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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACY T-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN- INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN

ENFERMEDADES GENÉTICAS Y METABÓLICAS –INVEGEM-

INFORME FINAL

CUANTIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL DE LOS DISTINTOS TRANSCRITOS DE BCR-ABL Y SU UTILIZACIÓN PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL EN LEUCEMIA LINFÓBLASTICA AGUDA Y LEUCEMIA MIELOIDE

CRÓNICA

PROYECTO FODECYT No. 24-2010

Dra. Claudia Carranza Investigador Principal

GUATEMALA, NOVIEMBRE DEL 2012

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo

Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaria Nacional de

Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –

CONCYT- .

RESUMEN El objetivo general del proyecto Fodecyt No. 24-2010 es cuantificar y evaluar la

presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 quiméricos del gen BCR-ABL y su

utilidad para el estudio de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y

leucemia mieloide crónica.

En el presente estudio se incluyeron 30 pacientes con leucemia mieloide crónica y que

reciben tratamiento con imatinib o nilotinib; a los cuales se les realizaron 4 monitoreos

trimestralmente; haciendo un total de 120 determinaciones. Para ello se obtuvieron los

glóbulos blancos y/o blastos de médula ósea y/o sangre periférica, mediante lisis de

amonio. Se realizó extracción de ARN y retrotranscripción. Posteriormente se

cuantificaron las copias del gen quimérico BCR-ABL y del gen control ABL, mediante

PCR en Tiempo Real. Cada monitoreo se reportó en el sistema internacional.

Del total de pacientes analizados, el 39% presentó una respuesta óptima, un 25% presentó

una respuesta sub-optima al tratamiento y un 36% tiene un fallo a la terapia.

Un 64% alcanzaron una respuesta citogenética completa (<1%IS), un 43% tienen una

respuesta molecular mayor (<0.1%) y por último el 36% que presentó fallo a terapia no

alcanzó la respuesta citogenética completa (>1%).

Los resultados obtenidos en la cuantificación del gen BCR-ABL, son comparables con los

reportados en la mayoría de estudios similares.

En cuando a la edad, cabe destacar que se puede observar que los pacientes con leucemia

mieloide crónica en Guatemala, tienen una mediana de edad (<39 años) menor que la

reportada en el resto de países, en donde la mediana de esta enfermedad se encuentra entre

50-60 años.

En el recuento de plaquetas se puede observar que el grupo que no alcanzó una respuesta

citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000 a 1,332,000

plaquetas/ml. En este grupo se encontró que un 62% presenta alteraciones hematológicas

como trombocitopenia, trombosis y leucopenia.

ABSTRACT The project goal is to quantify and evaluate the presence of different transcripts b2: a2, b3:

a3, e1: a2 from the chimeric BCR-ABL gene and its usefulness for the study of minimal

residual disease in leukemia acute lymphoblastic and chronic myeloid leukemia.

In the present study included 30 patients with chronic myeloid leukemia receiving imatinib

or nilotinib, to which were performed four quarterly monitoring, making a total of 120

determinations.

White blood cells or Blasts were obtained from bone marrow or peripheral blood by

ammonium lysis. RNA extraction and retrotranscription were performed. The BCR-ABL

and ABL gene copies were quantified by Real-Time PCR. Each monitoring was reported in

the international system.

Of the patients studied, 39% had an optimal response, 25% had a suboptimal response to

treatment and 36% has to therapy failure.

64% achieved a complete cytogenetic response (<1% IS), 43% have a major molecular

response (<0.1%) and finally the 36% that showed failure therapy did not achieve complete

cytogenetic response (> 1%).

The results obtained in the quantification of BCR-ABL, are comparable with those reported

in most similar studies.

As for the age, it is noteworthy that patients with chronic myeloid leukemia in Guatemala,

have a median age (<39 years) less than that reported in other countries, where the median

is between 50-60 years.

The platelet count shows that the group did not achieve a complete cytogenetic response

has more range of variation that goes from 89.000 to 1,332,000 platelets / ml. In this group

found that 62% have blood disorders including thrombocytopenia, thrombosis and

leukopenia.

OTROS AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al:

• Apoyo financiero y académico del Instituto de Investigación en

Enfermedades Genéticas y Metabólicas –INVEGEM-.

• Apoyo financiero de la Fundación Rozas-Botrán.

• Cooperación de la Unidad de Oncología Pediátrica –UNOP-

• Cooperación del Dr. Mauricio Villegas, Dr. Cáceres y Dra. Silvana Torselli.

BIBLIOGRAFÍA BREVE ACADÉMICA DE AUTORES .

1. Dra. Claudia Carranza PhD.

En el año 2004 se gradúo de Química Bióloga en la Universidad de San Carlos,

Posteriormente en el período 2005-2007 cursó un programa de Doctorado en Biología

Molecular y Celular, especializado en el área de Genética, en el Centro de Investigación

Médica Aplicada –CIMA- , Universidad de Navarra, Pamplona España. En el año 2008, se

incorpora en el Instituto de Investigación en enfermedades Genéticas y Métabolicas –

INVEGEM-, Guatemala; y también se incorpora como catedrática titular del curso de

Bioquímica Humana en la Facultad de Medicina, Universidad Francisco Marroquín. Su

línea de investigación se ha centrado en Genética humana, Biología Molecular del Cáncer,

Genética de neoplasias hematológicas. Actualmente se encuentra cursando un Máster en

Bioética en la Universidad del Istmo, Guatemala ( 2011-2012).

2. Licda. Swuanny Villagrán

Pensum cerrado de la carrera de Química biológica, de la Facultad de Farmacia,

Universidad San Carlos de Guatemala. Actualmente se encuentra laborando como

investigadora en el Instituto de Investigación de Enfermedades Genéticas y Metabólicas –

INVEGEM- .

TABLA DE CONTENIDOS :

PARTE I: I.1 INTRODUCCIÓN ………………………………………………............... 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL TEMA ……………………………………….. 3 I.2.1 Antecedentes en Guatemala………………………………………………. 3 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación…………………………............. 4 I.3 OBJETIVOS ……………………………………………………….. 6 I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General……………………………………………………. 6 I.3.1.2 Específicos………………………………………………… 6 I.3.2 Hipótesis……………………………………………………………. 8 I.4 METODOLOGÍA ………………………………………………………….. 9 I.4.1 Población…………………………………………………………………... 9 1.4.2 Indicadores………………………………………………………………… 9 I.4.3 Estrategia Metodológica…………………………………………………… 9 I.4.4 El Método………………………………………………………………….. 11 I.4.5 La técnica Estadística……………………………………………………… 19 1.4.6 Los instrumentos a utilizar………………………………………………… 19 PARTE II MARCO TEÓRICO ( CONCEPTUAL )……………………………………… 23 PARTE III III. RESULTADOS …………………………………………………………….. 44 III.1 Discusión de Resultados……………………………………………. 80 PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES………………………………………………………... 85 IV.2 RECOMENDACIONES ………………………………………………… 87 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………. 88 IV.4 ANEXOS…………………………………………………………………... 96 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO ……………………………………………….. 166

LISTA DE FIGURAS PAG. Figura No.1: Células mieloides inmaduras de un paciente con leucemia

mieloide crónica……………………………………………………………………. 26

Figura No. 2: Linfoblastos en un frote de médula ósea de un paciente

con leucemia linfoblástica aguda…………………………………………………… 28

Figura No. 3: Alteraciones genéticas encontradas en leucemia

linfoblástica aguda infantil (a) y adultos (b)………………………………………... 33

Figura No. 4: Esquema de la t(9;22) y la localización de los genes ABL y BCR…. 34

Figura No. 5: Translocación t(9;22)(q34:q11) en LMC……………………………. 36

Figura No. 6: Localización de los puntos de rotura en los genes ABL y BCR……. 37

Figura No. 7: Probabilidad de sobrevivencia libre de eventos, según el riesgo……. 41

Figura No. 8: Gráfica de seguimiento de paciente 13-LMC……………………….. 53

Figura No. 9: Gráfica de seguimiento de paciente 15-LMC. ……………………… 54

Figura No. 10: Gráfica de seguimiento de paciente 41-LMC……………………… 55













Figura No.23: Gráfica de seguimiento de paciente 43-LMC………………………. 68

LISTA DE FIGURAS PAG.

Figura No. 24: Gráfica de seguimiento de paciente 47-LMC…………………….. 69










Figura No. 34: Gráfica de seguimiento de paciente 50-LMC……………………. 79

Figura No. 35: Bandas comparando extracción de ARN con trizol y con kit……. 96

Figura No. 36: Almacenamiento de muestras de sangre periférica en RNAlater… 97

Figura No. 37: Trizol, reactivo que se utilizará para la extracción de ARN…….. 97

Figura No. 38: El reactivo trizol es agregado a las muestras…………………….. 98

Figura No. 39: El trizol de color rosa sobre la muestra de pacientes. …………… 98

Figura No. 40: Lisis con trizol de la muestra……………………………………… 99

Figura No. 41: Dispensación de cloroformo para la separación

de fases del ARN obtenido……………………………………………………….. 99

Figura No. 42: Tubo mezclado con cloroformo y trizol, listo para centrifugación... 100

Figura No. 43: Centrifugación de muestras para separación de fases……………... 100

Figura No. 44: Separación de fases; la fase superior lofórmica contiene el

ARNde interés……………………………………………………………………… 101

Figura No. 45: Dispensación de etanol para precipitación del ARN……………..... 101

Figura No. 46: Preparación de muestras y reactivos para QRT-PCR………………. 102

Figura No. 47: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL, primera evaluación del kit. 103


Figura No. 48: Amplificación de los estándares de BCR-ABL

Normalizada de la primera evaluación del kit……………………………. 103

Figura No. 49: Amplificación de los estándares de BCR-ABL, de la primera

evaluación del kit………………………………………………………………... 104

Figura No. 50: Amplificación normalizada de los estándares de ABL de la

primera evaluación del kit………………………………………………………. 104

Figura No. 51: Amplificación de los estándares de ABL, de la primera

evaluación del kit. ………………………………………………………………. 105

Figura No. 52: Amplificación del gen ABL de los controles positivos,

de la primera evaluación del kit…………………………………………………. 105

Figura No. 53: Amplificación de los controles positivos del gen BCR-ABL

normalizada, de la primera evaluación del kit…………………………………… 106


de la primera evaluación del kit…………………………………………………. 106

Figura No. 55: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL de la segunda

evaluación del kit. ……………………………………………………………….. 108

Figura No. 56: Amplificación de los estándares de ABL de la segunda

evaluación del kit……………………………………………………………….... 108

Figura No. 57: Amplificación de los estándares de ABL normalizada

de la segunda evaluación del kit. ………………………………………………… 109

Figura No. 58: Amplificación de los estándares de BCR-ABL de la segunda

evaluación del kit………………………………………………………………… 109

Figura No. 59: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada

de la segunda evaluación del kit……………………………………………….… 110


normalizada de la segunda evaluación del kit…………………………………… 110

Figura No. 61: Amplificación de los controles positivos del gen ABL

normalizada de la segunda evaluación del kit…………………………………… 111


Figura No. 62: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL de la evaluación

