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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-

SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

“SÍNTESIS DE ANÁLOGOS DEL MEDICAMENTO ANTI-ALZHEIMER

AMPAKINA CX-516 A PARTIR DEL PRODUCTO NATURAL SAFROL”

PROYECTO FODECYT No. 20-2006

OSCAR MANUEL CÓBAR PINTO

Investigador Principal

GUATEMALA, AGOSTO DEL 2008

Facultad de Ciencias Químicas Universidad de San Carlos

y Farmacia

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias a:

Apoyo financiero del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología –FONACYT-, otorgado por

la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y del Consejo Nacional de

Ciencia y Tecnología –CONCYT-, Proyecto FODECYT 20-2006.

OTROS AGRADECIMIENTOS

El equipo de investigación: Lic. Jorge Alejandro Torres Flores, Lic Jason Brian Marroquín

Reyes, Lic. Abraham Alejandro Vásquez Mencos y MSc. Luis Hugo Santa Cruz Cruz.

Laboratorios y personal de los Departamentos de Química Orgánica, Fisicoquímica,

Unidad de Análisis Instrumental y Unidad de Bioensayos del Laboratorio de Investigación

en Productos Naturales –LIPRONAT- de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de

la Universidad de San Carlos de Guatemala.

CONTENIDO

Página

RESUMEN 01

PARTE I

INTRODUCCIÓN 03

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 05

OBJETIVOS E HIPÓTESIS 06

METODOLOGÍA 09

PARTE II

MARCO TEÓRICO 22

PARTE III

RESULTADOS 40

DISCUSIÓN DE RESULTADOS 58

PARTE IV

CONCLUSIONES 66

RECOMENDACIONES 69

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70

ANEXOS

Vistas del cerebro con y sin la Enfermedad de Alzheimer 74

Algunos datos de Enfermedades Demenciales en Guatemala 74

Estructura de algunos Inhibidores de Acetilcolinesterasa 75

Espectros de Masa de Impacto Electrónico 79

Propuesta de Fragmentación de compuestos seleccionados 92

PARTE V

INFORME FINANCIERO 99

RESUMEN

La investigación consistió en la síntesis de moléculas orgánicas análogas

estructuralmente a la AMPAKINA CX-516 (AMPALEX®, Cortex Farmacéutica),

medicamento que actualmente se encuentra en Fase Clínica III, dentro de la Administración

Federal de Drogas y Alimentos -FDA- de los Estados Unidos de Norteamérica, para ser

aprobado como medicamento contra la Enfermedad de Alzheimer.

Utilizando reacciones orgánicas sencillas, con reactivos químicos accesibles y

disponibles en nuestro medio y a partir de Safrol, Eugenol (como materia prima para la

síntesis de Safrol) y Piperonal, productos naturales aislados como aceites esenciales de

varias especies de plantas medicinales locales, se sintetizaron siete moléculas orgánicas

(1,2,3,4,5,6,7) con funcionalidades y superficies moleculares similares a AMPAKINA CX-

516.

Los compuestos 1 al 7, mostraron inhibición in vitro contra las enzimas

Acetilcolinesterasa y Butirilcolinesterasa.

Adicionalmente, presentan propiedades farmacofóricas importantes que los ubica

como probables moléculas sujetas a posteriores estudios. Estas propiedades se obtuvieron

utilizando software de última generación.

Estos resultados los convierte en moléculas con promesa de incrementar la memoria

en mamíferos in vivo, aproximación directa a un estudio clínico para explorar sus

probabilidades de convertirse en medicamentos contra la Enfermedad de Alzheimer y otras

relacionadas como la Enfermedad de Parkinson y la Depresión.

2

ABSTRACT

The synthesis of seven organic compounds structurally similar to AMPAKINE CX-

516 (AMPALEX ®, Cortex Pharmaceuticals) was achieved.

AMPAKINE CX-516 is currently in FDA´s Phase III clinical trial as an Alzheimer's

disease drug.

Running simple organic reactions, with local accessible and available chemical reagents,

using Safrole, Eugenol (as raw material for the synthesis of Safrole) and Piperonal, were

synthesized (1,2,3,4,5,6,7) with similar structural features and molecular volumes that

AMPAKINE CX-516.

The raw material as essential oils, are found in several species of local medicinal plants.

Compounds 1 through 7 showed in vitro inhibition against the enzymes

Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase.

Moreover, the pharmacophore and the physicochemical properties of the synthesized

molecules, places them subject to further studies as Cholinesterase inhibitors.

These properties were obtained using the latest software available locally.

The results make these molecules a promise to, in vivo, increase the memory in mammals, a

direct approach to a clinical trial to explore its probabilities of becoming drugs against

Alzheimer's Disease and other related like Parkinson and Depression.

3

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

El mal de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa ligada con la disminución de la

disponibilidad de acetilcolina.

Se caracteriza por cambios fisiológicos en el cerebro como “encogimiento”, pérdida de

neuronas y la aparición de “placas” en el cerebro (Becker, R. et al. 1997, Belluti, F. et al.

2005, Goodman y Gilman, 2006).

Su tratamiento con Tacrine (Cognex®) inhibe la acetilcolinesterasa, aumentando la

disponibilidad de acetilcolina (Simmon, V. 1999).

En noviembre de 1996, aparecen las Ampakinas, desarrolladas en la Universidad de

California (Campus de Irving) y vendida su licencia a Cortex® Farmacéutica.

El compuesto base es el denominado CX-516. Pruebas de laboratorio en ratas demostraron

que animales ancianos mejoraron dramáticamente su habilidad para recordar.

Pruebas clínicas en humanos iniciaron en 1997 y actualmente se encuentra en Fase Clínica

III en la “Food and Drug Administration” (FDA) de Estados Unidos de América.

Un compuesto orgánico estructuralmente análogo a CX-516; 1-(1,3-benzodioxol-5-

ylcarbonyl)piperidina fue reportado por Staubli, Rogers y Link como un compuesto capaz

de incrementar la memoria en animales de experimentación, con similar actividad biológica

y el mismo mecanismo de acción farmacológica (Schatz, P. 1997, Lynch, G. 1998).

Es clara la similitud estructural existente, lo que se observa detalladamente al comparar el

modelo tridimensional entre ambas moléculas.

4

AMPAKINA CX-516 1-(1,3-BENZODIOXOL-5-YL-

CARBONIL)PIPERIDINA

Es razonable suponer entonces, que moléculas orgánicas similares estructuralmente a CX-

516 y a 1-(1,3-benzodioxol-5-ylcarbonyl)piperidina, que posean similares funcionalidades,

volúmenes y superficies moleculares puedan poseer similar actividad biológica.

Esta hipótesis, originó la creación de un programa de investigación sobre síntesis de

compuestos que incrementan la memoria a partir de productos naturales conocidos y

abundantes, cuya primera fase la constituye el proyecto “Síntesis de Análogos del

Medicamento Anti-Alzheimer AMPAKINA CX 516 a partir de los Productos Naturales

Safrol y Piperonal” (Cóbar, O.M. et al. 2004) que se desarrolló cofinanciado por la

Dirección General de Investigación.

En este proyecto, se sintetizaron, mediante rutas sintéticas cortas y con reactivos de bajo

costo, siete compuestos orgánicos estructuralmente similares a 1-(1,3-benzodioxol-5-

ylcarbonyl)piperidina (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) a partir de los productos naturales Safrol, Eugenol

y Piperonal, abundantes en plantas medicinales en Guatemala (Cáceres, A. 1997,

Vademecum), mostraron actividad inhibitoria contra las enzimas Acetilcolinesterasa y

Butirilcolinesterasa y calcularon sus propiedades farmacofóricas.

5

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes en Guatemala.

Esta investigación, como parte de un programa de síntesis de moléculas análogas al

medicamento Anti-Alzheimer Ampakina CX-516 es pionera en Guatemala y a nivel

mundial, planificándose sinterizar al menos 20 moléculas, de las cuales se espera que al

menos 10 (50%) inhiban in vitro a las enzimas Acetilcolinesterasa y Butirilcolinesterasa,

para posteriormente sintetizar a nivel de gramo las más activas y probar su capacidad de

incrementar la memoria en mamíferos, para convertirlas en potenciales medicamentos

contra la Enfermedad de Alzheimer.

Siendo Guatemala un país netamente agrícola, dependiente de los países industrializados en

el abastecimiento de principios activos para la formulación de fármacos, es importante

hacer uso de los recursos naturales con que cuenta el país como es el caso del Eugenol y el

Piperonal, productos naturales abundantes en plantas medicinales guatemaltecas, pudiendo

ser sus productos de síntesis, la respuesta con materia prima local, para la cura o prevención

de la Enfermedad de Alzheimer.

I.2.2 Justificación del Trabajo de Investigación.

A partir de los productos naturales conocidos y abundantes Safrol, Eugenol y Piperonal, se

espera sintetizar siete compuestos orgánicos, plenamente identificados y caracterizados,

que posean la capacidad de inhibir a las enzimas Acetilcolinesterasa y Butirilcolinesterasa y

puedan en un futuro cercano convertirse en probables medicamentos contra la Enfermedad

de Alzheimer.

El Safrol, materia prima utilizada para la síntesis de piperamidas en este proyecto, no puede

ser adquirido comercialmente al ser un compuesto controlado por las autoridades

regulatorias del país.

Safrol es utilizado para la síntesis de la droga Éxtasis, por lo que se le sintetiza a partir de

Eugenol.

Adicionalmente, con la síntesis de estos compuestos orgánicos y el estudio de su actividad

biológica para buscar convertirlos en nuevos medicamentos de origen natural, se contribuye

al cumplimiento a los “Acuerdos sobre Aspectos Socioeconómicos y Situación Agraria de

los Acuerdos de Paz, en su parte II, párrafo 15, establece que la elevación de vida, la salud

de sus habitantes y la educación y la capacitación constituyen las premisas para acceder al

desarrollo sustentable en Guatemala, en su parte B. Salud, párrafo f), valora la medicina

indígena y natural, indicándose que se promoverá su estudio y rescatarán sus concepciones,

métodos y prácticas.

Las Piperamidas (amidas con estructura similar al alcaloide piperina, componente

mayoritario de pimienta negra -piper nigrum-) han sido sintetizadas con éxito y probado

actividad biológica por varios grupos de investigación alrededor del mundo, sin embargo

ninguna ha sido probada como inhibidora de las enzimas Acetilcolinesterasa y

Butirilcolinesterasa y ninguna diseñada como homóloga de medicamentos Anti-Alzheimer.

6

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

Sintetizar a partir de Safrol siete moléculas orgánicas y determinar in vitro su inhibición

contra las enzimas Acetilcolinesterasa y Butirilcolinesterasa.

I.3.1.2 Específicos

I.3.1.2.1 Sintetizar, a partir de Isoeugenol, N-(5-metilisoxazol-3-yl)-1,3-benzodioxol-5-

carboxamida (1).

I.3.1.2.2 Sintetizar, a partir de Isoeugenol, N-(2-hidroxi-4-methylphenyl)-1,3-benzodioxol-

5-carboxamida (2).

I.3.1.2.3 Sintetizar, a partir de Isoeugenol, N-(3-metilisoxazol-5-yl)-1,3-benzodioxol-5-

carboxamida (3).

I.3.1.2.4 Sintetizar, a partir de Isoeugenol, N-(2-hidroxyi-5-

metilpfenyl)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (4).

I.3.1.2.5 Sintetizar a partir de Isoeugenol, benzo[d][1,3]dioxol-5-yl(piperazin-1-

yl)metanona (5).

I.3.1.2.6 Sintetizar, a partir de Eugenol, 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-

metilfenil)acetamida (6).

I.3.1.2.7 Sintetizar, a partir de Eugenol, 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxazol-3-

yl)acetamida (7).

I.3.1.2.8 Sintetizar Safrol a partir de Eugenol.

I.3.1.2.9 Determinar la actividad inhibitoria contra las enzimas Acetilcolinesterasa y

Butirilcolinesterasa de los siete compuestos sintetizados.

I.3.1.2.10 Explorar rutas sintéticas cortas y de bajo costo para la síntesis de análogos de 1-

(1,3-bnenzodioxol-5-yl-carbonil)piperidina a partir de Safrol, Eugenol e Isoeugenol.

I.3.1.2.11 Explorar modificaciones a la cadena lateral alquílica y el tipo de amina de los

productos a sintetizar para mejorar su actividad biológica.

I.3.1.2.12 Explorar el incremento de la actividad inhibitoria a las enzimas

Acetilcolinesterasa y Butirilcolinesterasa del dímero piperazilamida sintetizado.

7

I.3.1.2.13 Realizar estudios teóricos de modelaje molecular de las moléculas a sintetizar y

las diseñadas teóricamente para predecir su actividad de incremento de memoria en

mamíferos.

8

I.3.2 Hipótesis

Las moléculas sintetizadas poseen actividad inhibitoria contra las enzimas

Acetilcolinesterasa y Butirilcolinesterasa in vitro en el ensayo “Rapid TLC Bioautographic

Method for the Detection of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Inhibitors in

Plants” (Martson, A. et al. 2002).

9

I.4 METODOLOGÍA

I.4.1 Diseño, población a estudiar y muestra

I.4.1.1 Localización.

Laboratorio de Investigación en Productos Naturales –LIPRONAT- de la Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, ubicado en

14º36´03.55´´ Norte y 99º33´45.40´´ Oeste, a 1517 MSNM y temperatura media de 23 oC.

I.4.1.2 Universo.

Las siete moléculas a sintetizar, la materia prima y metodología necesaria para su síntesis

orgánica.

I.4.1.3. Población.

Reactivos necesarios para la síntesis orgánica de los compuestos a producir.

I.4.1.4. Modelo de muestreo.

Por la naturaleza de la investigación no se aplica un modelo de muestreo.

I.4.1.5. Fases de Trabajo. El trabajo se desarrollará en Dos Fases de Síntesis Orgánica, dos fases de estudios de

Modelaje molecular y una Fase de estudio de actividad inhibitoria enzimática.

I.4.1.4.1 Síntesis Orgánica

I.4.1.4.1.1 FASE I.

Síntesis, a partir de isoeugenol, de los compuestos N-(5-metilisoxazol-3-yl)-1,3-

benzodioxol-5-carboxamida (1), N-(2-hidroxi-4-metilfenil)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida

(2), N-(3-metilisoxazol-5-yl)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida (3), N-(2-hidroxi-5-

methilfenil)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida (4) y 1-(1,3-benzodioxol-5-

ylcarbonyl)piperazina (5).

