CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA

INFORME FINAL

PROYECTO FODECYT No. 088-2006

“DETECCIÓN DE VIRUS COMUNES EN CRISANTEMO UTILIZANDO

PRUEBAS ELISA EN SAN JUAN Y SAN PEDRO SACATEPÉQUEZ,

GUATEMALA”

SARA BARRIOS

Investigador Principal

GUATEMALA, 31 ENERO DE 2008

ii

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EQUIPO DE INVESTIGACIÓN

Lcda. Sara Barrios- Investigador Principal

Lcda. Margarita Palmieri- Investigador Asociado

Inga. Agr. Mónica Espinoza- Investigador Asociado

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AGRADECIMIENTO

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero de la línea

FODECYT, dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La

Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología -CONCYT-.

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OTROS AGRADECIMIENTOS

Se agradece también el apoyo del Instituto de Investigaciones de la Universidad del

Valle de Guatemala, especialmente al Departamento de Protección Vegetal, en cuyos

laboratorios se llevó a cabo el diagnóstico del material colectado durante el trabajo de campo.

Finalmente, pero no menos importante, se agradece a las comunidades de San Juan y San

Pedro Sacatepéquez y en especial a los productores de crisantemo por la ayuda brindada al

presente estudio. Gracias por permitirnos ingresar a sus invernaderos y por la atención que nos

brindaron.

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INDICE

Página

ÍNDICE DE FIGURAS

ÍNDICE DE CUADROS

ÍNDICE DE GRÁFICAS

RESUMEN

VII

IX

IX

X

ABSTRACT XI

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3

I.2.1 Antecedentes en Guatemala 3

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación 5

I.3 OBJETIVOS 7

I.3.1 General 7

I.3.2 Específicos 7

I.3.3 Hipótesis 7

I.4 METODOLOGÍA 8

PARTE II

II.1 MARCO TEORICO 13

II.2 RESULTADOS 35

II.2.1 Discusión de resultados 46

PARTE III

III.1 CONCLUSIONES 52

III.2 RECOMENDACIONES 53

III.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54

III.4 ANEXOS

Anexo 1

Anexo 2

Anexo 3

Anexo 4

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Ilustración de morfología de crisantemo (Chrysanthemum

coccineum de Chrysanthemum roseum Web. / Mohr.)

Figura 2. Crisantemos tipo uniflor y spray cultivados en San Juan

Sacatepéquez.

Figura 3. Ilustración de distintos tipos de inflorescencia de

crisantemos.

Figura 4. Crisantemos de la variedad Pinocho blanco, del área de San

Pedro Sacatepéquez.

Figura 5. Daño causado por Septoria chrysanthemi y daño causado por

Cercospora chysabthemi.

Figura 6. Daño causado por mildiu polvoriento.

Figura 7. Rosas mostrando infección con moho gris y flores de

crisantemo mostrando el moho gris.

Figura 8. Hojas con síntomas de roya (P. chrysanthemi) y síntomas de

roya causada por Puccinia horiana.

Figura 9. Daño causado por Psedomonas cichorii.

Figura 10. Tallos con daño causado por Erwinia carotovora.

Figura 11. Hojas con daño foliar cuasado por nemátodos.

Figura 12. Daño ocasionado por Fusarium.

Figura 13. Daño foliar por Vertycillium.

Figura 14. Sintomatología foliar clásica de Didymella ligulicola.

Figura 15. Sintomatología característica de Stemphylium lucopersici.

Figura 16. Síntomas causados por el viroide del enanismo del

crisantemo (CSVd) en crisantemo, síntomas en hojas, diferencia en

tamaño y floración de dos crisantemos infectados por el CSVd

comparados con un crisantemo sano y síntomas en las flores.

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Figura 17. Microscopía electrónica de partículas de TAV, daño foliar

causado por TAV en lechuga y daño causado por TAV a la flor del

crisantemo.

Figura 18. Síntomas causados por el virus del crisantemo (CVB).

Figura 19. Sintomatología de virus TSWV en hojas de Aster y en la

planta.

Figura 20. Síntomas de Aster yellows en crisantemo y resultados en

fotografía de crisantemos.

Figura 21. Esquema de principio de ELISA y de procedimiento de

ELISA competitivo por antígeno de captura.

Figura 22. Inclusiones virales ocasionadas por TSWV (tospovirus).

Figura 23. Inclusiones virales ocacionadas por CMV (cucumovirus).

Figura 24. Esquema de electroforesis de poliacrilamida (PAGE).

Figura 25. Invernadero cerrado visitado en la zona 3, San Pedro

Sacatepéquez, plantación techada visitada en el área de San Juan y

plantación a campo abierto visitada en la aldea Bellavista en San Pedro

Sacatepéquez.

Figura 26. Síntomas mostrados por plantas de crisantemo en campo.

Figura 27. Mapa de distribución del virus de la aspermia del tomate

(TAV) en el área de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.

Figura 28. Mapa de distribución del virus B del crisantemo (CMB) en

el área de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.

Figura 29. Mapa de distribución del virus del bronceado del tomate

(TSWV) en el área de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.

Figura 30. Síntomas presentados por plantas de tomate injertadas con

crisantemo contaminado con TAV, CVB y TSWV

Figura 31. Clorosis y mosaico en crisantemos con TAV.

Figura 32. Síntomas de necrosis tanto en tallo como en hojas.

Figura 33. Síntomas de TSWV y CVB, Síntomas de Erwinia

chrysanthemi con manchas bastante acuosas y grandes.

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ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Reacciones de tinción de los constituyentes de la célula

hospedera en tejidos vegetales.

Cuadro 2. Incidencia de los tres virus encontrados en el área de

estudio.

Cuadro 3. Frecuencia aparición de virus y resultado de la prueba X2

Cuadro 4. Número de plantas infectadas con alguno de los 3 tres virus

encontrados según rango de altitudes en ambos departamentos.

Cuadro 5. Número de plantas según cada categoría mostrada en

gráfica 5

Cuadro 6. Plantas indicadoras utilizadas y virus inoculados

ÍNDICE DE GRÁFICAS

Gráfica 1. Resultados del número de plantas infectadas con alguno

de los cinco virus estudiados en San Juan y San Pedro Sacatepéquez,

Guatemala, 2007.

Gráfica 2. Incidencia de CVB, TAV y TSWV a diferentes rangos de

altitudes en San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala en 2007.

Gráfica 3. Porcentaje de la presencia de los tres virus encontrados en

plantas infectadas con 1 sólo virus.

Gráfica 4. Porcentaje de plantas de crisantemo infectadas por uno,

dos y tres virus en San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala,

2007.

Gráfica 5. Porcentaje de plantas infectadas con CVB-TAV, CBV-

TSWV y TAV-TSWV.

Gráfica 6. Porcentaje de infecciones por 1, 2, ó 3 virus comparadas

con las sanas en los dos rangos de altitud muestreado en los

municipios de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala,

durante 2007.

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RESUMEN

El crisantemo es un cultivo de gran importancia económica en varias partes del mundo,

especialmente en China. En Guatemala, en las poblaciones de San Juan y San Pedro

Sacatepéquez se trabajan alrededor de 25 variedades de esta flor, la cual ocupa el tercer lugar en

las exportaciones de flores de corte a los Estados Unidos. Estos dos municipios son

considerados las principales zonas productoras del país. A pesar de esto, hasta ahora no se

habían realizado estudios acerca de las enfermedades virales que pueden estar afectando las

plantaciones de crisantemo en esas áreas. El objetivo de este estudio fue la detección de los virus

más comunes reportados en el cultivo de crisantemo y determinar su incidencia y distribución

dentro del área trabajada. Para lograrlo se realizaron varias visitas a los campos de cultivo de

San Juan y San Pedro Sacatepéquez, en donde se detectaron visualmente síntomas de

enfermedad y se tomaron muestras de material vegetal. Este material fue diagnosticado

mediante pruebas ELISA en el laboratorio de Protección Vegetal de la Universidad del Valle de

Guatemala. En todos los campos trabajados se detectó la presencia del virus del bronceado del

tomate (TSWV), el cual ya había sido reportado en Guatemala pero no para esta área. También

se encontró el Virus de la Aspermia del Tomate (TAV) y el Virus B del Crisantemo (CVB) los

cuales no habían sido reportados para el país.

El CVB fue el virus predominante (89%), en ambas regiones, seguido por TAV (60%) y

TSWV presente en el 8% de los casos. Se encontraron que las infecciones por dos virus

simultáneamente en los crisantemos predominaron (53%), siendo la asociación de CVB y TAV

la que predominó (97%). Se encontró en un 6% de los casos infección triple e infecciones sin

asociación a otro virus en un 34%. La prueba de Ji cuadrado no mostró diferencia significativa

para la distribución de los virus en la zona de trabajo por lo que se concluye que su distribución

es homogénea en el área de estudio.

xi

ABSTRACT

Chrysanthemum is a crop of great economical importance in many parts of the world,

especially China. In Guatemala, it is the third more important cut flower product of exportation

to the United States. San Juan and San Pedro Sacatepéquez grow around 25 varieties; these two

towns are the most important places for chrysanthemum production in Guatemala. Nevertheless,

viral diseases were not tested in those plantations until now. The main objective of this study

was the detection of the most common viruses already reported for this type of flower and to

determine their incidence and distribution in the area. Field samples of leaves from plants with

viral symptoms in all fields of the area were taken and were tested by ELISA at the Plant

Protection Laboratory at the Universidad del Valle de Guatemala. Tomato Spotted Wilt Virus

(TSWV) was found. This virus was already reported in Guatemala but for a different crop and

another location. We also found two viruses not reported previously for Guatemala: Tomato

Aspermia Virus (TAV) and Chrysanthemum Virus B (CVB).

El CVB was the most predominant virus in the fields of both regions (89%), followed by

TAV (60%); TSWV was present in only 8% of the cases. We found that infection with two

viruses at the same time was more frequent in chrysanthemums (53%), with the association

between CVB y TAV the most predominant (97%). We found in 6% of the cases triple infection

and infections with only one virus in 34% of the cases. No significant difference was found in

the distribution of the viruses between the two localities using Chi Square. We concluded that

the distribution of the viruses in the zone where we sampled was homogeneous.

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

El crisantemo es una flor ornamental que ha sido considerada como representante

de culturas como la japonesa o la china. Es una flor llena de simbolismo, es utilizada

tradicionalmente en el Día de los Difuntos en coronas y arreglos florales en Guatemala y

algunos países latinos, pero en otros países es una planta ornamental muy utilizada en

varias ocasiones. En países asiáticos como Japón y China es utilizada en ceremonias

rituales y representa longevidad. Es una flor muy resistente que permanece viva por

varios días en los arreglos y es fácil de cultivar en el campo. Se presenta en varios

colores, formas y posee buen aroma aunque no es perfumado. Esto se debe a que se

conocen más de 200 especies e innumerables variedades, tanto que los crisantemos

actuales pueden considerarse como híbridos. Además, es importante mencionar que tiene

propiedades medicinales y este aspecto es muy apreciado y de gran utilidad.

El crisantemo es originario de China en donde ha sido empleado ornamentalmente

desde hace más de dos mil años. Su cultivo se trasladó a Japón donde se convirtió en una

flor sagrada que se utiliza en ceremonias, es un símbolo de larga vida. El crisantemo fue

introducido en Europa a través de Francia en el último tercio del siglo XVIII (Infoagro

2003). Según Horst (1990) en Estados Unidos se volvió un cultivo predominante

alrededor del año 1820, siendo establecido como planta de invernadero alrededor de 1850

(Anmirato et al. 1990). No se tienen datos exactos de cuándo empezó el cultivo de esta

planta en Guatemala, pero se cree que a principios del siglo pasado ya era cultivado en

pequeñas huertas familiares y jardines. Más tarde fue cultivado en pequeñas parcelas de

la región de San Juan y San Pedro Sacatepéquez para suplir la demanda del país

(Orellana com. pers. 2006). Este cultivo ha representado para estas comunidades la

oportunidad de comercializar no sólo a nivel nacional sino a nivel centroamericano e

internacional, ayudando a aumentar sus movimientos financieros e involucrando a

diversos sectores de las poblaciones. Actualmente, el crisantemo ha adquirido

importancia económica para el país ya que es una de las flores de corte con mayor

demanda para la exportación a Estados Unidos, ocupando el tercer lugar en importancia

en exportación de flores de corte.

En los últimos años, el crisantemo ha sufrido algunas enfermedades,

principalmente hongos han sido identificados, sin embargo, se han presentado algunos

síntomas similares a éstos de los cuales no se han podido identificar patógenos. La

sintomatología, la facilidad de transmisión de los síntomas a plantas indicadoras y la

forma de aparición de los síntomas, nos hicieron pensar que algún virus podría estar

involucrado en esta patología. Esto nos estimuló a proponer este proyecto para poder

ayudar en la identificación de los posibles virus que estaban afectando a este cultivo y

sobre todo para poder proponer alguna medida de control y principalmente preventiva

para lo que se identificara. Estimamos también que sería muy conveniente poder elaborar

un manual en forma de trifoliar informativo para que los agricultores tuvieran

información sobre lo que estaba sucediendo o que podía suceder de acuerdo a los

síntomas, virus y vectores que se identificaran.

2

El crisantemo para San Pedro Sacatepéquez y para San Juan Sacatepéquez es de

mucha importancia ya que tienen el clima y la tierra adecuada para su siembra. La

comunidad se ha agrupado en cooperativas y/o asociaciones para propiciar una mejor

producción y para poder optar a mercados más fuertes e importantes como grupo. Esta

forma de producción ha ayudado a que el crisantemo sea considerada por la AGEXPORT

(http://www.negociosgt.com/main.php?id= 22&show_item=1&id_area=98), en el año

2005, como una de las principales flores de corte para la exportación. Una asociación

que ha tenido mucho impacto en estas poblaciones es la de ASOFLORSA (Asociación de

Floricultores Sanjuaneros). Este estudio fue hecho principalmente con la colaboración de

los socios de ASOFLORSA.

ASOFLORSA colaboró en este estudio prestando sus terrenos para que se

hicieran los muestreos, dando información sobre la forma como ellos llevan a cabo el

cultivo, lo cortan y lo comercializan. Así también colaboraron brindando facilidades para

poder fotografiar sus plantaciones y las diferentes variedades de crisantemo. Así

pudimos observar de cerca una producción de crisantemo que es apoyada por muchos

agricultores en la que participan todos los miembros de la familia.

La producción de crisantemo es muy importante para los agricultores de estas

comunidades y la presencia de enfermedades o de vectores de enfermedades hace que la

producción sea más difícil, elevando los gastos de la cosecha y evitando obtener las

ganancias planificadas. Los virus son entidades subcelulares que no pueden eliminarse

fácilmente agregando un químico, porque generalmente los químicos que afectan a los

virus también hacen daño a las células vivas o a los organismos. Por esto, es necesario

saber la identidad de lo que queremos controlar o eliminar. Hay un dicho que dice que es

necesario conocer al enemigo para poderlo controlar. En cuanto a virus, es importante

conocer características de ellos pero también características como su forma de

transmisión, su rango de hospederos, si existen diferentes cepas y otros aspectos. Por lo

tanto, en este proyecto trataremos de identificar los virus únicamente para saber quién

puede ser su probable vector. Con esto, podemos orientar el control y la prevención

hacia el vector del virus identificado para romper el ciclo de transmisión o de dispersión.

Se eliminarán las plantas infectadas, es decir, se eliminará el inóculo y los pocos vectores

presentes no podrán encontrar inóculo viral y no habrá infección ni dispersión del mismo.

