PROYECTO FODECYT No. 52-2009 MSc. Vivian Matta de …glifos.concyt.gob.gt/digital/fodecyt/fodecyt...

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

“EVALUACIÓN DE LAS ALTERNATIVAS DE DIAGNÓSTICO POR H. pylori: BÚSQUEDA DE ALTERNATIVAS DE DIAGNÓSTICO Y EVALUACIÓN DE

PRODUCTOS NATURALES PARA EL TRATAMIENTO”

PROYECTO FODECYT No. 52-2009

MSc. Vivian Matta de García Investigadora principal

GUATEMALA, JUNIO DE 2012

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología (FONACYT), otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYT).

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OTROS AGRADECIMIENTOS Se agradece además a Institutode Cancerología y Hospital Dr. Bernardo del Valle S.

(INCAN), por la colaboración prestada en el desarrollo del presente proyecto. A la compañía farmaceútica Qualypharm por la donación de 19 tratamientos

completos para los pacientes del estudio.

A los participantes de esta investigación financiados por CONCYT:

• Armando Cáceres Estrada • Ana Margarita Paz Morales • Karla Lange Cruz • Federico Nave Herrera • Keila Mariana Guerrero Gutiérrez • Nadia Hornquist Hurtarte • Rosenda Elizabeth Yax Suyuc

A los participantes del Seminario de Investigación I “Aislamiento de Helicobacter pylorie inhibición de la bacteria por diez extractos de plantas medicinales utilizadas popularmente en el tratamiento de infecciones gastrointestinales” de la Escuela de Química Biológica: • Rosenda Elizabeth Yax Suyuc • María Cristina Quintana Galindo

A los participantes del Seminario de Investigación II “Identificación de las pruebas más sensibles y específicas para el diagnóstico de H. pylori pre y post-tratamiento en pacientes dispépticos” de la Escuela de Química Biológica:

• Nadia Hornquist Hurtarte • Estuardo Alejandro Maldonado Rivera • Margarita Benito Zúñiga • María José Camo

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Fotografia 1. Integrantes del equipo de investigación

Fuente: Proyecto FODECYT 51-2009

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RESUMEN El presente estudio se realizó en en 178 pacientes con síntomas de dispepsia y que

acudieron al INCAN a realizarse una endoscopia, en su mayoría fueron mujeres (76.1%) y mayores de 50 años (48.8%). A todos se les realizó el panel de pruebas de cultivo microbiológico de biopsia, detección de antígeno fecal, anticuerpos IgM, IgA, IgG cagA, pepsinógeno I y II y gastrina. Se realizó el seguimiento después del tratamiento por cinco meses para evaluar la mejoría clínica, incluyéndose un total de 64 pacientes.

El estudio se dividió en tres partes, en la primera el objetivo fue obtener un mejor

diagnóstico de laboratorio de la infección por H. pylori y de la evaluación de la cura post-tratamiento, esta cura se evaluó en base a los cambios en la sintomatología presentada y por los resultados obtenidos en las pruebas de laboratorio.

En relación a los síntomas, todos disminuyeron al finalizar el tratamiento y el número

de pacientes asintomáticos se incrementó de 1.1% a 31%, lo cual sugiere un tratamiento exitoso. Los síntomas más frecuentes en ambas etapas fueron reflujo, dolor abdominal y flatulencia.

La detección del antígeno en heces disminuyó de 37.2% a 17.8%, diferencia

significativa (X2 de McNemar p<0.0001). Los resultados en cada prueba se comparon con la biopsia gástrica y se determinó la sensibilidad, especificidad y concordancia según Kappa. La prueba más sensible fue los anticuerpos IgA (74.2%) pero su nivel de concordancia fue muy pobre (k=0.1043). La positividad de esta prueba disminuyó del 66.3% a 57.1%. La prueba más específica fue el cultivo microbiológico con 95.9% pero su nivel de concordancia y sensibilidad fueron muy pobre (k=0.3596, 35.4%).

La segunda parte del estudio se evaluó el pepsinógeno I y II y gastrina antes y después

del tratamiento. El índice de pepsinógeno I/II en rango normal se incrementó de 60.6 a un 85.4% al finalizar el tratamiento, mientras que la gastrina el 95.2% de los pacientes presentó valores aumentado. En la tercera parte se estableció la acción anti- H. pylori de los extractos etanólicos de diez plantas nativas usadas popularmente en el tratamiento de enfermedades digestivas, encontrando actividad inhibitoria significativa (p< 0.05) en dos de los extractos etanólicos de B.orellana y L. dulcis a una concentración inhibitoria mínimade 100µg/mL.

Se puede concluir que el índice de pepsinógeno I/II en conjunto con la gastrina y las pruebas específicas de detección de antígeno en heces y de la inmunoglobulina IgA podrían utilizarse para el mejor diagnóstico de la infección y evaluación de la cura post-tratamiento. Así también que únicamente los extractos etanólicos B.orellana y L. dulcis presentaron una acción inhibitoria a H. pylori a una concentración inhibitoria mínima de 100µg/mL.

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ABSTRACT

The present study was performed in 178 patients with dyspeptic symptoms who attend INCAN for and endoscopy, most of whom were women (76.1%) and over 50 (48.8%). All underwent a panel of test that include biopsy, microbiology culture, fecal antigen detection, IgM, IgA and IgG cagA specific antibodies, pepsinogen I/II and gastrin. Follow up was performed in 64 patients for five months to asses clinical improvement.

The study was divided into three parts; the first one has the objetive to obtain a better

laboratory diagnosis of infection with H. pylori and evaluation of the cure after the treatment, which was evaluated based on changes in symptoms and laboratory test results.

Al reported symptoms decreases after the five months follow up and the number of

asymptomatic patiens increases form 1.1% to 31%, suggestin a succesful treatment. The most common symptoms in both stages were reflux, abdominal pain and flatulence which are strongly linked to the bacteria infection.

The fecal antigen detection decreased from 37.2 to 17.7%, this difference is

statistically significant (X2 MacNemar´s p < 0.0001). The obtained results were compared with those obtained in the biopsy, and the sensitivity, sensibility and the Kappa were calculated. The most sensitivity test was the IgA antibodies (74.2%) but it has a poor level of agreement (k=0.1043). The positivity of this test decreased from 66.3% to 57.1%. The most specific test was microbiological culture (95.9%) but its level of agreement and sensitivity were very poor (k=0.3596, 35.4%).

The second part of the study was to evaluate the usefulness of pepsinogen I/II and

gastrin determination during treatment. The index of pepsingen I/II increases from 60.6 85.4% after treatment and gastrin was increased in 95.2% of the patients.

The thid part of the study was to stablish the inhibition action on H. pylori of ten

ethanolic extract of native plants populary used in treatment of digestive diseases.Inhibitory activity was found significant (p<0.05) in only two of the ethanol extracts, B. orellana and L. dulcis to a minimun inhibitory concentracion of 100µg/mL.

We conclude that the rate of pepsinogen I/II and gastrin together with antigen stool

detection and immunoglobulin IgA could be used for better diagnosis of infection and assesment of cure after treatment. Also the ethanol extracts of B. orellana y L. dulcis showed an inhibitory action on H. pylori (MIC 100 µg/mL).

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TABLA DE CONTENIDOS

Resumen Abstract Agradecimientos Tabla de contenidos Lista de tablas Lista de fotografías Lista de gráficas Lista de anexos Lista de abreviaturas Abreviatura de los nombres científicos Dimensionales PARTE I. INTRODUCCIÓN I.1 Introducción 13 I.2 Planteamiento del problema 15 I.2.1 Antecedentes 15 I.3 Objetivos e hipótesis 19 I.3.1 General 19 I.3.2 Específicos 19 I.3.3 Hipótesis 19 I.4 Metodología 20 I.4.1 Localización 20 I.4.2 Variables 20 I.4.2.1 Variables dependientes 20 I.4.2.2 Variables independientes 20 I.4.3 Indicadores 20 I.4.4 Estrategia metodológica 21 I.4.5 Población y muestra 21 I.4.5.1 Población 21 I.4.5.2 Muestra 22 I.4.6 Métodos 22 I.4.6.1 Captación de pacientes y toma de muestra 22 I.4.6.2 Aislamiento y mantenimiento de cepas de H. pylori provenientes de

biopsias gástricas 24

I.4.6.3 Determinación cuantitativa de anticuerpos IgM anti H.pylori por la técnica de ELISA

27

I.4.6.4 Determinación cuantitativa de anticuerpos IgA anti H.pylori por la técnica de ELISA

28

I.4.6.5 Determinación de anticuerpos IgG cagA anti H.pylori por la técnica ELISA

31

I.4.6.6 Detección del antígeno de H. pylori en heces 32 I.4.6.7 Determinación cuantitativa de pepsinógeno I por la técnica de ELISA 33 I.4.6.8 Determinación cuantitativa de pepsinógeno II por la técnica de ELISA 34 I.4.6.9 Determinación cuantitativa de la gastrina 36 I.4.6.10 Ensayo de la actividad contra H. pylori por extractos de plantas 38

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I.4.7 Técnica estadística 41 I.4.7.1 Alternativas para el diagnóstico por cultivo y evaluación de productos

naturales para el tratamiento 41

I.4.7.2 Alternativa para el diagnóstico por pruebas serológicas y antígeno fecal 42 I.4.8 Instrumentos utilizados 42 I.4.8.1 Equipo 42 I.4.8.2 Materiales 43 PARTE II. MARCO TEÓRICO II.1 Helicobacter pylori 44 II.2 Infección por H. pylori 45 II.3 Características clínicas de la infección 45 II.4 Epidemiología de la infección por H. pylori 46 II.5 Métodos de diagnóstico 48 II.6 Métodos microbiológicos para el diagnóstico de H. pylori 54 II.7 Actividad de extractos vegetales contra H. pylori 58 II.8 Métodos de detección de sensibilidad 66 II.9 Tratamiento de la infección por H. pylori 68 PARTE III. RESULTADOS Descripción de la muestra de estudio 70 III.1 Objetivo 1

Evaluar el mejor diagnóstico de laboratorio de la infección por H. pylori y de la evaluación de la cura post-tratamiento al aplicar pruebas más sensibles y específicas

73

III.2 Objetivo 2 Establecer y evaluar la acción anti-H. pylori de extractos de plantas natuvas usadas popularmente en el tratamiento de enfermedades digestivas

79

III.3 Objetivo 3 Establecer y evaluar las pruebas de laboratorio más sensibles y específicas para el diagnóstico de la infección por H. pylori

81

III.4 Objetivo 4 Determinar la utilidad de la medición de la gastrina y pepsinógeno I y II en el diagnóstico de la infección por H. pylori

84

III.5 Objetivo 5 Establecer las pruebas de laboratorio más sensibles y específicas para la evaluación de la cura post-tratamiento de la infección por H. pylori

87

III.6 Objetivo 6 Establecer y validar un procedimiento para el procesamiento de muestras para el diagnóstico microbiológico de la infección por H. pylori mediante cultivo, técnica de ureasa rápida y observación microscópica del frote teñido por el método de Gram modificado

88

III.7 Objetivo 7 Desarrollar un banco de cepas con los aislamientos de H. pylori obtenidos de los pacientes que participen en el estudio

89

III.8 Objetivo 8 Establecer bioensayos para el tamizaje de la acción anti-H. pylori de las especies nativas utilizando como blanco bacterias aisladas de

90

ix

muestras clínicas III.9 Objetivo 9

Establecer, evaluar y validar la acción microbicida y la concentración inhibitoria mínima de especies vegetales nativas utilizadas popularmente para el tratamiento de enfermedades digestivas

94

III.10 Objetivo 10 Divulgar a las autoridades, actores sociales e institucionales en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación

95

PARTE IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 97 PARTE V. CONCLUSIONES V.1 Conclusiones 106 V.2 Recomendaciones 108 V.3 Referencias bibliográficas 109 V.4 Anexos Anexo 1. Ficha epidemiológica 118 Anexo 2. Consentimiento informado 121 Anexo 3. Trifoliar H. pylori 122 PARTE VI. INFORME FINANCIERO 124

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LISTA DE TABLAS 1 Diagnóstico de H. pylori en diferentes laboratorios de la ciudad capital 2 Asociación entre H. pylori y la patología gástrica detectada por endoscopía 3 Diluciones y concentraciones teóricas de la gastrina 4 Valoración del índice de kappa LISTA DE CUADROS 1 Distribución de la muestra por género 2 3

Distribución por grupo etario de los pacientes participantes Frecuencia de síntomas al momento de iniciar el estudio

4 Método de diagnóstico previo 5 Tipo de tratamiento recibido 6 Resultados obtenidos en las pruebas realizadas pre-tratamiento 7 Frecuencia porcentual de la sintomatología de pacientes pre y post-tratamiento 8 Resultados obtenidos en las pruebas realizadas post-tratamiento 9 Evaluación de las pruebas pre y post-tratamiento 10 Información general y porcentajes de rendimiento de las plantas a evaluar actividad

anti Helicobacter pylori Proyecto FODECYT 52-2009 11 Resultados obtenidos entre los métodos utilizados y biopsia 12 Distribución de los pacientes del estudio de acuerdo a los niveles de pepsinógeno I y

II 13 Relación pepsinógeno I/II pre post-tratamiento 14 15 16

Distribución de pacientes del estudio de acuerdo a los niveles de gastrina Condiciones de cultivo de H. pylori utilizadas en inóculos primarios y reactivación de cepas Aislamientos de H. pylori de los pacientes del estudio

17 Información general y porcentajes de rendimiento de las plantas a evaluar actividad anti Helicobacter pylori Seminario I

18 Determinación de concentración de Claritromicina para inhibir los aislamientos de H. pylori

19 Actividad inhibitoria in vitro de 10 extractos contra cepas de H. pylori, utilizando la técnica de dilución en agar

LISTA DE FOTOGRAFÍAS 1 Integrantes del equipo de investigación 2 Colonias características de H. pylori 3 Bacilos curvos Gram negativo, H. pylori 4 Pruebas bioquímicas para identificación de H. pylori 5 Toma de muestra sanguínea a pacientes post-tratamiento

xi

6 Proceso de antígeno fecal a pacientes post-tratamiento 7 Proceso de muestras mediante prueba ELISA 8 Lectura de absorbancias de muestras en lector de ELISA 9 Proceso de anticuerpos IgG, IgA y IgM contra H. pylori en muestras de pacientes

post-tratamiento 10 Colonias de H. pylori reactivadas 11 Actividad negativa anti-H. pylori a 100µg/mL 12 Actividad positiva anti-H. pylori a 100µg/mL 13 Controles para validación de bioensayo 14 Medición de nuveles de pepsinógeno I y II de muestras de pacientes post-

tratamiento por la técnica ELISA 15 Procesamiento de gastrina 16 Crecimiento de H. pylori, (A) se observa menor crecimiento en agar chocolate en

inóculo inicial comparado con (B) el crecimiento observado en ASC 7.5% mas suplemento nutritivo Isovitalex (C) Se observan colonias puras de H. pylori en fase de reactivación

17 Demostración de actividad inhibitoria mínima de B. orellana frente a H. pylori 18 Demostración de actividad inhibitoria mínima de L. dulcisfrente a H. pylori

LISTA DE GRÁFICAS

1 Resultados obtenidos en las pruebas realizadas pre-tratamiento 2 Frecuencia de sintomatología en los pacientes en las etapas pre y post-

tratamiento 3 Resultados de los anticuerpos y antígeno fecal en pacientes post-

tratamiento 4 Relación pepsinógeno I/II pre y post-tratamiento

LISTA DE ANEXOS

1 Ficha epidemiológica 2 Consentimiento informado 3 Trifoliar H. pylori

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LISTA DE ABREVIATURAS Ac Anticuerpos ASC Agar sangre de carnero BHI Infusión Cerebro y Corazón CIM Concentración inhibitoria mínima DMSO Dimetilsulfóxido ELISA Ensayo Inmuno enzimático Fac. CCQQ y Farmacia Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia FONACYT Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología GC Gastritis crónica HRP Peroxidasa de rábano IBP Inhibidor de bomba de protrones IC Intervalo de confianza IgA Inmunoglobulina IgA IgG Inmunoglobulina IgG IgM Inmunoglobulina IgM IGSS Instituto Guatemalteco de Seguridad Social INCAN Instituto de Cancerología y Hospital “Bernardo del Valle S.” NCCLS Comité Nacional para estándares clínicos de laboratorio

(National Committee for Clinical Laboratory Standards) OMS Organización Mundial de la Salud PCR Reacción de polimerasa en cadena Pep I Pepsinógeno I Pep II Pepsinógeno II PIENSA Departamento de Prevención, Investigación y Educación en

Salud SENACYT Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología USAC Universidad de San Carlos de Guatemala

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ABREVIATURA DE NOMBRES CIENTÍFICOS Bacterias: Helicobacter pylori

H. pylori

Plantas:

Bixa orellana B. orellana Bursera simarouba B. simarouba Chiranthodendron pentadactylon C. pentadactylon Eucalyptus globulus E. globulus Guazuma ulmifolia G. ulmifolia Lippia dulcis L. dulcis Litsea guatemalensis L. guatemalensis Sambucus mexicana S. mexicana Sida rhombifolia S. rhombifolia Tecoma stans T. stans DIMENSIONALES µg microgramos mm milímetros µL microlitros mM mini Molar µL micro Molar mmol milimol cm centímetros msnm metros sobre el nivel del mar g gramos N normal kg kilogramos nm nanómetros L litro pg picogramos M molar rpm revoluciones por minuto Meq miliequivalentes seg segundo mg miligramos ton/ha tonelada/hectárea min minutos UI Unidades Internacionales mL mililitros

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PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN

Helicobacter pylori es una bacteria con forma de espiral, Gram negativo, móvil, curvada, presente en la mucosa gástrica. Coloniza las mucosas no secretoras de ácido del estómago y de la parte alta del tracto intestinal, incluyendo el duodeno (Alarcón, 1994).

La infección que produce ha sido reportada a nivel mundial pero muestra grandes

variaciones geográficas. En los países en vías de desarrollo puede llegar a ser tan alta como el 90% mientras que en los países desarrollados esta es menor y oscila entre el 25 y el 50%. Se estima que la infección es adquirida antes de los diez años y que la prevalencia aumenta con la edad, sin embargo en países en desarrollo y con condiciones socioeconómicas bajas, la tasa de infección en niños es muy elevada, llegando hasta un 80% (Dunn, Cohen& Blaser, 1997).

El modo de transmisión no ha sido del todo definido, pero existen evidencias que

sugieren una transmisión de persona a persona y por ingesta de comida o agua contaminada. Aunque no se conoce un reservorio animal para H. pylori, éste ha sido aislado en varias especies animales (Thomas, 1994).

H. pylori es moderadamente invasivo y coloniza la superficie de la mucosa gástrica,

dondese protege de los ácidos estomacales gracias a la propia capa de mucus gástrico, posteriormente debido a la producción de sustancias patógenas y la propia respuesta del hospedero produce inflamación, destrucción de tejido y ulceración. Las patologías con las que se asocia con más frecuencia son la gastritis en sus variedades crónica activa, folicular, erosiva y atrófica. Se considera que más que comprometer el funcionamiento de la mucosa gástrica, el daño provocado más bien induce cambios malignos en ella.

Estudios epidemiológicos indican que las gastritis crónicas debidas a infecciones por H.

pylori y que no han sido tratadas o en las cuales el tratamiento no ha sido efectivo, pueden ocasionar el desarrollo de cáncer gástrico por el daño causado a la mucosa gástrica. Estas razones originaron que en junio del 1994 la Agencia Internacional de Investigaciones del Cáncer-OMS reconociera al H. pylori como un carcinógeno del grupo I, el rango de peligrosidad más alto otorgado (International Agency forResearchonCancer, 1994).

A fin de evitar las complicaciones anteriormente mencionadas se considera indispensable realizar el diagnóstico oportuno de la infección para administrar el tratamiento específico y principalmente establecer la cura post-tratamiento.

A la fecha se dispone de una variedad de pruebas para el diagnóstico de la infección por H. pylori, los cuales se clasifican en invasivas y no invasivas. Entre los no invasivas, que permiten su aplicación a un mayor número de personas, se encuentran las pruebas

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serológicas y la pruebade aliento, las cuales han sido ampliamente evaluadas y validadas. Estas permiten la detección de varios tipos de anticuerpos pero tienen la desventaja de tener un valor limitado para la confirmación de la erradicación del H. pylori post-tratamiento.Estas pruebas serológicas permiten además de realizar el diagnóstico, diferenciar entre una infección aguda y una crónica. Sin embargo, se desconoce su utilidad en la evaluación de la erradicación de la infección.

En los últimos años se ha introducido la combinación del pepsinógeno I y II, gastrina y

la detección de anticuerpos anti-H. pylori con el fin de realizar un diagnóstico no invasivo de la gastritis atrófica e identificar a los pacientes con un riesgo elevado de sufrir carcinoma gástrico (Valle Muñoz, Artaza Varasa, López Pardo, Rodríguez Merlo, Pérez Grueso, Martín Escobedo, 2007).

Por tal motivo, este estudio serealizó con el fin establecer la prueba o panel de pruebas

que permitan con una mayor sensibilidad y especificidad detectar la infección y posteriormente al término del tratamiento adecuado evaluar la erradicación del microorganismo. Esto favorecerá eliminar pacientes portadores de la infección y que puedan ser transmisores de la misma a sus familiares o personas cercanas así como evitar el desarrollo de las complicaciones asociadas con la infección especialmente el desarrollo de adenocarcinoma. Esta última una de las complicaciones más importantes y por la cual al H. pylori ha sido clasificado como carcinógeno tipo I.

Por otro lado, se obtuvo un banco de cepas de H. pylori para en un futurorealizar otros

estudios relacionados con la infección, entre ellos la caracterización de los aislamientos guatemaltecos y susceptibilidad a drogas antimicrobianas. En este estudio, los aislamientos obtenidos fueron utilizados para el establecimiento de un bioensayo y la validación del uso tradicional de diez plantas nativas que en un futuro puedan ser utilizadas para el desarrollo de nuevas alternativas de tratamiento.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.2.1 Antecedentes

En Guatemala, los primeros estudios sobre esta bacteria se realizaron en el año 1998,

cuando Moreira determinó la prevalencia de anticuerpos IgG en niños que padecían de enfermedad gástrica, encontrando una positividad en el 60% (Moreira, 1998). Otro estudio realizado en el mismo año demostró que el 64% de los pacientes (242) comprendidos entre 12 y 75 años presentaban anticuerpos IgG anti-H. pylori y de ellos el 9.5% (23 pacientes) fueron positivos en la detección de antígeno en cavidades orales al usar la reacción de polimerasa en cadena (PCR) (Dowsett, Archila, Segreto, Gonzalez, Silva, Vastola et al., 1998).

Dowset y colaboradores realizaron un estudio en una comunidad indígena guatemalteca demostrando en niños una importante relación entre la presencia de H. pylorien la lengua y el dedo índice de la mano dominante, lo que les permitió concluir que la mano puede ser un instrumento de transmisión de la infección (Dowsett, Archila, Segreto, Gonzalez, Silva, Vastola et al1999).

García en 1999 realizóun estudio en pacientes con gastritis activa crónica con o sin

presencia de úlcera duodenal, encontrando que la diversidad genética de las cepas circulantes es similar a la observada en otras regiones del mundo y que la infección que se presenta en diferentes regiones del estómago es originada por la misma cepa. En relación a los genes de virulencia, reportaron un gran porcentaje de cepas que presentan patrones genéticos asociados con las cepas más agresivas (García, 1999).

Otro estudio realizado en el mismo año en 242 pacientes entre 12 y 75 años, mostró que

el 64% presentó anticuerpos IgG anti-H. pylori. De ellos, 23 pacientes dieron positiva la detección de antígeno en cavidades orales al usar la PCR (Archila, 1998).

En el año 2002, Oregel determinó anticuerpos IgG anti-H. pylori en recién nacidos y

niños guatemaltecos de baja condición socioeconómica entre 0 y 36 meses de edad, reportando una prevalencia del 68% y una coincidencia del 100% entre las parejas madre/recién nacidos (Oregel, 2002). Posteriormente en el 2004, Afre evaluó a niños de 3 a 10 años de edad de la mismacondición socioeconómica, encontrando una prevalencia del 65.5% (Afre, 2004).

Hernández en el 2002 realizó un esudio en pacientes con cáncer gástrico con el fin de

establecer su relación con la infección por H.pylori y determinar el patrón genético de las cepas asociadas. El muestreo incluyó biopsias obtenidas de tres diferentes regiones del tumor en el estómago (tumor, región cercana y región lejana del tumor) encontrando que el 50.7% de las muestras fueron positivas para al menos una prueba microbiológica de H. pylori. En el análisis genético específico para H. pylori se reportó una positividad del 57.1%, encontrando en el 100% el patrón genético vacA s1/m1, cagA, el cual es asociado a la infección por cepas altamente virulentas y asociadas a infecciones más severas (Hernández, 2002)

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En 2008 se realizó en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia (Fac. CCQQ y

Farmacia) de la Universidad de San Carlos de Guatemala, una serie de estudios relacionados con esta bacteria. El primero de ellos fue realizado por Cruz y colaboradores quienes evaluaron los títulos de anticuerpos IgG e IgM anti-H. pylori en niños de edad escolar que asisten a dos centros educativos de la ciudad capital. En total se evaluaron 114 niños, en los cuales no se obtuvo ningún caso positivo para los anticuerpos IgM mientras que para IgG se obtuvo una positividad del 8.8%(10/114)(Cruz, Hornquist, Maldonado, Morales, Román, Rojas et al 2008).

Lange y colaboradores evaluaron la presencia de anticuerpos IgG e IgM en el personal

docente, administrativo y estudiantes pertenecientes a la Fac. CCQQ y Farmacia. Se incluyó un total de 173 estudiantes, 111 docentes y 48 miembros del personal administrativo. Se obtuvo una frecuencia de anticuerpos IgG del 28.9, 39 y 76% respectivamente, mientras que para anticuerpos IgM la frecuencia obtenida fue de 4.62, 4.82 y 2% respectivamente. Se concluyó que el 39.76%de la población evaluada ha estado en contacto con la bacteria y a pesar que son asintomáticos esta positividad debe ser tomada en cuenta para evitar en un futuro el aparecimiento de patologías como gastritis y cáncer gástrico asociadas a la presencia de H. pylori (Lange, Matta, Nave, Alvarado, Camó, Donis et al., 2011).

Durante el 2008 se realizó una revisión de los datos reportados por los diferentes

hospitales relacionados con el diagnóstico de la infección por H. pylori. Como se puede observar en la Tabla 1, el porcentaje general de infección activa (por detección de antígeno en heces) es del 23.2% y de memoria (detección de anticuerpos IgG) es del 58.7%. Es importante mencionar que el diagnóstico de la infección no se realiza en todos los hospitales públicos y si se realiza no es en una forma constante, lo cual se evidencia con los pocos datos obtenidos (Coronado, Garrido, Hernández, Ortiz, Ramírez, Velásquez et al. 2008; Cordero, Cruz, Gómez, Hermosilla, Matta, Nave et al. 2008; Hernández, Herrera, Mazariegos, Ovalle, Pérez, Quiróz et al. 2008).

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Tabla 1. Diagnóstico de H. pylori en Diferentes Laboratorios de la Ciudad Capital

Anticuerpos IgG Antígeno en Heces

Institución Total Positivo N %

Negativo N %

Total

Positivo N %

Negativo N %

Hospital Roosevelt 272 194 71.3 78 28.7 -- -- Hospital San Juan de Dios

104 11 10.6 93 89.4 -- --

IGSS zona 5 562 301 53.6 261 46.4 76 41 54.0 35 46.0 IGSS zona 6 537 365 67.9 172 32.1 67 47 70.1 20 29.8 IGSS zona 9 1438 810 56.3 628 43.6 17 6 35.3 11 4.7 Laboratorios privados (4) Amedesgua Biomédico Centrolab Biolab

2248

1349 60.0

899 40.0

4448

976 22.0

3472 78.0

Total 5161 3030 58.7 2131 1.3 4608 1070 23.2 3538 76.7 Fuente: Coronado, Garrido, Hernández, Ortiz, Ramírez, Velásquez et al, 2008; Cordero, Cruz, Gómez, Hermosilla, Matta, Nave et al, 2008; Hernández, Herrera, Mazariegos, Ovalle, Pérez, Quiróz et al 2008.

Con el objetivo de determinar la relación que existe entre la presencia de H. pylori detectada en biopsia con las patologías gástricas diagnosticada por endoscopías, Alonzo y colaboradores recopilaron los datos de 1,468 pacientes que acudieron con cinco gastroenterólogos a realizarse este procedimiento. La patología gástrica que se observó mayormente fue la gastritis crónica no atrófica en 415 pacientes (28.2%), seguida de la gastritis no especificada por el médico en 294 pacientes y la gastritis crónica de tipo química en 228 pacientes. El rango de edad en la que se presentó una mayor proporción de infección con H. pylori, es de 41-50 años. Se determinó que el 53% de las patologías encontradas por endoscopías presentaron una asociación con esta bacteria lo que demuestra su importancia como posible agente causal de estos procesos (Alonzo, Arroyo, Benito, Duarte, Matta, Naveet et al. 2009).

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Tabla 2. Asociación Entre H. pylori y la Patología Gástrica Detectada por Endoscopía

Positivo Negativo Patologia gástrica No. % No. %

Total

GC no atrófica 356 24.3 59 4.0 415 GC no especificada por el médico

198 13.5 96 6.5 294

GC mixtas 136 9.2 63 4.3 199 GC erosiva 47 3.2 20 1.4 67 GC atrófica 21 1.4 27 1.8 48 GC de tipo química 9 0.6 219 14.9 228 GC inactiva e inespecificidad

7 0.5 202 13.8 209

Gatritis aguda 2 0.1 0 0 2 Adenocarcinoma 1 0.007 4 0.3 5 Endoscopía normal 1 0.007 0 0 1 Total 778 53 690 47 1468

Fuente: Alonzo L, Arroyo G, Benito M, Duarte A, Matta V, Nave F et al. (2009). Asociación entre la presencia de H. pylori y patologías gástricas detectadas por endoscopias. Revista Científica. Fac. CCQQ y

Farmacia. Vol l4, No1. 34-40.

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I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS I.3.1 Generales I.3.1.1 Evaluación de las alternativas de diagnóstico y evaluación de productos naturales

para el tratamiento sobre la infección por H. pylori. I.3.2 Específicos I.3.2.1 Evaluar el mejor diagnóstico de laboratorio de la infección por H. pylori y de la

evaluación de la cura post-tratamiento al aplicar pruebas más sensibles y específicas.

I.3.2.2 Establecer y evaluar la acción anti-H. pylori de extractos de plantas nativas usadas popularmente en el tratamiento de enfermedades digestivas.

I.3.2.3 Establecer y evaluar las pruebas de laboratorio más sensibles y específicas para realizar el diagnóstico de la infección por H. pylori.

I.3.2.4 Determinar la utilidad de la medición de la gastrina y pepsinógeno I y II en el diagnóstico de la infección por H. pylori.

I.3.2.5 Establecer las pruebas de laboratorio más sensibles y específicas para la evaluación de la cura post-tratamiento de la infección por H. pylori.

I.3.2.6 Establecer y validar un procedimiento para el procesamiento de muestras para el diagnóstico microbiológico de la infección por H. pylori mediante cultivo, técnica de ureasa rápida y observación microscópica del frote teñido por el método de Gram modificado.

I.3.2.7 Desarrollar un banco de cepas con los aislamientos de H. pylori obtenidos de los pacientes que participen en el estudio.

I.3.2.8 Establecer bioensayos para el tamizaje de la acción anti-H pylori de las especies nativas utilizando como blanco bacterias aisladas de muestras clínicas.

I.3.2.9 Establecer, evaluar y validar la acción microbicida y la concentración inhibitoria mínima de especies vegetales nativas utilizadas popularmente para el tratamiento de enfermedades digestivas.

I.3.2.10 Divulgar a las autoridades, actores sociales e institucionales en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación

I.3.3 Hipótesis I.3.3.1 El papel de pepsinógeno I/II y gastrina aunados a las pruebas serológicas

favorece el diagnóstico de la infección y la evaluación de la cura post-tratamiento.

I.3.3.2 Al menos uno de los extractos evaluados tiene acción inhibitoria sobre H. pylori.

21

I.4 METODOLOGIA 1.4.1. Localización

El presente proyecto fue llevado a cabo en la Fac. de CCQQ y Farmacia, de la Universidad de San Carlos en las instalaciones del Departamento de Citohistología de Escuela de Química Biológica, situado en el segundo nivel del edificio T-11, Ciudad Universitaria. En estas instalaciones se realizó toda la parte experimental del proyecto, la cual incluyó cultivo microbiológico de las muestras de biopsia gástrica, detección del antígeno de H. pylori en heces, detección de anticuerpos IgG cagA, IgA e IgM específicos de las muestras séricas, cuantificación de pepsinógeno I y II y de gastrina.

Los aislamientos de H. pylori obtenidos se encuentran almacenados en los congeladores

y tanques de nitrógeno líquido en el Depto. de Citohistología. Las plantas incluidas en el estudio, fueron seleccionadas según sus usos populares para

afecciones gastrointestinales crónica y colitis, de una base total de 521 datos. Esta muestra posteriormente fue delimitada hasta llegar a un total de 121 plantas que además de ser usadas para afecciones gastrointestinales, se indicaba su uso para gastritis. De ellas se seleccionó un total de 10 extractos etanólicos los que fueron utilizados para realizar el bioensayo para la detección de la actividad anti-H. pylori.Los extractos etanólicos de nueveespecies se obtuvieron de la colección de extractos del Departamento de Citohistología siendo necesario recolectar únicamente una especie, la cual fue posteriormente secada y preparado su extracto etanólico seco.

