 1800 msnm, precipitación media 1270 mm, temperatura mínima 10 °C, temperatura máxima 25 °C, temperatura promedio 15 °C, porcentaje de humedad 75 HR. I.4.2 Materiales y Reactivos I.4.2.1 Trabajo de campo

• Bolsas plásticas de 2, 5 y 20 lb • Etiquetas blancas de 10 x 10 cm • Marcador negro y boletas de campo • Tijera de podar y machete • Secador solar

I.4.2.2 Trabajo de laboratorio • Muestras vegetales, secas y molidas • Licuadora industrial • Cilindro de CO2 con 2000 psi de presión • Celda de extracción de acero inoxidable de 60cm de largo X 1 pulgada DI • Filtro de salida, uniones de acero inoxidable y teflón • Llaves de paso para alta presión de acero inoxidable (tipo aguja) • Manómetro con escala de 0 – 3000 psi • Tubo colector de 10 cm de largo por 1cm de DI • Chaqueta de calentamiento para celda de extracción • Frascos de vidrio color ámbar 50 ml y beackers • Columnas de vidrio con llave 50 ml de largo por 2 cm de DI • Micropipetas automáticas 0 – 50 µl • Columna cromatográfica Rp-18 • Acetato de etilo y etanol grado analítico • Metanol y Agua grado HPLC • Estándar de beta caroteno y luteina • Equipo de Extracción con fluidos supercríticos CO2 • Cromatógrafo Líquido, Shimadzu Prominence, con detector

UV/VIS/Fluorescencia

I.4.3 Periodo de trabajo de campo El trabajo de campo se realizo durante los períodos de cosecha de los vegetales de estudio.

I.4.4 Muestreo Las especies de estudio fueron colectadas en el departamento de Chimaltenango y sus alrededores en donde se cultivan durante todo el año con sistemas de semillero transplante. Los meses del primer muestreo fueron: octubre y noviembre. Los meses del segundo muestreo fueron: mayo y junio.

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Cuadro 1. CARACTERISTICAS

Localidad Especie obtenida

Altura msnm

Coordena-das

pp media mm

Temp. °C % HR

Zona de Vida

Sumpango, Sacatepéquez, Aldea Los Encuentros

Berro (Nasturtium

officinale R.Br.) Solanum

americanum L.

1800 15° 38´ N y 90° 15´

1270

10 °C a 25 °C,

promedio 15 °C

75

Bosque húmedo Montano bajo Subtropical

Parramos, Chimaltenango

Brassica

oleracea. var. Italica plench;

Spinacia

oleracea L

Beta vulgaris

L.var. cicla

(L).

1800 14° 34´N y 90° 48´W

1110 9 a 24 °C promedio

18 °C 80

Bosque húmedo Montano bajo Subtropical

Fuente: FODECYT 49-2006 En este cuadro se presentan las características generales de los puntos de muestreo y colecta de las diversas especies vegetales I.4.5 Colecta del material vegetal

Se colectaron aproximadamente 1 Kg de material fresco de las especies de estudio: Acelga, hierba mora, espinaca, berro y brócoli.

I.4.6 Secado del material vegetal I.4.6.1 Los vegetales frescos fueron trasladados al secador solar de la facultad

de Agronomía de la Universidad de San Carlos. I.4.6.2 Las hojas verdes de cada especie vegetal, se colocaron en forma dispersa

en diferentes zarandas durante cinco días. I.4.6.3 Los vegetales secos con humedad igual o menor al 10 %, se llevaron al laboratorio de fisicoquímica de la facultad de CCQQ y Farmacia, para su posterior tratamiento y preparación I.4.6.4 Cada especie vegetal fue molida con una licuadora industrial y fueron

pesados en una balanza semianalítica.

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I.4.7 Extracción Supercrítica con CO2 I.4.7.1 Diseño, Ajuste y calibración del equipo de fluidos supercrítico I.4.7.2 Colocar 40g de material vegetal molido en la celda de extracción

I.4.7.3 Adicionar 50 ml de cosolvente etanol grado analítico I.4.7.4 Sellar herméticamente el sistema con teflón y llaves de tubo I.4.7.5 Calentar la celda de acero inoxidable a 35 oC I.4.7.6 Abrir la llave de paso del CO2 del cilindro a presión estática I.4.7.7 Dejar reposar durante 30 minutos a 1300 Psi y 35 oC I.4.7.8 Despresurizar y abrir la llave de salida del CO2, de la celda de extracción

I.4.7.9 Colectar el extracto etanólico en recipiente de color ámbar de 125 ml.

I.4.8 Separación en Cromatografía en Columna I.4.8.1 Lavar una columna de vidrio de 25 cm de alto por 1 cm de diámetro I.4.8.2 Empacar con Sílica gel 60 G en húmedo, con acetato de etilo y acondicionar el sistema cromatográfico. I.4.8.3 Aplicar 1ml del extracto etanólico en la parte superior de la columna I.4.8.4 Adicionar fase móvil: acetato de etilo I.4.8.5 Colectar las fracciones 1 y 2 de color amarillo (luteína y betacaroteno) en frasco de vidrio color ámbar de 25 ml. I.4.8.6 Identificar por cromatografía en capa fina el beta caroteno y la luteína presentes en cada fracción (utilizando como fase móvil n-heptano).

I.4.9 Identificación y Cuantificación HPLC

I.4.9.1 Ajustar el cromatógrafo HPLC a una longitud de onda de 350 nm y temperatura de 35 oC, con una columna Altima Rp-18, 250mm X 4.6 mm y 5 um de diámetro del relleno.

I.4.9.2 Utilizando fase móvil agua:metanol (50:50) isocrática, inyectar 10 ul de estándar de betacaroteno y luteína

I.4.9.3 Registras las áreas y los tiempos de retención de los estándares

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I.4.9.4 Inyectar 10ul de cada fracción vegetal que contiene luteína y beta caroteno

I.4.9.5 Cuantificar por el área de cada pico para luteína y beta caroteno presentes en los vegetales de estudio.

I.4.9.6 La ecuación utilizada está fundamentada en la ley de Beer, A = Ebc.

A1 / Ebc = A2 / Ebc

Concentración partes por millón de cada extracto vegetal:

Con. (ppm) = Conc. Estándar X Area 2 X F.D / Area 1

Concentración mg / 100 g de cada extracto vegetal:

Conc. = Conc. (ppm) Ext.vegetal X Vol. Aforo X 100 /g vegetal seco

Donde: A1 = Area del estándar. A2 = Area del extracto vegetal

F.D = Factor de dilución

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PARTE II II.1 MARCO TEÓRICO II.1.1 Alimentos Funcionales

Los alimentos funcionales son aquellos que pueden proporcionar un beneficio

para la salud además de nutrición básica. Usted puede tener un mayor control de su salud a través de la selección de sus alimentos, si sabe que algunos proporcionan beneficios específicos para la salud. Algunos ejemplos de estos alimentos incluyen tanto a las frutas, verduras y vegetales. Los componentes biológicamente activos que están presentes en los alimentos funcionales proporcionan beneficios a la salud o efectos fisiológicos deseables. Usualmente son enriquecidos, bien añadiéndoles o bien desarrollando en ellos durante su procesado, diversos componentes naturales (antioxidantes, ciertos ácidos grasos, carotenoides, fibras, sabores, etcétera) que se consideran beneficiosos para la salud. En sus etiquetas puede resaltar el distintivo "sin aditivos artificiales" y, lógicamente, es coherente con este concepto el que los ingredientes naturales añadidos se hayan obtenido del modo posible más limpio y respetuoso hacia el medio ambiente. Ello es difícil de lograr con los métodos fisicoquímicos tradicionales. Para conseguirlo, la tecnología de los fluidos supercríticos puede constituir una ayuda inestimable. (Francis, 1995)

II.1.2 Beneficios de los carotenoides para la salud

Los carotenoides previenen enfermedades degenerativas como aterosclerosis, cáncer, envejecimiento, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, etc. El papel protector para las células humanas frente a la radiación ultravioleta de diversos antioxidantes como β -caroteno, α-tocoferol y ácido ascórbico ha sido evaluado, llegándose a la conclusión de que el primero es el más eficiente, probablemente debido a su localización en la membrana celular . Luteína y zeaxantina, dos de los carotenoides mayoritarios en el suero humano, se localizan en cantidades apreciables en la retina, protegiéndola debido a sus propiedades antioxidantes (Krinsky, 1989).

Hay estudios que relacionan la aparición de algunos tipos de cáncer con la carencia de ciertos carotenoides en la dieta, por lo que son considerados compuestos anticancerígenos. Varias investigaciones epidemiológicas han mostrado que el riesgo de padecer cáncer es inversamente proporcional al consumo de vegetales y frutas ricos en carotenoides (Bendich, 1989)

Se ha demostrado una relación inversa entre el consumo de alimentos ricos en luteína (como espinaca o lechuga) y el cáncer de colon, tanto en hombres como en mujeres. La protección de los pigmentos carotenoides frente al cáncer y a otras enfermedades crónicas podría deberse a otros efectos como la inhibición de la proliferación de células, mejora de la diferenciación celular, estimulando la comunicación intercelular y filtración de la luz azul, entre otros.

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Un interesante ensayo en el que participaron voluntarios de cinco países, ha descubierto que la suplementación con carotenoides no implica un aumento de la resistencia de las lipoproteínas de baja densidad frente a la oxidación; no obstante, los resultados de dicho ensayo demostraron que el consumo de frutas y verduras ricas en carotenoides sí implicaba un aumento de resistencia frente a los procesos oxidativos. De igual forma se observó que el incremento de los niveles plasmáticos de carotenoides estaba asociado con un menor daño del ADN y una mayor actividad reparadora (Di Mascio, 1991)

Hay estudios que relacionan la aparición de algunos tipos de cáncer con la carencia de ciertos carotenoides en la dieta, por lo que son considerados compuestos anticancerígenos. Varias investigaciones epidemiológicas han mostrado que el riesgo de padecer cáncer es inversamente proporcional al consumo de vegetales y frutas ricos en carotenoides. En un estudio reciente, se ha demostrado una relación inversa entre el consumo de alimentos ricos en luteína (como espinaca o lechuga) y el cáncer de colon, tanto en hombres como en mujeres. La protección de los pigmentos carotenoides frente al cáncer y a otras enfermedades crónicas podría deberse, además de a sus propiedades antioxidantes, a otros efectos como la inhibición de la proliferación de células, mejora de la diferenciación celular, estimulación de la comunicación intercelular y filtración de la luz, entre otros (Goodwin, 1980).

II.1.3 Estructura química de los Carotenoides

Químicamente la mayoría de los carotenoides son tetraterpenoides, compuestos de 40 átomos de carbono formados por ocho unidades isoprenoides unidas de forma que la secuencia se invierte en el centro de la molécula. Es decir, la unión de dichas unidades es "cabeza-cola", excepto en el centro de la molécula, donde es "cabeza-cabeza". Debido a ello, los dos grupos metilo centrales de la cadena poliénica están separados por seis átomos de carbono, mientras que el resto están separados por cinco. Algunos carotenoides son acíclicos, si bien la mayoría contienen anillos a uno o ambos extremos de la molécula.

Considerando los elementos químicos presentes en sus moléculas, los carotenoides pueden dividirse en dos grandes grupos: carotenos, que son hidrocarburos, y xantófilas, que contienen átomos de oxígeno. Éste puede estar presente en forma de grupo hidroxilo (zeinoxantina, lactucaxantina, etc.), metoxilo (esferoidenona, espiriloxantina, etc.), epóxido (anteraxantina, licopeno-1,2-epóxido, etc.), carbonilo (capsantina, esferoidenona, etc.) o carboxilo (norbixina, neurosporaxantina, etc.), principalmente . Otros grupos oxigenados presentes en carotenoides son acetatos (fucoxantina, dinoxantina, etc.), lactonas (peridinina, uriólido, etc.) y sulfatos (caloxantina-3-sulfato, nostoxantina-3-sulfato, etc.) (Francis, 1995).