Por lo tanto, la enfermedad desaparecerá de los campos de cultivo.

Hay varias formas de control y/o prevención que se explican más adelante, éstas

podrán ser de mucha utilidad para el manejo de estas enfermedades y sobre todo para

prevenir la presencia de ellas en el campo. Creemos que si se manejan los cultivos

adecuadamente, principamente mediante medidas de prevención y utilizando no sólo un

acercamiento sino uno integrado, estas enfermedades virales disminuirán o desaparecerán

en el mejor de los casos, ayudando a que la producción sea mejor, sin tantos gastos y sin

riesgos para la salud y el ambiente

3

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes en Guatemala.

Las enfermedades causadas por virus son y han sido históricamente las causantes

de grandes pérdidas económicas en cultivos, tanto agrícolas como ornamentales. Los

virus se dispersan con suma facilidad en las áreas a las que han logrado ingresar debido a

que son transmitidos por vectores cuando éstos se alimentan. Además, son capaces de

permanecer en un área dada aún en ausencia de cultivos ya que son capaces de utilizar

malezas y plantas silvestres como hospederos. En el caso de los crisantemos, el problema

se agrava debido a que la forma tradicional de reproducción es por medio de esquejes,

con lo que las plantas de cada nuevo ciclo de cultivo son clones de las del ciclo anterior y

si éstas están contaminadas con virus, las nuevas también lo estarán. Cuando un virus se

ha introducido en un campo de cultivo, o en un invernadero, no es posible tratar las

plantas para eliminarlo, la única solución es eliminar todas las plantas infectadas.

Este proyecto se propuso para llevarse a cabo en San Pedro y San Juan

Sacatepéquez y para evaluar la presencia de virus debido a que en los años 2005 y 2006,

se reportaron pérdidas en el cultivo de crisantemo entre el 10 y el 90% debido a una

enfermedad que no se sabía su identidad y su origen. Esta enfermedad no había sido

reportada y no se pudo aislar hongos o bacterias de las muestras. Los síntomas

coincidían con los que produce el virus del bronceado del tomate (TSWV) por la necrosis

en tallos y hojas y por aparecer principalmente durante la floración. Se consideró que la

identificación del patógeno era muy importante para poder saber qué medidas preventivas

y de manejo se podían aplicar y sobre todo porque el TSWV es un virus de cuarentena en

varios países, al menos para tomate. Era de aprovechar este proyecto para poder

identificar otros virus reportados en la literatura para determinar si estaban presentes en

estos campos ya que muchos virus no se presentan aislados y no siempre hay un solo tipo

de vector de estas enfermedades. Además, en el crisantemo hay otros virus que pueden

transmitirse sistémicamente que afectarían la reproducción por esquejes. Esto nos daría

un panorama más completo y el manejo del cultivo tendría una visión más amplia y

adecuada a la realidad.

Por esto, en este proyecto se trabajó bajo la premisa que en el área de estudio no

se encontraba ningún cultivo libre de virus, no importando cuál virus de los estudiados

fuera, pero que podría causar pérdidas económicas a los agricultores. Esta premisa surgió

porque la forma como reproducen al crisantemo año con año no es con semillas sino es a

través de esquejes que no se sabe si están o no infectados por virus antes de

reproducirlos. Para demostrarlo se escogieron los cinco virus más comunes en

crisantemo reportados en la literatura, para detectarlos en el área trabajada. Se realizaron

muestreos espaciados a lo largo de un año, para cubrir las diferentes estaciones climáticas

y ver si éstas afectan de alguna manera la presencia y/o distribución de los diferentes

virus o si las mismas permanecen invariables a lo largo del año. Los muestreos se

realizaron viajando al área de estudio y visitando todos los campos de crisantemo que se

encontraron y a los que nos dieron permiso de entrar, de esta manera se cubrió la mayor

área posible. ASOFLORSA fue la asociación que nos puso en contacto con los

4

agricultores al inicio. Esta asociación fue fundada el 14 de junio del 2005 y es no

lucrativa. Está conformada por 50 socios que se dedican a la comercialización de

crisantemos de variedades no definidas y de rosas. Tienen un invernadero en común con

sistema de riego pero cada socio tiene unidades productivas en sus viviendas. La

asociación está formada por productores de nueve comunidades de San Juan

Sacatepéquez que son beneficiarios del Programa de Encadenamientos Empresariales de

AGEXPORT. Los productores miembros de esta Asociación se dedican a fortalecer el

manejo empresarial de la producción, así como la parte agronómica (nuevas variedades,

mejoramiento de imagen, inocuidad y buenas prácticas agrícolas). Esta asociación espera

que mediante la generación de empleo e ingresos se mejore la competitividad y ofertas

productivas para apoyar la reducción de pobreza y el desarrollo económico de la región.

Las variedades de crisantemos que ellos producen se encuentran en el siguiente enlace: http://www.tikoj.com/index.php?option=com_content&view=article&id=48&Itemid=62&lang=e

s.

5

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

La mejor justificación para este trabajo es la necesidad y preocupación

evidenciadas por los agricultores de San Pedro y San Juan Sacatepéquez al llegar a

solicitar la realización de este trabajo. ASOFLORSA fue durante todas las etapas del

proyecto un valioso aliado. Como evidencia de la importancia que tiene esta actividad

para estos agricultores están los datos que ellos mismos publican en su página web

(http://www.encadenamientosempresariales.com/Portal/

Home.aspx?tabpath=Questionaries%2fCompanyDetail&CID=27&companyName=ASOF

LORSA&CategoryName=\ASOFLORSA&tabPathBack=Encadenamientos%2fEncadena

mientos+Empresariales), en los cuales ellos establecen los montos anuales de ventas de la

Asociación y de los socios, que están alrededor de $50,000 a $60,000.00. Cada socio

recibe anualmente entre $3,750.00 a $4,250.00 y el número de personas que están

vinculadas a esta actividad es aproximadamente de 150. Esta actividad es de suma

importancia para la comunidad ya que cuenta con mercados tanto locales como

centroamericanos que debe conservar.

El desconocimiento de esta enfermedad ha causado muchos problemas en la

producción de crisantemo, a tal punto que abandonaron el cultivo de algunas variedades

muy buenas para comercializar pero que les estaban causando muchas pérdidas, esto a

pesar de estar tratando de aplicar medidas adecuadas. Sin embargo, para esta enfermedad

o grupo de enfermedades, las prácticas fitosanitarias fueron inadecuadas, el mal manejo

de las plantaciones y la reproducción asexual de plantas de crisantemo infectadas por

virus, condujo a la rápida diseminación de plagas y enfermedades virales dentro de los

campos de cultivo. Esto causó grandes problemas y pérdidas económicas a los

productores, en el caso del crisantemo. De las enfermedades reportadas para este cultivo,

los virus conforman un grupo de gran importancia. Las infecciones por virus provocan

deformaciones, cambios de color y tamaño de plantas, flores y hojas, así como la muerte

temprana no sólo de plántulas individuales sino también la pérdida de tablones enteros.

Estas deformaciones, cambios de color y de tamaño conducen a la reducción de la calidad

y cantidad de flor de corte producidas. En Guatemala, el cultivo de crisantemo está

considerado como uno de los cultivos más prometedores para exportación, pero para

comunidades como San Juan y San Pedro Sacatepéquez quienes se dedican a sembrar

flores de corte para exportación y el crisantemo es uno de los más cotizados, es más

importante aún. El crisantemo es una buena fuente de ingresos tanto para estas

comunidades como para el país. En los últimos años las importaciones de flores de corte

y follajes de Estados Unidos provenientes de Guatemala han alcanzado importantes

posiciones con respecto a otros abastecedores de este mercado. En el caso de flores de

corte y capullos frescos, Guatemala tiene un 1.5% de participación en el mercado,

ocupando la tercera posición a nivel mundial. En lo que respecta a flores de corte, los

crisantemos ocupan el tercer lugar en la preferencia del mercado estadounidense

(AGEXPRONT et al. 2006). Este mercado se caracteriza por ser altamente competitivo y

por tener un comportamiento estacional. Aunque la mayoría de flores frescas cortadas no

requieren permisos de entrada, todo embarque es revisado en las aduanas para determinar

la ausencia de plagas o enfermedades (AGEXPRONT et al. 2006). Debido a esto es

6

importante tener control sobre las enfermedades que puedan encontrarse en las

plantaciones de flores de corte.

Aunque en Guatemala se han reportado diversos síntomas indicadores de virus en

los campos cultivados, sobre todo en las zonas de San Juan y San Pedro Sacatepéquez,

hasta ahora no se había realizado un estudio formal de la presencia y distribución de

ninguno de los virus que afectan al crisantemo comúnmente. Hasta ahora se desconocía

tanto la presencia como la incidencia y síntomas típicos de los virus de la aspermia del

tomate, bronceado del tomate y virus B del crisantemo en campos de cultivo de la

principal zona productora de Guatemala. En el presente proyecto se trabajó sobre la

sospecha de que en el área de trabajo existía la presencia de virus en las plantaciones

debido a muestras que fueron enviadas al Laboratorio de Protección Vegetal para ser

analizadas. Es por esto que se consideró de suma importancia su estudio.

Las técnicas ELISA, junto con la caracterización de síntomas en plantas

indicadoras, son los métodos más frecuentemente utilizados para la detección y

diagnóstico de virus en cultivos hortícolas y ornamentales. Ambas técnicas presentan

ventajas, como el hecho de ser relativamente simples de realizar, bajo costo económico

(comparado con técnicas de extracción de ADN) y su confiabilidad, una vez han sido

estandarizadas. En este trabajo se propone la utilización de ambas técnicas de manera

complementaria, es decir, realizando diagnósticos de los virus por medio de ensayos

serológicos y caracterizando sus síntomas producidos en plantas indicadoras en

condiciones de invernadero.

7

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

1.3.1.1 General

Detectar, por medio de pruebas ELISA, la presencia de virus en los campos de

cultivo de crisantemo de las zonas de San Juan y San Pedro Sacatepéquez.

I.3.1.2 Específicos

Determinar la incidencia de los virus estudiados en los campos de cultivo de la

zona trabajada.

Caracterizar los síntomas producidos por los virus estudiados en plantas

indicadoras.

Determinar la distribución de los virus estudiados y hacer un mapa preliminar de

la misma en la zona estudio.

Elaborar un manual preliminar con los resultados obtenidos.

I.3.2 Hipótesis:

Los crisantemos de San Juan y San Pedro Sacatepéquez no están infectados por

virus.

La distribución de los virus en San Juan y San Pedro Sacatepéquez no es

uniforme.

8

I.4 METODOLOGÍA

1.4.1 Localización y condiciones atmosféricas:

San Juan Sacatepéquez se encuentra a 1,845 metros sobre el nivel del mar

(msnm) y tiene una extensión de 242 km2. Las temperaturas oscilan de 15 a 23°C

durante el año (http://medicina.ufm.edu/cms/es/san-juan-sacatepequez). San Pedro

Sacatepéquez se encuentra a 2,033 msnm y tiene una extensión de 48 km2. Su clima va

de templado a frío durante el año (http://info.worldbank.org/etools/docs/library/130392

/Guatemala%20-%20San%20Pedro%20 Sacatep%E9quez.pdf). Los datos de latitud de

los lugares muestreados se encuentran en el Anexo 1 de este informe. No se tomaron

datos de humedad relativa ni de temperatura ya que no eran relevantes para el estudio

(ver anexo 1).

1.4.2 Las variables:

I.4.2.1 Variables dependientes: Las variables dependientes son los tres virus

encontrados, TSWV, TAV y CBV.

I.4.2.2 Variables independientes: Estas variables los dos departamentos y la

distribución de los virus.

1.4.3 Indicadores:

El indicador principal es la presencia o ausencia de los diferentes virus en las

diferentes plantaciones de crisantemo.

1.4.4 Estrategia metodológica

1.4.4.1 Población y muestra: Para este proyecto se necesitaron hacer varios viajes

de colecta a los departamentos de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, municipios de

Guatemala, en el carro de doble tracción del Departamento de Biología de la Universidad

del Valle de Guatemala. Se realizaron 9 viajes. En estos viajes, se colectaron muestras

de tallos y hojas en bolsas plásticas sin aire dentro de una hielera o en macetas con tierra

si se traía a la planta entera. Se tomaron datos de georreferencia y de altitud con un GPS

marca Garmin modelo Etrex Color, los cuales se registraron en una base de datos en la

cual se colocaron los datos de la localidad, número de colecta y variedad (cuando se

conocía). Asimismo se detectaron visualmente los síntomas de posibles infecciones

causados por virus en plantas de crisantemo de diferentes variedades. Las plantas

muestreadas se encontraban en distintas etapas de desarrollo. Se tomaron fotos de las

plantas que presentaban síntomas de infección. El muestreo fue dirigido a sintomatología

y se colectaron por lo menos 10 plantas cada visita. Esto fue aproximadamente un 2%

del total de plantas encontradas con síntomas. El número varió de acuerdo a los síntomas

encontrados. Los síntomas se clasificaron según si las plantas presentaron manchas

necróticas, clorosis en el borde de las hojas, deformación en hojas nuevas, manchas

moradas en el tallo, enanismo y algunas que no presentaron síntomas pero parecían

9

enfermas. Se recolectaron también algunas muestras de plantas que estaban alrededor de

la planta con síntomas para detectar la posible enfermedad prematuramente.

I.4.5 El método:

El material colectado se llevó a la Universidad del Valle de Guatemala en donde

se le asignó un número de identificación de laboratorio y se registraron en la base de

datos del proyecto. Seguidamente, se almacenaron las muestras a 4 grados centígrados

deshidratadas en casos o se sembraban en macetas si venían en bolsas de tierra, hasta su

evaluación.

Las muestras fueron analizadas mediante pruebas de ELISA directo con kits de la

casa AGDIA, Inc. La técnica utilizada aparece en el anexo 2. Se corrieron pruebas para

el virus de la aspermia del tomate (TAV), virus del mosaico del pepino (CMV), virus del

bronceado del tomate (TSWV), virus de la mancha necrótica de Impatiens (INSV) y virus

B del crisantemo (CVB). El diagnóstico se realizó en las instalaciones del laboratorio de

virología en el departamento de Protección Vegetal de la Universidad del Valle de

Guatemala, el cual proveyó el siguiente equipo: lavador automático de placas ELISA,

lector de placas ELISA, cuarto frío para el almacenaje de las muestras, micropipetas,

cristalería y algunos químicos para los amortiguadores utilizados.

Los resultados completos obtenidos se colocaron en una tabla de Excel (apéndice

1), la cual fue utilizada para realizar el mapeo tanto de los sitios visitados como de los

virus encontrados en cada uno de ellos. Para llevar a cabo esta actividad se utilizó el

programa DIVA-GIS, el cual puede obtenerse libremente en internet.

El trabajo de invernadero se llevó a cabo en las instalaciones del inverdadero C de

la UVG, en donde se obtuvieron las plantas indicadoras utilizadas. En este proyecto se

utilizaron: Nicotiana glutinosa, N. clevelandii, N. tabacum, Lycopersicum esculentum,

Phaseolus vulgaris y Datura stramonium. Durante el trabajo de invernadero se tomaron

muestras de las plantas que salieron positivas para los diferentes virus y se realizaron

inoculaciones mecánicas e injertos. Estas se tuvieron en observación durante 40 días para

evaluar y documentar el desarrollo de síntomas. Para las inoculaciones mecánicas se

diluyó el inóculo (tejido infectado por virus) en un amortiguador de fosfatos con un pH

básico (8) y se frotaron sobre la superficie de las hojas de las plantas indicadoras

previamente rociadas con carborumdum para causar heridas en las hojas y facilitar la

penetración del virus al interior de las plantitas. Se hicieron anotaciones de las

observaciones diarias después de la inoculación y luego cada 3 días.