Se contó con el apoyo del INCAN, donde se realizó la captación de los pacientes con

sintomatología sugestiva de enfermedad péptica a quienes se les realizó una entrevista y la endoscopía para la obtención de la biopsia gástrica. Antes de la realización del procedimiento endoscópico, a cada paciente se le extrajo una muestra de sangre y se recolectó una muestra de heces, para lo cual se utilizó las instalaciones del Instituto.

Los médicos gastroenterólogos del INCAN Drs. Jorge Gómez y Carlos Zetina realizaron

las endoscopías, y el seguimiento clínico de los pacientes con resultados de biopsia positiva y/o un resultado positivo en serología. Se realizó seguimiento durante5 meses después de haber concluido el tratamiento, para lo cual fueron citados para la toma de muestra en las instalaciones del INCAN. I.4.2 Variables I.4.2.1 Variables dependientes: I.4.2.1.1 Sintomatología de la infección por H. pylori, presencia de anticuerpos IgG, IgA,

IgM específicos y valores de gastrina, pepsinógeno I y II. I.4.2.1.2 Inhibición del crecimiento del H. pylori por los extractos de la especies evaluadas I.4.2.2 Variables independientes: I.4.2.2.1. Infección por H. pylori

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I.4.2.2.2. Composición química y características biológicas de las plantas evaluadas.

I.4.3 Indicadores I.4.3.1 Presencia de H. pylori detectada por coloración de Hematoxilina-eosina en

biopsia gástrica. I.4.3.2 Sintomatología clínica presente asociada a la infección. I.4.3.3 Detección de anticuerpos IgG, IgM e IgA anti H. pylori evaluada por método

ELISA. 1.4.3.4 Detección de antígeno de H. pylori en muestras fecales. I.4.3.5 Valores detectados de gastrina y pepsinógeno I y II por método ELISA I.4.3.6 Aislamientos de H. pylori obtenidos de las muestras de biopsia gástrica de los

pacientes I.4.3.7 Extractos de las 10 plantas evaluadas. I.4.3.8 Ausencia del crecimiento de H. pylori en el bioensayo realizado con cada uno de

los 10 extractos. I.4.3.9 Cambios en los valores de gastrina, pepsinógeno I y II y en las pruebas

serológicas a los cinco meses post-tratamiento. I.4.3.10 Cambios en la sintomatología de los pacientes post-tratamiento durante los cinco

meses que duró el seguimiento. I.4.4 Estrategia Metodológica I.4.4.1 Captar pacientes con sintomatología sugestiva de enfermedad péptica en el

INCAN, quienes aceptaron participar en el estudio se les solicitó llenar la ficha epidemiológica y firmar el consentimiento.

I.4.4.2 Detectar antígeno de H. pylori en muestras fecales. I.4.4.3 Determinar anticuerpos IgG (cag A), IgM e IgA en las muestras séricas por el

método de ELISA (antes y cinco meses después de finalizado el tratamiento). I.4.4.4 Determinar la concentración de pepsinógeno I y II y de la gastrina (antes y cinco

meses después de finalizado el tratamiento). I.4.4.5. Seleccionar las especies vegetales a estudiar y preparar los extractos etanólicos. I.4.4.5. Cultivar las biopsia para el aislameinto de H. pylori en medio Columbia

enriquecido I.4.4.6. Identificar los aislamientos como H. pylori por pruebas bioquímicas. I.4.4.7. Evaluar la actividad anti-H. pylori de los extractos de las diez plantas en estudio. I.4.5 Población y Muestra I.4.5.1. Población

• 404 pacientes con sintomatología de enfermedad péptica y que acudieron a las jornadas de prevención de cáncer gástrico realizadas en el 2010 y 2011. • Plantas medicinales nativas de Guatemala que son utilizadas por la

población para el tratamiento de sintomatología gastrointestinal.

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I.4.5.2 Muestra

• 178 pacientes con sintomatología de enfermedad péptica que acudieron al INCAN para su tratamiento y control a quienes se les realizó una endoscopía y aceptaron voluntariamente a participar en el estudio. De ellos, 72 pacientes que finalizaron su tratamiento aceptaron participar en el seguimiento que duró cinco meses, después del cual se les tomaron las muestras de laboratorio.

• Diez extractos de plantas medicinales de uso popular para el tratamiento de afecciones gastrointestinales.

I.4.6 Métodos I.4.6.1 Captación de pacientes y toma de muestra I.4.6.1.1 Captación de pacientes: A los pacientes que acudieron al INCAN con síntomas

de enfermedad péptica y a realizarse una endoscopia, se les entrevistó (Anexo 1) y a quienes aceptaron voluntariamente a participar se les obtuvo el consentimiento informado (Anexo 2).

I.4.6.1.2 Muestra de sangre: A cada paciente luego de haber firmado el consentimiento

informado y antes de realizarle la endoscopía, se le extrajo 5mL de sangre venosa por medio de venipunción. Para la determinación de anticuerpos anti-H- pylori IgM, IgG cagA e IgA, pepsinógeno I y II se utilizó suero. Las muestras fueron centrifugadas y alicuotadas a temperatura ambiente y luego trasportadas en cadena de frío al laboratorio, para posteriormente conservarse a -80°C hasta el momento de realizar las pruebas. El mismo procedimiento se realizó cinco meses después de haber iniciado el tratamiento.

Se les cuantificó la concentración de pepsinógeno I y II y gastrina, para lo cual se

utilizó una muestra de plasma, la cual luego de su separación se transportaron en cadena de frio y almacenadas a -80 °C hasta su proceso.

I.4.6.1.3 Muestra de heces: El paciente proporcionó una muestra de heces frescas, las

cuales fueron transportadas en cadena de frio al laboratorio para su posterior análisis. El mismo procedimiento se realizó cinco meses después de haber iniciado el tratamiento.

Cada una de las muestras fue debidamente rotulada con la fecha de toma de muestra, código del paciente, el cual fue asignado al momento de la toma de datos para la ficha epidemiológica (a la cual se le asignó un número de orden correlativo).

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I.4.6.2 Aislamiento y mantenimiento de cepas de H. pylori provenientes de biopsias gástricas

I.4.6.2.1 Materiales y equipo

• Sangre de carnero • Hemoglobina • Agar base Columbia • Suplemento nutritivo Isovitalex • Suplemento selectivo Skirrow (OXOID) • Jarra anaeróbica • Sobres para microaerofilia CampyPack BBL • Tubos de ensayo con tapón rosca • Cajas de petri desechables • Caldo urea • Medio de transporte Cary Blair (o medio Stuart) • Colorante para tinción de Gram • Portaobjetos • Caldo Brucella + 15% de glicerol • Leche descremada estéril • Medio BHI + 15% de glicerol • Oxidasa • Hielera para transporte de muestras • Batería para mantener la temperatura en 4ºC • Autoclave • Campana de flujo laminar • Campana bacteriológica • Balanza analítica • Incubadora • Refrigeradora • Congelador a -70°C o nitrógeno líquido • Centrífuga • Pipetas automáticas • Estufa • Microscopio binocular • Incinerador • Bandejas para tinción • Soportes para tinción

I.4.6.2.2 Procedimiento I.4.6.2.2.1 Preparación de medios de cultivo

Agar sangre de carnero 7.5%. Base Columbia: • Se midió 555mL de agua destilada.

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• Se pesó 22.5g de agar base Columbia. • Se disolvió los 22.5g en 555mL de agua destilada por calentamiento. • Se esperó que hirviera y se retiró. Se autoclaveó 15min a 121°C • Se dejó enfriar a 50-45°C. • Se agregó 45mL de sangre de carnero. • Se sirvió en las cajas de petri, se enfrió y se almacenó con la base hacia

arriba. • Se realizó control de esterilidad. • El resto se almacenó en bolsa cerrada a temperatura de 2 a 8°C. Agar sangre de carnero 7.5% más suplemento nutritivo Isovitalex. Base Columbia: • Se midió 555mL de agua destilada. • Se pesó 2.5g de agar base Columbia. • Se disolvió los 22.5g en 555mL de agua destilada por calentamiento. • Se hiervó y se retiró. Se autoclaveó 15 minutos a 121°C • Se dejó enfriar a 50 - 45°C. • Se agregó los 45mL de sangre de carnero. • Se sirvió en las cajas de petri, se dejó enfriar y se almacenó con la base hacia

arriba. • Se agregó el suplemento nutritivo Isovitalex. • Se realizó el control de esterilidad. • El resto se almacenó en bolsa cerrada a temperatura de 2 a 8°C. Agar chocolate base de hemoglobina al 1%: • Se disolvió 13.2g en 136mL de agua destilada comenzando con 10mL y

luego se agregó poco a poco hasta completar la cantidad mencionada. • Se preparó agar base Columbia en 487mL de agua destilada. • Se autoclaveó 15 min. A 121°C. • Se agregó los 136mL de hemoglobina y se mezcló. • Se agregó 6.0mL de solución nutritiva Isovitalex. • Se sirvió en cajas de Petri en ambiente estéril.

NOTA: El volumen final (600mL) correspondió al volumen total. Este se dividió en dos soluciones; Hemoglobina (113mL) y agar base Columbia (487mL) los cuales se mezclaron después de esterilizar en autoclave (aproximadamente 45°C).

I.4.6.2.2.2 Aislamiento de H. pylori

Procedimiento con maceración de la muestra: • Se obtuvo la biopsia • Se preservó en medio de transporte Cary Blair • Con hasa se colocó en macerador con 0.5mL de solución salina estéril. • Se maceró. • Se agregó dos gotas de la solución macerada al medio de cultivo (utilizar

pipeta estéril)

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• Se estrió con asa estéril • Se incubó en jarra de microaerofilia por 6 días a 37°C. • Se buscaron colonias pequeñas, ligeramente grises, como gotas de rocío. Procedimiento con aislamiento directo de la biopsia: • Se obtuvo la biopsia • Se preservó en medio de transporte Cary Blair • Con hasa estéril se colocó en medio de cultivo y se estrió. • Se incubó en jarra por 6 días a 37°C. • Se buscaron colonias pequeñas, ligeramente grises, como gotas de rocío. Reaislamiento de colonias sospechosas: • Se buscaron colonias pequeñas, ligeramente grises, como gotas de rocío. • A partir de las colonias sospechosas se realizó la prueba de oxidasa, catalasa,

urea. H. pylori es positivo para las tres pruebas. • Se realizó tinción de Gram para confirmar la morfología de la bacteria.

Fotografía 2. Colonias características de H. pylori


Mantenimiento de la cepa • A partir de un cultivo confirmado de H. pylori, se estió en otro medio de

cultivo, en un cuarto de la caja con agar sangre de carnero al 7.5 por ciento. • Se sembró en forma masiva para obtener el mayor crecimiento posible. • Se Incubó en jarra anaeróbica con sobre Campy-Pack por 48 horas • Se recolectó todo el crecimiento y se reaisló utilizando media caja de petri

con agar sangre de carnero al 7.5 por ciento. • Se incubó en jarra anaeróbica con sobre Campy-Pack por 48 horas. • Se recolectó todo el crecimiento y se reaisló utilizando la caja de petri

completa con agar sangre de carnero al 7.5 por ciento. • Se incubó en jarra anaeróbica con sobre Campy-Pack por 48 horas • Se colocó en caldo brucella con 15 por ciento de glicerol, leche descremada

o caldo BHI con 15 por ciento de glicerol. • Se almacenó a -70ºC

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Tinción de Gram • Se colocó dos gotas del material macerado en un portaobjetos. • Se esperó a que secara y se fijó con calor • Se agregó sobre la lámina cristal violeta por un minuto • Se lavó con agua del grifo • Se agregó lugol por un minuto • Se decoloró con alcohol acetona (2-3 gotas) • Se lavó con agua de grifo • Se agregó con carbol fucsina por cinco minutos • Se lavó con agua de grifo • Se secó. • Se observó el frote buscando bacilos pequeños semi curvos, Gram negativo.

Fotografía 3. Bacilos curvos Gram negativo, H. pylori


Pruebas bioquímicas Oxidasa • Se tomó con un palillo una colonia sospechosa y se colocó en la tira reactiva. • Una coloración morado-negro indicó una reacción positiva. • Una coloración rosada indicó una reacción negativa. Catalasa • Se colocó en un porta objetos una gota de Peróxido de Hidrógeno al 5% • Con un asa estéril se tomó una colonia sospechosa y se colocó sobre la gota. • La formación de burbujas indicó una reacción positiva. Ureasa • Se colocaron de 3 a 5 gotas de la muestra macerada en el caldo urea. • Si la prueba fue confirmatoria, con el asa estéril se tomaron las colonias y se

colocaron en el caldo urea.

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• Un cambio de coloración de rosado a fucsia en un intervalo de 3 horas máximo indicó una reacción positiva.

• Se interpretó como negativo si el color del medio permaneció igual.

Fotografía 4. Pruebas bioquímicas para identificación de H. pylori


I.4.6.3 Determinación cuantitativa de anticuerpos IgM anti H. pylori por la técnica ELISA

I.4.6.3.1 Materiales

• Microplaca de 96 pozos • Puntas de pipeta de volumen 10 a 200µL • Puntas de pipeta de volumen 200 a 1000µL • Agua destilada o desionizada • Cronómetro • Papel absorbente • Papel parafilm • Descartadores • Muestras • Gradilla

I.4.6.3.2 Equipo

• Micropipetas calibradas (5 a 100µL y 100 a 1,000µL) • Lector de placas de ELISA 450 nm/630nm • Vortex

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I.4.6.3.3 Reactivos • Kit para determinación de anticuerpos IgM anti H. pylori International

Immuno-Diagnostics ®, 96 determinaciones. I.4.6.3.4 Procedimiento

Preparación de Reactivos • Solución de lavado (20x): es estable cuando se almacena entre 2-8ºC por una

semana.

Para preparar 1,000mL de solución: • 100 ml buffer de lavado (10x) más 900mL de agua desmineralizada. • Todas muestras y los reactivos del kit se llevaron a temperatura ambiente

(20-25ºC) y se mezclaron suavemente. Procesamiento de muestras • Se colocó el número deseado de tiras recubiertas en el soporte. • Se preparó una dilución 1:40, adicionando 5 µLde la muestra, control

negativo, control positivo y calibrador en 200 µLde la solución absorbente. Se mezcló bien.

• Se agregó 100µl de la dilución del suero, calibrador y controles en los pozos apropiados e identificados. Para el blanco de reactivo se agregó 100µL de la solución sorbente en la posición 1A de la microplaca.

• Se elimaron las burbujas de aire y se mezclaron bien. • Se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente (25ºC). • Se removió el líquido de todos los pozos y se realizó tres ciclos de lavado

con buffer de lavado (350µL/pozo). • Se agregó 100µl de conjugado enzimático a cada pozo. • Se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente (25ºC). • Se removió el conjugado enzimático de todos los pozos y se realizó tres

ciclos de lavado con buffer de lavado (350µL/pozo). • Se agregó 100µL de Substrato TMB (cromógeno) a todos los pozos. • Se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. • Se agregó 100µL de solución de parada (HCl 2N). • Se eliminaron las burbujas de aire en cada pozo antes de la lectura. • Se leyó a 450nm con un lector de microplacas. Cálculo de los resultados • Se calculó la media de los duplicados del valor por cada calibrador • Se calculó la media del control positivo, control negativo y muestras de

paciente por duplicado. • Se calculó índice de anticuerpos IgM anti H. pylorien cada determinación

dividiendo el valor medio de cada muestra por el calibrador de valor medio. Interpretación Negativo: índice menor de 0.90 indica que la muestra es negativa para anticuerpos IgM contra H. pylori.

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Dudoso: índice entre 0.91 a 0.99 es indeterminado. Se recomienda procesar de manera paralela con una nueva muestra de suero 3 semanas después.

Positivo: índice mayor de 1.00 indica la presencia de anticuerpos IgM anti H. pylori, o infección activa

Limitaciones • El ensayo debe utilizarse sólo para evaluar pacientes con síntomas y signos clínicos

sugestivos de enfermedad gastrointestinal. • Un resultado positivo indica una infección activa y colonización por H. pylori. Esto no

indica necesariamente que la enfermedad gastrointestinal está presente. I.4.6.4 Determinación cuantitativa de anticuerpos IgA anti H. pylori por la técnica

ELISA I.4.6.4.1 Materiales

• Microplaca de 96 pozos • Puntas de pipeta de volumen 10 a 200 µL • Puntas de pipeta de volumen 200 a 1000 µL • Agua destilada o desionizada • Cronómetro • Papel absorbente • Papel parafilm • Descartadores de material infeccioso • Muestras • Gradilla

I.4.6.4.2 Equipo • Micropipetas calibradas (5 a 100µL y 100 a 1,000µL) • Lector de placas de ELISA a 450 nm /630nm • Vortex

I.4.6.4.3 Reactivos

• Kit para determinación de anticuerpos IgA anti H. pylori International Immuno-Diagnostics ®, 96 determinaciones.

I.4.6.4.4 Procedimiento

Preparación de Reactivos: Solución de lavado (20x): • Para preparar 1 L de solución se agregó mezclando 100mL buffer de lavado

(10x) + 900mL de agua desmineralizada. Procesamiento de muestras • Todas las muestras y los reactivos del kit se llevaron a temperatura ambiente

(20-25º C) y se mezclaron suavemente.

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• Se colocó el número deseado de tiras recubiertas en el soporte. • Se prepaó una dilución 1:40, adicionando 5µL de la muestra, control

negativo, control positivo y calibrador en 200µL de la solución absorbente. Se mezcló bien.

• Se agregó 100µL de la dilución del suero, calibrador y controles en los pozos apropiados e identificados. Para el blanco de reactivo se agregaron 100µL de la solución absorbente en la posición 1A de la microplaca.

• La microplaca se agitó suavemente para eliminar las burbujas de aire del líquido y se mezcló bien.

• Se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente (25ºC). • Se removió el líquido de todos los pozos y se realizó tres ciclos de lavado

con buffer de lavado (350µL/pozo) • Se agregó 100µL de conjugado enzimático a cada pozo. • Se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente (25ºC). • Se removió el conjugado enzimático de todos los pozos y se realizó tres

ciclos de lavado con buffer de lavado (350µL/pozo) • Se agregó 100µL de Substrato TMB cromogénico a todos los pozos. • Se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. • Se agregó 100µL de solución de parada (2 N HCl). • Se eliminaron las burbujas de aire en cada pozo antes de la lectura. • Se leyó a 450 nm/630 nm con un lector de microplacas. Cálculo de los resultados • Se calculó la media de duplicados del valor por cada calibrador. • Se calculó la media del control positivo en los controles negativos y

muestras de paciente duplicados. • Se calculó el índice de en cada determinación dividiendo el valor medio de

cada muestra por el calibrador de valor medio. Interpretación: Negativo: índice menor de 0.90 indica que la muestra es negativa para

anticuerpos IgA contra H. pylori. Dudoso: índice entre 0.91 a 0.99 es indeterminado. Se recomienda procesar de

manera paralela con una nueva muestra de suero 3 semanas después. Positivo: índice mayor de 1.00 indica que la muestra es positiva para

anticuerpos IgA anti H. pylori. Limitaciones • El ensayo debe utilizarse sólo para evaluar pacientes con síntomas y signos clínicos

sugestivos de enfermedad gastrointestinal. • Un resultado positivo indica una infección activa y colonización por H. pylori. Esto no

indica necesariamente que la enfermedad gastrointestinal está presente. • Resultados de la prueba se debe utilizar en conjunto con la información disponible del

paciente, evaluación clínica y otros procedimientosde diagnóstico. I.4.6.5 Determinación de anticuerpos IgG cag A antiH. pylori por la técnica de ELISA

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I.4.6.5.1 Materiales • Puntas de pipeta de volumen 10 a 200µL • Puntas de pipeta de volumen 200 a 1000µL • Agua destilada o desionizada • Cronómetro • Papel absorbente • Microplacas para ELISA • Papel parafilm • Descartadoresde material infeccioso • Muestras de pacientes • Gradilla

I.4.6.5.2. Equipo • Lector de placas de ELISA con filtros de 450nm y 620-630nm • Micropipetas calibradas (10 a 100µL y 100 a 1,000µL) • Incubadora para microplacas a 37ºC • Vortex

I.4.6.5.3 Reactivos • Kit para determinación de anticuerpos IgG cag A anti H. pylori International

Immuno-Diagnostics ®, 96 determinaciones. I.4.6.5.4 Procedimiento

Preparación de los reactivos La microplaca se llevó a temperatura ambiente (alrededor de 1 hora) antes del proceso Determinación cuantitativa • Se diluyeron las muestras de 1:101 en un tubo de dilución adecuadamente

rotulado (se pipeteó 100 µL diluyente a + 10µL de muestra). Se mezcló con cuidado en vortex. Nota: los calibradores están listos para usar, no se diluyeron.

• Se colocó el número de pocillos necesarios en la microplaca. Se dejó los pozos A1 y B1 vacíos para el blanco.

• Se pipeteó 100µL de los calibradores y 100µL de suero control por duplicado. Luego se pipeteó 100µL de las muestras diluidas en cada pocillo debidamente identificado.

• Se incubó la microplaca durante 60 minutos a 37°C. Nota: Las tiras se sellaron con el adhesivo de cierre de aluminio.

• Se lavaron los pocillos (4-5 ciclos de lavado dispensando 350 µL/pozo de solución de lavado = 1 ciclo, de 20-30 segundos entre cada ciclos).

• Se pipeteó 100µL de conjugado enzimático en cada pocillo, excepto A1 y B1 (pozos del blanco) y se cubrió con el sellador.

• Se incubó la microplaca durante 60 minutos a 37 °C. • Se lavaron los pocillos como en el paso anterior.

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• Se pipetearon 100 µL de mezcla cromógeno/sustrato en cada pocillo, incluyendo los pozos A1 y B1. Se incubó la microplaca a temperatura ambiente (18-24ºC) durante 20 minutos. Nota: La microplaca y el reactivo no se expusieron a la luz directa.

• Se pipetearon 100µL de ácido sulfúrico para detener la reacción enzimática en todos los pozos con la misma secuencia de pipeteo que en el paso 9. El control positivo y las muestras positivas viraron el color azul al amarillo.

• Se medió la intensidad del color de la solución en cada pocillo. (El lector de microplacas debe tener un filtro de lectura de 450 nm y, preferiblemente, con un segundo filtro entre 620-630nm).

Limitaciones • Las muestras hemolizadas o hiperlipémicas, muestras que contienen residuos de

fibrina o partículas pesadas o filamentos microbianos y organismos se descartaron, ya que podrían dar lugar a resultados falsos.

• Los sueros y plasma se almacenaron entre +2 - + 8°C hasta cinco días después de la recolección. Para períodos más largos de almacenamiento, las muestras se congelaron a -20°C durante varios meses. Todas las muestras congeladas no se congelaron/descongelaron más de una vez ya que esto puede generar partículas que podrían afectar el resultado de la prueba.

• Si se observaron partículas presentes se centrifugó a 2,000rpm durante 20 min.

I.4.6.6 Detección del Antígeno de H. pylori en heces I.4.6.6.1 Materiales y equipo

• Dispositivos del test • Tubos colectores de espécimen con buffer de extracción • Cuentagotas • Ficha técnica • Colector para la colección de muestra • Centrífuga • Pipeta para dispensar 80µL • Cronómetro

I.4.6.6.2 Procedimiento • Se colocó suficiente cantidad de heces (1-2 mL o gr) en un envase colector

de muestras limpio y seco para obtener la cantidad importante de antígenos. Para procesar muestras fecales • Muestras sólidas: La tapa del tubo colector de muestra se desenroscó y se

introdujo el aplicador dentro de la muestra fecal en al menos 3 sitios diferentes para colectar aproximadamente 50 mg de heces.

• Muestras líquidas: con el gotero verticar se aspiró la muestra fecal, luego se transfirieron 2 gotas (aproximadamente 80 µL) dentro del tubo colector de la muestra que contiene el buffer de extracción.

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• Se ajustó la tapa del tubo colector de la muestra y se agistó vigorosamente el tubo para mezclar la muestra con el buffer de extracción. Se dejó el tubo solo por 2 minutos.

• Antes de abrir el sobre, este se llevó a temperatura ambiente. Se removió la placa del sobre laminado y se usó tan pronto fue posible. Los mejores resultados se obtuvieron cuando el examen se realizó inmediatamente después de abrirse el sobre laminado.

• Se sostuvo el tubo colector hacia arriba y se rompio la punta del tubo colector de la muestra. Se invirtió el tubo colector de la muestra y se transfirieron 2 gotas completas de la muestra extraída al pozo de la muestra (S) de la placa de examen, y se tomó el tiempo. Se evitó las burbujas en el pozo de la muestra.

• Se esperó a que las líneas coloreadas aparecieran. Se leyeron los resultados a los 10 minutos después de haber dispensado las gotas de la muestra. No debía excederse 20 minutos.

I.4.6.7 Determinación cuantitativa de pepsinógeno I por la técnica ELISA I.4.6.7.1 Materiales

• Gradilla • Puntas de pipeta de volumen 10 a 200µL • Puntas de pipeta de volumen 200 a 1000µL • Tubos de vidrio desechables de 12 x 75 mm o 13 x 100 mm • Papel de aluminio • Agua destilada o desmineralizada • Papel parafilm

I.4.6.7.2.Equipo • Espectrofotómetro para leer la absorbancia a 450 nm. • Pipetas calibradas (5 a 100µL y 100 a 1,000µL) • Vortex

I.4.6.7.3 Reactivos

• Kit para determinación pepsinógeno I, International Immuno-Diagnostics ®, 96 determinaciones.

I.4.6.7.4Procedimiento

Preparación de los reactivos • Antes de usar todos los reactivos, estos alcazaron la temperatura ambiente. • La solución de trabajo se diluyó antes de trabajar. • Se reconstituyeron todos los reactivos y controles agregando 1mL de agua

destilada. Todos los estándares y controles se dejaron reposar por 10 minutos, y después se mezclaron suavemente.

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• Se preparó la mezcla de anticuerpos (Ac) trazador/ captura: Para cada tira de pozos se requirió: 1mL de diluyente de trazador con la adición con 50mL de anticuerpo trazador y 50mL de anticuerpo de captura en un tubo de ensayo.

Procedimiento del ensayo • Se colocó en la microplaca:

o A1 a F1: estándares o G1 a H1: controles o A2 en adelante: muestras

• Se agregó 50µL de estándares, controles y muestras del paciente. • Se añadió 100µL de la mezcla de anticuerpos trazador/captura. • Se mezcló suavemente y se cubrió la placa con papel aluminio para evitar la

exposición a la luz. • Se incubó la placa a temperatura ambiente (25ºC) por 60 minutos. • Se removió el papel de aluminio y se descartó la solución. • Cada pozo se lavó 5 veces, con la suspensión de lavado de 350 µL/pozo. • Se agregó 100µL del sustrato HRP en cada pozo. • La placa se cubrió con un sellador y con papel aluminio para evitar la luz. • Se incubó la placa a temperatura ambiente (25ºC) por 20 minutos. • Se removió el papel aluminio y se agregó 100µL de solución de parada en

cada pozo. • Se leyó la absorbancia a 450nm dentro de 10 minutos en un lector de

microplacas. I.4.6.8 Determinación cuantitativa de pepsinógeno II por la técnica ELISA I.4.6.8.1 Materiales

• Gradilla • Puntas de pipeta de volumen 10 a 200 µL • Puntas de pipeta de volumen 200 a 1000 µL • Tubos de vidrio desechables de 12 x 7 mm o 13 x 100mm • Papel de aluminio • Agua destilada o desmineralizada • Papel parafilm

I.4.6.8.2 Equipo • Espectrofotómetro para leer la absorbancia a 450nm/630nm • Pipetas calibradas (5 a 100µL y 100 a 1,000µL) • Vortex

I.4.6.8.3 Reactivo

• Kit para determinación de Pepsinógeno II, International Immuno-Diagnostics ®, 96 determinaciones.


36

Preparación de los reactivos • Antes de usar todos los reactivos, estos se llevaron a temperatura ambiente. • La solución de trabajo se diluyó antes de trabajar. • Se reconstituyeron todos los reactivos y controles agregando 1mL de agua

destilada. Todos los estándares y controles se dejó reposar por 10 minutos y después se mezcló.

• Se preparó la mezcla de anticuerpos (Ac) trazador/captura: Para cada tira de ocho pozos, se requirió 1mL de diluyente de trazador con la adición con 50mL de anticuerpo trazador y 50mL de anticuerpo de captura en un tubo de ensayo. NOTA: Se aseguró que los sólidos se disolvieran por completo antes de usar. Los estándares y controles reconstituidos se almacenaron a -10°C o por debajo. No se superó los tres ciclos congelación-descongelación.

Procedimiento del ensayo • Se colocó en la microplaca:

o A1 a F1: estándares o G1 a H1: controles o A2 en adelante: muestras

• Se agregó 50µL de estándares, controles y muestras del paciente. • Se añadió 100µL de la mezcla de anticuerpos trazador/captura. • Se mezcló suavemente y se cubrió la placa con papel aluminio para evitar la

exposición a la luz. • Se incubó la placa a temperatura ambiente (25ºC) por 2 horas. • Se removió el papel de aluminio y se descartó la solución. • Se lavó cada pozo 5 veces, con la suspensión de lavado de 350 µL/pozo. • Se agregó 100µL del sustrato HRP en cada pozo. • Se cubrió la placa con un sellador y con papel aluminio para evitar la luz. • Se incubó la placa a temperatura ambiente (25ºC) por 20 minutos. • Se removió el papel aluminio y se agregó 100µL de solución de parada en

cada pozo. • Se leyó la absorbancia a 450/630nm dentro de 10 minutos en un lector de

microplacas. I.4.6.9 Determinación cuantitativa de la gastrina I.4.6.9.1 Materiales

• Microplacas • Acetato sellador de placas • Puntas de pipeta de volumen 10 a 200µL • Puntas de pipeta de volumen 200 a 1000µL • Pipetas automáticas de 5 a 100µL y de 100 a 1000µL • Puntas descartables para pipetas • Bolsas rojas para descarte de desechos • Gradillas • Beaker • Papel absorbente

37

• Tubos con EDTA (1 mg / mL de sangre).

I.4.6.9.2 Equipo • Lector de placas de microtitulación a 405nm. • Agitador de placas de 300-50 rpm • Incubadora a 37ºC • Centrífuga a 0ºC • Refrigerador a -70ºC (para almacenar el plasma)

I.4.6.9.3 Reactivos • Kit para determinación de gastrina International Immuno-Diagnostics ®, 96

determinaciones.

I.4.6.9.4. Procedimiento Manejo de muestra: • Muestra requerida es plasma con EDTA. • La muestra se recolectó en un tubo frío con EDTA. Se centrifugó a 17.000

xgdurante 15 minutos a 4°C y se guardó el sobrenadante. • Se almacenó a -20° C. Preparación de reactivos: • Las soluciones estándar se llevaron a temperatura ambiente. Solución de lavado concentrada: • Se preparó la solución de trabajo de la siguiente manera:

5mL de tampón de lavado concentrado + 95 mL de agua destilada. Solución Estándar: • Estándar 1: 22 µL de diluyente de estándar + 25 µL de estándar

concentrado (100,000 pg/mL) • Estándar 2-5: 187.5 µL de diluyente de estándar + 62.5 µL del

tubo #1. • Se realizaron las diluciones del tubo 2 al 3, 4 y 5 respectivamente.

Tabla 3. Diluciones y concentraciones teóricas de la gastrina

Tubo Buffer de ensayo

(µL) Estándar

(µL) Volumen

(µL) Concentración

pg/mL 1 225 25 ------ 10,000 2 187.5 62.5 250 solución #1 2,500 3 187.5 62.5 250 solución #2 650 4 187.5 62.5 250 solución #3 156.25 5 187.5 62.5 250 solución #4 39. 1

Se utilizaron dentro de 60 minutos posteriores a su preparación.

38

Conjugado a una dilución 1:10 • En un tubo limpio se agregó: 5µL de conjugado concentrado + 45 µL de

buffer de ensayo. Procesamiento de Muestras • Los reactivos se llevaron a temperatura ambiente durante al menos 30

minutos antes de la apertura. • En la placa se colocó el número de pozos a utilizar y pozos restantes se

colocaron en la bolsa y se almacenaron a 4°C. • Se pipeteó 100µL de diluyente de ensayo en el NSB y Bo (0 pg/ml estándar)

en cada pozo. • Se agregó 100µL de estándar del # 1 al # 5 en los pozos correspondientes y

en los pozos siguientes 100µLde las muestras. • Se pipetearon 50µLde tampón de ensayo en el pozo de NSB. • Se pipeteó 50µL de conjugado azul en cada pozo, EXCEPTO en el blanco y

el de actividad total (AT). • Se agregó 50µLde anticuerpos amarrillo en cada pozo, EXCEPTO en el

blanco, AT y NSB. • Se mezcló y tapó con el sellador de placa y se incubó a temperatura

ambiente en un agitador de placas durante 2 horas a aproximadamente 500 rpm.

• El contenido de los pocillos se vació y se lavó añadiendo 200µL de solución de lavado a cada pozo. Se repitió el lavado 2 veces más para un total de 3 lavados.

• Después del lavado final, el aspirado de los pozos se vació y se secó firmemente la placa sobre un papel absorbente o toalla para eliminar cualquier resto de tampón de lavado.

• Se añadió 5µLdel conjugado 1:10 (según se indicó en la preparación de los reactivos) al pozo AT (actividad total).

• Se añadió 200µLde sustrato en cada pozo, se selló la placa e incubó a 37°C durante 3 horas.

• Añadir 50µL de solución stop a todos los pozos. • Se leyó inmediatamente a 405 nm con filtro secundario entre 570 y 590 nm.