Etapa 1.

I.4.1.4.1.1.1 Reacción A: Síntesis de 4-alil-1,2-dimetoxibenceno.

Metilación del isoeugenol (Mauthner, 2004).

A una solución fría de 8g (0.2 moles) de hidróxido de sodio en 50ml de agua destilada en

un balón de 250ml se agregaron 4.37g (0.0266 moles) de isoeugenol.

10

El frasco es inmediatamente cerrado y la mezcla es agitada ocasionalmente hasta que se

encuentre uniforme y entonces añadieron 8.9g (6.7ml) de sulfato de dimetilo (0.071 moles)

y la mezcla se mantuvo con agitación constante durante 20 minutos.

Durante este periodo la temperatura se mantuvo entre 30°C y 35°C. Se destapó el frasco en

ocasiones para liberar la presión. Luego se añadió una segunda porción de 8.9g de sulfato

de dimetilo y agitó por un periodo de 10 minutos.

Durante esta segunda adición la temperatura se mantuvo entre 40°C y 45°C.

Se armó un sistema de reflujo y la mezcla se llevó a ebullición por un periodo de dos horas.

Luego la mezcla se enfrió y acidificó con ácido clorhídrico diluido. El producto se lavó con

agua.

El producto de reacción se caracterizó por su espectro de masa de impacto electrónico,

mediante la técnica de Cromatografía de Gases acoplado a un Espectrómetro de Masas

(GC-MS), bajo las siguientes condiciones:

Temperatura del puerto de inyección: 250ºC

Temperatura del detector: 280ºC

Se inyecta a una temperatura inicial de 50ºC (con un tiempo de espera de 3 minutos en

50ºC) y con una rampa de 20ºC/min hasta 280ºC (con un tiempo de espera de 15 minutos

en 280ºC)

Tipo de columna: HP-5 (crosslinked 5% PHME siloxane)

Cromatografo de gases masas HP 5890 serie 2, detector HP 5971A.

Etapa II

I.4.1.4.1.1.2 Reacción B. Síntesis de 5-[(1E)-prop-1-en-1-il]-1,3-benzodioxol.

Obtención del benzodioxol (Bonthrone and Cornforth, 1969).

Solución de 20g de 1,2-dimethoxy-4-[(1E)-prop-1-en-1-yl]benzene (0.1332 mol), 16ml de

hidróxido de sodio al 50% y 27ml de dimetilsulfóxido (DMSO) se calienta a 98°C con

agitación por 30 minutos.

Esta solución a 98°C es agregada en un periodo de treinta minutos a una solución en reflujo

de 20ml de diclorometano en 40ml de DMSO.

Finalmente, la mezcla de reacción es agitada en reflujo por una hora y media (1.5 horas).

Después, la mezcla es destilada por arrastre con vapor de agua.

El destilado (aproximadamente 100ml) es extraído con 30ml de diclorometano, luego este

extracto es lavado con 15ml de agua, la solución de diclorometano resultante, es evaporada

para producir aproximadamente noventa y cinco por ciento (95.4%) del producto.

11

El compuesto es caracterizado por su espectro de masa de impacto electrónico, mediante la

técnica de Cromatografía de Gases acoplado a un Espectrómetro de Masas (GC-MS) y por

su espectro infrarrojo.

Etapa III I.4.1.4.1.1.3 Reacción C. Síntesis del ácido 3,4-dimetoxifenilacético

Obtención del ácido 3,4-dimetoxibenzoico a partir del 5-[(1E)-prop-1-en-1-il]-1,3-

benzodioxol; Ruptura oxidativa de alquenos para la obtención de ácidos carboxílicos

(Hudlický, 1990; Herriot, Picker, 1974).

En un balón se agregaron 53.808g de permanganato de potasio (KMnO4, 0.3363 moles) y

disolvieron en 560 ml de agua con agitación vigorosa durante 10 minutos, la mezcla es

enfriada después con un baño de agua. Después agregaron 336.3ml de benceno, 5.5938g de

bromuro de tetrabutilamonio (0.0179 moles) y 21.98g de 5-[(1E)-prop-1-en-1-yl]-1,3-

benzodioxole (0.1233 moles).

La mezcla se agitó durante tres horas a temperatura ambiente y después es tratada con

bisulfito de sodio y ácido. La capa bencénica es separada, secada y evaporada.


mediante la técnica de Cromatografía de Gases acoplado a un Espectrómetro de Masas por

impacto electrónico (GC/MS).

El procedimiento estándar se modificó de la siguiente manera:

Previo al tratamiento de la mezcla con bisulfito de sodio y ácido clorhídrico, se procedió a

filtrar la mezcla para separar de esta el óxido de manganeso.

Posterior a esta filtración, al óxido de manganeso se le realizaron dos lavados con agua

caliente para extraer las pequeñas porciones de compuesto que pudieran haber quedado

atrapadas dentro de este. Se reconcentró el filtrado obtenido y luego se trató la mezcla con

bisulfito de sodio y acidificó la mezcla precipitándose los cristales de ácido 3,4-

dimetoxibenzoico.

Se extraen los cristales para purificarlos por medio de una extracción simple líquido-líquido

(o partición simple) con bicarbonato de sodio al 5%, posteriormente se analizan por medio

12

de la técnica de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) bajo las siguientes

condiciones:

Solvente A 60%: ácido fosfórico al 0.1% en agua HPLC

Solvente B 40%: acetonitrilo

Temperatura del horno: 35ºC

Tipo de columna: fase reversa RP18, de 24cm de longitud

Tiempo de elución: 30 minutos.

Longitud de onda del detector: 254nm (lámpara de Deuterio, detector UV-Vis).

Etapa IVa. I.4.1.4.1.1.4.1 Reacción D. Síntesis de 2-(3,4-dimetoxifenil-N-(2-hidroxi-5-


Síntesis de la amida a partir del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético y una base nitrogenada: el

2-amino-p-cresol; Formación de amidas a partir de ácidos carboxílicos y aminas catalizada

por ácido bórico (Tang, 2004).

En un balón de 250ml, secado a la llama y provisto de un agitador magnético, así como de

flujo de nitrógeno, se introdujeron 5.886g de ácido (3,4-dimetoxifenil)acético (0.03 moles),

0.02g de ácido bórico (0.003 moles) y 88ml de tolueno.

A la mezcla de reacción en agitación se añadieron 3.8179g de 2-amino-p-cresol (0.031

moles) en una sola porción. La mezcla de reacción es calentada a reflujo por dieciséis horas

(16h).

La mezcla se dejó enfriar hasta llegar a temperatura ambiente y luego es puesta en agitación

en 500ml de hexano, en donde inmediatamente precipitó un sólido blanco.

Se agitó por un periodo de treinta minutos y luego el precipitado es filtrado al vacío. El

sólido colectado es lavado sucesivamente con dos porciones de 60ml de hexano y dos

porciones de 60ml de agua destilada y luego secado al vacío.

Finalmente, el producto se secó por doce horas (12h) en desecadora.

El compuesto sintetizado se caracterizó mediante su espectro de masa de impacto

electrónico, mediante la técnica de Cromatografía de Gases acoplado a un Espectrómetro

de Masas por impacto electrónico (GC/MS).

Etapa IVb. I.4.1.4.1.1.4.2. Reacción E. Síntesis de 2-(3,4-dimetoxifenil-N-(5-metilisoxazol-3-

il)acetamida (7)


2-amino-p-cresol y el 3-amino-5-metilisoxasol, (dos aminas primarias y una secundaria);

13

Formación de amidas a partir de ácidos carboxílicos y aminas catalizada por ácido bórico

(Tang, 2004).

El procedimiento de síntesis utilizado es el mismo que el descrito en la etapa IVa.,

únicamente cambiando la amina por 3.0411g de 3-amino-5-metilisoxasol (0.031 moles).




Etapa IVc I.4.1.4.1.1.4.3. Reacción F. Síntesis de N-(5-metillisoxazol-3-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-

carboxamida (1).




(Tang, 2004).


utilizando 0.498 g de ácido piperonílico y cambiando la amina por 3.0411g de 3-amino-5-

metilisoxasol (0.031 moles).




Etapa IVd I.4.1.4.1.1.4.4. Reacción F. Síntesis de N-(2-hidroxi-4-metilfenil benzo[d][1,3]dioxol-5-

carboxamida (2)

Síntesis de la amida a partir del ácido Piperonílico y una base nitrogenada: el 2-amino-p-

cresol y el 3-amino-5-metilisoxasol, (dos aminas primarias y una secundaria); Formación

de amidas a partir de ácidos carboxílicos y aminas catalizada por ácido bórico (Tang,

2004).

14


únicamente cambiando la amina por 33.8179g de 2-amino-p-cresol (0.031 moles).




Etapa IVe I.4.1.4.1.1.4.5. Reacción G. Síntesis de N-(3-metilisoxazol-5-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-

carboxamida (3).

Síntesis de la amida a partir del ácido piperonílico y una base nitrogenada: el 2-amino-p-

cresol y el 3-amino-4-metilisoxasol, (dos aminas primarias y una secundaria); Formación

de amidas a partir de ácidos carboxílicos y aminas catalizada por ácido bórico (Tang,

2004).

El procedimiento de síntesis utilizado es el mismo que el descrito en la etapa IVd,





Etapa IVf I.4.1.4.1.1.4.6. Reacción H. Síntesis de benzo[d][1,3]dioxol-5-il(piperazin-1-il)metanona

(5).

Síntesis de la amida a partir del ácido piperonílico y la base nitrogenada piperazina. Es

formación de amidas a partir de ácidos carboxílicos y aminas catalizada por ácido bórico

(Tang, 2004).

El procedimiento de síntesis utilizado es el mismo que el descrito en la etapa IVe,

únicamente cambiando la amina por 2.6 g de piperazina (0.03 moles).

15

Etapa IVg I.4.1.4.1.1.4.7. Reacción I. Síntesis de N-(2-hidroxi-5-metilfenil)[d][1,3]dioxol-5-

carboxamida (5).

Síntesis de la amida a partir del ácido piperonílico y la base nitrogenada 2-hidroxi-5-metil-

anilina.

Es una típica reacción de formación de amidas a partir de ácidos carboxílicos y aminas

catalizada por ácido bórico (Tang, 2004).

El procedimiento de síntesis utilizado es el mismo que el descrito en la etapa IVf,

únicamente cambiando la amina por 3.7 g de 2-hidroxi-5-metil-anilina (0.03 moles).

I.4.1.4.1.2 FASE II.

Síntesis, a partir de eugenol, de los compuestos 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-

metilfenil)acetamida(6) y 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-il)acetamida(7).

Etapa I.

I.4.1.4.1.2.1 Reacción A: Síntesis de 4-alil-1,2-dimetoxibenceno.

Metilación del eugenol (Mauthner, 2004).

A una solución fría de 8g (0.2 moles) de hidróxido de sodio en 50ml de agua destilada en

un balón de 250ml se agregaron 4.37g (0.0266 moles) de eugenol.

El frasco es inmediatamente cerrado y la mezcla es agitada ocasionalmente hasta que se encuentre uniforme y entonces añadieron 8.9g (6.7ml) de sulfato de dimetilo (0.071 moles)

y la mezcla se mantuvo con agitación constante durante 20 minutos.

Durante este periodo la temperatura se mantuvo entre 30°C y 35°C. Se destapó el frasco en

ocasiones para liberar la presión.

Luego se añadió una segunda porción de 8.9g de sulfato de dimetilo y agitó por un periodo

de 10 minutos. Durante esta segunda adición la temperatura se mantuvo entre 40°C y 45°C.

16

Se armó un sistema de reflujo y la mezcla se llevó a ebullición por un periodo de dos horas.

La mezcla se enfrió y acidificó con ácido clorhídrico diluido. El producto se lavó con agua.



impacto electrónico (GC-MS), bajo las siguientes condiciones:

Temperatura del puerto de inyección: 250ºC

Temperatura del detector: 280ºC

Se inyecta a una temperatura inicial de 50ºC (con un tiempo de espera de 3 minutos en

50ºC) y con una rampa de 20ºC/min hasta 280ºC (con un tiempo de espera de 15 minutos

en 280ºC)

Tipo de columna: HP-5 (crosslinked 5% PHME siloxane)

Cromatógrafo de gases masas hp 5890 serie 2, detector hp 5971A.

Etapa II.

I.4.1.4.1.2.2. Reacción B. Síntesis del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético.

Obtención del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético a partir del 4-alil-1,2-dimetoxibenceno;

Ruptura oxidativa de alquenos para la obtención de ácidos carboxílicos (Hudlický, 1990;

Herriot, Picker, 1974).

En un balón se agregaron 53.808g de permanganato de potasio (KMnO4, 0.3363 moles) y

disolvieron en 560 ml de agua con agitación vigorosa durante 10 minutos, la mezcla es

enfriada después con un baño de agua. Después agregaron 336.3ml de benceno, 5.5938g de

bromuro de tetrabutilamonio (0.0179 moles) y 21.98g de 4-alil-1,2-dimetoxibenceno

(0.1233 moles). La mezcla se agitó durante tres horas a temperatura ambiente y después es

tratada con bisulfito de sodio y ácido. La capa bencénica es separada, secada y evaporada.



impacto electrónico (GC/MS).

El procedimiento estándar se modificó de la siguiente manera:

Previo al tratamiento de la mezcla con bisulfito de sodio y ácido clorhídrico, se procedió a

filtrar la mezcla para separar de esta el óxido de manganeso.

Posterior a esta filtración, al óxido de manganeso se le realizaron dos lavados con agua

caliente para extraer las pequeñas porciones de compuesto que pudieran haber quedado

atrapadas dentro de este. Después se reconcentró el filtrado obtenido y luego se trató la

mezcla con bisulfito de sodio y acidificó la mezcla precipitándose los cristales de ácido 2-

(3,4-dimetoxifenil)acético.

17

Se extraen los cristales para purificarlos por medio de una extracción simple líquido-líquido

(o partición simple) con bicarbonato de sodio al 5%, posteriormente se analizan por medio

de la técnica de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) bajo las siguientes

condiciones:

Solvente A 60%: ácido fosfórico al 0.1% en agua HPLC

Solvente B 40%: acetonitrilo

Temperatura del horno: 35ºC

Tipo de columna: fase reversa RP18, de 24cm de longitud

Tiempo de elución: 30 minutos.