I.4.5.1 Pruebas llevadas a cabo en las muestras colectadas:

I.4.5.1.1 Pruebas del ensayo inmunosorbente ligado a una enzima (ELISA):

La prueba de ELISA fue hecha a todas las muestras colectadas. Fue un ensayo directo de

doble sandwich, es decir, que se usó un anticuerpo dirigido al virus específico tanto antes

de agregar la muestra como después para determinar si había presencia de virus o no.

Este método se basa en reacciones de antígeno-anticuerpo que se explicarán con más

10

detalle en el marco teórico. Se usó un kit diferente para cada virus ya que los anticuerpos

son muy específicos. La descripción detallada de la técnica se encuentra en el apéndice

2. Se utilizó un lector de ELISA marca Biotek, modelo ELx800, un lavador de placas

marca BioRad modelo 1575 Immuno-wash, micropipeta multicanal marca Eppendorf

Research modelo Multi-8channel 30-300 ul y micropipetas individuales de diferentes

voúmenes (0-20 ul, 20-200 ul y 100-1000 ul) marcha Eppendorf Research. Los kits de

ELISA fueron de la casa AGDIA y traían las placas para la prueba incluídas.

I.4.5.1.2 Inoculación mecánica a plantas indicadoras o bioensayos: La técnica

de plantas indicadoras aunque usada hace mucho tiempo, sigue siendo una de las más

exactas. Esta metodología puede tener variantes y las más usadas son la inoculación

mecánica y los injertos. En esta técnica se usan generalmente plantas herbáceas para que

los resultados se obtengan más rápidamente pero pueden ser usadas algunas plantas

leñosas jóvenes. Lo que se busca es transmitir los síntomas que tenía la planta infectada

a una planta sana y que se cumplan los principios de Koch. Se usa no un solo tipo de

plantas sino varias que se haya comprobado que presentan reacciones diferentes a la

presencia del virus. Antiguamente se usaban baterías de 10 o más plantas, en la

actualidad se seleccionan menos pero que se conozca que presentan reacciones diferentes

con diferentes virus. Esta técnica puede llevarse a cabo no sólo utilizando carborundum

o una lejía, puede llevarse a cabo mediante la inyección del extracto con el mismo búfer

directamente a la vena o al tronco de la plántula, al xilema o al floema. Para llevar a cabo

estas técnicas se procede como se describe en el anexo 3. Las plantas indicadoras

utilizadas fueron: Lycopersicum esculentum, Datura stramonium, Chenopodium quinoa,

C. amaranticolor, Nicotiana tabacum, Nicotiana clevelandii, N. tabacum, N. glutinosa

Phaseolus vulgaris.

Si es un virus restringido a floema o un virus inestable o en baja concentración, es

más fácil obtener la transmisión por medio de la técnica de injerto. El injerto es la

operación por la cual una parte de la planta se une a otra planta (una es el pie y la otra es

la variedad). A la planta sana que es el pie se le injerta un trozo de la planta enferma para

transmitir la infección

En cuanto a los tipos de injerto son muy variados, siendo unos métodos más

aconsejables que otros para determinadas plantas o para la época en que se realicen. En

general destacaremos como más usuales y de una manera simplificada los siguientes:

I.4.5.1.2.1 Injerto de aproximación

I.4.5.1.2.2 Injerto de hendidura

I.4.5.1.2.3 Injerto a la inglesa

I.4.5.1.2.4 Injerto en plancha

I.4.5.1.2.5 Injerto de escudete o de yema

I.4.5.1.2.1 Injerto de aproximación: Es el más fácil y el que usan la mayoría de los

viveristas para dar robustez a las plantas ornamentales. Consiste en unir entre sí 2

plantas afines.

11

I.4.5.1.2.2 Injerto de hendidura o púa terminal o lateral: Se mete la estaca dentro

de un corte longitudinal en el patrón realizado previamente procurando que la

corteza del patrón y la de la estaca se toquen, a fin de que el cambium de ambos

pueda unirse. Este tipo de injerto recibe este nombre porque la parte a injertar es

una estaca, es decir, una rama pequeña en la que hay 2 ó 3 yemas. Puede

injertarse una sola vez o con varias púas. En la púa lateral se realiza un corte en

el patrón y en una cara de la estaca del injerto para introducirla en este corte.

I.4.5.1.2.3 El injerto a la inglesa: Aquí tanto el patrón como el injerto tienen

diámetros iguales o similares. Se hace un corte en bisel en ángulos inversos en

cada una de las ramas (patrón e injerto) en uno de los extremos, el largo será

mayor a 3 veces el diámetro de la rama.

http://www.bonsai-arte-viviente.com/los_injertos.html

I.4.5.1.2.4 Injerto de parche o plancha: Se hacen 4 cortes hasta formar un

rectángulo de una longitud aproximada a un tercio del diámetro del árbol y una

profundidad suficiente como para llegar al fondo de la corteza. Se procede de la

misma forma en el vástago y se acopla la corteza de éste al patrón, rematándolo

con una cinta selladora.

12

I.4.5.1.2.5 Escudete o de yema: es uno de los más utilizados y produce un

porcentaje muy elevado de éxitos. Sobre la corteza del patrón se realiza un corte

donde se acopla la yema cortada, este corte puede ser de T o T invertida. Se

introduce en la T la yema. Al finalizar se sella con cinta aislante o cualquier

material sellador para que se fijen bien las partes.

En el proyecto se utilizó el de púa terminal porque se trabajó con plántulas

pequeñas de más o menos 15 a 20 días. El injerto de púa terminal es mucho más fácil de

utilizar porque sólo se elimina la parte terminal, se hace un corte y se introduce en este

corte la punta de la púa que se formó con la ramita de la planta a injertar (la infectada).

Todas las ramas y hojas nuevas aparecerán con síntomas si hubo transmisión.

13

PARTE II

II.1 MARCO TEORICO

II.1.1 Descripción del cultivo de crisantemo:

El género Chrysanthemum pertenece a la familia Asteraceae. Sus hojas pueden

estar recubiertas de un polvo fino blanquecino que le da un color grisáceo y generalmente

son aromáticas. Lo que se conoce como flor es realmente una inflorescencia en capítulo

(Infoagro 2003). Esta clase de inflorescencia está formada por dos tipos de flores:

femeninas (radiales) y hermafroditas (concéntricas, que corresponden a las centrales). El

receptáculo es plano o convexo y está rodeado de una envoltura en brácteas (Infoagro

2003). Ver Figura 1.

Figura 1: Ilustración de morfología de crisantemo (Chrysanthemum coccineum de

Chrysanthemum roseum Web. & Mohr.).

Fuente: Grieve M, en: www.botanical.com/botanical/mgmh/p/pelper21-l.jpg

Los crisantemos presentan gran diversidad de colores, tamaños y formas de flor.

Pueden cultivarse de dos formas: tipo uniflor (eliminando las yemas axilares para

producir una sola flor terminal) o tipo spray (permitiendo el desarrollo de las yemas

axilares y eliminando la yema terminal) (Figura 2).

14

Figura 2. Crisantemos tipo uniflor (a) y tipo spray (b) cultivados en el área de San Juan

Sacatepéquez.

a) b)

Fuente: FD 088-2006 (Foto Sara Barrios 2007). Fuente: FD 088-2006 (Foto Sara Barrios 2007).

Según su forma, este tipo de inflorescencia se puede clasificar en:

Sencillas (comúnmente conocidas como Shasta): tipo margarita, compuestas de

una o dos hileras de flores radiales y con flores hermafroditas centrales.

Anémonas: flores concéntricas tubulares y alargadas.

Recurvadas: en forma globular, con flores recurvadas hacia adentro.

Reflejas: forma redonda con flores radiales doblándose hacia adentro y abajo.

Araña, pluma, cuchara, hirsuta: flores radiales se doblan hacia afuera y abajo.

Pompones: forma globular, constituidos por flores radiales cortas y uniformes.

No hay flores concéntricas.

Decorativas similares a los pompones, pero las hileras exteriores son más largas

que las interiores dando una inflorescencia plana e irregular. Ver Figura 3.

Figura 3: Ilustración de distintos tipos de inflorescencia de crisantemos. Pintura

histórica por Dodd, Mead and Company, 1902.

Fuente: http://en.wikipedia.org/wiki/File:NIEdot318.jpg

15

La multiplicación comercial del crisantemo se hace de forma vegetativa,

utilizando esquejes que salen de una “planta madre”. La obtención de éstos es un proceso

que dura alrededor de 3 meses y medio; después de este tiempo se elimina la planta

adulta para evitar que su degeneración perjudique la calidad de los esquejes producidos.

Una planta puede producir 14 ó 15 esquejes, los cuales son cortados de manera uniforme

con 5 - 6 centímetros u 8 - 10 centímetros de longitud (Herreros 1995, Infoagro 2003).

Los esquejes obtenidos se almacenan en cajas de cartón rodeadas de polietileno (para

evitar que se deshidraten) hasta por seis semanas, a temperaturas entre 0 - 3º C. También

pueden ser enraizados, con sombreado ligero, humedad relativa alta y temperatura entre

18 - 22º C. El proceso de enraizado se completa en 3 ó 4 semanas (Herreros 1995).

Cuando la planta ha sido establecida en el invernadero se produce su desarrollo

vegetativo y floración. Esta última depende de la temperatura y longitud del día

(Herreros 1995, Infoagro 2003). En la mayoría de las variedades, el exceso de calor

atrasa el proceso, mientras que el frío puede adelantarlo (Herreros 1995). Las

temperaturas recomendadas para las plantas en proceso de floración varían entre 16º C

durante la noche y 25º C durante el día. Para obtener flor de corte se pueden emplear

temperaturas de 11 º C por la noche y 16 - 24 º C durante el día. Si la temperatura es muy

alta pueden hacer palidecer el color de las flores, mientras que el frío excesivo puede

provocar la aparición de tintes rosados en las flores blancas (Figura 4). Las fluctuaciones

constantes de temperatura pueden causar falta de uniformidad en la floración (Herreros

1995). La floración de los crisantemos es muy sensible al fotoperíodo (Infoagro 2003,

Herreros 1995). Con más de 15 horas luz/día las plantas tienden a mantener su desarrollo

vegetativo, sin florear. El punto crítico para que se induzca la floración está por debajo

de las 13 horas luz/día dependiendo la variedad (Herreros 1995) aunque en el informe de

Infoagro (2003) se reporta que la longitud crítica de horas luz para la floración es 14.5

horas.

La intensidad de luz puede influir en la calidad de la flor, así, al plantar

crisantemos en zonas sombrías en general se obtienen tallos más delgados y flores más

pequeñas que en zonas soleadas, aunque también hay variedades más sensibles que otras

a esta influencia. Para la producción de flores durante todo el año se pueden aplicar

regímenes ya sea aumentando las horas luz artificialmente o acortando el día con plástico

o tela negra (Herreros 1995).

Figura 4. Crisantemos de la variedad Pinocho blanco, San Pedro Sacatepéquez. Se puede

observar la coloración morada provocada por el frío extremo al que se ven expuestas

Fuente: Foto tomada por Wendy Tort 2007

16

II.1.2 Plagas y enfermedades del crisantemo

Los crisantemos son susceptibles a numerosas plagas y enfermedades. Debido a

esto, es importante mantener un cuidado especial en su sanidad, ya que es determinante

para mantener una buena calidad en flores y hojas.

Se han reportado numerosas plagas que afectan los cultivos de crisantemo,

algunas de ellas son:

II.1.2.1 Artrópodos

Áfido del crisantemo (Macrosiphoniella sanborni).

Mosca del crisantemo (Liriomyza trifolii) cuya larva se desarrolla en el follaje,

teniendo preferencia en el haz de las hojas donde causa minas serpenteadas (Infoagro

2003, Herreros 1995).

Nemátodos, como el Aphelenchoides ritzemabosi, que se diseminan por los

estomas junto a las salpicaduras del agua causando lesiones angulares de color verde

oscuro- café en las hojas (Infoagro 2003); o los del género Pratylenchus, que causan daño

en las raíces (Herreros 1995).

Araña roja (Tetranychus urticae) que causa daño en las hojas, las cuales toman un

color grisáceo a medida que avanza el ataque y en las flores por deformación de pétalos.

Trips, de suma importancia por ser considerados como posibles transmisores de

virus sistémicos y persistentes a los cultivos de crisantemos. Entre las especies más

frecuentes se encuentran Frankliniella occidentalis, Thrips palmi, T. tabaci y F. intosa,

que provocan la decoloración y desfiguración de los pétalos. F. occidentalis es una

plaga de más de 200 especies de plantas y es un eficiente transmisor del virus del

bronceado del tomate (TSWV) y otros tospovirus. Su rango de alimentación incluye

tanto plantas hortícolas como ornamentales y de corte (crisantemo, rosa, clavel,

impatiens, gerberas, asteráceas en general, prímulas y cinerarias), vegetales (pepino,

lechuga, tomate, frijol, berenjena, chile) y frutas (fresa y frutas de hueso) (EEPO 2005).

II.1.2.2 Enfermedades bacterianas, fúngicas y causadas por nematodos.

Existen varias enfermedades que atacan el follaje y flores de las plantas de

crisantemo que afectan al crisantemo y que pueden causar algunos sintomatologías

similares a las causadas por virus, entre ellas se encuentran:

Manchas foliares: Generalmente son causadas por hongos que incluyen las

especies Septoria chrysanthemi, S. chrysanthemella, Alternaria spp. y Cercospora

chrysanthemi . La sintomatología inicial incluye la aparición de manchas amarillas que

cambian de marrón a negro. La infección ocurre primero en las hojas inferiores, las

17

cuales de manchas amarillas se convierten en grandes áreas necróticas que finalmente

causan la muerte de la hoja completa. (Bicklow 2006). La figura 5 muestra algunas

manchas causadas por estos patógenos.

Figura 5: (A) Daño causado por Septoria chrysanthemi y (B) Daño causado por

Cercospora chrysanthemi

A B

Fuente: www.forestryimages.org/search/action.cfm?q=sy)

Mildiu polvoriento (Erysiphe cichoracearm ): Caracterizado por un crecimiento

gris ceniciento en hojas y ocasionalmente en tallos. El follaje puede distorsionarse hasta

el punto de morir en casos de infecciones severas. La enfermedad es más seria cuando el

clima es caliente y húmedo. Para la infección con mildiu no es necesaria la presencia de

agua libre pero altos niveles de humedad estimulan el desarrollo de la enfermedad

(Bicklow, 2006). Su sintomatología es típica y se propaga rápidamente si no se manejan

las plantas adecuadamente. Un ejemplo de este patógeno se presenta en la figura 6.

Figura 6: Daño causado por mildiu polvoriento

Fuente: http://www.commanster.eu/commanster/Mushrooms/Asco/SuAsco/Erysiphe.cichoracearum.htm

Moho gris (Botrytis cinerea ): La sintomatología de esta patología puede ocurrir

en pétalos (tizones de inflorescencias), hojas y los tallos muestran manchas acuosas

18

marrón. Las plantas infectadas pueden estar cubiertas con masas polvorientas de esporas

de color café a gris. Los tejidos senescentes son más susceptibles a infección. El clima

húmedo, nuboso y mojado favorece el crecimiento de este moho (Bicklow 2006). La

figura 7 muestra algunos síntomas de esta enfermedad en rosas, ya que afecta a la

mayoría de plantas ornamentales si no se toman medidas de prevención.