Cálculo de resultados • Se trazó la curva de calibración (log-log), colocando en el eje de las X la

concentración del estándar y el eje de las Y la absorbancia. La curva demostró una relación inversa entre la concentración del estándar y la absorbancia. La concentración del estándar aumentó, mientras que la intensidad del color amarillo disminuyó

I.4.6.10 Ensayo de actividad contra H. pylori por extractos de plantas I.4.6.10.1 Materiales

• Jarra anaeróbica

39

• Cajas de Petri desechables estériles • Cajas de Petri cuadriplate estériles • Asas bacteriológicas en argolla de nicromo • Asas bacteriológicas desechables estériles de 0.001mL • Espátulas • Crioviales • Papel parafilm • Tubos cónicos plásticos estériles con tapón de rosca de 50 mL • Filtros 0.10 nm • Puntas amarillas 10 a 100 µLestériles • Puntas azules de 100 a 1000µLestériles • Pipetas desechables • Papel aluminio • Papel mayordomo • Algodón • Bolsas de cierre hermético • Jeringas estériles de 10 y 5 mL • Marcadores indelebles • Tijeras • Agua desmineralizada no estéril y estéril • Tubos de ensayo con tapón rosca • Portaobjetos • Maceradores • Erlenmeyer con topón de rosca de 100 mL • Erlenmeyer de 500 mL • Frascos con tapón de rosca de 100 y 500 mL • Pipetas Pasteur • Goteros • Balones de destilación • Balones aforados • Pinzas

I.4.6.10.2 Equipo • Autoclave • Campana de flujo laminar • Campana bacteriológica • Balanza analítica • Refrigeradora • Estufa • Incinerador de asas • Percolador • Rotavapor • Vortex o agitador

I.4.6.10.3 Reactivos • Claritromicina • Etanol al 50% y 70%

40

• Isopropanol al 95% y 70% • Metanol absoluto • Dimetilsulfóxido (DMSO) • Estándar de McFarland 3.0 • Pastillas efervescentes Alka Seltzer

I.4.6.10.4 Medios de cultivo para recuperación de H. pylori • Agar sangre de carnero (ASC) 7.5% (base Columbia) • Agar sangre de carnero (ASC) 7.5% (base Columbia), mas Isovitalex • Agar sangre de carnero (ASC) 5% (base Columbia) • Agar chocolate, mas Isovitalex (hemoglobina, base Columbia) • Agar Müeller-Hinton al 5% de sangre de carnero • Agar Müeller-Hinton al 7% de sangre de carnero • Agar planta base Müeller-Hinton al 5% de sangre de carnero • Agar planta base Müeller-Hinton al 7.5% de sangre de carnero • Agar planta sangre de carnero (ASC) 5% (base Columbia) • Agar planta sangre de carnero (ASC) 7.5% (base Columbia)


I.4.6.10.5.1 Obtención del extracto vegetal de Tecoma stans (Timboco)

• Se pesó 430.16 g de la hoja seca. • Se colocó una porción de algodón en la parte inferior y papel filtro en la

parte interna del percolador, a manera de crear un filtro para partículas grandes.

• Se transfirió todo el material al percolador y se cubrió con etanol al 50% y se dejó reposar por 18-24 horas.

• Se recolectó en un erlenmeyer todo el disolvente agregado y se transfirió a un balón de destilación de 1,000 mL.

• Se agregó el disolvente recuperado al material de extracción en el percolador (se repitió la operación para obtener el mayor porcentaje de rendimiento posible).

• Se colocó el balón con la muestra y se sujetó con la llave correspondiente. Se estableció una rotación de 50-60% y una temperatura entre 40-60°C.

• Se generó el vació por medio de una bomba hasta llegar una presión de 300-200atm, cuantas veces se consideró hasta agotar el disolvente.

• Una vez concentrado el extracto se retiró el balón y se colocó el extracto obtenido en cristalizador de vidrio previamente tarado.

• Se dejó en la desecadora durante 15 días y verificó la consistencia sólida del extracto, se guardó en frascos y almacenó en refrigeración a 4°C.

41

I.4.6.10.5.2 Preparación de dilución del extracto a concentración conocida (100

µg/mL) • Se pesó 0.028g de cada extracto y disolvió en 7mL de etanol al 50%. Se

llevó a una concentración 4,000µg/mL. • Se agregó a la solución de cada extracto, 7mL de agua desmineralizada

estéril para obtener una concentración de 2,000µg/mL. Se homogenizó y se filtró dos veces

• Se preparó el agar planta a una concentración final de 100µg/mL para cada extracto (1mL de agua destilada estéril + 1mL de extracto + 18 mL de ASC 7.5%).

I.4.6.10.5.3 Inóculo de microorganismos

• Se preparó una suspensión de cada bacteria equivalente a 9 x 108 UFC/mL (estándar de McFarland 3) de las cepas A, B y C.

• Se inoculó cinco estrías de cada aislamiento con asas bacteriológicas calibradas de 0.001mL.

• Una asada del estándar de Mc Farland 3 se inoculó al control positivo (ASC 7.5%+1mL de Claritromicina 0.125 µg/mL+1 mL de agua desmineralizada estéril) y control negativo (ASC 7.5% + 1mL de agua desmineralizada estéril+1 mL de etanol al 50%).

• Se incubó durante 6 días en jarra gas pack con sobre Campygen® 2.5L a 37°C.

I.4.6.10.5.4 Interpretación de resultados

Extracto activo: Presencia de crecimiento en la línea de inóculo. Extracto inactivo: Ausencia de crecimiento (más del 50%). Para la validez del ensayo se evaluó el resultado de los controles: Positivo: Ausencia de crecimiento Negativo: Presencia de crecimiento.

I.4.7 Técnica Estadística I.4.7.1 Alternativas para el diagnóstico por cultivo y evaluación de productos naturales para tratamiento

I.4.7.1.1Aislamiento

Muestra por intención, buscando obtener el mayor número de aislamientos posibles.

I.4.7.1.2 Metodología de aislamiento

Con las cepas obtenidas, se realizó el procedimiento de ensayo y error, se evaluó la metodología y se corrigieron los puntos críticos.

I.4.7.1.3 Bioensayo

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Se evaluaron los diez extractos para determinar si presentaron o no efecto anti-H.pylori, ensayo binomial (susceptible o resistente). Se prepararon los medios agar planta con cada extracto a una concentración conocida (100 µg/mL) y tres estándares de MacFarland 3.0 con los tres aislamientos obtenidos de 3 pacientes, se estriaron al azar sobre el agar. Se realizaron cinco réplicas de cada estría en los 10 extractos, para un nivel de significancia α = 0.05 (según la tabla de probabilidad binomial). El diseño experimental es totalmente al azar (el orden de los estriados en el agar debió ser diferente en cada ensayo).

I.4.7.1.4 Análisis

I.4.7.4.1 Prueba de hipótesis binomial:

Ho: p<0.5 (no tiene efecto inhibitorio) Ha: p>0.5 (si tiene efecto inhibitorio) Con cinco réplicas para α = 0.05, se esperaba que todas presentaron el efecto inhibitorio para rechazar Ho, para concluir tiene efecto significativo. La determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) se realizó a partir de la dilución de los extractos que presentaron actividad en el bioensayo; es decir, los que presentaron por lo menos un 50% de crecimiento. Con lo que se procedió a diluir el extracto por dilución en agar a las concentraciones: 100, 50 y 25 µg/mL.

I.4.7.2 Alternativas para el diagnóstico por pruebas serológicas y antígeno fecal.

I.4.7.2.1 Tipo de estudio:

Estudio de cohorte prospectivo. I.4.7.2.2 Número de muestras:

n= número de pacientes que cumplen con los criterios de inclusión (n= 125 pacientes por conveniencia)

I.4.7.2.3 Análisis estadístico:

La comparación de las siete pruebas diagnósticas para H. pylori se realizó contra la biopsia, considerada para estudio como el estándar de oro. A cada uno de los pacientes se les realizó el panel completo de pruebas, se estableció la sensibilidad y especificidad de cada prueba, a través de tablas de contingencia de 2 x 2. El resultado de cada prueba se comparón contra el resultado de la biopsia, de tal manera que se permitiera detectar el número de falsos positivos y negativos. Así también se evaluó la concordancia entre resultados por medio del índice Kappa.

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A los pacientes positivos se les dió seguimiento durante cinco meses después de finalizado el tratamiento y se les realizó el mismo panel de pruebas al final de dicho período. Debido a que en esta segunda etapa no hay patrón de comparación (biopsia), se evaluó la concordancia entre el panel de pruebas por medio de un índice Kappa ponderado. Así mismo se evaluó el grado de asociación de los niveles de pepsinógeno I/ II respecto con la sintomatología pre y post-tratamiento que los pacientes refieren, por medio de Chi cuadrado. En forma descriptiva se compararon los resultados de la primera y segunda fase, en función de identificar los métodos más sensibles y específicos o el comportamiento de dichas pruebas en el desarrollo del estudio, así como la negativización de los valores como resultados de la terapia anti-H. pylori. Para evaluar la significancia en la etapa pre y post se utilizó la prueba X2 de McNemar.

I.4.8 Instrumentos utilizados I.4.8.1 Equipo

Las instituciones participantes aportaron el siguiente equipo:

I.4.8.1.1 Instituto de Cancerología –INCAN- Aportó el equipo necesario para la realización de la endoscopía y obtención de la biopsia gástrica en el área de Gastroenterología, entre los que se pueden mencionar camilla y endoscopio. El laboratorio clínico proporcionó el área para la entrevista de los pacientes y para la toma de muestra sanguínea y recolección de la muestra de heces fecales. Así también el equipo para la separación de la muestra de suero y plasma y el almacenamiento de muestras cuando no pudieron ser transportadas inmediatamente. Entre ellos se mencionan: centrífuga, refrigerador, congelador a -60o C y gabinete para almacenamiento de materiales.

I.4.8.1.2 Laboratorio de Bioensayos y de Inmunodiagnóstico del Departamento de Citohistología de la Escuela de Química Biológica En estos laboratorios se realizó el procesamiento de las muestras para la determinación de anticuerpos anti-H. pylori, pepsinógeno I y II gastrina. Así como el bioensayo para la detección de la actividad inhibitoria de las plantas. Entre este equipo se incluye incubadoras, rotavapores, autoclave, congelador a -80oC, refrigeradora, cristalería, balanza analítica, campana microbiológica, lector de ELISA, micropipetas y gabinete para almacenamiento de materiales.

I.4.8.2 Materiales El departamento de Citohistología proporcionó la mayoría de la cristalería (vasos de precipitar, pipetas, matraces, refrigerantes), materiales (guantes, puntas plásticas descartables, microplacas) y reactivos (disolventes, estándares, medios

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de cultivo). Algunos materiales y los reactivos para serología y medios de cultivo utilizados fueron complementados con los fondos del proyecto.

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PARTE II. MARCO TEÓRICO II.1 Helicobacter pylori

Helicobacter pylori es una bacteria en forma de S o de bastón curvado, Gram negativo, móvil, microaerofílica que se encuentra en la mucosa gástrica del estómago humano (Alarcón, 1994). Posee de dos a seis flagelos unipolares de aproximadamente 3µm de largo, cada uno cubierto con una vaina rica en proteínas y polisacáridos, responsables de su movilidad. Puede presentarse en una forma cocoide, que se cree que son células envejecidas o muertas que no pueden ser cultivadas. Su característica bioquímica más importante es que posee la enzima ureasa, la cual es más potente que en otras bacterias. Posee además las enzimas oxidasa y catalasa cuya presencia ayuda a su identificación (Olivares & Gisbert, 2006).

Existen varias descripciones histológicas realizadas por patólogos alemanes desde 1874,

pero no fue hasta principios del 1980 que fue considerada una bacteria responsable de patologías gástricas (Hunt, Xiao, Megraud, Leon-Barua, Bazzoli, Van der Merwe, Vaz Coelho et al., 2006).

En 1983 Warren la aisló por primera vez y describió las características morfológicas de

una bacteria similar a Campylobacter jejuni por lo que se le denominó “Campylobacter like organism”. Marshall en el mismo año describió su aislamiento, características microbiológicas y bioquímicas. En el mismo año, Skirrow sugirió que por su localización próxima al píloro deberían denominarse Campylobacter pyloridis, nomenclatura que años más tarde fue sustituida por Campylobacter pylori (Murray, Rosenthal, Kobayashi, Tsaller, 2004).

Finalmente en 1984 fue publicado por primera vez su asociación con la gastritis crónica

y sugiriendo también por vez primera que la úlcera péptica pudiera ser de etiología infecciosa (Kuster, Vliet & Kulper, 2006). Posteriormente, en 1989, Goowich y colaboradores con base en los estudios de la ultraestructura de la bacteria describieron características, fundamentalmente en relación con los ácido grasos celulares, que la diferencian del género Campylobacter, sugiriendo el nombre de H. pylori con el cual es conocida hasta la actualidad (Hernández & Rivera, 2003).

II.2 Infección por H. pylori

La ruta más común de infección por H. pylori puede ser a través de contenido estomacal transmitido boca a boca (oral-oral), o por contacto feco-oral. En un hospedero susceptible H. pylori establece una gastritis crónica activa que es caracterizada por un infiltrado del epitelio gástrico y de la lámina propia por neutrófilos, linfocitos T y B, macrófagos y mastocitos. Los mastocitos, usualmente responsables del balance de la respuesta inmune pueden ser importantes efectores en la patogénesis de la gastritis. Sin embargo, H. pylori, no parece invadir la mucosa gástrica, aunque la evidencia sugiere que el moco crea un nicho en el que la bacteria es protegida de las secreciones gástricas.

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La liberación de citocinas del hospedero después del contacto directo de H. pylori con

las células epiteliales de la cubierta gástrica recluta células inflamatorias en el área infectada.

La infección por H. pylori ha sido asociada a deficiencia de hierro y de algunas

vitaminas. Se cree que una de las principales causas es la reducción de la secreción del ácido clorhídrico como producto de la infección que lleva a una mala absorción de nutrientes. Otra explicación para la deficiencia de hierro y otros elementos puede ser la predisposición a sufrir diarreas como consecuencia de la barrera ácida del hospedero contra los patógenos o una solubilidad alterada (Barabino, 2002).

Varios estudios han demostrado que la prevalencia de H. pylori aumenta con el edad

alcanzando un pico entre los 50-60 años, observándose que luego tiende a bajar. Se cree que es debido a la progresión de la gastritis atrófica en los pacientes ancianos por lo que el estómago se vuelve un ambiente inhabitable para la bacteria (Goldschmiedt, Barnett, Schawarsz, Karnes, Redfern, Feldman, 1991).

Debido a la diferencia entre la prevalencia y las dificultades para el diagnóstico de la

infección y sobre todo a que los síntomas pasan desapercibidos, los investigadores han realizado estudios con cohortes de la población a quienes les han realizado pruebas diagnósticas en forma repetitiva y con un seguimiento de varios años. En los países en vías de desarrollo se ha encontrado una seroconversión anual en adultos del 1.9%, mientras que en los países industrializados es de 0.3-1.0 % (Pérez-Pérez, Rothenbacher & Brenner, 2004).

II.3 Características clínicas de la infección

Los pacientes portadores de la infección presentan dolor abdominal generalmente epigástrico, acompañado de vómitos en aproximadamente la tercera parte de los niños, y en menor proporción anorexia, con pérdida de peso, pirosis y sensación de plenitud post-prandial. Histológicamente, se observa gastritis antral y solo en un pequeño número de casos se detecta úlcera duodenal y excepcionalmente úlcera gástrica. H. pylori posee ciertos factores de patogenicidad como la citotoxina asociada al gen cagA y la toxina vacuolizante asociada al gen vacA, que se relacionan con la aparición de úlcera y cáncer gástrico en adultos.

Esta bacteria se ha asociado con gastritis crónica, úlcera péptica y duodenal, así como

con linfomas y adenocarcinomas gástricos lo que ha llevado a que en junio del 1994 la Agencia Internacional de Investigaciones del Cáncer - OMS reconociera al H. pylori como carcinógeno del grupo I, el rango de peligrosidad más alto otorgado (IARC, 1994; NIH, 1994; Hernández, 2001).

Se ha encontrado mucha similitud entre la epidemiología de la infección por H. pylori y

la del cáncer gástrico. En un estudio realizado por el grupo EUROGAST en 17 poblaciones de 11 países europeos, Japón y los Estados Unidos se encontró una estrecha relación entre las prevalencias entre estas dos patologías, estimándose que el 10% de incremento en la

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prevalencia de la infección se asociaba con el 27% de aumento del cáncer gástrico (Eurogast, 1994). Por otro lado, el linfoma (MALToma) a bajo grado de células B puede experimentar una regresión después de la erradicación del H. pylori, lo que ha sugerido que esta bacteria puede jugar un papel etiológico en este tipo de linfoma (Graham, 1994). II.4 Epidemiología de la infección por H. pylori

Esta es una infección que ocurre a nivel mundial pero muestra grandes variaciones geográficas. En los países en vías de desarrollo puede llegar a ser tan alta como el 90% mientras que en los países desarrollados esta es menor y oscila entre el 25 y el 50% (Dunn, Cohen, Blaser, 1997). Se estima que la infección es adquirida antes de los diez años y que la prevalencia aumenta con la edad, sin embargo en países en desarrollo y con condiciones socioeconómicas bajas, la tasa de infección en niños es muy elevada, llegando hasta un 80% (Hernández, 2001; Salgueiro, Zubillaga, Goldman, Barrado, Martínez Sarrasague, Leonardiet et al., 2004). En las poblaciones afroamericanas, latinos e indígenas la infección ocurre desde los primeros años y se observan una transmisión intrafamiliar bastante alta (Cave, 1997).

La infección por Helicobacter pylori es reconocida como un problema de salud a nivel

mundial por ser la causa más común de gastritis crónica activa y estar fuertemente ligada a enfermedad ulcerativa péptica y duodenal, jugando un papel etiopatogénico importante en el adenocarcinoma gástrico y el linfoma superficial gástrico primario (MALT). Desde 1994 la Organización Mundial de la Salud –OMS- incluyó a Helicobacter pylori como carcinógeno Tipo 1 para el ser humano (IARC Monographs WHO, 1994).

Mientras que la infección es usualmente adquirida durante la infancia existe un largo período de latencia hasta la edad adulta, cuando aparecen manifestaciones clínicas de enfermedad gástrica. El cáncer gástrico, cuando aparece, no se manifiesta usualmente hasta edad avanzada, sin embargo la infección ocasiona un alto rango de morbilidad pero bajo de mortalidad, debido a que puede ser erradicado por terapia antibiótica (Malaty, 2002).

Se ha determinado en algunos países que la infección se caracteriza por una rápida tasa

de adquisición llegando a prevalencias de infección cercanas al 80% en pacientes de 20 años, debido a que la enfermedad se adquiere frecuentemente durante la infancia. En países desarrollados el pico de elevación se manifiesta en el grupo de 20 a 30 años de edad.

La Organización Mundial de Gastroenterología –WGO- (2010) señala que H. pylori se

encuentra en la mitad de la población mundial. La prevalencia varía de país en país, e inclusive en las diferentes áreas geográficas de cada país, así mismo se encuentran variaciones por grupo étnico, edad y factores socioeconómicos, encontrando mayor correlación entre el estado socioeconómico durante la infancia. Se ha determinado que la prevalencia es mayor en países en desarrollo que en países desarrollados.

A nivel mundial las cepas de H. pylori han sido asociadas a diferentes grados de virulencia, lo que junto con diferentes factores ambientales, puede ser la razón que la enfermedad se exprese de manera diversa. Entre los principales factores de riesgo se identifican el bajo acceso a servicios sanitarios, agua potable y drenajes, bajo nivel

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educativo, pobres prácticas higiénicas durante la infancia, manipulación inadecuada de los alimentos, hacinamiento, todos ellos, factores asociados con el bajo nivel de desarrollo socioeconómico. Se consideran como formas de transmisión las vías feco-oral, oral-oral y gastro-oral. La bacteria puede también ser transmitida a través de exposición con agua o alimentos contaminados (Vale, F., Vítor, J., 2010, Malaty & Nyren 2002).

Una disminución constante en la prevalencia de la infección por H. pylori y la incidencia de cáncer gástrico ha sido observada en algunos países desarrollados en las últimas décadas. Poblaciones con alto riesgo de cáncer gástrico son infectadas con cepas más virulentas, comparadas con poblaciones con bajo riesgo. En algunos individuos, han sido aislados más de una cepa de H. pylori colonizando la mucosa gástrica, lo que ocasiona variaciones en la virulencia. Concomitantemente con la disminución en las tasas de cáncer y la prevalencia de la infección, muchos cambios han ocurrido en estas sociedades, especialmente aquellos relacionados con el desarrollo económico. Incluyendo aspectos sanitarios en el hogar, menor número de miembros familiares, cambios en los hábitos dietéticos como menor consumo de sal y mayor ingesta de frutas y verduras (Correa & Piazuelo, 2008).

Se estima que entre 68 y 70% de la población adulta de Guatemala presenta anticuerpos

IgG anti H. pylori, lo que significa que tienen o han tenido infección gástrica por esta bacteria. En 2004 se determinó la presencia histológica de infección gástrica activa por H. pylori en adultos dispépticos, siendo ésta de 89% en el grupo de condición socioeconómica baja y de 67% en los de condición socioeconómica alta. En 2,002 se determinó la seroprevalencia de este microorganismo en niños pobres entre 9 y 10 años de edad, quienes presentaron una seroprevalencia de 65.7% mediante la determinación de anticuerpos IgG contra H. pylori, lo cual evidencia que la primoinfección con esta bacteria en este grupo poblacional sucede a temprana edad (Oregel, 2002; Afre & Flores, 2004).

Se analizaron 337 biopsias de pacientes que consultaron por enfermedad péptica al Hospital Roosevelt de 1994 a 1997, de ellas 38.5% fueron positivas por histología. En 2001 se determinó la presencia de anticuerpos IgG contra H. pylori en adultos con rosácea, urticaria crónica, neurodermatitis y grupo control, con frecuencias de 86.3% sin encontrar diferencia significativa entre el grupo control y los pacientes en estudio. Así mismo se determinó la presencia de antígenos de H. pylori en heces en pacientes con urticaria crónica idiopática con una frecuencia de 67.5% (Toledo, 1997, Castañeda, 2001, Ordoñez, 2004).

Estudios realizados en la Universidad de San Carlos de Guatemala, muestra frecuencia

de infección por este microorganismo arriba del 70%. En 2011 se evaluó la frecuencia de anticuerpos IgG anti H. pylori en 151 expendedores de alimentos de la Universidad de San Carlos de Guatemala, determinando una frecuencia de seropositividad para estos anticuerpos en 72.19% de los expendedores, sin encontrar ninguna asociación con síntomas como dolor de estómago, nausea, pérdida de peso, diarrea, boca amarga, acidez, dolor de cabeza ni vómitos. De igual manera no se presentó asociación con la presencia de estos anticuerpos con los factores de riesgo tales como hacinamiento, salario, acceso a agua potable y a servicios sanitarios (Cifuentes, Silvestre, Lange & Matta 2012).

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Al evaluar la frecuencia de anticuerpos IgM e IgG anti Helicobacter pylori en estudiantes, personal docente y administrativo de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, se determinó una frecuencia de 39.76% de anticuerpos IgG anti H. pylori, 28.9% en estudiantes, 39% en docentes y 76% en personal administrativo. La frecuencia para anticuerpos IgM fue de 4.8%, 4.62% en estudiantes, 2% en personal administrativo y 4.8% en docentes. No se pudo encontrar relación entre la frecuencia de los anticuerpos con sintomatología de malestar gastrointestinal (Lange, Matta, Nave, Alvarado, Camó, Donis et al 2011).

Se determinó la frecuencia de anticuerpos IgG anti H. pylori en 435 profesionales de salud (químicos biólogos, odontólogos y médicos). Se comparó la población profesional con población libre de riesgo ocupacional, observando que no hay asociación al ser profesional de estas carreras con la presencia de anticuerpos IgG anti H. pylori, con frecuencias de 29.7% en profesionales de salud con riesgo ocupacional y 24.9% en personas sin riesgo ocupacional (Orozco, Posada, Robles, De León, Lange, Matta 2011).

En 2010 la prevalencia de la infección reportada por la WGO para Guatemala en niños

de 5-10 años es de 51%, en adultos de 65%, en general los rangos de seropositividad para la infección por H. pylori aumentan progresivamente con la edad. Los datos reportados para México en grupo etario de 5-9 años son de 43% y en adultos de 70-90%.

II.5 Métodos de diagnóstico II.5.1 Pruebas serológicas para Helicobacter pylori

Los métodos diagnósticos de la infección por H. pylori se dividen tradicionalmente en directos e indirectos. Los primeros se basan en la demostración de microorganismos mediante el estudio de muestras obtenidas por biopsia gástrica, mientras que los segundos se basan en el estudio y la detección de ciertas características de la bacteria (p. ej., la capacidad de hidrolizar la urea, propiedad en la que se basa la prueba del aliento) o de la respuesta del sistema inmunitario del huésped frente a la infección (detección de anticuerpos específicos mediante las diversas pruebas serológicas). Este último tipo de técnicas no precisan endoscopia y, por lo tanto, pueden considerarse poco agresivo para el enfermo (Gisbert, Cruzado, Cabrera, Carpio, Benito, Pérez et al 2000).

La determinación de anticuerpos específicos contra antígenos de H. pylori en suero, o prueba serológica, es comúnmente utilizada para diagnosticar la presencia de H. pylori en la mucosa gástrica. El método es de fácil realización, gran disponibilidad y diferentes estudios realizados sugieren que su eficacia es superior al 90% (Zapatier, Gómez, Vargas & Maya, 2007).

Los anticuerpos IgG contra H. pylori se correlacionan con la severidad de la gastritis antral y la densidad de la colonización antral por H. pylori, al punto que un alto índice de absorbancia indica gastritis antral severa y una densa colonización del antro. Además, se ha documentado una discrepancia entre una prevalencia baja por tinción histológica y una prevalencia alta de seropositividad para H. pylori en pacientes con gastritis crónica atrófica

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o no atrófica. Esto sugiere que la determinación sérica de IgG pueda ser más útil que la histología en determinar la infección presente o previa por H. pylori en pacientes con gastritis crónica atrófica o no atrófica (Bravo, Cortéz, Carrascosa, Correa, Ordoñez, 2000).

Existen cepas más virulentas del organismo (proteína cagA positivas) que se asocian con más probabilidad con la úlcera gástrica o duodenal, y orientan un poco acerca de estrategias de tratamiento designadas a esos grupos críticos. En este sentido, se ha demostrado la utilidad de las pruebas serológicas que asociadas con la seropositividad para anti-cagA y niveles de pepsinógeno I pueden identificar personas que tienen enfermedad gastroduodenal aun en ausencia de síntomas y que se deben tratar. Esto puede ser alguna parte de la explicación de porqué sólo unas pocas personas infectadas desarrollan enfermedad ulcerosa gástrica o duodenal y menos aun cáncer gástrico (Bravo, Cortéz, Carrascosa, Correa, Ordoñez, 2000).

La eficacia de la serología IgA es limitada de acuerdo a varios autores y no ha sido tan relevante como la determinación de IgG. La sensibilidad de IgA sérica es mayor que la de IgA secretora obtenida de saliva y jugo gástrico, la cual no es mayor de 25%. A de pesar que la serología IgA tiene menor sensibilidad que la serología IgG, se ha propuesto que no se debe estimar la prevalencia del H. pylori utilizando únicamente IgG ya que la eficacia de la serología en general incrementa al utilizar IgG e IgA simultáneamente (Zapatier et.al., 2007). Debido a que dichos anticuerpos van a persistir por muchos años, no son útiles para el seguimiento de los pacientes, por consiguiente solamente sirven para establecer el diagnóstico epidemiológico para estudios de prevalencia (Serrano, González, Rollan, Duarte, Torres et al, 2008).

En un estudio con un grupo de niños, adolescentes y adultos, se evaluó la IgG, IgA, IgM

y se pudo observar que las sensibilidades y especificidades eran relativamente aceptables para IgG, relativamente buenas para IgA y bastante malas para IgM. La IgM, a diferencia de en otras infecciones, no desempeña rol alguno. La IgG y la IgA sólo sirven para estudios epidemiologicos ya que persisten mucho tiempo (Serrano, González, Rollan, Duarte, Torres et al, 2008).

Un estudio realizado en Utah reportó que la IgG contra H. pylori correlaciona más con

la prueba de antígeno fecal que con IgA e IgM. Así también la IgG fue mucho más específica en niños que en adultos, corroborando el hecho de que los adultos son más propensos a haber sido expuestos a H. pylori en el pasado. Dado que la serología no puede medir la actividad de la enfermedad, no es sorprendente que la IgG e IgA fueron más frecuentemente positivos que la prueba de antígeno fecal la cual es un indicador más exacto de enfermedad activa. Estos datos son coherentes con la baja especificidad de la serología de los anticuerpos IgA e IgG. IgM se he encontrado que tiene poca utilidad diagnóstica para H. pylori y se eleva solo después de la infección aguda, mientras que las infecciones por H. pylori son generalmente crónicas, por consiguiente tiene una sensibilidad extremedamente baja y a esto se debe su falta de utilidad clínica, ya sea en niños o adultos (She, Wilson & Christine, 2009)

Se ha propuesto, ante un paciente joven con síntomas dispépticos y sin signos de «alarma», la utilización de la alternativa denominada test and treat que, como su nombre

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indica, se basa en la investigación de la presencia de infección por H. pylori mediante los métodos diagnósticos indirectos como la serología y, en caso de demostrarse, su consiguiente tratamiento. Una ventaja de la serología «rápida» consiste en utilizar sangre capilar obtenida mediante punción digital, mientras que la serología «clásica» requiere la extracción de sangre total, que ha de ser centrifugada para la posterior separación del suero. La exactitud diagnóstica de la serología «rápida» en los diferentes estudios llevados a cabo en otros países, si bien existe una notable variación en los resultados, los cuales son generalmente subóptimos (Gisbert, Cruzado, Cabrera, Carpio, Benito, Pérez Poveda et al, 2000).

La persistencia de una respuesta inmunológica (detectada por la serología) en un paciente sin infección activa podría deberse a la desaparición espontánea del microorganismo o al tratamiento antibiótico por otra infección no relacionada, o al desarrollo de lesiones como atrofia gástrica y metaplasia intestinal que no pueden ser colonizadas por H. pylori.

Las pruebas serológicas permiten la detección de anticuerpos IgG, IgA e IgM y se han

usado técnicas con diferentes principios inmunológicos. Estas tienen la desventaja de tener un valor limitado en la confirmación de la erradicación del H. pylori, y en la mayoría de los pacientes requiere de 6 a 12 meses para que el título de anticuerpos descienda al 50% (Velasco, 2007). Se ha sugerido que los test de ELISA deben de ser validados en cada región geográfica para asegurar el desempeño en cada región debido a la gran heterogeneidad de los antígenos presentes en las diferentes cepas. Estudios realizados en varias regiones han reportado sensibilidades que varían entre el rango de 95.1–98.5% y especificidades entre 90.2- 100%, dependiendo de la población estudiada (Mitchel, Bohane, Tobias, Bullpitt, Daskalopoulos, Carrick et al, 1993).

El número de estudios publicados sobre la validación local de la serología es creciente y

su metodología varía desde la comparación entre diferentes marcas comerciales hasta la comparación entre la utilización de antígenos locales y foráneos. En la población Japonesa se determinó que no existe diferencia en la eficacia diagnóstica de las diferentes marcas comerciales para la determinación de anticuerpos de tipo IgG y que se pueden mejorar las cifras de eficacia si en los equipos comerciales se utilizan antígenos extraídos de pacientes locales. La especificidad de pruebas fabricadas en países occidentales fue considerablemente baja al realizarlas en pacientesorientales, como fue demostrado en un estudio realizado en Tailandia. En Costa Rica la utilizaciónde antígenos autóctonos no mostró ventaja alguna en comparación con los antígenos foráneos (Zapatier, Gómez, Vargas & Maya, 2007). II.5.2 Otras pruebas de diagnóstico no específicas

En el test del aliento se detecta la producción de la urea, por un isótopo radioactivo (14C) o por un isótopo estable (13C). Este último ha sido utilizado en niños pequeños, mujeres embarazadas y lactantes, poblaciones en las cuales no es permitido el uso de isótopos radioactivos (Páez Valery, Barón, Solano, Nadaff, Boccio y Barrado, 2006).

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En los últimos años se ha introducido la combinación del pepsinógeno I y II, gastrina y la detección de anticuerpos anti H. pylori con el fin de realizar un diagnóstico no invasivo de la gastritis atrófica e identificar a los pacientes con un riesgo elevado de sufrir carcinoma gástrico (Valle Muñoz, Artaza Varasa, López Pardo, Rodríguez Merlo, Pérez Grueso, Escobedo, 2007).

En 2007, en la convención médica realizada en Helsinki se estableció el GastroPanel el

cual utiliza los marcadores pepsinógeno I y II, gastrina-17, anticuerpos IgG e IgA anti-H. pylori. Con los resultados de este panel es posible realizar el diagnóstico de la infección por H. pylori, de la gastritis y su localización (cuerpo, antro o ambos). Si los resultados son normales indican que el paciente sufre de una dispepsia funcional u otra enfermedad que no afecta la mucosa gástrica. Por otro lado la mayoría de los cánceres gástricos surgen de una mucosa gástrica afectada por gastritis crónica atrófica, por lo que se considera que estos dos marcadores pueden ayudar en el tamizaje de las personas con un alto riesgo de desarrollar cáncer gástrico (Oliveros, Albis, Ceballos, Ospina, Villamizar, Escobar, 2003).

En Japón este GastroPanel ha sido utilizado como un test de tamizaje para cáncer

gástrico no invasivo y se considera positivo un valor de PGI menor de 70ng/mL y PGI/II menor de 3 y de ésta forma se ha disminuido la mortalidad por este tipo de cáncer (Miki, Ichinose, Ishikawa, Yahagi, Matsuhima, Kakei, 1993).