Longitud de onda del detector: 254nm (lámpara de Deuterio, detector UV-Vis)

Etapa IIIa. I.4.1.4.1.2.3 Reacción C. Síntesis de 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-



2-amino-p-cresol; Formación de amidas a partir de ácidos carboxílicos y aminas catalizada

por ácido bórico (Tang, 2004).

En un balón de 250ml, secado a la llama y provisto de un agitador magnético, así como de

flujo de nitrógeno, se introdujeron 5.886g de ácido (3,4-dimetoxifenil)acético (0.03 moles),

0.02g de ácido bórico (0.003 moles) y 88ml de tolueno.

A la mezcla de reacción en agitación se añadieron 3.8179g de 2-amino-p-cresol (0.031

moles) en una sola porción. La mezcla de reacción es calentada a reflujo por dieciséis horas

(16h).

La mezcla se dejó enfriar hasta llegar a temperatura ambiente y luego es puesta en agitación

en 500ml de hexano, en donde inmediatamente precipitó un sólido blanco.

Se agitó por un periodo de treinta minutos y luego el precipitado es filtrado al vacío.

El sólido colectado es lavado sucesivamente con dos porciones de 60ml de hexano y dos

porciones de 60ml de agua destilada y luego secado al vacío. Finalmente, el producto se

secó por doce horas (12h) en desecadora.




Etapa IIIb. I.4.1.4.1.2.4. Reacción D. Síntesis de 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-

il)acetamida (7).

18




(Tang, 2004)

El procedimiento de síntesis utilizado es el mismo que el descrito en la etapa IIIa.,





FASE III.

I.4.1.4.1.3 Método utilizado para la determinación de la inhibición de la

acetilcolinesterasa y de la butirilcolinesterasa por los compuestos sintetizados: 1-(1,3-

benzodioxol-5-ilacetil)pirrolidina (A), 1-(1,3-benzodioxol-5-ilacetil)piperidina (B) y 1-(1,3-

benzodioxol-5-ilacetil)piperazina (C): Método bioautográfico para la detección de

inhibidores en plantas de la acetilcolinesterasa y la butirilcolinesterasa (Martson, A. et al.,

2002)

Se preparan soluciones de cada compuesto de 1mg en 1ml de metanol, para aplicar 15μl a

la placa de cromatografía en capa fina (TLC). La cafeína, que se utilizará como compuesto

de referencia se prepara de la misma manera (1mg cafeína/1ml metanol), o se preparan

varias diluciones para aplicar en la placa de cromatografía en capa fina (TLC).

Bioautografía

La acetilcolinesterasa (1000U) o butirilcolinesterasa (500U) se disuelve en 150ml de una

solución buffer de Tris (0.05M) y ácido clorhídrico que tenga un pH de 7.8, se agrega la

albúmina de suero bovino (150mg) a la solución para estabilizar la enzima durante el

bioensayo.

Esta solución es almacenada a 4°C. Las placas para cromatografía en capa fina (TLC) son

eluidas con el solvente apropiado (acetona o isopropanol) para lavarlas y son secadas justo

antes de ser utilizadas.

Después de la migración de la muestra en un solvente adecuado (o deposición directa de la

muestra), la placa es secada para remover completamente el solvente.

La placa entonces es asperjada con la solución de la enzima y secada nuevamente (al aire).

Para la incubación de la enzima la placa se coloca sobre una base plástica dentro de una

cámara con un poco de agua, esto significa, el agua no debe estar en contacto directo con la

placa pero la atmósfera se debe mantener húmeda.

19

La incubación se lleva a cabo a 37°C por 20 minutos. La enzima es estable bajo estas

condiciones. Para la detección de la enzima, soluciones de acetato de α-naftilo (250mg) en

etanol (100ml) y de la sal de Fast Blue B (400mg) en agua destilada (160ml) son

preparadas inmediatamente antes de ser utilizadas (en este orden para evitar la

descomposición).

Después de incubar la placa, 10ml de la solución de acetato de α-naftilo y 40ml de la

solución de Fast Blue B son mezclados y rociados en la placa para dar una coloración

morada después de 1-2 minutos.

La ausencia de una coloración morada indica la inhibición de la enzima.

20

FASE IV I.4.1.4.1.5. Modelaje Molecular y Propiedades Farmacofóricas de Compuestos

Sintetizados

Se realizan los estudios de Modelaje Molecular de las amidas 1 a 7:

N-(5-metilisoxazol-3-yl)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida (1), N-(2-hidroxi-4-metilfenil)-

1,3-benzodioxol-5-carboxamida (2), N-(3-metilisoxazol-5-yl)-1,3-benzodioxol-5-

carboxamida (3), N-(2-hidroxi-5-metilfenil)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida (4) y 1-(1,3-

benzodioxol-5-ylcarbonil)piperazina (5), 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-

metilfenil)acetamida(6) y 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-il)acetamida(7).

Ellos fueron minimizados utilizando el Algoritmo RM1, re-parametrización de AM1

contenido en el Programa Spartan for Windows 2006 (G.B. Rocha, R.O. Freire, A. Simas

and J.J.P. Stewart, J.Computational Chem. 2006, 27, 1101) de Wavefunction Inc.

De cada uno se calcularon, entre otros, los siguientes parámetros:

Energía de Formación

Momento Dipolo

Distancia entre cada uno de los enlaces de la molécula

Distancia espacial entre átomos de la molécula

Densidad Superficial

Highest Occupied Molecular Orbital -HOMO-

Lowest Occupied Molecular Orbital -LUMO-

Las propiedades farmacofóricas estudiadas de los compuestos citados son:

C log P (Indice de Solubilidad en n-octano)

TPSA (Topological Polar Surface Area)

Número de Aceptores de Protones

Número de Donadores de Protones

Número de Negativos Ionizables

Número de Positivos Ionizables

Relación átomos/enlaces

Número de Anillos

Enlaces Rotables

Atomos Aromáticos

Estas propiedades se calcularon utilizando los siguientes programas informáticos:

LigandScout v. 1.03, (No. de Serie: 14520307730892251293) de Inte:Ligand S.A.

basado en: G. Wolber and T. Langer. LigandScout: 3-D Pharmacophores Derived from

Protein-Bound Ligands and Their Use as Virtual Screening Filters J. Chem. Inf. Model;

2005; 45(1); 160-169.

21

Peter Ertl, Bernhard Rohde, Paul Selzer. Fast Calculation of Molecular Polar

Surface Area Directly from SMILES. Novartis Pharma AG, ChemInformatics, CH-4002,

Basel, Switzerland. Basado en: Ertl, P., Rohde, B., Selzer, P. Fast calculation of molecular

polar surface area as a sum of fragment based contributions and its application to the

prediction of drug transport properties. J. Med. Chem. 2000, 43, 3714-3717.

22

PARTE II

MARCO TEÓRICO

La Enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la pérdida de la sinapsis neuronal, aunada a

la co-ocurrencia de dos lesiones histológicas en el cerebro; el aparecimiento de depósitos

extracelulares (placas seniles), cuyo componente principal es una forma fibrilar

predominantemente de un péptido de 40-42 aminoácidos conocido como Beta-amiloide

(A) y aglomerados intracelulares de una forma hiperfosforilada del microtúbulo asociado

a la “proteina tau”, que parece jugar un rol importante en la degeneración de la enfermedad

(Khachaturian, Z. 1985).

El sistema colinérgico, es entonces, el más afectado de los sistemas neurotransmisores, con

pérdida sustancial de su función en la corteza cerebral e hipocampo.

Lo anterior, es la base para la utilización de moléculas anticolinérgicas (bloqueadores de la

acetil y de la butiril-colinesterasa) como la base para el tratamiento mas efectivo que existe

contra la enfermedad (Becker, R. et al. 1997, Belluti, F. et al. 2005).

Su inhibición, ya sea selectiva o no, amplifica la acción de la Acetilcolina, manteniendo por

más tiempo la sinapsis neuronal durante la Enfermedad de Alzheimer. Tacrine (Cognex

),

que es actualmente el medicamento más utilizado, es un inhibidor de la acetilcolinesterasa,

sin embargo posee una utilidad clínica limitada, por la mejoría relativamente pequeña

obtenida con la terapéutica y un importante espectro de efectos adversos (Goodman y

Gilman, 2006).

Inhibidores de la Buririlcolinesterasa, como N8-norphenserine, N

1,N

8-bisnorphenserine,

Tolserina y análogos de la Cysmerina han sido sintetizados recientemente, realizado

estudios de Estructura-Actividad Biológica (SAR) y demostrado potente acción

anticolinérgica (Yu, Q. et al. 1999).

Sinapsis, acetilcolina y acetilcolinesterasa.

El proceso de transmisión de los impulsos nerviosos, que es el medio por el cual se

transmite la información a través del cerebro, se denomina sinapsis. En este proceso de

transmisión de los impulsos nerviosos se ve implicada la acetilcolinesteresa, enzima que

23

hidroliza la acetilcolina, que es la sustancia encargada de esta transmisión, por lo cual

debemos de comprender una parte del proceso de la sinapsis.

Sinapsis.

Al sitio de comunicación entre dos neuronas se le conoce como sinapsis.

No se trata de un contacto directo, puesto que existe una separación infinitesimal entre las

dos células (ver figura 1).

En el caso de la célula que "envía" la señal, nos referimos a la terminación pre-sináptica

(axonal). La neurona que recibe esa información representa la porción post-sináptica

(dendrítica). La parte distal del axón muestra un engrosamiento en forma de botón, en cuyo

interior podemos encontrar mitocondrias (para el aporte de energía) y pequeñas vesículas

que contienen moléculas de neurotransmisor.

Al otro lado hay dendritas con forma de espina, a las que la terminación axónica puede

asociarse, ya sea en su parte terminal (cabeza) o en la unión con la dendrita principal

(cuello). En muchos casos podemos identificar esta porción post-sináptica por la presencia

de una capa más densa localizada justo al lado opuesto de la pre-sinapsis.

Este espesamiento o densidad post-sináptica puede contener las sustancias receptoras que

interactúan con los neurotransmisores liberados desde la pre-sinapsis (Brailowsky, 2005,

Tejedor, 2005).

Existen varios tipos de sinapsis: por una parte las llamadas químicas (en las cuales actúan

los fármacos) y por otra parte las sinapsis eléctricas que representan sitios donde las

membranas de las dos neuronas están casi juntas. En estas sinapsis, el impulso nervioso

pasa de una célula a otra manteniendo su forma eléctrica, sin pasar por una transformación

de fuerzas químicas (Tejedor, 2005).

24

Acetilcolina.

La acetilcolina es el neurotransmisor de las sinapsis colinérgicas, abundantes especialmente

en las inervaciones nerviosas en los músculos voluntarios, las llamadas placas motoras.

Es una molécula relativamente pequeña, con estructura química de éster y con cierta

polaridad, pues tiene un nitrógeno cuaternario y por tanto con carga positiva, lo que le

25

facilitará su interacción con proteínas, como su receptor (en la membrana postsináptica) o

la enzima que la degrada, la acetilcolinesterasa, en la hendidura sináptica (Tejedor, 2005).

El metabolismo de la acetilcolina en las sinapsis colinérgicas consiste en su síntesis a partir

de acetato y colina en una reacción catalizada por la colina-acetil-transferasa (ChAT), la

cual se realiza dentro de las terminaciones presinápticas. Después de su liberación a la

hendidura sináptica y de que haya realizado su función unida a sus receptores, la

acetilcolina se hidroliza en una reacción catalizada por la acetilcolinesterasa (AChE)

(Tejedor, 2005).

Figura 2: Síntesis y degradación de la acetilcolina

Fuente: Tejedor Gilmartín, María Cristina. [En línea]. Guía académica para el aprendizaje de Bioquímica

Ambiental. [España]. Universidad Complutense. 2005. “Sinapsis colinérgica”

<http://www2.uah.es/tejedor_bio/bioquimica_ambiental/tema12/tema%2012-sinapsis-colonergica.htm>

[Consulta: 6 octubre 2005].

Acetilcolinesterasa.

La acetilcolinesterasa es una esterasa tipo B (con un resto sérico en el centro activo) que

hidroliza a la acetilcolina, neurotransmisor en muchas sinapsis, especialmente en las placas

neuromotoras. Es una enzima situada en las hendiduras sinápticas y allí va a hidrolizar a la

acetilcolina, después de que ésta haya realizado su función mediante la unión a sus

receptores, permitiendo así que las sinapsis colinérgicas transmitan los impulsos nerviosos.

CH3

O

O-

OH

N+

CH3

CH3

CH3

O

N+

CH3

CH3

CH3

CH3

O

Acetilcolinesterasa

(AChE)

Colinacetiltransferasa

(ChAT)

OH2

CH3

O

SCoA

HS

CoA

26

La reacción catalizada es la hidrólisis de la acetilcolina hasta colina y acetato (Tejedor,

2005).

La acetilcolinesterasa produce la inactivación de la acetilcolina, se estima que es capaz de

hidrolizar una molécula de acetilcolina en ácido acético y colina en un milisegundo. La

reacción química producida en este proceso es (Tejedor, 2005):

Acetilcolina + enzima (Acetilcolinesterasa) ------> Colina + Acetilcolinesterasa acetilada

Acetilcolinesterasa acetilada + H2O ------> Acetilcolinesterasa + ácido acético

Este mecanismo de acción es característico de las serin-proteasas, similar al de la

quimiotripsina. La colina puede regresar a la membrana pre-sináptica y ser reutilizada en la

síntesis de la acetilcolina (Tejedor, 2005).

Las colinesterasas, es decir, las enzimas que producen la hidrólisis de la acetilcolina pueden

ser de dos tipos, a saber (Tejedor, 2005):

La colinesterasa verdadera, acetilcolinesterasa, colinesterasa eritrocitaria, específica o

de tipo e, se encuentra unida a las membranas de las neuronas, en las sinapsis

ganglionares de la estructura neuromuscular del organismo y en los eritrocitos.

La pseudocolinesterasa o colinesterasa inespecífica, también denominada

butirilcolinesterasa, colinesterasa plasmática o de tipo s, está presente generalmente en

forma soluble en casi todos los tejidos (principalmente hígado) y en el plasma, pero en

poca concentración en el sistema nervioso central y periférico. Dicha enzima también es

inhibida por los plaguicidas organofosforados y carbamatos, pero sin manifestación de

síntomas clínicos.