Figura 7. (A) Rosas mostrando infección con moho gris (tomado de:

www.urbanext.illinois.edu) y (B) Flores de crisantemo mostrando el moho gris

Fuente: www.harrylawson.me.uk/Pestsanddiseases/pests.htm).

Roya: Existen dos especies de Puccinia causantes de la roya en crisantemos, la

P. chrysanthemi y P. horiana. P. chrysanthemi es común durante el verano y se

caracteriza por la aparición de pústulas marrón y manchas amarillo verdosas en la

superficie de las hojas. P. chrysanthemi causa daños menores en el campo y es poco

común en los invernaderos. Una infestación severa puede dañar áreas grandes de las

hojas provocando defoliación y reducción la producción de flores. P. horiana causa

pústulas rosáceas y marrones en la hoja y lesiones

blancas, amarillas y verdes en la superficie de las hojas (Bicklow 2006). Este tipo de

pústulas es visto en época de humedad relativa alta en algunas plantaciones de

Guatemala.

Figura 8: (A) Hojas con síntomas de roya (P.chrysanthemi) (tomado de: y (B y C)

síntomas de roya causada por Puccinia horiana.

Fuentes: A. http://www.asturnatura.com/fotografia /setas-hongos/puccinia-chrysanthemi-roze-1/3801.html, B y C: www.viarural.com.ar/.../puccinia-horiana.htm.

C

B

A

A B

19

Manchas foliares bacterianas (Pseudomonas cichorii): Los síntomas de esta

enfermedad son manchas marrones bordeadas de un tejido amarillento. Hay decoloración

prominente a lo largo de las venas de las hojas y las lesiones pueden volverse angulares si

el crecimiento bacteriano es limitado por las venas mayores. Generalmente la hoja muere

cuando la enfermedad está avanzada. Las bacterias persisten en las plantas infectadas,

semillas infectadas, herramientas y macetas (Bicklow 2006). En la figura 9 se presentan

algunos daños causados por esta bacteria.

Figura 9: Daño causado por Pseudomonas cichorii

Fuente: http://www.forestryimages.org/search /action.cfm?Start=1&q=brown&results=1367) y

www.infojardin.com/foro/showthread.php?p=1881867

Pudrición bacteriana (Erwinia carotovora): La sintomatología de esta

enfermedad se extiende a las hojas, los tallos que se llenan de agua, brotes que se

oscurecen, ennegrecimiento de las terminales y el colapso de la parte superior de la

planta. Esta bacteria sobrevive dentro de los escombros agrícolas y se ve favorecida por

alta humedad y altas temperaturas. Se dispersa fácilmente a través de herramientas, por

contacto o por plantas infectadas (Bicklow 2006). En la figura 10 se presentan daños en

los tallos de girasol.

Figura 10: Tallos con daño causado por Erwinia carotovora

Fuente:http://www.inta.gov.ar/parana/info/documentos/produccion_vegetal/girasol/enfermedades

/20311_071207_podr.htm

20

Nemátodos foliares (Aphelenchoides ritzema-bosi): Los indicadores de una

infección por nemátodos son el aparecimiento de manchas angulares de amarillo a café.

Los nemátodos nadan en un film de agua formado en las plantas para movilizarse a hojas

sanas. Las lesiones en las hojas eventualmente crecen hasta cubrir toda la hoja, la cual

muere y se cae (Bicklow 2006). En la figura 11 se presentan algunos síntomas vistos en

plantas susceptibles a este tipo de infección.

Figura 11: Hojas con daño foliar causado por nemátodos

Fuente: http://www.apsnet.org/pd/searchnotes/2007/PDIS-91-5-0637B.asp

Marchitez por Fusarium: Los primeros signos de esta enfermedad son el

amarillamiento del follaje y achicamiento. Las plantas pueden parecer estresadas y el

follaje puede ponerse color marrón y morir. Los tallos presentan una decoloración rojo-

marrón en el sistema vascular. El Fusarium se propaga en suelo contaminado y cortes

infectados la cual se ve favorecida por temperaturas cálidas, humedad relativa alta,

mucho riego y drenajes deficientes. Las variedades susceptibles son: 'Bravo',

'Cirbronze', 'Illini Trophy', 'Orange Bowl', 'Royal Trophy', y 'Yellow Delaware'

(Bicklow 2006). La figura 12 muestra los daños ocasionados en crisantemo.

Figura 12: Daño ocasionado por Fusarium.

Fuente: http://www.ppdl.purdue.edu/ppdl/weeklypics/8-31-09.html.

21

Marchitez por Verticillium: Los síntomas del marchitamiento por Verticillium

pueden aparecer después del florecimiento de los capullos; las plantas jóvenes y

vigorosas pueden no presentar síntomas. El follaje se pone amarillo y se marchita,

algunas veces esto sucede a lo largo de los márgenes y en un lado de la planta. Las hojas

empiezan a morir desde la base de la planta hacia arriba y generalmente permanecen

adheridas. Los tallos pueden exhibir rayas oscuras en el sistema vascular. Esta

enfermedad es favorecida por clima frío seguido por clima cálido. Como medidas de

seguridad se debe utilizar medio de cultivo pasteurizado. Evitar usar las variedades

susceptibles incluyendo 'Bright Golden Ann', 'Echo', 'Glowing Mandalay', Mountain

Peak', 'Paragon', 'Pert', 'Puritan' y 'Wedgewood' (Bicklow 2006). Ejemplo de los daños

causados por Verticillium se observan en la figura 13.

Figura 13. Daño foliar por Vertycillium

Fuente: http://www.forestryimages.org/search/ action.cfm?q=symptoms&Start=1&results=4440).

II.1.2.3 Enfermedades de flores

Didymella ligulicola: Esta enfermedad es causada por un hongo ascomiceto del

orden Dothideales y comúnmente llamado ascoquita del crisantemo, afecta los racimos y

se puede extenderse hasta los tallos de las flores. Las hojas bajas y el tallo también

pueden verse afectados. Los síntomas incluyen pudrición y deformación de las flores en

un lado. El rompimiento de los capullos puede ocurrir en casos severos. Las hojas bajas

y los tallos pueden pudrirse y el follaje puede distorsionarse o morir de un lado del tallo.

La Didymella ligulicola persiste en plantas muertas y esporas que se propagan por viento

y agua. La enfermedad es favorecida por sobre irrigación o lluvia. Se debe evitar mojar

el follaje y las flores y mantener baja la humedad. También se recomienda proteger el

follaje con fungicidas con ingredientes activos como el clorotalonil, mancozeb,

miclobutanil, propiconazole, o tiofanato de metilo (Bicklow 2006). En la figura 14 se

muestra un síntoma típico de esta enfermedad.

22

Figura 14. Sintomatología foliar clásica de Didymella ligulicola.

Fuente: http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=0454020.

Stemphylium lycopersici: Causa lesiones pequeñas necróticas que van de color

marrón claro a marrón oscuro. Dichas lesiones pueden empeorar hasta causar la muerte

del retoño. El patógeno se ve favorecido por condiciones húmedas y temperaturas entre

60° y 85° F. Como medidas preventivas se deben cortar y desechar las plantas

infectadas. Debe proporcionarse una buena circulación de aire y no se deben sobrepoblar

los cultivos. Se debe evitar la sobreirrigación y se deben mantener las plantas secas

(Bicklow 2006). Síntomas causados por este hongo ascomiceto de la familia

Pleuroporaceae, se muestran en la figura 15.

Figura15. Sintomatología característica de Stemphylium lycopersici.

Fuente: http://www.nogyo.tosa.pref.kochi.lg.jp/byoki/daityou/sakumotu/tomato/hanten.html.

23

II.1.2.4 Enfermedades causadas por virus y viroides:

Aunque dentro de las enfermedades más comunes en el crisantemo se cuentan las

causadas por bacterias y hongos, son las infecciones virales quienes conforman el grupo

de mayor importancia. Esto se debe principalmente a que no se ha encontrado hasta el

momento maneras de control de la enfermedad una vez establecida y a que pueden

dispersarse rápidamente, principalmente por vectores o de forma mecánica. Entre los

vectores de estas enfermedades encontramos a los insectos como los trips, áfidos y mosca

blanca. Estos vectores son ejemplos de vectores muy eficientes de estas enfermedades.

Además, muchos de estos virus infectan sistémicamente a la planta y si el cultivo como el

crisantemo se propaga por esquejes, la infección se expande desde que se inicia la

plantación. En Guatemala, se ha iniciado el estudio de estas enfermedades pero se

necesita hacerlo de una manera formal para dejarlas bien documentadas.

Las enfermedades producidas por virus no fueron reconocidas sino hasta 1945. El

enanismo del crisantemo, reportado como un problema viral por Dimock en 1947, llegó a

ser un serio problema en 1949 para la industria. En 1973 Diener y Lawson reportaron

que la enfermedad es producida por un viroide, el viroide del enanismo del cristantemo

(CSVd) (Anmirato et al. 1990). Los síntomas que presentan las plantas afectadas

incluyen palidez o amarillamiento en el follaje y disminución en el tamaño y maduración

temprana de las flores, que pueden abrir una semana antes de las normales (Infoagro

2003). Las plantas en general alcanzan la mitad de su altura normal y pueden presentar

pequeños puntos o manchas de tejido muerto en las hojas (Moorman sin fecha). En la

figura 16 se muestran síntomas diferentes que causa el viroide del enanismo del

crisantemo (CSVd) en su hospedero.

Figura 16. Síntomas causados por el viroide del enanismo del cristantemo (CSVd) en

crisantemo.

(A) Síntomas en hojas (fuente: www.apsnet.org/online/archive/1998/chrys34.htm). (B) Diferencia en

tamaño y floración de dos crisantemos infectados por el CSVd comparados con un crisantemo sano (centro)

(fuente: photos.eppo.org/index.php/image/1950-csvd00-02). (C) Síntomas en las flores, se puede observar

la coloración amarilla en los pétalos de la flor comparado con uno normal de color rojo

(fuente:www.forestryimages.org/browse/subthumb.cfm?su).

24

Las enfermedades causadas por viroides incluyen el “Chrysanthemum chlorotic

mottle viroid” y el “Chrysanthemum Stunt viroid”mencionado en el párrafo anterior. Los

viroides son ARNs pequeños y autorreplicables. Son capaces de inducir una amplia

variedad de sintomatologías en plantas hospederas susceptibles, las cuales incluyen

papas, tomate, pepino, coco, árboles frutales y plantas con flores como el crisantemo.

Los viroides son hebras sencillas de ARN que tienen un tamaño que va de 250 a 400

nucleótidos y existen como una estructura circular con un alto grado de

complementariedad. Sus pequeños genomas contienen información relacionada al

tráfico intracelular, localización, replicación y patogenicidad. En la actualidad se

conocen 30 especies de viroides y sus variantes. Los viroides se pueden clasificar en dos

familias: Pospiviroidae y Avsunviroidae. Los viroides de la familia Pospiviroidae la

estructura secundaria de ARN es casi de doble hebra, mientras que los viroides de la

familia de Avsunviroidae tienen estructuras secundarias altamente ramificadas. Estos

viroides también se diferencian por otras propiedades como la presencia o ausencia de

secuencias funcionales y estructurales y por el modo de replicación (Matsushita y

Penmetcha 2009).

Alrededor de 1950 fueron descubiertas otras afecciones virales, las cuales

causaron problemas en la producción de crisantemo. El virus de la aspermia de

crisantemo ChAV o CAV (Chrysanthemum aspermy cucumovirus) fue reportado por

Hollins en Inglaterra y Brierley en Estados Unidos en 1955 (Anmirato et al. 1990). Es un

virus de ARN de una sola banda en sentido positivo, perteneciente al género

Cucumovirus, está formado por partículas icosahédricas de 29 nm de diámetro

aproximadamente. Este virus puede formar cuerpos de inclusión en forma de cristales y

pueden encontrarse en el mesófilo, en el citoplasma y en las vacuolas. Sus inclusiones

son restos de virus (Brunt et al. 1996). Este virus produce deformación en la

inflorescencia (reduce y cambia el color de las flores) Los síntomas de esta enfermedad

no necesariamente se presentan el primer año; en la mayoría de variedades no se

presentan síntomas en las hojas, pero puede aparecer un jaspeado, acompañado de una

reducción de crecimiento y más raramente de enanismo. Este virus puede ser transmitido

por vectores (generalmente pulgones), o de manera mecánica (herramientas y de forma

manual) (Infoagro 2003). Es común la trasmisión a través de esquejes ya que los virus se

transportan a través de la savia. Por esto, es muy importante evaluar los crisantemos de

los cuales se sacará material para iniciar plantaciones nuevas. Si hay presencia de virus

en el crisantemo madre, seguramente las nuevas plántulas también estarán afectadas y la

calidad del crisantemo puede iniciar a deteriorarse aunque al principio no sea muy

evidente. Actualmente se le reconoce como sinónimo del virus de la aspermia del tomate

(TAV). En la figura 17 se pueden observar micrografías electrónicas del virus y daño

foliar causado por TAV.

El rango de hospederos de este virus se restringe a 9 familias entre las cuales

tenemos a Cannaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae, y otras. El pepino

(Cucumis sativus) es no susceptible. En un estudio llevado a cabo en Korea se encontró

que algunas plantas presentaron únicamente lesiones locales, entre éstas se encuentran

Chenopodium spp., Vigna unguiculata y Tetragonia expansa. Otras plantas presentaron

síntomas de infección sistémico como: Nicotiana spp., Capsicum annuum, Datura

25

stramonium, Petunia hybrida, Gomphrena globosa, Physalis floridana y Lycopersicon

esculentum „Rutgers‟ (Chung et al. 1999)

Figura 17. El virus de la aspermia del tomate (TAV) y los daños que causa.

Fuentes: (A) Microscopía electrónica de partículas de TAV, fuente: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/ICTV

db/ICTVdB/00.010.0.04.003.htm, (B) Daño foliar causado por TAV en lechuga, fuente:

http://nyxt.zsagri.gov. cn/scbch/Boundary/PlantProtection/DiseasesAndInsectDetail. aspx?uqid=315 y (C)

Daño causado por TAV a la flor del crisantemo, fuente: www.harrylawson.me.uk/Pestsanddiseases

/pests.htm.

Otro virus que afecta el crisantemo es el virus del mosaico del crisantemo

(ChMV), el cual fue reportado en 1950 por Keller. En 1952, Noordam en Holanda

reportó el virus del mosaico del crisantemo B (CVB). Estos dos virus se presume son

similares. El CVB pertenece al género Carlavirus. Es un virus helical de 685 nm y 7500

nucleótidos de longitud, con ARN de una banda en sentido positivo. Este virus es

transmitido mecánicamente pero no por contacto entre plantas, es transmitido por áfidos

de forma no persistente y no se transmite por semilla.