del segundo kit. ………………………………………………………………. 113

Figura No. 63: Amplificación de los estándares de ABL normalizada

de la evaluación del segundo kit………………………………………………. 113

Figura No. 64: Amplificación de los estándares de ABL de la evaluación

del segundo kit………………………………………………………………… 114

Figura No. 65: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada

de la evaluación del segundo kit……………………………………………………… 114

Figura No. 66: Amplificación de los estándares de BCR-ABLde la

evaluación del segundo kit…………………………………………………….. 115


normalizada de la evaluación del segundo kit…………………………………. 115


de la evaluación del segundo kit……………………………………………….. 116

Figura No. 69: Amplificación del gen ABL y BCR-ABL del primer

monitoreo de pacientes ………………………………………………………… 118

Figura No. 70: Curva de estándares de BCR-ABL y ABL del primer

monitoreo de pacientes. ………………………………………………………... 119

Figura No.71: Amplificación de los estándares de BCR-ABL normalizada

del primer monitoreo de pacientes……………………………………………… 119

Figura No. 72: Amplificación de los estándares de ABL normalizada del

primer monitoreo de pacientes………………………………………………….. 120

Figura No. 73: Amplificación de los controles positivos del gen ABL

normalizada del primer monitoreo de pacientes………………………………… 120


del primer monitoreo de pacientes………………………………………………. 121

Figura No. 75: Amplificación de muestras de pacientes de no. 1-11

del primer monitoreo……………………………………………………………. 121

Figura no. 76: Amplificación de muestras de pacientes de no. 1-11 normalizada

del primer monitoreo…………………………………………………………….. 122


Figura No. 77: Curva estándar de BCR-ABL de la segunda corrida del

Primer monitoreo de pacientes …………………………………………..….. 125

Figura No. 78: Curva estándar de ABL de la segunda corrida del

primer monitoreo de pacientes……………………………………………….. 125

Figura No. 79: Amplificación de cada una de las muestras, de la segunda

corrida del primer monitoreo de pacientes…………………………………… 126

Figura No. 80: Amplificación de los estándares de ABL normalizada de la

segunda corrida del primer monitoreo de pacientes………………………….. 126

Figura No. 81: Amplificación de los estándares de BCR-ABL

normalizada de la segunda corrida del primer monitoreo…………………….. 127

Figura No. 82: Amplificación de los controles del gen ABL de la segunda

corrida del primer monitoreo de pacientes…………………………………………. 127

Figura No. 83: Amplificación de los controles del gen BCR-ABL normalizada

de la segunda corrida del primer monitoreo……………………………………. 128

Figura No. 84: Amplificación de las muestras del gen BCR-ABL normalizada

de la segunda corrida del primer monitoreo……………………………………. 128

Figura No. 85: Amplificación de las muestras del gen ABL de la segunda

corrida del primer monitoreo…………………………………………………… 129

Figura No. 86: Curva estándar del gen ABL de la tercera corrida del

primer monitoreo de pacientes………………………………………………….. 130

Figura No. 87: Curva estándar del gen BCR-ABL de la tercera

corrida del primer monitoreo de pacientes……………………………………… 131

Figura No. 88: Amplificación de todas las muestras, de la tercera

corrida del primer monitoreo……………………………………………………. 131

Figura No. 89: Amplificación de los estándares del gen control ABL

normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo……………………….. 132

Figura No. 90: Amplificación de los estándares del gen control BCR-ABL

normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo.……………………… 132

Figura No. 91: Amplificación de las muestras del gen ABL

normalizada de la tercera corrida del primer monitoreo……………………….. 133


Figura No. 92: Amplificación del gen control BCR-ABL normalizada

de la tercera corrida del primer monitoreo……………………………………. 133

Figura No. 93: Amplificación de los cuatro estándares del gen control ABL

normalizada para la cuarta corrida del segunda jornada……………………… 135

Figura No. 94: Amplificación de los estándares del gen ABL de la cuarta

corrida del segunda jornada………………………………………………………….. 136

Figura No. 95: Amplificación del transcrito BCR-ABL de la cuarta corrida

del segunda jornada……………………………………………………………. 136

Figura No. 96: Amplificación del gen BCR-ABL de la cuarta corrida del

segunda jornada………………………………………………………………… 137

Figura No. 97: Curva estándar del gen control ABL de la cuarta corrida

del segunda jornada…………………………………………………………….. 137

Figura No. 98: Curva estándar del gen BCR-ABL de la cuarta corrida

del segunda jornada…………………………………………………………….. 138

Figura No. 99: Se observa la amplificación de los controles alto, mediano

y negativo del gen BCR-ABL………………………………………………… 138

Figura No. 100: Se observa la amplificación del gen control ABL en

las muestras de pacientes no. 11-25…………………………………………….. 139

Figura No. 101: Amplificación del gen ABL en muestras de pacientes de

la cuarta corrida segunda jornada………………………………………………. 139

Figura No. 102: Amplificación del gen control BCR-ABL en las muestras

de pacientes no. 11-35………………………………………………………….. 140

Figura No. 103: Se observa la amplificación del gen control BCR-ABL

en la muestras de paciente no. 11-25. …………………………………………. 140

Figura No. 104: Amplificación del gen BCR-ABL de muestras de pacientes

segundo monitoreo……………………………………………………………… 143

Figura No. 105: Amplificación del gen control ABLen muestras de pacientes

en el segundo monitoreo………………………………………………………… 144

Figura No. 106: Amplificación del gen BCR-ABL en el segundo monitoreo….. 144

Figura No. 107: Amplificación del gen BCR-ABL en el segundo monitoreo…. 145


Figura No. 108: Amplificación del gen control ABL normalizada en el

segundo monitoreo…………………………………………………………. 145

Figura No. 109: Amplificación de curva estándar del gen ABL en el

segundo monitoreo………………………………………………………….. 146

Figura No.110 : Amplificación de estándares y 10 pacientes,

del segundo monitoreo……………………………………………………… 146

Figura No. 111: Amplificación de muestras de pacientes del gen BCR-ABL

en la segunda jornada del segundo monitoreo…………………………….. 147

Figura No. 112: Amplificación del gen control ABL de los pacientes

analizados en la segunda jornada del segundo monitoreo…………………. 147

Figura No. 113: Amplificación de muestras y estándares de la segunda

jornada del segundo monitoreo……………………………………………... 148

Figura No. 114: Curva de estándares del gen control ABL de la segunda

jornada del segundo monitoreo……………………………………………… 148

Figura No. 115: Amplificación de muestras de 15 pacientes y curva estándar

de la tercera jornada del segundo monitoreo………………………………… 149

Figura No. 116: Amplificación de muestras de pacientes de la tercera jornada

del segundo monitoreo………………………………………………………. 149

Figura No. 117: Amplificación de gen control ABL de la tercera jornada

de la segunda monitoreo……………………………………………………… 150

Figura No. 118: Amplificación de curva estándar del gen BCR-ABL de la

tercera jornada del segundo monitoreo………………………………………. 150

Figura No. 119: Amplificación del gen ABLen muestras de pacientes de la

tercera jornada del segundo monitoreo………………………………………. 151

Figura No. 120: Amplificación del gen BCR-ABL de muestras de pacientes

del tercer monitoreo…………………………………………………………... 153

Figura No. 121: Amplificación del gen control ABL en muestras de

pacientes del tercer monitoreo……………………………………………….. 153

Figura No. 122: Amplificación del gen BCR-ABL del tercer monitoreo……. 154


Figura No. 123: Amplificación de curva estándar del gen ABL del

tercer monitoreo………………………………………………………………. 154

Figura No.124 : Amplificación de estándares y pacientes, del tercer monitoreo

Figura No. 125: Curva estándar del gen control ABL del tercer monitoreo…… 155

Figura No. 126: Curva estándar del gen BCR-ABL del tercer monitoreo……. 155

Figura No. 127: Amplificación de muestras de 15 pacientes y curva

estándar de la segunda jornada del tercer monitoreo…………………………… 158

Figura No. 128: Amplificación de gen control ABL de la segunda

jornada del tercer monitoreo…………………………………………………….. 159

Figura No. 129: Amplificación de estándares del gen ABL de la segunda

jornada del tercer monitoreo…………………………………………………….. 159

Figura No. 130: Amplificación de estándares del gen BCR-ABL de la segunda

jornada del tercer monitoreo……………………………………………………. 160

Figura No. 131: Amplificación del gen BCR-ABL de los pacientes analizados

de la segunda jornada del tercer monitoreo…………………………………….. 160

Figura No. 132: Gráfica de estándares de BCR-ABL de la segunda

jornada del tercer monitoreo……………………………………………………. 161

Figura No. 133: Curva estándar del gen ABL de la segunda jornada del

tercer monitoreo………………………………………………………………… 161

Figura No. 134: Amplificación de muestras y calibradores del cuarto monitoreo. 163

Figura No. 135: Amplificación de estándares del gen BCR-ABL del

cuarto monitoreo………………………………………………………………… 163

Figura No. 136: Amplificación de muestras del cuarto monitoreo…………….. 164

Figura No. 137: Amplificación de estándares del gen ABL del cuarto monitoreo 164

Figura No. 138: Curva estándar del gen control ABL del cuarto monitoreo….. 165

Figura No. 139: Curva estándar del gen BCR-ABL del cuarto monitoreo……. 165

LISTA DE TABLAS PAG.

Tabla No. 1: Peso molecular de transcritos…………………………. 18

Tabla No. 2 Clasificación citomorfológica de leucemias agudas

linfoblásticas (lal) de acuerdo al grupo cooperativo franco americano

- británico (fab)……………………………………………………… 30

Tabla No.3: Resultados de los cuatro monitoreos de los

pacientes analizados………………………………………………….. 45

Tabla No 4: Evaluación de la respuesta al tratamiento imatinib……. 48

Tabla No. 5 : Respuesta al imatinib del total de pacientes analizados. 49

Tabla No. 6: Pacientes y las respuestas alcanzadas………………….. 50

Tabla No 7: Respuesta al imatinib alcanzada durante el monitoreo

molecular……………………………………………………………… 50

Tabla No. 8: Datos clínicos y hematológicos…………………………. 52

Tabla No. 9: Resultado de MCGR, CCGR y MMR en distintos estudios 82

Tabla No. 10: Parámetros evaluados durante la primera corrida……… 107

Tabla No. 11: Parámetros evaluados durante la primera corrida. …….. 112

Tabla No. 12: Parámetros evaluados durante corrida………………….. 117

Tabla No. 13: Parámetros evaluados…………………………………... 123

Tabla No.14: Resultados de pacientes primera corrida………………… 124

Tabla No. 15: Resultados de pacientes de segunda corrida……………. 129

Tabla No. 16: Resultados de tercera corrida de pacientes……………… 134

Tabla No. 17: Resultados globales de los 10 pacientes ………………… 134

Tabla No. 18 : Resultados obtenidos de la corrida de pcr en tiempo real de

los pacientes 11-25……………………………………………………… 141

Tabla No. 19: Resultados e interpretación de los pacientes……………. 142

Tabla No. 20 resultados de validación de corridas del tercer monitoreo 152

Tabla No. 21: Resultados en numero de copias de BCR-ABL……….. 157

Tabla No. 22: Resultados de validación de corridas…………………... 157

RESUMEN El objetivo general del proyecto Fodecyt No. 24-2010 es cuantificar y evaluar la

presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 quiméricos del gen BCR-ABL y su

utilidad para el estudio de enfermedad mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y


En el presente estudio se incluyeron 30 pacientes con leucemia mieloide crónica y que

reciben tratamiento con imatinib o nilotinib; a los cuales se les realizaron 4 monitoreos

trimestralmente; haciendo un total de 120 determinaciones. Para ello se obtuvieron los

glóbulos blancos y/o blastos de médula ósea y/o sangre periférica, mediante lisis de

amonio. Se realizó extracción de ARN y retrotranscripción. Posteriormente se

cuantificaron las copias del gen quimérico BCR-ABL y del gen control ABL, mediante

PCR en Tiempo Real. Cada monitoreo se reportó en el sistema internacional.

Del total de pacientes analizados, el 39% presentó una respuesta óptima, un 25% presentó

una respuesta sub-optima al tratamiento y un 36% tiene un fallo a la terapia.

Un 64% alcanzaron una respuesta citogenética completa (<1%IS), un 43% tienen una

respuesta molecular mayor (<0.1%) y por último el 36% que presentó fallo a terapia no

alcanzó la respuesta citogenética completa (>1%).

Los resultados obtenidos en la cuantificación del gen BCR-ABL, son comparables con los

reportados en la mayoría de estudios similares.

En cuando a la edad, cabe destacar que se puede observar que los pacientes con leucemia

mieloide crónica en Guatemala, tienen una mediana de edad (<39 años) menor que la

reportada en el resto de países, en donde la mediana de esta enfermedad se encuentra entre

50-60 años.

En el recuento de plaquetas se puede observar que el grupo que no alcanzó una respuesta


plaquetas/ml. En este grupo se encontró que un 62% presenta alteraciones hematológicas

como trombocitopenia, trombosis y leucopenia.

ABSTRACT The project goal is to quantify and evaluate the presence of different transcripts b2: a2, b3:

a3, e1: a2 from the chimeric BCR-ABL gene and its usefulness for the study of minimal

residual disease in leukemia acute lymphoblastic and chronic myeloid leukemia.

In the present study included 30 patients with chronic myeloid leukemia receiving imatinib

or nilotinib, to which were performed four quarterly monitoring, making a total of 120

determinations.

White blood cells or Blasts were obtained from bone marrow or peripheral blood by

ammonium lysis. RNA extraction and retrotranscription were performed.

The BCR-ABL and ABL gene copies were quantified by Real-Time PCR. Each monitoring

was reported in the international system.

Of the patients studied, 39% had an optimal response, 25% had a suboptimal response to

treatment and 36% has to therapy failure.

64% achieved a complete cytogenetic response (<1% IS), 43% have a major molecular

response (<0.1%) and finally the 36% that showed failure therapy did not achieve complete

cytogenetic response (> 1%).

The results obtained in the quantification of BCR-ABL, are comparable with those reported

in most similar studies.

As for the age, it is noteworthy that patients with chronic myeloid leukemia in Guatemala,

have a median age (<39 years) less than that reported in other countries, where the median

is between 50-60 years.

The platelet count shows that the group did not achieve a complete cytogenetic response

has more range of variation that goes from 89.000 to 1,332,000 platelets / ml. In this group

found that 62% have blood disorders including thrombocytopenia, thrombosis and

leukopenia.

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

En general, el cáncer sigue siendo un reto para la ciencia pues hasta el momento su

porcentaje de curación es muy bajo. Sin embargo, actualmente una gran variedad de

instituciones se han dedicado a investigar este tipo de enfermedades con el fin de tener un

mayor conocimiento de cómo se produce, y de esta manera poder encontrar un tratamiento

adecuado.

Las neoplasias suelen ser de origen genético adquirido es decir que se presentan como

resultado de una gran variedad de alteraciones genéticas, que pueden ir desde mutaciones,

deleciones e inserciones en genes; hasta pérdidas o ganancias de varios cromosomas.

Se han encontrado una gran variedad de marcadores genéticos asociados a los

distintos tipos de neoplasias; y se ha visto que estos marcadores pueden dar una gran

variedad de información al médico, hasta permitirle un diagnóstico certero, darle

información sobre el pronóstico, e incluso orientar a tratamientos más específicos.

Las neoplasias hematológicas se han estudiado ampliamente mediante técnicas

citogenéticas y moleculares. Este hecho ha permitido conocer mejor los mecanismos

alterados relacionados con el desarrollo de la neoplasia. Las neoplasias hematológicas

forman un grupo de enfermedades que provienen de la expansión clonal de células

hematopoyéticas y constituyen una colección heterogénea de neoplasias originadas en el

tejido formador de la sangre.

La leucemia linfoblástica aguda es un tipo de neoplasia hematológica que se

caracteriza por la alteración del crecimiento de las células de la línea hematopoyética

linfoide. Esta enfermedad se encuentra frecuentemente en la población en general. Se han

asociado a esta leucemia una gran variedad de marcadores genéticos, que brindan

información muy importante y que además son el blanco de estudio de muchos científicos.

Uno de los marcadores encontrados frecuentemente en LLA es la alteración BCR-ABL,

que suele ser de muy mal pronóstico. Se han encontrado una gran variedad de transcritos

(b2:a2, b3:a3, e1:a2) producidos por esta alteración.

El marcador genético BCR-ABL también se encuentra presente en leucemias

mieloides crónicas en un 90%. Sin embargo, en esta enfermedad se conoce que funciona

muy bien un tratamiento conocido con el nombre de Imatinib, que fue producido

específicamente para la alteración BCR-ABL. Es importante estudiar este marcador

también en LMC, debido a que el tratamiento con Imatinib posee un costo muy elevado,

por lo que debe administrarse únicamente en pacientes que posean dicha alteración.

En Guatemala, no se ha estudiado con anterioridad la genética de las leucemias, y

además por lo mismo no se ha podido contar con esta herramienta para el mejor manejo de

la enfermedad. Actualmente el Instituto de Investigaciones en Genética –INVEGEM- de la

Fundación Rozas-Botrán ha empezado este tipo de proyectos; el primer proyecto de

investigación ya concluido fue sobre cuatro marcadores genéticos asociados a LLA ( E2A-

PBX1, MLL-AF4, ETV6-AML1 y BCR-ABL), con el fin de orientar sobre el pronóstico y

tratamiento de la misma; este proyecto también obtuvo de co-financiación de la Secretaría

nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT-, mediante su línea FODECYT. Y luego

también se goza de financiamiento de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología,

mediante su línea FODECYT para determinar la presencia de monosomía del cromosoma 7

en pacientes con leucemia mieloide aguda.

Para continuar con el avance en el estudio de las neoplasias hematológicas, se ha

planteó cuantificar, mediante técnicas moleculares, la presencia de los distintos transcritos

(b2:a2, b3:a3, e1:a2) del gen BCR-ABL. Una vez evaluada la presencia de estos

marcadores, se procedió a utilizarlos para monitorear la respuesta al tratamiento; así como

para detectar la presencia de enfermedad mínima residual, es decir determinar la presencia

periódica de clones celulares con alguno de estos marcadores, que puedan indicar una

posible recaída.

Con este estudio se pretendió por un lado continuar con la caracterización genética de

leucemias de la población guatemalteca; así como ayudar al hemato-oncólogo en el manejo

de la enfermedad, al realizar un monitoreo periódico de la presencia de dichos marcadores.

Se analizaron un total de 30 pacientes con diagnóstico clínico de leucemia

linfoblástica aguda, a los cuales se les realizó un total de 4 monitoreos del % BCR-

ABL/ABL espaciados por 3-4 meses.

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala)

En Guatemala, la genética humana se encuentra desarrollada pobremente.

Actualmente no existen publicaciones guatemaltecas que involucren estudios de genética en

humanos. La biología molecular es una herramienta útil para el área de genética humana.

Los estudios sobre enfermedades de origen genético como las neoplasias

hematológicas poseen un alto impacto en países en vías de desarrollo como Guatemala.

Pues gracias a estos estudios se puede apoyar en diagnóstico y pronóstico al clínico

hematólogo. Y por otro lado también es posible la caracterización genética de nuestra

población en distintas enfermedades.