27

La enfermedad del Alzheimer.

En la 10ª revisión de la Clasificación Internacional de las Enfermedades (CIE-10) publicada

por la Organización Mundial de la Salud, en 1992, se definió la Enfermedad de Alzheimer

como:

“La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad degenerativa cerebral primaria, de

etiología desconocida que presenta rasgos neuropatológicos y neuroquímicos

característicos. El trastorno se inicia, por lo general, de manera insidiosa y lenta y

evoluciona progresivamente durante un período de años. El período evolutivo puede ser

corto, 2 ó 3 años, pero en ocasiones es bastante más largo” (Dtchamp, 2005).

Causas de la enfermedad de Alzheimer.

La causa de la enfermedad de Alzheimer se desconoce, pero no es parte del proceso de

envejecimiento normal.

Factores biológicos y genéticos.

Dentro de los factores biológicos, las neuronas que controlan la memoria y el pensamiento

están deterioradas, interrumpiendo el paso de mensajes entre ellas. Estas células desarrollan

cambios distintivos: placas seniles y haces neurofibrilares (degeneraciones del tejido

cerebral) (Dtchamp, 2005).

La corteza del cerebro (principal origen de las funciones intelectuales) se atrofia, se encoge

y los espacios en el centro del cerebro se agrandan, reduciendo por lo tanto su superficie

(ver anexo A y anexo B) (Dtchamp, 2005).

El segundo hallazgo significativo es una concentración alta de la proteína conocida como

beta amiloide (β-amiloide), que forma parches llamados placas neuríticas (Dtchamp, 2005).

Para los factores genéticos, el tejido cerebral muestra "nudos neurofibrilares" (fragmentos

enrollados de proteína dentro de las neuronas que las obstruyen), "placas neuríticas"

(aglomeraciones anormales de células nerviosas muertas y que están muriendo, otras

células cerebrales y proteína) y "placas seniles" (áreas donde se han acumulado productos

de neuronas muertas alrededor de proteínas).

28

Aunque estos cambios ocurren en cierto grado en todos los cerebros con la edad, se

presentan muchos más en los cerebros de las personas con enfermedad de Alzheimer

(Dtchamp, 2005).

La destrucción de las células nerviosas (neuronas) lleva a una disminución de los

neurotransmisores (sustancias secretadas por una neurona para enviar los mensajes a otra

neurona), cuyo equilibrio correcto es crítico para el cerebro. Los tres neurotransmisores

comúnmente afectados por la enfermedad de Alzheimer son acetilcolina, serotonina y

norepinefrina; la acetilcolina es la más afectada (Dtchamp, 2005).

Al causar cambios tanto estructurales como químicos en el cerebro, la enfermedad de

Alzheimer parece desconectar áreas del cerebro que normalmente trabajan juntas

(Dtchamp, 2005).

Medicamentos contra el Alzheimer.

Los inhibidores de acetilcolinesterasa (IAChE) se clasifican en cuatro categorías (para

apreciar las estructuras de algunos de los compuestos utilizados como medicamentos anti-

alzheimer ver el anexo D)

Inhibidores pseudo-irreversibles.

Esta clase de inhibidores de la acetilcolinesterasa incluye un grupo de carbamatos que

forman un complejo carbamoilado con el residuo de Ser200 de la tríada catalítica de la

acetilcolinesterasa que se hidroliza más lentamente que la forma acilada resultante de la

interacción con acetilcolina (Marco, 2005).

El prototipo de este grupo de inhibidores es fisostigmina, que fue el primer inhibidor

clínicamente estudiado para el tratamiento de la enfermedad del Alzheimer. No superó la

fase clínica III por problemas de corta vida-media, variable biodisponibilidad y estrecho

índice terapéutico.

A partir de este compuesto se han generado una gran cantidad de moléculas relacionadas,

los llamados carbamatos de 2ª generación, entre los que hay que incluir eptastigmina,

quilostigmina y rivastigmina.

29

Más recientemente, se han desarrollado los llamados carbamatos de 3ª generación, que

combinan una acción prolongada con una fuerte selectividad en la inhibición de

acetilcolinesterasa versus butirilcolinesterasa, tales como fenserina y tolserina (Marco,

2005).

Inhibidores irreversibles.

Esta familia de inhibidores de la acetilcolinesterasa incluye una serie de organofosfatos que

forman complejos estables fosforilados con el residuo de serina en el centro activo de

acetilcolinesterasa, y cuya desfosforilación es aún más lenta que la descarbamoilación.

El único representante de este grupo que ha experimentado un amplio estudio clínico es

metrifonato.

Este compuesto es un pro-fármaco, de por sí no-activo, que se transforma no-

enzimáticamente en 2,2-diclorovinil-dimetilfosfonato (DDVP), el verdadero inhibidor de la

acetilcolinesterasa in vivo (y también de butirilcolinesterasa) en pequeñas dosis y por largo

tiempo (varias semanas) (Marco, 2005).

Inhibidores tipo-análogos de estados de transición.

El yoduro de m-(N,N,N-trimetilamonio)trifluoroacetofenona es un poderoso (en el rango de

lo fentomolar) inhibidor de la acetilcolinesterasa, cuya potencia procede de la interacción

covalente y reversible con el residuo de serina del centro activo de la enzima, formando un

aducto hemicetálico, tetraédrico, que recuerda el estado de transición en el mecanismo

mismo de la enzima. No obstante, el carácter iónico de este compuesto impide su paso por

la barrera hematoencefálica (Marco, 2005).

Este aspecto, pero con el mismo diseño, ha sido superado en zifrosilona, compuesto que se

está evaluando como posible fármaco para el tratamiento de la enfermedad del Alzheimer

(Marco, 2005).

Inhibidores reversibles.

A diferencia de los anteriores, estos inhibidores interaccionan con la enzima cerca del sitio

catalítico, sin producir complejos covalentes. Tres son las grandes familias en este grupo:

30

tacrinas (análogos de aminoacridinas), las N-bencilpiperidinas y algunos alcaloides (Marco,

2005).

Dentro de la familia de las tacrinas (análogos de aminoacridinas) se encuentra la Tacrina

(9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina), estructura en torno a la cual se han descrito

numerosos análogos como la velnacrina, la suronacrina, la 7-metoxitacrina y la amiridina

(Marco, 2005).

En la familia de las N-bencilpiperidinas, el prototipo es el donepecilo (Marco, 2005).

En el grupo de los alcaloides se encuentran la galantamina y la huperzina A.

Existen varios análogos de la galantamina, que son compuestos pro-fármacos que in vivo se

hidrolizan y se convierten en el principio activo, 6-desmetilgalantamina (Marco, 2005).

Los esfuerzos dedicados a preparar análogos de huperzina A no han conducido a mejores

compuestos.

En este contexto sí cabe destacar los híbridos de huperzina A y tacrina, conocidos por

huprinas.

Esta clase de inhibidores de la acetilcolinesterasa se han diseñado como una combinación

de la subestructura de 4-aminoquinolina, presente en tacrina, y de huperzina A.

De este análisis han resultado un gran número de productos, de los que huprina X y huprina

Y han sido los más potentes y selectivos (Marco, 2005).

Reacciones involucradas en la ruta sintética propuesta.

Los éteres son sustancias que poseen enlazados a un mismo átomo de oxígeno dos grupos

orgánicos que pueden ser alquilos, arilos o vinílicos, y el átomo de oxígeno puede situarse

en una cadena abierta o ser parte de un anillo.

El éter más conocido es el dietiléter (o éter dietílico), una sustancia familiar utilizada en la

medicina como anestésico y es utilizado como un disolvente en la industria.

Además, otros éteres de utilidad son el anisol, un éter aromático utilizado en la perfumería,

y el tetrahidrofurano (THF), un éter cíclico usado como disolvente (McMurry, 2001).

Los éteres son relativamente estables y no reaccionan en muchos aspectos, pero algunos

éteres reaccionan con el aire muy lentamente para dar lugar a los peróxidos, compuestos

que contienen un doble enlace oxígeno-oxígeno (McMurry, 2001).

31

Los éteres son compuestos que poseen una geometría similar a la del agua, los enlaces R-O-

R poseen un ángulo de enlace semitetraédrico de aproximadamente 112° y el átomo de

oxígeno presenta una hibridación sp3. El átomo de oxígeno da la los éteres un leve

momento dipolar (McMurry, 2001).

Fundamentos teóricos de cada una de las reacciones que se llevaran a cabo para la

obtención de las moléculas orgánicas de interés.

Síntesis de éteres de Williamson.

Los alcóxidos metálicos reaccionan con los halogenuros y tosilatos primarios por una vía

SN2 para producir éteres, reacción que se conoce como síntesis de éteres de Williamson.

Descubierta hacia 1850, aún es el mejor método para preparar éteres, tanto simétricos como

asimétricos (McMurry, 2001; Morrison, Boyd, 1990; Wingrove, Caret, 1984; Pine et al.

1982).

Los iones alcóxido necesarios en la reacción de Williamson se preparan normalmente por

medio de la reacción de un alcohol con una base fuerte como el hidruro de sodio.

Se efectúa una reacción ácido-base entre el alcohol y el hidruro de sodio para generar la sal

de sodio del alcohol (McMurry, 2001; Pine et al. 1982).

Una variación útil de la síntesis de Williamson incluye el óxido de plata como base en lugar

del hidruro de sodio. En estas condiciones, el alcohol libre reacciona directamente con el

halogenuro de alquilo, de modo que no se necesita preformar el alcóxido metálico

intermediario (McMurry, 2001).

Para la preparación de los aril metil éteres se suele utilizar sulfato de dimetilo, en lugar de

los mucho más caros halogenuros de alquilo (Morrison, Boyd, 1990; Wingrove, Caret,

1984; Pine et al. 1982).

32

Por otra parte, debido a la apreciable acidez de los fenoles, los fenóxidos de sodio se

preparan por la acción del hidróxido de sodio acuoso sobre fenoles (Morrison, Boyd, 1990;

Wingrove, Caret, 1984; Pine et al. 1982).

Desde el punto de vista del mecanismo, la síntesis es tan solo el desplazamiento SN2 de un

ion halogenuro por un ion alcóxido nucleófilo.

La síntesis de Williamson está sujeta a todas las restricciones usuales para este tipo de

reacción. Los halogenuros y los tosilatos primarios funcionan mejor ya que la eliminación

competitiva de HX, E2, es posible con los sustratos más impedidos, esto debido a que el

alcóxido, además de ser un buen nucleófilo es también una base fuerte.

En consecuencia, los éteres asimétricos se deben sintetizar por reacción entre el reactivo

alcóxido, más impedido, y el reactivo halogenuro, el menos impedido, y no en la forma

inversa (McMurry, 2001; Morrison, Boyd, 1990; Wingrove, Caret, 1984; Pine et al. 1982).

Ruptura oxidativa de alquenos.

Los dobles enlaces pueden sufrir ruptura oxidativa para dar alcoholes, aldehídos, cetonas o

ácidos.

El producto específico formado depende de la estructura del alguno, de la presencia o

ausencia de átomos de hidrógeno en los carbonos del doble enlace, así como del agente

oxidante utilizado (Hudlický, 1990; Wingrove, Caret, 1984).

La ruptura más común y simple de alquenos para obtener ácidos carboxílicos es llevada a

cabo con permanganato de potasio o permanganato de sodio en solución acuosa o con

permanganato de tetra-alquilamonio en solventes orgánicos (Hudlický, 1990).

El permanganato de potasio en solución ácida o neutra separa a los alquenos y forma

productos con carbonilo con rendimientos de bajos a moderados. Si hay hidrógenos junto al

doble enlace, se producen ácidos carboxílicos, si hay dos hidrógenos en uno de los

carbonos, se forma CO2. (McMurry, 2001; Wingrove, Caret, 1984)

33

El mecanismo de la reacción es: (Wingrove Caret, 1984)

Formación de amidas (McMurry, 2001; Morrison Boyd 1990; Pine et al. 1982; Tang,,

2004; Yamamoto, I. 2004).

Las amidas son difíciles de preparar mediante la reacción directa de los ácidos carboxílicos

con aminas, debido a que estas últimas son bases que convierten los grupos ácido

carboxílico en sus aniones carboxilato, dando como producto sales amónicas.

Puesto que el anión carboxilato posee una carga negativa, no puede ser atacado por un

nucleófilo (McMurry, 2001; Pine et al. 1982).

Las amidas se pueden preparar a partir de los ácidos carboxílicos (y sus derivados) y

aminas primarias y secundarias, así como con amoníaco (Pine et. al., 1982).

La formación de la sal es un proceso rápido y exotérmico, y estas sales normalmente son

sólidos estables de elevado punto de fusión.

Normalmente se requiere de una temperatura elevada para deshidratar la sal amónica y

formar la amida correspondiente.

Esta técnica de formación de amida, promovido térmicamente, es utilizado comercialmente

para la preparación del nilón, una poliamida (Pine et al. 1982).

Las lactamas (amidas cíclicas) de cinco y seis miembros se forman con facilidad a partir de

compuestos apropiados que posean un grupo amino y un carboxilo (Pine et al. 1982).

34

El método más común para la preparación de amidas consiste en la reacción de halogenuros

de acilo con amoniaco o aminas (McMurry, 2001; Morrison Boyd, 1990; Pine et. al.,

1982; Tang, 2004). También se utiliza el intercambio entre ésteres y aminas (Pine et. al.,

1982).

Además, debido a la notable inestabilidad de los cloruros de ácido, a la alta peligrosidad de

los reactivos que se ven implicados en su formación (cloruro de tionilo, cloruro de oxalilo,

fosgeno, etc.), y a la reactividad de otros grupos funcionales que necesitan ser protegidos

para la formación quimioselectiva de las amidas, se ha utilizado un nuevo método

propuesto por Yamamoto y colaboradores, que es la formación catalizada de amidas a partir

del ácido carboxílico y la amina, obteniéndose los mejores resultados al utilizar ácidos

fenilbóricos con sustituyentes electrón dadores en meta y/o para como catalíticos,

descubriéndose también que la utilización de ácido bórico constituye una catálisis

altamente efectiva en la formación de amidas, y en la mayoría de los casos se utiliza al 5%

dando altos porcentajes de rendimiento (Tang, P. 2004; Yamamoto, I. 2004, Ishikara, K.

2004).