El rango de hospederos de este virus incluye familias como Compositae,

Leguminosae-Papilionoidae, Passifloraceae, Solanaceae y Tetragoniaceae. En las hojas

de las plantas afectadas aparece un moteado clorótico seguido por el amarillamiento total

(Anmirato et al. 1990) dando como resultado una clorosis severa debido a la inhibición

de producción de clorofila (Horst et al. sin fecha). Plantas infectadas que han crecido

bajo condiciones de poca luz y con temperatura promedio inferior a 20 º C no muestran

síntomas visibles (Moorman sin fecha). Esta enfermedad es diseminada principalmente

por pulgones. Los síntomas son muy variables dependiendo del cultivar, edad de las

plantas y condiciones del cultivo, pero suelen ser más acentuados en esquejes y plantas

jóvenes. En algunas variedades se ha observado una caída anormal de las hojas (Infoagro

2003). En la figura 18 se muestran algunos síntomas como el amarillamiento de las hojas

y el debilitamiento de las flores por falta de fotosíntesis de sus hojas. El virus puede

detectarse en cualquier parte de la planta aunque los viriones se encuentran en el

citoplasma de la planta. Este virus no produce inclusiones virales.

A

B

C

26

Figura 18. Síntomas causados por el virus del cristantemo B (CVB)

Fuente: www.poljoberza.net/AutorskiTekstoviJedan.aspx.

El virus de la necrosis del tallo del crisantemo (CSNV) fue descrito por primera

vez en 1995 y está estrechamente relacionado con el virus del bronceado del tomate

(TSWV). Este virus se ha encontrado en las variedades de crisantemo Cocarde, Fiji,

Reagan, Majoor Bosshardt, Spider, Tiger, Tigerrag, Viquingo y en otras plantas de

importancia económica como gerbera, pepino, lechuga, berenjena, frijol, arveja, chile y

tabaco. Este virus, al igual que todos los tospovirus, es un virus de ARN de una banda en

sentido negativo, tripartito, icosahédrico, envuelto (Francki et al. 1985). Es transmitido

por insectos de la familia Thripidae (Thysanoptera) de forma persistente, siendo los

principales vectores Frankliniella schultzei y F. occidentalis. Los síntomas del CSNV

son muy similares a los del TSWV; las plantas infectadas presentan manchas necróticas

sobre los tallos, marchitez de tallos y hojas y manchas necróticas en forma de anillo sobre

las hojas, pedúnculos y flores (EEPO 2005).

Además, se han encontrado reportes de la presencia de TSWV (Tomato Spotted

Wilt Virus), INSV (Impatiens Necrotic Spot Virus), IYSV (Iris Yellow Spot Tospovirus)

y TCSW (Tomato Chlorotic Spot Tospovirus) asociados al cultivos de crisantemo (EEPO

2005). Se ha reportado que TSWV causa síntomas severos en una gran variedad de

plantas ornamentales, especialmente geranios, prímulas, fuscias, ciclamen e Impatiens.

El vector principal de este virus es F. occidentalis (www.agric.nsw.gov.au

/Hort/ascu/insects/wft.htm). En Guatemala, TSWV se ha encontrado con mayor

frecuencia en crisantemo que el INSV (Comunicación personal, Palmieri 2007

palmieri@uvg.edu.gt). En la figura 19 se presentan síntomas de TSWV en Aster sp. en

donde se pueden apreciar las manchas cloróticas y necróticas en las hojas principalmente

y a uno de los posibles vectores Frankliniella schultzei.

27

La transmisión del virus es persistente, circulativa y propagativa. El virus es

adquirido por las larvas al alimentarse de tejidos vegetales infectados absorbiendo

partículas virales. Estas partículas pasan del intestino a la cavidad bucal donde se

replican (Wijkamp et al. 1993). El tiempo entre la adquisición de las partículas virales y

su llegada a las glándulas salivales es largo, es superior al que precisa la larva para pasar

a estado ninfal, por lo que los adultos son los que transmiten la enfermedad. Otra

característica es que se ha observado que el virus no se transmite transováricamente y que

los adultos no pueden adquirir el virus, sólo transmitirlo.

Figura 19. Sintomatología causada por el Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) y uno de

sus vectores.

(A) Sintomatología de virus TSWV en hojas de Aster y (B) en la planta (fuente: diagnosingplantdiseases.

blogspot.com/2008_12. (C) Frankliniella schultzei, vector de TSWV (fuente: http://anic.ento.csiro.au

/thrips/identifying_thrips/Thripinae.htm).

El “Aster Yellows” es una enfermedad severa causada por fitoplasmas. Un

fitoplasma se define como un grupo de bacterias pequeñas carentes de pared celular y que

viven en el sistema vascular de una planta causando enfermedades (Guariguata & Kattan

2002). El Aster Yellows resulta en follaje clorótico, achicamiento de la planta, brotes

amarillentos, pocas o ninguna flor, distorsión de las flores y fallas en la coloración de la

flor. Los síntomas causados por virus y viroides en plantas infectadas en cambio,

incluyen el achicamiento, crecimiento anormal y formación de rosetas densas. Las flores

pueden ser pequeñas, distorsionadas o pueden exhibir rayas o interrupción del color. La

A

B

C

28

sintomatología foliar incluye amarillamiento, aparición de anillos, manchas, mosaico,

distorsión, marchitez y caída de la hoja. Muchas de las enfermedades producidas por

fitoplasmas son transmitidas por insectos los como saltahojas o cicadélidos. No hay cura

para las plantas infectadas con virus y viroides (Bicklow 2006). Para las plantas

infectadas con fitoplasmas dependiendo del avance de la enfermedad, se usa la poda de

las ramas infectadas. Los fitoplasmas se definen como ya que los fitoplasmas están

restringidos al floema.Algunos fitoplasmas pueden presentar remisión de síntomas con el

uso de antibióticos como tetraciclina, pero en algunos casos su efecto no es permanente,

vuelven a aparecer los fitoplasmas después de cierto período de tiempo. En crisantemos

el Aster Yellows es una enfermedad que se ha reportado en varias especies

principalmente en Italia, causando enanismo, formación de rosetas y ramificación

excesiva (Chung et al. 2002). En la figura 20 se presentan síntomas de la enfermedad y

un experimento en el que se usan aplicaciones foliares de oxitetraciclina a diferentes

concentraciones.

Figura 20. Síntomas de Aster yellows en crisantemo

Fuente: http://urbanext.illinois.edu/ hortanswers/detailproblem.cfm?PathogenID=153) y los resultados en

fotografía de crisantemos tratados con oxitetraciclina por un mes usando un spray foliar (A y E son

crisantemos no tratados; B aplicación de 100 mg/l; C aplicación de 200 mg/l; D 400 mg/l; F, 400 mg/l; G,

800 mg/l; H,1,200 mg/l. Esta foto fue tomada al mes después de iniciar el tratamiento (Chung et al. 2002).

En general, las enfermedades virales han sido las principales causas de pérdidas

económicas en plantaciones de crisantemo. El CSNV o TSWV es un virus que se ha

esparcido muy rápidamente a través del mundo ya que no sólo ha causado daños

importantes en crisantemo sino en otros cultivos como el tomate (EEPO 2005). El

ChMV y ChAV causan reducciones aproximadas de 5 % en el tamaño de la flor y 11 %

del largo de los tallos, lo que supone daños considerables en las plantaciones y pérdidas

económicas elevadas (EEPO 2005, Anmirato et al. 1990).

29

II.1.2.5 Técnicas de detección de virus

Debido a que la detección visual de síntomas en campo es una técnica con muchas

limitaciones, se han desarrollado varios procedimientos para realizar un diagnóstico más

adecuado de la presencia de los agentes virales; los más comunes son:

II.1.2.5.1 Ensayos serológicos: Las pruebas serológicas son altamente

específicas y proveen resultados inmediatos. El desarrollo y uso de ELISA ha mejorado

la confiabilidad de estas técnicas ya que se trabaja con sistemas antígeno-anticuerpo, los

cuales son específicos para cada virus. Esta especificidad dependerá del tipo y calidad de

anticuerpo que se produzca.

La detección en este tipo de ensayos depende del uso de una o más posibles

reacciones que pueden cuantificar en el rango de picogramos después de la elaboración

de la curva de calibración. La fosfatasa alcalina y la peroxidasa son las más utilizadas

como rastreadores de enzimas, lo que facilita pruebas que son más seguras, fáciles,

baratas y muchas veces más sensibles que los radioinmunoensayos, en los cuales el

antígeno o anticuerpo generalmente están marcados con un emisor de rayos gamma

(Glick y Thomson 1993).

Hay tres tipos de ensayos de ELISA:

a) Competitivo con antígeno de captura: Este método se utiliza comúnmente para

análisis de hormonas y otros compuestos de bajo peso molecular que pueden ligarse a

una proteína comercial y al complejo usado para generar la producción de los anticuerpos

contra el analito de interés.

Los más adecuados para utilizar en la detección de virus en plantas para este proyecto

son:

b) ELISA directo con antígeno de captura: A pesar de que se prefiere usar antígenos

purificados para minimizar la reactividad cruzada y el fondo, este tipo de ELISA se usa

comúnmente con extractos parcialmente purificados o crudos, en casos cuando no está

disponible un antígeno altamente purificado. Este es un ensayo no competitivo en el cual

dos anticuerpos se unen a un mismo antígeno pero no uno al otro. Los anticuerpos

monoclonales de dos diferentes especies pueden ser usados. Una población de

anticuerpos monoclonales está libre, y otra conjugada a una enzima. Si se utilizan

anticuerpos policlonales, una porción de esa población es marcada con la enzima.

c) Detección indirecta con antígeno de captura: El antígeno de interés se une a las

paredes de la placa de microtitulación, seguido por la unión del anticuerpo primario

(mono o policlonal), el cual luego es detectado por un anticuerpo policlonal secundario

ligado a una enzima y el cual actúa como marcador. Esto es conveniente de usar cuando

se tienen suficientes cantidades de antígeno altamente purificado para cubrir los pozos, de

esta forma el fondo no oscurece la detección. En algunos casos no se requiere un

antígeno de alta pureza si ambos sets de anticuerpos son altamente específicos (Dumbroff

30

y Gepstein, 1993). El segundo anticuerpo es un anticuerpo universal ya que se ha

producido contra la inmunoglobulina G de ratón o de otro animal, por eso se le llama

conmunmente que es un antianti-inmunoglobulina. Este anticuerpo se puede usar en

cualquier prueba de virus siempre y cuando se use como primer anticuerpo una

inmunoglobulina G. La figura 21 muestra los diferentes tipos de ELISA, el primero en el

que el anticuerpo es marcado con la enzima y se agrega después de añadir el antígeno (A)

y en el segundo caso se marca el antígeno pero se añade primero el anticuerpo (B).

Figura 21: Esquema de principio de ELISA (A) y de procedimiento de ELISA

competitivo por antígeno de captura (B).

A B

Fuente: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=imm&part=A2395.

Ligación Anticuerpo anti A

a placa

Agregar antígeno A

marcado

Agregar antígeno A

marcado + antígeno

no marcado

Lavar antígeno lo ligado

Cuantificar antígeno ligado y marcado

Agregar anticuerpo anti A ligado

covalentemente a la enzima

Lavar anticuerpo no

ligado

Enzima colorea producto

Se mide absorbancia de producto

coloreado

31

II.1.2.5.2 Bioensayos: En esta prueba se usa una serie de plantas como

indicadoras, seleccionadas de diferentes familias que puedan ser hospederas del virus

(que presenten infecciones locales y sistémicas) y otras que no sean susceptibles a él.

Luego son mecánicamente infectadas o se injertan con la planta infectada del virus que se

desea detectar. La técnica consiste en la detección de síntomas específicos que se

desarrollan para cada virus en la planta generalmente en los crecimientos nuevos. Los

síntomas se esperan son los mismos o similares en plantas del mismo tipo que la

infectada pero pueden variar en las otras plantas de la serie (principios de Koch). Sin

embargo, los síntomas son los mismos en cada una de las plantas siempre que esté

infectando el mismo virus. Los resultados no se obtienen de forma inmediata, pueden

durar meses de pendiendo del tipo de planta que se utilice como planta indicadora. Si es

herbácea es más rápida la respuesta y si es leñosa tardará más tiempo. Esta prueba

aunque lenta pero es quizá la más confiable para detectar la presencia de virus.

II.1.2.5.3 Ensayos de cuerpos de inclusión. Muchos virus de plantas

inducen la formación de inclusiones intracelulares. Estas inclusiones pueden contener

partículas virales y/u otros productos del genoma viral, y en algunos casos pueden

modificar los constituyentes de la célula. Muchas inclusiones muestran gran consistencia

a lo largo de varios hospederos. Su detección puede proporcionar una solución rápida de

detección de una infección viral. En muchos casos las inclusiones son el producto del

genoma viral y el estudio de su desarrollo puede proporcionar información valiosa acerca

de los procesos involucrados en las infecciones virales (Christie y Edwardson 1994). Los

resultados obtenidos por esta técnica son únicamente hasta familia.

Los estudios citológicos de las inclusiones pueden llevarse a cabo con

microscopía de luz y electrónica. La microscopía electrónica proporciona información

acerca de las inclusiones y de su ambiente a nivel ultra estructural. La microscopía de luz

posee varias características que la hacen invaluable, principalmente que es una técnica

sencilla de llevar a cabo, no es costosa, pero necesita experiencia para la visualización y

la identificación de las inclusiones. Este tipo de microscopía permite monitorear la

morfología y desarrollo de la inclusión, así como la relación de estos procesos desde el

punto de vista de la célula completa. La microscopía de luz puede ser valiosa para

revelar alteraciones citológicas causadas por los virus, restos de virus o proteínas y/o

ácidos nucleicos anormales estimulados por la infección viral. Generalmente se

manifiestan como cristales, lámina o laminillas en el citoplasma, en la membrana o en el

núcleo de las células. Si las inclusiones son protéicas se manifiestan mejor con

colorantes específicos para proteínas como el Orange Green. Las inclusiones protéicas se

tiñen de color café amarillentas hasta verde amarillentas. Las inclusiones formadas por

ácidos nucleicos se manifiestan mejor con colorantes para ácidos nucleicos, como el

Azure A. Estas inclusiones se colorean azules si son de ADN y fucsia si son de ARN.

Estos colorantes o compuestos químicos reaccionan con los componentes estructurales de

la célula hospedera y del virus. En el cuadro 1 se muestra los constituyentes celulares y

la tinción que hace posible su visualización y su diferenciación de los componentes

virales a identificar. Muchos de los ensayos citoquímicos y enzimáticos que son difíciles

de llevar a cabo con microscopía electrónica se pueden hacer con la microscopía de luz

(Christie y Edwardson 1994).

32

Cuadro 1. Reacciones de tinción de los constituyentes de la célula hospedera en tejidos

vegetales.

Constituyente Reacciones de tinción

Tinción con Azure A Tinción O-G

Pared celular Incolora Amarillo-verde

Cromatina Azul Verde

Citoplasma Incoloro Amarillo-verde

Cristales inorgánicos Incoloro Incoloro

Microcuerpos y

microcristales

Incoloro Verde

Nucléolo Rojo-violeta Verde

Nucleoplasma Claro Naranja

Plástidos Incoloro Amarillo-verde

Proteína P Incoloro Verde

Gránulos de almidón Incoloro Incoloro Fuente: Christie y Edwardson, 1994)

Las figuras 22 y 23 muestran ejemplos de cuerpos de inclusión vistos con

microscopía de luz en preparaciones coloreadas con colorantes para proteínas (Orange-

Green) y con colorantes para ácidos nucleicos (Azure A).

Figura 22: Inclusiones virales ocasionadas por TSWV (tospovirus).

Fuente: http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5265087.

INCLUSIONES PROTÉICAS

NÚCLEO

NUCLEOLO

33

Figura 23: Inclusiones virales ocasionadas por CMV (cucumovirus).

Fuente: http://www.forestryimages. org/browse/detail.cfm?imgnum=5265056.