El único estudio epidemiológico sobre leucemias infantiles realizado en

Centroamérica, incluyendo México, fue el realizado por Arangúre y colaboradores; en

donde se incluyeron datos de pacientes desde 1996 hasta el 2000. El promedio anual de

incidencia obtenido fue de: 44.9 por millón de niños para leucemia linfoblástica aguda –

LLA-( el principal tipo de leucemia infantil). (1)

A nivel mundial, principalmente en países desarrollados se han implementado como

técnicas de rutina, el análisis de la presencia de distintos marcadores genéticos para cada

una de las neoplasias hematológicas. Además se esta realizando una amplia investigación

para conocer mejor el desarrollo de esta afecciones, para encontrar también nuevos

biomarcadores y para establecer nuevas estrategias terapéuticas.(2)

En España, se ha tenido experiencia personal en la caracterización genética de

neoplasias hematológicas mediante la utilización de distintas técnicas moleculares

citogenéticas, principalmente en la búsqueda de nuevos mecanismos que expliquen la

sobreexpresión del gen EVI1, un gen importante en leucemias mieloides agudas. (3)

En Guatemala, El Instituto de Investigaciones en Genética –INVEGEM- de la

FUNDACIÓN ROZAS-BOTRÁN; formado por la inquietud de varios investigadores

guatemaltecos y extranjeros en desarrollar la genética humana en Guatemala, y ser una

institución a la vanguardia en los países centroamericanos; se encuentra desarrollando una

gran variedad de proyectos relacionados.

En el área hemato-oncológica, nuestro equipo se encuentra desarrollando el primer

proyecto de investigación en Guatemala sobre neoplasias hematológicas. Este proyecto se

inició en el año 2009, y contó con financiamiento de la Secretaría Nacional de Ciencia y

Tecnología –SENACYT-, a través de su línea FODECYT. El objetivo global de este

estudio es detectar la presencia de los transcritos de fusión BCR-ABL, E2A-PBX1, MLL-

AF4 y ETV6-AML1 en leucemia linfoblástica aguda; estos transcritos confieren

información importante sobre el pronóstico y el tipo de terapia a escoger. Con este proyecto

se ha empezado un largo y extenso objetivo que es el de caracterizar genéticamente las

neoplasias hematológicas en la población guatemalteca. Todo esto a largo plazo nos

permitirá seleccionar algunos genes importantes, con el fin de estudiar sus funciones,

mecanismos de activación, etc. Y con todo esto describir nuevos procesos y buscar nuevos

tratamientos más eficaces (4)

Para continuar con este extenso proyecto, ahora se ha planteado cuantificar los

transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 del gen BCR-ABL. Y se piensa dar un paso más que el

proyecto anterior, ya que con los marcadores encontrados se va a monitorear la respuesta al

tratamiento de la enfermedad; y también se buscará encontrar la presencia de enfermedad

mínima residual.

En los países cercanos a Guatemala, el único que ya ha realizado el estudio de los

distintos transcritos del gen BCR-ABL fue el realizado por Arana, et al. en el país de

México en el año 2002. En donde se caracterizaron 250 pacientes con leucemia mieloide

crónica. (5)

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

Las técnicas moleculares y citogenéticas se han convertido en países desarrollados en

herramientas clínicas importantes en neoplasias; pues sirven de soporte para el manejo

global de la enfermedad. Ya que como se ha descrito anteriormente proporcionan

información para obtener un diagnóstico más certero; así como indican el pronóstico de la

enfermedad, orientan al tratamiento y permiten el monitoreo del avance de la misma.

La utilización de estas técnicas en países en vías de desarrollo ha sido muy limitada;

debido a que suelen ser procedimientos de alto coste económico y además también por la

falta de personal calificado para realizar la misma.

Actualmente en Guatemala, no se cuenta con el apoyo de estas técnicas para el

manejo de neoplasias hematológicas; es por esta razón que INVEGEM, se ha propuesto el

desarrollo de las mismas, con el fin de detectar los marcadores genéticos principales en

nuestro país, y ponerlos a disposición de toda la población afectada por algún tipo de

leucemia. Con ello se pretende proporcionar un nuevo panorama al hemato-oncólogo en el

manejo de leucemias; y con ello lograr que una mayor cantidad de pacientes remitan y no

vuelvan a presentar recaídas.

La cuantificación de los distintos transcritos de BCR-ABL en la población

guatemalteca, permitirá monitorear la presencia de enfermedad mínima residual.

Por otro lado este proyecto permitirá continuar con la caracterización genética de las

leucemias en Guatemala, y con ello detectar los marcadores asociados a nuestra población;

para posteriormente seleccionar algunos para la realización de estudios más específicos

sobre mecanismos de acción, mutaciones, y búsqueda de nuevas opciones terapéuticas.

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 OBJETIVOS

I.3.1.1 Objetivo General

• Cuantificar y evaluar la presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2

quiméricos del gen BCR-ABL y su utilidad para el estudio de enfermedad

mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica.

I.3.1.2 Objetivos Específicos

• Cuantificar y evaluar la presencia de los distintos transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2

quiméricos del gen BCR-ABL y su utilidad para el estudio de enfermedad

mínima residual en leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica.

• Estandarizar la técnica de PCR en tiempo real para cuantificar los distintos

transcritos de b2:a2, b3:a3, e1:a2 producidos por la translocación BCR-ABL.

• Evaluar la presencia de los transcritos b2:a2, b3:a3, e1:a2 del gen quimérico

BCR-ABL mediante RT-PCR en todos los pacientes con leucemia linfoblástica

aguda y leucemia mieloide crónica.

• Monitorear y evaluar la respuesta al tratamiento de los pacientes con leucemia

linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica, mediante la cuantificación

periódica (cada 3-4 meses) de los transcritos de BCR-ABL encontrados.

• Establecer la presencia de enfermedad mínima residual en los pacientes con

leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide crónica que han recibido

tratamiento.

• Divulgar los resultados obtenidos, a las distintas entidades que atienden

pacientes con leucemias para ofrecerles el mismo servicio.

I.3.1 Hipótesis descriptiva

Nuestra hipótesis es que la cuantificación de la presencia de los transcritos b2:a2,

b3:a3, e1:a2 del gen quimérico BCR-ABL en leucemia linfoblástica aguda y en leucemia

mieloide crónica; permitirá monitorear el desarrollo de enfermedad mínima residual, de

manera que se evite las posibles recaídas que la leucemia pueda presentar.

.

I.4 METODOLOGÍA (INCLUYE LA LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA )

I.4.1 LOCALIZACIÓN

El presente estudio, analiza pacientes con leucemia mieloide crónica y/o leucemia

linfoblástica aguda provenientes de todos los departamentos de Guatemala; y que han sido

referidos al Hospital San Juan de Dios y Hospital Roosevelt.

I.4.2 INDICADORES

La determinación del porcentaje en el sistema internacional, se obtendrá de la relación

copias BCR-ABL/copias ABL *100 * factor de conversión. Dichos datos se obtendrán de

un analizador llamado Real Time PCR fast 7500 de APPLIED BIOSYTEMS

I.4.3 ESTRATEGIA METODOLÓGICA

El estudio que se pretende realizar es de tipo descriptivo longitudinal prospectivo,

esto debido a que se cuantificará la presencia de los distintos transcritos de manera

periódica; cada 3 ó 4 meses, una vez identificado la presencia de alguno de ellos en medula

ósea, y con esto se pretende monitorear el transcurso de la enfermedad. Esto se realizará

por el período de un año y medio; una vez iniciado el proyecto.

I.4.3.1 POBLACIÓN

La población objetivo de este estudio la integran todos los pacientes con

diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda o leucemia mieloide crónica; sin

importar la edad, ni el tiempo de padecer la enfermedad que posean cualquier

transcrito de BCR-ABL positivo, para permitir el monitoreo de la enfermedad.

I.4.3.2 TÉCNICA DE MUESTREO Y CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y

EXCLUSIÓN.

La técnica de muestreo a utilizar es por conveniencia. Y los criterios de inclusión

son:

• Paciente con leucemia linfoblástica aguda o leucemia mieloide crónica

• Edad: 0 años a 99 años.

• Casos nuevos o paciente ya en tratamiento

• Presencia de algún transcrito de BCR-ABL

Y los Criterios de exclusión son:

• Paciente que presente otras formas de leucemia

• Casos que presenten transcritos diferentes de BCR-ABL

I.4.3.3 MUESTRA

Pacientes con diagnóstico de Leucemia linfoblástica aguda y leucemia

mieloide crónica referidos por el Doctor hematólogo Julio Caceres, presidente de la

asociación para tratamiento con Imatinib de pacientes BCR-ABL positivo; o

referidos del área de hematooncología del IGGS, del Hospital de Quetzaltenango y

del Hospital Roosevelt; que presenten todos los criterios de inclusión mencionados

anteriormente. La cantidad de muestras que se analizará, serán todas las

recolectadas en el período de un año y medio de realización del proyecto ( 100

aproximadamente), cuya fecha de inicio dependerá de la fecha de inicio del

proyecto.

I.4.3.4 PLAN ESTADÍSTICO

Al ser un estudio de tipo descriptivo, no se aplicará ningún modelo

estadístico, únicamente se cuantificará la presencia del transcrito para monitoreo de

la enfermedad.

I.4.3.4 EVALUACIÓN BIOETICA

Se solicitará mediante un consentimiento escrito informado la aceptación expresa de

los pacientes de participar en el estudio y proporcionar los datos necesarios para su

ejecución, en el caso de tratarse de menores de edad, el encargado responsable del

paciente debe aceptar el consentimiento; los niños que estén en uso de razón

firmarán la hoja de asentimiento.

I.4.3.4 IMPACTO AMBIENTAL

El único compuesto que es tóxico que se utilizará en el presente proyecto es el

bromuro de etidio, el cual se eliminará mediante el uso de carbón activado. Los

líquidos contaminados con bromuro de etidio se filtrarán con carbón activado para

su posterior eliminación. Los residuos solidos se colocarán en contacto con carbón

activado y posteriormente se enviarán para su incineración.

I.4.4 MATERIALES Y MÉTODOS

I.4.4.1 MATERIALES Y REACTIVOS.

A. Médula ósea de pacientes diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda o


B. Kit para extracción de linfocitos de médula ósea (FICOLL, GENERAL

ELECTRIC)

C. Kit de extracción de RNA (APPLIED BIOSYSTEMS, USA)

D. Reactivos para retrotranscripción (APPLIED BIOSYSTEMS, USA)

• H2O DEPC

• Hexámeros

• dNTPs

• Buffer 5X

• DTT

• RNASE outTM

• enzima Transcriptasa

• Tubos eppendorf 1.5 ml RNAsa free

• Tubos eppendorf 0.5 ml y 0.2ml RNAsa free

• Hielo seco

E. PCR calidad cDNA

• Tris (10mM) pH 8,3

• MgCl2 (1.5 mM)

• KCl (50mM)

• dNTPs (0.25mM de dATP, dCTP, dTTP y dGPT)

• Oligonucleótidos (0.5 µM de A2 y C3)

• Taq Gold (1.5 U/µl)

• EDTA

• H2O DEPC

F. Reactivos de reacción de cadena de polimerasa

• Cebadores de los transcritos de fusión del gen BCR-ABL (p190,p210 y p230)

• Buffer PCR (10x)

• MgCl2 (50 mM)

• dNTPs (10mM)

• Taq Gold (5unids/µl)

• H2O DEPC

• Agarosa

• Buffer TAE

G. Curva de estandarización para cuantificación absoluta

• Estándar para transcritos de BCR-ABL

• Kit de clonación

• Primers

• Kit de purificación de plásmidos

• Kit de transcripción

• DNAsa I

• Caldo de cultivo LB

• Medio LB sólido

• IPTG

• X-gal

• Antibióticos

• Glicerol

• Fragmentos de DNA sintético

• Secuenciación de fragmentos de DNA amplificados anteriormente

• Cajás de petri

• Tubos falcon de 50 ml


• crioviales

H. Controles positivos y su cultivo

• Se escogerán tres de las siguientes líneas celulares humanas: CML-T1,

HNT-34, JURL-MK1, JURL-MK2, K-562, KCL-22, SUP-B15,

TOM1.

• Medio RPMI 1640

• Suero fetal bovino

• antibióticos

• Glutamina

• Fitohemaglutinina

• Tubos falcon 15 ml


• Frascos para cultivo celular

• Crioviales

• Nitrógeno líquido

• DMSO

• Bromuro de etidio (Sigma-Aldrich)

• Colcemid

• Cloruro de potasio KCl

• Metanol

• ácido acético glacial (3:1)

• tubos eppendorf de 1.5 ml

• Hank’s solución balanceada 10X libre de calcio y magnesio

• Solución de tripsina 5% w/v;

• Tinción Giemsa modificada para tinción de cromosomas

• Timidina

• fluorodeoxiuridina

• Portaobjetos

• Cubreobjetos

• Heparina sódica

• Pipetas serológicas

• Pipetas automáticas

• Gradillas

• Equipo de filtración al vacío

• tubos vacutainer con heparina sódica

• pipetas Pasteur

• tubos de 50 mL para contener el medio

• Puntas con o sin filtro de distintos tamaños

• Kimwipes

• Guantes

• Parafilm

I. PCR en tiempo real

• Primer 10 picomoles

• Sonda Taqman MGB 6000 pico moles

• Taqman Control RNA 100 ul

• Taqman Fast Universal PCR master Mix

• Nuclease Free water 500 ml

• Micro Amp adhesive aplicator

• Micro amp 96 well film 100 per Pack

• Microamp Fast optical reaction plate 100 per Pack

• High capacity cDNA transcription kit 200 reaction

• DNAZAP

• Rna later 100 ml

• RNA ZAP

• RnasFree Micro tubes 1.5( 500 tubes)

• Barrier tips 10 ul 8x12 racks





• Micro amp optical 8 tube strip

• Micro amp optical 8 strip cap

J. Equipos

• Termociclador

• Termociclador para PCR EN TIEMPO REAL

• Vórtex

• Equipo de electroforesis

• Transiluminador

• Autoclave

• Centrifugas de alta velocidad

• Tanque almacenador de nitrógeno líquido; para almacenar líneas

celulares.

• Congelador -20

• incubadora con 5% de CO2

• soporte para tubos de 50 mL

• centrifuga

• vortex

• jarras coplin

• cronómetro

• estufa para secar láminas

• refrigeradora

• Portaobjetos

• Cubreobjetos

• Microscopio óptico

• Soporte para tinción

• Bandeja para tinción

• Secadora

• Campana de flujo laminar

I.4.4.2 PROCEDIMIENTO

La metodología utilizada para el análisis molecular se ha obtenido de estudios

realizados por Martinelli y colaboradores en el año 2001, Hochhaus y colaboradores en el

año 1999 y 2007; Naoe y colaboradores en el año 2008; Fenaux y colaboradores en el año

1999; Lee y colaboradores en el año 2002; Lerma y colaboradores en el año 2000; Rosas y

colaboradores en el año 2003 ( ver Anexo No.1) (6-10).

A. Obtención de muestras de pacientes

Se solicitará mediante un consentimiento escrito informado la aceptación expresa de

los pacientes de participar en el estudio y proporcionar los datos necesarios para su

ejecución, en el caso de tratarse de menores de edad, el encargado responsable del paciente

debe aceptar el consentimiento (Anexo 1). Las muestras de médula ósea se obtendrán de

pacientes referidos por el Doctor hematólogo Julio Caceres y por el jefe de

hematooncología del IGSS; así como el hospital de Quetzaltenango y el Roosevelt,

principalmente; con diagnóstico de LMC y LLA durante el período comprendido de un año

y medio, correspondientes a enero 2011 a julio del 2012.