Se ha propuesto que el ácido bórico reacciona con el ácido carboxílico para dar como

producto un anhídrido mixto, intermediario que en la reacción con la amina forma la

deseada carboxamida y regenera el catalítico, el ácido bórico (Tang, P. 2004, Yamamoto, I.

2004, Ishikara, K. 2004), mecanismo presentado en el esquema a continuación:

Se espera en un futuro cercano el inicio de las pruebas clínicas que puedan convertirla en

medicamentos.

35

Otro tipo de sustancias, las AMPAKINAS (Ampalex

), licenciadas a Cortex Farmacéutica

por la Universidad de California en 1993 y actualmente en Fase Clínica III en la FDA de

los Estados Unidos, actúan por un mecanismo de acción diferente, al incrementar el

funcionamiento de los receptores AMPA (ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol

propanoico) tipo glutamato, aumentando el flujo de este neurotransmisor hacia su receptor

(Simmon, V. 1999).

Los receptores AMPA estimulan a nivel molecular ciertos tipos de memoria, al fomentar el

funcionamiento de neuronas en un proceso que se conoce como Potenciación a Largo Plazo

(PLP).

Las AMPAKINAS cuando se unen a un receptor AMPA, producen en respuesta un

incremento del flujo de glutamato hacia su receptor, generando PLP.

El efecto es que se mejora la capacidad de memoria y de recordar, hecho que está probado

en estudios farmacológicos con ratas (Lynch, G. 1998).

Estudios simultáneos, sugieren que las AMPAKINAS, tienen potencial como probables

medicamentos contra la esquizofrenia, depresión y la enfermedad de parkinson, incluso

Cortex farmacéutica en 1999, licencia a la compañía farmacéutica de origen suizo,

Organón, la licencia para estudiarlas clínicamente contra la esquizofrenia y el Desorden de

Déficit de Atención e Hiperactividad (Attention Deficit Hyperactivity Disorder -ADHD-).

En 1994, se reporta que 1-(1-3-bezodioxol-5-ylcarbonil)piperidina, un compuesto similar

estructuralmente a la principal AMPAKINA (CX-516) tiene la capacidad de incrementar la

memoria en animales de experimentación (Staubli, U. et al. 1994).

La similitud estructural de este último con la piperina, el principal componente de la

pimienta negra (Piper nigrum), visualizada por Schatz y publicada en un artículo

educacional en 1997 (Schatz, P. 1997), lleva a la creación del Programa de “Síntesis de

Moléculas Estimuladoras de la Memoria Derivadas de Productos Naturales Abundantes y

Conocidos” (Memory Enhancers by Molecules Derived from Common Natural

Compounds), del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Químicas

y Farmacia de la Universidad de San Carlos (Cóbar, O. en preparación), que pretende

sintetizar moléculas funcional y estructuralmente similares a CX-516, por ruptura de la

molécula de piperina y síntesis a partir de precursores naturales pequeños.

36

El primer proyecto “Síntesis de Tres Posibles Medicamentos por Modificación Estructural

de la Piperina” (Orozco N., et al. 2000), basado en el documento pionero “Pimienta Negra;

Respuesta a los Males de Alzheimer y Parkinson?” (Cóbar, O. 1998), se desarrolló en

1999-2000 cofinanciado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT- y el

segundo en 2005, cofinanciado por la Dirección General de Investigación (Cóbar, O. et al.

2006) han generado once moléculas que en un futuro cercano serán sometidos a las pruebas

farmacológicas necesarias para probar su capacidad de incrementar la memoria en animales

de experimentación.

Las Piperamidas (moléculas estructuralmente similares a 1-(1-3-bezodioxol-5-

ylcarbonil)piperidina) han sido aisladas de varias especies de plantas del género Piper

(Dyer, L. et al. 2004, Vasques, R. et al. 2002, Alecio, A. et al. 1998) sintetizadas (Dyer, L.

et al. 2004, Araujo-Junior, J. et al. 1999) y probada su actividad biológica como

ansiolíticos, antiparasitarios antioxidantes, e insecticidas (Araujo, J. 2004, Ribeiro, T. et al.

2004, Panda, S.; Kar, A. 2003).

Las moléculas sintetizadas en las anteriores fases de este proyecto y las propuestas a

sintetizar en este proyecto, son noveles y distintas de las reportadas en la literatura.

Moléculas Sintetizadas a partir de los Productos Naturales Safrol y Piperonal”,

Fuente: -DIGI- (Cóbar, O. et al. 2006)

37

Moléculas Sintetizadas a partir de Eugenol y Piperonal”

Fuente: -DIGI- (Cóbar, O. et al. 2007).

Fuente: FODECYT 20-2006. Moléculas Sintetizadas en este Proyecto.

En 2002 (Martson, A. et al. 2002), se ha reportado un ensayo in vitro, utilizando

cromatografía en capa fina (TLC) para determinar actividad de extractos naturales y

compuestos para determinar inhibición contra las enzimas Acetilcolinesterasa y

Butirilcolinesterasa, mecanismo actualmente utilizado para detectar compuestos orgánicos

con potencial anti-Alzheimer.

Lo anterior permite ahora probar de una manera más sencilla y con alto grado de

objetividad, la actividad buscada de los productos orgánicos a sintetizar.

“Relative Topological Polar Surface Area”, “Topological Polar Surface Area” -TPSA-,

Número de Atomos Aromáticos, “cLogP”, Número de Atomos Donadores y Número de

Atomos Aceptores de Hidrógeno, son los parámetros farmacofóricos a determinar de las

moléculas a sintetizar todo ello para tener una idea de su capacidad para acomodarse al sitio

38

activo de enzimas cuyas estructuras ya se encuentran elucidadas y pueden obtenerse en la

base de datos de “Protein Data Bank” (base de datos de libre acceso).

Farmacóforo de Compuesto DIGI-06-2006

Fuente: Cóbar, O.M. et al. 2006, Dirección General de Investigación, USAC.

“Topological Polar Surface Area”, se define como la suma de las contribuciones

superficiales de los átomos polares de la molécula (usualmente Oxígenos, Nitrógenos y los

Hidrógenos unidos a ellos).

Estudios “in silico” han mostrado que sus resultados correlacionan bien con sus

propiedades de transporte como abosrción intestinal o penetración en las barreras cerebrales

sanguíneas (Ertl, P. et al. 2000).

El número de donadores y aceptores de Hidrógeno, el peso molecular y el “Coeficiente de

Partición n-octanol/agua” (cLogP) permiten predecir, mediante sus “Propiedades de

Lipinski”, su capacidad para unirse a donadores y aceptores de Hidrógeno en los sitios

activos de enzimas y su capacidad para absorberse oralmente, ya que está relacionado con

su solubilidad e influencia su habilidad para penetrar entre membranas celulares,

incluyendo aquellas de los epitelios intestinales.

La Regla de Lipinski, formulada por Christopher Lipinski y colaboradores de Pfizer

Pharmaceutics en 1997 (Lipinski, C. et al. 1997), establece que las moléculas para poseer

adecuada absorción y permeación en sistemas biológicos y tener probabilidades de éxito en

convertirse en buenos candidatos a medicamentos deben cumplir con los siguientes

criterios:

39

Cinco (5) o menos donadores de Puentes de Hidrógeno.

Diez (10) o menos aceptores de Puentes de Hidrógeno.

Peso molecular menor o igual a 500 umas.

logP calculada es menor o igual a cinco (5).

Cinco (5) o menos enlaces rotables.

La Regla de Lipinski denomina así ya que los valores “límite” de cada uno de estos

parámetros son cercanos a 5 o múltiplos de 5.

Se ha encontrado que normalmente la suma de Ns y Os en la fórmula molecular fue mayor

que 10 en el 12% de los compuestos.

Adicionalmente el 11% poseen un peso molecular mayor que 500, el 10% tiene un CLogP

mayor que 5 (o un MlogP mayor que 4.15) y en el 8% de los compuestos la suma de OHs y

NHs en la estructura química es mayor que 5.

Como resultado de la ejecución de cuatro proyectos dentro del Programa de “Síntesis de

Compuestos que Incrementan la Memoria, Derivados de Productos Naturales Conocidos y

Abundantes”, se enfatiza en que se han sintetizado 24 moléculas orgánicas análogas a 1-

(1,3-bnenzodioxol-5-ylacetil)piperidina, la mayoría de ellas con actividad inhibitoria

contra las enzimas citadas.

40

PARTE III

III.1 RESULTADOS

Se desarrolló la ruta sintética propuesta para obtener la 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-N-(2-

hydroxy-5-methylphenyl)acetamide (6) y 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-N-(5-methylisoxazol-3-

yl)acetamide (7).

La ruta esquemática que se describe a continuación:

Fuente: Proyecto FODECYT 20-2006.

En la ruta sintética propuesta se aplicó los procedimientos de tres reacciones orgánicas: la

reacción de metilación del eugenol (reacción A) para obtención del 4-alil-1,2-

dimetoxibenceno, la reacción de ruptura oxidativa (reacción B) del 4-alil-1,2-

dimetoxibenceno para la obtención del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético, siendo estos dos

compuestos intermediarios de reacción de la ruta sintética propuesta.

Para la identificación de los intermediarios sintéticos, se utilizó la técnica de cromatografía

de gases acoplada a espectrometría de masas por impacto electrónico (GC/MS).

41

Finalmente la reacción de formación de amidas (reacciónes C, D y E) para sintetizar los

compuestos análogos a Ampakina CX-516 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-

metilfenil)acetamida (6) y 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-yl)acetamida (7)].

(Los espectros de masas por impacto electrónico de cada uno de los compuestos obtenidos

como productos en cada una de las reacciones de la ruta sintética propuesta se encuentran

en el Anexo E).

De la aplicación del procedimiento de la reacción A (de la cual se esperaba obtener el 4-

alil-1,2-dimetoxibenceno) se obtuvo un compuesto oleaginoso, de color amarillo pálido, el

cual se analizó por medio de la técnica de cromatografía de gases acoplado a espectrometría

de masas por impacto electrónico (GC/MS) obteniéndose el siguiente cromatograma de

iones totales (Figura 1):

Figura 1. Cromatograma de iones totales # 1.

Fuente: FODECYT 20-2006

Cromatograma de iones totales obtenido en la síntesis del 4-alil-1,2-dimetoxibenceno (metileugenol) a partir del 4-alil-2-

metoxifenol (eugenol), reacción A. Fuente: Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

En el cromatograma de iones totales # 1 se observa un pico con un tiempo de retención de

11.28 minutos, con un ion molecular M+ de 178, relación de masa/carga que representa el

peso molecular del 4-alil-1,2-dimetoxibenceno. El rendimiento de la reacción fue de 90%

(calculado según la abundancia relativa de iones totales en el cromatograma # 1) en el cual

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.000

5000000

1e+07

1.5e+07

2e+07

2.5e+07

3e+07

3.5e+07

4e+07

4.5e+07

5e+07

Time-->

Abundance

TIC: AV2588.D

42

se observa la poca formación de productos secundarios, obteniéndose así 3.7925g del 4-alil-

1,2-dimetoxibenceno.

Al 4-alil-1,2-dimetoxibenceno se le aplicó un análisis por medio de espectroscopía

infrarroja, para poder identificar al compuesto por medio de sus grupos funcionales,

obteniéndose el siguiente espectro (Figura 2):

Figura 2. Espectro infrarrojo # 1.

4-alil-1,2-dimetoxibenceno


Espectro del compuesto obtenido en la reacción A con tiempo de retención de 11.29min. Fuente: Unidad de Análisis

Instrumental (UAI) de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

En el espectro infrarrojo correspondiente al 4-alil-1,2-dimetoxibenceno, se observan dos

picos, uno a 1235.08 y otro a 1260.11 cm-1

, que son los característicos del estiramiento del

enlace –O–C– de los dos grupos metoxi presentes en la molécula.

En la región de 700 a 900cm-1

se observan tres picos uno a 765.89cm-1

que indica la

sustitución orto en el anillo bencénico, otro a 850.23cm-1

que es el correspondiente a la

43

sustitución para en el anillo, y uno a 807.4cm-1

que indica la sustitución meta en el anillo,

para la sustitución meta se encuentran generalmente dos picos, pero debido a que se

presentan varios traslapes en esta región el otro podría estar contenido dentro de alguno de

estos.

En la región del espectro comprendida entre 1700 y 2000cm-1

se observa la presencia varios

picos que son los correspondientes a la resonancia aromática, por lo que se puede afirmar la

existencia de un ciclo aromático, que es el anillo bencénico que posee el eugenol en su

estructura, que se confirma con los picos a 1513.76cm-1

y en 1464.04cm-1

, los cuales son

característicos de los enlaces dobles –C–C– en el anillo bencénico.

Los picos en 1852.21cm-1

y en 912.78cm-1

corresponden al enlace C-H del vinilo terminal,

así como los picos en 3076.01cm-1

y en 1639.18cm-1

que corresponden al doble enlace C–C

presente en este grupo funcional. Los picos en 2965.46cm-1

y en 2936.13cm-1

son los

correspondientes a los enlaces C–H del grupo metileno que posee la molécula.

De este espectro se puede afirmar que el compuesto se encuentra de forma pura, ya que no

existen rastros de la presencia de grupos hidroxilo que vendrían del eugenol utilizado como

sustrato, picos que se encontrarían en la región de 3200 a 3500cm-1

. (Pretsch et al. 1980).

Luego, al 4-alil-1,2-dimetoxibenceno sintetizado en la reacción anterior (reacción A), se le

aplicó una reacción de ruptura oxidativa (reacción B), de la cual se obtuvo como producto

un compuesto de color blanco.

Este compuesto se disolvió en metanol y se eliminó el solvente para obtener cristales del

compuesto. Se obtuvieron cristales transparentes con forma de aguja, característicos de los

ácidos carboxílicos.

A los cristales obtenidos se les aplicó el mismo procedimiento de análisis que al 4-alil-1,2-

dimetoxibenceno, cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas por impacto

electrónico (GC/MS), obteniéndose el siguiente cromatograma de iones totales (Figura 3):

44

Figura 3. Cromatograma de iones totales # 2.


Cromatograma de iones totales obtenido en la síntesis del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético a partir del 4-alil-1,2-

dimetoxibenceno (metileugenol), reacción B.