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Estructuras de algunos CarotenosEstructuras de algunos CarotenosEstructuras de algunos CarotenosEstructuras de algunos Carotenos

ββββ----caroteno: caroteno: caroteno: caroteno: Tiene dos grupos

cíclicos ionona unidos por una cadena con 9 enlaces conjugados. Es de color amarillo. La ruptura del centro de la cadena da como resultado dos vitaminas A. Se encuentra en vegetales verdes, en la zanahoria, etc.

αααα----carotenocarotenocarotenocaroteno: : : : Tiene dos grupos

cíclicos de ionona, uno y otro unidos por una cadena con 9 enlaces conjugados. Es de color amarillo. La ruptura del centro de la cadena da como resultado una vitamina A. Se encuentra en vegetales verdes, zanahorias, etc. LicopenoLicopenoLicopenoLicopeno: : : : No tiene anillos, pero

posee 11 enlaces conjugados. Es de color rojo. No posee actividad de vitamina A. Tiene actividad antioxidante. Se encuentra en los tomates.

Caroteniodes: XantofilasCaroteniodes: XantofilasCaroteniodes: XantofilasCaroteniodes: Xantofilas luteina: luteina: luteina: luteina: Tiene dos grupos cíclicos de

ionona oxidados unidos por una cadena con 9 enlaces conjugados. Es de color amarillento. No posee actividad de vitamina A. Es uno de los pigmentos oculares, protege a los ojos de la radiación ultravioleta. Se la encuentra en vegetales con hojas verdes.

Criptoxantinas: Criptoxantinas: Criptoxantinas: Criptoxantinas: Tienen dos grupos

cíclicos de ionona, uno de ellos oxidado, unidos por una cadena con 9 enlaces conjugados. Son de color amarillo. La ruptura del centro de la cadena en la -criptoxantina da como resultado una vitamina A. Se encuentran en el maíz amarillo. zeazeazeazeaxantina: xantina: xantina: xantina: Tiene dos grupos

cíclicos de ionona oxidados unidos por una cadena con 9 enlaces conjugados. Es de color amarillento. No tiene actividad como vitamina A. Es uno de los pigmentos oculares, y tiene actividad antioxidante.

(Francis, 1995)

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II.1.4 Distribución de Carotenoides en los Alimentos

Los pigmentos carotenoides están ampliamente distribuidos entre los seres vivos, en especial en los vegetales es en donde se encuentran en mayor concentración y variedad, aunque también se encuentran en bacterias, algas y hongos, así como en animales, si bien éstos no pueden sintetizarlos. Se estima que en la naturaleza se producen anualmente más de 100.000.000 de toneladas de carotenoides. La mayor parte de esta cantidad se encuentra en forma de fucoxantina (en diversas algas) y en los tres principales carotenoides de las hojas verdes: luteína, violaxantina y neoxantina (Brusway, 1986)

La distribución de carotenoides entre los distintos grupos de plantas no presenta un patrón único. En verduras, el contenido en carotenoides sigue el modelo general de los cloroplastos de todas las plantas superiores, siendo generalmente luteína, β -caroteno, violaxantina y neoxantina, en este orden, los mayoritarios . En pequeñas cantidades se encuentran zeaxantina, β -caroteno, β -criptoxantina y anteraxantina. En frutos, las xantofilas suelen encontrarse en mayor proporción, aunque en algunos casos, los pigmentos mayoritarios son carotenos, como es el caso del licopeno del tomate. A veces, en ciertos frutos ocurre que algún carotenoide, además de ser mayoritario, se limita a una sola especie de plantas. Capsantina y capsorrubina se encuentran casi exclusivamente en frutos del género Capsicum y son los principales pigmentos que dan color al pimiento rojo. Hay que tener en cuenta que el patrón de carotenoides en un mismo fruto varía en función de factores como la variedad y las condiciones climáticas, entre otros (Olga, 1997)

En los animales, los carotenoides son incorporados a través de la dieta y se almacenan en el tejido adiposo sin transformarse. La yema del huevo debe su color a dos xantofilas, luteína y zeaxantina, y a trazas de β-caroteno, mientras que la astaxantina es responsable del color rosado de la carne del salmón . En ocasiones, algunos carotenoides como la astaxantina, se unen a proteínas originando unos compuestos conocidos como carotenoproteínas, lo cual ocurre en algunos crustáceos. Las carotenoproteínas confieren a estos animales colores verdosos o azulados, si bien cuando estos complejos se desnaturalizan durante el cocinado se pone de manifiesto el color rojo del carotenoide (Hof, 2000).

II.1.5 Importancia de los Carotenoides en la Dieta

Además de la contribución de los carotenoides al color atractivo de las frutas y verduras, destaca, por su importancia a nivel fisiológico y dietético, la propiedad de algunos de ellos de tener actividad como provitamina A.

La vitamina A es esencial para la visión nocturna y necesaria para mantener sanos la piel y los tejidos superficiales. Puede aportarse como tal vitamina, llamada retinol, como algunos análogos menos activos, o como sus precursores, los carotenoides. El retinol es un alcohol cíclico, insaturado, de veinte átomos de carbono, compuesto por un núcleo de β-ionona y una cadena lateral insaturada. En la molécula de retinol existen cinco dobles enlaces conjugados, incluido el doble enlace del anillo de β-ionona que está conjugado con los de la cadena lateral (Olson, 1992).

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Figura. 1 Estructura del retinol

(CRC, 1988)

No todos los carotenoides son precursores de la vitamina A, por lo que podemos dividirlos en dos grandes grupos: provitamínicos y no provitamínicos. El número de carotenoides precursores de vitamina A oscila entre 50 y 60, destacando los carotenos (α -,β - y γ-caroteno) y algunas xantofilas (β -criptoxantina) .

La capacidad de los carotenos para actuar como provitamina A depende de la conversión en retinol, así como de la presencia de β-ionona. Los carotenos que contienen como mínimo un anillo de β-ionona pueden convertirse en retinol en los animales. De esta forma, el carotenoide más importante al respecto es el β -caroteno, que contiene dos de estos anillos. El α - y el γ -caroteno, no pueden convertirse en retinol en los animales con la misma eficacia que el β -caroteno, ya que el anillo ε del α -caroteno no puede convertirse en el organismo en γ -ionona, y la estructura abierta de la cadena del γ -caroteno no puede hacerse cíclica en los animales. Es por ello que el α -caroteno y el γ -caroteno se transforman en retinol con la mitad de eficiencia que el β-caroteno. La actividad biológica del anillo de β-ionona en los carotenos disminuye por la introducción de un grupo hidroxilo (Molina, 1997)

II.1.6 Niveles de Ingesta y Recomendaciones

La actividad provitamínica A de algunos carotenoides, como α -caroteno, β -caroteno y β -criptoxantina, está ampliamente demostrada, como ya se ha comentado con anterioridad, por lo que en las ingestas recomendadas de vitamina A se consideran estos carotenoides provitamínicos. Las ingestas recomendadas de los carotenoides provitamínicos están expresadas como equivalentes de retinol (ER) (1 equivalente de retinol = 1 µ g de retinol = 12 µ g de β -caroteno = 24 µ g de α -caroteno = 24 µ g de β -criptoxantina). Se ha estimado que el consumo medio de vitamina A oscila entre los 744 y 811 equivalentes de retinol por día en los hombres y los 530 y 716 equivalentes de retinol por día en las mujeres. Considerando equivalentes de retinol, se estima que aproximadamente un 26% y un 34% de la vitamina A consumida por hombres y mujeres, respectivamente, es proporcionada por los carotenoides provitamínicos (West, 2000)

Por otro lado, las observaciones epidemiológicas parecen indicar que el consumo de alimentos ricos en carotenoides está relacionado con un menor riesgo de padecer enfermedades crónicas. Sin embargo, estas evidencias no son suficientes para establecer requerimientos para estos compuestos, ya que los efectos observados podrían deberse a otros compuestos presentes en alimentos ricos en carotenoides. No obstante se recomienda aumentar el consumo de frutas y vegetales ricos en estos pigmentos (Ramos, 1987).

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II.1.7 Estabilidad de los carotenoides

Los carotenoides son pigmentos estables en su ambiente natural, pero cuando los alimentos se calientan, o cuando son extraídos en disolución en aceites o en disolventes orgánicos, se vuelven mucho más lábiles. Así, se ha comprobado que los procesos de oxidación son más acusados cuando se pierde la integridad celular, de forma que en alimentos vegetales triturados, la pérdida de compartimentación celular pone en contacto sustancias que pueden modificar estructuralmente, e incluso destruir los pigmentos. No todos los tipos de cocinado afectan en la misma medida a los carotenoides, de forma que la pérdida de estos pigmentos aumenta en el siguiente orden: cocinado con microondas < cocinado al vapor < hervido < salteado (Caballero, 1995).

Los carotenoides, excepto algunas excepciones, son insolubles en agua y por lo tanto las pérdidas por lixiviación durante el lavado y procesamiento de frutos son mínimas. Otros tratamientos empleados en las industrias alimentarias, como por ejemplo el tratamiento a alta presión, parecen no afectar significativamente a los niveles de carotenoides en diversos productos vegetales. El proceso industrial de los alimentos puede producir pérdidas de carotenoides, si bien la inactivación enzimática que produce previene pérdidas posteriores durante el procesado y almacenamiento. En cambio, la congelación, la adición de antioxidantes y la exclusión del oxígeno (vacío, envases impermeables al oxígeno, atmósfera inerte) disminuyen las pérdidas durante el procesado y almacenamiento de los alimentos (CRC, 1988).

La destrucción de estos pigmentos reduce el valor nutritivo de los alimentos e induce una decoloración y una pérdida de sus características organolépticas. El grado de decoloración va a depender fundamentalmente de la presencia de agentes oxidantes en el medio (sobre todo oxígeno molecular) y de que se comunique energía suficiente para que la reacción de degradación tenga lugar. La energía se aporta en forma de luz o calor. La reacción de decoloración supone la pérdida de conjugación de la molécula y, en principio, no tiene por qué implicar la rotura del esqueleto hidrocarbonado, por lo que cualquier factor capaz de interrumpir la deslocalización electrónica existente, podría producir pérdida de color. Si las condiciones oxidantes son débiles y la energía suministrada no es suficiente, se vuelve a restaurar el orbital molecular con la posibilidad de que la estructura adopte la configuración cis o trans, en función de que haya habido rotación en el enlace. Si las condiciones son muy severas, el grado de degradación progresa, fragmentándose entonces el pigmento. (Chandler, 1987).

II.1.8 Propiedades Físico Químicas de los Carotenoides

Los carotenoides son compuestos lipídicos, aunque existen algunas excepciones, por lo que son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos como acetona, metanol, éter dietílico, hexano, cloroformo y piridina, entre muchos otros. Debido a su carácter hidrofóbico se encuentran normalmente en ambientes lipófilos, como en membranas, si bien su asociación con proteínas o reacciones de glicosilación les permiten también estar presentes en medios acuosos (CRC, 1988).

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Los carotenoides ácidos pueden formar sales sódicas o potásicas solubles en agua por tratatamiento con álcali, como es el caso de bixina, astaceno o mitiloxantina Las carotenoproteínas son también solubles en agua y muy estables.