II.1.2.5.3.1 Cuerpos de inclusión de cucumovirus: Los

virus de este grupo tienen partículas isométricas que miden aproximadamente 30 nm de

diámetro. Entre este grupo se encuentra el CMV y el TAV. En muestras de tejidos

infectados con CMV se encontraron muchas inclusiones virales, las cuales no estaban

distribuidas uniformemente. Dichas inclusiones ocurren principalmente en las células

mesófilas, y a veces en la epidermis de la hoja. En estudios efectuados con secciones

delgadas de tejido con inclusiones masivas se encontró que había grandes cantidades de

partículas virales agrupadas. Estos agregados principalmente se encontraban en la

vacuola central, y ocasionalmente en el citoplasma (Christie y Edwardson 1994).

La tinción con azure A de hojas de tomate infectadas con TAV muestran

inclusiones grandes de color rojo-violeta. Estas inclusiones ocurren predominantemente

en el mesófilo, así como las inclusiones del CMV. Los estudios con secciones finas de

tejidos revelan arreglos virales en el citoplasma y agregados pequeños dentro de la

vacuola central (Christie y Edwardson 1994).

II.1.2.5.3.2 Cuerpos de inclusión de tospovirus: El TSWV

pertenece al grupo de los tospovirus de la familia Bunyaviridae. Las partículas de TSWV

se agregan en pequeños grupos dentro del citoplasma y del retículo endoplasmático. Se

han observado masas densas de material proteináceo dentro del citoplasma de la Datura

stramonium y de la Nicotiana benthamiana (Christie y Edwardson 1994).

II.1.2.5.4 Geles de poliacrilamida con electroforesis (PAGE). Esta

técnica sirve para analizar ssRNA y dsRNA asociado a infecciones virales; este método

ha sido muy efectivo para el análisis de virus y viroides en crisantemo. Han sido

altamente eficientes para la detección de ChSV en tejidos infectados (Horst y Kawamoto

1980).

NÚCLEO

CUERPOS DE

INCLUSIÓN DE ARN

(FUSCIA).

34

Esta electroforesis conlleva el uso de un gel de agarosa desnaturalizante ya que el

ARN forma estructuras secundarias extensivas vía apareamiento de bases

intramoleculares, y esto previene la separación estrictamente por tamaño

(http://www.ambion.com/techlib/append/ supp/rna_gel.html). La figura 24 muestra el

principio de la electroforesis de poliacrilamida.

Figura 24: Esquema de electroforesis de poliacrilamida (PAGE).

Fuente: http://www.answers.com/topic/sds-polyacrylamide-gel-electrophoresis.

Microscopia electrónica: Tiene limitaciones cuando se remueven partes de la planta con

una cantidad baja de virus o si están restringidos a los haces vasculares. La preparación

de las muestras para su observación no es compleja pero requiere de personas con

conocimiento sobre el funcionamiento y la forma de identificación de las partículas

virales y cuerpos de inclusión en las muestras. En Guatemala no existe microscopio

electrónico.

35

PARTE III

III. RESULTADOS

Durante los viajes de campo se visitaron tanto plantaciones a campo abierto como

plantaciones techadas e invernaderos cerrados (figura 25). En todas ellas se detectaron

síntomas de infecciones virales.

Figura 25. Vistas de plantaciones de crisantemos protegidos y a campo libre en San

Pedro y San Juan Sacatepéquez.

a) invernadero cerrado visitado en la zona 3, San Pedro Sacatepéquez (fuente: 088-2006); b) plantación

techada visitada en el área de San Juan (fuente: 088-2006; c) plantación a campo abierto visitada en la

aldea Bellavista en San Pedro Sacatepéquez (fuente: 088-2006).

En total se colectaron 288 muestras de plantas con sintomatología parecida a la

producida por los diferentes virus trabajados (Figura 26). Entre los síntomas

identificados como de infección virótica se encontraban: clorosis intervenal, con un claro

oscurecimiento de las venas (figura 26b), amarillamiento y acolochamiento de hojas

nuevas y brotes (figura 26g), manchas necróticas en tallo (figura 26i); deformidades y

marchitamiento de flores (figura 26e y j) y otros.

Figura 26. Síntomas mostrados por plantas de crisantemo en campo, éstos son

indicativos de enfermedad y en todos los casos las plantas estaban infectadas con al

menos un virus.

a)

)

a

.

b

.

c

.

Enaciones y deformidad hojas

(FODECYT 088-2006)

a

.

b

. Mosaico (FODECYT 088-2006).

36

Figura 26 (continuación). Síntomas mostrados por plantas de crisantemo en campo,

éstos son indicativos de enfermedad y en todos los casos las plantas estaban infectadas

con al menos un virus.

i j

Necrosis en el tallo (FODECYT 088-2006) Enanismo y deformación de la flor

(FODECYT 088-2006)

g

.

h

. Clorosis y deformación hojas (FODECYT

088-2006)

Deformación hojas y clareado de venas

(FODECYT 088-2006)

Mosaico (FODECYT 088-2006)

d

. Moteado (FODECYT 088-2006)

e

.

f

. Necrosis floral (FODECYT 088-2006) Manchas necróticas (FODECYT 088-2006)

c

.

37

Se encontró gran cantidad de ejemplares con clorosis severa en hojas nuevas,

manchas necróticas o necrosis en tallo, reducción de tamaño de la flor. Algunas de las

variedades de cristantemo incluidas en el estudio se pueden apreciar en el Anexo 4.

Se corrieron pruebas ELISA para cinco virus, de los cuales sólo se encontraron

los siguientes tres: Virus de la aspermia del tomate (TAV), Virus del bronceado del

tomate (TSWV) y el Virus B del crisantemo (CVB). La incidencia de estos virus en el

área trabajada se muestra en el cuadro 2. En ninguno de los puntos trabajados se

encontró el virus de la mancha necrótica de impatiens (INSV), ni el virus del mosaico del

pepino (CMV).

El total de infecciones encontradas en los dos municipios (San Juan y San Pedro

Sacatepéquez) se presenta en la gráfica 1. La mayor incidencia fue la de CVB, luego

TAV y finalmente TSWV en los dos municipios muestreados (gráfica 1).

Gráfica 1. Resultados del número de plantas infectadas con alguno de los cinco virus

estudiados en San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala, 2007.

Los números en el cuadro sobre o en las columnas muestra el número de plantas encontradas positivas para el virus

correspondiente. Fuente: FODECYT 088-2006.

Cuadro 2. Incidencia de los tres virus encontrados en el área de estudio

Virus Incidencia (%)

Virus B del crisantemo (CVB) 90%

Virus de la Aspermia del Tomate (TAV) 61%

Virus del Bronceado del Tomate (TSWV) 7% Fuente: FODECYT 088-2006.

Se corrieron pruebas de Ji cuadrado para las frecuencias de aparición de los virus

encontrados en el área de trabajo, así como para la frecuencia de cada uno de ellos en los

38

dos diferentes municipios muestreados, encontrando diferencias significativas en la

primera pero no en la segunda (Cuadro 3).

Cuadro 3. Frecuencia aparición de virus y resultado de la prueba X2

Virus San Juan

Sacatepéquez

San Pedro

Sacatepéquez

X2 Toda la

zona

X2

TAV 63 112 2.42* 175

CVB 99 160 1.31* 259 189.96**

TSWV 12 10 1.48* 22 *X

2(0.95,1)= 3.841

**X2(0.95,2)= 5.991

Fuente: FODECYT 088-2010.

La distribución de estos tres virus en los dos municipios es similar ya que no se

encontró diferencia significativa en sus distribuciones en los municipios individuales sino

sólo en el área muestreada en general. CVB es el virus predominante en el área

muestreada. La distribución para cada virus encontrado se muestra en las figuras 27, 28 y

29.

Figura 27. Mapa de distribución del virus de la aspermia del tomate (TAV) en el área de

San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.

Elaborado con DIVA-GIS (programa de libre acceso). Fuente: FODECYT 088-2010.

39

Figura 28. Mapa de distribución del virus B del crisantemo (CVB) en el área de San

Juan y San PedroSacatepéquez, Guatemala.

Elaborado con DIVA-GIS (programa de libre acceso). Fuente: FODECYT 088-2006.

Figura 29. Mapa de distribución del virus del bronceado del tomate (TSWV) en el área

de San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala.

Elaborado con DIVA-GIS (programa de libre acceso). Fuente: 088-2006.

La distribución de los virus también fue analizada agrupando los datos según la

altitud a la cual se encontraban los cultivos muestreados. Los dos municipios

muestreados se encuentran a altitudes mayores de de 1500 msnm. Sin embargo, se

usaron dos rangos de altitud con una diferencia de 500 msnm en los dos municipios (área

total) para evaluar si este factor podría tener alguna repercusión en la incidencia o

presencia de los virus. La gráfica 2 muestra el comportamiento de los tres virus a las

40

diferentes altitudes. El cuadro 4 muestra el número de plantas infectadas con cada virus a

las diferentes altitudes en San Juan y San Pedro Sacatepéquez.

Gráfica 2. Incidencia de CVB, TAV y TSWV a diferentes rangos de altitudes en San

Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala en 2007.

Fuente: FODECYT 088-2006.

Cuadro 4. Número de plantas infectadas con alguno de los tres virus encontrados según

rango de altitudes en ambos departamentos.

Fuente: FODECYT 088-2006.

En estos resultados se puede ver que el factor altitud no presenta ningún efecto

significativo en la distribución de los virus en los cultivos de crisantemo. La diferencia

de altitud no es un factor que esté afectando en estos lugares para la incidencia de los

virus. En ambos lugares a pesar de la diferencia de altitudes hay infección en cantidades

similares. La altitud no es un factor que pueda explicar la presencia de los virus en estos

lugares.

ALTITUD – msnm CVB TAV TSWV

1500 a 2000 109 72 12

>2000 150 101 10

TOTAL 259 173 22

41

En la gráfica 3 se puede observar la infección por un sólo virus en las plantas

muestreadas. De las 99 muestras encontradas con infección de 1 sólo virus, 89 mostraron

infección por CVB. Esta gráfica pone de manifiesto más aún, la importancia que CVB

tiene en estas plantaciones.

Gráfica 3. Porcentaje de la presencia de los tres virus encontrados en plantas infectadas

con 1 sólo virus.

Los números en los cuadrados representan el número de plantas encontradas con el virus respectivo.

Fuente: FODECYT 088-2006

La mayor parte de infecciones en los crisantemos no se encontraron aisladas, es

decir, no fue un sólo virus el encontrado en cada planta. Usualmente, se encontró

infecciones por 2 ó más virus (infecciones mixtas). Esto indica que los vectores

respectivos en el campo pueden no ser sólo 1 o según sea el vector para cada virus, los

vectores pueden transmitir más de un virus a las plantas. En la gráfica 4 se muestra el

porcentaje de infecciones por 1 o más tipos de virus (infecciones mixtas) a las plantas del

estudio comparado con las plantas sanas que se detectaron en el estudio.

42

Gráfica 4. Porcentaje de plantas de crisantemo infectadas por uno, dos y tres virus en

San Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala, 2007.

Fuente: FODECYT 088-2006.

En vista que las infecciones mixtas y, sobre todo, las de dos virus fueron tan altas,

se analizó cuáles eran las parejas de virus presentes en las plantas. La gráfica 5 muestra

el porcentaje de veces que se encontraron los diferentes virus relacionados. Se puede

observar que la relación entre CVB y TAV es predominante. La relación entre TSWV y

CVB no es tan importante, pero debemos tomar en cuenta que el TSWV en la época que

muestreamos los crisantemos no tuvo una incidencia muy alta (2007). La relación entre

TAV y TSWV no se encontró.

Los casos de infecciones triples fueron 17 (5.90%) de las cuales 9 infecciones se

encontraron a menos de 2000 msnm y 8 infecciones se encontraron a más de 2000 msnm.

Esto indica que no hay diferencia entre las altitudes en cuanto a la posibilidad que existan

infecciones mixtas por 3 virus. En la gráfica 6 se presenta la incidencia de infecciones

simples y mixtas, pero haciendo diferencias por rango de altitud. La barra para plantas

sanas representa el número de plantas sanas que se encontró en este estudio para cada

rango de altitud. El cuadro 5 muestra la cantidad de plantas que está representada en

cada barra de porcentaje de la gráfica 6.

43

Gráfica 5. Porcentaje de plantas infectadas con CVB-TAV, CVB-TSWV y TAV-

TSWV.

Fuente: FODECYT 088-2006.

El número en el cuadrado representa las plantas encontradas con la pareja de virus al mismo tiempo.

Gráfica 6. Porcentaje de infecciones por 1,2 ó 3 virus comparadas con las sanas en los

dos rangos de altitud muestreado en los municipios de San Juan y San Pedro

Sacatepéquez, Guatemala, durante 2007.

Fuente: FODECYT 088-2006.

44

Cuadro 5. Número de plantas según cada categoría mostrada en la gráfica 6.

Fuente: FODECYT 088-2006.

La diferencia entre altitudes para encontrar infecciones mixtas por uno o tres virus

no es tan relevante en estos dos rangos de altitud. Sin embargo, la incidencia de

infecciones por dos virus tiende a ser más relevante aunque no sea significativa. Lo que

sí podemos apreciar es que a rangos de altitud mayores a 2000 msnm, tiende a haber

mayores problemas con infección y hay menos plantas sanas que en el rango de altitud

más bajo.

Se realizaron tres inoculaciones a plantas indicadoras. El primer lote estaba

compuesto por la batería estándar que se usa en el Laboratorio de Protección Vegetal (L.

esculentum, D. stramonium, C. quinoa, N. tabacum y C. amaranticolor). No se

obtuvieron resultados positivos (síntomas) en estas plantas, por lo que se cambió la

composición de indicadoras utilizadas tomando en cuenta las recomendadas para el

estudio de cada uno de los virus trabajados (cuadro 6). El segundo y tercer lote de

plantas inoculadas tampoco presentaron síntomas. En la última inoculación se realizaron

también algunos injertos en tomate; estas plantas presentaron algunos síntomas (figura

30). El tomate es hospedero susceptible para los tres virus, los síntomas encontrados en

tomate después de la injertación no fueron típicos de ninguno de los tres virus inoculados.

Esto se debe a que los tres virus producen en tomate clorosis, enaciones, deformación de

las hojas y enanismo. Sin embargo, nos mostró la presencia de estos virus en las

muestras injertadas ya que coinciden con los síntomas de los crisantemos injertados sólo

que en grado diferente. La identidad de los virus se hizo por ELISA más adelante.

Cuadro 6. Plantas indicadoras utilizadas y virus inoculados Inoculación Especie TAV CBV CMV TSWV INSV

1 Lycopersicum esculentum X X

1 Datura stramoniun X X

1 Chenopodium quinoa X X

1 C. amaranticolor X X

1 Nicotiana tabacum X X

2 y 3 Nicotiana clevelandii X X X

2 y 3 N. tabacum X X X X

2 y 3 N. glutinosa X X X

2 y 3 Lycopersicum esculentum X X X

2 y 3 Datura stramonium X X X

2 y 3 Phaseolus vulgaris X X X Fuente: FODECYT 088-2006.

la planta fue inoculada con el virus

X la planta no fue inoculada con el virus

Msnm Sanas

Infección

1 virus

Infección

2 virus

Infección

3 virus

1500-2000 12 49 59 9

>2000 6 50 94 8

Totales 18 99 153 17

45

Figura 30. Síntomas presentados por plantas de tomate injertadas con crisantemo

contaminado con TAV, CVB y TSWV

Fuente: FODECYT 088-2006. Fuente: FODECYT 088-2006.