Se ha encontrado una asociación entre la presencia de la infección crónica por H. pylori

y la elevación de los niveles de pepsinógeno I y II. Estos dos marcadores permiten evaluar el estado funcional y morfológico de la mucosa gástrica, ya que a medida que la gastritis atrófica se hace más severa, la función glandular se pierde.

El pepsinógeno es el precursor de la pepsina, es una proteína aspártica que es

principalmente secretada por las células principales de las glándulas oxíntecas de la mucosa del cuerpo gástrico. El pepsinógeno es el precursor de la pepsina y existe principalmente en dos formas: pepsinógeno I, es secretado por las células principales y mucosas del cuerpo gástrico y está íntimamente relacionado con la secreción ácida gástrica. Es un indicador indirecto de la atrofia del cuerpo; pepsinógeno II el cual es secretado por las células principales de la mucosa del cuerpo, antro, fondo del estómago y también por las glándulas duodenales. Es también producido por las glándulas pilóricas del antro y por las glándulas de Brunner en el duodeno proximal. Ambos pespsinógenos son liberados en pequeñas cantidades en la circulación lo que permite su medición en el suero (Naito, Ito, Watanabe, Suzuki, 2005; Asaka, Kimura, Kudo, Takeda, Mitani, Miyazaki, 1992).

Se ha encontrado que los valores de pepsinógeno permanecen estables a través del día,

no se ven afectados por dieta o ejercicio, varían poco con el género y parecen permanecer constantes en la edad después de la segunda década. Los niveles de pepsinógeno se correlacionan con la apariencia histológica de la mucosa gástrica, encontrándose niveles bajos en la atrofia gástrica o gastritis atrófica (Nolan, 1958).

Estudios realizados por Goldschmiedt y colaboradores demostraron que los valores de

pepsinógeno I, II y ácido gástrico aumentan con el edad al igual que la prevalencia de la infección por H. pylori. Este efecto ha sido observado principalmente en hombres. Ellos

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reportaron que la prevalencia de H. pylori aumentaba con el edad, observándose un pico entre los 50-60 años, y luego tiende a bajar. Esta asociación ha sido encontrada en otros estudios y se cree que es debido a la progresión de la gastritis a atrófica en los pacientes ancianos por lo que el estómago se vuelve un ambiente inhabitable para la bacteria. (Goldschmiedt, Barnett, Schawarsz, Karnes, Redfern, Fedman, 1991). Por otro lado los dientes y encías se han propuesto como reservorios de la infección y las personas ancianas al perder la dentadura pierden su sitio reservorio (Khandaker, Scott, Eastwood, Palmer, 1991).

A medida que la gastritis progresa, la inflamación lleva a un aumento del I y II, al incrementar la atrofia, las células principales son reemplazadas por las glándulas pilóricas, por lo que el pepsinógeno II se mantiene igual y el I disminuye. En varios estudios se ha encontrado que los valores de pepsinógeno II regresan a los valores normales después del tratamiento efectivo contra la bacteria, considerándose este un marcador importante para la evaluación de la erradicación de la bacteria (Gisbert, Boixeda, Vila, Rafael, Alvarez Baleriola et al., 1995).

La gastrina-17 es el fragmento biológicamente activo de la gastrina y es secretado casi

exclusivamente por las células G antrales. Es una hormona producida por las células G situadas en el antro gástrico. Los factores que regulan su secreción son complejos pero no se ha encontrado diferencia entre la edad y el género, pero si por la infección por H. pylori, el que se cree interfiere en los mecanismos fisiológicos que regulan la liberación de la gastrina (Mossi, Meyer-Wyss, Renner, Merki, Gamboni, Beglinger, 1993).

El H. pylori induce al aumento de la gastrina por la producción de amonio a través de su

enzima ureasa, lo que ocasiona un aumento en el pH en la capa celular del antro lo que a su vez inhibe que el mecanismo regulador de la secreción de la gastrina actúe mediante un mecanismo de una baja acidez intragástrica. Por otro lado la gastrina se eleva por la inflamación local como se observa en otras gastritis (Wyatt, Rathbone, Green, Primrose, 1989).

Los valores altos de gastrina observados producen un aumento en la cantidad de las

células parietales y en secreción de ácido, los que contribuyen a la producción de las úlceras duodenales. Sin embargo se ha observado que después del adecuado tratamiento, los valores regresan a normales (Levi, Beardshall, Swift, Foulkes, Playford, Ghosh, Calam, 1989).

La gastrina y los pepsinógenos influencian la fisiología gástrica y por lo tanto reflejan el

estado funcional de la mucosa gástrica, Se ha reportado que su medición puede ser utilizada como biomarcadores de las patologías gástricas tales como gastritis atrófica y dispepsia. Se ha utilizado tanto la disminución de valores de pepsinógeno I como el índice de pepsinógeno I /II bajo (Naito, Ito, Watanabe, Susuki, 2005; Sipponen, Ranta, Helske, Kaariainen, Maki, Linnala, et al., 2002).

Con el afán de encontrar la asociación entre los valores del índice de pepsinógeno I y II

y el riesgo de desarrollar adenocarcinoma gástrico o carcinoma esofágico escamoso, Ren y colaboradores realizaron un estudio en el cual incluyeron 29, 584 pacientes sanos

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provenientes del área de Linxian, China. A todos ellos se les realizó la detección de anticuerpos IgG anti H. pylori y una endoscopía. Se encontró que los casos que presentaron adenocarcinoma gástrico eran principalmente hombres, fumadores y fueron H. pylori positivos. Los valores de pepsinógenos y el índice variaron según la positividad a H. pylori, encontrando que los pacientes que fueron positivos para H. pylori presentaron una media de pepsinógeno I de 130.9ng/dL, pepsinógeno II de 19.6ng/dl y un índice de 9.3. Los cuales fueron más altos que los encontrados en pacientes que fueron H. pylori negativos (pepsinógeno I de 99.6ng/dL, pepsinógeno II de 7.9ng/dl e índice de 16.7). Así también reportaron que el riesgo de padecer adenocarcinoma gástrico era mayor en aquellos pacientes que presentaron un índice de pepsinógenoI/II bajo, y es aún mayor en aquellos pacientes que además son H. pylori positivo (Ren, Kamangar, Quiao, Taylor, Liang, Dawsey et al., 2009).

Yamaji y colaboradores en un estudio que incluyó a 5732 pacientes japoneses, a quienes

se les determinó los valores de pepsinógeno I, II, índice I/II y anticuerpos IgG anti-H. pylori, reportaron que la incidencia de cáncer gástrico aumentó conforme disminuyeron los índices y valores de pepsinógeno I, mostrando una tendencia contraria en relación al desarrollo de esofagitis de reflujo, el cual fue más frecuente en pacientes que fueron H. pylori negativo o con valores normales de pepsinógeno I y I/II, lo que sugiere una correlación negativa, sin importar edad o sexo. Los pacientes que presentaron los valores más bajos de pepsinógeno I y un alto riesgo de carcinoma gástrico presentaron además una disminución en los valores de anticuerpos anti-H. pylori, los cuales pueden incluso hasta desaparecer o bien se requiere de técnicas más especificas para la detección de la bacteria como PCR del jugo gástrico.

Se cree que estos datos también están influenciados por la cepa de H. pylori, ya que las

cepas de H. pylori que son CagA positivas son las más patogénicas para la gastritis atrófica, ulcera péptica y cáncer gástrico pero por otro lado presentan un papel protector para la producción de reflujo esofágico (Vicari, Peek, Falk, Goldblulm, Easly, Schnell et al., 1998).

Con el fin de evaluar la utilidad de la determinación de los pepsinógenos, Kitahara y

colaboradores realizaron un estudio que incluyó a 5,113 pacientes a quienes se les realizó endoscopia y determinación de pepsinógeno I y II. Los resultados demostraron que no hubo diferencia en los valores del pepsinógeno I y la edad, mientras que los valores de pepsinógeno II aumentaron con la edad y por consiguiente el índice PGI/PG II disminuyó significativamente. En relación con el género, los hombres presentaron valores de pepsinógeno I más alto que las mujeres. Al relacionar los valores de ambos pepsinógenos e indice con la presencia de cáncer se encontró que en pacientes con gastritis atrófica, una concentración de pepsinógeno I menor de 70ng/mL y un índice I/II menor de 3.0 permitía separar a los pacientes con riesgo de sufrir cáncer. Este valor fue también sugerido por Miki y cols (Miki, Ichinose, Ishikawa, Yahagi, Matsuhima, Kakei et al, 1993). Otros autores han sugerido un índice I/II menor de 2.0 (Stemmermann, Samloff, Nomura, 2002).o bien como Kodoi quien sugiere un índice menor de 3.0 pero un valor de pepsinógeno I menor de 50 ng/mL (Kodoi, Ashibara, Sumii, Haruma, Kajiyama, 1995).

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El punto de corte puede ser determinado por la concentración de pepsinógeno I o el índice pepsinógeno I/II o por cada uno de estos valores aislados, sin embargo para aumentar la sensibilidad y especificidad es mejor ambas determinaciones. La combinación sugerida por el estudio de Kitahara, proporciona una sensibilidad del 84.6%, especificidad del 73.5%, valor predictivo positivo de 0.81% y negativo de 99.9% (Kitahara, Kobsyashi, Sato, Kojima, Araki, Fujino, 1999).

Parente y colaboradores demostraron que el pepsinógeno I y gastrina disminuyeron como una respuesta a la erradicación del H. pylori. En relación a la gastrina se observó una disminución tanto de la basal como la posterior a un estimulo, esta disminución se observó a los tres meses posterior del tratamiento pero alcanzó el máximo a los seis meses. Esta disminución es consistente con la idea que la inflamación producida por el H. pylori es la responsable de la elevación de la gastrina, al erradicarse la bacteria estos valores bajan (Parente, Maconi, Sangaletti, Minguzzi, Vago, Bianchi Porro, 1995). Este mismo resultado se ha observado en pacientes con úlcera duodenal que son H. pylori positivo y reciben tratamiento específico (Smith, Pounder, Nwokolo, Lanzon-Miller, Evans, Graham DY et al 1990).

Además de la importancia epidemiológica, otras razones por las cuales se hace necesario

contar con un test de tamizaje que sea práctico, confiable, no invasivo y barato, entre ellas asociar la gastritis crónica atrófica con la presencia de adenocarcinoma gástrico cuyo pronóstico depende de la detección precoz de la lesiones y en grupos con alto riesgo de cáncer gástrico se requiere realizar el tamizaje en pacientes después de la erradicación del H. pylori (Craanen, Blok, Dekker, Ferwerda, Tytgat, 1991).

II.6. Métodos microbiológicos para el diagnóstico de H. pylori

La alta prevalencia de la infección a nivel mundial ha estimulado el desarrollo de varios métodos para el diagnóstico de la infección de Helicobacter pylori. Estos se clasifican en invasivo y no invasivos; en el primero se necesita la biopsia gástrica, en el segundo se puede hacer serología o las pruebas de aliento. La biopsia es útil para hacer improntas teñidas con el fin de buscar a la bacteria, los cortes histológicos apoyan al diagnóstico anatomopatológico (Makristathis, Hirschl, Lehours, Megraud, 2004).

La zona de elección sugerida para la toma de biopsia gástrica es la zona del antro, su

cultivo es difícil dadas las condiciones nutricionales exigentes; sin embargo, es indispensable la recuperación de la bacteria porque confirma el diagnóstico y permite realizar las pruebas de identificación, genotipificación, ensayos de susceptibilidad a antimicrobianos, determinar factores de virulencia y diversidad genética a partir de las bacterias recuperadas de la muestra, esto permite hacer estudios de reinfecciones y recurrencias de la infección. El cultivo de aislamientos clínicos de H. pylori es un procedimiento largo y costoso ya que, se requiere de biopsias frescas de mucosa gástrica. El cultivo microbiológico es necesario para la identificación definitiva del microorganismo y para determinar la sensibilidad a los agentes antimicrobianos; además, esta técnica es la única que permite obtener y conservar cepas para la purificación de antígenos específicos y para realizar estudios posteriores. La principal desventaja de esta técnica de diagnóstico es

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su baja sensibilidad en condiciones no óptimas, por los requerimientos exigentes de cultivo que necesita H. pylori. Lo anterior, en muchos casos, está influenciado por la experiencia del personal y la necesidad de tomar más de una muestra, dada la colonización en forma parchada de H. pylori en la mucosa gástrica, lo que encarece aún más su detección con esta técnica (Makristathis, Asaka, Dragosics, 2004).

El aislamiento mediante cultivo de H. pylori es sin duda el método más especifico en el

diagnóstico del microorganismo. No obstante su sensibilidad varía notablemente en relación con diferentes variables como la recogida, transporte y almacenamiento de la muestra, los medios de cultivo utilizados y las condiciones de incubación (porcentaje de CO2 y humedad, principalmente). Se puede considerar como un método tedioso e incluso de difícil realización, pero debe efectuarse de rutina si se realiza la endoscopia ya que aporta un gran número de ventajas en el estudio de la bacteria. Entre ellas destaca el conocimiento de la sensibilidad a los diferentes antimicrobianos, la caracterización de factores de virulencia y la posibilidad del tipado de cepas con fines epidemiológicos (Malfertheiner, Megraud, Morain, Bazzoli, El-Omar, Graham et al., 2002). II.6.1 Recolección de la muestra La muestra más habitual para el cultivo de H. pylori es la biopsia a partir de mucosa gástrica. El microorganismo se encuentra predominantemente en la parte antral del estómago, excepto en individuos tratados con inhibidores de la bomba de protones y antihistamínicos anti-H2, en los que se encuentran densidades más grandes en el cuerpo. Debido a la distribución parcheada se recomiendan varias biopsias para el aislamiento. Para obtener resultados óptimos se requieren cuatro biopsias, si bien se acepta de una manera general y de acuerdo con la clasificación modificada de Sydney que para asegurar un diagnóstico suficiente se deben procesar para cultivo al menos una muestra de antro y, si es posible, dos de cuerpo. Se han utilizado otras muestras gástricas como jugo gástrico, la obtenida mediante la prueba del hilo ("string test") y el aislamiento a partir de vómitos, aportando diferentes resultados. H. pylori se ha cultivado puntualmente también de muestras extragástricas como placa dental, esófago, recto y vejiga urinaria (Megraud, Lamouliatte, 2003). II.6.2 Transporte y conservación de la muestra H. pylori es un microorganismo lábil y el procesamiento de la muestra debe realizarse de una forma rápida una vez que esta ha sido obtenida; de no ser posible entonces la biopsia debe introducirse en medio de transporte semisólido para aumentar la viabilidad de la bacteria hasta 48 h si se conserva en frío a 40C. No obstante la mejor alternativa parece ser procesar la biopsia durante las cuatro horas posteriores tras la recogida de la muestra (Fresnadillo, Rodríguez, Blázquez, García, García, Trujillano et al 1997).

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II.6.3 Procesamiento de la muestra y medios de cultivo

Previa a la inoculación es conveniente realizar una homogeneización de la biopsia mediante un mortero de cristal en un volumen pequeño de suero fisiológico o caldo de cultivo enriquecido. El objetivo no es romper completamente el tejido sino mejorar la liberación de las bacterias de la superficie del mismo. Una vez realizada la homogeneización de la muestra se deben colocar dos gotas del homogeneizado en un medio selectivo y otras dos en otro no selectivo.

H. pylori es un microorganismo capaz de crecer en distintos medios de cultivo si bien

requiere diferentes factores de crecimiento. Es difícil de cultivar en medio líquido aunque se logra con menor dificultad a partir de caldo de Brucella, cerebro-corazón, Mueller-Hinton y tripticasa soja, todos ellos suplementados con nutrientes, siendo el más común el suero bovino fetal.

Los medios de cultivo sólidos base más frecuentes son agar Mueller-Hinton y agar

Columbia y los suplementos más comúnmente empleados son la sangre o derivados de ella. Otros suplementos son el suero de caballo, lisado de eritrocitos y hemina, extracto de levadura, peptona, e Isovitalex (Ndip, MacKay, Farthing & Weaver, 2003).

Entre los medios sólidos no específicos, el más utilizado corresponde a un agar sangre

de base nutritiva rica, pudiendo ser adicionado con diferentes antimicrobianos (colistina - ácido nalidíxico; vancomicina- polimixinatrimetoprima–anfotericina; vancomicina- trimetoprima-cefsulodina-anfotericina) para conferirle poder selectivo. También pueden ser utilizados medios comerciales elaborados específicamente para cultivar estas bacterias.

Dos aspectos importantes a considerar en relación con la sangre son, en primer lugar la

cantidad utilizada, ya que un aumento en la proporción al 7-10% mejora significativamente el crecimiento en comparación con el 5%. En segundo lugar el tipo de sangre utilizada, encontrándose un crecimiento más denso con sangre de caballo al 10% y lisada al 7%.

Con el objeto de evitar el sobrecrecimiento de contaminantes que pueden acompañar

a H. pylori en la biopsia es necesaria la utilización de inhibidores que no afecten su viabilidad. H. pylori es resistente in vitro a la vancomicina, sulfametoxazol, trimetoprim, cefsulodina y polimixina B, los cuales pueden utilizarse en los medios selectivos para su aislamiento (Hernández & Rivera 2003, Pellicano, Smedile, Ponzetto 2005, Kiesslich, Goetz, Burg, Stolte, Siegel, Maeurer, Thomas, Stran & Galle, 2005). II.6.4 Condiciones de incubación

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H. pylori es un microorganismo microaerofílico que requiere para su crecimiento una atmósfera con las siguientes características: 5-10% de O2, 5-10% de CO2 y 80-90% de N2 a 35-37ºC, una humedad del 95% y una incubación de hasta 7-10 días antes de considerar negativo el cultivo. Estas condiciones se obtienen bien utilizando incubadoras de CO2 o jarras de microaerofília con sobres comerciales que proporcionen las características anteriores. Estos últimos proporcionan resultados muy buenos pero tienen como inconveniente la necesidad de reemplazar los sobres una vez abiertas las jarras (Koneman, Allen, Yanda, Schreckenberger & Winn W C, 1999). II.6.5 Criterios para interpretación de resultados Identificación del microorganismo. La identificación se realiza mediante visualización en fresco con un microscopio de contraste de fases para ver la morfología o bien mediante una tinción de Gram modificada (cFaddin, 1993). II.6.5.1 Identificación de Helicobacter pylori La incubación se realiza a 37ºC, en microaerofilia estricta. Debido al crecimiento lento de H. pylori, ésta debe prolongarse hasta por 7 días antes de declarar la muestra como negativa. Las colonias son pequeñas, no mayores de 1mm de diámetro y pueden presentar hemólisis. Son citocromo-oxidasa, catalasa y ureasa positivas (Ndip, MacKay, Farthing & Weaver, 2003). II.6.5.2 Coloración Gram modificada Se realiza el procedimiento del método estándar, excepto que se contratiñe con carbol fucsina o fucsina fenicada usada para Ziehl Neelsen en lugar de safranina por cinco minutos (McFaddin, 1993). II.6.5.3 Prueba de catalasa

La catalasa, degrada el peróxido de oxígeno que se produce como consecuencia de la acumulación de oxígeno. Esta prueba consiste en recoger una porción de colonia pura y colocarla sobre una lámina porta objetos limpia, inmediatamente agregar con una pipeta Pasteur o un gotero una gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%, y se observa la formación de burbujas (liberación de gas), lo que indica un resultado positivo (McFaddin, 1993).

II.6.5.4 Prueba rápida de ureasa Pone de manifiesto la actividad de la enzima ureasa, para degradar la urea en dos moléculas de amoniaco. El medio lleva como indicador Rojo fenol, que se torna amarillo cuando es negativo y rosa cuando es positivo. Se realiza colocando una cantidad de colonia pura y se introdujo en un vial limpio conteniendo la urea al 6% con el indicador de pH (rojo

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de fenol), se observa el cambio de color de la suspensión de un color amarillo a un color fucsia dentro de los primeros 10 minutos (McFaddin, 1993). II.6.5.5 Prueba de oxidasa

La oxidasa, es una prueba que se usa para poner de manifiesto el sistema citocromoxidasa, que se encuentra en organismos aerobios, anaerobios facultativos y ocasionalmente en microaerófilos, careciendo los anaerobios estrictos de esta. El método más frecuente es el indirecto, se realiza en una tira reactiva, en la cual se coloca una parte de la colonia de H. pylori con un palillo. El resultado será positivo si se produce una reacción de color a los pocos segundos (McFaddin, 1993).

II.6.5.6 Subcultivos y conservación de las cepas. Una vez realizado el aislamiento se debe subcultivar cada 48-72 horas en medios no selectivos en las condiciones anteriormente expuestas. Las cepas se pueden conservar en caldo tripticasa soja, caldo Brucella o infusión de cerebro corazón con glicerol al 20% en congelador a –800C o en nitrógeno líquido (Pellicano, Smedile, Ponzetto et al, 2005). II.7. Actividad de extractos vegetales contra H. pylori II.7.1 Estudios de tamizaje de actividad La investigación de la actividad anti-H. pylori por especies vegetales usadas para tratar afecciones gástricas comenzó en Europa en 1996. El extracto acuoso (EA) de Allium sativum fue activo contra 16 cepas clínicas y tres referencias (CIM 2.5mg/mL), encontrándose actividad sinergística (47%) con omeprazol (Cellini, di Campli, Masulli, di Bartolomeo & Allocati, 1996); en Holanda se confirmó actividad de extractos crudos y comerciales (CIM 10.0-17.5mg/mL) (Jonkers, van den Broeck, van Dooren, Dorant, Hageman, & Stobberingh, 1999). siendo los más potentes allicina (CIM 4.0 µg/mL; CBM 6µg/mL) y aceite de ajo (CIM 8-32µg/mL; CBM 16-32µg/mL) (O’Gara, Hill & Maslin, 2000). En Estonia se evaluaron cuatro extractos contra seis cepas clínicas, elEA de Arctostaphylos uva-ursi demostró efecto bacteriostático atribuido a los taninos, Vaccinium vitis-idaea, Matricaria recutita y M. matricarioidesfueron inactivos (Annuk, Hirmo, Türi, Mikelsaar, Arak & Wadström, 1999); el extracto con aceite de oliva de M. recutita fue activo (CIM90 125mg/mL) e inhibió la producción de ureasa (Shikov, Pozharitskaya, Makarov & Kvetnaya, 2008).Extractos metanólicos (EM) de 70 hierbas de Grecia se evaluaron contra 15 cepas clínicas y una ATCC 43504 por microdilución; siete demostraron actividad (CIM 0.625-1.25mg/mL) (Stamatis, Kyriazopolous, Golegou, Basayiannis, Skaltsas & Skaltsa 2003). ElEA y etanólico (EE) de 17 plantas de Italia se evaluaron contra una cepa estándar y 11 clínicas; en la mayoría de extractos se demostró actividad por difusión; los EE fueron más potentes que los EA; los más activos fueron Cuminum cyminum y propóleo (CIM90 0.075mg/mL) (Nostro, Cellini, Di Bartolomoeo, Di Campli, Grande, Cannatelli et al, 2005).

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Estudios en el oriente medio demuestran que los EEy diclorometánicos (ED) de canela evaluados en Israel contra siete cepas clínicas inhiben en un rango similar a los antibióticos en medio sólido y liquido (CIM 50µg/mL y 15µg/mL) (Tabak, Armon & Neeman, 1999). EA y EM de siete plantas de Turquía (Cistus laurifolius, Cedrus libani, Centaurea solstitialis, Sambucus ebulus, Hypericum perforatum y Momordica charantia) fueron activos contra una cepa estándar y ocho clínicas (CIM 1.95-250µg/mL) (Yeşilada, Gürbüz & Shibata, 1999). En Irán, la actividad de seis plantasse determinó contra 70 cepas clínicas por difusión y dilución; los más activos fueronXanthium brasilicum y Trachyspermum copticum (CIM 31-250µg/mL); el fraccionamiento de X. brasilicum demostró la presencia de un flavonoide y un xantanólido (Nariman, Eftekhar, Habibi & Falsafit, 2004). EE de eneldo, hinojo, alcaravea y canela se evaluaron contra 14 cepas clínicas; el masactivo fueeneldo, aunque todas fueron bacteriostáticas (Sadeghian, Neyestani, Shirazi & Ranjbarian, 2005). En 20 extractos orgánicos se evaluó la actividad por difusión; los más activos fueron Carum bulbocastanum, C. carvi, Mentha longifolia, Salvia limbata, S. sclarea, Ziziphora clinopodioides, Thymus caramanicus, Glycyrrhiza glabra, X. brasilicum y T. copticum (CIM 31-500 µg/mL) (Nariman, Eftekhar, Habibi, Massarrat & Malekzadeh, 2009). EM de 64 de plantas medicinales orientales se evaluaron contrala cepa ATCC 43504, fueron activos Alpinia officinarum, A. oxyphylla, Angelica tenuissina, Asiasarum heterotropoides, Lindera strychnifolia y Polygonum cuspidatum (Lee, Lee & Ahn, 2003). EE de 30 especies de la medicina china se evaluaron contra una cepa estándar y cinco clínicas, Abrus cantoniensis, Eugenia caryophyllata y Saussurea lappafueron activos (CIM 40µg/mL) (Li, Xu, Zhang, Liu & Tan, 2005). De 50 EE de plantas de Taiwan, Paederia scandens, Plumbago zeylanica, Anisomeles indica, Bombax malabaricum y Alpinia speciosa fueron activos (CIM 0.64-10.24mg/mL) (Wang & Huang, 2005). En la India, EE de Pterocarpus santalinusfue activo (CIM 20µg/mL) (Narayan, Veeraraghavan & Devi, 2007).EA, EM y particiones en hexano (PH), cloroformo (PC), butanol y agua de Tephrosia purpurease enfrentaron a 10 cepas estándar y clínicas por micodilución y resiembra en agar, EM fue activo contra bacterias metroinidazol-resistentes, PH y PC fueron las mas activas, aun en condiciones ácidas (Chinniah et al., 2009). EA de 21 plantas de Sri Lanka se probaron contra cinco cepas clínicas y NCTC 11637 por deter-minando colonias viables después de 60 min; la mejor CBM fueron cúrcuma, jengibre, chile y te (Weerasekera, Fernando, Bogahawatta, Rajapakse-Mallikahewa & Naulla, 2008). EA y EE de 13 plantas de Tailandia se evaluaron contra 20 cepas, la mayoría fueron sensibles, los más efectivos fueron Punica granatum y Quercus infectoria (CIM 0.8-3.1mg/mL; CBM 3.1-6.2 mg/mL); las fracciones purificadas fueron 10 veces más potentes que el extracto (Voravuthikunchal & Mitchell, 2008). EE de 50 plantas de Pakistán se evaluaron contra siete cepas clínicas; losactivos se evaluaron por CBM en tubo; Curcuma amada, Mallotus phillipinensis, Myristica fragrans y Psoralea corylifolia fueron activos (CBM 15.6-62.5 µg/mL) (Zaidi, Yamada, Kadowaki, Usmanghani & Sugiyama, 2009). En Marruecos EM y FH de varios órganos deAristolochia paucinervis se evaluaron contra una cepa de referencia; EM y FH de rizoma y hojas fueron activos (CIM4µg/mL); la actividad se confirmó en 20 cepas clínicas (Gadhi, Benharref, Jana & Lozniewski, 2001). EM de 10 especies de Camerún se evaluaron contra 15 cepas clínicas; todas demostraron

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zonas de inhibición de 0-30mm; las mas activas fueron Scleria striatinux (CIM 0.032-1.0mg/mL), Lycopodium cernua y Ageratum conyzoides (CIM 0.063-1.0mg/mL) (Ndip et al., 2007). El EA de corteza de Enantia chlorantha, se evaluó in vitro por difusión y dilución e in vivo por la tasa de muerte; in vitro se demostró actividad dosis-dependiente (CIM 0.39; CBM 1.56mg/mL); en ratones se determinó la potencia de erradicación, demostrando que el moco del antro no contiene la bacteria (500mg/kg/3 días) (Tan, Boda & Etoa, 2010). El EM de corteza de Eucalyptus grandis fue tamizado contra la cepa ATCC 97002 y 10 cepas clínicas, ocho fueron inhibidas (CIM0.39-1.56µg/mL); la actividad de ureasa disminuyó al aumentar la concentración (Adeniyi, Onwubuche, Anyiam, Ekundayo & Mahady, 2009). FH, FC y FM de hojas y corteza de E. camaldulensis y E. torelliana fueron activas (CIM 12.5-400µg/mL) (Adeniyi, Lawal & Mahady, 2009). EA y con disolventes orgánicos de cinco especies de Sud Africa se evaluaron contra 30 cepas clínicas y unaNCTC 11638; todosfueron activos (CIM50 0.06-0.63mg/mL); EA de Combretum molle, Garcinia kola y Sclerocarya birrea fueron los mas activos (Njume, Afolayan & Ndip, 2011).EAc, EE y EMde C. molle se investigaron contra 32 cepas clínicas por dilución, todos los extractos fueron activos; EAc fue el más potente (87.5%, CIM 0.078-2.5mg/mL; amoxicilina 0.001-1.25mg/mL) (Njume, Afolayan, Samie & Ndip, 2011). Estudios en México con ED y EM de 48 plantas de Yucatán demuestran que siete son activas, ED y EM de Piscidia piscipula (CIM 0.7-3.0µg/mL), EM de Casimiroa tetrameria (CIM 3µg/mL) y Jatropha gaumeri (CIM 5µg/mL) y extractos de Dorstenia contrajerva, Psidium sartorianum, Microgramma nitida y Chrysophyllum mexicanum (Ankli et al., 2002). EM de 17 especies se evaluaron contra 15 cepas; la CIM de los mas activos fueronM. fragrans (12.5µg/mL); Zingiber officinale y Rosmarinus officinalis (25µg/mL); Achillea millefolium, Foeniculum vulgare, Passiflora incarnata, Origanum majorana y Curcuma longa (50µg/mL) (Mahady et al., 2005).De 53 plantas se prepararon EA y EM y se evaluó la actividad por microdilución;EA de Artemisia ludoviciana, Cuphea aequipetala, Ludwigia repens y M. piperita demostraron actividad (CIM 125-250 µg/mL), EM de Persea americana, Annona cherimola, Guaiacum coulteri y Moussania deppeana fueron más activos (CIM<7.5-15.6µg/mL) (Castillo-Juárez, 2009). Según estudios etnofarmacológicos en Brasil, se evaluaron EM de hojas de Davilla elliptica y D. nitida por su actividad antiúlcera inducida por HCl/etanol en ratón, antiinfla-matoria por inducción del edema de la pata en ratas por carragenina, inmunológica en macrófagos peritoneales murinos y anti-H. pylori en una cepa estándar; ambos extractos fueron protectores de la mucosa gástrica (77-67%); EDN tuvo mejor actividad anti-H. pylori; ninguno de los extractos presentó actividad antiinflamatoria por vía oral (Kushima et al., 2009).Se prepararon EA de seis especies y se tamizaron contra dos cepas de referencia y 11 clínicas por difusión y la CIM por dilución en agar, los extractos de semillas de Bixa orellana, flores de M. recutita, hojas de Ilex paraguariensis y Malva sylvestris fueron activos (CIM < 0.625 mg/mL (Cogo, Bastos Monteiro, Miguel, Miguel, Machado Cunico et al, 2010). II.7.2. Estudios en búsqueda de substancias activas y mecanismos de acción

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El EM de la madera de Myroxilon peruiferum de Brasilfue activo (CIM 62.5µg/mL), por aislamiento bioguiado se demostró que la actividad corresponde a cabreuvina (CIM 30µg/mL), un derivado de isoflavona (Ohsaki, Takashima, Chiba, & Kawamura, 1999). En estudios previos se demostró la actividad del ECde los botones florales de C. laurifolius de Turquía; por un procedimiento bioguiado se aislaron seis componentes y se probaron por dilución en agar; la mayor actividad la produjo el metil éter de quercetina (isoramnetina) (CIM 3.9µg/mL) (Ustün, Ozçelik, Akyön, Abbasoglu & Yesilada, 2006). De Piper multiplinervium usado por los kuna de Panamá, se aisló el ácido 3 farnesil-2-hidroxibenzóico, activo contra H. pylori (CIM 37.5µg/mL) (Rüegg, Calderón, Queiroz, Solís, Marston, Rivas et al 2006). De Piper carpunya se evaluaron 16 fracciones y 16 compuestos aislados por su actividad liberadora de mieloperoxidasa (MPO) y anti-H. pylori por microdilución; ocho fracciones mostraron inhibición de MPO y 15 fueron activas(CIM 6.25µg/mL); se aislaron 16 compuestos, tres flavonoides antioxidantes (vitexina, isovitexina, ramnopiranosilvitexina), varios terpenoi-des gastroprotectores y dihidrochalconas antibacterianas; se concluye que los flavonoides pueden ser los responsables de la actividad (Quilez, Berenguer, Gilardoni, Souccar, de Mendonça, Oliveira et al, 2010). Del género Glycyrrhiza se aislaron 15 flavonoides y se evaluaron contra dos cepas de referencia, dos clínicas y una claritromicina-resistente; los más activos fueron glabridina, glabreno, gancaonol, licochalcona A, licoricidina y licoisoflavona B (CIM 12.5-25µg/mL) (Fukai, Marumko, Kaitou, Kanda, Terada & Nomura, 2002). El extracto de G. glabra, ácidos glicirrícico (AG) y glicirrético y el munoglucurónido del ácido glicirréticose evaluaron contra 29 cepas por dilución en agar y se monitoreo la cinética de muerte a 0-96 h; AG fue el más potente (CIM ≤0.05mg/mL, 79.3%), las cepas claritromicina- y metronidazol-resistentes fueron susceptibles (CIM 0.012-0.025 y 0.025-0.20mg/mL)(Krausse, Bielenberg, Blaschek & Ullmann, 2004). El efecto clínico se relaciona con 12-cetotriperpensaponina con actividad antiinflamatoria; el EA y polisacáridos crudos y purificados se evaluaron por difusión y la actividad antiadhesiva por adhesión in situ de bacterias marcadas con ITCF a tejido de resecciones de estómago humano; el EA inhibió la adhesión de H. pylori al tejido estomacal, actividad atribuida a los polisacáridos de la fracción acídica (Wittschier, Faller & Hensel, 2009).