El color de estos complejos es estable durante años a temperatura ambiente y en contacto con el aire, por lo que tienen un gran interés como posibles colorantes. El carácter hidrofóbico de la mayoría de los carotenoides hace que tiendan a la agregación y cristalización en medio acuoso, siendo un ejemplo típico los cristales de licopeno en los cromoplastos de los tomates. Los puntos de fusión son elevados, generalmente comprendidos en el rango 130-220°C y la solubilidad de los cristales generalmente pequeña, siendo mejor en disolventes orgánicos clorados y en benceno (Minguez, 1993).

El color característico de los carotenoides se debe a la deslocalización de los electrones a lo largo de la cadena hidrocarbonada insaturada. La absorción de luz produce el paso de la molécula de su estado energético basal a otro de mayor energía llamado estado excitado. En el caso de los carotenoides, la transición electrónica se produce de orbitales de enlace a orbitales antienlazantes. La molécula en estado excitado no posee un alto contenido energético, de ahí que la energía de la radiación visible sea normalmente suficiente para que se produzca el salto electrónico. La asociación de carotenoides con proteínas estabiliza a los pigmentos además de extender el rango de colores a verde, azul y púrpura. Analíticamente, el color de los carotenoides es de gran importancia, ya que un cambio de color durante el análisis es indicativo de degradación o de modificación estructural de los pigmentos. De igual forma, el color permite monitorizar su separación mediante cromatografía en columna y en capa fina (Rodriguez, 1976)

ΙΙΙΙΙΙΙΙ....1111....9999 β β β β-Caroteno

El β caroteno fue el primer carotenoide purificado. En 1831, Wackenroder lo aisló en forma cristalina a partir de la zanahoria, dándole el nombre que lleva, derivado de la denominación latina de este vegetal (Daucus carota). Su abundancia en los vegetales y también en algunos alimentos animales, como la leche, hace de él una fuente fundamental de vitamina A para muchísimas personas. Los carotenoides representan alrededor del 30% de la ingesta total de vitamina A. Son ricas en β caroteno la zanahoria, que contiene entre 70 y 140 mg/kg. En los vegetales verdes el β caroteno se encuentra en los cloroplastos, junto con xantofilas, y suele ser el carotenoide mayoritario.

El β-caroteno se emplea como colorante alimenticio. Al ser insoluble en agua, no es fácil de utilizar, por ejemplo para colorear bebidas refrescantes, una de sus principales aplicaciones. En este caso, se utiliza en forma de polvo extremadamente fino, en partículas de alrededor de 0.4 micras de diámetro, que se puede dispersar en el agua, con la ayuda de un polisacárido como la goma arábiga. Se obtiene actualmente por sínstesis química, o bien por cultivo de Dunaliella salina, un alga microscópica que prolifera en aguas con concentraciones muy elevadas de sal (Molina, 1997)

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II.1.9.1 Propiedades del Beta Caroteno:

Los betacarotenos son precursores de la vitamina A. Son pigmentos vegetales de color amarillo o naranja que al ser ingeridos, se transforman en el hígado y en el intestino delgado en vitamina A. Son antioxidantes que favorecen la no aparición del cáncer, especialmente de pulmón, boca y estómago. Además de su función preventiva, se ha comprobado que pueden, inhibir el crecimiento de células cancerosas, entre ellas la de próstata. Estudios comparativos han puesto de manifiesto que el índice de cánceres en personas que realizan una alimentación vegetariana, rica en beta carotenos, es menor que en los no vegetarianos. Sin embargo se ha visto como el uso de suplementos de este elemento puede aumentar los cánceres de pulmón entre los fumadores, un proceso que no se han podido demostrar científicamente, aunque se sospecha que la falta de oxígeno en los pulmones de los fumadores pueda ser la razón que el beta caroteno se comporte más como un oxidante que un antioxidante. También se ha demostrado que previene la aparición de enfermedades del corazón. Por sus propiedades antioxidantes contribuye a que se formen menos depósitos en las arterias, por lo que favorecen la circulación e impiden la formación de trombos. El beta caroteno ayuda al sistema inmune al aumentar el numero de linfocitos, tal como se ha visto en los estudios realizados con enfermos de SIDA, o al aumentar su respuesta frente a los antígenos o cuerpos extraños que podrían perjudicar al organismo (Bendich, 1989).

Se ha demostrado su papel en la prevención de las cataratas y su efecto beneficioso en procesos inflamatorios y en los relacionados con el envejecimiento. Alimentos ricos en beta-caroteno: Verduras de color verde o coloración rojo-anaranjado-amarillento (zanahoria, espinacas, brócoli, calabaza, tomate, etc.), y ciertas frutas (albaricoques, cerezas, plátanos, melón y durazno) el beta-caroteno es especialmente bueno para suprimir en cada molécula él oxigeno, ayuda a prevenir las cataratas al eliminar los radicales libres, antes de que puedan lesionar al cristalino del ojo, previenen la oxidación de la LDL (� spectrofoto de baja densidad) que ayuda a mantener los niveles normales de colesterol y reduce el riesgo de desarrollar aterosclerosis y enfermedades coronarias (Janice, 1986)

II.1.9.2 Dosis y Toxicidad

La dosis más frecuente de beta caroteno como suplemento es de 25,000 UI (15 mg) al día, aunque algunas personas llegan a tomar hasta 100,000 UI (60 mg) al día. La toxicidad de los carotenoides es baja, una ingesta alta de ellos produce pigmentación de la piel parecido a la ictericia. Sin embargo, la hipercarotemia no produce pigmentación de las escleras en los ojos.

Un exceso de betacaroteno lleva a un estado de hipercarotenodermia, que se caracteriza por una coloración amarillenta de la piel, especialmente en las palmas de las manos y en las plantas de los pies, que es inocua y desaparece sin secuelas cuando se deja de ingerir alimentos ricos en betacarotenos. Este complemento no debería suministrarse a los fumadores. Por sus interacciones con otros medicamentos se aconseja consultar primero al médico. El betacaroteno se puede ingerir a partir de suplementos, con dosis usuales de 2 a 15 mg diarios, tomados en forma de cápsulas o tabletas. (Mercadante, 1989).

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II.1.10 Carotenos y Vitamina A

Cuando fue descubierta la vitamina A, se le llamo el “agente antiinfeccioso” Es una vitamina liposoluble que combate las infecciones y las enfermedades, forma barreras de primera línea ayudando al tejido epitelial del organismo a crecer y repararse a sí mismo. Sin suficiente vitamina A, estas células se vuelven rígidas, secas y con probabilidad de bajar la guardia favoreciendo la entrada de gérmenes al organismo.

El organismo constantemente remplaza las células viejas y gastadas por otras nuevas y se necesita la vitamina A para producir células sanas de reemplazo. La única forma de obtenerla era por medio de alimentos de origen animal como el huevo, el hígado, pollo, leche y productos lácteos que contienen retinoles de forma natural pero luego se descubrieron otra manera de obtener esta vitamina y fue comiendo alimentos de origen vegetal que contengan carotenos. Los carotenos pertenecen a la familia de los carotenoides de los vegetales. El organismo es capaz de transformarlo en vitamina A en el intestino delgado. Posee conjuntamente las propiedades de la vitamina A y de los antioxidantes que actúan sobre los radicales libres (Olson, 1992).

II.1.11 Vitamina A y su Deficiencia

Es una de las primeras vitaminas liposoluble que fue reconocida en el año 1913. Los compuestos que dan lugar a la formación de retinol, se les llama provitaminas A, el más activo de estos compuestos es el beta caroteno, el cual es un dímero de retinol. Esta vitamina se considera esencial, cuya dosis diaria se estima en unas 4000 - 5000 UI. Dosis más elevadas, sobre unas 25,000 UI, de manera continuada pueden resultar tóxicas, produciendo hipervitaminosis, que se manifiesta en forma de debilidad muscular, visión borrosa, perdida del cabello, mal estado de la piel, diarrea ..etc. Por otra parte una falta de este elemento produce ceguera nocturna, fatiga, dientes o piel en mal estado, mayor facilidad a contraer infecciones. La vitamina a es necesaria para la salud de las membranas mucosas, formación correcta de los huesos y dientes, el buen estado de la piel, de la vista, para la formación de los glóbulos rojos, y para reparar los accidentes que sufren los tejidos corporales.

Su deficiencia produce: Ceguera nocturna, xeroftalmia, pérdida de la integridad de las membranas mucosas debido a deficiencia de vitamina A aumentar la susceptibilidad de infecciones, se producen cambios en la piel como hiperkeratosis folicular en la cual el bloqueo de los folículo pilosos con keratina produce la piel de pollo, piel seca y gruesa, al inicio se afectan los brazos y muslos, pero luego se puede afectar todo el cuerpo (Ramos, 1987).

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II.1.12 Luteína

La luteína se encuentra en muchos vegetales, como: espinaca, brócoli, aunque su color está enmascarado por el de la clorofila. Junto con la zeaxantina, es el carotenoide responsable del color de la yema de huevo. La luteína tienen dos grupos hidroxilo, pero en los alimentos se encuentra generalmente en forma no esterificada. En los pétalos de algunas flores, como Tagetes erecta, en los que es muy abundante, se encuentra como mono o di ésteres de los ácidos palmítico o mirístico. Aunque no tienen actividad como vitamina A, la luteína y la zeaxantina se acumulan en la retina del ojo, donde absorben la luz de la zona azul del espectro. Se ha indicado que protege de la enfermedad conocida como degeneración macular, y se vende como “suplementos dietéticos” (Francis, 1995).

II.1.12.1 Propiedades de la luteína

La luteína es un pigmento liposoluble de color amarillento que aparece en algas, bacterias y plantas superiores. Protege la planta contra la radiación solar. Esta misma propiedad resulta eficaz para proteger la retina humana de las radiaciones ultravioleta del sol. La luteína es un pigmento que ya aparece de una forma natural en la retina, junto con la zeaxantina. La conservación de este pigmento es el que permite el filtrado de los rayos ultravioleta del sol, impidiendo la formación de muchas enfermedades, entre ellas la degeneración macular, o perdida de la visión, que es un trastorno de la visión caracterizado por la perdida de la agudeza, como consecuencia de la degeneración que se produce en la mácula o parte central de la retina. Se ha demostrado que niveles altos de estos componentes en la retina defienden la vista contra las catarata. Ambos pigmentos parecen también proteger al organismo contra la aparición de ciertas formas de cáncer (Bendich, 1989).

La luteína protege la vista de dos maneras diferentes: una es por su efecto antioxidante (la parte externa de la retina es rica en ácidos poliinsaturados que son atacados por los radicales libres y sufren un proceso de oxidación debido a la incidencia de la luz en esta área) actuando como un filtro de luz, protegiendo la vista de algunos de los efectos dañinos del sol. Una de sus propiedades más estudiadas es la protección de la retina ocular llamada mácula que es donde el ojo tiene mayor agudeza visual. La Luteína nos ayuda, contra la degeneración macular y en la prevención o tratamiento de las cataratas. Protege la piel de la radiación solar gracias a su efecto antioxidante (Calvo, 2000).

II.1.12.2 Dosis y Toxicidad de la luteína

Tomada como complemento para el tratamiento de problemas oculares, su dosis se establece entre los 6 y los 11 mg diarios. Cuando forma parte de un complemento dietético mixto, suele aparecer en dosis de 0,5 mg diarios. Este suplemento debe tomarse junto con las comidas para mejorar su absorción. No deberían de tomar suplementos de luteína las mujeres embarazadas o lactantes, aunque resulta conveniente adquirir este compuesto a través de los alimentos. A parte de la ingestión de los vegetales anteriormente mencionados, se encuentra en una cantidad considerable en la yema del huevo. Este carotenoide no se transforma en vitamina A (West, 2000).