Fuente: Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

Se propone el mecanismo de fragmentación del metileugenol así (Fuente: FODECYT 20-2006):

OH3C

OH3C

Chemical Formula: C11H14O2•+

Molecular Weight: 178.23

O

OH3C

Chemical Formula: C10H11O2+


OH3C

OH3C



OH3C

Chemical Formula: C10H11O+


OCH3

Chemical Formula: C9H8•+




Chemical Formula: C7H7+

Molecular Weight: 91.13Chemical Formula: C7H7

+




C2H2HC C

En el cromatograma de iones totales # 2 se observan dos picos con tiempos de retención de

12.49 y 13.22 minutos, los cuales corresponden a iones moleculares M+ de 196 y M

+ de 182

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.000

2000000

4000000

6000000

8000000

1e+07

1.2e+07

1.4e+07

1.6e+07

1.8e+07

2e+07

2.2e+07

Time-->

Abundance

TIC: 2947.D

11.78

12.49

13.22

14.12 14.41

14.65 15.79

45

respectivamente, relaciones de masa/carga que representan el peso molecular del ácido

(3,4-dimetoxifenil)acético y el ácido (4-hidroxi-3-metoxifenil)acético.

La abundancia de los iones que se observa en el cromatograma de iones totales # 2 nos

indica la poca abundancia del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético contenida en los cristales

obtenidos después de aplicar el proceso de recristalización en metanol del compuesto

obtenido en la reacción B en comparación con la abundancia del ácido (4-hidroxi-3-

metoxifenil)acético, no siendo este último el compuesto de interés.

El patrón de fragmentación de ambos ácidos se propone así (Fuente: FODECYT 20-2006):

O

O

O

O

O

OH OH

O


Molecular Weight: 196.20Chemical Formula: C9H9O3

+


O

O

OH



CH3COOH

O



O C CH

CH

C CH

HC CH

C CH



CO



El porcentaje de rendimiento de esta reacción fue extremadamente bajo, del 5% (calculado

según la abundancia relativa de iones totales en el cromatograma # 2), obteniéndose

0.1920g del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético. Los cristales se analizaron por medio de la técnica

de cromatografía en capa fina para poder separar los compuestos que en estos se contenían,

O

O OH

O

CH3

CH3

ácido (3,4-dimetoxifenil)acético

OH

O OH

O

CH3

ácido (4-hidroxi-3-metoxifenil)acético

46

aplicándose variaciones en la composición de la fase móvil no obteniéndose así ninguna separación

(para ver las cromatografías ver el anexo H).

O

HO

H3C

O

OH O

O

H3C

CH2 O

HO

H3C C+

H

H

CH+O

HO

H3CC+

O

C9H10O4, m/z 182.06

COOH

H

C8H9O2+ m/z 137.16 C8H9O2

+ m/z 137.16

C6H7O2+ m/z 111.12

C2H2

HO C CH

CH

C

COCH3

C5H3O•+ m/z 79.08C5H3O•+ m/z 79.08

O C CH

CH

C CH

C5H3O•+ m/z 79.08

CO

HC CH

C CH

C4H3+ m/z 51.07

O

HO

H3C

O

OH O

HOO

OH

C8H7O4+ m/z 167.14C9H10O4, m/z 182.06

O C C

OH

CH

CH C CH

O CH

C

O

CH

CH C CH

C6H4O2+ m/z 108.09

O C CH CH

C CH

C5H3O+ m/z 79.08


Por medio de la técnica de cromatografía en capa fina no se observó separación alguna, por lo que

se procedió a realizar una extracción.

47

El procedimiento que se aplicó fue el necesario para realizar la extracción de ácidos carboxílicos

presentes en la mezcla por medio de una extracción simple con bicarbonato de sodio al 5%, luego,

esta fase se acidificó de nuevo con ácido clorhídrico hasta pH 7.

Los cristales ahora obtenidos se analizaron por medio de la técnica de cromatografía líquida de alta

presión (HPLC).

En el análisis de los cristales por medio de la técnica de cromatografía líquida de alta presión

(HPLC), se observa que en la separación se obtuvieron varios compuestos, de donde el compuesto

mayoritario tenía una pureza del 98.085%, que se presumía era el ácido carboxílico.

El cromatograma obtenido es el siguiente (Figura 4):

Figura 4. Cromatograma de composición # 1.


Cromatograma de los compuestos obtenidos en la separación de los ácidos carboxílicos obtenidos en la reacción B.

Fuente: Laboratorio de Fisicoquímica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

Los cristales obtenidos producto de la separación de la mezcla se analizaron por medio de

la técnica de espectroscopía infrarroja, obteniéndose el espectro anterior, el espectro

infrarrojo # 2.

48

En el análisis de los cristales obtenidos de la reacción B por medio de la técnica de

espectroscopía infrarroja (Figura 5), se observan dos picos, uno a 1235.8 y otro a 1269.07

cm-1

, que son los característicos del estiramiento del enlace –O–C– de los dos grupos

metoxilo presentes en la molécula. En la región de 700 a 900cm-1

se observan tres picos

uno a 756.45cm-1

que indica la sustitución orto en el anillo bencénico, otro a 780.00cm-1

que es el correspondiente a la sustitución para en el anillo, y uno a 767.93cm-1

que indica la

sustitución meta en el anillo, para la sustitución meta se encuentran generalmente dos picos,

pero debido a que se presentan varios traslapes en esta región el otro podría estar contenido

dentro de alguno de estos. En la región del espectro comprendida entre 1700 y 2000cm-1

se

observa la presencia varios picos que son los correspondientes a la resonancia aromática,

por lo que se puede afirmar la existencia de un ciclo aromático, que es el anillo bencénico

que posee el eugenol en su estructura, que se confirma con los picos a 1519.09cm-1

y en

1466.36cm-1, los cuales son característicos de los enlaces dobles –C–C– en el anillo bencénico.

Figura 5.Espectro infrarrojo # 2.


Espectro de los cristales obtenidos de la separación del compuesto obtenido en la reacción B.

Fuente: Unidad de Análisis Instrumental (UAI) de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

El pico en 2961.70cm-1

es el correspondiente al enlace C–H del grupo metileno que posee

la molécula.

49

En la región de 2800 a 3200cm-1

se observa una como pequeña inflexión, que es la que se

evidencia la existencia del grupo hidroxilo del ácido carboxílico.

Finalmente, el pico en 1683.64cm-1

es el característico de la presencia del doble enlace C-

O, del grupo carbonilo del ácido carboxílico. (Pretsch et al. 1980)

A los cristales crudos (sin tratamiento alguno previo) de ácido carboxílico, se les aplicó el

método de formación de amidas por catálisis con ácido bórico, para la obtención de los

compuestos propuestos a sintetizar por medio de la ruta sintética propuesta.

En la reacción D, se sintetizar la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida

(B), a partir de la reacción del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético con el 2-amino-p-cresol.

Al aplicar el procedimiento se obtuvo un sólido con un color café pálido, que se cristalizó

en metanol, obteniéndose cristales que presentaban las características de los cristales del

ácido (3,4-dimetoxifenil)acético.

Adicionalmente, luego de la purificación se aislaron pocos y pequeños cristales de

apariencia similar a los del ácido pero de color café claro, pero se encontraban en una

cantidad muy pequeña, que se asignan a 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-

metilfenil)acetamida (6) por el aparecimiento de un pico en m/z 311 (masa molecular de 6)

y m/z 151 junto con m/z 150 que representan los fragmentos [M-C8H8NO2]+

y [M-

C9H11O2]+

típicos de la fragmentación de la amida.

A esta mezcla de ambos tipos de cristales se les aplicó el mismo procedimiento de análisis

que a los dos compuestos intermediarios anteriores, cromatografía de gases acoplado a

espectrometría de masas por impacto electrónico (GC/MS), obteniéndose el siguiente

cromatograma de iones totales:

En el cromatograma de iones totales # 3 se observan varios picos con diversos tiempos de

retención.

50

Figura 6. Cromatograma de iones totales # 3


Cromatograma de iones totales obtenido en la síntesis de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida (B)

a partir del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético y el 2-amino-p-cresol, reacción D.


A continuación se presenta el cromatograma de iones totales # 3, y la tabla # 1, la cual

contiene el análisis de los compuestos encontrados después de realizar la interpretación

respectiva de los espectros de masas por impacto electrónico (ver anexo E, espectros del #4

al #13) de cada uno de los compuestos detectados en el cromatograma de iones totales # 3

(Tabla 1).

Tabla 1. Compuestos identificados en el cromatograma # 3.

Tiempo de

retención

Ion molecular M+

(relación masa/carga) Compuesto encontrado

10.78 123 2-amino-p-cresol

12.49 196 ácido (3,4-dimetoxifenil)acético

13.34 182 ácido (4-hidroxi-3-metoxifenil)acético

18.04 301 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida (B)


Fuente: Datos obtenidos experimentalmente en el Laboratorio de Toxicología

de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.000

5000000

1e+07

1.5e+07

2e+07

2.5e+07

3e+07

3.5e+07

4e+07

4.5e+07

5e+07

Time-->

Abundance

TIC: 2948.D

8.54

8.97

10.66

10.78

11.55

12.49

13.11

13.34

13.67

18.04

51

La señal que tiene un tiempo de retención de 18.04 minutos se asignó a la 2-(3,4-

dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida (6), ya que en su espectro de masas por

impacto electrónico, posee un ion molecular M+ de 301 umas que es el peso molecular de

esta amida y fragmentos a m/z 179 (M-amina)+ y m/z 122 (el catión de la amina

correspondiente). Debido al tan bajo rendimiento de esta reacción (5%, calculado según la

abundancia relativa de iones totales en el cromatograma de iones totales # 3), se obtuvieron

0.01327g de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida.

El rendimiento global para la síntesis de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-

metilfenil)acetamida (6) por medio de la ruta sintética propuesta fue de 0.00225%

(calculado en base a la multiplicación de cada uno de los porcentajes de rendimiento

individuales de las reacciones involucradas), obteniéndose cantidades muy pequeñas y

difíciles de separar con las técnicas tradicionales de cromatografía, por lo que no se llevó a

cabo la separación para poder realizarle otras pruebas de identificación a este compuesto,

tales como Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de protón (RMN-1H) y de carbono

(RMN-13

C).

Se propone la fragmentación del compuesto 6 así (Fuente: FODECYT 20-2006):

52

O

OHN

O

H3C

H3C

OH

CH3

Chemical Formula: C17H19NO4•+


O

OH3C

H3C

C O

HN

OH

CH3



O

OH3C

H3C



O

OH3C



O

O



O

OHN

O

H3C

H3C

OH

CH3

O

O HNH3C

H3C

OH

CH3

CO

Chemical Formula: C8H8NO2+




HN

OH

CH3

Chemical Formula: C7H8NO+


OH

CH3

Chemical Formula:

C7H7O+

Molecular Weight:

107.13

CO NHCO

O

O

H3C



H3CO

O



C2H3

O C CH

CH

C CH HC CH

C CH

OCH3

Chemical Formula: C5H3O•+




CO

53

En la reacción E, se sintetizaría la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-il)acetamida

(7), a partir de la reacción del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético con el 3-amino-5-

metilisoxasol.

Al aplicar el procedimiento se obtuvo un sólido con un color levemente amarillento, que se

cristalizó en metanol, obteniéndose cristales que presentaban las características de los

cristales del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético, de apariencia similar a los del ácido, de color

amarillo claro, pero en muy pequeña cantidad, que se asignan a los cristales de la 2-(3,4-

dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-il)acetamida (7).

El ion molecular m/z 276 y los fragmentos m/z 151 y m/z 125 correspondientes a la pérdida

de [M-C5H5N2O2]+ y [M-C8H8NO2]

+ respectivamente, típicos de la fragmentación de la

amida.

A este compuesto obtenido (mezcla de ambos tipos de cristales) se le procedió a realizar un

análisis por medio de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas por

impacto electrónico (GC/MS), obteniéndose el cromatograma de iones totales # 4, en el

cual se observan varios picos con diversos tiempos de retención. A continuación se

presentan los compuestos encontrados después de realizar la interpretación respectiva de

los espectros de masas por impacto electrónico de cada uno de los compuestos detectados

en el cromatograma de iones totales # 4 (Tabla 2 y Figura 7).

Tabla 2. Compuestos identificados en el cromatograma # 4.

Tiempo de

retención

Ion molecular M+

(relación masa/carga) Compuesto encontrado

12.50 196 ácido (3,4-dimetoxifenil)acético

13.34 182 ácido (4-hidroxi-3-metoxifenil)acético


Fuente: Datos obtenidos experimentalmente en el Laboratorio de Toxicología de la

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

54

Figura 7. Cromatograma de iones totales # 4


Cromatograma de iones totales obtenido en la síntesis de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-il)acetamida (C) a

partir del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético y el 3-amino-5-metilisoxasol, reacción E.


Adicionalmente no se observan en el espectro de masas por impacto electrónico,

fragmentos que indiquen que la amida se formó, como (m/z 98, 3-amino-5-metilisoxasol),

encontrándose los fragmentos característicos del ácido carboxílico utilizado como materia

prima.

A continuación se describe en una tabla las propiedades de los compuestos intermediarios

obtenidos en el desarrollo de la ruta sintética propuesta.

Tabla 3. Ppropiedades de los compuestos intermediarios

Propiedad

Compuesto

Punto de

fusión

(°C)

Punto de

ebullición

(°C)

Color Estado

Índice de

refracción /

polarización

4-alil-1,2-dimetoxibenceno ---

260-267°C

(determinado

a 680mmHg)

Café claro Líquido

oleaginoso ---

Ácido 2-(3,4-dimetoxifenil)acético 110-116°C --- Amarillo pálido Cristales ---


Fuente: Datos obtenidos experimentalmente en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales de la


6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.000

5000000

1e+07

1.5e+07

2e+07

2.5e+07

3e+07

3.5e+07

4e+07

4.5e+07

5e+07

Time-->

Abundance

TIC: 2990.D

8.53

12.06

12.50

13.34

13.52

55

El compuesto 5 (FD 05-06), se sintetiza de acuerdo al siguiente esquema:

La reacción es típica.

El alqueno se oxida con permanganato de potasio, convierte en el cloruro de ácido

respectivo y convierte en la amina por la reacción de Tang y colaboradores (Tang, P..

2004).

La molécula se caracteriza por su espectro infrarrojo y sus fragmentos en m/z 202 que

corresponde al ion molecular y m/z 117 de fórmula C8H5O+ es decir,[M-C4H9N2]

. que

representa la pérdida de la piperazina.