Las muestras se recolectarán mediante punción aspirativa de 1 cm3 de sangre

medular con aguja de 0,8 mm de diámetro, mediante técnica aséptica en cresta ilíaca

posterosuperior o en esternón. Las muestras de médula ósea serán colocadas en un tubo de

10cc con EDTA (Vacutainer®) para el diagnóstico molecular los cuales se conservarán a 4º

C hasta el momento del envío al laboratorio de referencia. El tiempo transcurrido desde la

extracción de las muestras hasta su procesamiento en el laboratorio no debe ser superior a

las 24 horas.

B. Obtención linfocitos de sangre periférica (pbls)

La separación de células mononucleares de sangre periférica se realizará utilizando

gradientes de densidad FICOLL (General Electric) (9). Las células obtenidas se

almacenarán en RNAlater a -20 C hasta su uso.

C. Extracción RNA a partir de PBLS (kit de applied biosystems)

El RNA total se extraerá utilizando el producto comercial RNAaqueous (APPLIED

BIOSYSTEMS, USA) a partir de las suspensiones de linfocitos obtenidos en el proceso

anterior. Se seguirá el procedimiento establecido en el manual del mismo kit ( ver manual

en www.appliedbiosytems.com ).

D. Retrotranscripción y amplificación (kit de RT applied biosystem)

Para la síntesis de cDNA se utilizará 1µg de RNA total con la enzima Multiscribe

(APPLIED BIOSYSTEMS) con hexámeros al azar en 20µl de reacción en condiciones

estándar.

La PCR para la evaluación de los transcritos de fusión del gen quimérico BCR-ABL, se

estandarizará con las siguientes condiciones: 5 minutos a 94ºC, 35 ciclos de 60 segundos a

94º C , 65 segundos a 55º C y 65 segundos a 72º C, seguidos por una extensión final de 5

minutos a 72º C. Se evaluarán los resultados según la tabla que se presenta a continuación:

TABLA No. 1: PESO MOLECULAR DE TRANSCRITOS

Fuente: FODECYT 24-2010

Translocación Transcrito Peso molecular (bp)

t(9;22) p210 (b3:a2) 407

t(9;22) p210 (b2:a2) 333

t(9;22) p190 (e1:a2) 281

Se tomarán las precauciones descritas por Kwok e Higuchi para mantener la calidad

de la reacción de la cadena de la polimerasa, y la secuencia de cebadores según las descritas

por Arana, et al. (5).

E. Visualización en gel de agarosa

Los productos de PCR se visualizarán mediante electroforesis en un gel de agarosa al

1.5 %, después de la tinción con bromuro de etidio.

F. Comprobación de calidad del cDNA obtenido (gen ABL)

Para comprobar que la RT había sido correcta, y de forma indirecta conocer la

integridad del ARN utilizado, se amplificara una secuencia del gen ABL, presente en todas

las células del organismo. Para ello se utilizaron los oligonucleótidos A2 y CA3

correspondientes al gen ABL según la técnica descrita por Cross (11-15).

G. Curva de estandarización de cuantificación de transcritos

Se clonarán los productos obtenidos de la RT-PCR, amplificada con los primers

descritos anteriormente. Los transcritos se clonaran utilizando un kit de clonación de

novagen (perfectly blund), posteriormente se extraerán los plásmidos que contienen la

secuencia clonada. Este DNA que se encuentra dentro de los plásmidos se utilizará para

construir la curva estándar para la cuantificación de cada uno de los transcritos de BCR-

ABL; se realizaran diluciones seriadas empezando de 104 copias de plásmido hasta 108;

por triplicado.

H. Controles positivos

Se escogerán tres de las siguientes líneas celulares humanas: CML-T1, HNT-34,

JURL-MK1, JURL-MK2, K-562, KCL-22, SUP-B15, TOM1. Estas se cultivarán según lo

especificado por manual que acompaña cada línea celular de la casa comercial ATCC y se

almacenarán en nitrógeno líquido (ver procedimiento de cada línea celular en

www.atcc.org

I. Estandarización de PCR en tiempo real

Se utilizará el equipo para PCR en Tiempo Real, FAST 7500 de APPLIED BIOSYSTEMS,

se procederá a realizar y validar la curva de estandarización para la cuantificación absoluta

de los distintos transcritos de BCR- ABL.

Una vez validada la curva de estandarización, se procederá a cuantificar los transcritos

presentes en las médulas óseas analizadas de los pacientes con LLA o LMC, para realizar

esto se seleccionarán las condiciones de PCR, según el artículo escrito por Martenelli en el

2001. Del mismo artículo se obtendrán las secuencias para los cebadores y las sondas. Se

espera obtener resultados en 40 minutos a 2 horas.

J. Monitoreo de enfermedad mínima residual (EMR)

El monitoreo de la enfermedad se realizará con todos los pacientes con LLA y LMC

referidos que expresen al menos uno de los transcritos de BCR-ABL; El transcrito que se

encuentre presente se cuantificará cada 3-4 meses para monitorear el avance de la

enfermedad. Se espera que si el paciente está respondiendo bien a la quimioterapia, las

cantidades de los transcritos vayan decayendo hasta volverse negativos. Si por determinada

situación el paciente empezará a presentar una recaída una vez ya hayan estado negativos

las cantidades de los transcrito; esto se interpretará como la presencia de enfermedad

mínima residual, y se notificará inmediatamente al médico para que tome las medidas que

considere pertinentes.

K. Análisis de resultados

La recopilación de información del paciente y de los exámenes realizados se

realizará mediante el uso de la boleta de recolección de datos siguiente:

INVEGEM BOLETA DE RECOLECCION DE DATOS

IDENTIFICACION DEL PACIENTE

Iniciales de paciente

No. de Historia

Clínica

Código del paciente

DATOS SOCIODEMOGRÁFICOS

Edad

Género Masculino Femenino

INFORMACION CLINICA

Clasificación de

leucemias

según FAB

LLA 1 LMC2

DATOS

HEMATOLOG

ICOS

Recuento de Leucocitos:

Recuento de Plaquetas:

Nivel de Hemoglobina:

DATOS

CITOGENETI

COS

MARCADORE

S GENETICOS

Transcritos de

fusión del gen

BCR-ABL

e1a2 (p190 BCR-ABL)

P3 A4

b2a2 (p210 BCR-ABL) P A

b3a2 (p210 BCR-ABL) P A

e19a2 (p230 BCR-ABL) P A

CUANTIFICA 2 3 4 5 6

CIÓN DEL

TRANSCRITO

BCR-ABL

1

CONTR

OL

CONTR

OL

CONTR

OL

CONTRO

L

CONTR

OL

CONTR

OL

CANTIDAD

DE

TRANSCRITO

CLAVE 1: Leucemia linfoblástica aguda 2: Leucemia mieloide crónica 3: Presente

4: Ausente

PARTE II

MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)

A. APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CITOGENÉTICAS Y MOLECULA RES EN

EL ESTUDIO DEL CANCER

El cáncer es una enfermedad en la que se produce un crecimiento desordenado de un

clon celular, debido a una alteración en el proceso de crecimiento celular, en la

diferenciación celular o en la apóptosis celular.

Es una enfermedad considerada de origen genético adquirido; esto quiere decir que

su causa son las distintas alteraciones genéticas que se han desarrollado y adquirido con el

transcurso del tiempo.

Las principales técnicas que actualmente se utilizan para el diagnóstico, pronóstico

y monitoreo de las neoplasias son las técnicas citogenéticas y las moleculares.

Las técnicas de análisis citogenético permiten estudiar de manera global los 46

cromosomas, y detectar cualquier alteración presente. Estas técnicas se han desarrollado

más en neoplasias hematológicas debido a la facilidad de obtención de metafases en tejidos

líquidos. En neoplasias sólidas se tiene la dificultad de obtención de metafases adecuadas,

por lo que la utilidad de las técnicas citogenéticas es limitada.

Las técnicas de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa –

PCR- y sus distintas variedades, se han desarrollado también ampliamente para el estudio

de distintas neoplasias. Sin embargo estas técnicas no son pruebas de screening, por lo que

se necesita conocer específicamente la alteración genética que se desea estudiar. Entre las

ventajas de las técnicas moleculares sobre las citogenéticas es que poseen una mayor

sensibilidad y especificidad.

En el estudio de neoplasias hematológicas es posible la aplicación de métodos de

biología molecular por medio de la detección de transcritos (mRNA de una sección

genética especifica). Estas técnicas son de gran utilidad para el diagnóstico, pronóstico y

monitoreo de la enfermedad mínima residual (EMR) y, por tanto, ayudan en las decisiones

clínicas para definir nuevas estrategias terapéuticas que favorezcan la disminución de la

actividad oncogénica (7).

En resumen para un estudio genético completo de una neoplasia hematológica y

algunos tumores sólidos se recomienda utilizar tanto las técnicas citogenéticas como las

moleculares (1, 2, 3, 6, 8-12).

B. NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

Las neoplasias hematológicas forman un grupo de enfermedades que provienen de

la expansión clonal de células hematopoyéticas. La leucemia constituye una colección

heterogénea de neoplasias originadas en el tejido formador de sangre, que se caracteriza por

la expansión clonal de células hematopoyéticas como resultado de una alteración en los

mecanismos de proliferación, diferenciación y muerte celular, en cualquiera de las etapas

de maduración de las células sanguíneas, habitualmente acompañada de la invasión al

torrente sanguíneo y producción de metástasis, con mayor o menor grado de

desorganización de los tejidos invadidos (6-15).

Las leucemias se clasifican basándose en el tipo de células afectadas y en su estado

de maduración. Las agudas se caracterizan por la presencia de células muy inmaduras

(denominadas blastos) y por un curso rápidamente mortal. Las crónicas se caracterizan por

una población expandida de células que proliferan y que conservan su capacidad para

diferenciarse y madurar. Se distinguen dos variantes: linfocíticas y mielocíticas. Así pues

de forma rudimentaria las leucemias se pueden clasificar en cuatro tipos: leucemia

linfocítica aguda (linfoblástica) (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia

mielocítica aguda (mieloblástica) (LMA) y leucemia mielocítica crónica (LMC) (8-14).

El diagnóstico se realiza, considerando, además de las manifestaciones clínicas, estudios de

laboratorio que incluyen hemograma, frotis de sangre periférica, inmunofenotipo, biopsia y el frotis

de médula ósea. En la actualidad la tinción con inmunohistoquímica de células malignas en sangre

periférica, es uno de los métodos más específicos para clasificar las leucemias por lo cual se

recomienda realizar este procedimiento en todo paciente con esta enfermedad, al igual que el

seguimiento de un protocolo que combine la citomorfología y citoquímica con el inmunofenotipo, y

siempre que sea posible acompañado por métodos citogenéticos y moleculares permitiendo con

ello no solo un diagnóstico certero, sino que además proporcionar una amplia información

sobre el pronóstico del paciente, así como del tratamiento a seguir (6,15).

B.I Leucemia mieloide crónica (LMC)

La leucemia mieloide crónica (LMC) es un síndrome mieloproliferativo crónico de

naturaleza clonal, con origen en una célula madre pluripotencial común a las tres series

hematopoyéticas. Representa entre el 15% y el 20% del total de leucemias y su incidencia

en los países occidentales se ha estimado en 1,6 casos por cada 100.000 habitantes/año. La

edad media de presentación es de 53 años, la incidencia máxima se encuentra entre los 40 y

los 60 años y predomina ligeramente en varones, con una relación de 1,3:1 (15-21).

Alrededor de la mitad de los pacientes son asintomáticos al momento del

diagnóstico y la mediana de supervivencia global después de éste es de cuatro a seis años,

con un rango que oscila desde menos de un año a más de diez años. La mortalidad ajustada

por edad es de 0,6 por cada 100.000 habitantes/año; la gran mayoría de los sujetos que

fallecen por LMC tienen más de 55 años (74,7%) y se ha estimado que el 0,16% (1 de cada

619 hombres y mujeres) de las personas que nacen en la actualidad tendrán la enfermedad

en algún momento de sus vidas y que el 0,06% morirán por ella.

En la actualidad, la tasa de mortalidad anual de la LMC es menor al 10% durante los

dos primeros años después del diagnóstico; en los pacientes en fase crónica con bajo riesgo

es del 12% durante los tres primeros años, mientras que en los de riesgo intermedio y alto

es del 20% y 45%, respectivamente. La supervivencia después de cinco años en los grupos

de bajo, intermedio y alto riesgo es del 76%, 55% y 25%, respectivamente, y para los

sujetos en fase acelerada y blástica es inferior al 10% y 5%, respectivamente (15-21).

La enfermedad se presenta con un curso bifásico o trifásico, constituido por

diferentes etapas. Una es crónica, caracterizada por la expansión de las células mieloides

con maduración normal; el 90% de los pacientes se diagnostican en esta etapa, que suele

evolucionar a estados más agresivos, los cuales, habitualmente, siguen dos patrones clínico-

hematológicos: la fase acelerada y la crisis blástica (CB). Durante las fases tardías de la

enfermedad, las células leucémicas pierden la capacidad de diferenciarse; así, resulta en una

leucemia aguda resistente a la quimioterapia. La CB es inevitable, excepto para el subgrupo

de pacientes trasplantados tempranamente durante la fase crónica de la enfermedad (ver

Figura No.1) (17-20).

FIGURA No.1: CÉLULAS MIELOIDES INMADURAS

DE UN PACIENTE CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA.

Fuente: Artigas C. Rev. Int. J. Morphol 2003;21:205-209.

B.II Leucemia linfoblástica aguda (LLA)

Las leucemias agudas son enfermedades monoclonales que se originan

principalmente en la médula ósea, caracterizadas por el crecimiento incontrolado de formas

celulares inmaduras de los componentes sanguíneos llamados blastos. Dependiendo de la

estirpe celular afectada, se puede hacer la distinción de leucemias agudas mieloblásticas,

linfoblásticas o de estirpe indiferenciada. La leucemia linfoblástica aguda es la leucemia

aguda más común en los niños entre 2 y 15 años y representa cerca de 85 % de los casos.

Se ha descrito sin embargo un comportamiento bimodal con un segundo pico, mucho

menor hacia los 70 años. Los datos de diferentes registros demuestran que la incidencia de

LLA se incrementa de 0,39 por millón en adultos de 35 a 39 años a 2,1 por millón en

pacientes mayores de 85 años. Entre el 16% y el 31% de los pacientes adultos con LLA

tiene más de 60 años (15-20).

La leucemia linfoblástica aguda (LLA) representa la proliferación clonal de las

células inmaduras, morfológicamente constituida por linfoblastos, en la ciudad de México

representan alrededor de 40 % de todas las neoplasias, mientras que en otros países

constituyen entre 30 y 34 %. Actualmente se reconoce que en diferentes partes del mundo

la frecuencia de las leucemias agudas se ha incrementado. De 1982 a 1991, en la ciudad de

México se observó aumento importante en la incidencia de las leucemias agudas

linfoblásticas: en 1982 se reportó una tasa de incidencia de 7.75 por millón de niños

menores de 15 años y para 1991 se alcanzó 22.19 por millón. Entre 1993 y 1994, en el

Instituto Mexicano del Seguro Social se encontró una frecuencia de 34 por millón; entre

1996 y 1998, de 60.3. Datos que abarcan el periodo de 1996 a 2000 muestran que el

promedio anual de incidencia es de 44.9 por millón de niños para leucemia linfoblástica

aguda, siendo una de las más altas a nivel mundial (ver Figura No. 2) (15-21).