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II.1.13 Cromatografía de Fluidos Supercrítico

Un fluido supercrítico es cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico. La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una técnica híbrida entre la cromatografía de gases y la cromatografía HPLC, que combina lo mejor de ambas técnicas. Esta técnica es importante porque permite la separación de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no pueden ser separados por GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su detección por HPLC.

La extracción supercrítica es una técnica que permite extraer componentes de matrices complejas. La técnica está basada en las extraordinarias propiedades que adquieren algunos fluidos en condiciones de presión y temperatura próximas al punto crítico (Edgar, 1994).

II.I.13.1 Extracción Supercrítica con CO2

La extracción con fluidos supercríticos es una técnica de separación de sustancias disueltas o incluidas dentro de una matriz, basada fundamentalmente en la capacidad que tienen determinados fluidos en estado supercrítico (FSC) de modificar su poder disolvente. El poder disolvente de los FSC puede ser elevado, dependiendo de las condiciones de presión y temperatura aplicadas que permiten la disolución selectiva de sustancias determinadas en el FSC. Las sustancias seleccionadas se separan fácilmente del fluido supercrítico. La extracción se realiza sin cambios de fase, simplemente variando las condiciones de presión y/o temperatura de los FSC.

La técnica de extracción con CO2 supercrítico utiliza como disolvente de extracción el gas carbónico comprimido (hasta 300 veces la presión atmosférica) a temperatura moderada (aproximadamente 30°C). Al final de la extracción, una fase de reposo (por bajada de la presión) provoca el paso del gas carbónico del estado supercrítico al estado gaseoso, lo que permite que este se elimine completamente del extracto obtenido. El hecho de trabajar a baja temperatura permite que no se desnaturalicen los principios activos del extracto obtenido, que están muy próximos a la materia prima vegetal. Esto permite obtener extractos 100% naturales libres de residuos de disolventes de extracción.

La densidad de los FSC puede ser modificada de forma continua; por tanto, también lo puede ser su poder disolvente, simplemente variando moderadamente la presión y/o la temperatura, dado que en el proceso no se producen cambios de fase.

La transferencia de materia de los FSC es elevada, lo cual permite una extracción rápida y eficaz del extracto de su matriz. Ésta viene definida por dos propiedades, que son la viscosidad y la difusividad (Vega, 1996).

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II.1.13.2 Instrumentación

Debido a las características de la fase móvil (alta presión y temperatura) se emplean equipos parecidos a los de HPLC, con varias diferencias: el empleo de un horno termostático para poder controlar con precisión la temperatura de la fase móvil y el uso de un restrictor, empleado para mantener la presión en el interior de la columna y para bajar la presión a la salida para que el fluido supercrítico pase al estado gaseoso y pueda ser detectado el analito.

A diferencia de la cromatografía de gases, en la SFC no se aumenta la velocidad de elusión modificando la temperatura, sino la presión del fluido supercrítico. El aumento de presión, al aumentar la densidad, permite una mayor interacción del analito con la fase móvil y disminuyen los tiempos de elusión. Se suele emplear en las elusiones una primera etapa isobárica para luego aumentar la presión lineal hasta el final de la elusión (Erdogan, 1993).

II.1.13.3 Fases estacionarias y Móviles

Se pueden emplear, al igual que en la GC, las columnas capilares o de relleno, prefiriéndose las primeras. Las dimensiones son parecidas en longitud, de 10 a 20 m, y el diámetro interno es bastante menor, de 0,05 a 0,10 mm. La película interna es de siloxano entrelazado y polimerizado. Si se emplean columnas de relleno, su diámetro interno varía entre 0,5 y 4,6 mm, y el grosor de la partícula de relleno es de 3 a 10 µm. En este caso, el recubrimiento es parecido al empleando en HPLC de reparto.

La fase móvil en SFC es el dióxido de carbono, por sus excelentes propiedades: apolar, transparente en la región UV, inodoro, no tóxico, bajo costo y no inflamable. El CO2 en estado supercrítico (CO2SC), representan una alternativa prometedora al uso de los solventes orgánicos en procesos industriales. Entre sus ventajas destacan su poder de solvatación de liposolubles, la facilidad de ajustar la densidad del solvente por variaciones simples de presión y temperatura, así como su recuperación facilitada por despresurización y recompresión. Adicionalmente, el CO2 es un gas no tóxico, no inflamable, propiedades que lo favorecen al compararlo con los solventes orgánicos. Por sus ventajas, la tendencia hacia un mayor uso industrial del CO2SC como fase móvil es clara. Otras fases móviles también probadas y empleadas son el etano, pentano, dietiléter, amoniaco, tetrahidrofurano, diclorofluorometano y óxido nitroso (Skoog, 2001).

II.1.13.4 Ventajas de la Extracción Supercrítica

Las bases tecnológicas de la extracción supercrítica fueron diseñadas hace unos 30 años. Sus propiedades más sobresalientes son versatilidad, selectividad, alto respeto medioambiental, posible procesado en condiciones de temperatura baja y ausencia de alteraciones químicas, permitiendo obtener productos de alta calidad, con sus propiedades naturales intactas, exentos de residuos de disolventes. La eliminación del disolvente, para aislar el ingrediente puro extraído, es simple; basta reducir la presión y el fluido supercrítico se convierte en gas que se evaporará espontánea y totalmente. La adición de otros componentes, como acetato de etilo, al dióxido de carbono suele extender su grado de aplicabilidad (Skoog, 2001).

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II.I.13.5 Aplicaciones de la Extracción con fluidos supercríticos

La industria agroalimentaria está buscando la mejor técnica de separación para obtener extractos naturales de gran pureza, que son utilizados en una gran diversidad de aplicaciones; al mismo tiempo es necesario garantizar que tanto los productos extractados como los extractos en sí no provoquen riesgos para la salud pública y que sean de excelente calidad. Las tecnologías actuales para la obtención de extractos alimentarios generalmente utilizan disolventes orgánicos, que comportan un riesgo debido a su toxicidad, a su poder inflamable y a los residuos que generan. Por este motivo, se están desarrollando nuevas tecnologías más respetuosas con el medio ambiente, que no representan ningún riesgo para la salud y garantizan una calidad superior de los productos.

La extracción con CO2 supercrítico se utiliza a escala comercial en la obtención del lúpulo para la elaboración de cerveza, la obtención de aromas y sabores de especias y hierbas aromáticas, y café y té sin cafeína. Además, varios procesos se encuentran en fase de expansión, como son la obtención de bebidas sin alcohol, productos animales sin colesterol y aceites de semillas (Erdogan, 1993)

II.1.14 Cromatografía Líquida de Alta Resolución ( HPLC)

Es el método moderno de la cromatografía líquida, que utiliza partículas de fase estacionaria para el interior de la columna con diámetros muy pequeños para aumentar la eficiencia, en torno a 3-10 µm. Así, se ha logrado reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de diámetro en la cromatografía HPLC, y el tiempo necesario para la separación a minutos.

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Esta técnica cromatográfica, consiste en la separación física de sustancias entre una fase estacionaria y una móvil. En este caso la fase estacionaria es un material de partículas pequeñas que se encuentran empacadas dentro de una columna de acero inoxidable de diámetro interno uniforme. La columna es reutilizable, y por lo compacto de la fase estacionaria, la fase móvil requiere de presiones altas para que fluya por ella (Yost, 1980)

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. Existen varios tipos de cromatografía HPLC:

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a) Cromatografía de fase normal: Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basándose en la polaridad. Este método usa una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito y la interacción entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elución. La fuerza de interacción depende no solo de los grupos funcionales, sino también de factores estéricos e isómeros estructurales. El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retención, mientras que disolventes hidrófobos aumentan el tiempo de retención. Algunos solutos polares interaccionan con la fase estacionaria y desactivan la columna. b) Cromatografía de fase reversa: Este tipo de HPLC es el más común. En esta técnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase móvil moderadamente polar. La fase estacionaria típica es silicio tratado con distintas cadenas de hidrocarburos. La adición de disolventes polares incrementa el tiempo de retención y añadir disolventes hidrofóbicos lo disminuyen. El tiempo de retención es mayor para moléculas no polares. El principio básico de este método esta basado en las interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no polar. Las características del analito son importantes para sus propiedades de retención. Las moléculas muy grandes pueden causar que la interacción no sea completa. El tiempo de retención aumenta con el área hidrofobicidad, que es inversamente proporcional al tamaño del soluto. Los componentes ramificados eluyen más rápido porque el área total esta disminuida.

Hay otros modificadores de la fase móvil que afectan a la retención del analito. Añadir sales inorgánicas causa incremento lineal en la tensión superficial de soluciones acuosas, incrementando el tiempo de retención. El pH también es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso se suele usar un buffer como fosfato sódico para controlar el pH. Un ácido orgánico como ácido fórmico o ácido trifluoracetico. Sirven para controlan el pH, neutralizan cualquier carga residual del silicato en la fase estacionaria y actúa como formador de pares iónicos.

Las columnas de fase inversa son más difíciles de dañar que las normales. Algunas consisten en silicatos alcalinos y nunca se deben usar con sales acuosas, destruirían el silicato. Pueden ser usados con ácidos acuosos, pero no durante mucho tiempo, pueden corroer metal. Con base en la naturaleza de la fase estacionaria y al tipo de proceso de separación, la cromatografía líquida de alta resolución se divide en cuatro clases:

a) Cromatografía de adsorción ( solida – líquida): Su fase estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en procesos repetidos de adsorción-desorción.

b) Cromatografía de partición ( líquida – líquida): La fase estacionaria tiene moléculas unidas a un soporte. La separación se produce por la partición entre la fase estacionaria “líquida“ y la fase móvil “líquida”.

Con respecto a la relación de polaridades de la fase móvil y la fase

estacionaria, en cromatografía de fase normal, la fase estacionaria es más polar que la primera y la fase reversa se refiere a lo contrario.

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c) Cromatografía por intercambio iónico: La retención se basa en la atracción entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Algunos intercambiadores de iones son: Las resinas de poliestireno: permite entrecruzamientos que dan estabilidad a la cadena.

Los intercambiadores de iones favorecen la unión de iones de mayor carga y radio inferior. Un incremento en el contra-ión (con respecto a los grupos funcionales de resinas) reduce el tiempo de retención. Un incremento del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio catiónico, pero bajar el pH reduce la retención en intercambio aniónico.

Se utiliza en la purificación de agua, preconcentración de componentes traza, cromatografía de intercambio de ligandos, cromatografía de intercambio de iones de proteínas, intercambio de aniones a alto pH de carbohidratos y polisacáridos. d) Cromatografía por exclusión molecular: También conocida como cromatografía de gel permeante o cromatografía de gel filtrante. Separa las partículas en función del tamaño. Es una cromatografía de baja resolución y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias de proteínas y es la técnica común para averiguar el peso molecular de polímeros sintéticos y naturales. La fase estacionaria posee poros de tamaño controlado, las moléculas son separadas por su peso molecular (Janice, 1986). II.I.14.1 Instrumentación

II.I.14.1.1 Bombas: La bomba tiene la función de proveer un flujo continuo del eluyente a través del inyector, la columna y el detector. Los requisitos de una bomba para HPLC son:

- Rango de flujo: de 0.01 a 10 ml/min - Rango de presión: de 1 a 5000 psi - Pulsos de presión: menos del 1% para HPLC normal e inverso y menos del 0,2% para el HPLC de exclusión de tamaño.