Clorosis y deformación de la hoja. Enaciones y deformación de la hoja.

46

III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Durante los viajes de campo se visitaron tanto plantaciones a campo abierto como

plantaciones en invernaderos cerrados o al menos techados. En todos los casos se

encontraron plantas con síntomas de infecciones por virus aunque en diferente medida.

Al parecer la severidad con que la plantación se ve afectada se relaciona con la cantidad

de insectos (potenciales vectores) que viven y se alimentan en ellas. La cantidad de los

mismos está directamente relacionada con el grado de protección que tenga la plantación.

En invernaderos cerrados y con buen control prácticamente no se encontraban insectos,

pero en aquellos a campo abierto o solamente techados los había en abundancia. Sin

embargo, esto no se midió estadísticamente durante la ejecución de este trabajo.

La utilización de síntomas para recoger el material de campo fue difícil ya que

cada una de las variedades de crisantemo encontradas presentan distintos patrones de

crecimiento, color, tamaño y forma tanto en tallo como en hojas. A pesar de esto, se

pudo distinguir un patrón de clorosis que en todos los casos presentaron plantas que

resultaron positivas para TAV. Este patrón se puede observar en la figura 31.

Figura 31. Clorosis y mosaico en crisantemos con TAV.

Fuente: FODECYT 088-2006. Fotos tomadas por miembros del Laboratorio de Protección

Vegetal.

En el caso de TSWV se pudo identificar que la mayoría de muestras con manchas

necróticas (no con coloración morada) estaban infectadas con este virus, sin embargo, se

presentaron casos en que los síntomas no estaban presentes y la prueba fue positiva. Esto

fue importante porque la variedad de crisantemo Shasta (anexo 4) presentan de manera

natural manchas con coloración morada en el tallo durante su desarrollo y se confunden

con los síntomas virales si no se tiene experiencia. Este virus, TSWV, produce manchas

necróticas de color café, no moradas pero es muy fácil confundirlas. A diferencia de los

síntomas de TAV y CVB, aquí predomina la necrosis que la clorosis o mosaico. La

figura 32 muestra algunos síntomas relacionados a TSWV en crisantemo.

47

Figura 32. Síntomas de necrosis tanto en tallo como en hojas producidas en la

infección por TSWV en crisantemo.

Fuente: FODECYT 0-88-2006. Fotos tomadas por miembros del Laboratorio de Protección

Vegetal.

La enfermedad llamada “cáncer” o “tizón”por los cultivadores puede ser confusa

ya que según sea el lugar y los síntomas que se presenten, puede referirse a una

enfermedad causada por virus (TSWV) o a una enfermedad causada por bacterias

(Erwinia chrysanthemi) o a una enfermedad causada por hongos (Alternaria sp. o

Alternaria chrysanthemi Simmons). En San Juan y San Pedro Sacatepéquez puede

deberse a cualquiera de las causas antes mencionadas pero durante el período previo al

inicio del estudio y durante la primera colecta, se debió principalmente al virus TSWV.

Esto se puede aseverar basado en resultados obtenidos mediante pruebas de ELISA en el

laboratorio de Protección Vegetal y a los resultados negativos que se obtuvieron en

cultivos para bacterias y hongos. Los síntomas encontrados en el campo la mayor parte

del tiempo fueron similares a los presentados en la figura 32 y no como los presentados

en la figura 33 que son producidos por Erwinia chrysanthemi o por Alternaria sp. Los

síntomas producidos por Erwinia chrysanthemi son síntomas más acuosos y parecen más

una pudrición que los síntomas producidos por TSWV y los síntomas que produce

Alternaria chrysanthemi, son manchas más secas y mejor delimitadas que las producidas

por TSWV. En las figura 33 se pueden ver los tres casos. La figura 33a. salió positiva

para TSWV pero también salió positiva para CVB y TAV. Se pueden ver claramente los

48

patrones de necrosis que corresponden a TSWV y los patrones de clorosis y deformación

de las hojas que corresponden a CVB. Este es un claro ejemplo de una infección mixta

de virus que se encontró en el campo. Por el otro lado, también se encontraron plantas

que no presentaron síntomas de ningún tipo y salieron positivas para TAV y CVB. Esto

puede deberse a que la concentración de virus necesaria para que la prueba de ELISA

detecte al virus es baja, por lo tanto puede detectarlos aún antes de que la planta presente

sintomatología. Es importante notar que aunque la planta no presente síntomas, no quiere

decir que el tamaño de la flor no se verá afectada durante la floración.

Figura 33. Síntomas de TSWV, CVB, Erwinia chrysanthemi y Alternaria

chrysanthemi.

A- Síntomas de TSWV y CVB, foto tomada por Protección Vegetal (Fuente: FODECYT 088-2006). B-

Síntomas de Erwinia chrysanthemi con manchas bastante acuosas y grandes. Tomado de

www.eppo.org/.../ERWICH_images.htm. C- Sintomas de Alternaria chrysanthemi con manchas secas,

concéntricas y bien delimitadas. Tomada de www.forestryimages.org/search/action.cfm?q=cl.

Como puede verse en los mapas elaborados, en todas las plantaciones se

encontraron los virus de la aspermia del tomate, el virus B del crisantemo y el virus del

bronceado del tomate, siendo los dos primeros los de mayor incidencia. Para Guatemala

no está formalmente reportada la presencia y/o frecuencia para ninguno de los tres virus

A

B

C

49

en crisantemo. Solamente TSWV ha sido reportado para tomate. La presencia de estos

virus consideramos que debe ser monitoreada porque en realidad no se conoce la relación

que tiene con diferentes factores que intervienen en un cultivo como lo es lluvia,

temperatura, vectores, manejo de las plantaciones, etc. Solamente se pudo identificar que

TSWV había sido un gran problema en años anteriores en crisantemo pero no se sabía su

relación con CVB o TAV. Tampoco se conoce si la infección de estos virus es estacional

o permanentes. Por lo encontrado, el CVB es un virus que ya se ha establecido y al

parecer el TAV se ha establecido pero la mayor parte del tiempo en asociación con CVB,

únicamente en el 5% de los casos fue encontrado aislado, en el resto de los casos fue

encontrado en asociación con el CVB. Otros estudios como el llevado a cabo por Chung

et al. 1999, quien estudió la incidencia de CVB y TAV en crisantemo en Korea, también

encontró que la incidencia de CVB fue de 97.5%, que TAV no fue encontrado aislado

sino en todos los casos en co-infección con CVB (20.9% de los casos). En Guatemala, se

evaluaron 285 plantas de crisantemo para estos dos virus y se encontró que sí había

presencia de TAV aislado en crisantemo en un 3% pero la total detección de TAV en

crisantemo fue de 61%, lo cual indica que el 58% se encontró en infección mixta con

CVB. El total de infección de CVB fue un poco más bajo que en Korea (97.2%), fue de

90.5% pero el 32.6% fue lo que se presentó libre de TAV. Esta relación es muy estrecha

y alta por lo visto no sólo en Guatemala, por lo que sería muy interesante poder estudiar

más profundamente qué tipo de relación existe entre estos dos virus. Finalmente, no se

encontró ninguna relación entre TAV y TSWV.

A pesar de estar ampliamente distribuidos, el CVB y el TAV, los agricultores

consideran que no afectan al crecimiento y producción de flores de corte en las

localidades visitadas. Sin embargo, ellos no consideran el debilitamiento que puede

sufrir una planta ante una infección viral y la facilidad con que otras enfermedades

pueden afectarles. Tampoco están considerando al parecer, la deformidad que están

sufriendo las plantas y el tamaño reducido de la flor que al principio no se observa, pero

poco a poco se va perdiendo el tamaño original y la especie del crisantemo sufre

modificaciones, muchas veces permanentes, no pudiendo recuperar las características

originales de la variedad.

También se puede observar de los resultados obtenidos, que los síntomas aislados

de cada virus fueron imposible de obtener. La mayoría de los casos presentaba

infecciones mixtas. Es necesario poder aislar la sintomatología para poder identificar a

los virus en el campo pero en estos campos no fue factible, especialmente si el TAV y el

CVB son transmitidos por el mismo vector, áfidos. Este vector puede estar ya infectado

con los dos virus al mismo tiempo aunque para comprobarlo haría falta continuar con el

presente estudio y enfocarse a los vectores y a estudios de invernadero para aislar los

virus mediante plantas indicadoras y detectarlos mediante pruebas serológicas y/o

moleculares. La caracterización de los síntomas en plantas indicadoras no tuvo

resultados positivos, esto se debe principalmente a dos motivos, el primero son las

infecciones mixtas (157 de las 287 plantas tienen dos virus y 17 tres), lo que hace

sumamente difícil aislar los virus para observar el desarrollo de síntomas característicos

del virus en ella. Los síntomas que produce cada virus en sí, son poco diferentes y por

50

esto no fue posible encontrar un hospedero común al que sólo le afectara uno de los virus

para aislarlo, sobre todo para CVB y TAV.

El TSWV en cambio, es transmitido por trips. Este vector adquiere el virus en su

etapa ninfal y lo transmite de adulto. La presencia de TSWV indicaría que el virus ha

estado ya por algún tiempo, al menos durante un ciclo de vida del trips, presente en las

plantaciones. Para TSWV, sí se obtuvieron síntomas típicos como lo es el bronceado de

la hoja en tomate así como manchas necróticas en plantas de tomate pero no en otros

hospederos. Este es un virus muy lábil y quien hace el procedimiento debe hacerlo

rápidamente para que el virus no se degrade.

Una consideración importante para el trabajo llevado a cabo en los invernaderos

fue su temperatura interna. En esa época todavía no estaba bien controlada ésta ya que el

sistema de enfriamiento se estaba probando. La temperatura es un factor muy importante

para la transmisión del virus, pero es más importante para la aparición de síntomas. Si la

temperatura es alta, los síntomas no aparecen aunque la planta salga positiva en una

prueba de ELISA.

Al correr pruebas de Ji cuadrado a las frecuencias de aparición del virus, se

obtuvo que hay diferencias significativas en la frecuencia de aparición de los tres virus en

toda el área de trabajo, pero al correr la prueba para comparar las frecuencias de aparición

de cada uno de ellos en las dos localidades (cuadro 3), se encontró que no hay diferencias

significativas en las mismas, lo que indica que aunque su incidencia es diferente, su

distribución en ambos municipios es bastante homogénea. Esto es importante porque se

puede deducir de estos datos que el problema viral en los dos municipios es bastante

similar y sobre todo que es posible que la causa sea la misma. Este resultado se ve

apoyado al observar las figuras 27, 28 y 29, ya que los tres virus se encuentran en todos

los puntos muestreados, siendo la principal diferencia la incidencia. Consideramos que

como estos virus son transmitidos o pueden ser transmitidos mecánicamente, la

homogeneidad de su distribución en el área puede deberse a la utilización de esquejes

para propagación, que es la forma que todos los agricultores de estos municipios usan

para continuar con sus plantaciones año con año. Ellos no inician de semillas.

Generalmente cada productor genera sus esquejes a partir de las plantas que posee, pero

en ocasiones los obtienen de plantaciones de otras áreas, y esto ayuda a que los virus

puedan moverse con mayor efectividad y a que se mantengan dentro del área a pesar de

utilizar insecticidas u otras formas de manejo y control. Otra causa puede ser las malas

prácticas dentro de los invernaderos en lo que se refiere a higiene en el manejo de las

plantas, desinfección de manos, herramientas de trabajo y otras.

51

52

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES:

El método de ELISA sirvió para detectar los virus presentes en las plantaciones de

San Pedro y San Juan Sacatepéquez y resultó ser un método fácil y bastante

sensitivo para la detección de los virus.

Los virus presentes en plantaciones de crisantemo de San Pedro y San Juan

Sacatepéquez fueron: El virus del bronceado del tomate o TSWV presente en un

7%, el virus de la aspermia de tomate o TAV presente en un 61% y el virus B del

crisantemo o CVB presente en un 90% de las muestras.

Los síntomas más relacionados a la presencia de CVB y TAV son la clorosis y

deformación de las hojas o flores, en crisantemo. Los síntomas en plantas

indicadoras no pudieron aislarse para cada uno de estos virus pero en ambos

casos, tanto la necrosis como la clorosis predominaron.

Los síntomas más relacionados a la presencia del TSWV son los síntomas de

necrosis en los tallos, hojas, en plantas indicadoras y en tallos, hojas y flores, en

crisantemo.

La distribución de los tres virus en los dos municipios es similar ya que no se

encontró diferencia significativa en sus distribuciones en los municipios

individuales sino sólo en el área muestreada en general. En el trabajo se

presentan los mapas (figuras 27, 28 y 29) en donde se muestra la distribución de

dichos virus.

Se elaboró un manual en forma de trifoliar con los resultados obtenidos e

información sobre los virus encontrados que puede ser de utilidad para los

agricultores.

El virus B del crisantemo es el virus predominante en los campos de crisantemo

en los municipios de San Juan y San Pedro Sacatepéquez.

En todas las plantaciones de crisantemo muestreadas se encontró la presencia de

virus. No hay plantación libre de éstos.

La mayoría de virus se encontró en infecciones mixtas y de estas asociaciones

predominó la asociación de dos virus en la misma planta (57%). La asociación

por tres virus fue de únicamente 6% y la presencia de un solo virus fue en 37% de

los casos.

La hipótesis nula que dice que no hay presencia de virus en crisantemos en las

localidades de San Juan y San Pedro Sacatepéquez queda descartada porque sí se

encontró infección por virus en el 93% de los casos analizados.

La hipótesis nula que establece que la distribución de los virus en San Juan y San

Pedro Sacatepéquez no es uniforme, también queda descartada porque como se

vio en los mapas anteriores (figuras 27,28 y 29), la distribución de estos es

bastante uniforme.

53

IV.2 RECOMENDACIONES

Es importante que los agricultores de esta área inicien sus plantaciones utilizando

material libre de virus, de lo contrario las enfermedades provocadas por los virus

o por algunas bacterias permanecerán en los campos y en la región. Las

variedades originales de crisantemo producidas pueden desaparecer o cambiarán

su calidad modificándose en tamaño, forma o color de la flor así como las

características de la planta. Otra alternativa es que desaparezcan algunas

variedades (ej. Bombón y amarillo pache) porque no se podrían producir y se

sustituirían por variedades más resistentes, pero quizá no con las características

que se quisieran.

Pueden utilizar material proveniente de cultivo de teiidos y verificado que esté

libre de patógenos.

Deben establecer una plantación madre con estos crisantemos provenientes de

cultivo de tejidos y colocarlos en un invernadero que llene los requisitos

necesarios para que no ingresen vectores y con las normas de calidad necesarias

para el buen manejo de las plantaciones.

Es necesario capacitar a los agricultores sobre el manejo y propósito de los

invernaderos para hacer efectivo el uso de los mismos.

Se deben monitorear los virus y los vectores en las plantaciones para establecer

épocas críticas y de esta manera minimizar el daño que producen a las

plantaciones.

Es necesario aprender a evitar la transmisión mecánica de los virus dentro del

invernadero para evitar la presencia de virus transmitidos de esta manera.

Es necesario que se capacite a los agricultores en lo que son enfermedades virales

principalmente y sobre todo en su relación con los vectores y sus formas de

transmisión.

Es importante colaborar con los agricultores para establecer planes de manejo del

cultivo, principalmente dirigidos a prevención y adecuados a los problemas que

presentan.