Se evaluaron 13 aceites esenciales (AE) por microdilución y el desarrollo de resistencia por dilución en agar e in vivo; AE de Cymbopogon citratus y Lippia citriodora fueron bac-tericidas (0.01%, pH 4.0 y 5.0); después de 10 pasajes en AE las bacterias no desarrollaron resistencia, pero si a claritromicina; in vivo se demostró que la densidad de H. pylori en el estómago de ratones infectados fue menor en los tratados (Ohno, Kita, Yamaoka, Imamura, Yamamoto, Mitsufuji et al, 2003). De 60 AE, 15 fueron activos (CIM 0.02-0.1mg/mL a pH 7.4), principalmente carvacrol, citral, isoeugenol, nerol ysabineno, aunque no fueron eficacescontra H. pylori in vivo, podrían ser útiles como aditivo alimenticio para complementar las terapias disponibles (Bergonzelli, Donnicola, Porta & Corhtésy-Theulaz, 2003). El AE de Dittrichia viscosa y sus fracciones se evaluaron contra seis cepas por dilución en agar; con 0.025µg/mL deAE oxigenados constituidos en un 40% por 3-metoxi cuminil isobutirato, no se recuperó ninguna bacteria; el AE crudo (0.33µg/mL) redujo las

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poblaciones de H. pylori de 8.52±0.3 log10 UFC/mL a 7.67±0.22 (Miguel, Faleiro, Cavaleiro, Salgueiro & Casanova, 2008). Eugenol y cinnamaldehido comerciales se evaluaron contra 30 cepas clínicas, ambos inhibieron a todas las cepas (CIM 2µg/mL); al acidificar el medio aumentó la actividad; después de 10 pasajes en una dosis sub-inhibitoria no se desarrolló resistencia (Ali, Khan, Ahmed, Musaddiq, Ahmed, Polasa, et al 2005). El extracto de corteza de S. birrea fue fraccionado en columna y analizado por CG/MS; la actividad contra cinco cepas (ATCC 43526 ymetronidazol- y claritromicina-resistentes) se evaluó por microdilución; de las 18 fracciones obtenidas, 16 fueron activas (CIM50 310-2500µg/mL); la mayoría de compuestos fueron AE, siendo los más abundantes terpinen-4-ol, pirrolidina, aromadendreno y α-hurjuneno (CIM 0.004-0.06µg/mL), similar a los valores obtenidos con amoxicilina (Njume, Afolayan, Green & Ndip, 2011). El sulforafano, precursor del glicosinolato de brócoli tiene actividad in vitro; se evaluó su efecto in vivo usando un modelo de trasplante de tejido gástrico humano en ratones desnudos; H. pylori fue erradicado completamente en 8 de 11 trasplantes (Haristoy, Angioi-Duprez, Duprez & Lozniewski, 2003). En ratones infectados con una dieta rica en sal se administraron oralmente retoños de brócoli demostrándose reducción de la colonización gástrica, de la expresión en las mucosas de TNFα e IL-1β, mitigación de la inflamación del corpus y prevención de la atrofia gástrica por la carga de sal; este efecto no se observó en ratones a los que se les administró placebo (alfalfa) (Yanaka, Fahey, Fukumoto, Nakayama, Inoue, Zhang et al, 2009). Los EM de rizomas de Sanguinaria canadensis y de Hydrastis canadensisse evaluaron contra 15 cepas por dilución en agar MH; EM de S. canadensis fue activo (CIM 12.5-50.0 µg/mL); de las fracciones activas se aislaron dos alcaloides isoquinolínicos, sanguinarina y cheleritrina (CIM 50-100µg/mL) y uno de tipo protopina (CIM 100µg/mL); EM de H. canadensis fue muy activo (CIM 12.5µg/mL), se aislaron dos alcaloides, berberina y β-hidrastina (CIM 12.5 y 100µg/mL) (Mahady, Pendland, Stola & Chadwick, 2003). Del EA O. vulgare y Vaccinium macrocarpumse prepararon extractos ricos en fenoles y mezclas, se enfrentaron aH. pylori ATCC 43579 por difusión y se evaluó la actividad de ureasa; la actividad es mayor en la mezcla que en los fenoles aislados, se propone el uso de una mezcla de fenoles de ambas especies; se demostró que el posible modo de acción es por inhibición de la ureasa y de la producción de energía por inhibición de la prolina deshidro-genasa (Lin, Kwon, Labbe & Shetty, 2005). Extractos de hojas y polifenoles de Rubus ulmifolius se evaluaron contra dos cepas de H. pylori (cagA+ 10K y cagA- G21) y como antioxidantes; todos los polifenoles y extractos fueron activos contra ambas cepas (MBC 1.2 y 1.5mg/mL en 24 h, y 0.134 y 0.270 mg/mL en 48 h); los menores valores fueron ácido elágico y kaempferol (MBC 2 y 6µg/mL); la asociación entre actividad antioxidante y antibacteriana fue evidente únicamente en H. pylori cagA- G21 (Martini, D’Addario, Colacevich, Focardi, Borghini, Santucci et al, 2009). Se evaluaron antraquinonas de corteza de Tabebuia impetiginosa y antibióticos contra H. pyloriATCC 43504 por difusión (0.01mg/disco); la CIM se determinó por dilución en agar; amoxicilina demostró la mejore actividad (CIM 0.063µg/mL), seguida de 2-(hidroxi-

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metil)antraquinona (CIM 2µg/mL), ácido carboxílico 2-antraquinona (CIM 8µg/mL), lapachol (CIM 4µg/mL) y metronidazol (CIM 32µg/mL) (Park, Lee, Lee, Piao, Takeoka, Wong et al 2006). Se aislaron 13 oleanano saponinas de Pteleopsis suberosa, que fueron evaluadas contra cepas estándar y clínicas con los genotipos vacA y cagA; el compuesto más activo fue el arjunglucósido I (CIM 1.9-7.8µg/mL) aun contra cepas metronidazol-resistentes (De Leo, de Tommasi, Sanogo, d’Angelo, Germanó, Bisignano & Branca, 2006). Por fraccionamiento bioguiado de la corteza de Amphipteryngium adstringens se identificó que la fracción de éter de petróleo era la que tenía mayor actividad; de esta fracción se aislaron triterpenos conocidos, β-sitosterol y ácido anacárdico, siendo este el único que demostró actividad en relación dosis-dependiente (CIM 10µg/mL) (Castillo-Juárez, Rivero-Cruz, Celis & Romero, 2007).

Se prepararon geraniloxicumarinas y ácidos isopenteniloxi naturales y se evaluaron in vitro contraH. pylori; el más activo fue el ácido boropínico aislado de Boronia pinnata (CIM 1.62µg/mL) (Epifano et al., 2006).Infusión y EE de corteza deHancornia speciosa se evaluaron en un modelo en roedores que simula la enfermedad en la mucosa gástrica; la infusión no fue efecto gastroprotectora, pero EE (500mg/mL, p.o.) disminuyó la severidad del daño inducido por HCl/etanol, indometacina, estress y ligadura del píloro; EE aumento el pH y disminuyó la salida de jugo gástrico, aumentó la cantidad de moco, la actividad antioxidante y anti-H. pylori, atribuidas a las proantocianidinas (Morães, Rodrigues, Kushima, Bauab, Villegas, Pellizzon, et al, 2008). EC y EM de hojas de Byrsonima crassa de Brasil se evaluaron por dilución, ambos extractosfueron activos (CIM 1024µg/mL); EM indujo la producción de H2O2 y NO, pero EC solo NO; para desarrollar un producto para gastritis debe tomarse en cuenta la producción deambos reactivos intermediarios (Bonacorsi, Raddi, Carlos, Sannomiya & Vilegas, 2009). De las hojas de Mouriri ellipticase obtuvieronEM y FAEy se evaluaron como gastroprotectores por modelos animales ein vitro, inmunhistoquímica, toxicología y anti-H. pylori. EM presentó acción gastroprotectora sin efecto secretor, actividad anti-H. pylori (CIM 0.025µg/mL), inhibió la producción de NO por macrófagos, aceleró la cicatrización de la mucosa gástrica por estimulación de factores de proliferación y mantuvo los niveles basales de PGE2; la investigación fitoquímica demostró la presencia de derivados fenólicos, acilglicoflavonoides y taninos condensados (Moleiro, Andreo, dos Santos, Moraes, Rodrigues, de Andrade Carli et al, 2009). La actividad inhibidora de curcumina sobre 65 aislamientos clínicosse evaluó por dilución en agar; todas las cepas fueron inhibidas (CIM 5-50µg/mL), la actividad fue comprobada por erradicación en un modelo de ratón infectado con H. pylori; como mecanismo de acción se propone inhibición no competitiva de shikimato deshidrogenasa, aunque no todas las cepas parecieran depender de este mecanismo (De, Kundu, Swarnakar, Ramamurthy, Chowdhury, Balakrish, & Mukhopadhyay, 2009). Estudios in vitro demostraron actividad de extractos de Z. officinale; seevaluó la actividad en un modelo en jerbo mongólico (100mg/kg) durante 3 semanas pre-infección y

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6 semanas post-infección; el tratamiento redujo la carga de H. pylori comparado con los controles, además,inhibe la actividad de ciclooxigenasa (CI50 8.5µg/ml) y la liberación de IL-1β, IL-6, IL-8 y TNFα sugiriendo que estos extractos pueden reducir la inflamación, así como una forma de quemoprevencion de cáncer gástrico (Gaus, Huang, Israel, Pendland, Adeniyi, & Mahady, 2009). La corteza de Calophyllum brasilenseha demostradoser gastroprotectora e inhibidora de la acidez gástrica. Se evaluó la actividad anti-H. pylori deEA y FDy la actividad antiúlcera en ratas infectadas. FD fue la más activa y potente in vitro (CIM 31µg/mL); en el ensayo in vivo, las ratas con úlcera inducida por ácido acético e inoculadas con H. pylori mostraron un marcado retraso en la cicatrización; el tratamiento con EA (50, 100 y 200mg/kg) y FD (100 y 200mg/kg) redujo el área ulcerada en forma dosis-dependiente; FD (200mg/kg) aumentó los niveles de PGE2, mientras que EA y FD disminuyeron el número de animales ureasa-positivos y redujeron H. pylori por histopatología (Souza, Beserra, Martins, Villa Real, Nunes dos Santos, Rao et al, 2009). Del EM de Hypericum sikokumontanum se aislaron 30 moléculas, 27 conocidas y takanechromonas y takanechromanonas, que fueron activas contra H. pylori y citotóxicas contra líneas celulares de cáncer multiresistentes (Tanaka, Kashiwada, Nakano, Shibata, Higuchi, Sekiya et al, 2009). EM y FAE de H. erectum se evaluaron por microdilución; FAE inhibió a H. pylori ATCC43504 (CIM 38.7-63.2µg/mL), comparable a metronidazol (CIM 43.2µg/mL); de cuatro glicósidos fenólicos aislados, dos demostraron actividad (CIM 7.3-27.3µg/mL) (Moon, Lee & Lee, 2011). II.7.3. Estudios clínicos con extractos vegetales En una población de bajo riesgo de cáncer gástrico se hizo una encuesta gastroscópica, entrevista dietaria y medición de anticuerpos anti-H. pylori; la prevalencia fue baja (19%) en la población normal, elevándose en gastritis (35%), gastritis crónica (56%), metaplasia intestinal (80%) y dispepsia (100%); los resultados sugieren que la infección es un factor de riesgo y que el uso de ajo puede proteger el desarrollo y progresión de lesiones precan-cerosas y en asociación inversa a la infección (Youet al., 1998). En 5 pacientes con dis-pepsia con Ac anti-H. pylori confirmada con la prueba de urea, se administró una cápsula con 4 mg de aceite de ajo en las comidas cuatro veces/día/14 días; en ningún pacientes se demostró erradicación de H. pylori, posiblemente porque en el medio ácido del estómago a la dosis ensayada no se inhibe elcrecimientodemostradoin vitro; se sugiere probar el consumo del aceite con un inhibidor de la bomba de protones, ya que al aumentar el pH podría aumentar la actividad del ajo in vivo (McNulty, Wilson, Havinga, Johnston, O’Gara, & Maslin, 2001). Estudios in vitro demostraron actividad de extractos de Cinnamomum verum; se estudió el efecto de 40 mg de EE (2 veces/día/4 semanas) en 15 pacientes con H. pylori (edad 16-79), 8 pacientes recibieron placebo y se midió la colonización por la prueba del aliento antes y después del tratamiento; el promedio de cuentas de la prueba del aliento en el grupo de estudio fue 22.1-23.9 y en el control 24.4-25.9; el extracto fue bien tolerado y los efectos secundarios mínimos; a la dosis empleada el extracto no erradica H. pylori, se sugiere combinarlo con antibióticos (Nir, Potasman, Stermer, Tabak & Neeman, 2000).

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Un estudio meta-analítico en cuatro bases electrónicas, en las que se detectaron cuatro ensayos clínicos con estudios aleatorizados, demostró que en tres de ellos se investigó el efecto clínico de tratamientos con ajo y canela contra infecciones por H. pylori, demostrándose que no existe un efecto significativo; se concluye que los ensayos tuvieron un diseño metodológico pobre y que serán necesarios nuevos ensayos más rigurosos para demostrar eficacia de estos tratamientos más allá de la duda (Martin & Ernst, 2003). Se aleatorizaron 100 pacientes con dispepsia para recibir 500 mg del extracto metabólico de Lafoensia pasari (n: 55) o placebo (n: 45) durante 14 días en un ensayo doble-ciego; las variables fueron la erradicación de H. pylori después de 8 semanas y desaparecimiento completo de los síntomas; los exámenes (ureasa e histología) mostraron persistencia de H. pylori en 100% de los participantes; se demostró desaparecimiento completo de los síntomas en 42.5% de los tratados y en 21% del grupo control (p=0.020); los efectos secundarios fueron mínimos en ambos grupos; se concluye que el extracto solo, no erradica H. pylori, pero es bien tolerado y puede mejorar los síntomas o combinarse para mejorar su efecto (Menezes, Atallah, Lapa & Catapani, 2006). Se realizó un ensayo multricéntrico, al azar, controlado, doble-ciego, conducido en 295 niños asintomáticos (6-16 años) que fueron positivos a la prueba del aliento urea-C13; se asignaron cuatro grupos: jugo de arándano/La1, jugo placebo/La1, jugo de arándano/La1 muerta por calor, y jugo placebo/La1 muerta por calor (control), los que se administraron diariamente durante 3 semanas, con pruebas de UBT a las 3 semanas y al mes; 271 niños terminaron el tratamiento, demostrándose una erradicación de H. pylori de 1.5% en el grupo control, contra 14.9-22.9% en los grupos experimentales (p<0.01); se demuestra que la administración de ambos tratamiento disminuye la colonización, pero no se demuestra que exista un efecto sinergístico al consumirlos simultáneamente (Gotteland, Andrews, Toledo, Muñoz, Caceres, Anziani et al, 2008). Un grupo de 48 pacientes infectados se asignaron aleatoriamente a alimentación con brócoli o alfalfa durante 8 semanas; los pacientes con broccoli pero no con placebo, disminuyeron los niveles de ureasa medida por la prueba del aliento, los antígenos de H. pylori en heces y los niveles de pepsinógenos I y II; los resultados demuestran protección de la mucosa gástrica contra el estrés oxidativo (Yanaka, Fahey, Fukumoto, Nakayama, Inoue, Zhang et al, 2009). Se evaluó el efecto del extracto de semillas de Nigella sativa (NS) para erradicar H. pylori en 88 pacientes dispépticos diagnosticados por histopatología y prueba de ureasa, se distribuyeron al azar en cuatro grupos, terapia triple (claritromicina, amoxicilina, omeprazol); 1 g de NS+omeprazol; 2 g de NS+omeprazol; y, 3 g de NS+omeprazol; la erradicación se alcanzó en 82, 47, 66 y 47%, respectivamente (Salem, Yar, Bamosa, Al-Quorain, Yasawy, Alsulalman & Randhawa, 2010). II. 8. Métodos de detección de sensibilidad Numerosos métodos han sido desarrollados para detectar la resistencia de H. pylori a los antibióticos (Alarcón, Domingo & López-Brea, 1999). Se ha determinado la

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sensibilidad antimicrobiana mediante pruebas basadas en cultivo como la difusión en disco, micro dilución en caldo, E-test y la dilución en agar (McNulty, Owen, Tompkins, Hawtin, McColl & Smith, 2002; Alarcón, Domingo, Sánchez, Sanz & López-Brea, 1997). Este ultimo establecido como método de referencia por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) y actualmente Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) ( ). El E-test (método epsilometro) es altamente concordante con el método de referencia y su uso está recomendado por la British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) (Glupczynski, Megraud, Andersen & López-Brea, 1999). Las ventajas de la prueba de difusión en agar incluyen la reproducibilidad de los resultados y el desarrollo satisfactorio de la mayoría de los microorganismos de difícil crecimiento. Sin embargo, entre sus desventajas están la compleja metodología requerida para su desarrollo y el alto costo por prueba. Generalmente la difusión en agar no se realiza en laboratorios clínicos de rutina pero es ideal para laboratorios laboratorios de investigación que analizan un gran número de cepas (Boyanova, Gergova, Nikolov, Davidkov, Kamburov, Jelev & Mitov, 2008) II.8.1 Dilución en agar Es el método de referencia pero no aplicable de forma rutinaria para cada cepa aunque es válido para confirmar los resultados obtenidos por otros métodos y realizar estudios con el objeto de conocer la tasa global de resistencia en un área determinada. El método recomendado por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) para dilución en agar utiliza agar Mueller–Hinton suplementado con 5% de sangre de carnero, un inóculo de una suspensión equivalente a 2 de McFarland (1x107 a 1x108

UFC/mL) en solución salina a partir de un subcultivo de 72 horas de H. pylori en agar sangre, aplicado directamente sobre las placas de agar que contienen las diferentes concentraciones del agente antimicrobiano a estudio y una incubación a 35 ±2 oC por 3 días en atmósfera microaerofílica producida con sobre generador de gas. II.8.2 Difusión por E-Test Es un método cuantitativo para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro basado en la difusión. El método del epsilómetro está especialmente recomendado en organismos exigentes y cuando se deben probar pocos microorganismos o pocos antibióticos. Tiene diferentes ventajas sobre los métodos tradicionales de dilución en agar, dilución en caldo o difusión en agar. La Sociedad Británica para la Quimioterapia Antimicrobiana (British Society for Antimicrobial Chemotherapy-BSAC) recomienda: Mueller-Hinton o Wilkins-Chalgren suplementado con 5-10% de sangre de caballo, un inóculo de Colonias de un cultivo de 2 a 3 días de incubación en agua destilada estéril con turbidez ajustada al estándar 3 de McFarland, aplicación de la tira de E-test después de dejar que se seque el inóculo aplicado, con incubación a 35 ºC en microaerofília durante 3 a 5 días. II.8.3 Difusión en disco Es el método más fácil y barato para determinar la sensibilidad in vitro, pero no hay muchos estudios de correlación entre los valores de CIM y los diámetros de inhibición en el

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caso de H. pylori, por lo que no es el método más adecuado. McNulty en 2002 realizó una revisión de los estudios en los que se había utilizado difusión con disco, recomendando medio Mueller-Hinton o Columbia suplementado con 5 a 10% de sangre (de caballo o carnero), un inóculo de 4 de McFarland (108 UFC/mL) a partir de un cultivo de menos de 4 días de incubación. El punto de corte utilizando 5 µg metronidazol en el disco es como sigue: cepa resistente si el halo de inhibición es menor de 16 mm, intermedio si está en el rango de 16-21mm y sensible si el halo es mayor de 21 mm. En las cepas con sensibilidad intermedia se recomienda la realización de un método de determinación de CIM.

II.8.4 Microdilución en caldo Se realiza en microplacas que contienen concentraciones crecientes de un determinado antibiótico. El organismo en estudio es inoculado en los diferentes pocillos de la microplaca y la CIM es determinada después de la incubación, de la misma forma descrita anteriormente para el método de la dilución en agar. Después de la incubación, se examina si el organismo crece o no en cada una de las placas, con lo cual se determina la CIM de los antibióticos. II. 8.5. Bioensayos para determinar actividad anti-H. pylori Mitscher et al., (1972) y Mitscher (1975) fueron de los primeros autores que iniciaron los programas de tamizaje (screening) de extractos de plantas para evaluar su actividad antibacteriana. La metodología principal consiste en exponer cultivos de bacterias a diferentes concentraciones de extractos vegetales y determinar la inhibición del crecimiento bacteriano. Usualmente los métodos empleados para evaluar actividad anti-H. pylori y CIM de extractos de especies vegetales son variados, aunque tratan de seguir los lineamientos sugeridos por el CLSI, el método de dilución en agar (Stamatis, Kyriazopolous, Golegou, Basayiannis, Skaltsas & Skaltsa, 2003; Shikov, Pozharitskaya, Makarov & Kvetnaya, 2008). Así mismo las condiciones adaptadas en cada método también han sido variadas como lo son, el medio cultivo, adición de suplementos y/o antibióticos, atmósfera de incubación, tiempo de incubación y tamaño del inoculo (Hartzen, Andersen, & Bremmelgaard, 1997). Sin embargo, el método de dilución en agar no es práctico para su uso habitual y con frecuencia se han utilizado los métodos de difusión. Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia en diversos estudios para determinar la actividad anti H. pylori de especies vegetales son difusión en disco y dilución en agar, en menor frecuencia son utilizados los métodos de microdilución en caldo e E-test (Piccolomini, R., Bonaventura, G., Catamo, G., Carbone, F. & Neri, M. 1997). Diversos estudios han demostrado obtener resultados favorables utilizando las distintas metodologías y variación de las condiciones en los distintos bioensayos (Nostro, Cellini, di Bartolomeo, di Campli, Grande, Cannatelli et al, 2005; Stamatis, Kyriazopolous, Golegou, Basayiannis, Skaltsas & Skaltsa, 2003; Shikov, Pozharitskaya, Makarov & Kvetnaya, 2008). II.9 Tratamiento de la infección por H. pylori

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H. pylori es difícil de erradicar y es necesario cuando menos de dos a tres antimicrobianos para obtener una terapéutica exitosa. De los tratamientos disponibles, ninguno erradica al germen en el 100% de los casos y aumenta el riesgo en dos posibilidades: la resistencia bacteriana y los efectos colaterales. (Sanjurjo, Pérez Manauta, Hidalgo, Geyene, 1999). Los consensos de Maastricht, el latinoamericano y otros como el del pacífico, han considerado que la terapia de primera línea debe ser IBP combinado con dos antibióticos como la amoxicilina + claritromicina o metronidazol durante siete a 10 días; estas terapias alcanzan altas tasas de erradicación cuando no hay resistencia a la claritromicina, cuya terapia ha sido probada en estudios multicéntricos mostraron resultados de erradicación superiores al 90%. Un ejemplo de ellos es un estudio piloto realizado por Lind (Lind, Veldhuyzen van Zanten, Unge, Spiller, Batyerdoerffer, O'Morain C, et al. (1996) alcanzando un éxito del 96% con el esquema de omeprazol 20mg, amoxicilina 1000mg y claritromicina 500mg suministrados dos veces al día por una semana. Sin embargo la falta de apego al tratamiento ligada a la resistencia bacteriana, como la resistencia natural de H. pylori a la claritromicina, pero en menor proporción que la resistencia al metronidazol , así como la resistencia transitoria a la amoxicilina, ha conducido a la adopción de nuevas terapias combinadas, así como la sugerencia de que el uso del omeprazol puede disminuir la tasa de resistencia al metronidazol, incrementando la tasa de erradicación de un 43 a un 76% cuando se adiciona a los regímenes terapéuticos. (Gomez, Otero, Gutiérrez, 2007). Dado que los consensos nacional e internacional determinan que para el tratamiento de la infección por H. pylori se debe incluir por lo menos dos antimicrobianos debido a la rápida resistencia que desarrolla la bacteria, se eligió al subcitrato de bismuto, ya que tiene condiciones farmacodinámicas semejantes a nitazoxanida y puede sinergizar con ella. Se han realizado estudios tendientes a demostrar la efectividad terapéutica del bismuto por Gomez, Otero, Gutiérrez, 2007) y posteriormente los trabajos para dilucidar la actividad de H. pylori y sobre todo la respuesta bacteriológica a los diferentes antimicrobianos utilizados en la terapéutica, ya fuera sola o combinada. Otros estudios realizados evaluaron un grupo de pacientes, el cual recibió nitazoxanida 500mg más subcitrato de bismuto 120 mg más 30 mg de lansoprazol cada 12 horas durante 14 días. Los pacientes fueron evaluados a los 14 días y a las seis semanas mediante prueba de aliento con carbono 14, para sustentar cura bacteriológica se alcanzó un 100% de erradicación. Los efectos colaterales (dolor epigástrico, náusea, coluria y cefalea) fueron mínimos y no obligaron a suspender el tratamiento, concluyendo que nitazoxanida más subcitrato de bismuto más lansoprazol tiene alta tasa de erradicación (87%); es seguro, bien tolerado y muestra eficacia en el tratamiento de la enfermedad acidopéptica asociada a infección por Helicobacter pylori (Sanjurjo, Pérez Manauta, Hidalgo, Geyene, 1999). Cabe destacar que la combinación de lansoprazol, claritromicina y un nitroimidazol es del 85,4%, mientras que si este último antibiótico es sustituido por amoxicilina se obtiene una tasa de erradicación media del 80.7%. Finalmente, la asociación de lansoprazol junto con amoxicilina y un nitroimidazol dispone de una eficacia terapéutica media del 76.4%.

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Los resultados mencionados son similares a los descritos previamente cuando es el omeprazol el IBP empleado. Por otra parte, diversos estudios aleatorizados que comparan omeprazol frente a lansoprazol junto con dos antibióticos han demostrado que ambos son igual de eficaces, En resumen, se afirma que puede utilizarse indistintamente omeprazol o lansoprazol dentro de las terapias triples con dos antibióticos durante una semana (Gisbert, Boixeda, Vila, Rafael, Alvarez Baleriola et al, 1995).

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PARTE III. RESULTADOS DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA DE ESTUDIO Para la realización del estudio se invitó a participar a las personas que atendieron la invitación a participar en la jornada de detección de cáncer de esófago, estómago, colon recto y ano organizada por La Liga Nacional contra el Cáncer junto con su Departamento de PIENSA e INCAN durante los años 2010 y 2011. En total acudieron 404 personas, de las cuales 296 (73%) fueron del género femenino y 208 (27%). De ellos 181 pacientes accedieron a participar voluntariamente en el estudio. La mayoría de ellos presentaron síntomas de dispepsia por lo que acudieron a la Clínica de Gastroenterología del INCAN a realizarse una endoscopía. Tres pacientes se retiraron voluntariamente del estudio, obteniéndose un total de 178 que participaron en el estudio por lo cual se les solicitó llenar la hoja de consentimiento informado y la ficha epidemiológica para obtención de datos demográficos. La muestra estuvo conformada en su mayoría por el género femenino, obteniendo una participación de 137 mujeres y de 43 hombres (Cuadro 1), distribución similar a la observada en el total de personas que participaron en las jornadas.

Cuadro 1. Distribución de la Muestra por Género

Género Frecuencia Porcentaje Femenino 137 76.11 Masculino 43 23.89 Total 180 100.00

Fuente: Proyecto FODECYT 52-2009 En el Cuadro 2 se puede observar la distribución etaria de los pacientes, la frecuencia de los pacientes aumentó conforme la edad, siendo la edad más frecuente la de más de 50 años con 80 pacientes, lo que corresponde al 48.8% de la muestra del estudio.

Cuadro 2. Distribución por Grupo Etario de los Pacientes Participantes

Rango Frecuencia Porcentaje

<18 2 1.2 20-25 5 3.0 26-30 6 3.7 31-35 15 9.2 36-40 18 11 41-45 20 12.2 46-50 18 11 >51 80 48.8

Total 164

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La información obtenida a través de la entrevista demostró que 178 (98.9%) pacientes

presentaron síntomas diversos y 2 (1.1%) fueron asintomáticos. El síntoma más frecuente fue el reflujo seguido por dolor abdominal, inflamación y flatulencia, las cuales coinciden con los síntomas más comúnmente descritos en la infección por H. pylori.

Cuadro 3. Frecuencia de Síntomas al Momento de Iniciar el Estudio

Síntomas Frecuencia Porcentaje

77.2 65.6 61.7 61.1 51.1 42.2

Reflujo Dolor abdomen Flatulencia Inflamación Llenura Náusea Diarrea Tos Otros Asintomáticos

139 113 111 110 92 76 49 46 12 2

27.2 25.6 6.7 1.1

Proyecto FODECYT 52-2009

De los 180 pacientes, 65 (36.1%) refirieron haber tenido un diagnóstico previo de H. pylori, 107 (59.4%) refirieron no haber tenido diagnóstico previo y 8 (4.4%) no respondieron. De los 65 que presentaron un diagnóstico previo, la mayoría indicó que fue por serología y ninguno refirió haber sido diagnosticado por clínica (Cuadro 4). De ellos, 52 (80%) refirieron haber recibido tratamiento específico para la infección. Sin embargo, fueron incluidos en el estudio por aún presentar la sintomatología sugestiva y al momento del estudio ninguno se encontraba en tratamiento.

Cuadro 4. Método de Diagnóstico Previo

Diagnóstico Frecuencia Porcentaje Serología 35 53.9 Biopsia 23 35.4 Heces 22 33.8 Aliento 2 3.1 Otros métodos 1 1.5 No sabe 1 1.5


En relación al tipo de tratamiento recibido, en el Cuadro 5 se presenta el tipo reportado por los 52 pacientes. Ningún paciente refirió haber recibido antidiarreicos u otro tipo de tratamiento.

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Cuadro 5. Tipo de Tratamiento Recibido

Tipo de tratamiento Frecuencia Porcentaje Antibiótico 41 78.8 Antiácido 10 19.2 Inhibidor de bomba de protones 10 19.2 No se recuerda 5 9.6


En lo que se refiere a los antecedentes familiares relacionados con la presencia de la bacteria, 57 (31.7%) pacientes reportaron tener un familiar cercano que ha sido diagnosticado con la infección y 42 (23.3%) tener un pariente con cáncer de estómago.

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III. 1 OBJETIVO 1 Evaluar el mejor diagnóstico de laboratorio de la infección por H. pylori y de la evaluación de la cura post-tratamiento al aplicar pruebas más sensibles y específicas

A los pacientes que aceptaron participar en el estudio se les tomó una muestra de tejido gástrico durante la endoscopía la cual fue utilizada para cultivo de H. pylori y tinción con hematoxilina-eosina para evaluación histopatológica. Además se les realizó el panel de pruebas para la detección de los diferentes anticuerpos específicos y del antígeno en heces. Es importante mencionar que a pesar que la infección fue diagnosticada previamente en 36% de los pacientes, fueron reclutados en el estudio ya que 98.9% de los mismos persistía con síntomas a pesar de haber sido tratados principalmentecon antibióticos. Las posibles causas de falla terapéutica podrían ser la falta de apego a la terapia o una posible resistencia a los antimicrobianos.

En el cuadro 6 se presentan los resultados obtenidos en la fase pre-tratamiento,

observándose una mayor positividad en los anticuerpos de tipo IgA anti-H. pylori con un 66.3%, los cualesconstituyenla respuesta inmune producida por el daño local a la mucosa gástrica causada por la bacteria.Los anticuerpos IgG específicos contra el antígeno cagA de H. pylorifueron positivos en 56.5% de los pacientes, lo que indica la respuesta crónica del hospedero al antígeno cagA de la bacteria que es un importante factor de patogenicidad y virulencia y eventual inductor de cáncer gástrico. Por otro lado los anticuerpos tipo IgM fueron positivos en un 43.3%, lo cual es un indicador de infección activa. El porcentaje de positividad en el cultivo obtenido fue bastante bajo, lográndose la recuperación únicamente en 19 pacientes (10.5%) (Gráfica 1).

Cuadro 6. Resultados Obtenidos en las Pruebas Realizadas Pre-tratamiento

Prueba Muestras

procesadas Muestras positivas

Muestras negativas

Número Número % Número % Anticuerpos IgG (cagA) 177 100 56.5 77 43.5 Anticuerpos IgM 179 76 43.3 102 56.7 Anticuerpos IgA 178 118 66.3 60 33.7 Antígeno en heces 148 55 36.7 93 62.8 Cultivo de H. pylori Biopsia

181 179

19 67

10.5 40.4

162 112

89.5 62.6


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Gráfica 1. Resultados obtenidos en las pruebas realizadas pre-tratamiento

Únicamente el 7.8% (14 pacientes) dieron un resultado negativo a todas las pruebas realizadas, lo que indica que el porcentaje de positividad en esta población es del 92.2%.

El criterio para considerar a un paciente positivo fue cumplir con alguno de lo siguiente,

siguiendo el criterio del consenso de Maastricht (1997):

• Resultado positivo en la biopsia • Resultado positivo para antígeno fecal • Resultado positivo en anticuerpos IgM • Resultado positivo en al menos dos tipos de anticuerpos

Todo paciente considerado positivo para la presencia de la bacteria fue citado al INCAN

para que el médico le recetara el tratamiento específico. Estospacientes seleccionados fueron contactados mensualmente por vía telefónica con el fin de registrar su evolución en cuanto a cambios en los síntomas después de la administración del tratamiento. Al transcurrir cinco meses después definalizado el tratamiento, se les programó una nueva cita en las instalaciones del INCAN para una nueva extracción de muestra y una segunda evaluación con el panel de pruebas serológicas y la detección de antígeno fecal (Fotografías 4 y 5).