Existen distintos tipos de bombas: - Presión constante: son fáciles de usar y con bajo mantenimiento, además evitan los pulsos de presión. El problema es que requiere una vigilancia constante del flujo, puesto que las variaciones pueden producir fallos. - Flujo constante: son capaces de mantener el flujo, existen varios tipos: - Pistón recíproco: un pistón expela líquido a través de una válvula anti-retorno. - Pistón dual: Usando dos pistones, provee una señal constante y libre de pulsos. - Desplazamiento positivo (jeringa): un pistón controlado por motor que provee un flujo suave y sin pulso

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II.I.14.1.2 Inyectores Los inyectores deben introducir muestras liquidas en un rango de volumen

desde 0,1 ml a 100 ml con una alta precisión y alta presión. Normalmente se usan inyectores marca Rheodyne que poseen válvulas de 6 puertos con un bucle que permite no solo la inyección de muestra sino también la purga del sistema y la eliminación de burbujas. II.I.14.1.3 Columnas

Las columnas de HPLC estas hechas de acero inoxidable, con un diámetro interno de 2-5 mm y una longitud variable de 10 a 30 cm, dependiendo del diámetro de las micropartículas que contiene la columna (fase estacionaria), que puede ser de 3-10µm. Como cierre de las columnas se utilizan placas filtrantes de acero que no dejen escapar las micropartículas de la columna. En muchos casos se utiliza una precolumna para eliminar contaminantes y partículas de polvo.

La mayor parte de los instrumentos comerciales modernos están equipados con calentadores de columna, que controlan la temperatura desde la cercana al ambiente hasta 150 ºC. Manteniendo la temperatura constante se obtienen mejores cromatogramas.

Existe una gran variedad de materiales de relleno de las columnas según las distintas separaciones. Básicamente, las micropartículas utilizadas están compuestas de sílice, aluminio o resina. Pueden ser de dos tipos: -Partículas enteramente porosas, de forma irregular y diámetro 3-10µm. -Partículas esféricas de superficie porosa, con diámetros de 30-60µm y un núcleo imposible de atravesar. II.I.14.1.4 Sistema de Inyección de Muestra

Nos permite introducir la muestra de estudio dentro de la columna, las que más se emplean son bucles o válvulas dosificadoras que permiten una aplicación cuantitativa y reproducible a presión elevada. Proporcionan una selección del tamaño de la muestra que va desde 5 a 500µl. La muestra se pasa primero al bucle sin presión, para luego pasar a la columna accionando el flujo del disolvente con una llave de varias vías o válvulas de membrana.

La muestra no debe contener sólidos para que no se atasque la columna, si es

necesario deberá filtrarse por un filtro de membrana o precolumna. Lo mejor es disolver la muestra en el eluyente que se vaya a emplear en la separación. El volumen inyectado de muestra debe ser lo más pequeño posible, para que los resultados sean buenos. II.I.14.1.5 Tubos conectores y Filtros Todos aquellos tubos que transportan las sustancias de columna a columna, de columna a detector o de detector a detector. No deben superar los 0,634 mm de diámetro interno o causaran picos en las mediciones. Los filtros están colocados entre la bomba y el inyector de muestras, para evitar la entrada de ciertas sustancias y evitar el colapso de la columna. Normalmente estos filtros estas compuestos de acero poroso (Minguez, 1993).

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II.1.14.1.6 Medidores de presión y Termostatos

Son indicadores de fallos en el sistema, nos indica cuando un flujo continuo falla por motivos de presión y si existe alguna fuga en la infraestructura del sistema. Los termostatos de columnas son importantes para mantener la columna a una temperatura optima, sobretodo en análisis cualitativo, puesto que las variaciones de temperatura pueden cambian la viscosidad del eluyente e influir en el volumen retenido. II.I.14.1.7 Detectores

En la cromatografía HPLC se emplean distintos detectores dependiendo de la naturaleza de la muestra. Estos se pueden clasificar en:

a) Detectores selectivos: responden a una propiedad del soluto en disolución. Entre estos se encuentran los detectores ultravioleta/visible (UV/Vis), detector de fluorescencia y detector electroquímico. b) Detectores universales: responden cuando una propiedad de la fase móvil es cambiada por la presencia de un soluto. Entre estos se encuentran el detector de índice de refracción (IR) y el detector de conductividad. Conductividad electrolítica: el flujo pasa a través de un capilar con dos electrodos, la conductividad se mide en función de la composición del eluyente. Muy común en combinación con el HPLC de intercambio iónico. Electroquímicos: se basa en la reacción de oxidación/reducción del analito con un electrodo, el nivel de reacción es proporcional a la concentración de analito, midiendo esto y comparándolo con el electrodo de referencia nos da datos que podemos usar para cuantificar. Fluorescencia: es el detector más usado y el más preciso, nos permite hacer un análisis cualitativo, puesto que las sustancias al ser excitadas con ciertas longitudes de onda, emiten en longitudes de onda en el espectro ultravioleta únicas para cada sustancia. Indice de refracción: El más utilizado es el detector IR, que registran todas aquellas sustancias que presenten un IR distinto al de la fase móvil pura. La señal será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia en el IR de la fase móvil y de la muestra. Es necesario un control estricto de la temperatura y no se pueden utilizar para separaciones por elución en gradiente. Luz visible/ultravioleta: el detector es básicamente un espectrofotómetro que mide el cambio que sufre un haz luminoso al atravesar la muestra, midiendo la absorbancia de las sustancias. Es el más utilizado, sobre todo el � spectrofotométrico, que registra sustancias que absorben la radiación ultravioleta o visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de temperatura y se pueden utilizar en la elución en gradiente (Ramos, 1999).

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II.I.15 Aplicaciones de la Cromatografía HPLC al Análisis de Alimentos

Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimétrico para medir simultáneamente los nueve antioxidantes más comunes.

Análisis de carbohidratos en bebidas: la adición de mono y disacáridos a bebidas y zumos sirve como propósito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad añadida es correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio iónico con detección de pulso amperométrico con detectores de refracción o ultravioletas.

Isómeros de carotenoides: el HPLC en combinación con detectores calorimétricos permite el análisis de los carotenoides dietéticos en tejidos animales y vegetales.

Flavonoides y fenoles: en el vino la medición de estas sustancias permite la determinación del color, la edad y las variedades de uva usadas. El HPLC en combinación con colorímetros, permiten la determinación de hasta 22 compuestos diferentes simultáneamente.

Lípidos: la determinación de lípidos animales y vegetales como: colesterol, triglicéridos, glicéridos y esteroles, se basa en el uso del HPLC y un detector de Dispersión de Luz Evaporativa (ELS). Acidos lipoico y ácido dihidrolipoico en suplementos alimenticios: aun en estudio pero su detección combinando HPLC con detectores colorimétricos es importante ya que estos dos compuestos parecen importantes como antioxidantes y reguladores del ciclo celular. Medición de nutrientes liposolubles en tabletas multivitamínicas: el uso del HPLC permite la detección de múltiples vitaminas en alimentos suplementarios para neonatos. 4-Hidroxinonenal y otros aldehídos: se forman como resultado de peroxidación de lípidos, durante la cocción o podredumbre. Se usa HPLC con detectores de fluorescencia para detectar estas sustancias que son citotóxicas. Carbohidratos simples: se separan por HPLC con ELSD elimina la necesidad de usar bases fuertes o alto pH, convirtiéndose en un método no destructivo.

Catequinas del té: las catequinas son flavonoles del té, posiblemente anticancerígenos. Se usa HPLC con hidrólisis enzimática para detectar estas sustancias tan beneficiosas.

Triglicéridos: HPLC con ELSD permite la separación y caracterización de todos los tipos de triglicéridos. Contaminantes triptófanos: el HPLC con ELSD y detectores colorimétricos permiten la detección de esta sustancia tóxica proveniente de plaguicidas (Skoog, 2001).

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PARTE III

III.1 RESULTADOS

CONCENTRACIÓN DE LOS ESTANDARES Tabla 1.

Estándar Tiempo de Retención

Area del Pico Concentración / ppm

Beta Caroteno 3.01 836611 100

Luteína 6.69 111660 80.71

Fuente: FODECYT 49-2006 CONCENTRACIÓN DE BETA CAROTENO Y LUTEÍNA (Primer Muestreo Octubre – Noviembre) Tabla 2.

Especie Vegetal

Cantidad (g) en Seco

Tiempo de Retención

Area del Pico

Concentración mg/100g Beta Caroteno

Concentración mg/100g Luteina

Acelga 40 3.05

4625 4.15 -----

Berro 25 2.99

12605 10.85 -------

Brócoli 50

6.69 69174 ------- 50

Espinaca 35

6.95 20764 ------- 17.14

Hierba Mora

40 6.64 15570 ------- 11.25

Fuente: FODECYT 49-2006

CONCENTRACIÓN DE BETA CAROTENO Y LUTEÍNA (Segundo Muestreo Mayo – Junio) Tabla 3.

Especie Vegetal

Cantidad (g) en Seco

Tiempo de Retención

Area del Pico

Concentración mg/100g Beta Caroteno

Concentración mg/100g Luteina

Acelga 40 7.35

17335 ------ -----

Berro 30 3.04

10608 7.6 -----

Brócoli 40

6.69 60310 ------- 54.5

Espinaca 20

6.95 17908 ------- 19.41

Hierba Mora

55 6.64 20764 ------- 13.64

Fuente: FODECYT 49-2006

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CROMATOGRAMAS DE LOS ESTANDARES

ESTANDAR DE BETA CAROTENO Grafica 1.

Fuente: FODECYT 49-2006 Este cromatograma HPLC, presenta el tiempo de retención = 3 minutos y el área del pico de absorción del estándnar de beta caroteno 600 ppm.

Figura 2. Estructura Química de β - Caroteno

(CRC, 1988)

Esta molécula tiene dos grupos cíclicos β ionona unidos por una cadena con 9 enlaces conjugados, es de color amarillo. La ruptura del centro de la cadena da como resultado dos moléculas de vitaminas A.

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ESTANDAR DE LUTEINA

Gráfica 2.

Fuente: FODECYT 49-2006

Este cromatograma HPLC, presenta el tiempo de retención = 6.6 minutos y el área del pico de absorción del estándar de luteina 80.71 ppm.

Figura 3. Estructura Química de Luteina

(CRC, 1988)

Tiene dos grupos cíclicos de ionona oxidados unidos por una cadena con 9 enlaces conjugados. Es de color amarillento.

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III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los vegetales de estudio: acelga, berro, brócoli, hierba mora y espinaca, fueron colectados en los campos de cultivo del departamento de Chimaltenango, en donde son cultivados durante todo el año por medio de semilleros y abonados con material orgánico. Los meses de colecta fueron seleccionados considerando las épocas seca y lluviosa que se presentan en Guatemala y de esta forma poder comparar el contenido de beta caroteno y luteína en cada especie vegetal.

La metodología de extracción supercrítica con CO2 fue utilizada considerándola una alternativa moderna, con la cual se pudo extraer de forma rápida, eficiente y con poca cantidad de muestra seca ( 40 g ) los carotenoides analizados. Siendo efectiva en la extracción de la luteína y beta caroteno, ya que en cada extracto vegetal fueron identificados por sus respectivos tiempos de retención, comparándolos con los tiempos de retención de cada estándar.

La separación por cromatografía en columna de beta caroteno y luteína fue

efectiva utilizando como fase móvil acetato de etilo grado analítico y como fase estacionaria sílica gel, ya que estos carotenoides fueron colectados en las primeras fracciones de color amarillo ( 1 y 2 ). La coloración de éstos carotenoides se debe a la presencia de los dobles enlaces conjugados, lo cual hace que ellos presenten color en el espectro visible a longitudes de onda mayor de los 400 nm.