54

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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59

IV.4 ANEXOS

60

Anexo 1. Cuadro de ingresos de las muestras colectadas en campo y resultados

obtenidos.

No.

Campo

ID lab X Y Msnm CMV CVB INSV TAV TSWV

1 1 -90.700767 14.714350 1955 0 1 0 1 0

2 2 -90.677917 14.709450 1858 0 1 0 1 0

3 3 -90.677917 14.709450 1789 0 1 0 1 0

4 4 -90.677983 14.710150 1868 0 1 0 1 0

5 6 -90.700783 14.714117 1960 0 1 0 1 0

6 7 -90.677917 14.709450 1790 0 1 0 1 0

7 8 -90.700783 14.714133 1494 0 0 0 0 0

8 9 -90.677983 14.710150 1862 0 1 0 1 1

9 10 -90.676283 14.710117 1868 0 1 0 1 1

10 11 -90.691133 14.709483 1876 0 1 0 1 0

11 12 -90.676417 14.710183 1869 0 1 0 1 0

12 13 -90.676550 14.710217 1869 0 1 0 1 0

13 14 -90.637300 14.705383 1776 0 0 0 1 0

14 15 -90.637300 14.705383 1776 0 0 0 1 0

15 16 -90.637300 14.705383 1776 0 1 0 1 0

16 17 -90.637300 14.705383 1776 0 1 0 1 0

17 18 -90.637300 14.705383 1776 0 0 0 1 0

18 19 -90.640650 14.705383 1759 0 0 0 1 0

19 20 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 1 0

20 21 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 1 0

21 22 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 0 0

22 23 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 1 0

23 24 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 1 0

24 25 -90.640650 14.705383 1759 0 0 0 1 0

25 26 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 1

26 27 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 0

27 28 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 0

28 29 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 1

29 30 -90.649300 14.710833 1802 0 0 0 1 0

30 31 -90.649300 14.710833 1802 0 1 0 1 0

31 32 -90.649170 14.694333 2037 0 1 0 1 0

32 33 -90.649170 14.694333 2037 0 1 0 1 0

33 34 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0

34 35 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 1 0

61

Continuación anexo 1.

No.

Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV

35 36 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 1 0

36 37 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 1 0

37 38 -90.662867 14.727550 1706 0 0 0 1 0

38 39 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0

39 40 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0

40 41 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0

41 42 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 1 1

42 43 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 0 0

43 44 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 0 0

44 45 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 0 0

45 46 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 1 0

46 47 -90.664700 14.720567 1795 0 1 0 1 0

47 48 -90.664700 14.721283 1803 0 1 0 0 0

48 49 -90.664700 14.721283 1803 0 1 0 0 0

49 50 -90.664700 14.721283 1803 0 1 0 0 0

50 51 -90.662867 14.727550 1706 0 1 0 0 0

51 52 -90.637300 14.705383 1776 0 1 0 0 0

52 53 -90.640650 14.705383 1759 0 1 0 0 0

53 54 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0

54 55 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0

55 56 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0

56 57 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0

57 58 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0

58 59 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0

59 60 -90.639367 14.690117 1945 0 1 0 1 0

60 61 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0

61 62 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0

62 63 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0

63 64 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0

64 65 -90.639383 14.689750 1945 0 1 0 1 0

65 66 -90.640633 14.689417 2049 0 1 0 1 1

66 67 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

67 68 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

68 69 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

69 70 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

70 71 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

71 72 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

62

Continuación anexo 1.

No.

Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV

72 73 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

73 74 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

74 75 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

75 76 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

76 77 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

77 78 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 1

78 79 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

79 80 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

80 81 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

81 82 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

82 83 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

83 84 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

84 85 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

85 86 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 R 0

86 87 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 1 0

87 88 -90.639233 14.690350 2041 0 1 0 0 0

88 89 -90.631383 14.727950 1770 0 0 0 0 0

89 90 -90.631383 14.727950 1770 0 0 0 0 0

90 91 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0

91 92 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0

92 93 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0

93 94 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0

94 95 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0

95 96 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 0 0

96 97 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 0 0

97 98 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 0 0

98 99 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0

99 100 -90.640100 14.711867 1697 0 1 0 1 0

100 101 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0

101 102 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 0 1

102 103 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0

103 104 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 0 0

104 105 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0

105 106 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0

106 107 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0

107 108 -90.633617 14.727633 1781 0 R 0 0 0

108 109 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 0 0

63

Continuación anexo 1.

No.

Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV

109 110 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0

110 111 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 1

111 112 -90.633617 14.727633 1781 0 R 0 1 0

112 113 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 0 0

113 114 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 1

114 115 -90.633617 14.727633 1781 0 1 0 1 0

115 116 -90.633700 14.727733 1773 0 1 0 0 0

116 117 -90.633700 14.727733 1773 0 1 0 0 0

117 118 -90.633700 14.727733 1773 0 1 0 0 0

118 119 -90.633700 14.727733 1773 0 1 0 0 0

119 120 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0

120 121 -90.633650 14.727733 1783 0 1 0 0 0

121 122 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0

122 123 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0

123 124 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0

124 125 -90.633650 14.727733 1783 0 0 0 0 0

125 127 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

126 128 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

127 129 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

128 130 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

129 131 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 1 0

130 132 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

131 133 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

132 134 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

133 135 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

134 136 -90.655350 14.710583 1886 0 0 0 0 0

135 137 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

136 138 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

137 139 NST NST NST 0 0 0 0 0

138 140 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

139 141 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

140 142 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

141 143 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 1 0

142 144 -90.655350 14.710583 1886 0 0 0 0 0

143 145 -90.655350 14.710583 1886 0 0 0 0 0

144 146 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

145 147 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 1

64

Continuación anexo 1.

No.

Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV

146 148 -90.655350 14.710583 1886 0 1 0 0 0

147 149 -90.655450 14.712667 1895 0 1 0 0 0

148 150 -90.655450 14.712667 1895 0 1 0 0 1

149 151 -90.655450 14.712667 1895 0 1 0 1 1

150 152 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 0 0

151 153 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 0 0

152 154 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0

153 155 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0

154 156 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0

155 157 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

156 158 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

157 159 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

158 160 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

159 161 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

160 162 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 0 0

161 163 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

162 164 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

163 165 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

164 166 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

165 167 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 1

166 168 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0

167 169 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0

168 170 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 0 0

169 171 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 0 0

170 172 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0

171 173 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0

172 174 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 1 0

173 175 -90.644733 14.677467 2113 0 1 0 0 0

174 176 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 1

175 177 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

176 178 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 0 0

177 179 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

178 180 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 1

179 181 -90.647400 14.673983 2183 0 1 0 1 0

180 182 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0

181 183 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0

182 184 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0

65

Continuación anexo 1.

No.

Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV

183 185 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 0 1

184 186 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 1

185 187 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 1 0

186 188 -90.647400 14.673983 2185 0 1 0 0 0

187 189 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 1 0

188 190 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 0 0

189 191 -90.645533 14.680083 2080 0 0 0 0 0

190 192 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 0 0

191 193 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 0 0

192 194 -90.645533 14.680083 2080 0 0 0 1 0

193 195 -90.645533 14.680083 2080 0 1 0 1 0

194 196 -90.657600 14.673267 2115 0 0 0 1 Sd

195 197 -90.657600 14.673267 2115 0 1 0 0 0

196 198 -90.657600 14.673267 2115 0 1 0 0 0

197 199 -90.657600 14.673267 2115 0 1 0 0 0

198 200 -90.657967 14.681500 2147 0 1 0 1 0

199 201 -90.657967 14.681500 2147 0 0 0 0 Sd

200 202 -90.657967 14.681500 2147 0 1 0 0 0

201 203 -90.657967 14.681500 2147 0 0 0 0 0

202 204 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 1 0

203 205 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 1 0

204 206 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0

205 207 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 1 0

206 208 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0

207 209 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0

208 210 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0

209 211 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 1 0

210 212 -90.658017 14.681483 2189 0 1 0 0 0

211 213 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0

212 214 -90.659950 14.677983 2053 0 0 0 0 0

213 215 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

214 216 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0

215 217 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0

216 218 -90.659950 14.677983 2053 0 0 0 0 0

217 219 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

218 220 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

219 221 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

66

Continuación anexo 1.

No.

Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV

220 222 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

221 223 -90.659950 14.677983 2053 0 0 0 0 0

222 224 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0

223 225 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0

224 226 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

225 227 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

226 228 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 0 0

227 229 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 0 0

228 230 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

229 231 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 0 0

230 232 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 0 0

231 233 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

232 234 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

233 235 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

234 236 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

235 237 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0

236 238 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0

237 239 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

238 240 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

239 241 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0

240 242 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

241 243 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

242 244 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

243 245 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

244 246 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

245 247 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0

246 248 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 0 0

247 249 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

248 250 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

249 251 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

250 252 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

251 253 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

252 254 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

253 255 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 1

254 256 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

255 257 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 0 1

256 258 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 0 0

67

Continuación anexo 1.

No.

Campo ID lab x Y msnm CMV CVB INSV TAV TSWV

257 259 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 0 0

258 260 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

259 261 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

260 262 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

261 263 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

262 264 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

263 265 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

264 266 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 0 0

265 267 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

266 268 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

267 269 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

268 270 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

269 271 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

270 272 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 0 0

271 273 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

272 274 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

273 275 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

274 276 -90.659950 14.677983 2053 0 1 0 1 0

275 277 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

276 278 -90.661200 14.688750 2167 0 1 0 1 0

277 279 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 1

278 280 -90.661267 14.688817 2166 0 1 0 1 0

279 281 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

280 282 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

281 283 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

282 284 -90.676750 14.687433 2188 0 1 0 1 0

283 285 -90.669933 14.707433 1902 0 1 0 1 0

284 286 -90.669933 14.707433 1902 0 1 0 1 0

285 287 -90.672933 14.708167 1911 0 1 0 1 0

286 288 -90.672933 14.708167 1911 0 1 0 1 0

287 289 -90.672933 14.708167 1911 0 1 0 1 1

288 290 -90.672933 14.708167 1911 0 1 0 1 0

0 = ausencia de virus

1 = presencia de virus

NST= no se tomó

68

Anexo 2. ELISA DIRECTO FOSFATASA ALCALINA PARA LA DETECCIÓN

DE VIRUS.

1. Anticuerpo de cobertura (para 96 pozos):

En un beaker colocar:

10 ml de buffer de cobertura

50 l de anticuerpo (Agdia)

Agitar por aproximadamente 10 minutos

Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape.

Incubar en cámara húmeda por 4 horas o toda la noche a 4o C.

2. Preparación de muestras

Todas las muestras se trabajan en duplicado. Se puede trabajar 46 muestras

máximo, más los controles positivo y negativo.

En un tubo:

pesar 0.1 g de cada muestra

agregar 1.0 ml de buffer de extracción directo

Macerar

3. Lavado de la placa

Se utiliza el lavador de placas automático BIORAD ImmunoWash modelo 1575. Se

emplea PBST como solución de lavado.

4. Colocación de muestras

Colocar en dos pozos buffer de extracción directo lo cual servirá de blanco.

Realizar el mapa en duplicado.

Colocar control positivo de Agdia® (si no hay control positivo de Agdia puede

colocar muestra de una hoja infectada)

Colocar control negativo de Agdia® (si no hay control negativo de Agdia puede

colocar muestra de una hoja no infectada)

Colocar 100l de cada muestra en el pozo respectivo y en duplicado.

Cubrir con tape

Incubar 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente o toda la noche a 4oC

5. Lavado de placa

Véase Paso 3.

6. Anticuerpo Conjugado

En un beaker colocar (para los 96 pozos, sino ver cálculos en el paso 1):

10 ml de buffer de conjugado

50 l de anticuerpo conjugado

Agitar por 10 minutos.

Agregar 100l a cada pozo, cubrir con tape.

Incubar 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente.

69

7. Lavado de placa

Véase paso 3

8. Revelado de la placa

Agregar una pastilla de PNP (fosfatasa Alcalina) para cada 5ml de buffer de revelado,

disolverlo hasta desaparecer la pastilla.

Agregar 100ul de esta preparación a cada pozito y colocar la placa en camara

obscura (sin tape) por una hora

9. Lectura de placa

Se hacen de dos a tres lecturas (una hora, dos horas y/o hasta tres horas después de

agregado el sustrato y si es necesario a 405nm.

70

Anexo 3. MÉTODOS DE TRANSMISIÓN DE VIRUS A PLANTAS

INDICADORAS.

Inoculación mecánica. Se pretende exponer a una planta sana indicadora con un

extracto de material vegetal de una planta enferma. Hay una gran variedad de

amortiguadores o búfers utilizados para inoculación dependiendo del virus que se

trate. El que más se utiliza es el Búfer de Fosfato de sodio dibásico y monobásico

(Na2HPO4) 0.01M-0.1 M, pH 8.0.

1. Macerar hojas de plantas infectadas o posiblemente infectadas

(muestra de campo) con Búfer y un poco de carborundum (600 mesh.).

1. Espolvorear carborundum (romper paredes celulares) a las hojas que

se van ha inocular en la planta indicadora.

2. Frotar las hojas de las plantas a inocular con la solución preparada

(búfer + planta).

3. Dejar a la planta reposar durante 5-10 min.

4. Lavar la planta por completo con agua destilada

5. Cada vez que se va ha inocular una nueva planta con un virus o

muestra diferente, se debe limpiar completamente el área y lavar las

manos con jabón.

6. Depositar las macetas en las mesas a 15 cms. Entre macetas para evitar

el contacto entre ellas. Las macetas deben estar en platillo

desinfectados (Cloro 10%), para evitar la contaminación del área a la

hora de regar.

7. Se debe evitar la aplicación de agroquímicos quemantes, ataques de

insectos, enfermedades, para evita la confusión de daños producidos

por estos y, que la identificación de la enfermedad sea lo más

confiable posible.

Inoculación por inyección. Se inyecta a una planta sana indicadora con un

extracto de material vegetal de una planta enferma. Se utiliza el mismo búfer

utilizado en la inoculación mecánica. Esto se asemeja a la infección por vectores.

Es muy útil para transmitir virus altamente inestables que se encuentran

encapsulados en el xilema o en el floema.

71

Anexo 4 Algunas variedades de crisantemo encontradas durante el estudio en San

Juan y San Pedro Sacatepéquez, Guatemala, 2007.

Chrysanthemum x grandiflorum (Euro) –

Polar blanca Chrysanthemum x grandiflorum (Pompon

Furore) – Centro verde

Chrysanthemum x grandiflorum (Poser)-

Penileño

Chrysanthemum x grandiflorum no

clasificada (Lemon Fiji) – Polar amarilla

Chrysanthemum leucanthemum - Shasta Chrysanthemum x grandiflorum (Penine

Marie)- Moradita

72

Anexo 4. Continuación.

Chrysanthemum weyrichii (Yellow

bomb)- Chao mein

Chrysanthemum x grandiflorum

(Pompon, Furore)-Pinocho

Chrysanthemum x grandiflorum (Yellow

Biarritz)- Lagrimita

Chrysanthemum x grandiflorum (Fiji)-

Amarillo pache.

Chrysanthemum x grandifolium (Gold

Creamest)- Bombón amarillo

Chrysanthemum leucanthemum -

Margaritón

73

Anexo 4. Continuación.

Fuente: FODECYT 088-2006. Nombres tomados de: Hogan, 2003.

Chrysanthemum x grandifolium (Single

Poser) - Rosado

Chrysanthemum x grandifolium (Spoon

Dublin) - Rojo