FIGURA No. 2: LINFOBLASTOS EN UN FROTE DE MÉDULA

ÓSEA DE UN PACIENTE CON LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGU DA.

Fuente: Artigas C. Rev. Int. J. Morphol 2003;21:205-209.

Existe una leve preponderancia de los hombres sobre las mujeres, con una relación

de 1.4:1.0, así mismo, en la raza blanca se observa una mayor frecuencia que en la raza

negra, lo cual podría reflejar una diferente susceptibilidad genética. Se calcula que en el año

2006 en Estados Unidos se diagnosticarán 3.930 casos nuevos de LLA en adultos (2.150

hombres y 1.780 mujeres); de forma similar, la enfermedad causará cerca de 1.500 muertes

(900 hombres y 590 mujeres) en este país. Se ha descrito que a nivel mundial la letalidad media

anual de las leucemias agudas es de 3 a 5 casos por cada 100,000 habitantes y hay una tendencia

notable al aumento del padecimiento (15-21).

Con los modernos tratamientos, los niños con leucemia linfoblástica aguda (LLA)

obtienen una tasas de remisión completa (RC) del 95-100% y una probabilidad de

supervivencia del 80%, lo que supone uno de los grandes triunfos de la oncohematología.

Por el contrario, los avances en el tratamiento de la LLA en los adultos han sido modestos,

con tasas de RC del 80% y de supervivencia del 40% (15-21).

La LLA es la consecuencia de la transformación maligna de una célula progenitora

linfoide inmadura que tiene la capacidad de expandirse y formar un clon de células

progenitoras idénticas bloqueadas en un punto de su diferenciación. La secuencia de

eventos que llevan a la transformación maligna es multifactorial. Estos eventos se producen

durante el desarrollo linfoide, momento en el que los precursores linfoides tienen mayor

riesgo de presentar mutaciones espontáneas debido a la alta tasa de proliferación de estas

células y al reordenamiento genético que se lleva a cabo en ese proceso. La acumulación de

estos linfoblastos en la médula ósea y en diversos órganos provoca las manifestaciones

clínicas de las LLA tales como: malestar general, pérdida de apetito, fiebre, palidez, anemia

y trompocitopenia entre otros (15,17-20).

La LLA se clasifica por criterios citomorfológicos e inmunológicos de las células

blásticas. El grupo de trabajo Franco anglo americano (FAB) ha propuesto una clasificación

basándose en la morfología de las células leucémicas en el momento del diagnóstico,

reconociendo tres tipos morfológicos L1, L2 y L3. En el subtipo L1 se evidencia un

tamaño celular pequeño, núcleo regular, nucléolos ausentes y es reconocida como la

leucemia linfocítica infantil presente en el 85% de los casos reportados. En el subtipo L2 la

población celular es más heterogénea con una morfología irregular, también es denominada

leucemia linfocítica del adulto y se evidencia en un 14% de la población. Como leucemia

tipo Burkitt es identificado el subtipo L3 que se caracteriza por la presencia de células

grades, homogéneas, con núcleo redondo, cromatina dispersa, citoplasma basófilo y

vacuolado, cuya población celular se evidencia en menos del 3% de pacientes con leucemia

( Ver Tabla No. 2) (15-20).

TABLA NO. 2 CLASIFICACIÓN CITOMORFOLÓGICA DE LEUCEM IAS

AGUDAS LINFOBLÁSTICAS (LAL) DE ACUERDO AL GRUPO

COOPERATIVO FRANCO AMERICANO - BRITÁNICO (FAB)

Rasgos citológicos L1 L2 L3

Tamaño celular Pequeño Grande

heterogéneo

Grande

homogéneo

Cromatina nuclear Homogénea Variable

heterogénea

Finamente

homogénea

Forma nuclear Regular Irregular Regular redondo u

oval

Nucléolos Ausentes o

escasos

Visibles Prominentes uno o

más

Citoplasma Escaso, poco

intenso,

vacuolización

variable

Moderada cantidad,

débilmente

basófilo,

vacuolización

variable

Moderada cantidad

fuertemente

basófilo,

vacuolización

prominente

Frecuencia 85% 14% 1-3%

Fuente: Bennett J, et al. The French American British (FAB) cooperative grou.

Concordance among observers and clinical correlations. British Journal of Haematology.

1981;553-561

C. CITOGENETICA DE LEUCEMIAS

El estudio citogenético puede realizarse mediante método directo o a través de

cultivos de células de médula ósea, de ganglios linfáticos y de bazo (en pacientes con

leucemia y otras enfermedades que afecten dichos órganos), los cromosomas se requieren

en metafase del ciclo celular para su análisis y una vez obtenidos se efectúa la tinción con

bandas G (Giemsa), Q (Quinacrina), C (heterocromatina constitucional) o R (revés), cada

colorante brinda un patrón de bandas diferente al otro, que puede evidenciar patrones

específicos o marcadores cromosómicos diferentes, dicha técnica se denomina cariotipo y

permite evidenciar alteraciones numéricas y/o estructurales, las primeras llevan consigo

pérdida (hipoploidías) o ganancias (hiperploidías) de cromosomas, las estructurales

reordenan el material genético de un cromosoma, pierden o ganan material genético o lo

intercambian entre ellos (translocación), dicho análisis se reporta en base a las sugerencias

del International System for Human Cytogenetic Nomenclature 1995 (ISCN) (16, 24).

C.I Citogenética de la Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA)

Entre el 60 y 85% de los pacientes con LLA presentan un cariotipo anormal con

alteraciones numéricas y/o estructurales, estas alteraciones tienen gran importancia debido

a que tienen un valor pronóstico (16,24).

Las alteraciones numéricas se pueden presentar tanto de forma aislada como en

asociación con alteraciones estructurales. Las alteraciones numéricas, comprenden la

pérdida o ganancia de cromosomas e incluyen los siguientes tipos:

- Hiperdiplodía: es la presencia de 47 o más cromosomas, se presenta en

aproximadamente el 7% de los pacientes adultos con LLA y en un 25% en niños, la

presencia de más de 50 cromosomas se denomina como Hiperdiploidía masiva, esta

representa un muy buen pronóstico, a diferencia de la Hiperdiploidía entre 47 y 50

cromosomas que presenta un pronóstico moderado (64,65).

- Hipodiploidía: es la presencia de 45 o menor cantidad de cromosomas, se presenta en

aproximadamente el 1% de los pacientes adultos con ALL y en un 2% en niños, debido a

la existencia de sólo un cromosoma del par correspondiente ( monosomía). Se han

identificado monosomías en pacientes hipodiploides con LLA en los cromosomas: 1, 5,

6, 10, 11, 18, 19, 21 y 22. La hipodiploidía presenta un valor pronóstico individual a

variables relevantes, como lo es la combinación con el sexo o edad del paciente,

representando un mal pronóstico (16-24).

Otro tipo de alteraciones presentes en los pacientes con LLA, son de tipo

estructural, que pueden llagar a ser hasta 30 diferentes alteraciones abarcando hasta el 78%

de las anormalidades en la LLA. Las translocaciones constituyen el grupo más común, con

un 30 a 39%. La translocación se origina por el intercambio de material genético entre

cromosomas, generando dímeros que se traducen en proteínas diméricas que alteran la

actividad celular (16-24). Entre las translocaciones más importantes presentadas en

pacientes con LLA se encuentran:

- t(9;22)(q34;q11): a esta translocación se le conoce con el nombre de cromosoma

filadelfia, se presenta en aproximadamente el 30% de los pacientes adultos con LLA y

un 4% en niños (Fig.1), la alteración generada es la producción del dímero BCR-ABL

(ver reordenación BCR-ABL), es un marcador de muy mal pronóstico, y entre

características asociadas a su presencia se encuentra elevado conteo de leucocitos y

pacientes de edad avanzada (16).

- t(1;19)(q23;p13.3): la alteración genética producida como consecuencia de la

translocación es la fusión de los genes E2A-PBX1, representando un 4% en adultos con

LLA y en un 5% en niños (Fig.1), dicha translocación representa un mal pronóstico en

los pacientes ante la terapia con antimetabolitos, y su presencia se asocia a elevados

conteos de leucocitos (24).

- t(12;21): la alteración genética producida es la fusión de genes TEL-AML1, se presenta

en cerca del 3% en adultos con LLA y en un 25% en niños (Fig.1), este marcador

representa un buen pronóstico (16,24).

- t(4;11)(q21;q23): la alteración genética producida es la fusión de genes MLL-AF4, se

presenta en el 13% en adultos con LLA y en un 9% en niños (Ver figura No. 3), este

marcador se encuentra asociado a conteos elevados de leucocitos, y conlleva un mal

pronostico para el paciente (21,22).

Existen otras anomalías en la LLA pero se presentan en menores porcentajes, siendo

las principales, mencionadas anteriormente.

FIGURA No. 3: ALTERACIONES GENÉTICAS ENCONTRADAS EN LEUCEMIA

LINFOBLÁSTICA AGUDA INFANTIL (A) Y ADULTOS (B).

Fuente: Scott A, Look T. JCO 2005;23:6306-6313

C.II Citogenética de la Leucemia mieloide Crónica (LMC)

La LMC fue la primera enfermedad en la que se determinó una anormalidad

genética en el cariotipo, denominada cromosoma filadelfia, el cual se asoció en gran

medida a la patogenia de dicha leucemia. El cromosoma filadelfia, como ya se mencionó

anteriormente es el resultado de la translocación entre los cromosomas 9 y 22, esta

translocación genera la fusión de los genes BCR-ABL (ver reordenación BCR-ABL); esta

reordenación se encuentra en el 95% de los pacientes con LMC. Sin embargo a pesar de

que el cromosoma fiñadelfia existe como única anormalidad cromosómica a través de la

fase crónica de la enfermedad y se mantiene también durante las fases avanzadas, entre el

50 y 80 % de los pacientes adquieren anormalidades cromosómicas adicionales,

desarrollando cariotipos complejos que incluyen trisomía 8, trisomía 19, isocromosoma 17

y copias adicionales distintos cromosomas (21,22).

En los análisis citogenéticos de pacientes con LMC también se han identificado

otras translocaciones después del cromosoma filadelfia que son: t(5;12)(q33;p13) y

t(8;13)(p11;q12), ambas translocaciones generan la fusión de genes, y tienen en común la

alteración de genes que codifican receptores tirosin cinasa, en el caso de la t(5;12) la

alteración ocurre en el receptor del factor de crecimiento B, mientras en el caso de la

translocación t(8;13) la alteración se da en el receptor del factor de crecimiento de

fibroblastos, esto sugiere que ambas alteraciones activan las mismas vías que activa la

presencia del cromosoma filadelfia, razón por la cual se considera que ambas

translocaciones son capaces de desarrollar LMC (21-22).

D. REORDENACION BCR-ABL

La fusión génica BCR-ABL resulta de la formación del cromosoma Filadelfia, en la

que ocurre la translocación de la región q11 del cromosoma 22 (BCR) a la región q34 del

cromosoma 9 (ABL) (Ver figura No. 4) (23).

FIGURA No. 4: ESQUEMA DE LA T(9;22) Y LA LOCALIZAC IÓN DE LOS

GENES ABL Y BCR.

33´ BCR

22q11

ABL9q34

5´BCR

3´BCR

5´BCR

ABL

9 22 der(9) der(22)

Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.)

El gen ABL localizado en el cromosoma 9q, es el homólogo humano del oncogen v-

abl del virus de la leucemia murina y codifica para un receptor de tirosina cinasa. ABL es

un gen constituido por 8 exones que como resultado del corte y empalme (splicing)

alternativo del primer exón 1a y 1b, codifica para dos isoformas de una proteína de 145

KDa. La proteína está constituida por tres dominios homólogos a secuencias SRC (SH1,

SH2 y SH3), que se localizan en la región NH2-terminal. El dominio SH1 tiene la función

de tirosina cinasa, mientras que los dominios SH2 y SH3 permiten la interacción con otras

proteínas. Hacía la región 3’ se localiza la secuencia señal de localización nuclear y los

dominios de unión a DNA y actina. La proteína normal ABL está involucrada en la

regulación del ciclo celular, en la respuesta al estrés genotóxico y en la transmisión de

información acerca del ambiente celular a través de la señalización mediada por las

integrinas. Al parecer la proteína ABL tiene un complejo papel como modulador celular que

integra las señales del ambiente extracelular e intracelular e influye en las decisiones para

mantener el ciclo celular y la apoptosis (23-44).

El gen BCR, se localiza en la región q34 del cromosoma 22 y está constituido por 23

exones que codifican para una proteína de 160 KDa. La proteína BCR posee un dominio de

dimerización y un dominio de cinasa, en la región NH2-terminal, además de un dominio

con actividad de GTPasa hacia la región COOH. La proteína BCR está presente en varios

tejidos y aunque existen datos que apoyan la hipótesis de que BCR participa en la

transducción de señales, su verdadero papel permanece sin ser determinado (25,44).

A nivel molecular, la t(9;22) resulta en una fusión cabeza-cola de los genes BCR y

ABL cuando parte del gen ABL localizado en el cromosoma 9 es transferida e insertada

dentro del gen BCR del cromosoma 22, originando el transcrito de fusión del gen quimérico

BCR-ABL, mismo que codifica para una proteína que aumenta la actividad tirosina quinasa

con potencial neoplásico asociado a un pronóstico adverso (Ver figura No. 5) (23-44).

FIGURA No. 5 : TRANSLOCACIÓN t(9;22)(q34:q11) EN LM C.

Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.

La localización precisa del punto de ruptura en el gen BCR y ABL, así como la

composición de la proteína producto de la fusión BCR-ABL puede servir para determinar el

fenotipo de la enfermedad y por tanto, para orientarse en la estrategia terapéutica a seguir

(40).

El oncogén quimérico BCR-ABL lleva a la síntesis de proteínas de diferente peso

molecular dependiendo de la localización del punto de rotura. Así es posible distinguir tres

9 22 t(9;22)(q34;q11)

9 22

nuevas proteínas de fusión (p190BCR-ABL, p210BCR-ABL y p230BCR-ABL). Los puntos de

rupturas más frecuentes en el gen BCR ocurren en los exones 1(e1), 12(b2), 13(b3) y

19(e19) y el punto de ruptura en el gen ABL habitualmente se produce en el exón 2(a2) (23-

44).

Cuando se da la unión de los exones b3a2 y/o b2a2 (Región M-bcr) se codifica para

una proteína de 210kD (p210BCR-ABL) la cual se presenta en el 20% a 40% de los pacientes

con Leucemia Linfoblástica aguda (LLA) y es característica en más del 95% de pacientes

con leucemia mieloide crónica (LMC); si los exones e1 y e2 son removidos por el corte y

empalme (Región m-bcr) la unión de e1a2 se transcribe en una proteína de 190kD

(p190BCR-ABL) la cual se detecta en el 60% a 80% de los pacientes con LLA y en menos del

10% para aquellos con LMC. Es posible observar una tercer proteína de fusión próxima a

3’ del extremo distal del gen BCR denominada p230BCR-ABL, la cual resulta de la fusión de

los exones e19a2 (Región µ-bcr), cuya expresión se asocia a leucemias crónicas neutrofilas

y trombocitosis (Ver figura No. 6) (23,44).

FIGURA No. 6: LOCALIZACIÓN DE LOS PUNTOS DE ROTURA EN LOS

GENES ABL Y BCR.

Fuente: Melo J. Rev. Blood. 1996; 88:2375-2384.