En la cuantificación por cromatografía HPLC el beta caroteno presentó el

menor tiempo de retención (3 minutos), esto debido a que tiene menor afinidad por la fase estacionaria no polar (Rp-18) y más afin a la fase móvil polar (agua:metanol) utilizadas en las separaciones e identificación de estos carotenoides. Los resultados obtenidos en esta investigación, nos muestra que la cantidad de beta caroteno y luteína en los vegetales de estudio es diferente en cada especie, se puede ver que la acelga y el berro son los vegetales que contienen beta caroteno en concentración de 4 - 10 mg/100g. Mientras que el brócoli, hierba mora y espinaca son los vegetales que contienen luteína en concentración de 15 - 50 mg/100g. Con estos resultados se puede ver que el brócoli es la especie vegetal que tiene el mayor contenido de luteína (50 mg/100g) y el berro es la especie vegetal que tiene el mayor contenido de beta caroteno (10 mg/100). Estos resultados son equivalentes a otros estudios realizados en vegetales, pues se ha reportado que el contenido de beta caroteno siempre es menor que el de luteína. También se pudo observar que en la cuantificación HPLC, se encontraban presentes otros carotenoides ya estos presentaron sus respectivas áreas en tiempos de retención diferentes a los estándares de luteína (tR=6.6) y beta caroteno (tR = 3.0 ).

El contenido de luteína y beta caroteno en las especies vegetales fue mayor en época lluviosa, esto se considera aceptable ya que muchos de los carotenoides son sensibles al calor o la luz y pueden sufrir reacciones de oxidación, lo cual puede degradarlos y afectar su presencia en cada vegetal. Otros factores que afectan la concentración de los corotenoides en las especies vegetales son: la variedad de la

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especie vegetal, grado de madurez, tipo de suelo, uso de fertilizantes, intensidad y duración de la luz solar, temperatura, lluvias y la forma de extracción.

La composición de una misma variedad cultivada en distintas épocas del año es diferente que no permite estimar el valor real nutritivo de estos vegetales en cuanto a su contenido de beta caroteno y luteina. Sin embargo es importante consumir vegetales en nuestra dieta alimenticia, ya que ellos brindan diversos carotenoides en forma natural, los cuales son indispensables en la prevención de diversas enfermedades crónicas y en mantener una buena salud, cumpliendo su función de alimento funcional.

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PARTE IV

1V.1 CONCLUSIONES

IV.1.1 Se separó por cromatografía en columna el beta caroteno y la luteína presentes en los vegetales de estudio: berro, acelga, hierbamora, espinaca y brócoli.

IV.1.2 Se cuantificó por cromatografía líquida HPLC el beta caroteno en berro y acelga (4 -10 mg/100g) y para la hierbamora, espinaca y brócoli (15 - 50 mg/100g) IV.1.3 Se estableció la variabilidad en el contenido de luteína y betacaroteno entre las especies vegetales estudiadas, aumentando su concentración en época lluviosa. IV.1.4 Se aprovechó el consumo de los carotenoides en forma natural presentes en los vegetales que se utilizan como alimento. IV.1.5 La extracción supercrítica con CO2, es un método selectivo para luteína y

beta caroteno, siendo los carotenoides mayoritarios en cada extracto vegetal.

IV.1.6 Se acepta la hipótesis planteada.

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IV.2 RECOMENDACIONES IV.2.1 Separar por cromatografía en columna otros carotenoides como: cantaxantina, criptoxantina, zeaxantina, etc. Presentes de forma natural en otras especies vegetales que se consumen diariamente por la población Guatemalteca. IV.2.2 Cuantificar por cromatorafía HPLC, los carotenoides luteína y beta caroteno en muestras: frescas, secas y cocidas de las especies vegetales estudiadas. IV.2.3 Mantener los extractos de los vegetales en frascos color ámbar, para evitar la oxidación de los mismos, por efecto de la luz.

IV.2.4 Aprovechar el consumo de vegetales como fuente natural de luteina y betacaroteno por su bajo costo y accesibilidad.

IV.2.5 Realizar estudios de biodisponibilidad, para conocer la efectividad del

aprovechamiento de los carotenoides en el consumo de vegetales.

IV.2.6 Utilizar la técnica de extracción supercrítica con CO2 y cosolvente acetato de etilo, para lograr una mayor extracción de luteína y beta caroteno, ya que esta fue una fase móvil ideal para separarlos por cromatografía en columna en las fracciones 1 y 2 de color amarillo.

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IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- AZURDIA C. 1995. Caracterización de algunos cultivos nativos de Guatemala.

Instituto de Investigaciones Agronómicas, Facultad de Agronomía, USAC. 172 p.

2- BENDICH, 1989. Adrianne and James Allen Olson. Biological actions of carotenoids. FASEB J. 3: 1927 – 1932. 3- BUENO, M. 1997. Determination of retinol and carotene by high-performance liquid chromatography. Food Chemistry 59(1):165-170. 4- BRUSWAY, R.J. 1986. Separation of carotenoides in fruits and vegetables by High Performance Liquid Chromatography. J. Liq. Chromatogr. 8 (8): 1527-1547. 5- CABALLERO C. L. 1995. Variación en el contenido de vitamina A en acelga cruda sometida a diferentes tipos de almacenamiento y cocción. Tesis Nutrición. Facultad de C.C.Q.Q y Farmacia/USAC. 1995, 77 p. 6- CALVO C., CARRANCO J., MUÑO M., SALAS R., PEREZ-GIL R. (2000). Contenido de beta caroteno y luteína en espinacas (spinaca oleracea L.) frescas y procesadas consumidas en México. En: XII Congreso Latinoamericano de Nutrición; Argentina 12 - 16 de noviembre de 2000.

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38

13- FRANCIS, F. J. 1995. Carotenoids as colorants. World of ingredients. Sept-Oct: 34-38. 14- GOODWIN, T. W. 1980. The Biochemisty of the Carotenoids. Vol I. Plants. London, Chapman and Hall, pp.23 - 27 15- HART, David y K. J. Scott, 1995. Development and evaluation of an HPLC method for the analysis of the carotenoids in foods, and the measurement of the carotenoid contend of vegetables and fruits commonly consumed in the UK. Food Chem. 54: 101 – 111. 16- HOF, K., C. WEST, J. WESTSTRATE and J. HAUTVAST. 2000. Dietary factors that affect the bioavalability of carotenoids. J. of Nutrition 130 (3):503-506. 17- JANICE L. BUREAU, RODNEY J. BUSHWAY. HPLC Determination of

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Introducction . Norwalk, Perkin – Elmer.

40

IV.4 ANEXOS

41

IV.4 ANEXO 1 Cromatogramas HPLC, de los diferentes vegetales de estudio (muestreo 1 y 2)

Fuente: FODECYT 49-2006

Fuente: FODECYT 49-2006

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Fuente: FODECYT 49-2006

Fuente: FODECYT 49-2006

43

Fuente: FODECYT 49-2006

Fuente: FODECYT 49-2006

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ESPINACA MUESTREO 1

Fuente: FODECYT 49-2006

ESPINACA MUESTREO 2

Fuente: FODECYT 49-2006

45

Fuente: FODECYT 49-2006

Fuente: FODECYT 49-2006

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COLECTA DE LOS VEGETALES ESTUDIADOS Los vegetales de estudio fueron colectados en los campos de producción del departamento de Chimaltenango. ACELGA BROCOLI

BERRO HIERBA MORA

MANOJOS DE HIERBA MORA ESPINACA

Fuente: FODECYT 49-2006

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SECADO Y MOLIENDA DE LOS VEGETALES Secador solar de la Facultad de Agronomia / USAC

ACELGA BRÓCOLI

Las muestras vegetales se colocaron en las zarandas en forma dispersa

BERRO ESPINACA

MOLIENDA Y PESADO DE LOS VEGETALES

Las muestras vegetales secas, fueron molidas con una licuadora y colocadas en bolsas plásticas.

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EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA CON CO2 EN EL LABORATORIO DE FISICOQUIMICA / FACULTAD DE CCQQ y FARMACIA

pesado de las muestras vegetales y estándares con la balanza analítica

Llenado de la columna y ajuste del equipo supercríco (1300 psi y 35 oC)

Extracción supercrítica de los carotenoides con CO2 y cosolvente etanol

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SEPARACION DE LOS CAROTENOIDES POR CROMATOGRAFÍA EN

COLUMNA (

Empaquetamiento de la columna en húmedo con acetato de etilo

y con la fase estacionaria sílica gel G 60.

Aplicación de 1 ml de extracto etanólico, obtenido por extracción supercrítica.

Separación de luteína y el beta caroteono con la fase móvil acetato de etilo y colecta de las

fracciones 1 y 2 de color amarillo

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CUANTIFICACIÓN HPLC DE LUTEINA Y BETA CAROTENO

Cromatógrafo líquido Shimandzu marca prominence con bomba cuaternaria.

Inyección de los estándares y de cada una de las fracciones vegetales

Obtención de los cromatogramas de cada extracto vegetal analizado

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FICHAS AGROTECNOLOGICAS

CULTIVO DE ACELGA

Beta vulgaris L. var. cicla (L.).

FAMILIA: Quenopodiaceae DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA Planta con sistema radical fibroso y bastante profundo. Las hojas constituyen la parte comestible y son grandes de forma oval tirando hacia acorazonada, pecíolo ancho y largo, que se prolonga en el limbo; el color varía, según variedades, entre verde oscuro fuerte y verde claro. Los pecíolos pueden ser de color crema o blancos. Flores al final de vástago floral que alcanza una altura promedio de 1.20 m. La inflorescencia está compuesta por una larga panícula. Las flores son sésiles y hermafroditas pudiendo aparecer solas o en grupos de dos o tres; cáliz de color verdoso y está compuesto por 5 sépalos y 5 pétalos. Las semillas son muy pequeñas y están encerradas en un pequeño fruto al que comúnmente se le llama semilla, que contiene de 3 a 4 semillas. HÁBITO O FORMA DE VIDA: Hábito erecto ANUALISMO-PERENNIDAD Para la cosecha de hojas de 3 a 4 meses para floración y fructificación la planta tienen que tener dos años y pasar previamente por temperaturas bajas.

DISTRIBUCIÓN GEOGRAFICA Y ECOLOGICA

FITOGEOGRAFÍA Según Vavilov, los primeros informes que se tienen de esta hortaliza la ubican en la región del Mediterráneo y en las Islas Canarias. Aristóteles hace mención de la acelga en el siglo IV a.C. La acelga ha sido considerada como alimento básico de la nutrición humana durante mucho tiempo

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HÁBITAT En Guatemala se cultiva en las regiones templadas de altiplano central y occidental. ALTITUD 1800-2000 msnm CLIMA Temperatura: La acelga es una planta de clima templado, que vegeta bien con temperaturas medias; le perjudica bastante los cambios bruscos de temperatura. Las variaciones bruscas de temperatura, cuando las bajas siguen a las elevadas, pueden hacer que se inicie el segundo periodo de desarrollo, subiéndose a flor la planta. La planta se hiela cuando las temperaturas son menores de -5ºC y detiene su desarrollo cuando las temperaturas bajan de 5ºC. En el desarrollo vegetativo las temperaturas están comprendidas entre un mínimo de 6ºC y un máximo de 27 a 33º C, con un medio óptimo entre 15 y 25º C. Las temperaturas de germinación están entre 5ºC de mínima y 30 a 35ºC de máxima, con un óptimo entre 18 y 22ºC. Luminosidad: no requiere excesiva luz, perjudicándole cuando ésta es elevada, si va acompañada de un aumento de la temperatura. La humedad relativa está comprendida entre el 60 y 90% en cultivos en invernadero. SUELOS Suelo: la acelga necesita suelos de consistencia media; vegeta mejor cuando la textura tiende a arcillosa que cuando es arenosa. Requiere suelos profundos, permeables, con gran poder de absorción y ricos en materia orgánica en estado de humificación. Es un cultivo que soporta muy bien la salinidad del suelo, resistiendo bien a cloruros y sulfatos, pero no tanto al carbonato sódico. Requiere suelos algo alcalinos, con un pH óptimo de 7,2; vegetando en buenas condiciones en los comprendidos entre 5,5 y 8; no tolerando los suelos ácidos. CULTIVO VARIEDADES Dentro de las variedades de acelga hay que distinguir las características siguientes:

• Color de la penca: blanca o amarilla. • Color de la hoja: verde oscuro, verde claro, amarillo. • Grosor de la penca: tamaño y grosor de la hoja; abuñolado del limbo. • Resistencia a la subida a flor. • Recuperación rápida en corte de hojas. • Precocidad.