Los compuestos orgánicos 1, 2, 3 y 4 se sintetizaron de acuerdo al procedimiento de

Terekado y colaboradores (ver secciones III.d, III.e y III.F).

Se mezclan 0.03 moles del ácido con 0.003 mole de Acido Bórico, se refluja en unos 80 mL

de tolueno durante 2 horas.

Se añade luego 0.03 moles de la amida correspondiente y deja reflujar durante 16 horas

aproximadamente hasta que se formen los cristales de la amida.

La amida es recristalizada en metanol y caracterizada.

56

Síntesis de Amidas 1 a 4.


La amida FD 01-06 se caracteriza por sus fragmentos a m/z 247, su ion molecular y

fragmentos a m/z 150 y m/z 97, correspondientes a la pérdida de [M-C4H5N2O] y [M-

C8H6O3] respectivamente.


fragmentos a m/z 150 y m/z 122, correspondientes a la pérdida de [M-C7H8NO] y [M-





57




Es de hacer notar que por la similitud estructural entre los compuestos 1 y 3 y 2 y 4, sus

patrones de fragmentación son casi idénticos.

Las pruebas de inhibición enzimática mostraron los siguientes resultados (Tabla 4):

Tabla 4. Actividad in vitro contra la Enzima Acetilcolinesterasa**

Amida Actividad*

(FD 01-2006) ++++

(FD 02-2006) +++

((FD 03-2006) ++++

(FD 04-2006) +++

(FD 05-2006) +++

(FD 06-2006) +++

(FD 07-2006) ++++

*Se compara la máxima inhibición (++++) del compuesto (1,3 y 7) con los compuestos (2,4,5 y 6).

**Martson, A.; Kissling, J.; Hostettmann, K. A Rapid TLC Bioautographic Method for the Detection of

Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Inhibitors in Plants. Phytochemical Analysis, 2002, 13, 51-54.


58

III.2 Discusión de Resultados

Se procedió a la síntesis de las tres moléculas propuestas a partir del eugenol por medio de

la formación de amidas vía reacción directa del ácido carboxílico y la amina

correspondiente catalizadas por ácido bórico.

La primera reacción, la metilación de eugenol, utiliza sulfato de dimetilo como agente

metilante, la mezcla se lleva a reflujo y luego se acidifica.

En el procedimiento propuesto se describe que precipita el compuesto metilado al

acidificar, pero debido a la naturaleza del sustrato se separó de la mezcla un compuesto

oleaginoso, el 4-alil-1,2-dimetoxibenceno, el primer intermediario de la ruta sintética.

Según el cromatograma de iones totales # 1 se puede observar que no existió la formación

significativa de productos secundarios de reacción, ya que se observa una sola señal

abundante con un tiempo de retención de 11.28 que corresponde al 4-alil-1,2-

dimetoxibenceno, identificado por su ion molecular a m/z 178 y fragmentos a m/z 163 (M-

CH3)+ y m/z 91 (el ion tropilio respectivo). El rendimiento de esta reacción fue del 90%,

porcentaje muy semejante al reportado en la literatura consultada, que es de 89-92%

(Mauthner, 2004). Se identificó el compuesto por medio de la obtención e interpretación de

su espectro infrarrojo (Espectro infrarrojo # 1), en el cual se observaron los picos

característicos de los grupos funcionales de este compuesto.

Para la obtención del segundo compuesto intermediario, el ácido 2-(3,4-

dimetoxifenil)acético, se aplicó al 4-alil-1,2-dimetoxibenceno una reacción de ruptura

oxidativa de dobles enlaces con permanganato de potasio por medio de catálisis de

intercambio de fase. En el procedimiento de ruptura oxidativa original, después de agitar la

mezcla se debe proceder a tratarla con bisulfito de sodio y con ácido clorhídrico diluido,

pero al llevar a cabo esta parte del procedimiento, no se separaron los cristales del ácido

como debiera ser, debido a que los porcentajes de rendimiento que se obtuvieron para esta

reacción fueron demasiado bajos (5%), y se formaban pequeños cristales que no se

separaban del óxido de manganeso que es subproducto de la reacción.

Por lo anterior, previo a tratar la mezcla resultante se aplicó la modificación propuesta al

procedimiento (ver sección E de Materiales y Métodos).

59

El cromatograma de iones totales # 2, indica la presencia de dos ácidos carboxílicos, el

ácido (3,4-dimetoxifenil)acético y el ácido (4-hidroxi-3-metoxifenil)acético.

De la interpretación de la abundancia de los iones, se puede inferir que se encuentra en

mucha mayor proporción el ácido (4-hidroxi-3-metoxifenil)acético que el ácido 2-(3,4-

dimetoxifenil)acético, siendo este último nuestra molécula de interés.

Se obtuvo un porcentaje de rendimiento del 5%, y según la bibliografía revisada debía ser

del 92% (Hudlický, 1990; Herriot, Picker, 1974).

Se separaron los ácidos carboxílicos obtenidos en la mezcla por medio de la aplicación de

una extracción simple con una base, bicarbonato de sodio al 5%. Se filtró y la fase acuosa

se neutralizó con ácido clorhídrico, precipitando de nuevo cristales. Los cristales obtenidos

fueron analizados por medio de la técnica de cromatografía líquida de alta presión (HPLC)

observándose un solo compuesto mayoritario (con una pureza del 98.085%), al cual se le

aplicó una análisis por medio de la técnica de espectroscopía infrarroja, de donde se obtuvo

el Espectro infrarrojo # 2, en el cual se identificó el ácido (3,4-dimetoxifenil)acético, ya que

no se detectó la presencia de grupos hidroxilo provenientes de fenoles presentes en el ácido

(4-hidroxi-3-metoxifenil)acético.

Después de obtener los intermediarios de la ruta sintética propuesta, se procedió a realizar

la última reacción, la de formación de amidas; y mediante la aplicación de esta se deberían

obtener las moléculas orgánicas objeto de este estudio.

Esta reacción, que es de reciente publicación, propone la reacción de una amina con un

ácido carboxílico por medio de la catálisis del ácido bórico. Al aplicar el procedimiento en

la síntesis de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-1-[(2R,6S)-2,6-dimetilpiperidin-1-yl]etanona (A) no

hubo reacción, ya que al final del procedimiento se indica que se debe lavar el compuesto

obtenido con agua, y al lavarlo este se disolvió.

Como resultados de la aplicación de esta misma reacción se obtuvieron, en la síntesis de la

2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida (6) un compuesto de color café

pálido y en la síntesis de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-il)acetamida (7) un

compuesto de color blanco amarillento, compuestos que fueron sometidos posteriormente a

análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas por impacto

electrónico.

60

De la interpretación de los espectros de masas por impacto electrónico obtenidos, en el

espectro de iones totales # 3, se determinó que se logró sintetizar la 2-(3,4-dimetoxifenil)-

N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida (6) (señal con tiempo de retención de 18.04) y cuyo

espectro de masas por impacto electrónico posee el ion molecular M+ con m/z de 301 y los

fragmentos a m/z 179 (M-amina)+ y m/z 122 (el catión de la amina correspondiente).

La amida (6) se obtuvo en cantidades muy pequeñas, con un porcentaje de rendimiento del

5%. El porcentaje del rendimiento global de la síntesis de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-

hidroxi-5-metilfenil)acetamida (6) es del 0.00225%, porcentaje de rendimiento

extremadamente bajo, y se lograron sintetizar 0.01327g de esta.

En el cromatograma de iones totales # 4 no se identificó la formación de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-

(5-metilisoxasol-3-il)acetamida (7).

En todos los espectros de masas por impacto electrónico se comprobó la existencia de dos ácidos

producto de la reacción de ruptura oxidativa con permanganato de potasio, el ácido (3,4-

dimetoxifenil)acético y el ácido (4-hidroxi-3-metoxifenil)acético, de pesos moleculares de 196 y

182 respectivamente, lo cual indica que una parte del eugenol no se metiló en el momento de aplicar

la reacción de metilación con sulfato de dimetilo o bien, el 4-alil-1,2-dimetoxibenceno se demetiló

debido a las condiciones de la aplicación de la reacción de ruptura oxidativa.

En los cromatogramas de iones totales # 2, 3 y 4 se observa que el ácido (4-hidroxi-3-

metoxifenil)acético se encuentra en mucha mayor proporción que el ácido (3,4-

dimetoxifenil)acético.

Las moléculas 1, 2, 3, 4 y 5 se sintetizaron por el mismo protocolo (Tang, P. 2004), una

aproximación novedosa de la reacción de formación de amidas a partir del ácido carboxílico

correspondiente de una forma directa, sin tener que convertir el ácido carboxílico en su cloruro de

acilo respectivo.

La reacción de inhibición contra las enzimas Acetilcolionesterasa y Butirlcolinesterasa, muestra que

los grupos 1,3-benzodioxol y metilisoxazol incrementan la capacidad de inhibición de las amidas.

En ambas enzimas, el test cualitativo de Marston arrojó los mismos resultados con cada uno de las

amidas estudiadas.

Las Propiedades Farmacofóricas serán analizadas en detalle para determinar el potencial de cada

amida en su interacción “in silico” con ambas enzimas.

61

III.2.4 Modelaje Molecular y Propiedades Farmacofóricas.

III.2.4.1 4-alil-1,2-dimetoxibenceno

Boiling Point: 520.885 K

Critical Pressure: 25.8985 bar

Critical Temperature: 722.804 K

Critical Volume: 560.5 cm.cm.cm/mol

Heat of Formation: -195.79 Kcal/mol at 25 C

Henry's Law Constant: 2.9518 log[unitless]

Ideal Gas Thermal Capacity: 221.467 J/(mol.K) at 25 C

and 1 Atm.

LogP: 3.21

Melting Point: 307.39 K

Molar Refractivity: 53.2717 cm.cm.cm/mol

Standard Gibbs Free Energy: 12.73 kJ/mol

Vapor Pressure: 0. Pa at 25 C

Water Solubility: 2.91005e-321 mg/L

Property Server: CLogP

Molar Refractivity: 5.2884

Partition Coefficient (Octanol/Water): 2.873

III.2.4.2 Ácido (3,4-dimetoxifenil)acético

Boiling Point: 599.976 K Critical Pressure: 30.1233 bar





Ideal Gas Thermal Capacity: 223.072 J/(mol.K) at 25 C

and 1 Atm.

LogP: 1.671



Standard Gibbs Free Energy: -427.44 kJ/mol


Water Solubility: 0. mg/L




62

III.2.4.3 2-(3,4-dimetoxifenil)-1-((2R,6S)-2,6-dimetilpiperidin-1-il)etanona







Ideal Gas Thermal Capacity: 357.707 J/(mol.K)

at 25 C and 1 Atm.

LogP: 2.4729









III.2.4.4 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida







Ideal Gas Thermal Capacity: 342.577

J/(mol.K) at 25 C and 1 Atm.

LogP: 2.6286









III.2.4.5 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-il)acetamida







63

Ideal Gas Thermal Capacity: 305.081 J/(mol.K) at 25 C and 1 Atm.

LogP: 1.7561





Water Solubility: 0. mg/L




III.2.4.6 Farmacóforo de la Amida 1 (FD01-06).

III.2.4.7 Farmacóforo de la Amida 2 (FD02-06).

64

III.2.4.8 Farmacóforo de la Amida 3 (FD03-06)



65



Clave.

Esferas rojas y verdes: Zonas de influencia de grupos polares como Nitrógeno y Oxígeno que poseen pares de electrones no compartidos que pueden “donar”. Se

diferencian en la “profundidad” de ubicación.

Esferas amarillas: Zonas de influencia de grupos apolares (lipofílicos)

Esferas cafés: Zonas de influencia de grupos lipofílicos en sitios de mayor

“profundidad” de ubicación.

Esferas azules: Zonas de alta densidad electrónica como en sistemas aromáticos.

66

PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES

1. Se sintetizaron a partir de eugenol los dos intermediarios de reacción de la ruta

sintética propuesta: el 4-alil-1,2-dimetoxibenceno y el ácido (3,4-

dimetoxifenil)acético, con rendimientos del 90% y del 5% respectivamente,

obteniéndose 3.7925g de 4-alil-1,2-dimetoxibenceno y 0.192096g de ácido (3,4-

dimetoxifenil)acético.

2. Se sintetiza N-(5-metilisoxazol-3-yl-)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida (1) por

medio de la ruta sintética propuesta.

3. Se sintetiza N-(2-hidroxi-4-metilfenil)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida (2) por


4. Se sintetiza N-(3-metilisoxazol-5-yl)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida (3) por medio

de la ruta sintética propuesta.

67

5. Se sintetiza N-(2-hidroxi-5-metilfenil)-1,3-benzodioxol-5-carboxamida (4) por


6. Se sintetiza 1-(1,3-benzodioxol-5-yl-carbonil)piperazina (5) por medio de la ruta

sintética propuesta.

7. Se sintetiza 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida (6) por


8. Se sintetiza 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxazol-3-yl)acetamida (7) por medio

de la ruta sintética propuesta.

68

9. Las amidas 1 a 7, muestran inhibición contra las enzimas Acetilcolinesterasa y

butirilcolinesterasa en el ensayo Autobiográfico en Cromatografía en capa Fina

(Martson, J. 2002).

10. Se exploraron rutas sintéticas nuevas para la síntesis de estas piperamidas y

similares, se planteará en otra investigación el uso de reacciones de condensación

aldólica como la de Perkin y Knoevanegel.

11. La inhibición de ambas enzimas fue más evidente en las amidas 3 y 7 que contienen

el grupo metil isoxazol. Sin embargo el compuesto 3 es ligeramente mejor inhibidor

de ambas enzimas, probablemente por la rigidez que le brinda el grupo 1,3-

benzodioxol.

12. Se realizaron estudios de modelaje molecular y propiedades farmacofóricas de los 7

compuestos sintetizados.

69

IV.2 RECOMENDACIONES

Tratar de optimizar la reacción de formación de amidas por medio de la catálisis con

ácido bórico, para lograr obtener mejores porcentajes de rendimiento en la

obtención de amidas.

Investigar otros procedimientos de obtención de amidas para poder sintetizar las

amidas de interés.

Realizar otras pruebas de actividad inhibitoria “in vitro” contra ambas enzimas de

las amidas 3 y 7.

Efectuar estudios farmacofóricos más profundos sobre estas amidas y moléculas

análogas para explorar su potencial actividad biológica.