Tanto la p210 como la p190 presentan una mayor actividad de tirosina cinasa

comparada con la proteína ABL normal. La proteína BCR-ABL fosforila residuos de

tirosina de muchas proteínas celulares y activa diferentes rutas de señalización, lo cual

conlleva a la transformación celular. En modelos experimentales, se ha observado que estas

proteínas son capaces de transformar precursores hematopoyéticos por la activación de

señales mitógenas, inhibición de apoptosis y alteraciones en la adhesión de las células al

estroma (25, 30-37).

Vías de señalización activadas por Bcr-Abl

Una consecuencia del incremento de la actividad de la tirosina quinasaradica en que

el BCR-ABL puede fosforilar diferentes sustratos, activando múltiples señales de

transducción en las células. Las vías activadas son RAS, vía Fosfatidilinositol-3-cinasa, Jak-

Stat, MAPK y ROS.

- Vía RAS: la activación de Ras se poduce por transducción de señales mediadas por

receptores con actividad tirosin cinasas. Una vez realizada la unión al ligando y

dimerización, los receptores tirosincinasas activados, se unen a moléculas adpatadoras

que contiene los dominios SH2 y SH3 como son Grb-2 y SHC formando complejos de

señalización con factores intercambiadores Ras en la membrana celular. Estos complejos

desencadenan una acumulación de la forma Ras e inducen un efecto antiapoptótico que,

aunque sea insuficiente, es necesario para la transformación derivada de BCR-ABL. La

activación inapropiada del gen Ras por una mutación del gen, ha demostrado ser una

importante vía de la señal de transducción celular para la proliferación y transformación

maligna de los tumores.

- Vía Fosfatidilinositol-3-cinasa: esta vía funciona en la regulación del metabolismo

lipídico fosfoinositídico y en la generación de segundos mensajeros lipídicos

relacionados con la transducción de señales. Se ha visto que una subunidad de esta

proteína se fosforila en residuos tirosina en células que expresan BCR-ABL y forma

complejos con cbl y moléculas adaptadas crk y crkl. PI3 está activado de forma

constitutiva por la translocación BCR-ABL jugando un papel importante en su

transformación (84,85).

- Vía Jak-Stat: El crecimiento de las células hematopoyéticas normales se controla por

citocinas. Los receptores para estas citocinas traducen señales mediante activación de

proteínas denominadas genéricamente Jak (Janus tirosine kinases), que es una familia de

cinasas citoplasmáticas que fosforilan y activan los factores de transcripción STAT

(Signal Transducer and Activators of transcription), BCR-ABL activa constitutivamente

las vías de señalización de JAK y STAT en células hematopoyéticas, siendo STAT 1 y

STAT 5 las tirosin-fosforiladas más importantes. La fosforilación constitutiva de factores

de transcripción STAT han sido reportados en líneas celulares positivas BCR-ABL y en

células primarias con LMC, la activación STAT 5 contribuye a la transformación

maligna a pesar de sus funciones pleiotropicas; su efecto en la transformación de células

BCR-ABL parece ser anti-apoptotico e implica la activación trasncripcional de Bcl-xl. En

contraste con la activación de la vía Jak-Stat por medio de estímulos fisiológicos, BCR-

ABL activa directamente STAT 1 y STAT 5 sin previa fosforilación de proteínas Jak (35-

44).

- Vía MAPK: un primer acontecimiento de señalización que sigue a la activación de RAS

es la activación de la vía de señalización de proteínas activadoras de mitogénesis con

actividad cinasa (MAPK). Se conocen claramente tres cascadas de MAPK: la cinasa

regulada extracelularmente (ERK), la vía de las Jun cinasas o cinasas activadas por

estrés (SAPK) y la vía de la p28 cinasa. El punto final para cada una de estas vías es la

fosforilación y activación de transcripción. BCR-ABL y v-ABL activan la vía SAPK en

fibroblastos y células hematopoyéticas. Así mismo activan promotores dependientes de

Jun de manera dependiente de RAS, MEPK y SAPK. Mientras que los efectos de BCR-

ABL en la vía JNK parecen ser claros, estudios de la vía ERK muestran que la BCR-ABL

funciona de manera distinta a la mayoría de los receptores con actividad tirosincinasa

(35-44).

- Vía ROS: la transformación de las líneas celulares con BCR-ABL presenta un incremento

de ROS, comparado con las líneas celulares no BCR-ABL. Este incremento es suficiente

para la transformación fenotípica en sí misma. Se ha sugerido que ROS podría actuar

como segundo mensajero en la regulación de la actividad de las enzimas sensibles a la

acción de oxidorreducción (redox), como son las cinasas y fosfatasas. La inhibición de la

proteína tirosin fosfatasa (PTPasa) mediante la modulación redox explicaría el amplio

espectro de las actividades biológicas de ROS. Un incremento de ROS amplifica las

señales de BCR-ABL, posiblemente regulando las proteínas redox-sensibles, como es la

PTPasa celular, la cual también está incrementada. También es de particual interés en la

LMC humana, el hecho de que un incremento de ROS pueda tener consecuencias a largo

plazo en la estabilidad genética. Los niveles de ROS no sólo son modulados por

enzimas, antioxidantes y grupos sulfhidrilos, sino también reaccionados con las bases

del ADN. Aunque las modificaciones pueden ser corregidas eficientemente por los

mecanismos de reparación de ADN, un incremnto persistente de ROS podría inducir la

acumulación de mutaciones en las células de la LMC, que podría contribuir a la

progresión de la enfermedad (35-44).

E. EVALUACION DEL RIESGO EN PACIENTES CON LEUCEMIA

La evaluación rigurosa del riesgo o posibilidad de recaida en un paciente con leucemia

es necesaria en el momento del diagnóstico para evitar un tratamiento inefectivo. Existe un

notable desacuerdo para definir los subgrupos de riesgo, sin embargo de forma común se

dividen en tres categorías: riesgo bajo, riesgo moderado y alto riesgo (44-50).

Deacuerdo con los criterios de definición de un riesgo bajo, se presenta en pacientes

con edad entre los 1 y 9 años y un recuento de leucocitos menor a 50,000/mm3, pacientes

con conteos por arriba de 50,000 leucocitos/mm3 se encuentran en un riesgo alto. Una

mejor clasificación para el riesgo se basa en marcadores genéticos, como por ejemplo: se

ha observado que niños menores a un año, los cuales son evaluados como pacientes de alto

riesgo, en el 70 al 80% presentan reordemamientos en el gen MLL el cual es un marcador

de mal pronóstico, previamente explicado, este reareglo genético junto con el gen

quimérico BCR-ABL, son dos alteraciones que se presentan con frecuencia en adultos,

colocandolos en un riesgo alto, pero marcadores como la hiperdiploidía masiva y la

reordenación TEL-AML1 se presentan con una frecuencia mayor en niños (fig 1), ambos

marcadores son de muy buen pronóstico lo cual coloca a pacientes con dichos rearreglos

como pacientes de bajo rieso, además se han observado ciertas carácteristicas en conjunto

de tal forma que pacientes que presentan hiperdiploidía masiva tambien presentan bajos

conteos de leucocitos. En el caso de pacientes con riesgo moderado son considerados

aquellos con edad inferior a un año o mayores a 10 años y un recuento superior a 50,000

leucocitos/mm3 que no presenten marcadores genéticos favorables o desfavorales (44-50).

Es por ello que la clasificación e identificación de perfiles de riesgo se realiza en

base a lo que la institución determine como parámetros claves, y ello depende en gran

medida de los recursos institucionales.

La determinación del riesgo, permite identificar la probabilidad de sobrevivencia libre

de eventos años depues del diagnóstico, es decir como por ejemplo: para pacientes con un

riesgo alto se espera que el 40% sobrevivan 10 años post-diagnóstico, por el contrario

pacientes identificados como de bajo riesgo hasta el 80% puede sobrevivir 10 años sin

eventos (recaídas) (Ver figura No. 7) (44-50).

FIGURA NO. 7: PROBABILIDAD DE SOBREVIVENCIA LIBRE D E

EVENTOS, SEGÚN EL RIESGO

Fuente: Ching-Hon P. NEJ 1995;332(24).

F. TRATAMIENTO DE PACIENTES CON LEUCEMIA

En la actualidad debido al desarrollo de terapias más efectivas, se ha incrementado

la tasa de cura de pacientes con LLA. El tratamiento se divide en tres fases:

- Induccíon a la remisión: el primer objetivo de la terapia en pacientes con leucemia es

inducir la remisión completa con el reestablecimiento de una hematopoyesis normal, la

inducción incluye el uso de glucocorticoides (prednisona o dexametasona, esta última

ofrece una vida media mayor y penetracion en LCR, por lo que es más segura). Por otro

lado la vincristina y la asparginasa (para evitar recaidas en el sistema nervioso central)

para niños o antraciclina para adultos, ha llevado a tasas de remisión completa de 97 a

99% en niños y de 75 a 90% en adultos. (50-62).

- Intensificacion de la terapia o consolidación: Los pacientes que logren el

reestablecimiento de la hematopoyesis, pueden seguir a la fase de consolidación. El

tratamiento es aplicado en poco tiempo después de la inducción, entre las drogas se

encuentran altas dosis de metrotrexato con o sin 6-mercaptopurina (50-62).

- Continuación de tratamiento: es una prolongación en el tratamiento para eliminar

cualquier posibilidad de que existan células malignas en el post tratamiento (55).

Otras posibilidades de tratamiento son:

- Profilaxis del sistema nervioso central (SNC): esto se debe como consecuencia de que el

SNC puede ser un reservorio de células malignas, sin embargo niveles altos de

quimioterapia sistémica eliminan la necesidad de irradiación craneal, en ciertos casos

(50-62).

- Trasplante de progenitores hematopoyéticos: este se recomienda en el caso de pacientes

que no logran un remisión inicial, pacientes que presentan una segunda recaída después

de la remisión hematológica, y en niños con LLA en los cuales se lleva una terapia de

más de 36 meses con antimetabolitos, sin remisión. Debido al pronóstico desfavorable

de los pacientes con reordenamiento BCR-ABL, se indica un trasplante cuando se logra

la primera remisión (50-62).

Los pacientes con reordenamiento BCR-ABL requieren de regímenes más

agresivos, en la actualidad en el caso de pacientes con LLA se recomienda el trasplante de

médula ósea que provee de un 30% de remisión, el mesilato de imatinib (Gleevec), el cual

es un inhibidor de la actividad tirosin cinasa (que genera la fusión BCR-ABL), se ha

incorporado en los regímenes de mantenimiento de pacientes con LLA positiva al Ph (55-

62).

En el caso de la LMC, el objetivo del tratamiento es la prevención de una crisis

blástica (ver LMC), ya que cuando ocurre el pronóstico es muy pobre, aunque se puede

lograr una rápida reducción de conteo de células blancas con quimioterapia (bilsulfán o

hidroxiurea en la crisis blástica), sin embargo estas drogas fallan en prevenir la progresión

de la enfermedad. El interferón alfa (IFN) fue el primer agente en modificar la historia

natural de la LMC prolongando la sobrevida en pacientes con una remisión hematológica

completa (<35% de células Ph positivas). Un segundo avance en la tratamiento de la LMC

ocurre cuando el 60-80% de pacientes trasplantados presenta una sobrevida libre de eventos

de 5 años, pero tanto el INF como el trasplante son considerados como posibles inductores

de toxicidad para la LMC. En el año 2001, se reporta que estudios que utilizan como

tratamiento el mesilato de imatinib (Gleevec), presentan altas tasas de remisión

hematológica completa. (50,52,55).

G. ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL (EMR)

La EMR consiste en la persistencia de un clon anormal, aún en niveles bajos,

durante o tras finalizar el tratamiento. La EMR tiene significado pronóstico ya que predice

la recaída de la enfermedad y por este motivo, conocer su presencia ayuda a plantear

estrategias terapéuticas que permitan prevenirla (14,131-135).

Las técnicas para determinar la EMR, se basan en monitorear la presencia de un

marcador asociado a la enfermedad por determinados períodos, hasta determinar su

ausencia total. Esta evaluación del marcador citogenética se puede realizar por distintas

técnicas como cariotipo, Hibridación in situ con Fluorescencia –FISH-, reacción en cadena

de la polimerasa – PCR- y Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real –RQ PCR-

(50-62).

PARTE III

RESULTADOS

TABLA No. 3: RESULTADOS DE LOS CUATRO MONITOREOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS

CODIGO GENERA

L

RESULTADO PRIMER

MONITOREO (%IS)

RESULTADO SEGUNDO

MONITOREO (%IS)

RESULTADO TERCER

MONITOREO (%IS)

RESULTADO CUARTO

MONITOREO (%IS)

OBSERVACIONES

12-LMC 1.21 2.95 0.20 0.19

Fecha de diagnóstico 04/11/2010

13-LMC 0.35 0.0496 0.003

No se presentó Fecha de diagnóstico

19/01/2010

14-LMC Indetectable 0.02 0.003 0.003 Fecha de diagnóstico

06/12/2010

15-LMC 0.40 0.022 0.012 0.004

Fecha de diagnóstico: 04/11/2010

16-LMC 2.83 48.33

50.25

No se presentó

Fecha de diagnóstico: 01/10/2010 Resistencia a Glivec, es necesario cambiar a Nilotinib pero no se cuenta con los recursos necesarios. Medico tratante sugiere ingreso al IGSS para recibir el medicamente de la institución, sin embargo no ha sido posible.

17-LMC 3.51 No se presento 0.029 No se presentó

Fecha de diagnóstico: octubre del 2010

18-LMC 8.11 41.22

31.38

32.92

Fecha de diagnóstico: Enero del 2010 Posible Resistencia, no fue posible hablar con el médico tratante sobre la evolución del paciente.

19-LMC 16.72 0.56 0.61

0.73


20-LMC No se presentó No se presentó 35.28 48.79

23-LMC 10.51 No se presentó

No se presentó

No se presentó

Fecha de diagnóstico: 05/04/2004 Falleció, no se tienen datos exactos de la fecha de fallecimiento o las causas del mismo.

24-LMC

15.44 0.53

0.31

0.093


36-LMC

0.13 0.17

No se presentó

0.030

Fecha de diagnóstico: 03/11/2009 No se presento el día de la jornada, sin embargo se logro tomar muestra de sangre del paciente el día de la consulta en el Hospital San Juan de Dios. No se ha procesado y sigue en espera de que entren mas muestras.

37-LMC 0.12 0.16 0.12

0.052


38-LMC 1.16 1.22 0.67 0.56


39-LMC 2.68 40.19

13.37

7.93

Fecha de diagnóstico 28/12/2007 Paciente con buena adherencia al tratamiento, sin embargo presenta resistencia a Glivec. Presento toxicidad al inicio del tratamiento, a la fecha tolera la dosis de 400 mg/dia. La resistencia se debe posiblemente a las dosis bajas y medicación con suspensión parcial e intermitente.

40-LMC 0.81 0.81 0.18

0.28


41-LMC 0.46 No se presento 0.13

indetectable


42-LMC 0.26 0.10 0.64

15.29


43-LMC 1.45 No se presento

No se presentó 0.64 Fecha de diagnóstico. 08/09/2010


CODIGO GENERA

L

RESULTADO PRIMER

MONITOREO (%IS)

RESULTADO SEGUNDO

MONITOREO (%IS)

RESULTADO TERCER

MONITOREO (%IS)

RESULTADO CUARTO

MONITOREO (%IS)

OBSERVACIONES

44-LMC

BCR-ABL: 168,401.719 ABL: 28,934.201 RATIO: 5.82016

BCR-ABL: 155,965.141

ABL: 55,561.035

RATIO: 2.8070

No se presentó

No se presentó

Fecha de diagnóstico 06/07/2005 Resistencia a Glivec. Toma actualmente 800 mg/ día de Glivec sin embargo no responde al tratamiento.