Las más conocidas son:

• Amarilla de Lyon. Hojas grandes, onduladas, de color verde amarillo muy claro. Penca de color blanco muy puro, con una anchura de hasta 10 cm. Producción abundante. Resistencia a la subida a flor. Muy apreciada por su calidad y gusto. • Verde con penca blanca Bressane. Hojas muy onduladas, de color verde oscuro. Pencas muy blancas y muy anchas (hasta 15 cm.). Planta muy

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vigorosa, por lo que el marco de plantación debe ser amplio. Variedad muy apreciada. • Otras variedades: Verde penca blanca, R.Niza, Paros, Green y Fordook Giant.

REPRODUCCIÓN: Se utiliza normalmente la siembra directa SEMBRADO Y ESPACIAMIENTO Se colocan de 2 a 3 semillas por golpe, distantes 0.35 cm sobre líneas espaciadas de 0.4 a 0.5 m, ya sea en surco sencillo o doble. Las épocas de siembra de acuerdo a la zona son las siguientes: Zona Fría: Época de siembra: octubre-marzo. Días a la madurez: 50-60. Zona Templada: Época de siembra: todo el año. Días a madurez: 55-65.

Se pueden obtener poblaciones de 86.000 plantas por hectárea. • Densidad de siembra: 8-10 Kg/ha • Distancia entre surcos: 66 ó 77 cm a hilera sencilla 92 ó 100 cm a hilera doble • Distancia entre plantas: 25 cm

En siembra directa poniendo una semilla por agujero. Esto conlleva un aclareo posterior de las plantas, debido a que las semillas de acelga son poligérnicas y de cada una de ellas emergerán varias plantas. En invernadero es común germinar las semillas en semilleros, repicando las plantas cuando tienen cuatro o cinco hojas. De esta forma es posible trasladar las plantas al terreno definitivo de cultivo con un mes de adelanto respecto a las plantas de siembre directa. De esta forma se tarda entre 8 a 10 días en nacer la semilla de acelga, cuando las temperaturas están comprendidas entre 25ºC por el día y 15ºC por la noche. Los marcos de plantación más empleados son de 7 plantas por metro cuadrado. COSECHA Y RECOLECCIÓN La recolección de la acelga puede hacerse de dos formas, bien recolectando la planta entera cuando tenga un tamaño comercial de entre 0.75 y 1 Kg de peso, o bien recolectando manualmente las hojas a medida que estas van teniendo un tamaño óptimo. La longitud de las hojas es un indicador visual del momento de la cosecha (25 cm), siendo el tiempo otro parámetro, 60-70 días el primer corte y después cada 12 a 15 días. Es recomendable cortar las hojas con cuchillos o navajas bien afilados, evitando dañar el cogollo, ya que podría provocarse la muerte de la planta. RENDIMIENTO: La producción media es de 15 kilos por metro cuadrado. PROCESAMIENTO DE LA COSECHA Una vez recolectadas las hojas, se colocan en manojos de un kilo que a su vez se empaquetan en conjuntos de 10 kilos. En cada manojo se alterna la mitad del fajo de hojas y otra mitad del pecíolo. La conservación se realiza a 0ºC y 90% de humedad relativa durante 10-12 días.

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CULTIVO DE BERRO

Nasturtium officinale R.Br.

Familia: Brassicaceae ASPECTOS TAXONÓMICOS DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA

Planta acuática que crece en las fuentes, riachuelos, en las aguas limpias a la orilla de los arroyos pero también puede ser cultivado. Mide de 10 a 50 cm de altura, con tallo suave y muy ramificado. Hojas alargadas de forma oval y con nervaduras muy marcadas. Sus flores, amarillas o blancas, tienen cuatro sépalos, cuatro pétalos, seis estambres y un único pistilo, agrupadas en inflorescencias axilares y terminales, El fruto es largo y delgado, y sus semillas se utilizan como condimento.

HÁBITO O FORMA DE VIDA: Herbácea ANUALISMO-PERENNIDAD: Anual DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y ECOLOGÍA FITOGEOGRAFÍA Originaria de Europa, pero naturalizada en varias partes del mundo, en Guatemala crece en Sacatepéquez, Sololá, Quetzaltenango, Totonicapán, El Quiché y San Marcos. HÁBITAT: Crece en habitat acuáticos en aguas de corrientes lentas. ALTITUD: De 1500 a 3000 msnm CLIMA Templado, pero para este caso lo más importante es contar con una fuente de agua poco profundas donde pueda desarrollarse la planta.

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SUELOS Por crecer en habitat acuáticos el suelo no es muy importante para el cultivo de esta especie VARIEDADES: No hay variedades, los agricultores trabajan sus materiales por años. MULTIPLICACIÓN POR SEMILLA Produce una gran cantidad de semilla, que en el campo cae al suelo anagado y ahí produce nuevas plantas. No se maneja la semilla para su propagación. FERTILIZACIÓN Y SUMINISTRO DE NUTRIENTES El suelo tiene que tener, al menos, 8 cm de barro arenoso, rico en humus. Se realizan aplicaciones de nitrato de potasio SEMBRADO Y ESPACIAMIENTO El berro generalmente no es sembrado sino que rebrota nuevamente en los lugares donde se cultiva, siempre que estos tengan una alta humedad, se prefiere lugares donde el agua circule. No hay espaciamiento entre plantas, crecen formando tapetes.

PLAGAS Y ENFERMEDADES Y TRATAMIENTO Para el control de larvas de leptidoteros se aplica el producto Zipper, que es un Piretroide Dicarbamato. COSECHA Y RECOLECCIÓN Cuanto más joven y tierna sea la planta mayor valor culinario tendrá. Se cortan los tallos, aproximadamente de 8 cm, y se atan en pequeños manojos. Estos manojos, bien lavados, se ponen en agua para conservarlos frescos hasta su consumo. Después de la cosecha se hace una aplicación de Ridomil y Manceceb en los tocones para evitar infecciones por los cortes producidos. PROCESAMIENTO DE LA COSECHA: Los manojos se colocan en sacos y de esa manera son transportados al mercado.

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CULTIVO DE BRÓCOLI

Brassica oleracea var. Italica Plench Familia: Brassicaceae (Cruciferae) ASPECTOS TAXONÓMICOS NOMBRES DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA Planta hojas erguidas, pecíolos generalmente desnudos, limbos normalmente con los bordes ondulados; nervaduras marcadas y blancas; pellas claras, superficie más granulada, y constituyendo conglomerados parciales más o menos cónicos que suelen terminar en este tipo de formación en el ápice, en bastantes casos muy marcada. Flores pequeñas, en forma de cruz de color amarillo, fruto en silicua de valvas ligeramente convexas con un solo nervio longitudinal. Produce abundantes semillas redondas y de color rosáceo. HÁBITO O FORMA DE VIDA: Hierba erecta. ANUALISMO-PERENNIDAD: Anual. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y ECOLOGÍA FITOGEOGRAFÍA: Originaria del Mediterráneo oriental y concretamente en el Próximo Oriente (Asia Menor, Líbano, Siria, etc.). HÁBITAT: Ambientes frescos a pleno sol. ALTITUD: 1500 a 2300 msnm. CLIMA: Para un desarrollo normal de la planta es necesario que las temperaturas durante la fase de crecimiento oscilen entre 20 y 24ºC; para poder iniciar la fase de inducción floral necesita entre 10 y 15ºC durante varias horas del día. Crece bien en el altiplano occidental de Guatemala.

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SUELOS: Crece mejor en suelos con tendencia a la acidez y no a la alcalinidad, estando el óptimo de pH entre 6,5 y 7. Desarrolla mejor en suelos francos. CULTIVO MULTIPLICACIÓN POR SEMILLA Se siembra en semillero. La semilla se cubre ligeramente con una capa de tierra de 1-1.5 cm y con riegos frecuentes para conseguir una planta desarrolla en unos 45-55 días. La germinación tiene lugar aproximadamente 10 días después de la siembra. La cantidad de semilla necesaria para una hectárea de plantación es de 250 a 300 gramos. Si el semillero está muy espeso es conveniente aclararlo para que la planta se desarrolle de forma vigorosa y evitar el ahilamiento. La planta es vigorosa y estar bien desarrollada, con 18-20 cm de altura y 6-8 hojas definitivas a los 50 días de la siembra, momento en que se puede trasplantar. Se deben eliminar las plantas débiles y las que tengan la yema terminal abortada. FERTILIZACIÓN Y SUMINISTRO DE NUTRIENTES Es un cultivo que requiere un alto nivel de materia orgánica, que se incorporará un mes o dos antes de la plantación del orden de 4 kg/ha de abono orgánico bien descompuesto. Tiene altos requerimientos en potasio y también en boro; en suelos en los que el magnesio sea escaso conviene hacer aportación de este elemento por medio de aplicaciones foliares. En suelos demasiado ácidos conviene utilizar abonos alcalinos para elevar un poco el pH con el fin de evitar el desarrollo de la enfermedad denominada “hernia o potra de la col”. SEMBRADO Y ESPACIAMIENTO Normalmente se emplean unas densidades de 12.000-30.000 plantas/ha, en distancias de 0.80-1 m entre surcos y 0.40-0.80 m entre plantas. COSECHA Y RECOLECCIÓN Los brócolis deben cosecharse con el número de hojas exteriores necesario para su protección; con la pella lo más cubierta posible. La recolección comienza cuando la longitud del tallo alcanza 5 ó 6 cm., se realizan cosechas dos a tres veces por semana de acuerdo a que la pella este en punto. El brócoli de buena calidad debe tener las inflorescencias cerradas y de color verde oscuro brillante, compacta (firme a la presión de la mano) y el tallo bien cortado y de la longitud requerida. RENDIMIENTO Pero pueden estimarse unos rendimientos normales entre 15.000 y 25.000 kg/ha. PROCESAMIENTO DE LA COSECHA -Temperatura y humedad relativa óptima: se requiere una temperatura de 0°C y una HR >95% para optimizar la vida de almacenamiento (21-28 días). El brócoli almacenado a 5°C puede tener una vida útil de14 días, pero de sólo 5 días a 10°C. Generalmente, se enfría rápidamente con la inyección de una mezcla hielo-agua (liquid-icing) a los cartones encerados en los que se ha empacado el producto en el campo. El hidroenfriamiento y el enfriamiento con aire forzado también pueden usarse, pero el manejo de la temperatura durante la distribución es más crítico que el empacado con hielo.

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CULTIVO DE ESPINACA

Spinacea oleracea L.