De los 72 pacientes seleccionados para seguimiento post-tratamiento, solamente en 64

(35.4% del número inicial de muestra) logró completar su seguimiento y tomar una segunda muestra para evaluar la cura post-tratamiento. Este bajo porcentaje de pacientes en seguimiento fue influenciado por diferentes motivos entre los cuales se encuentran que no se logró una nueva comunicación con los pacientes por pérdida o desactivación de teléfono celular, dirección o teléfono inexacto, fallecimiento, viaje del paciente fuera del país, falta de tiempo disponible o de interés para acudir a su cita. Algunos pacientes presentaron problemas para adquirir su tratamiento motivo por el cual se tramitó la donación de 19 dosis del Helipack® de la compañía Qualypharm, la cual fue entregada a igual número de pacientes.

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La posible cura post-tratamiento fue evaluada según los cambios en la sintomatología presentada y confirmadacon base en los resultados obtenidos en las pruebas de laboratorio.

En relación a la sintomatología, como puede observarse en el Cuadro 7, se observó una disminución en todos los síntomas reportados en la fase pre-tratamiento y los síntomas más frecuentes al finalizar el tratamiento continuaron siendo reflujo y dolor abdominal. Es importante señalar que el número de pacientes asintomáticos se incrementó de 1.1% a 31% lo que sugiere un tratamiento exitoso en la reducción de síntomas dispépticos (Cuadro 7).

Cuadro 7. Frecuencia Porcentual de la Sintomatología de Pacientes pre y post- tratamiento

Síntomas Pre-tratamiento Post-tratamiento

Reflujo Dolor abdominal Flatulencia Inflamación Llenura Náusea Diarrea Tos Otros Asintomáticos

77.2 65.6 61.7 61.1 51.1 42.2 27.2 25.6 6.7 1.1

38.0 36.6 9.9

11.3 4.2 5.6 8.4 0

15.5 31



Gráfica 2. Frecuencia de sintomatología en los pacientes en las etapas pre y post-

tratamiento

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Fotografía 5. Toma de muestra sanguínea a pacientes post-tratamiento


Fotografía 6. Proceso de antígeno fecal a pacientes post-tratamiento


En los resultados de las pruebas de laboratorio realizadas post-tratamiento, se observó que en esta fase los anticuerpos IgM fueron los quepresentaron mayor positividad (60.3%) seguido por anticuerpos IgA (57.1%). Únicamente 17.8% de las muestras fueron positivas para antígeno en heces (Cuadro 8, Gráfica 3, Fotografías 6-8).

Cuadro 8. Resultados Obtenidos en las Pruebas Realizadas post-tratamiento

Prueba Muestras

procesadas Muestras positivas

Muestras negativas

Número Número % Número % Anticuerpos IgG cagA 64 34 53.1 30 46.9 Anticuerpos IgM 63 38 60.3 25 39.7 Anticuerpos IgA 63 36 57.1 27 42.9 Antígeno en heces 62 11 17.7 51 82.3


78


Gráfica 3. Resultados de los anticuerpos y antígeno fecal en pacientes post-

tratamiento

Fotografía 7. Proceso de pruebas por la metodología ELISA


Fotografía 8. Lectura de absorbancias de muestras en el lector de placas


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Fotografía 9. Procesamiento de pruebas para anticuerpos IgG, IgA y IgM contra H. pylori en muestras de pacientes post-tratamiento


Al realizar una comparación descriptiva de los resultados obtenidos en los diferentes métodos de diagnóstico pre y post-tratamiento, se puede observan una disminución marcada de la positividad del antígeno fecal, moderada en los anticuerpos IgA y leve en los anticuerpos IgG cagA. Por el contrario, en los anticuerpos IgM se observó un incremento.

Se realizó una evaluación estadística con el resultado obtenido en 51 pacientes a

quienes,después de completado el tratamiento, se les realizó el panel de antígeno y anticuerpos. Se evaluó el cambio en cada prueba,pre y post-tratamiento, por medio de la prueba de X2 de McNemar, obteniendo el resultado que se presenta en el Cuadro 9.

Cuadro 9. Evaluación de las Pruebas pre y post-tratamiento

Prueba Probabilidad Antígeno fecal <0.0001 Anticuerpos IgM 0.9999 Anticuerpos IgA 0.9999 Anticuerpos IgG cagA 0.057


Estos resultados demuestran que la única prueba de diagnóstico que presentó un cambio estadísticamente significativo luego del tratamiento fue la detección de antígeno fecal la cual disminuyó significativamente.

80

III.2 OBJETIVO 2

Establecer y evaluar la acción anti-H. pylori de extractos de plantas nativas usadas popularmente en el tratamiento de enfermedades digestivas.

Fueron seleccionadas plantas nativas usadas popularmente para afecciones gastrointestinales. El punto de partida fue una base de datos con 521 entradas de la cual se fueron seleccionando todas aquellas por su uso en afecciones gastrointestinales crónicas y colitis. Se delimitó la muestra hasta llegar a un total de 121 plantas que, aparte de ser usadas para afecciones indicadas previamente, se indicaba su uso para gastritis. Finalmente, fueron obtenidos los extractos etanólicos de Bixa orellana, Bursera simarouba, Sambucus mexicana, Litsea guatemalensis, Sida rhombifolia, Eucalyptus globulus, Chiranthodendron pentadactylon, Guazuma ulmifolia y Lippia dulcis de la colección de extractos del departamento de Citohistología, Fac. de CCQQ y Farmacia, USAC. Las hojas de Tecoma stans fueron recolectadas, secadas y posteriormente preparada para obtener el extracto etanólico de la misma, obteniéndose un porcentaje de rendimiento del extracto de 24.7%.

Un total de 10 extractos etanólicos fueron utilizados para realizar el bioensayo para la detección de la actividad anti-H. pylori. Los porcentajes de rendimiento de los extractos utilizados se presentan en el cuadro

Cuadro 10. Información general y porcentajes de rendimiento de las plantas a

evaluar actividad anti Helicobacter pylori Proyecto FODECYT 52-2009

Familia Especie Vegetal Nombre común

Parte utilizada/solvente

*Voucher No.

Procedencia Usos Rendimiento (%)

Bixaceae Bixa orellana L. Achiote Semilla/etanol 379 El Cacaotal, Suchitepéquez

BCEFIJT 13.95

Burseraceae Bursera simarouba L.

Palo jiote Corteza/etanol 345 Jalapa BCFT NR

Caprifoliaceae Sambucus mexicana Pres ex A.DC. in DC.

Saúco Hoja/etanol 341 San Marcos BCEFIT NR

Laureceae Litsea guatemalensis Mez.

Laurel Hoja/etanol 965 Tecpán, Chimaltenango

CF 20.70

Malvaceae Sida rhombifolia Swartz

Escobillo Corteza/etanol 354 Guatemala Guatemala

BCFIT NR

Myrtaceae Eucalyptus glubulus Labill

Eucalipto Hoja/etanol 265 Livingston, Izabal

CFT NR

Sterculiaceae Chiranthodendron pentadactylon Larr.

Manita Corteza/etanol 1,088 Carretera entre Chimaltenango

y Tecpán

BCF 1.52

Sterculiaceae Guazuma ulmifolia Lam.

Caulote Hoja/etanol 685 El Cacaotal, Suchitepequez

BFIT NR

Verbenaceae Lippia dulcis Trev. Hoja/metanol 968 USAC, Guatemala

BCEFT 10.64

Bignoniaceae Tecoma stans Juss. Ex HBK.

Timboco Hoja/etanol 435 Samayac, Suchitepequez

BCEFIT 24.7%

• *Herbario: Laboratorio de Productos Naturales Farmaya, S.A. • NR No se encontraron datos reportados. • Usos: A= Amebiasis; B= Diarrea/Disentería; C= Cólico/Dolor abdominal; E= Estreñimiento/Laxante/Emético; F=

Gastritis/Colitis; G= Parasitos; I= Indigestión/Flatulencia; J= Antiemético; T= Tónico/Aperitivo. Fuente: Proyecto Fodecyt 52-2009

81

Para llevar a cabo el bioensayo se reactivaron tres aislamientos (I-0610085, I-0610111,

I-0211164) de H. pylori que se encontraban almacenadas a -80°C con caldo Brucella y que se obtuvieron de los cultivos de las biopsias de los pacientes del estudio (Fotografía 3).

Para evaluar la actividad anti-H. pylori, los diez extractos de plantas seleccionados

fueron utilizados para la preparación de agar planta a una concentración 100µg/mL en agar sangre de carnero (ASC) al 7.5% en base Columbia. Los resultados obtenidos en esta etapa de tamizaje demostraron actividad inhibitoria del extracto etanólico de la hoja de B.orellana y L. dulcis contra el crecimiento del aislamiento I-0211164 (Fotografías 9-11).

Fotografía 10. Colonias de H. pylori reactivadas


Fotografía 11. Actividad negativa anti-H. pylori a 100µg/mL


82

Fotografía 12. Actividad positiva anti-H. pylori a 100µg/mL

Fuente Proyecto FODECYT 52-2009

Para darle validez al ensayo se prepararon medios ASC 7.5% con una concentración de claritromicina de 0.125µg/mL y con etanol al 50%, los que sirvieron como control positivo y negativo respectivamente (Fotografía 12).

Fotografía 13. Controles para validación de bioensayo


83

III.3 OBJETIVO 3

Establecer y evaluar las pruebas de laboratorio más sensibles y específicas para realizar el diagnóstico de la infección por H. pylori.

Para realizar el análisis y determinar el grado de concordancia entre los métodos, se utilizó el análisis estadístico kappa (Tabla 4), el cual permite comparar los resultados de los cuatro métodos serológicos utilizados en el presente estudio para el diagnóstico de la infección por H. pylori con el resultado obtenido en el estudio histopatológico de la biopsia realizada en el INCAN, el cual se consideró en este estudio como el estándar de oro.

Tabla 4. Valoración del Índice de kappa

Valor de kappa Fuerza de la concordancia < 0.20 Pobre

0.21 – 0.40 Débil 0.41 – 0.60 Moderada 0.61 – 0.80 Buena 0.81 – 1.0 Muy buena

Fuente: Altman DG (1991). Practical statistics for medical research. New York: Chapman and Hall; 1

Se determinó la sensibilidad y especificidad de las diferentes pruebas utilizadas en el presente estudio y el índice de kappa al compararlos con el estándar de oro, la biopsia. Como se trata de pacientes enfermos, lo que más interesa es evaluar la sensibilidad, es decir que una prueba de un resultado positivo cuando verdaderamente es positivo. La determinación de anticuerpos IgA fue el método en el que se obtuvo una mayor sensibilidad (74.2%), seguido de la determinación de anticuerpos IgG cagA. Los anticuerpos IgA desempeñan un papel importante como primera línea de defensa a nivel local, mientras que los IgG se encuentran elevados cuando el paciente presenta una enfermedad crónica, siendo éste un indicador del daño persistente en la mucosa gástrica. En relación a la especificidad, el cultivo fue el que presentó el valor más alto (95.9%), esto quiere decir que da un resultado negativo en una población negativa, pero tiene muy mala sensibilidad (35.4%). Todas las pruebas presentaron altas tasas de falsos negativos y falsos positivos, lo que explica los índices de concordancia tan bajos.

Al realizar la comparación entre los resultados obtenidos en la biopsia con la detección

de antígeno fecal y anticuerpos (IgM, IgA e IgG cagA) anti H. pylori en la fase previa a la toma del tratamiento, se obtuvo un índice kappa < 0.20 (IC 95%) en todas las pruebas, lo cual demuestra que la concordancia entre los métodos es pobre, es decir que no existe relación (Cuadro 11).

84

Cuadro 11. Resultados Obtenidos Entre los Métodos Utilizados y la Biopsia

Prueba Sensibilidad (%)

Especificidad (%)

kappa

Antigenofecal 50.0 69.9 0.2005 Anticuerpos IgM 48.5 62.6 0.1103 Anticuerpos IgA 74.2 37.4 0.1043 Anticuerpos IgG cagA 63.6 47.5 0.1038 Cultivo 35.4 95.9 0.3596


85

III.4 OBJETIVO 4 Determinar la utilidad de la medición de la gastrina y pepsinógeno I y II en el diagnóstico de la infección por H. pylori. A la fecha para poder detectar el daño en la mucosa gástrica se utilizan métodos invasivos, por lo que se ha propuesto el uso del pepsinógeno I y II en conjunto con la gastrina para evaluar este daño. Por tal motivo a los pacientes del estudio se les realizaron estas mediciones antes y después del tratamiento (Fotografía 14).

Fotografía14. Medición de niveles de pepsinógeno I y II de muestras de pacientes post-tratamiento por la técnica ELISA


Los resultados obtenidos en la medición de los niveles de pepsinógeno I y II antes y después del tratamiento se observan en el Cuadro 12, en el que se demuestra que al finalizar el tratamientose incrementó el número de pacientes con valores altos de pepsinógeno I, mientras que los valores de pepsinógeno II los cambios no fueron significativos.

86

Cuadro 12. Distribución de los Pacientes del Estudio de Acuerdo a los Niveles de Pepsinógeno I y II

Alto Normal Disminuido Total Pre-tratamiento Pepsinógeno I (35 – 200µg/mL)

6 (6.1%)

82 (82.9%)

11 (11.1%)

99

Pepsinógeno II (2.3 – 20µg/mL)

34 (21.9%)

106 (68.4%)

15 (9.7%)

155

Post-tratamiento Pepsinógeno I (35 – 200µg/ml)

13 (22.8%)

40 (70.2%)

4 (7%)

57

Pepsinógeno II (2.3 – 20µg/mL)

11 (17.5%)

44 (69.8%)

8 (12.7%)

63


Al inicio del estudio 60.6% de los pacientes presentaron un índice de pepsinógeno I/II dentro del rango normal, el cual se incrementóa 85.4% en la etapa post-tratamiento, lo cual es un indicativo que la mucosa gástrica se recuperó como respuesta al mismo (Cuadro13), Gráfica 4).

Cuadro 13. Relación Pepsinógeno I/ II de los pacientes pre y post-tratamiento

Índice pep I/ pep II

Pre- tratamiento (%)

Post- tratamiento (%)

Alto 4.22 8.33 Disminuido 35.21 6.25 Normal 60.56 85.42



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Gráfica 4. Relación pepsinógeno I/ II de los pacientes pre y post-tratamiento

A los pacientes también se les realizó la prueba de gastrina que evalúa la integridad de la mucosa, el 95.2% de los pacientes presentaron valores elevados. Sin embargo, en la etapa post-tratamiento solo se evaluaron 13 muestras por inestabilidad de los reactivos y otras dificultades técnicas con el método diagnóstico.Valores arriba del rango normal son indicativos del daño en la mucosa debido a la infección de la bacteria lo que interfiere en los mecanismos fisiológicos que regulan la producción de la gastrina (Cuadro 14). Como respuesta al tratamiento era de esperar que los valores de gastrina regresaran a los valores normales al igual que el índice de pepsinógeno I /II.

Fotografía 15. Procesamiento de gastrina


Cuadro 14. Distribución de Pacientes del Estudio de Acuerdo a los Niveles de Gastrina

Gastrina

(Normal: < 100UI/mL) Pre-tratamiento Post-tratamiento

Número % Número % Normal 6 4.8 0 0 Elevado 119 95.2 13 100 Total 125 13


88

III. 5 OBJETIVO 5 Establecer las pruebas de laboratorio más sensibles y específicas para la evaluación de la cura post-tratamiento de la infección por H. pylori. A todos los pacientes con un resultado positivo de acuerdo a los criterios establecidos se les programó una cita con el médico para informarle del resultado y establecer el tratamiento adecuado, de preferencia siguiendo los consensos de Maastricht. A cada paciente se le dio seguimiento durante 5 meses post-tratamiento, contactándolo mensualmente vía telefónica para llevar su control respecto al cumplimiento del mismo y evaluar la evolución de la sintomatología.Algunos pacientes fueron excluidos ya que no se presentaron a su cita, no tomaron el tratamiento o no siguieron en el estudio por cualquier otra razón. En los Cuadros 6, 8 y 9 se observa de una forma global los cambios de los anticuerpos y antígeno durante el pre y post-tratamiento para la erradicación de H. pylori. En la comparación descriptiva de la frecuencia porcentual del antígeno fecal y anticuerpos, muestra la disminución marcada del antígeno fecal, moderada de IgA y leve de IgG cagA, mientras que la IgM se incrementó notablemente. Para la evaluación del cambio entrela frecuencia de positividad en las pruebas pre y post-tratamiento se realizó la prueba de X2 de McNemar, en la cual se puede observar que el antígeno fecal presentó un cambio estadísticamente significativo luego del tratamiento. Los anticuerpos, si bien presentaron cambios como se indicó anteriormente, no fueron significativos.

89

III. 6 OBJETIVO 6 Establecer y validar un procedimiento para el procesamiento de muestras para el diagnóstico microbiológico de la infección por H. pylori mediante cultivo, técnica de ureasa rápida y observación microscópica del frote teñido por el método de Gram modificado. Este objetivo se alcanzó cultivando las 179 biopsias recibidas, caracterizando los aislamientos sospechosos y reactivando los aislamientos utilizados. Se establecieron las condiciones óptimas de cultivo para el aislamiento en el Laboratorio de Bioensayos. El mejor crecimiento en los aislamientos primariosfue observado en muestras maceradas e inoculadas en medio de cultivo ASC al 7.5% base Columbia más suplemento Isovitalex. Las mismas condiciones fueron utilizadas para la reactivación (Cuadro15, Fotografía 16).

Cuadro 15. Condiciones de Cultivo de H. pylori Utilizadas en Inóculos Primarios y Reactivación de Aislamientos

Condiciones Parámetros

Medio de cultivo ASC 7.5% base Columbia más suplemento Isovitalex Atmósfera microaerofílica Sobre para generación de microaerofilia

CampygenMTcon 10% de CO2 Tiempo de cultivo Siete días


Fotografía 16. Crecimiento de H. pylori


(A) se observa menor crecimiento en agar chocolate en inóculo inicial comparado con (B) el

crecimiento observado en ASC 7.5% mas Isovitalex. (C) Se observan colonias puras de H. pylori en fase de reactivación

90

III. 7 OBJETIVO 7 Desarrollar un banco de cepas con los aislamientos de H. pylori obtenidos de los pacientes que participen en el estudio.

Se compararon tres metodologías de preservación de aislamientos de H. pylori, caldo Brucella adicionado con 15% de glicerol, leche descremada y caldo BHI; las mejores condiciones para garantizar la reactivación se obtuvieron en el caldo Brucella. Usando este medio y condiciones de almacenamiento de -80°C se guardaron los 12 aislamientos del estudio para futuras investigaciones (Cuadro 16). Estos aislamientos se encuentran almacenados en el Departamento de Citohistologia, Fac. CCQQ y Farmacia, USAC:

Cuadro 16. Aislamientos de H. pylori de los pacientes del estudio

Fecha procesamiento Código

08/04/2010 I-0310039 15/03/2010 I-0310057 10/06/2010 I-0610085 22/06/2010 I-0610096 24/09/2010 I-0910107 27/07/2010 I-1110101 04/11/2010 I-1110110 15/11/2010 I-1110117 24/01/2011 I-0111141 21/02/2011 I-0211163 21/02/2011 I-0211164 22/02/2011 I-0211167 14/03/2011 I-0311176 15/03/2011 I-0311177


91

III. 8 OBJETIVO 8 Establecer bioensayos para el tamizaje de la acción anti-H pylori de las especies nativas utilizando como blanco bacterias aisladas de muestras clínicas.

Se realizó el tamizaje de actividad anti-H. pylori por medio de la metodología estandarizada por el seminario I de investigación “Aislamiento de Helicobacter pylori e inhibición de la bacteria por diez extractos de plantas medicinales utilizadas popularmente en el tratamiento de infecciones gastrointestinales” el cual fue realizado por las estudiantes Cristina Quintana, Rosenda Yax y Licda. Margarita Paz de Ramírez en la Unidad de Bioensayos, Departamento de Citohistología, Fac. CCQQ y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala.

Dentro de las actividades de este seminario se estandarizó la metodología para la

realización del bioensayo, la cual utiliza como medio agar planta, base Columbia enriquecido con sangre de carnero al 7.5% habiendo sido este medio en el que se presentó mayor crecimiento.

Por otro lado dentro de las actividades de este seminario se determinó la actividad

antimicrobiana de diez extractos de plantas medicinales utilizadas popularmente en Guatemala para el tratamiento de infecciones gastrointestinales. Para ello se utilizaron los aislamientos de H. pylori obtenidos de las biopsias gástricas. Los porcentajes de rendimiento de los extractos etanólicos se presentan en el cuadro 17.

92

Cuadro 17. Información general y porcentajes de rendimiento de las plantas a evaluar actividad anti Helicobacter pylori Seminario I

Familia Especie Vegetal Nombre

común Parte

utilizada/solvente *Voucher Procedencia Usos Rend

(%) Asteraceae/Compositae Neurolaena

lobata (L.) R. Br. Tres puntas Hoja/etanol 458 Samayac

Suchitepequez CFIT 23.6

Asteraceae Tagetes lucida Cav.

Pericón Hoja/etanol 1,127 Cuatro Caminos, San Cristóbal, Totonicapán

BCEEFGIJT 12.55

Fagaceae Quercus crispifolia Trelease.

Encino Hoja/etanol 754 Cierra de las minas

BEF 5.6

Malpighiaceae Byrsonima crassifolia L. HBK

Nance Corteza/etanol 31 Samayac Suchitepequez

BCGIT 29.5

Myrtaceae Psidium guajava L.

Guayaba Hoja/etanol 1169

Ecoparcela, El cacaotal Samayac Suchitepéquez

BCEFGIJ 20.15

Piperaceae Piper jaquemontianum Kunth

Cordoncillo Hoja/etanol 1098

Laguna de Lachuá, Cobán Alta Verapaz

CFI 11.0

Rhizophoraceae Rhizophora mangle L.

Mangle rojo Corteza/etanol 399 Chiquimulilla Santa Rosa

BT 24

Smilacaceae Smilax dominguensis Willd

Zarzaparrilla Raiz/etanol 662 Samayac Suchitepequez

BCF 40.4

Solanaceae Solanum nigrescensa

Mart.& Gal

Macuy, quilete

Hierba/metanol 1111 Carretera entre Chimaltenango y Tecpán

EF 28.3

Verbenaceae Cornutia pyramidata L.

Jorkté Hoja/etanol 724 Coban, Altaverapaz

BCI 15.6

• *Voucher: Laboratorio de Productos Naturales Farmaya, S.A. • Usos: A= Amebiasis; B= Diarrea/Disentería; C= Cólico/Dolor abdominal; E= Estreñimiento/Laxante/Emético; F=

Gastritis/Colitis; G= Parasitos; I= Indigestión/Flatulencia; J= Antiemético; T= Tónico/Aperitivo. Fuente: Yax R, Quintana C, Paz M. Aislamiento de Helicobacter pylori e inhibición de la bacteria por diez

extractos de plantas medicinales utilizadas popularmente en el tratamiento de infecciones gastrointestinales. Seminario de Investigación. Fac. CCQQ y Farmacia. En proceso.

Se evaluó el efecto inhibitorio in vitro de diez especies vegetales, las cuales son

utilizadas popularmente para el tratamiento de infecciones gastrointestinales. Dichos extractos fueron evaluados contra tres aislamientos de H. pylori obtenidos y recuperados de muestras clínicas de los pacientes de éste proyecto, con el fin de comprobar su acción bactericida y poder proponerlas como una alternativa natural para el control efectivo de este enteropatógeno.

La actividad anti-H. pylori de los extractos, fue evaluada por el método de dilución en

agar, utilizando como medio agar base Columbia enriquecido con sangre de carnero al 7.5%, en condiciones de microaerofília (CampyGen™ Oxoid). Fueron utilizados los aislamientos de los pacientes y se aplicó el ensayo con un total de cinco repeticiones para asegurar un nivel de confianza de α = 0.05. Así mismo, el método empleado fue validado mediante una curva de actividad dosis/efecto, enfrentando al microorganismo contra

93

diferentes concentraciones de claritromicina, el antibiótico de elección. Tomando esta metodología y condiciones de cultivo como estandarización del bioensayo.

Cuadro 18. Determinación de concentración de Claritromicina para inhibir los

aislamientos de H. pylori

Concentración µg/mL Resultado obtenido 32 No inhibición 16 No inhibición 8 No inhibición 4 No inhibición 2 No inhibición 1 No inhibición

0.5 No inhibición 0.25 No inhibición 0.125 Inhibición 0.0625 Inhibición 0.03125 Inhibición

Fuente: Yax R, Quintana C, Paz M. Aislamiento de Helicobacter pylori e inhibición de la bacteria por

diez extractos de plantas medicinales utilizadas popularmente en el tratamiento de infecciones gastrointestinales. Seminario de Investigación. Fac. CCQQ y Farmacia. En proceso.

Se encontró actividad inhibitoria significativa (p< 0.05) de los extractos etanólicos de C.

pyramidata, T. lucida, B. crassifolia y S. nigrescens (metanólico) con una CIM de 100 µg/mL y 50 µg/mL para R. mangle. Utilizando las condiciones establecidas por este seminario, se evaluaron las diez plantas seleccionadas en este proyecto. Para ellos se realizaron cinco repeticiones por ensayo con cada uno de los extractos tanto en la fase de tamizaje como en la determinación de la CIM con tresaislamiento (identificadas como cepas I-0610085, I-0610111, I-0211164) de H. pylori seleccionadas a conveniencia por presentar un crecimiento adecuado al bioensayo. Se demostró actividad en el extracto de B.orellana y de L. dulcis contra el aislamiento I-0211164. El análisis de los resultados se hizo por medio de la prueba de hipótesis binomial, mostrando una actividad anti-H. pylori significativa (p<0.05) (Cuadro 19). Para la validez del bioensayo se utilizó como control interno positivo el medio de cultivo con claritromicina a 0.125µg/mL, el cual mostró actividad sobre H. pylori y el control negativo, con etanol al 50%, que no mostró ninguna inhibición. El crecimiento de H. pylori fue homogéneo y no se encontró contaminación en ninguna de las placas.

94

Cuadro 19. Actividad Inhibitoria in vitro de 10 Extractos Vegetales Contra

Aislamientos de H. pylori, Utilizando la Técnica de Dilución en Agar

Especie Vegetal Parte utilizada

Test de dilución en agar (100µg/mL)

I-0610085 I-0610111 I-0211164 B. orellana Semilla Inactivo Inactivo Activoa B. simarouba Corteza Inactivo Inactivo Inactivo C. pentadactylon Corteza Inactivo Inactivo Inactivo E. globulus Hoja Inactivo Inactivo Inactivo G. ulmifolia Hoja Inactivo Inactivo Inactivo L. dulcis Hoja Inactivo Inactivo Activo a L. guatemalensis Hoja Inactivo Inactivo Inactivo S. mexicana Hoja Inactivo Inactivo Inactivo S. rhombifolia Corteza Inactivo Inactivo Inactivo T. stans Hoja Inactivo Inactivo Inactivo

Fuente: Proyecto FODECYT 52-2009 aActividad inhibitoria significativa (p < 0.05)

95

III. 9 OBJETIVO 9 Establecer, evaluar y validar la acción microbicida y la concentración inhibitoria mínima de especies vegetales nativas utilizadas popularmente para el tratamiento de enfermedades digestivas. Se determinó la CIM de los extractos con actividad anti-H. pylori en la fase de tamizaje, la actividad fue significativa (p=0.0312), tanto para L. dulcis como para B. orellana demostrando una inhibición bacteriana a una concentración de 100µg/mL lo que permite aceptar la hipótesis planteada.

Fotografía 17. Demostración de actividad inhibitoria mínimade B. orellana frente a H. pylori


Fotografía 18. Demostración de actividad inhibitoria mínimade L. dulcis frente a H. pylori


De acuerdo a los resultados en otras regiones del mundo se estima que de 10 a 20%

96

de las plantas evaluadas podrían tener actividad inhibitoria contra H. pylori. En la presente investigación y el Seminario de investigación I (Yax R, Quintana C, Paz M. Aislamiento de Helicobacter pylori e inhibición de la bacteria por diez extractos de plantas medicinales utilizadas popularmente en el tratamiento de infecciones gastrointestinales. Seminario de Investigación. Fac. CCQQ y Farmacia.) se generó información de 20 extractos vegetales, de los cuales 6 (30%) presentaron actividad a la concentración de tamizaje (100µg/mL). Esta actividad es relevante para validar el uso popular, pero no es suficiente para proponer el desarrollo de un nuevo medicamento.

97

III. 10 OBJETIVO 10 Divulgar a las autoridades, actores sociales e institucionales en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación.

Con el apoyo de este proyecto se logró la elaboración de dos trabajos de evaluación terminal de Química Biológica (modalidad de Seminario de Investigación, Fac. CCQQ y Farmacia) los cuales son:

1. Yax R, Quintana C, Paz M. Aislamiento de Helicobacter pylori e inhibición de la bacteria por diez extractos de plantas medicinales utilizadas popularmente en el tratamiento de infecciones gastrointestinales. Seminario de Investigación. Fac. CCQQ y Farmacia. En proceso. Las actividades realizadas dentro de este seminario se encuentran detalladas en el objetivo 8 de este proyecto.

2. Hornquist N, Maldonado E, Benito M, Camo M, Lange K, Matta V. Identificación de las pruebas más sensibles y específicas para el diagnóstico de H. pylori pre y post-tratamiento en pacientes dispépticos. Seminario de Investigación. Fac. CCQQ y Farmacia. En proceso. Este seminario se realizó durante el período de enero de 2010 a noviembre de 2011 con el objetivo de identificar dentro de un panel de pruebas diagnósticas la o las mejores pruebas que permitan identificar una infección activa por Helicobacter pylori. Para ello a los pacientes que voluntariamente aceptaron participar se les realizaron varias pruebas diagnósticas no invasivas, las cuales permitieron la detección del antígeno y la identificación de anticuerpos específicos para Helicobacter pylori (IgA, IgM e IgG CagA). Además se determinaron los valores de pepsinógeno I/II, las cuales evalúan la integridad de la mucosa gástrica (estado funcional). Posteriormente se evaluó la efectividad del tratamiento en base a la negativización de las pruebas de laboratorio para la cual se determinaron anticuerpos, antígeno y pepsinógeno I/II seis meses después de la toma adecuada del tratamiento. De las pruebas evaluadas, el índice de pepsinógeno I/II reflejaron tener un bajo valor diagnóstico en la infección por lo que no es recomendable, la prueba antígeno fecal presentó una disminución estadísticamente significativa siendo esta la más específica para el diagnostico (69.9%, k=0.2005); y entre las pruebas serológicas, el anticuerpo IgA fue la más sensible (74.2%), por consiguiente según este estudio ambas son las recomendadas para hacer un diagnostico de la infección primaria y la evaluación de la cura post-tratamiento.

Ambos seminarios han finalizado su parte experimental y el informe final está siendo

elaborado para su presentación ante las autoridades. Con los resultados obtenidos en el presente proyecto se espera por lo menos preparar dos

artículos científicos para su publicación en revistas nacionales.

98

Por otro lado se ha planeado realizar una actividad de difusión durante la Jornada Científica de la Fac. CCQQ y Farmacia que se realizará en el mes de septiembre 2012 donde se divulgarán los resultados del presente proyecto.

Para socialización de los resultados con actores sociales se realizará una presentación de

resultados a los miembros de PIENSA que participan en jornadas de prevención de cáncer gástrico y a los profesionales de las ciencias médicas durante el próximo congreso nacional de medicina.

Con el fin de promover el conocimiento, forma de transmisión y prevención de la

enfermedad se elaboró un trifoliar el cual será enviado a la Editorial Universitaria para su impresión y posterior divulgación (Anexo 3).

99

PARTE IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

La infección por Helicobacter pylori ocurre a nivel mundial y se ha demostrado que su prevalencia muestra una alta variabilidad según la región geográfica, etnia, raza, edad y factores socioeconómicos. Es alta en países en desarrollo y más baja en el mundo desarrollado por lo que ha sido considerada como un marcador de pobreza (Dunn, Cohen, Blaser, 1997). En los últimos años se ha visto una tendencia creciente en la prevalencia de H. pylori en muchas partes del mundo. En Guatemala en el 2010 se determinó que el 65% de la población adulta estaba infectada con H. pylori por lo cual la determinación de la infección a través de pruebas de laboratorio es importante para el diagnóstico y tratamiento temprano del mismo para evitar de esta manera problemas gástricos e incluso daños irreversibles como el cáncer gástrico (Cardona, Gutiérrez, Orozco, Otero, Quintero y Sánchez, 2003).

H. pylori es una bacteria que presenta factores de virulencia que contribuyen a la

invasión de la mucosa y submucosa gástrica tales como adhesinas, la producción de las enzimas ureasa y fosfolipasas y presencia de citotoxinas (VacA y CagA) entre otras. Dicha patogenicidad provoca daños a nivel gástrico tales como la formación de úlceras, gastritis crónica y el desarrollo de cáncer gástrico. Estudios han demostrado que los pacientes con un diagnóstico positivo por H. pylori tienen 3.73 veces más probabilidad de padecer gastritis crónica, planteando que dicha bacteria es la causante de aproximadamente el 85% de los casos de gastritis crónica en el ser humano y el factor causal más importante de ésta.

Investigaciones realizadas han demostrado que algunos personas que padecenla infección por H. pylori no presentan síntomas y la misma puede pasar desapercibidapor varios años, mientras que otros pacientes padecen de gastritis, úlcera duodenal o gástrica pudiendo desarrollar linfomas o adenocarcinomas gástricosEstudios realizados han encontrado mucha similitud entre la epidemiología de la infección por H. pylori y la de cáncer gástrico (Hernández, 2001).