45-LMC 0.09

BCR-ABL: 1,444,219.5

ABL:47,373.125

RATIO: 30.4860

falleció

falleció

Fecha de diagnóstico: 03/06/2010 Falleció el 24 de Octubre de 2011, sexto día de quimioterapia para la inducción a la remisión, como consecuencia de hemorragias múltiples. Fenotipo compatible con LMA.

46-LMC 2.86 0.0097

0.003

No se presentó

Fecha de diagnóstico: 19/12/2006 Paciente con tratamiento con Glivec desde 2007 y sin alcanzar respuesta molecular mayor. Presento toxicidad al Glivec, por lo que medico tratante decide cambiar a 400 mg/día de Tasigna en agosto de 2011. Obteniendo buenos resultados.

47-LMC 1.24 0.22

0.24

0.23 Fecha de diagnóstico: 23/01/2003

48-LMC 0.10 0.098

0.022 No se presentó Fecha de diagnóstico: 13/10/2010

49-LMC 13.59

BCR-ABL: 17,167.045

ABL:12,581.998

RATIO: 136.44

333.73

108.459

Fecha de diagnóstico: 25/04/2005 Paciente resistente a Nilotib, actualmente no existe otra opción de tratamiento.

50-LMC 36.47 No se presento 1.25

14.66



indetectable

indetectable

Fecha de diagnóstico: Abril del 2011 Paciente con ingreso reciente al estudio.

60-LMC 2.50 0.30

0.42

No se presentó

Fecha de diagnóstico: Marzo del 2011 Paciente con ingreso reciente al estudio


3.71 0.19

Paciente con ingreso reciente al estudio. Paciente diagnosticada en 6 de Septiembre de 2011, inicio tratamiento el 11 de octubre Glivec 300 mg/día. Se sugiere esperar respuesta.


0.11

0.023

Fecha de diagnóstico: noviembre del 2008. Paciente con ingreso reciente al estudio. Tiene 3 años de tratamiento con Glivec y no muestra mejora completa, posible resistencia al tratamiento por no alcanzar respuesta molecular mayor ante el tiempo de tratamiento.

En la tabla No. 3, presentada anteriormente se observa un resumen de los valores en %IS

obtenidos en cada uno de los monitoreos por paciente; así como la fecha de diagnóstico y

algunos datos clínicos de interés. En los anexos 2 al 7, se observan los datos y gráficas

obtenidos por las corridas de muestras en PCR en Tiempo Real.

Según Baccarani, et al. Se indica en la tabla No. 4 a continuación los parámetros que se

utilizan para clasificar la respuesta al imatinib como óptima, subóptima y fallo a terapia; y

que fueron los parámetros utilizados para la clasificación de respuesta a tratamiento que se

muestra en la tabla No. 4. (63-70)

TABLA 4: EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO IMATINIB

MESES OPTIMA SUBÓPTIMA FALLO DE

TERAPIA

3 CHR No CgR ( Ph>95%) Menos de CHR

6 PCgR (Ph<35%) Menos de PCgR (

Ph<35%)

No CgR (Ph> 95%)

12 CCgR PCgR ( 1% a 35%) Menos de PCgR

(Ph>35%)

18 MMolR Menos de MMolR Menos de CCgR, no

MMolR

Cualquier tiempo

durante duración de

tratamiento

MMolR estable Pérdida de MMolR,

presencia de

Mutaciones

Perdida de CHR,

perdida de CCgR;

CHR: respuesta hematolótica completa; CCgR: respuesta citogenética completa; PCgR:

respuesta citogenética parcial; MMolR: respuesta molecular mayor.

Fuente: Baccarani M, et al. Journal of Clinical Oncology, 27:6041-6051, 2009.

En la Tabla 5, se observa que un 39% de los pacientes analizados obtuvieron una respuesta

óptima, en base a los parámetro expuestos en la tabla anterior; es decir que alcanzaron una

respuesta citogenética completa a los 12 meses o una respuesta molecular mayor a los 18

meses. Y luego se observa que un 25% de los pacientes incluidos en el presente estudio

tuvieron una respuesta subóptima, menos de respuesta molecular mayor a los 18 meses; y

por último presentaron fallo a la terapia un 36% de pacientes; los cuales no alcanzaron ni

respuesta citogenética completa a los 18 meses; de estos pacientes fallecieron 3. Y por

último se obtuvieron dos pacientes falsos positivos, es decir que el diagnóstico de

philadelphia positivo se había realizado por otras técnicas y por Tiempo Real fueron

negativos. (63-70)

TABLA 5 : RESPUESTA AL IMATINIB DEL TOTAL DE PACIEN TES

ANALIZADOS

RESPUESTA

ÓPTIMA

RESPUESTA

SUBÓPTIMA

FALLO DE

TERAPIA

FALSOS

POSITIVOS

39% 25% 36% 6%


A continuación se presenta la tabla No. 6, que agrupa los tipos de respuesta molecular al

Imatinib presentada por los paciente incluidos en el estudio; los tipos de respuesta

molecular se definen como Respuesta Molecular completa (MR), cuando el porcentaje en

escala internacional de BCR-ABL es menor a un 0.01%; y luego se define como respuesta

molecular mayor (MMR) cuando se tiene un valor menor o igual a 0.1%; la respuesta

citogenética completa equivale a <1% de BCR-ABl/ABL en la escala internacional. La

respuesta citogenética mayor (CCM) corresponde a valores <10% y por último No CCM si

la respuesta es mayor al 10%. (63-70)

En cuanto a la MR; se suele dividir en tres subclasificaciones: MR 4.0 si el valor es menor

o igual a 0.01% en Escala internacional; MR4.5 si el valor es menor o igual al 0.0032%, y

por ý último MR5.0 si el valor es de 0.001%. (66)

TABLA No. 6: PACIENTES Y LAS RESPUESTAS ALCANZADAS

MR

( <0.01%)

MMR

(<0.1%)

CCR

(< 1%)

CCM

(<10%)

NO CCM

( >10%)

13-LMC 0.003 12-LMC 0.19 19-LMC 0-73 39-LMC 7.93 16-LMC 50.25

15-LMC 0.004 17-LMC 0.029 38-LMC 0.56 18-LMC 41.22

41-LMC 0.003 24-LMC 0.093 40-LMC 0.28 20-LMC 48.79

46-LMC 0.003 36-LMC 0.030 43-LMC 0.64 42-LMC 15.29

37-LMC 0.052 47-LMC 0.23 44-LMC >100%

48-LMC 0.022 60-LMC 0.40 45-LMC >100%

61-LMC 0.10 49-LMC >100%

62-LMC 0.023 50-LMC 14.66%

23-LMC 10.51


TABLA No 7: RESPUESTA AL IMATINIB ALCANZADA DURANTE EL

MONITOREO MOLECULAR

TOTAL DE

PACIENTES

ANALIZADOS

MCgR % CCgR % MMR %MR

28 4% 21% 29% 14%

Fuente FODECYT 24-2010

En la tabla anterior se observa que todos los pacientes con CCgR, MMR y MR, alcanzaron

una respuesta citogenética completa; lo que corresponde con un 64% de paciente que

alcanzaron dicha respuesta. Y el total de pacientes con MMR y MR, corresponde a un 43%

de paciente que alcanzaron una respuesta molecular mayor. Y por último un 36% de

pacientes que no alcanzaron respuesta citogenética completa.

En la tabla No. 8 se observan los datos clínicos y hematológicos de los pacientes,

agrupados según MMR, CCR Y NO CCR. En cuento la edad se puede observar que los

que alcanzaron una respuesta molecular mayor tienen menos edad, con una mediana de 25

años en relación a los que no alcanzaron respuesta citogenética completa; es decir que

tienen arriba de 1% IS que tienen una mediana de 39 años. En general la mediana de edad

de los tres grupos se encuentra debajo de los 39 años.

En relación al sexo, se puede observar; que existe un predominio del sexo Masculino con

leucemia mieloide crónica; ya que en los tres grupos de respuesta el porcentaje de hombres

oscila entre 70-80%.

En cuanto al recuento de glóbulos blancos se observa una mediana entre 5000-6000

leucocitos/ml. En el recuento de plaquetas se puede observar en el grupo que no alcanzó

una respuesta citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000

a 1,332,000 plaquetas/ml. La mediana de hemoglobina en los tres grupos se encuentra de

11.7-12.85 g/dl. En el recuento de plaquetas se puede observar en el grupo que no alcanzó

una respuesta citogenética completa presenta más rango de variación, que va desde 89,000

a 1,332,000 plaquetas/ml.

TABLA No. 8 DE DATOS CLÍNICOS Y HEMATOLÓGICOS.

CARACTERÍSTICAS RESPUESTA

MOLECULAR

MAYOR (MMR)

RESPUESTA

CITOGENÉTICA

COMPLETA

(CCR)

NO RESPUESTA

CITOGENÉTICA

COMPLETA ( NO

CCR)

N= 12 N=18 N=10

EDAD

Mediana (años) 25 32 39

Rango (años) 5 a 85 5 a 85 25 a 64

mayor de 60

años 3 ( 25%) 3 (17%) 1 (10%)

SEXO

Masculino 9 ( 75%) 13 ( 72%) 8 (80%)

Femenino 3 (25%) 5 (28%) 2 (20%)

RECUENTO

GLÓBULOS

BLANCOS

unidades/ml

Mediana (/ml) 6205 6010 5100

Rango ( ml) 4500-239000 1500-239000 2800-15000

RECUENTO

PLAQUETAS

Mediana ( /ml) 260000 234000 172000

Rango (/ml) 128000-388000 128000-348000 89000-1332000

HEMOGLOBINA

Mediana (g/dl) 12.85 12.3 11.7

Rango (g/dl) 7.89-15.09 6.6-15.5 6.0-15


PACIENTES CON BUENA RESPUESTA AL TRATAMIENTO

A. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES CON RESPUESTA MOLECULAR

COMPLETA (MR)

a. CASO 13-LMC

Este paciente fue diagnosticado en enero del 2010; se le realizaron tres

monitoreos, como se puede ver en la figura No. 8. El último monitoreo de

esta paciente se encuentra en 0.003% , lo cual se considera una respuesta

molecular completa; por esta razón la respuesta al tratamiento de este

paciente se considera óptima.

FIGURA NO. 8: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 13 -LMC


0.35235 0.0496449 0.003

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO

Series1

SEGUIMIENTO DEL PACIENTE 13-LMC

% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12

b. CASO 15-LMC

Este paciente fue diagnosticado en noviembre del 2010; se le realizaron

cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 9. El último

monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.004% , lo cual se considera una

respuesta molecular completa; por esta razón la respuesta al tratamiento de

este paciente se considera óptima.

FIGURA NO. 9: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 15 -LMC


c. CASO 41-LMC

Este paciente fue diagnosticado en julio del 2010; se le realizaron cuatro



molecular completa; por esta razón la respuesta al tratamiento de este


0.4

0.022 0.012

0.004-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO

% IS

% IS


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012

FIGURA NO. 10: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 4 1-LMC


d. CASO 46-LMC

Este paciente fue diagnosticado en el año 2006; y presentó resistencia al

Imatinib por lo que se cambio al medicamento de segunda línea, a nilotinib

con 100 mg. Y ahora tiene una buena repuesta; se le realizaron tres



molecular completa; por esta razón la respuesta al Nilotinib de este paciente

se considera óptima.

0.46 0.13 0.003

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 13/3/12 15/7/2012



B. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES CON RESPUESTA MOLECULAR

MAYOR (MMR)

a. CASO 12-LMC

El paciente 12-LMC fue diagnosticado el 4 de noviembre del 2010; ; se le

realizaron cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No. 12. El

último monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.19% , lo cual se

considera una respuesta molecular mayor; por esta razón la respuesta al

tratamiento de este paciente se considera óptima.

2.860.0097

0.003-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12



b. CASO 17-LMC

El paciente 17-LMC fue diagnosticado en octubre del 2010; ; se le realizaron



respuesta molecular mayor; por esta razón la respuesta al tratamiento de este


1.212.95

0.2

0.19-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO

% IS

% IS


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



c. CASO 24-LMC

El paciente 24-LMC fue diagnosticado en noviembre del 2011; se le





3.51

0.029

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO

Series1


% IS

16/3/11 13/3/12



d. CASO 36-LMC

El paciente 36-LMC fue diagnosticado en noviembre del 2009; ; se le





15.44

0.53 0.31 0.093

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



e. CASO 37-LMC

El paciente 37-LMC fue diagnosticado en julio del 2010; ; se le realizaron

cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No.16. El último




0.130.17 0.03

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 15/7/2012



f. CASO 48-LMC

El paciente 48-LMC fue diagnosticado en octubre del 2010; ; se le realizaron

tres monitoreos, como se puede ver en la figura No. 17. El último monitoreo

de esta paciente se encuentra en 0.022% , lo cual se considera una respuesta

molecular mayor; por esta razón la respuesta al tratamiento de este paciente

se considera óptima.

0.120.16 0.12 0.052

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



g. CASO 61-LMC

El paciente 61-LMC fue diagnosticado en septiembre del 2011; se le

realizaron tres monitoreos, como se puede ver en la figura No.18. El último




0.1 0.00980.022

-1

2

5

8

11

14

17

20

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12



h. CASO 62-LMC

El paciente 62-LMC fue diagnosticado en el año 2008; ; se le realizaron tres



molecular mayor; sin embargo se tardó tres años en alcanzar esta respuesta

por lo que se considera subóptima. Y alcanzó MMR cuando se subió la dosis

de imatinib de 400 mg a 600 mg.

98.49

3.710.19

-1

9

19

29

39

49

59

69

79

89

99

109

119

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 13/3/12 15/7/2012



C. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES CON RESPUESTA

CITOGENÉTICA COMPLETA (CCR; <1% IS)

a. CASO 19-LMC

El paciente 19-LMC fue diagnosticado en septiembre del 2009; ; se le



considera una respuesta citogenética completa; se considera una respuesta

subóptima debido a que lleva tres años de monitoreo y no ha alcanzado la

MMR.

19.84

0.11 0.023

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 13/3/12 15/7/2012



b. CASO 38-LMC

El paciente 38-LMC fue diagnosticado en enero 2011; ; se le realizaron


monitoreo de esta paciente se encuentra en 0.56%, lo cual se considera una

respuesta citogenética completa; se considera una respuesta subóptima

debido a que no alcanzo la MMR en 18 meses.

16.72

0.56 0.61 0.73

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



c. CASO 40-LMC

El paciente 40-LMC fue diagnosticado en enero del 2008 ; se le realizaron

cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No.22. El último




1.161.22 0.67 0.56

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



d. CASO 43-LMC

El paciente 43-LMC fue diagnosticado en septiembre del 2010 ; se le

realizaron tres monitoreos, como se puede ver en la figura No.23. El último




0.810.81 0.18 0.28

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012

FIGURA NO.23: GRÁFICA DE SEGUIMIENTO DE PACIENTE 43-LMC


e. CASO 47-LMC

El paciente 47-LMC fue diagnosticado en el año 2003 ; se le realizaron





1.45 0.64

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 15/7/2012



f. CASO 60-LMC

El paciente 60-LMC fue diagnosticado en abril del 2011 ; se le realizaron

tres monitoreos, como se puede ver en la figura No.25. El último monitoreo

de esta paciente se encuentra en 0.40%, lo cual se considera una respuesta

citogenética completa; se considera una respuesta óptima debido a que

alcanzó la CCR en 11 meses.