FAMILIA: Chenopodiaceae ASPECTOS TAXONÓMICOS NOMBRES: Espinaca. DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA La planta en una primera fase forma una roseta de hojas de duración variable según condiciones climáticas y posteriormente emite el tallo. De las axilas de las hojas o directamente del cuello surgen tallitos laterales que dan lugar a ramificaciones secundarias, en las que pueden desarrollarse flores. Existen plantas masculinas, femeninas e incluso hermafroditas, que se diferencian fácilmente, ya que las femeninas poseen mayor número de hojas básales, tardan más en desarrollar la semilla y por ello son más productivas. Raíz pivotante, poco ramificada y de desarrollo radicular superficial. Tallo erecto de 30 cm a 1 m de longitud en el que se sitúan las flores. Hojas caulíferas, más o menos alternas y pecioladas, de forma y consistencia muy variables, en función de la variedad. Color verde oscuro. Pecíolo cóncavo y a menudo rojo en su base, con longitud variable, que va disminuyendo poco a poco a medida que soporta las hojas de más reciente formación y va desapareciendo en las hojas que se sitúan en la parte más alta del tallo. Flores las flores masculinas, agrupadas en número de 6-12 en las espigas terminales o axilares presentan color verde y están formadas por un periantio con 4-5 pétalos y 4 estambres. Las flores femeninas se reúnen en glomérulos axilares y están formadas por un periantio bi o tetradentado, con ovarios uniovulares, estilo único y estigma dividido en 3-5 segmentos. HÁBITO O FORMA DE VIDA: Roseta. ANUALISMO-PERENNIDAD: Para su cultivo anual para producción de semilla bianual.

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DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y ECOLOGÍA FITOGEOGRAFÍA Originaria de regiones asiáticas, probablemente de Persia, pero únicamente a partir del siglo XVIII comenzó a difundirse por Europa y se establecieron cultivos para su explotación, principalmente en Holanda, Inglaterra y Francia; se cultivó después en otros países y mas tarde pasó a América. HÁBITAT: Ambientes abiertos, sin sombra. ALTITUD: 1800 a 2500 msnm CLIMA Temperatura mínima mensual de crecimiento es de aproximadamente 5ºC. La adaptabilidad a las temperaturas bajas es de gran importancia práctica, dado que la mayor demanda de esta verdura coincide con el período de época fría. Las espinacas que se han desarrollado a temperaturas muy bajas (5-15ºC de media mensual), en días muy cortos, típicos de los meses invernales, florecen más rápidamente y en un porcentaje mayor que las desarrolladas también en fotoperiodos cortos, pero con temperaturas más elevadas (15-26ºC). También las lluvias irregulares son perjudiciales para la buena producción de espinacas y la sequía provoca una rápida elevación, especialmente si se acompaña de temperaturas elevadas y de días largos. SUELOS Crece mejor en terrenos fértiles, de buena estructura física y de reacción química equilibrada. Por tanto, el terreno debe ser fértil, profundo, bien drenado, de consistencia media, ligeramente suelto, rico en materia orgánica y nitrógeno, del que la espinaca es muy exigente. No debe secarse fácilmente, ni permitir el estancamiento de agua. En suelos ácidos con pH inferior a 6. se desarrolla mal, a pH ligeramente alcalino se produce el enrojecimiento del pecíolo y a pH muy elevado es muy susceptible a la clorosis.

CULTIVO

MULTIPLICACIÓN POR SEMILLA Siembra directa al campo. La germinación tiene lugar a las tres semanas de la siembra si durante este periodo se mantiene una temperatura en torno a 4-6ºC, ya que a medida que se incrementa la temperatura se inhibe la germinación. Si la temperatura es mayor de 26ºC se produce la inhibición total de la germinación. SEMBRADO Y ESPACIAMIENTO La siembra realizada en época seca. Con el fin de obtener una producción escalonada, se aconseja realizar siembras periódicas cada 20 días. La siembra debe realizarse en terrenos ligeramente húmedos. Las hileras distarán entre sí 20-35 cm, estas distancias son variables, dependiendo de las exigencias de la variedad, maquinaria utilizada, modalidades de recolección, etc. Las siembras mas densas permiten un mejor control de las malas hierbas. La semilla se deposita a 1-2 cm de profundidad. Conviene tratar las semillas con productos fungicidas (Captan, Tiram, Sulfato de plata, Permanganato potásico).

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COSECHA Y RECOLECCIÓN La recolección se inicia en las variedades precoces a los 40-50 días tras la siembra y a los 60 días después de la siembra con raíz incluida La recolección nunca se realizará después de un riego, ya que las hojas se ponen turgentes y son más susceptibles de romperse Puede efectuarse de dos formas principalmente: manual o mecanizada. La recolección manual consiste en cortar las hojas más desarrolladas de la espinaca, dando aproximadamente 5 ó 6 pasadas a un cultivo. Si se pretende comercializar plantas enteras , se corta cada planta por debajo de la roseta de hojas a 1 cm bajo tierra, en este caso se dará solo una pasada. Si la espinaca se destina a la industria la recolección será mecanizada empleando cosechadoras autopropulsadas, éstas constan de una barra de corte de altura regulable y anchura variable (1-3 m), una cinta transportadora de producto y una tolva. En algunas zonas se realiza un segundo corte unos 10-15 días más tarde de la primera recolección mecánica, dando lugar a una segunda cosecha. Sin embargo, la calidad del producto que se obtiene en este segundo corte es muy inferior. RENDIMIENTO: .Las producciones óptimas entre 15 y 20 Tm/ha. PROCESAMIENTO DE LA COSECHA Las espinacas, tanto en manojo como en hojas, deben estar uniformemente verdes, totalmente túrgidas, limpias y sin serios daños. En las espinacas en manojos, las raíces deben ser eliminadas y los pecíolos deben ser mas cortos que la lámina de la hoja. -Temperatura óptima: 0°C; 95-98% H.R. La espinaca es altamente perecedera y no mantendrá una buena calidad por más de 2 semanas. La marchites, el amarillamiento de las hojas y las pudriciones se incrementan con un almacenaje superior a 10 días.

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CULTIVO DE HIERBA MORA

Solanum americanum Miller

Familia: Solanaceae ASPECTOS TAXONÓMICOS SINÓNIMOS: Quilete, macuy. DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA Hierba de hasta 1 m de alto, tallo pubescente. Hojas en pares o solitarias, 3-14 cm de largo, lanceoladas, ápice agudo. Inflorescencia internodal, racemiforme. Flores en cálices de 1-2 mm, lóbulos ovalados, agudos; corola blanca, limbo partido 5-8 mm de ancho, estilo 2.5-3.5 cm de largo, mas largo que los estambres, ovario globoso. Frutos globosos, negros al madurar 4-8 mm de diámetro; semillas pequeñas. HÁBITO O FORMA DE VIDA: Arbustiva. ANUALISMO-PERENNIDAD: Anual. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y ECOLOGÍA FITOGEOGRAFÍA Especie nativa de América de México a Costa Rica. En Guatemala se ha descrito en Alta Verapaz, Baja Verapaz, Chimaltenango, Chiquimula, Escuintla, Guatemala, Huehuetenango, Jutiapa, Peten, Retalhuleu, Sacatepéquez, San Marcos, Santa Rosa, Suchitepéquez y Zacapa. HÁBITAT: Crece en campos de cultivo, en forma asilvestrada. ALTITUD: 0 a 1500 msnm. CLIMA: Cálido húmedo. SUELOS: Crece en diversidad de suelos, en especial en suelos diturbados.

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USOS Y VALOR NUTRICIONAL La planta se utiliza para alimentación para lo cual se corta antes o en floración, es muy recomendada para el tratamiento de desnutrición. Como medicinal se utiliza cuando la planta tiene frutos maduros, es recomendada la decocción de hojas utilizadas tópicamente para afecciones dermatomuchosas en especial para la vaginitis. CULTIVO VARIEDADES No hay variedades de esta especie. Algunos agricultores han realizado selección a partir de material asilvestrado y siembran estos en cultivo. MULTIPLICACIÓN POR SEMILLA Los frutos tienen un diámetro promedio de 7 mm y contienen una gran cantidad de semilla (4500 semillas por gramo). Para su propagación bajo manejo, los agricultores recolectan los frutos maduros y los ponen a secar junto con las semillas, luego en la época de siembra esparcen los frutos secos en el semillero y obtienen las plántulas. La otra forma es recolectar los frutos, desintegrarlos en un recipiente para que suelten la semilla y dejarlos en agua por dos a tres días, después de lo cual se separa la semilla se limpia y se pone a secar. Posteriormente se hace un semillero donde se obtiene en promedio un 53% de germinación, una vez que las plantas tienen al menos cuatro hojas pueden ser trasplantadas al campo definitivo. FERTILIZACIÓN Y SUMINISTRO DE NUTRIENTES No se tienen información precisa, generalmente la fertilización se hace con abono orgánico, algunos agricultores aplican aproximadamente 1 qq por hectárea de Urea. SEMBRADO Y ESPACIAMIENTO Cuando se hace en tablones se siembra a 25x25 procurando tener una alta densidad porque las plantas se aprovechan en corto tiempo. En siembras se puede tener una distancia entre surcos de 60 cm y de 25 cm entre plantas. COSECHA Y RECOLECCIÓN La cosecha se puede iniciar al mes después del trasplante y posteriormente se pueden realizar cortes cada 25 a 30 días. RENDIMIENTO La forma de comercializar la hierba mora es en manojos, de un tablón de 1.5 m por 4 m de largo se obtienen hasta 20 manojos. De un cálculo realizado de 1 manojo, se obtuvo aproximadamente 200g de hoja fresca.

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V.1 INFORME FINANCIERO

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AD-R-0013

DÉCIMA CONVOCATORIA

LINEA FODECYT Nombre del Proyecto: Extración Supercrítica y Cuantificación por HPLC de Luteina y Beta

Caroteno presentes en vegetales de consumo popular Numero del Proyecto: 49-2006

Investigador Principal: Lic. Rodolfo Marinelli Orozco

Monto Autorizado: Q137,768.40

12 MESES Fecha de Inicio y Finalización: 01/06/2006 AL 31/05/2007 PRÓRROGA AL 31/08/2007

Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA En Ejecuciòn

Menos (-) Mas (+) Ejecutado Pendiente de

Ejecutar

1 SERVICIOS NO PERSONALES

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factiblidad Q 85,244.00 Q 75,494.00 Q 9,750.00

121 Publicidad y Propaganda Q 1,000.00 Q 1,000.00

122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 3,000.00 Q 3,000.00 133 Viáticos en el interior Q 3,840.00 Q 2,760.00 Q 1,080.00

2 MATERIALES Y SUMINISTROS 261 Elementos y compuestos químicos Q 4,560.00 Q 3,720.60 Q 839.40 262 Combustibles y lubricantes Q 600.00 Q 228.50 Q 371.50 Q -

65

267 Tintes, pinturas y colorantes Q 2,000.00 Q 1,717.00 Q 283.00 268 Productos plásticos, vinil y pvc Q 1,000.00 Q 164.74 Q 835.26 272 Productos de Vidrio Q 2,000.00 Q 47.75 Q 1,952.25 281 Productos Siderúrgicos Q 7,000.00 Q 5,214.63 Q 1,785.37 289 Otros productos metálicos Q 500.00 Q 159.98 Q 340.02

295 Útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio Q 19,000.00 Q 18,579.30 Q 6,800.00 Q 7,220.70 Q -

297 Útiles, accesorios y materiales eléctricos Q 500.00 Q 1,579.30 Q 1,809.00 Q 270.30

298 Accesorios y repuestros en gral. Q 6,800.00 Q 10,228.50 Q 3,334.23 Q 94.27

3 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E INTANGIBLES

323 Equipo, médico-sanitario y de Laboratorio Q 4,000.00 Q 3,975.93 Q 24.07

914 GASTOS NO PREVISTOS GASTOS DE ADMÓN. (10%) Q 12,524.40 Q 12,524.40 Q 137,768.40 Q25,607.80 Q27,607.80 Q 118,514.46 Q19,253.94

MONTO AUTORIZADO Q137,768.40

(-) EJECUTADO Q118,514.46 SUBTOTAL Q19,253.94 (-) CAJA CHICA TOTAL POR EJECUTAR