Por esta razón es importante que a los pacientes que presenten la infección se les

administre el tratamiento específico a tiempo antes de que el cáncer gástrico ya se encuentre desarrollado. Para realizar el diagnóstico adecuado y poder conocer el daño en la mucosa es necesario el uso de pruebas invasivas que permitan evaluar el daño que ya existe en la mucosa. En los últimos años se ha sugerido el uso del gastropanel, que incluye la detección de los anticuerpos específicos anti-H. pylori en conjunto con la determinación de pepsinógeno I y II en conjunto con la gastrina, con el fin de realizar el diagnóstico de la gastritis atrófica e identificar a los pacientes que tienen un riesgo elevado de sufrir carcinoma gástrico (Valle Muñoz, Artaza Varasa, López Pardo, Rodríguez Merlo , Pérez Grueso, Escobedo et al, 2007).

Este estudio se realizó con el fin de realizar un diagnóstico de laboratorio de la infección

por H. pylori y de la evaluación de la cura post-tratamiento al aplicar pruebas más sensibles y específicas utilizando las pruebas sugeridas en el gastropanel. Asi también evaluar la cura

100

post-tratamiento y en esta forma evitar el desarrollo de lesiones más graves como el cáncer gástrico.

Por ello en este estudio se invitó a participar a personas que presentaron síntomas de dispepsia por lo quese entrevistaron a 181 pacientes de ambos géneros mayores de edad que asistieron al INCAN para realización de una endoscopía. Del total de pacientes entrevistados, 3 pacientes se retiraron voluntariamente del estudio, obteniéndose un total de 178 pacientes, que cumplían con los criterios de inclusión.

La muestra en su mayoría estuvo conformada por el género femenino (76.1%), lo cual

probablemente se deba al horario matutino de atención de la consulta externa del INCAN. En relación a la edad se encontró que la mas frecuente fue la de mayor de 50 años, que correspondió al 48.8% de la muestra.

Del total de pacientes del estudio 36.1% habían sido diagnósticados previamente con la

infección y refirieron haber sido tratados; a pesar de ello, el 98.8% indicó presentar aún sintomatología. Los síntomas de mayor prevalencia en orden descendente fueron: reflujo, dolor abdominal, inflamación y flatulencias, coincidiendo con los síntomas más frecuentemente reportados en la literatura sobre infección gastrointestinal por H. pylori (Egan, O’morain, 2007).

La falta de apego al tratamiento y la posible resistencia antimicrobiana se pueden

considerar como factores importantes en la erradicación de la bacteria ypor consiguiente implica la persistencia de síntomas generales en el 69.01% delos pacientes post-tratamiento participantes en el estudio. Sin embargo, en este estudio se evaluó la presencia de sintomatología antes y después del tratamiento, observándose un cambio estadísticamente significativo de reducción de síntomas después del tratamiento (de 98.8% a 69.01%), así como el porcentaje de pacientes asintomáticos el cual aumentó de 1.1% a 30.99%, demostrando una mejoría en los pacientes posterior al tratamiento antibiótico. Es interesante saber que aún después del tratamiento los síntomas más importantes continúan siendo el reflujo, dolor de abdomen y flatulencia.

Entre las terapias mas utilizadas por los pacientes, se encuentra el uso de claritromicina,

y se ha señalado que el H. pylori manifiesta resistencia a este macrólido por mecanismos de mutaciones puntuales. En un estudio realizado de 2002 a 2005 en Japón se encontró una tasa de resistencia del H. pylori a este antibiótico del 24% comparado con un 22% encontrado en Europa (Kobayashi, Murakami, Kato, Kato, Azuma, Takahashi et al, 2007).

La resistencia a los antibióticos y su negativa influencia en la efectividad de los

tratamientos erradicadores de H. pylori constituyó un tema de máxima relevancia en la III Conferencia de Consenso de Maastrich. Se reconoció el incremento de la resistencia a la claritromicina y se recomendó la triple terapia con un inhibidor de la bomba de protones (IBP), amoxicilina o metronidazol y claritromicina para aquellas poblaciones con una prevalencia de resistencia a este antibiótico menor del 15-20. La cuádruple terapia con un IBP, bismuto, tetraciclinas y metronidazol podría ser una alternativa a la triple terapia como tratamiento de primera elección (Castro y Vargas, 2009).

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En esta muestra, el 92.2% de la población dieron positiva en al menos una prueba para H. pylori lo que indica un porcentaje bastante alto. Este porcentaje tan alto pudiera deberse a que es una población que fue seleccionada por la presencia de la sintomatología específica.

Una de las pruebas utilizadas en es este estudio fue la detección de antígeno en heces fecales. Sus ventajas más importantes son la rapidez y la sencillez de la técnica ya que puede realizarse en pocos minutos y obtener resultados inmediatos que permitan iniciar el tratamiento adecuado (Calvet, Quezada, Sanfelius, Monserrat, Brullet, Real et al, 2003). En la primera etapa en este estudio, del total de pacientes evaluados (178) solamente 148 pacientes entregaron sus muestras para su análisis. De ellos, el 37.16% presentaron un resultado positivo lo cual representa un porcentaje bajo,e indica que esta prueba en forma aislada no puede ser utilizada como un criterio diagnóstico por el médico para recomendar el tratamiento.Sin embargo, al comparar los cambios en la positividad pre y post-tratamiento se observa una disminución estadísticamente significativa del 37.16% a 17.74% (p <0.0001), lo cual demuestra el posible éxito del tratamiento, criterio considerado como válido según recomendación emitida del III Consenso de Maastricht para confirmar erradicación de esta bacteria.

En la evaluación post-tratamiento se presentaron dos casos nuevos en la determinación

del antígeno fecaly ocho casos se mantuvieron positivos en las dos etapas. Según los resultados del análisis de Kappa realizado, esta prueba es la prueba no microbiológica más específica (69.9%) para el diagnóstico de H. pylori tanto antes como después del tratamiento (kappa 0.2005), pero no es la más sensible (50.0%). Al realizar el análisis estadístico por la prueba de X2 de McNemar se obtuvo un valor de p < 0.0001, lo que indica que la diferencia entre la etapa pre y post-tratamiento es significativa, siendo la única prueba con este resultado.

La inmunoglobulina IgA específica a H. pylori constituye el principal anticuerpo

implicado en la respuesta inmune a nivel local, jugando un papel importante como primera línea de defensa contra diferentes antígenos, lo cual provoca la liberación de anticuerpos que permanecen elevados durante dicho daño. La respuesta sistémica (nivel local) suele ser menos marcada que la de los anticuerpos IgG, sin embargo sus niveles en suero parecen indicar un grado más severo de inflamación de la mucosa (Quintana, Chávez, Achí, Davidovich y Schosinsky, 2002; She, Wilson y Litwin, 2009).

En la infección por H. pylori, a consecuencia de la invasión de la mucosa gástrica se

produce una respuesta inmune que implica un equilibrio entre las respuestas celular y humoral. La celular comprende dos mecanismos, la fagocitosis y la apoptosis. La fagocitosis se efectua por los macrófagos que actúan como células presentadoras de antígeno y quienes por no resistir a los factores de virulencia de las bacterias y la presencia de ácido clorhídrico, no pueden realizar la fagocitosis. Esto lleva a la producción de anticuerpos específicos los cuales no son efectivos para controlar la infección bacteriana por no poder atravezar la capa de la mucosa gástrica (Bouquet, 2003).

En la respuesta humoral se producen inmunoglobulinas diversas y que activan mecanismos efectores. La IgA actúa como primera línea de defensa y facilitando la

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fagocitosis, es de gran utilidad en al diagnóstico no invasivo de la infección y se puede detectar en la saliva de los niños. La IgG activa la via clásica del complemento favoreciendo la fagocitosis y la opsonificación, es utilizada en el diagnóstico y seguimiento (Egan, O’morain, 2007).

En este estudio la inmunoglobulina IgA fue la que presentó la mayor positividad en los

pacientes con un 66.3%en la etapa pretratamiento la cual disminuyó a 57.1% post-tratamiento. Al comparar esta prueba con la biopsia, se obtuvo una sensibilidad del 74.2%, siendo la mejor sensibilidad de todas pruebas evaluadas, sin embargo su especificidad fue bastante baja (37.4%) y el índice de Kappa se clasifica como una concordancia pobre (0.1043). Los valores más altos fueron encontrados en 25 pacientes quienes presentaron un diagnóstico de gastritis crónica activa, según resultado de la biopsia realizada en el INCAN, lo cual concuerda con lo reportado en la bibliografía en la que se reporta que estos anticuerpos están elevados en pacientescon enfermedad crónica (Pipili M, Michopoulous S, SotiropolouM, Mpakirtzi T, Grapsa E, 2012).

Se evaluaron también los anticuerpos IgG dirigidos contra el gen cagA asociado a la citotoxina cagA, el cual es el segundo factor de virulencia y de gran importancia desde el punto de vista de epidemiología y patología. Se encontró que en la etapa pre tratamiento el 56.5% de los pacientes presentaron positividad a este anticuerpos la cual disminuyó a 53.12% post-tratamiento, lo cual no es estadísticamente significativa (0.057) según la prueba X2 de McNemar. La sensibilidad de esta prueba fue de 63.6% con una especificidad de 47.5% y una concordancia pobre al compararla con la biopsia (k=0.1038).Se ha demostrado que la seropostividad de IgG cagA es más elevada en pacientes con úlcera duodenal que aquellos que presentan úlceras gástricas, por lo que se tiene que tomar en cuenta la porción del tracto digestivo de la cual se toma la muestra (Tamássy K, Auli P, Fekete B, Antonello C, 1997).

Figueroa reportó una disminución significativa en los niveles de IgG específica para H.

pylori a los 8 y 12 meses de seguimiento, sin embargo en este estudio la reducción no fue significativa probablemente porque únicamente transcurrió un período de cinco meses entre ambas determinaciones.

Sin embargo es importante señalar que estos resultados demuestran que este gen si está presente en las cepas guatemaltecas y que son reconocidos por la población guatemalteca. Además concuerdan con lo reportado por Hernández quien realizó el análisis genético de varios aislamientos guatemaltecos de H. pylori, reportando en el 100% el patrón genético vacA s1/m1, cagA (Hernández, 2002).

Este gen se ha demostrado ser parte de una isla de ADN conocida como Isla de la

patogenicidad (cag IPA), cuyo fenotipo es la proteína denominada CagA, con un peso molecular de 120 a 140 Kda (Mobley, 1996), y tiene la capacidad de aumentar el riesgo de desarrollar gastritis atrófica, enfermedad ulcerosa péptica y de neoplasias gástricas (Blaser & Berg, 2001, Nomura, Pérez-Pérez, Stemmermam, Blaser, 2002).

Por último, se evaluó la respuesta de los anticuerpos IgM, los cualesse elevan en

procesos infecciosos agudos y cuya utilidad diagnóstica parece ser limitada ya que se

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detectan raramente en individuos infectados (She, Wilson y Litwin, 2009).Esta inmunoglobulina se presenta en pacientes con primoinfección, la cual es poco frecuente en los países en desarrollo (Egan, O’morain, 2007). Estos anticuerpos fueron los que menor positividad presentaron en la etapa pretratamiento (42.5%) la que se elevó a 60.3% post-tratamiento.Sin embargo esta variación según la prueba de McNemar no fue significativa (p=0.9999).

Al evaluar esta prueba con la biopsia, se observó una sensibilidad de 48.5%,

especificidad de 62.6% y una concordancia pobre (k=0.1103). Es por esta razón que se demuestra que los análisis serológicos no son suficientes para el diagnóstico de infección por H. pylori y que no sustituyen a la biopsia para el diagnóstico definitivo. Sin embargo, se pueden.utilizar en el seguimiento del tratamiento del paciente (Gerncsér Z, Juhász P, Nemesánszky E, 1992).

A los 178 pacientes se les realizó el cultivo microbiológico a partir del material obtenido de la biopsia gástrica al momento de realizarse la endoscopia. Se lograronobtener 19 cultivos positivos a H. pylori lo que corresponde a un 10.7 % de porcentaje recuperación. Este número es muy inferior al número de pacientes diagnosticados por medio del estudio histopatológico de la biopsia gástrica. Lo anterior obedece a los altos requerimientos de la bacteria para ser recuperada in vitro. Al comparar el cultivo con la biopsia se obtuvo una sensibilidad del 35.4%, y una especificidad del 95.9%, la más alta de todas las pruebas elevadas. Sin embargo su nivel de concordancia es aún muy débil (k=0.3596). Con el fin de optimizar la metodología del cultivo, sobre todo en la obtención de una atmósfera microaerofílica se utilizó Alka Seltzer™. Por estudios realizados se sabe que dicho antiácido colocado en una bolsa plástica pequeña con 15 mL de agua, logra una atmósfera O2, CO2 y N2 similar a la de los sobres comerciales generadores de atmósferas microaerofílica, pero en el presente estudio no se obtuvo este efecto. Fue por esta razón que se utilizaron sobres especiales para favorecer la microaereofilia necesaria para el cultivo in vitro de H. pylori. Otro factor importante que afectó el porcentaje de recuperación fue la contaminación provocada por el misma material de la biopsia gástrica, ya que al atravesar el tracto orofaríngeo pudo adquirir microorganismoscolonizantes de estos lugares, lo que se vio reflejado en el aislamiento de varias bacterias en el cultivo primario. Debido a que este microorganismo es de crecimiento lento, los cultivos fueron incubados durante 7 días y al utilizar medios enriquecidos se favoreció el crecimiento de otras bacterias de rápido crecimiento, que impidieron el crecimiento u ocultaron las colonias de H. pylori (Alarcón,1994; Hernández 2003). Tanto el medio ASC 7.5% con suplemento nutritivo Isovitalex como el agar chocolate demostraron un crecimiento bacteriano similar, pero se recomienda utilizar ASC 7.5% por su facilidad en la preparación del mismo. Por otro lado, el suplemento Isovitalex adicionó al medio los requerimientos nutricionales esenciales para la bacteria pues se sabe que es clasificada como fastidiosa, lo que permitió obtener mayor crecimiento de la misma (Fresnadillo et al, 1997; MacKay 2003).

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El pepsinógeno y gastrina reflejan el estado funcional de la mucosa gástrica y su determinación puede servir como un instrumento de diagnóstico no endoscópico de la gastritis atropica, principalmente porque la mucosa del fondo gástrico cambia a mucosa tipo antral y por lo tanto no secreta pepsinógeno I. Por otro lado, los valores de pepsinógeno II permanecen normales o ligeramente aumentados durante la progresión de una mucosa gástrica normal a una con una atrofia severa. Conforme la gastritis progresa, la inflamación leve produce valores elevados de pepsinógeno I y II en la circulación y las células principales son sustituidas por glándulas pilóricas y la concentración de pepsinógeno II permanece elevada, mientras que la de pepsinógeno I disminuye y por lo tanto el radio PGI/PGII disminuye. Estos marcadores pueden ser utilizados en una población como tamizaje del riesgo de desarrollar cáncer gástrico y como una herramienta para indirectamente medir otros factores importantes en la patogénesis de la ulcera, como lo son la acidez y la pepsina. (Germana, Di Mario, Cavallaro, Moussa, Lecis, Liatoupolou et al, 2005).

Recientemente el gastropanel que incluye pepsinógeno I, pepsinógeno II, gastrina,

anticuerpos IgG e IgA anti H. pylori fue validado para su uso en el tamizaje del cáncer gástrico (Sipponnen, Ranta, Helske, Kaariainen, Maki, Linnala et al., 2002), por tal motivo en este estudio se realizó esta determinación en los pacientes del estudio, positivos a la infección por H. pylori, antes y después de finalizado el tratamiento específico.

En los resultados obtenidos, el 60.6% de los pacientes presentaron un índice

pepsinógeno I/II dentro de los rangos normales, lo cual pudiera considerarse como que los pacientes no presentan todavía un daño en la mucosa gástrica significativo o bien este es muy leve.Los valores normales de este índice pueden indicar también que el paciente sufre de una dispepsia funcional u otra enfermedad que no afecta la mucosa gástrica.

Interesantemente, el porcentaje de pacientes con valores normales en este índice

aumentó a 85.4% al finalizar el tratamiento. En total fueron 33 pacientes los que normalizaron sus valores de pepsinógeno, de ellos 23 presentaron un índice elevado antes del tratamiento y 10 disminuidos, lo cual podría se un indicativo de una mejoría en la mucosa gástrica. Estos resultados también correlacionan con la disminución de la positividad del antígeno fecal, en los pacientes en seguimiento.

Antes de la erradicación se cree que los valores de pepsinógeno pueden estar alterados

por al menos 3 factores: atrofia, inflamación y la infección por H. pylori. Estos son liberados en la sangre principalmente por las células principales en respuesta a la infección por H. pylori, ya sea secretada por las células intactas o bien por las células en destrucción (Knight, Greaves, Wilson, Hengels, Newell, Coelett et al., 1995). Después de la erradicación exitosa, los pepsinógenos ya no se liberan por las celulas en respuesta a la inflamación sino son liberados por las cèlulas al torrente sanguìneo, lo que explica la disminuciòn de ambos que se observa despues de tratamiento. En los casos de atrofia y metaplasia intestinal los cambios persisten asi tambiénel riesgo de la carcinogénesis (Uemura, Mukai, Okamoto, Yamaguchi, Mashiba, Taniyama et al., 1997). En este caso se observó que los valores de pepsinógeno I aumentaron en algunos pacientes después del tratamiento, (6.1% a 22%) lo cual puede ser indicativo que la inflamación aún está presente.

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Aquellos pacientes que persisten con el índice bajo después de la adecuada eliminacion

del H.pylori han presentado valores pre tratamientos bajos de pepsinógeno I y II, una severa gastritis atrofica con una marcada atrofia y metaplasia intestinal y en este grupo se ha reportado que el riesgo de desarrollar cáncer gástrico puede ser muy alto.

En este estudio, los pacientes tratados con éxito presentan un descenso en los valores

séricos de gastrina al evaluarlos cinco meses después de terminado el tratamiento. Por tanto, la erradicación de la infección por H. pylori se asocia a un descenso en los valores basales de gastrina que se produce en el período inmediatamente posterior a la obtención de la erradicación. Se ha descrito que la inflamación de la mucosa inducida por H. pylori es responsable tanto de un incremento en los valores de gastrina, respecto a los que muestran los pacientes no infectados, como de la liberación de mediadores de la respuesta inflamatoria (interleucinas, factor de necrosis tumoral alfa (Moss &Calam, 1992), sustancias que estimularían la función de las células G productoras de gastrina. Así mismo, el descenso de la gastrina podría depender fundamentalmente de la mejoría en la gastritis crónica activa, aunque no hay estudios aún que respalden este hecho. Otros estudios han demostrado que el descenso en los valores de gastrina no tiene una buena relación entre sensibilidad y especificidad a la hora de confirmar la erradicación de la bacteria tras el tratamiento (Bermejo, Boixeda, Gisbertb, Sanza, Defargesa y Álvarez 2000).

Se ha observado que los valores de pepsinógeno I y gastrina disminuyen como una respuesta a la erradicación del H. pylori. En relación a la gastrina se ha observado una disminución tanto de la basal como la después de estimulo, la cual alcanza un pico a los tres meses el cual es mayor a los 6 meses después de tratamiento. Esta disminución es consistente con la idea que la inflamación producida por el H. pylori es la responsable de la elevación de la gastrina, al erradicarse la bacteria estos valores bajan. Este cambio puede ser observado únicamente 6 meses después de la erradicación de la bacteria. No se ha observado una diferencia entre la edad y género de los pacientes (Smith, Pounder, Nwokolo, Lanzon-Miller, Evans, Graham et al., 1990). En este estudio se realizó la determinación de gastrina a los pacientes del estudio en su fase pretratamiento, encontrando que el 95.2% de los pacientes presentaron valores altos de la gastrina lo cual es consistente con la presencia de inflamación por la presencia del H. pylori. En su fase post-tratamiento, no fue posible realizar la determinación a todos los pacientes por falta de reactivo pero a los 13 pacientes que se les realizó demostraron que permanecían con valores alterados, probablemente por que la infección no había sido erradicada. Es importante señalar que el desarrollo de la técnica de la gastrina se encontraron muchos problemas que obligaron ha repetir el proceso de las muestras, entre ellas inestabilidad de los reactivos, falta de reproducibilidad de los resultados lo que ocasionò que el reactivo no alcanzará para el análisis de las muestras, especialmente las del control postratamiento. Es problable que utilizando otro reactivo estos errores puedan minimizarse. Es por ello que no se puede llegar a ninguna conclusión del uso de la gastrina en este estudio.

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Existen muchas variables preanalíticas que afectan la determinación de gastrina, entre ellos el transporte de las muestras, ya que por ser una molécula muy lábil la muestra debe refrigerarse inmediatamente después de haberla obtenido y debe evitarse una descongelación posterior. Otro factor muy importante que producen valores de gastrina falsamente elevados es el consumo de algunos medicamentos, entre ellos los agentes bloqueadores de H2 y los inhibidores de la bomba de protones (omeprazol) (Jensen, Niedeerle, Mitry 2011). Aunque algunos pacientes refirieron no saber qué tipo de tratamiento consumieron, no se puede descartar la posibilidad de que ingirieran dichos medicamentos.

El segundo objetivo de este estudio fue establecer la acción anti- H. pylori de extractos de plantas nativas usadas popularmente en el tratamiento de enfermedades digestivas como una alternativa en el tratamiento de esta infección.

Las plantas que se evaluaron fueron seleccionadas en base a su uso popular para afecciones gastrointestinales, tales como gastritis crónica y colitis. Se evaluó los extractos etanólicos y de ellos nueve fueron obtenidos de la colección de extractos del departamento de Citohistología, y el décimo fue preparado por percolación y concentración en rotavapor. El extracto preparado fue de hojas de T. stans (timboco) el cual presentó un rendimiento de 22.8%, el cual es considerado como bueno ya que permite captar una buena fracción de los metabolitos secundarios responsables de la actividad biológica de la planta. Este rendimiento también representa una ventaja si se analiza el costo-beneficio. Para el bioensayo se utilizó tres aislamientos obtenidos de los cultivos de las biopsias realizadas a los pacientes las que fueron cultivadas también en agar base Columbia, 7.5% de sangre y extracto de planta para obtener una concentración final de 100µg/mL. Inicialmente se usó agar Mueller Hinton con sangre y extracto como recomienda la NCCLS, pero debido a que no se obtuvo el crecimiento esperado ser realizó esta modificación. Es importante señalar que la recomendación de la NCCLS es únicamente para la evaluación de compuestos puros y en ningún momento hace referencia de su uso para extractos de plantas (Documento M100 NCCLS, 2011). Se examinó el efecto de los extractos etanólico sobre el crecimiento de tresaislamientos diferentes de H. pylori, utilizando el sistema experimental de dilución en agar. De los 10 extractos, únicamente dos mostraron una posible actividad anti-H. pylori, siendo ellas B. orellana y L. dulcis. Es importante hacer notar que estas plantas que mostraron actividad no presentaron el mismo comportamiento contra las tres distintos aislmientos utilizados para la evaluación de los extractos. Lo anterior puede deberse a diferencias fenotípicas de los aislamientos, características que pueden ser determinantes de patogenicidad y virulencia de cada uno de ellos pues los pacientes de donde fueron aislados presentaban patologías gástricas distintas como gastritis crónica, gastritis erosiva y ulcera duodenal, de acuerdo al resultado de la biopsia, lo que pudo haber influido en el tipo de cepa de H. pylori. Con el objetivo de utilizar un método comparativo para el cálculo de la concentración mínima inhibitoria (CIM) se tomaron en cuenta las recomendaciones hechas por la NCCLS con las respectivas modificaciones mencionadas anteriormente para el método de dilución

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en agar. Se evidenció que dos extractos presentaron actividad anti-H. pylori, lo cual puede indicar que estos extractos tienen la propiedad de inducir la producción de H2, O2 y NO, lo que crea un ambiente hostil para la bacteria inhibiendo su crecimiento. Por otro lado, los extractos utilizados son ricos en compuestos como flavonoides, taninos y saponinas cuyo mecanismo de acción ejerce un efecto protector contra la mucosa gástrica ya que actúan como antiinflamatorios, antioxidantes, y reducción de la irritación respectivamente (Cáceres 1999; Del Cid et al., 2004; Morton 1981). Interesantemente, la actividad anti-H. pylori fue evidenciadaúnicamente en uno de los aislamientos, el cualse obtuvo de un paciente que nunca había estado expuesto al tratamiento para la erradicación del microorganismo, lo que hace probable que se trate de un aislamientosusceptible por no haber estado expuesto a tratamiento químico o natural. Para la preservación de los aislamientos obtenidos se utilizó el caldo BHI y en leche descremada, pero el crecimiento en la reactivación fue escaso por ello se utilizó el caldo Brucella con 15% de glicerol, por ser el medio más recomendable demostrando resultados muy alentadores para la conservación de la bacteria ya que se obtuvo buen crecimiento en todas las reactivaciones realizadas. Aún no se obtienen suficientes datos sobre las plantas del estudio en otros países, pero durante los últimos 6 años destacan las evaluaciones de especies originarias de Irán, Taiwán, China, Italia, Pakistán, Camerún y México entre otros (Ankli, 2002; Nariman, Eftekhar, Habibi & Falsafi 2004; Wang & Huang 2005; Nostro, Cellini, Di Bartolomoeo, Di Campli, Grande, Cannatelli et al, 2005; Zaidi, 2009; Atapor, 2009; Castillo-Juárez, 2009). La actividad inhibitoria in vitro de 8 plantas resultó negativa probablemente porque los principios activos presentes los extractos, no tienen actividad sobre los diferentes componentes y la estructura de esta bacteria. A pesar que en Guatemala existe una amplia variedad de especies vegetales medicinales y de las cuales un importante porcentaje se utilizan popularmente para el tratamiento de enfermedades gastrointestinales, a la fecha no se habían realizado evaluaciones para la identificación de especies medicinales que pudieran constituir fuentes de nuevos agentes para el combate de la infección de H. pylori, por lo que es necesario continuar investigando sobre la actividad terapéutica que pueden proporcionar.

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PARTE V V. 1 CONCLUSIONES

1. En este estudio se comprobó que la determinación de anticuerpos IgA en conjunto con la detección de antígeno fecal y el índice índice pepI/pepII favorecen el diagnóstico, seguimiento de los pacientes con infección por H. pylori y permiten la demostración de la recuperación de la mucosa gástrica.

2. No fue posible demostrar la utilidad de la gastrina en la evaluación de los pacientes con infección por H. pylori por problemas técnicos del reactivo usado.

3. Se cumplió la hipótesis ya que se encontró acción inhibitoria en dos extractos etanólicos, siendo ellos B. orellana y L. dulcis, los que presentaron una CIM de 100µg/mL.

4. La detección del antígeno fecal es la única prueba de laboratorio que presentó una disminución estadísticamente significativa luego del tratamiento para la infección por H. pylori (p < 0.0001).

5. Los cambios observados en la determinación de anticuerpos (IgA, IgM e IgG cagA) pre y post-tratamiento no fueron estadísticamente significativos.

6. El número de pacientes asintomáticos se incrementó de 1.11% a 30.99 % lo pudiera sugerir un tratamiento exitoso, por lo menos en lo que se refiere al alivio de los síntomas dispépticos.

7. El 56.5% de los pacientes presentaron anticuerpos IgG específicos contra el antígeno cagA, lo cual demuestran que este gen si está presente en las cepas guatemaltecas y que son reconocidos por la población guatemalteca.

8. Los extractos etanólicos de B. orellana y L. dulcis demostraron una actividad inhibitoria del crecimiento de los tres aislamientos clínicos de H. pylori evaluados.

9. La determinación de anticuerpos IgA fue la prueba con mayor sensibilidad (74.2%). 10. El cultivo fue la prueba que presentó el valor de especificidad más alto (95.9%)

pero tiene muy mala sensibilidad (35.4%). 11. Se encontró una concordancia muy pobre entre todas las pruebas evaluadas. 12. Los valores de pepsinógeno I fueron los que demostraron un mayor cambio post-

tratamiento. 13. El porcentaje de pacientes con pepsinógeno I e índice pepI/pepII disminuido fue

menor en el control post-tratamiento indicando una recuperación de la inflamación de la mucosa gástrica.

14. El 95.2% de los pacientes presentaron valores de gastrina mayores del rango normal, lo cual ha coincide con la presencia de la inflamación de la mucosa debido a la infección por H. pylori, sin embargo no se pudo realizar el control post-tratamiento.

15. La prueba de gastrina utilizada en este estudio presentó muchos problemas técnicos, entre ellos poca reproducibilidad, inestabilidad de los reactivos, lo que dificultó su uso.

16. La detección del antígeno fecal es la única prueba de laboratorio que presentó una disminución estadísticamente significativa luego del tratamiento para la infección por H. pylori (p<0.0001).

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17. Los cambios observados en la determinación de anticuerpos (IgA, IgM e IgG cagA) pre y post-tratamiento no fueron estadísticamente significativos.

18. Se estableció y validó las condiciones para el cultivo y reactivación de los aislamientos de H. pylori.

19. Se logró aislar doce aislamientos de H. pylori los que se encuentran almacenados a -80°C.

20. Las mejores condiciones de preservación de los aislamientos de H. pylori se lograron utilizando caldo Brucella con 15% de glicerol.

21. Se demostró actividad en el extracto de B. orellana y de L. dulcis contra el aislamiento I-0211164. El análisis de los resultados se hizo por medio de la prueba de hipótesis binomial, mostrando una actividad anti-H. pylori significativa (p<0.05).

22. Se estableció y validó el bioensayo para el tamizaje de la acción anti-H. pylori de especies de plantas nativas.

23. La concentración inhibitoria mínima de los extractos etanólicos de B. orellana y L. dulcis es de 100µg/mL.

24. En la presente investigación y el Seminario de investigación I se generó información de 20 extractos vegetales, de los cuales 6 (30%) presentaron actividad a la concentración de tamizaje (100µg/mL).

25. Se concluye que la determinación de anticuerpos IgA en conjunto con la detección de antígeno fecal y el índice índice pepI/pepII favorecen el diagnóstico, seguimiento de los pacientes con infección por H. pylori y permiten la demostración de la recuperación de la mucosa gástrica.

26. Se encontró actividad inhibitoria contra H. pylori en los extractos etanólicos de B. orellana y L. dulcis a un CIM de 100µg/mL.

27. Se generó información de 20 extractos vegetales, de los cuales 6 (30%) presentaron actividad a la concentración de tamizaje (100µg/mL).

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V. 2 RECOMENDACIONES

1. Utilizar la prueba de detección de antigeno fecal para el diagnóstico y evaluación post-tratamiento de la infección por H. pylori.

2. Evaluar la utilidad diagnóstica de las pruebas evaluadas en este estudio comparándolas con métodos más sensibles y específicos como la detección de PCR de la biopsia o del jugo gástrico.

3. Evaluar el efecto in vivo de las infusiones acuosas de las plantas que evidenciaron actividad anti-H. pylori en pacientes que no han recibido tratamiento convencional.

4. Utilizar la prueba de anticuerpos IgA en conjunto con la detección del antígeno fecal para el diagnóstico y seguimiento de los pacientes con infección por H. pylori.

5. Realizar estudios que permitan aumentar la sensibilidad del cultivo y aumentar el porcentaje de recuperación de la bacteria.

6. Utilizar el índice pepI/pepII como un indicador de la recuperación de la mucosa gástrica.

7. Realizar otro estudio similar con un reactivo más estable para la medición de la gastrina.

8. Realizar un seguimiento por más tiempo a los pacientes del presente estudio con los valores de pepsinógeno I, II y gastrina a fin de evaluar el riesgo de cáncer gástrico.

9. Utilizar la prueba de detección de antígeno fecal en conjunto con la determinación de anticuerpos IgA específicos para el diagnóstico y seguimiento de la infección de H. pylori.

10. Realizar estudios de cultivo microbiológico con las condiciones establecidas en este estudio con biopsias gástricas de pacientes con reincidencia de infección.

11. Realizar pruebas de susceptibilidad a los antibióticos utilizados actualmente con los aislamientos que se obtuvieron en el presente estudio.

12. Caracterizar geneticamente los aislamientos obtenidos y asociar las caracteristicas al daño producido por cada uno.

13. Continuar con la búsqueda de actividad bactericida contra H. pylori con otras plantas de uso popular y nativas de Guatemala utilizando las condiciones establecidas y validadas en este estudio.

14. La concentración inhibitoria mínima de los extractos etanólicos de B. orellana y L. dulcis es de 100µg/mL.

15. En la presente investigación y el Seminario de investigación I se generó información de 20 extractos vegetales, de los cuales 6 (30%) presentaron actividad a la concentración de tamizaje (100µg/mL).

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V. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Afre, J. (2004). Prevalencia de anticuerpo séricos contra Helicobacter pylori en niños de 3 a 10 años de baja condición socioeconómica. Universidad de San Carlos de Guatemala (Tesis de Graduación, Facultad de Ciencias Médicas). Guatemala. 40 pp.

Alarcón, T. (1994). Diagnóstico Microbiológico de la infección por Helicobacter pylori. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.12(1) 23-27.

Ali, S. M., Khan, A. A., Ahmed, I., Musaddiq, M., Ahmed, K. S., Polasa, H. et al. (2005). Antimicrobial activities of eugenol and cinnamaldehyde against the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 4, 20 (1-7).

Alonzo, L., Arroyo, G., Benito, M., Duarte, A., Matta, V., Nave, F. et al. (2009). Asociación entre la presencia de Helicobacter pylori y patologías gástricas detectadas por endoscopias. Revista Científica. Fac. CCQQ y Farmacia. 14, 34-40.

Ankli, A. (2002). Yucatec Mayan medicinal plants: evaluation basedon indigenous uses. Journal of Ethnopharmacology. 79, 43-52.