70

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Phenserine-Based-Selective Inhibitors of Butyrilcholinesterase for Alzheimer’s

Disease. Journal of Medicinal Chemistry, 1999, 42, 1855-1861.

74

IV.4 ANEXOS

Anexo 1

Vistas del cerebro, arriba con Alzheimer, abajo un cerebro sano

Fuente: Liliana Dtchamp. Alzheimer. Disponible en www.monografías.com

Anexo 2

TABLA 1: Algunos datos referentes a las enfermedades demenciales en personas mayores de 40 años en

Guatemala.

1981 *1 1997 *2 2005 *2

Enfermedad de Alzheimer 4063 11055 16582

Otras demencias 4966 13511 20267

Total demencias 9029 24566 36849

1. Según censo poblacional 1981, Guatemala Opening the Mind (indicadores) Alzheimer's

Disease Society -ADS-, julio 1996. Proyecciones poblacionales estimadas (indicadores) -

ADS-, julio 1996.

2. Proyecciones estimadas según Bureau of the census. Center for International Research,

U.S. Department of Commerce. Fuente: Asociación Grupo ERMITA

75

Anexo 3

Estructura de algunos de los compuestos utilizados como inhibidores de la

acetilcolinesterasa

Inhibidores pseudo-irreversibles

76

Inhibidores irreversibles

Inhibidores tipo-análogos de estados de transición

77

Inhibidores reversibles

78

Fuente: Marco, José L. [En línea]. Inhibidores clásicos y nuevos inhibidores de la acetilcolinesterasa para tratar la

enfermedad de Alzheimer.

<http://www.farmaindustria.es/farmaweb/7pb43811prod.nsf/0/1a9b17d293445a6cc1256ce50045b670/$FILE/cap08.pdf>

[Consulta: 6 octubre 2005].

79

Anexo 4:

Espectros de masas por impacto electrónico de los compuestos encontrados en los cromatogramas

de iones totales obtenidos en la aplicación de cada una de las reacciones descritas para la ruta

sintética propuesta.

Cromatograma de iones totales y espectro de masas por impacto electrónico obtenido en la síntesis

del 4-alil-1,2-dimetoxibenceno (metileugenol) a partir del 4-alil-2-metoxifenol (eugenol), reacción

A.

Cromatograma de iones totales # 5

Cromatogramas de iones totales del compuesto obtenido en la reacción A.


Espectro de masas # 1

Espectro de masas del compuesto obtenido en la reacción A con tiempo de retención de 11.29min. Fuente: Laboratorio de

Toxicología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

11.00 11.20 11.40 11.60 11.80 12.00 12.20 12.40 12.60 12.80 13.00 13.200

5000000

1e+07

1.5e+07

2e+07

2.5e+07

3e+07

3.5e+07

4e+07

4.5e+07

5e+07

Time-->

Abundance

TIC: AV2588.D

10.99

11.28

11.69 11.90 11.97 12.27 12.39 12.59 12.74 12.88 13.23

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

m/z-->

Abundance

Scan 570 (11.273 min): AV2588.D178

91

147

65

115

326254207 285 481229 503

80

Espectros de masas por impacto electrónico obtenidos en la síntesis del ácido (3,4-

dimetoxifenil)acético a partir del 4-alil-1,2-dimetoxibenceno (metileugenol), reacción B.


Espectro de masas del compuesto obtenido en la reacción B con tiempo de retención de 12.49min. Fuente: Laboratorio de



Espectro de masas del compuesto obtenido en la reacción B con tiempo de retención de 13.22min. Fuente: Laboratorio de


50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

700000

750000

m/z-->

Abundance

Scan 681 (12.492 min): 2947.D165 196

79

51

125

104281254 341 401 461227 303 533431368

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

m/z-->

Abundance

Scan 748 (13.226 min): 2947.D182

111

79

51

139

240209 284161 345 415315 388263 482 524446

81

Espectros de masas por impacto electrónico obtenido en la síntesis de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-

hidroxi-5-metilfenil)acetamida (B) a partir del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético, reacción D.


Espectro de masas del compuesto obtenido en la reacción D con tiempo de retención de 8.54min. Fuente: Laboratorio de





50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 320 (8.536 min): 2948.D109

81

53

267182208 477135 310 436237 346 388 527

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#16531: Phenol, 2-methoxy- (CAS) $$ Guaiacol $$ o-Methoxyph109

81

53

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 360 (8.975 min): 2948.D133

78

51

104

182 312337 457271209 537503384 420236

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#22471: Furo[2,3-c]pyridine, 2-methyl- (CAS) $$ 2-Methylfur133

78

104

51

82







50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 525 (10.782 min): 2948.D123

78

51

100 182 355207 267147 401232 327296 444 473 549

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#16190: Phenol, 4-amino-3-methyl- (CAS) $$ 4-Amino-m-cresol123

94

52

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 514 (10.662 min): 2948.D123

78

51

182160100 285 322 372 402207 542247

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#16225: Phenol, 3-amino-2-methyl- (CAS) $$ 3-Amino-o-cresol123

94

3961

83







50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 681 (12.491 min): 2948.D165 196

79

51 125

105 281223 256 343314 367 432 498

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#80130: Benzoic acid, 3,4-dimethoxy-, methyl ester (CAS) $$165 196

7951 125

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 595 (11.549 min): 2948.D179

211

59

89149

123256 323 415 499355 526283 387

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#63360: 2-METHYLAMINO-5-METHOXY-4-METHYL-BENZALDEHYDE $$ Be179

150

77 120

84







0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 737 (13.105 min): 2948.D182

111

77

51 139

240207 281 355160 313 412 449 487388

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#66319: Benzoic acid, 3,4-dimethoxy- (CAS) $$ 3,4-Dimethoxy182

11151 77

15139

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 759 (13.346 min): 2948.D182

111

79

51

139

240209 281 355327 388 419 503304 446 534

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance


11151 77

15139

85







50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 1159 (18.031 min): 2948.D269

226

1837751

134107 157 206 356327 386 415301249 507436

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#152427: 9(10H)-Acridinone, 1,3-dimethoxy-10-methyl- (CAS) $269

226196

155

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 762 (13.682 min): 2948.D182

1117751

139240209 281 355160 313 429401 461 505 534

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#66418: Uracil, 1-butyl-6-methyl- (CAS) $$ 1-N-BUTYL-6-METH182

126

48

96

86

Espectros de masas por impacto electrónico obtenidos en la síntesis de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-

(5-metilisoxasol-3-il)acetamida (C) a partir del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético, reacción E.


Espectro de masas del compuesto obtenido en la reacción E con tiempo de retención de 8.53min. Fuente: Laboratorio de





50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 319 (8.531 min): 2990.D109

81

53

355267182 207133 495153 323235 379 404 443

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#16531: Phenol, 2-methoxy- (CAS) $$ Guaiacol $$ o-Methoxyph109

81

53

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 641 (12.058 min): 2990.D151

182

1235279

207 281 341 401252 535376 474

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#66312: Benzoic acid, 4-hydroxy-3-methoxy-, methyl ester (C151

182

12352

79

87







0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 681 (12.497 min): 2990.D165 196

79

12551

225 281102 253 494318341368 401 440 525

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#80126: Benzoic acid, 3,4-dimethoxy-, methyl ester (CAS) $$196165

79

51 13710715

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 736 (13.099 min): 2990.D182

111

77

51 139

240209 281 341160 312 365 401 431 505472

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance


11151 77

15139

88







50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

Scan 758 (13.340 min): 2990.D182

111

79

51

139

240209 281 355313159 429385405261 475 509334

50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#67985: .beta.-(.alpha.,.alpha.-dimethyl-propargyl)indole182

180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 5400

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

2200000

2400000

2600000

2800000

3000000

3200000

3400000

3600000

3800000

m/z-->

Abundance

Scan 761 (13.523 min): 2990.D - CORRUPT182

240209 281256 355326 429298 373 401 460 489 529544

89

Cromatograma de iones totales y espectro de masas por impacto electrónico del 2-amino-p-cresol.


Cromatograma de iones totales del 2-amino-p-cresol.



Espectros de masas del 2-amino-p-cresol con tiempo de retención de 10.59min. Fuente: Laboratorio de Toxicología de la


9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.500

5000000

1e+07

1.5e+07

2e+07

2.5e+07

3e+07

3.5e+07

4e+07

Time-->

Abundance

TIC: 3419.D

10.59

10.78

11.52

40 60 80 1001201401601802002202402602803003203403603804004200

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

m/z-->

Abundance

Scan 507 (10.591 min): 3419.D123

78

94

51

160179 255201 429303220

90


Espectros de masas del 2-amino-p-cresol con tiempo de retención de 10.78min. Fuente: Laboratorio de Toxicología de la


Cromatograma de iones totales y espectro de masas por impacto electrónico del 3-amino-5-

metilisoxasol.


Cromatograma de iones totales del 3-amino-5-metilisoxasol. Fuente: Laboratorio de Toxicología de la Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacia.

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 4000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

m/z-->

Abundance

Scan 524 (10.777 min): 3419.D123

78

94

51

149 179 355197 382250 402216 327280

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

6500000

Time-->

Abundance

TIC: 34120.D

7.50

8.05

8.28 8.33 10.64 10.68 14.35

91


Espectro de masas del 3-amino-5-metilisoxasol con tiempo de retención de 7.978min. Fuente: Laboratorio de Toxicología

de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 4200

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

1300000

1400000

1500000

1600000

m/z-->

Abundance

Scan 269 (7.978 min): 34120.D98

55

82 123 199 333 419265152 378

Anexo 5:

Propuestas de fragmentación de los compuestos obtenidos en la aplicación de las reacciones de

síntesis para la identificación de los compuestos obtenidos.

Propuesta de fragmentación del 4-alil-1,2-dimetoxibenceno

Propuesta de fragmentación del ácido (3,4-dimetoxifenil)acético

OH3C

OH3C



O

OH3C



OH3C

OH3C



OH3C



OCH3






Molecular Weight: 91.13Chemical Formula: C7H7

+




C2H2HC C

93

O

O

O

O

O

OH OH

O


Molecular Weight: 196.20Chemical Formula: C

9H

9O

3+


O

O

OH



CH3COOH

O



O C CH

CH

C CH

HC CH

C CH

Chemical Formula: C5H

3O+


CO



94

Propuesta de fragmentación del ácido (4-hidroxi-3-metoxifenil)acético

O

HO

H3C

O

OH O

O

H3CCH2 O

HO

H3C C+

H

H

CH+O

HO

H3CC+

O

C9H10O4, m/z 182.06

COOH

H

C8H9O2+ m/z 137.16 C8H9O2

+ m/z 137.16

C6H7O2+ m/z 111.12

C2H2

HO C CH

CH

C

COCH3

C5H3O•+ m/z 79.08 C5H3O•+ m/z 79.08

O C CH

CH

C CH

C5H3O•+ m/z 79.08

CO

HC CH

C CH

C4H3+ m/z 51.07

O

HO

H3C

O

OH O

HOO

OH

C8H7O4+ m/z 167.14C9H10O4, m/z 182.06

O C C

OH

CH

CH C CH

O CH

C

O

CH

CH C CH

C6H4O2+ m/z 108.09

O C CH CH

C CH

C5H3O+ m/z 79.08

95

Propuestas de fragmentación de la 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida y de

la 2-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida

OH

O NH

O

CH3

OH

CH3

H

O

O NH+

O

CH3

CH3

OH

CH3

H

OH

O CH NH2

+

O

CH3

OH

CH3

O

O CH NH2

+

O

CH3

CH3

OH

CH3

NH2

+

OH

CH3

C16

H17

O4N

m/z = 287

C17

H19

O4N

m/z = 301

C7H

9ON

m/z = 123

2-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-N-(2-hidroxi-

5-metilfenil)acetamida

2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metil

fenil)acetamida

96

O

OHN

O

H3C

H3C

OH

CH3

Chemical Formula: C17H19NO4•+


O

OH3C

H3C

C O

HN

OH

CH3



O

OH3C

H3C



O

OH3C



O

O



O

OHN

O

H3C

H3C

OH

CH3

O

O HNH3C

H3C

OH

CH3

CO

Chemical Formula: C8H8NO2+




HN

OH

CH3

Chemical Formula: C7H8NO+


OH

CH3

Chemical Formula:

C7H7O+


CO NHCO

O

O

H3C



H3CO

O



C2H3

O C CH

CH

C CH HC CH

C CH

OCH3

Chemical Formula: C5H3O•+




CO

97

Anexo H: Cromatografías obtenidas en los análisis aplicados a los compuestos intermediarios

sintetizados en la ruta sintética

Cromatoplaca # 1. Fase móvil: hexano-acetato de etilo, proporción 1:1. Longitud de onda 254nm.

Cromatoplaca # 2. Fase móvil: hexano-acetato de etilo-diclorometano, proporción 1:2:2.

Longitud de onda 254nm.

98

Cromatoplaca # 3. Fase móvil: hexano-acetato de etilo-diclorometano, proporción 2:2:1.

Longitud de onda 254nm.

En todas las cromatoplacas el orden de los compuestos es el siguiente:

1. 3-amino-5-metilisoxasol

2. 2-amino-p-cresol

3. 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(2-hidroxi-5-metilfenil)acetamida (B)

4. 2-(3,4-dimetoxifenil)-N-(5-metilisoxasol-3-il)acetamida (C)

5. Ácido (3,4-dimetoxifenil)acético

Y, para la primer cromatoplaca, la primera muestra aplicada es una mezcla de los cinco

compuestos.

99

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO

Monto del Proyecto: Q. 246,928.00

Monto Ejecutado: Q. 220,428.00

Renglones no ejecutados:

122. Impresión, encuadernación y reproducción. Q. 500.00

158. Derecho de bienes intangibles. Q. 18,000.00

189. Otros estudios y/o servicios. Q. 3,000.00

245. Libros, revistas y periódicos. Q. 5,000.00

Los renglones presupuestarios 122 y 189 fueron absorbidos por la Unidad Ejecutora del

proyecto como parte de la contrapartida.

El renglón 158, presupuestado para adquirir software de última generación para realizar

modelaje molecular, no pudo utilizarse por las dificultades de adquirirse con los

requerimientos de la legislación guatemalteca relacionada con compras al exterior.

En Guatemala ninguna empresa calificada ofreció el producto.

Las mismas razones no permitieron utilizar el renglón 245, presupuestado para adquirir

revistas científicas arbitradas internacionalmente.

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