Annuk, H., Hirmo, S., Türi, E., Mikelsaar, M., Arak, E., & Wadström, T. (1999). Effect of cell surface hydrophobicity and susceptibiity of Helicobacter pylori to medicinal plant extracts. Federation European of Microbiological Societies Microbiology Letters, 172, 41-45.

Asaka M, Kimura T, Kudo M, Takeda H, Mitani H, Miyazaki T, et al (1992). Relationship of Helicobacter pylori to serum pepsinogens in asymptomatic Japanese population. Gastroenterology. 102 (3):760-766.

Atapor M (2009). In vitro susceptibility of the Gram negativebacteriumHelicobacter pylori extracts of Iranian medicinalplants. Pharmaceutical Biology 47, 77-80.

Barabino, A. (2002). Helicobacter pylori-Related Iron deficiency anemia: A Review. Helicobacter 7, 71-75.

BermejoF, Boixeda D, Gisbert JP, Sanz JM, Defarges V, Alvarez-Calatayud G et. al. (2001) Concentraciones basales de gastrina y pepsinógeno I y II en la úlcera gástrica: influencia de la infección por Helicobacter pylori y utilidad en el control de la erradicación. Gastroenterologia y Hepatología 24(2)56-62

Bravo LE, Cortéz A, Carrascosa E, Correa P, Ordoñez N (2000). Seroprevalencia de anticuerpos anti-Helicobacter pylori en donantes de sangre de regiones colombianas con diferencias en la mortalidad por cáncer gástrico. Revista Colombia Médica 31(3) 122-130.

Bouquet P (2003). Gastric cell apoptosis and Helicobacster pylori has the main function of Vac A finally been identified. Trends of Microbiology. 11(9): 410.3

Cabrera L, Casia A, Godinez C, Martinez E, Matta V, Nave F et al (2008). Seroprevalencia de anticuerpos anti-H. pylori en pacientes que acuden para su diagnóstico a los laboratorios clínicos de la ciudad capital. Informe final. Fac. CCQQ y Farmacia.

Cáceres, A. (1999) Plantas de Uso Medicinal en Guatemala. Guatemala. Editorial Universitaria, USAC. 402p.

Calvet X, Quezada M, Sanfelius I, Monserrat E, Brullet E, Real J et al (2003). Evaluación de un test rápido (Inmunocard Stat HpSA para la detección de Helicobacter pylori en heces. Gastroenterology and hepatology. 26(9).531-4.

112

Castillo-Juárez, I., Rivero-Cruz, F., Celis, H.& Romero, I. (2007). Anti-Helicobacter pylori activity of anacardic acids from Amphiptery giumadstringens. Journal of Ethnopharmacology114, 72-77

Castillo-Juárez, I. (2009). Anti-Helicobacter pylori activity of plants used in Mexican traditional medicine for gastrointestinal disorders. Journal of Ethnopharmacology 122, 402-405.

Castro Fernández M y Vargas Romero J (2009). Infección por Helicobacter pylori. Prevalencia, investigación y repercusión de la resistencia antibiótica.Revista Española de Enfermedades Digestivas101 (11).

Cave, D.R. (1997). Epidemiology and transmission of Helicobacter pylori infection. HowisHelicobacer pylori transmitted?. Gastroenterology, 113, 9-14.

Cogo LL, Bastos Monteiro CL, Miguel MD, Miguel OG, Machado Cunico M et al (2010). Anti-Helicobacter pylori activity of plant extracts traditionally used for the treatment of gastrointestinal disorders. Brazilian Journal of Microbiology. 41(2) 304-309.

Cordero J, Cruz V, Gómez M, Hermosilla V, Matta V, Nave F et al, 2008 (2008). Seroprevalencia de anticuerpos anti-Helicobacter pylori en pacientes que acuden a los laboratorios clínicos de los hospitales nacionales de la ciudad capital. Informe Final Curso de Investigación. Fac. CCQQ y Farmacia.

Coronado, C., Garrido, B., Hernández, A., Ortiz, N., Ramírez, J., Velásquez, D et al(2008). Frecuencia de positividad del antígeno de Helicobacter pylori en pacientes que acuden para su diagnóstico a los laboratorios clínicos del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social zona 5, zona 6 y zona 9 de la ciudad capital. Informe Final, Curso Investigación Fac. CCQQ y Farmacia.

Correa P & Piazuelo M (2008). Natural history of Helicobacter pylori infection. Digestive and Liver Diseases. 40(7) 490-6.

Cruz N, Hornquist N, Maldonado E, Morales O, Román A, Rojas Cet al(2008). Seroprevalencia de anticuerpos IgG e IgM anti-Helicobacter pylori en niños comprendidos entre las edades de 5-10 años que asisten a dos centros educativos de la ciudad capital de Guatemala. Informe final Curso de Investigación .Fac. CCQQ y Farmacia.

Daugherty DF, Beardshall K, Swift I et al. Antral Helicobacter pylori, hypergastrinaemia and duodenal ulcers:effect of eradicating the organisms. British Medical Journal 1989:299:1504-5.

De, R., Kundu, P., Swarnakar, S., Ramamurthy, T., Chowdhury, A., Balakrish, G., & Mukhopadhyay, A. K. (2009). Antimicrobial activity of curcumin against Helicobacter pylori isolates from India and during infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53, 1592-1597.

Del Cid NE (2004). Tamizaje de la actividad antimicrobiana de 37 especies vegetales en el tratamiento de infecciones en Guatemala. XIII Congreso Italo-Latinoamericano de Etnomedicina. Revista Cubana de Plantas Medicinales10 (5), 405.

De Leo, M., de Tommasi, N., Sanogo, R., d’Angelo, V., Germanò, M. P., Bisignano, G., & Branca, A. (2006). Triterpenoid saponins from Pteleopsis suberosa stem bark. Phytochemistry, 67, 2623-2629.

Dowsett SA, Archila L, Segreto VA, Gonzalez CR, Silva A, Vastola A, et al(1999). Helicobacter pylori infection in indigenous families of Central America: serostatus and oral and fingernail carriage. Journal of Clinical Microbiology, 37, 2456-2460.

113

Dunn, B., Cohen, H.,& Blaser, M. (1997). Helicobacter pylori. Clinical Microbiology Review10 ,720-741.

Eurogast Study Group (1994). An international association between Helicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet, 341,1359-62.

Figueroa G, Troncoso M, Toledo MS y Acuña R(2000).Aplicación de la serología para confirmar la erradicación de Helicobacter pylori en pacientes con úlcera péptica. Revista Médica de Chile, 128, 10

Fresnadillo, MJ, Rodríguez M, Blázquez AM, García E, García JE, Trujillano I et al. (1997). Comparative evaluation of selective and nonselective media for primary isolation of Helicobacter pylori from gastric biopsies. Helicobacter, 2,36-39.

Fukai, T., Marumko, A., Kaitou, K., Kanda, T., Terada, S., & Nomura, T. (2002). Anti-Helicobacter pylori flavonoids from licorice extract. Life Sciences, 71, 1449-1463.

García, C.M. (1999). Epidemiologia de H. pylori en un grupo de pacientes del Seguro Social de Guatemala. Comparación de cepas por técnicas moleculares. Guatemala. Universidad de San Carlos de Guatemala (Tesis de Graduación, Fac. CCQQ y Farmacia).82 pp.

Gaus, K., Huang, Y., Israel, D. A., Pendland, S. L., Adeniyi, B. A., & Mahady, G. B. (2009). Standardized ginger (Zingiber officinale) extract reduces bacterial load and suppresses acute and chronic inflammatory in Mongolian gerbils infected with cagA+ Helicobacter pylori. Pharmaceutical Biology, 47, 92-98.

Germana B, Di Mario F, Cavallaro LG, Moussa A, Lecis P, Liatoupolou S et al (2005). Clinical usefulness of serum pepsinogens I and II, gastrina-17 and anti-Helicobacter pylori antibodies in the management of dyspeptic patients in primary care. Digestive Liver diseases. 2005, 37: 501-8.

Gerncsér Z, Juhász P, Nemesánszky E. (1992). Clinical significance of serological markers of Helicobacter pylori. Orvosi. Hetilap. 133: 1877-81.

Gisbert JP, Boixeda D, Vila T, Rafael L de, Alvarez Baleriola I et al. (1995). ¿Es útil la determinación de las concentraciones basales de pepsinógeno II sérico para comprobar la erradicación de Helicobacter pylori con el tratamiento. Medicina clínica 105 (15), 561-565.

Gisbert JP, Cruzado AI, Cabrera MM, Carpio D, Benito LM, Pérez Poveda JJ et al (2000). Serología «rápida» para el diagnóstico de infección por H. pylori. Estudio de su validez frente a un patrón de referencia y de su concordancia con la serología «clásica» Gastroenterology and Hepatology, 23(4)159-64.

Goldschmiedt M, Barnett CC, Schawarsz BE, Karnes WE, Redfern JS, Feldman M (1991).Effect of age on gastric acid secretion and serum gastrin concentration in healthy men and women.Gastroenterology;101:977-90.

Gomez M, Otero W, Gutiérrez O (2007). Tratamiento de la Infección por Helicobacter pylori. Encuesta en un grupo de médicos generales y especialistas en Colombia.Revista Colombiana de Gastroenterologìa. 22(1)7-16.

Goowich, S.C (1993). Microbiology of Helicobacter pilory. Gastroenterology Clinics of North America, 22.5-19.

Gotteland, M., Andrews, M., Toledo, M., Muñoz, L., Caceres, P., Anziani, A. et al., (2008). Modulation of Helicobacter pylori colonization with cranberry juice and Lactobacillus johnsonii La1 in children. Nutrition, 24, 421-426.

Graham, D.Y. (1994). Evolution of concepts regarding Helicobacter pylori: from a cause gastritis to a public health problem. American Journal of Gastroenterology, 89,469-72.

114

Gutiérrez O, Otero W, Cardona H, Quintero F, Orozco C, Sanchez L (2003). Terapia cuádruple con furazolidona como tratamiento de rescate para la infección por Helicobacter vpylori. Revista Colombiana de Gastroenterologia 18 (4) 222-227.

Hernández, C.F.& Rivera, P. (2003). Experiencia en el cultivo de bacterias microaerofílicas: Helicobacter. Publicación No 06. Disponible desde internet en: http://www.ucr.ac.cr/gacetapc/Helicobacter.cultivo.html

Hernández, R.D. (2002). Detección de los genes de virulencia de cepas de Helicobacter pylori en biopsias de pacientes con cáncer gástrico. Guatemala. Universidad de San Carlos de Guatemala (Tesis de Graduación, Fac. CCQQ y Farmacia). 82 pp

Hernández I, Herrera M, Mazariegos C, Ovalle A, Pérez A, Quiróz M et al(2008). Frecuencia de la positividad del antígeno de Helicobacter pylori en heces de pacientes que acudieron a laboratorios clínicos privados de la ciudad de Guatemala, durante el período de enero del 2005 al 2008. Informe final Curso de Investigación. Fac. CCQQ y Farmacia.

Hernández M. (2001). Helicobacter pylori. La bacteria que más infecta al ser humano. Revista Cubana de Alimentación y Nutrición, 15, 42-54.

Hernández CF y Rivera P (2003). Experiencia en el Cultivo de Bacterias Microaerofílicas: Helicobacter. Publicación No 06. Disponible desde internet en: http://www.ucr.ac.cr/gacetapc/Helicobacter.cultivo.html

Hunt H, Xiao D, Megraud F, Leon-Barua L, Bazzoli B, Van der Merwe S, Vaz Coelho G et al (2006). Helicobacter pylori en developing countries.World Gastroenterology Organization.September.2-14pp.

International Agency for Research on Cancer. (1994). Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. Lyon: Journal of Assisted Reproduccion and Genetics 61:177-241.

Jensen RT, Niederle B, Mitry E. (2006). Gastrinoma (duodenal and pancreatic). Neuroendocrinology 84(3):173-82.

Jonkers, D., van den Broeck, E., van Dooren, I., Dorant, T. E., Hageman, G., & Stobberingh, E. (1999). Antibacterial effect of garlic and omeprazole on Helicobacter pylori. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 43, 837-839.

Khandaker MAK, Scott A, Eastwood MA, Palmer KR (1991). Do teeth predispone to duodenal ulcer relapse? Gut. 32:A1207.

Lange, K., Matta, V., Nave, F., Alvarado, V., Camó, M., Donis, E. et al.(2011). Frecuencia de anticuerpos IgM e IgG anti-Helicobacter pylori en estudiantes, personal docente y administrativo de la Fac. de CCQQ y Farmacia. Revista Científica, Fac. CCQQ y Farmacia. 20., 96-101.

Levi S, Beardshall K, Swift I., Foulkes W, Playford R, Ghosh P, Calam J (1989). Antral Helicobacter pylori, hypergastrinaemia and duodenal ulcers:effect of eradicating the organisms. British Medical Journal: 299:1504-5.

Lind T, Veldhuyzen van Zanten S, Unge P, Spiller R, Batyerdoerffer E, O'Morain C, et al. (1996). Erradication of Helicobacter pylori using one-week triple therapies combining omeprazole with two antimicrobials: the MACH I Study. Helicobacter 1:138-44.

Knight T, Greaves S, Wilson A, Hengels K, Newell D, Coelett M et al (1995). Variability in serum pepsinogen levels in an asymptomatic population. European Journal of Gastroenterology and Hepatology7:647-654

115

Kobayashi I, Murakami K, Kato M, Kato S, Azuma T, Takahashi S, et al. (2007). Changing antimicrobial susceptibility epidemiology of Helicobacter pylori strains in Japan between 2002 and 2005. Journal of Clinical Microbiology; 45: 4006-10.

Kuster, J., Vliet, A., & Kulper, E. (2006). Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clinical Microbiology Reviews 19, 449-490

MacKay, W.G. (2003). Culturing Helicobacter pylori from clinical specimens: review of microbiologic methods.Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutriology.36,616-622.

Malaty H & Nyren O. (2003). Epidemiology of Helicobacter pylori infection. Helicobacter. 8(suppl 1): 8-12.

Malfertheiner P, Megraud F, O’Morain C, Bazzoli F, El-Omar E, Graham D et al., (2007). Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection. The Maastricht 2-2000 Consensus Report. Gut 56:772-78.

Martini, S., D’Addario, C., Colacevich, A., Focardi, S., Borghini, F., Santucci, A., et al. (2009). Antimicrobial activity against Helicobacter pylori strains and antioxidant properties of blackberry leaves (Rubus ulmifolius) and isolated compounds. International Journal of Antimicrobial Agents, 34, 50-59.

McFaddin, J (1993), editores. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Mexico. Editorial Médica Panamericana, 1993: 39,154,183.

McNulty, C. A. M., Wilson, M. P., Havinga, W., Johnston, B., O’Gara, DE. A., & Maslin, D. J. (2001). A pilot study to determine the effectiveness of garlic oil capsules in the treatment of dyspeptic patients with Helicobacter pylori. Helicobacter, 6, 249-253.

Miki K, Ichinose M, Ishikawa KB, Yahagi N, Matsuhima M, Kakei N (1993). Clinical application of serum pepsinogen I and II levels for mass screening to detect gastric cancer. Japanese Journal of Cancer Research, 10:1086-1090.

Mitchel HM, Bohane TD, TobiasV, Bullpitt P, DaskalopoulosG, Carrick J et al (1993). Helicobacter pylori infection in children: potencial clues to pathogenesis. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutriology.16,120-125.

Morães, T. M., Rodrigues, C. M., Kushima, H., Bauab, T. M., Villegas, W., Pellizzon, C. H., et al. (2008). Hancornia speciosa: Indications of gastroprotective, healing and anti-Helicobacter pylori actions. Journal of Ethnopharmacology, 120, 161-168.

Moleiro, F. C., Andreo, M.A., dos Santos, R. C., Moraes, T. M., Rodrigues, C. M., de Andrade Carli, C. B., et al. (2009). Mouriri elliptica: Validation of gastroprotective, healing and anti-Helicobacter pylori effects. Journal of Ethnopharmacology,123, 359.368.

Moreira, J. (1998). Prevalencia de Helicobacter pylori en pacientes con enfermedad gástrica. Guatemala. Universidad de San Carlos de Guatemala. (Tesis de Graduación, Facultad de Medicina).Guatemala.

Morton, J. (1981). Atlas of Medicinal Plants of Middle America, Bahamas to Yucatán.Springfield: Charles C Thomas, Illinois, EEUU, 1419.

Moss, S. & Calam, J. (1992) Helicobacter pylori and peptic ulcers: the present position. Gastroenterology Clinics of North America 21: 803-815.

Mossi S, Meyer-Wyss B, Renner EL, Merki HS, Gamboni GC, Beglinger C. (1993).Influence of Helicobacter pylori, sex and age on serum gastrin and pepsinogen concentration in subjects without symptoms and patients with duodenal ulcers. Gut 34.752-756.

116

Muñoz, C, Jané M, González A, JuncosaT, Gené A, Varea Vet al. (1999). Evaluación de una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) rápida y sencilla para el diagnóstico de la infección por Helicobacter pylori. Enfermedades Infecciosas y. Microbiología Clinica. 17, 119-125.

Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Tsaller M. (2004). Campylobacter y Helicobacter. 4ed. Madrid: Mosby. 289-90.

Naito Y, Ito M, Watanabe T, Suzuki H (2005). Biomarkes in patients with gastric inflamation: a systematic review. Digestion:72:164-80.

Nariman, F., Eftekhar, F., Habibi, Z. & Falsafi, T. (2004). Anti-Helicobacter pylori activities of six Iranian plants. Helicobacter.9,146-151.

NIH Consensus Conference (1994).Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. NHI Consensus Development Panel on Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. The Journal of the American Medical Association, 272:65-69.

NdipR., MalangeTarkangAE, MbullahSM, LumaHN, MalongueA,NdipLM et al (2007). In vitro anti-Helicobacterpylori activity of extracts of selected medicinal plants from North WestCameroon.Journal of Ethnopharmacology 114, 452-457.

Nolan KE (1958). Serum pepsinogen levels: relation to gastric secretion and gastric biopsy. Medical Journal of Australia. 2:831-833.

Nomura AMY, Pérez-Pérez GI, Lee J, Stemmermann MJ, Blaser MJ (2002). Relationship between H. pylori cagA status and risk of peptic ulcer disease. American Journal of Epidemiology. 155:1054-9.

Nostro A, Cellini L, Di Bartolomoeo S, Di Campli E, Grande R, Cannatelli MA et al (2005). Antibacterial effect of plant extracts against Helicobacter pylori. Phytotherapy Research. 19 (3) 173–262.

Ohno T, Kita M, Yamaoka Y, Imamura S, Yamamoto T, Mitsufuji S et al (2003). Antimicrobial Activity of Essential Oils against Helicobacter pylori. Helicobacter. 8(3) 207-215.

Olivares, D. & Gisbert, J. (2006). Factores implicados en la patogenia de la infección por Helicobacter pylori. Revista Españolade Enfermades Digestivas 98,374-386.

Oliveros R, Albis R, Ceballos J, Ospina J, Villamizar J, Escobar J et al (2003). Evaluación de la concentración sérica de pepsinógeno como método de tamizaje para gastritis atrófica y cáncer gástrico. Revista Colombiana de Gastroenterología 18, 73-77.

Oregel, S. (2002). Prevalencia de anticuerpos séricos contra Helicobacter pylori en niños menores de 3 años de baja condición socioeconómica. Universidad de San Carlos de Guatemala (Tesis de Graduación, Facultad de Ciencias Médicas). Guatemala, 62pp.

Orozco, M., Posada, L., Robles, A., De Leon, J., Lange, K. & Matta, V. (2010). Detección de anticuerpos IgG contra Helicobacter pylori en personas a riesgo. Revista Cientifica Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC. 21:2. 49-55.

Quilez A, Berenguer B, Gilardoni G, Souccar C, de Mendonça S, Oliveira LFS et al (2010). Anti-secretory, anti-inflammatory and anti-Helicobacter pylori activities of several fractions isolated from Piper carpunya Ruiz & Pav. Journal of Ethnopharmacology. 141(2) 547-760.

Quintana-Guzmán E, Salas-Chávez P, Achí-Araya R, Davidovich-Rose, H y Schosinsky K (2002). Valor diagnóstico de anticuerpos anti Helicobacter pylori en pacientes referidos al Servicio de Endoscopia Digestiva del Hospital San Vicente de Paul, Costa Rica. Revista Biomedicina. 13:15-23.

117

Páez Valery M., Barón MA, Solano L, Nadaff G, Boccio J y Barrado A (2006). Infección por Helicobacter pylori (13C-UBT) y factores nutricionales y socioeconómicos asociados en escolares de estratos bajos de la ciudad de Valencia, Venezuela. Archivos Latinoamericanos de Nutrición 56,4.

Park, B.-S., Lee, H.-K., Lee, S.-E., Piao, X.-L., Takeoka. G. R.,Wong, R. Y., et al. (2006). Antibacterial activity of Tabebuia impetiginosa Martius ex DC (Taheebo) against Helicobacter pylori. Journal of Ethnopharmacology, 105, 255-262.

Pellicano R, Smedile A, Ponzetto A, Berruti M, Astegiano M (2005). How accurate is the culture of Helicobacter pylori in a clinical setting? An appraisal. Panminerva Medica. 47, 191–194.

Pérez-Pérez, G.I..Rothenbacher. D., Brenner, H. (2004). Epidemiology of Helicobacter pylori Infection. Helicobacter 9. Supplement 1. 1-6 pp.

Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 16TH International Supplement Clinical and Laboratory.Standards Institute NC-S16. Documento M100-S15-CLSI-NCCLS, 31:Número 2,011.

Pipili M, Michopoulous S, Sotiropolou M, Mpakirtzi T, Grapsa E.(2012). Is there any association between IgA Nephropathy, Crohn’s Disease, and Helicobacter pylori infection? Ren Fail. 34:506-9.SalgueiroJ, Zubillaga M, Goldman C, Barrado A, Martínez Sarrasague M, Leonardi N et al (2004). Review article: is there a link between micronutrient malnutrition and Helicobacter pylori infection?. Alimentary Pharmacology and Therapeutics 20 (10), 1029-1034.

She R, Wilson A & Litwin C (2009). Evaluation of Helicobacter pylori Immunoglobulin G (IgG), IgA, and IgM Serologic Testing Compared to Stool Antigen Testing. Clinical and Vaccine Inmunology. 16(8).1253-1255.

Rüegg, T., Calderón, A. I., Queiroz, E. F., Solís, P. N., Marston, A., Rivas, F., et al (2006). 3.farmesyl-2-hydroxybenzoic acid is a new anti-Helicobacter pylori compound from Piper multiplinervium. Journal of Ethnopharmacology, 103, 461-467.

Salem, E. M., Yar, T., Bamosa, A. O., Al-Quorain, A., Yasawy, M. I., Alsulalman, R. M., & Randhawa, M. A. (2010). Comparative study of Nigella sativa and triple therapy in eradication of Helicobacter pylori in patients with non-ulcer dispepsia. Saudi Journal of Gastroenterology, 16, 207-214.

Sanjurjo JL, Pérez Manauta J, Hidalgo H, Geyene A. (1999). Eficacia y seguridad entre diferentes dosis de nitazoxanida + subcitrato de bismuto + lansoprazol para la erradicación de Helicobacter pylori. Efficacy and safety amongst different doses of nitazoxanide + bismut subcitrate + lansoprazol to eradicate Helicobacter pylori. Revista Médica General Méxica. 62(3):172-5.

Serrano C, González C, Rollan A, Duarte I, Torres J et al (2008). Lack of Diagnostic Utility of Specific Immunoglobulin M in Helicobacter pylori Infection in Children. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 47(5) 612-617.

She, R., Wilson, A. & Litwin, C. (2009). Evaluation of Helicobacter pylori Immunoglobulin G (IgG), IgA, and IgM serologic testing compared to stool antigen testing. Clinical and Vaccine Immunology. 16, 8.

Smith JTL, Pounder RE, Nwokolo CU, Lanzon-Miller S, Evans DG, Graham DY et al. (1990). Inappropiate hypergastrinaemia in asymptomatic healthy subjects infected with Helicobacter pylori. Gut, 31:522-5).

118

Sipponnen P, Ranta P, Helske T, Kaariainen I, Maki T,Linnala A, et al (2002). Serum levels of amidated gastrin-17 and pepsinogen I and atrophic gastritis: an observational case-control study. Scandinavian Journal of Gastroenterology 37:785-791.

Souza, M. C., Beserra, A. M. S., Martins, D. C., Villa Real, V., Nunes dos Santos, R. A., Rao, V. S., et al. (2009). In vitro and in vivo anti-Helicobacter pylori of Calophyllum brasiliense Camb. Journal of Ethnopharmacology, 123, 452-458.

Stamatis, G., Kyriazopolous, P., Golegou, S., Basayiannis, A., Skaltsas, S., & Skaltsa, H. (2003). In vitro anti-Helicobacter pylori activity of Greek herbal medicines. Journal of Ethnopharmacology, 88, 175-179.

Tamássy K, Auli P, Fekete B, Antonello C, (1997). Immune responses of IgG, IgA, and anti-cagA IgG to Helicobacter pylori in dyspeptic and peptic ulcer patients. Orvosi Hetilap. 138: 985-8.

Tanaka, N., Kashiwada, Y., Nakano, T., Shibata, H., Higuchi, T., Sekiya, M., et al. (2009). Chromone and chromanone glucosides from Hypericum sikokumontanum and their anti-Helicobacter pylori activity. Phytochemistry, 70, 141-146.

The European Helicobacter pylori Study Group (EHPSG). (1997). Current European concepts in the management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht Consensus Report. Gut. 41: 8-13

Thomas, J.E. (1994). Epidemiología de las infecciones por Helicobacter pylori. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clinica. 12(suppl, 1P). 6-13.

Uemura N, Mukai T, Okamoto S, Yamaguchi S, Mashiba H, Taniyama K et al (1997). Effect of Helicobacter pylori erradication on subsequent development of cancer after endoscopic resection or early gastric cancer. Cancer Epidemiology Biomarkers Prevention. 6:639-642.

Vale FF, Vítor JMB (2010). Transmission pathway of Helicobacter pylori: Does food play a role in rural and urban areas?. International Journal of Food Microbiology. 138:1:1-12.

Valle Muñoz J,Artaza Varasa T, López Pardo R, Rodríguez Merlo R, Pérez Grueso MJ, Escobedo R et al (2007). Diagnóstico serológico de gastritis atrófica con una combinación del pepsinógeno I y II, gastrina-17 y anticuerpos anti-Helicobacter pylori. Gastroenterology and Hepatology.30:10:5467-71.

Velasco, C. (2007). Serologic diagnosis of Helicobacter pylori in endoscopypersonnel.: serology in endoscopists. Revista Española de Enfermedades Digestivas. 99, 88-93.

Wang, Y.C. & Huang, T.L. (2005). Screening of anti-Helicobacter pylori herbs deriving from Taiwanese folk medicinal plants.FEMS Immunology and Medical Microbiology 43,295-300.

Wyatt JI, Rathbone BJ, Green DM, Primrose J (1989). Raised fasting serum gastrin in chronic gastritis independent of Campylobacter pylori status and duodenal ulceration. Gut; 30:A1483).

Yanaka, A., Fahey, J. W., Fukumoto, A., Nakayama, M., Inoue, S., Zhang, S., et al (2009). Dietary sulforaphane-rich broccoli sprouts reduce colonization and attenuate gastritis in Helicobacter pylori-infected mice and humans. Cancer Prevention Research, 2, 353-360.

Zaidi, S.F. (2009). Bactericidal activity of medicinal plants, employed for treatment of gastrointestinal ailments, against Helicobacter pylori. Journal of Ethnopharmacology 121, 286-291.

119

Zapatier J, Gómez NA, Vargas PE & Maya SV (2007). Valoración de la serología como método diagnóstico de Helicobacter pylori en la población local de la ciudad de Guayaquil Acta Gastroenterológica Latinoamericana 37, 104-109

120

V.4 ANEXO 1

FICHA EPIDEMIOLÓGICA: INFECCIÒN POR Helicobacter pylori

Código: _____________ Fecha de la entrevista: _____/ _____ / ______ I. DATOS GENERALES _______________________________________________________________ Primer apellido Segundo apellido Apellido de casada ____________________________________ Género: F ( ) M ( ) Nombres Edad (años): <18: __ 20-25: __ 26-30: __ 31-35: __ 36-40: __ 41-45: __ 46-50: _>51__ Dirección residencia______________________________________________ Dirección trabajo________________________________________________ Teléfono (residencia): ______________ Teléfono oficina: ________________ Teléfono celular: ________________ Correo electrónico: _______________________ Estado civil: soltero(a) ___ casado (a) ____ unido (a) ____ ¿Cuál es el último grado o nivel escolar que Ud. ha completado? □ No he completado ningún grado o nivel escolar □ Primaria □ Secundaria □ Superior universitario □ Postgrado universitario ¿Cuál es su ocupación? □ Profesional independiente

□ Comerciante

121

□ Empleado □ Ama de casa

□ Estudiante □ Desempleado

II. INFECCIÓN POR Helicobacter pylori 1) ¿Ha tomado algún antibiótico en los últimos dos meses? Sí _____ No _____ Si la respuesta es SI, nocontinuar. 2) ¿Ha presentado usted alguno de los siguientes síntomas?

(en caso necesario elegir más de una opción) □ Dolor en la región superior del abdomen □ Inflamación abdominal □ Reflujo / acidez / ardor / agrura □ Náuseas □ Flatulencia (gas) □ Diarrea □ Tos □ Sensación de llenura rápida con la ingesta de alimentos □ Otro (especifique): _______________________ □ Asintomático

3) ¿Ha sido diagnosticado con infección por Helicobacter pylori? Sí _____ ¿Cuándo? ____________________ No _____

4) ¿Cómo le hicieron el diagnóstico de infección por Helicobacter pylori? (en caso necesario elegir más de una opción)

□ Evaluación clínica únicamente □ Análisis de sangre □ Análisis de heces □ Prueba del aliento □ Biopsia □ Otro (especifique): _______________________ □ No sabe

5) ¿Cuál fue el costo aproximado empleado en el diagnóstico? ______________________

6) ¿Recibió tratamiento luego de ser diagnosticado con infección por Helicobacter pylori? Sí _____ No _____ Si la respuesta es NO, pasar a la pregunta 9.

7) ¿Qué tipo de medicamento utilizó y por cuánto tiempo lo tomó?

□ Antibióticos Tiempo: _____________ □ Antiácidos Tiempo: _____________ □ Inhibidor de la bomba de protones Tiempo: _____________ □ Antidiarreicos Tiempo: _____________

122

□ Otro (especifique): _______________________ □ No sabe

8) ¿Cuál fue el costo aproximado empleado en el tratamiento? ___________________ 9) ¿Ha tenido usted necesidad de ausentarse de sus labores por las molestias descritas en la

pregunta # 2? Sí _____ ¿Cuántos días? _______________________________ No _____ Si la respuesta es NO, pasar a la pregunta 11.

10) Si se ha ausentado de sus labores, ¿ha necesitado que algún miembro de la familia se ausente de sus labores para cuidar de usted en casa? Sí _____ No _____

11) ¿Ha tenido necesidad de hospitalizarse por las molestias descritas en la pregunta # 2? Sí _____ ¿Cuántos días? _______________________________ No _____

12) ¿Alguna persona cercana a usted ha sido diagnosticada con infección por Helicobacter pylori ? Sí _____ No _____ No sabe _____

13) ¿Algún familiar ha sido diagnosticado con cáncer de estómago? Sí _____ No _____ No sabe _____

123

ANEXO 2

CONSENTIMIENTO INFORMADO Código: _____________

I. Información general La infección por Helicobacter pylori se transmite por contacto entre personas, por el consumo de alimentos contaminados con heces o ambos. Esta infección es un factor de riesgo para desarrollar gastritis crónica, úlcera péptica y duodenal, así como linfomas y adenocarcinomas gástricos. En Guatemala, los estudios que se han realizado han demostrado que alrededor del 65% de la población ha padecido de la infección. Este estudio desea establecer el panel de pruebas de laboratorio que permitan con mayor sensibilidad y especificidad detectar la infección y luego término del tratamiento adecuado evaluar la erradicación de la infección.

II. Beneficios • Usted recibirá su boleta con el informe de laboratorio serológico y microbiológico respectivo. III. Confidencialidad • Todos los registros que lo identifiquen como participante se mantendrán en TOTAL

CONFIDENCIALIDAD y, hasta donde lo permiten las leyes y/o regulaciones aplicables, NO se harán del conocimiento público.

• La publicación de los resultados del estudio mantendrá completamente confidencial su identidad como participante.

IV. Participación • Usted hace uso de su derecho de decisión, siendo VOLUNTARIO el enrolamiento en este

estudio, el cual carece de pago alguno. • NO se brindará el tratamiento necesario en caso de requerirlo. • Usted tiene DERECHO a retirarse, por lo que de aceptar participar, se COMPROMETE al

seguimiento que el protocolo del estudio requiere: llamadas mensuales y repetición del panel de pruebas de laboratorio.

Yo_______________________________________________ estoy de acuerdo en participar en el estudio. Sé que mi participación es completamente voluntaria y confidencial. Me comprometo a responder al seguimiento que el estudio requiere. Se me ha explicado la naturaleza y los objetivos de lo que se me propone, incluyendo procedimientos con sus beneficios y riesgos. Estoy satisfecho con esas explicaciones y las he comprendido.

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Fecha________________ Edad__________ Dirección______________________________________________________________ Teléfono (s) ________________________________ Firma__________________________________ Por la presente certifico que he explicado la naturaleza, propósito, beneficios y riesgos del procedimiento propuesto, me he ofrecido a contestar cualquier pregunta y he contestado completamente todas las preguntas hechas. Creo que los interesados han comprendido completamente lo que he explicado y contestado.

_________________________________ Nombre y firma del investigador

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