1.240.22

0.240.23

-1

2

5

8

11

14

17

20

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



D. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES CON RESPUESTA

CITOGENÉTICA MAYOR (CCR; <10% IS)

a. CASO 39-LMC

El paciente 39-LMC fue diagnosticado en diciembre del 2007 ; se le

realizaron cuatro monitoreos, como se puede ver en la figura No.26. El

último monitoreo de esta paciente se encuentra en 7.93%, lo cual se

considera una respuesta citogenética mayor; sin embargo se considera un

fallo de terapia debido a que tienen 4 años de tratamiento y no ha alcanzado

ni CCR ni MMR.

2.5

0.3 0.42

-1

3

7

11

15

19

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12



E. ANALISIS DE CASOS DE PACIENTES SIN RESPUESTA CITOGENÉTICA

MAYOR (CCM; > 10% IS)

a. CASO 16-LMC

El paciente 16-LMC fue diagnosticado en octubre del 2010 ; se le realizaron

tres monitoreos, como se puede ver en la figura No. 27. El último monitoreo

de esta paciente se encuentra en 50.25%, se considera un fallo de terapia

debido a que el paciente presenta toxicidad al medicamento, por lo que los

valores de plaquetas suelen estar muy bajos.

2.68

40.19

13.37

7.93

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



b. CASO 18-LMC

El paciente 18-LMC fue diagnosticado en enero del 2010 ; se le realizaron


monitoreo de esta paciente se encuentra en 31.38%, se considera un fallo de

terapia debido a que el paciente presenta toxicidad al medicamento, por lo

que los valores de plaquetas suelen estar muy bajos.

2.83

48.33

50.25

-1

6

13

20

27

34

41

48

55

62

69

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO

Series1


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12



c. CASO 20-LMC

El paciente 20-LMC fue diagnosticado en el año 2010 ; se le realizaron dos


este paciente se encuentra en 48.79%, se considera un fallo de terapia, y se

le aumentó la dosis a 600 mg de Imatinib.

8.11

41.22

31.3832.92

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO

Series1


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



d. CASO 42-LMC

El paciente 42-LMC fue diagnosticado en octubre del 2010 ; se le realizaron


monitoreo de este paciente se encuentra en 15.29%, se considera un fallo de

terapia, ya que perdió la respuesta molecular mayor.

35.28

48.79

10

20

30

40

50

60

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



e. CASO 44-LMC

El paciente 44-LMC fue diagnosticado en julio del 2005; se le realizaron dos


este paciente posee más de un 100% de copias de BCR-ABL; por lo que se

considera un fallo de terapia y una posible resistencia; tomaba una dosis de

800 mg, y falleció.

0.26 0.1 0.64

15.29

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



f. CASO 45-LMC

El paciente 44-LMC fue diagnosticado en junio del 2010; se le realizaron

dos monitoreos, como se puede ver en la figura No. 32. El último monitoreo

de este paciente posee más de un 100% de copias de BCR-ABL; por lo que

se considera un fallo de terapia y una posible resistencia; tuvo una

complicación con LMA y falleció.

582

280.7

-1

99

199

299

399

499

599

699

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11



g. CASO 49-LMC

El paciente 49-LMC fue diagnosticado en el año 2005; se le realizaron dos


este paciente posee más de un 100% de copias de BCR-ABL; por lo que se

considera un fallo de terapia y una posible resistencia; actualmente se

encuentra con tratamiento de segunda línea, nilotinib.

0.09

3049

-1

299

599

899

1199

1499

1799

2099

2399

2699

2999

3299

3599

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



h. CASO 50-LMC

El paciente 50-LMC fue diagnosticado en mayo del 2011; se le realizaron


monitoreo de este paciente presentó un 14.66 % IS; por lo que se considera

un fallo de terapia y una posible resistencia.

13.59

136.45

333.73

108.459

-1

49

99

149

199

249

299

349

399

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 09/11/11 13/3/12 15/7/2012



i. CASO 23-LMC

El paciente 23-LMC fue diagnosticado en enero del 2011; se realizó

únicamente un monitoreo, en el cual presentó 10.57% IS; y luego

posteriormente falleció, se desconoce la causa de su muerte.

Los paciente 14 y 59 se consideraron falsos positivos porque no presentaron copias en

ninguno de los monitoreos realizados.

36.47

1.25

14.66

-1

6

13

20

27

34

41

48

% I

S B

CR

-AB

L/A

BL

FECHAS DE MONITOREO


% IS

16/3/11 13/3/12 15/7/2012

III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En la tabla No. 3 se observa el total de pacientes analizados (30), y sus respectivos

resultados de BCR-ABL en el sistema internacional (%IS). A partir de esta tabla se

analizaron distintos aspectos, como la clasificación de la respuesta del paciente al

tratamiento Imatinib como óptima, subóptima y fallo de la terapia. Esta clasificación se

realizó según lo expuso Baccarani en la tabla No. 4. En dicha tabla se clasificó como

respuesta óptima, a todos aquellos pacientes que presentaron respuesta molecular mayor

(MMR) a los 18 meses y el equivalente a la respuesta citogenética completa ( CCgR) a los

12 meses. Como respuesta subóptima, se clasificaron los pacientes que no alcanzaron la

CCgR a los 12 meses ni la respuesta molecular mayor a los 18 meses. (63-70)

Según la tabla No. 5, el 39% de pacientes alcanzaron una respuesta óptima, este grupo es el

que tendrá un mejor pronóstico en cuanto a la respuesta al Imatinib; y luego un 25% tiene

una respuesta subóptima, es decir que si han descendido el % BCR-ABL/ABL pero no en

los valores esperados, dicho grupo necesita un monitoreo y un seguimiento más cercano

para poder prevenir un fallo de terapia, y determinar la necesidad de cambiar a inhibidores

de la tirosinkinasa de segunda línea como el Nilotinib y dasatinib. Y por último un 36% de

pacientes presentaron un fallo de terapia, esto se puede deber a la presencia de resistencia al

Imatinib debido a mutaciones en BCR-ABL o a toxicidad al medicamento; de estos

pacientes 3 fallecieron.

En las tablas No. 6 y 7 se agrupan los pacientes que alcanzaron MR, MMR, CCgR Y

MCgR, de esto se puede observar que únicamente 14% ( 4 pacientes) alcanzaron una

respuesta molecular completa (MR), y los cuatro con valores MR4.5 es decir con copias

alrededor de 0.0032%. En estudios presentados por Druker et. al en el año 2006,

Kantarjan, et. a. en el año 2004 y Rosti G, et al en el año 2004, se encontró que el

porcentaje de MR era de 28%, 15% y 22%, respectivamente. Datos que no difieren

demasiado del 14% encontrado en pacientes guatemaltecos. (63-70)

Por otro lado se obtuvo que un 29% se encuentra en respuesta molecular mayor (MMR), es

decir con %IS de 0.01 a 0.1%; y un 21% se encuentre en CCgR, es decir con valores de

%IS entre 0.1-1%.

En porcentajes acumulados, se obtuvo un 64% del total de pacientes analizados tiene una

CCgR ( <1%), y un 43% del total de pacientes incluidos en el presente estudio se encuentra

en MR ( < 0.1%); y un 36% no tiene CCgR. En estudios anteriores se ha reportado un

aumento de estas respuestas conforme ha aumentado el tiempo de monitoreo de los

pacientes, por ejemplo el estudio IRIS, en el cual se incluyeron 1106 pacientes y se

monitorearon por 5 años, se encontró que un 87 % alcanzaron un CCgR, y un 37%

alcanzaron MMR. En otro estudio realizado por Kantarjan, en el año 2004, se obtuvieron

un 63% de pacientes en CCgR y un 31% en MMR a los 45 meses de seguimiento. Y por

último en el estudio GINEMA realizado por Rosti, et al. en 2004, se obtuvieron 44% de

CCgR y CMR 22%; en este proyecto se realizó un seguimiento de 2 años. En el presente

estudio se realizó un seguimiento de 16 a 18 meses, y los resultados de 64% de CCgR y un

43% de MMR, se encuentran en rangos comparables al resto de estudios realizados. Es

importante destacar que comparando con el estudio realizado por Rosti, en el cual se dio un

seguimiento de dos años, se obtuvieron porcentajes del gen más bajos que los reportados en

el presente estudio en el que se dio un seguimiento menor. (63-70)

A continuación se presenta la tabla No. 9 se observa un resumen de los resultados, según

respuesta reportados en varios estudios realizados a nivel mundial; en el último renglón se

presentan los resultados del presente estudio, que al compararlos con los reportados en el

resto de publicaciones, se puede determinar claramente que en pacientes guatemaltecos se

observa el mismo patrón de respuesta, es decir porcentajes similares de respuesta. En esta

tabla la respuesta MMR se obtuvo no del total de pacientes analizados, sino del total de

pacientes en CCgR.

TABLA No. 9: RESULTADO DE MCgR, CCgR Y MMR EN DISTINTOS ESTUDIOS

ESTUDIO No.

PACIENTES

MCgR CCgR MMR

Kantarjan, et al. 2002 454 60 41 NR

Cervantes, et al. 2003 150 66 44 NR

Rosti et al, 2004 191 61 44 60

Lahaye, et al. 2005 139 61 49 63

Silver, et. Al. 2004 532 65 52 NR

Kantarjan, et al. 2004 261 73 63 74

Palandri et al, 2008 277 71 55 68

Presente estudio 30 68 64 67

Fuente: Palandri, F. et. al. 2008, Journal of Clinical Oncology, 26: 106-111.

En la tabla No. 8 se encuentran los datos clínicos y hematológicos de los pacientes

agrupados según el tipo de respuesta. En cuanto a la edad se puede observar que los

pacientes con MMR tienen una edad ligeramente menor ( mediana de 25 años), que los que

no alcanzaron la MMR, y los que alcanzaron la CCgR tienen una mediana de 32 años, y por

último los que no alcanzaron la CCgR tienen una mediana de 39 años. Es decir que se

observa que cuando hay mayor edad, menos respuesta se alcanza. Y en general en cuando a

la edad, cabe destacar que se puede observar que en los pacientes con leucemia mieloide

crónica en Guatemala, tienen una mediana de edad (<39 años) menor que la reportada en el

resto de países, en donde la mediana de esta enfermedad se encuentra entre 50-60 años; es

necesario realizar más estudios que ayuden a determinar la causa de esto.

En relación sexo se observa claramente un predominio de esta enfermedad en pacientes del

sexo masculino ( 70-80%), este dado concuerda con lo reportado en otros estudios.

La mediana de glóbulos blancos en general se encuentra entre 5000-6000 leucocitos por

mililitro; es decir que en general los pacientes con LMC incluidos en el presente estudio

presentan rangos normales de leucocitos, lo que concuerda con una respuesta hematológica.

En cuanto al recuento de glóbulos blancos se observa una mediana entre 5000-6000

leucocitos/ml. La mediana de hemoglobina en los tres grupos se encuentra de 11.7-12.85

g/dl.

En el recuento de plaquetas se puede observar en el grupo que no alcanzó una respuesta


plaquetas/ml. Esto se debe a que en este grupo se encontró que un 62% presenta

alteraciones hematológicas como trombocitopenia, trombosis y leucopenia. Uno de los

efectos secundarios más frecuentes en pacientes que toman Imatinib, es la presencia de

trombocitopenia; a los pacientes que presentan trombocitopenia más agresiva, se les ha

disminuido las dosis del tratamiento; lo que podría ser la causa del fallo al mismo.

En las figuras No. 8 a 11 se puede observar que los casos 13-LMC, 15-LMC, 41-LMC y

46 LMC; presentaron una excelente respuesta al tratamiento ya que se encuentran en

respuesta molecular completa (MR).

Luego los casos 12-LMC, 17-LMC, 24-LMC, 36-LMC, 37-LMC, 48-LMC, 61-LMC Y 62-

LMC, presentan también una respuesta óptima ya que se encuentran en respuesta molecular

mayor, como se puede observar en las figuras No. 12-19.

Los pacientes 19-LMC, 38-LMC, 40-LMC, 43-LMC, 47-LMC, 60-LMC, se encuentran en

respuesta citogenética completa, si bien no han alcanzado respuesta molecular mayor, han

mantenido valores menores del 1% de BCR-ABL/ABL, lo cual también indican que están

respondiendo al tratamiento, aunque más lentamente.

Y por último, los casos 39-LMC, 16-LMC, 18-LMC, 20-LMC, 42-LMC, 44-LMC, 45-

LMC, 49-LMC, 50-LMC Y 23-LMC; tienen valores arriba del 10% de BCR-ABL/ABL. Y

de estos el 23-LMC, 44-LMC Y 45-LMC fallecieron durante la realización del presente

estudio. El caso 16-LMC y 18-LMC presentan toxicidad al medicamento Imatinib, por lo

que la dosis del tratamiento ha sido variable y en ocasiones ha debido suspenderse. El resto

de casos posiblemente tienen resistencia, sería necesario realizarles un panel de mutaciones.

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES

1. En el presente se cuantificó y evalúo la presencia de los transcritos de BCR-

ABL, mediante 4 monitoreos en un período de 18 meses a un total de 30

pacientes con diagnóstico clínico de leucemia mieloide crónica.

2. Se estandarizó la técnica de PCR en Tiempo Real para la cuantificación de los

transcritos de BCR-ABL en los pacientes incluidos en el presente estudio.

3. En este estudio se realizaron un total de 120 cuantificaciones de BCR-ABL con

el fin de evaluar su respuesta al tratamiento.

4. Los treinta pacientes incluidos en el estudio se monitorearon cada 3-4 meses

para evaluar la respuesta al Imatinib.

5. Del total de pacientes analizados, veinticuatro presentaron presencia de copias

del gen BCR-ABL; demostrándose que poseen enfermedad mínima residual.

6. El 39% de los pacientes incluidos en el presente estudio alcanzaron una

respuesta óptima al tratamiento Imatinib, alcanzando la respuesta molecular

mayor dentro de los 18 meses posteriores al inicio del tratamiento.

7. El 25% de los pacientes alcanzaron una respuesta subóptima y el 36% de

pacientes tuvo fallo de respuesta al tratamiento; en ninguno de los dos casos se

alcanzó una respuesta molecular mayor.

8. Únicamente un 14% de pacientes se encontraron en respuesta molecular

completa (MR) es decir libres de enfermedad mínima residual.

9. Un 64% de pacientes se encontraron en respuesta citogenética completa, CCgR

( menos de 1% IS), los cuales son considerados como de buen pronóstico.

10. Del total de pacientes con respuesta citogenética completa, un 66% alcanzaron

una respuesta molecular mayor en un período menor a 18 meses de monitoreo.

11. En relación con los datos de los pacientes, la mediana de la edad de los

pacientes es menor a 39 años, y la mayoría son de sexo masculino.

12. Un 62% de pacientes que no alcanzaron respuesta citogenética completa

(>1%IS) presentan alteraciones hematológicas como trombocitopenia,

trombosis y leucopenia.

13. Los resultados obtenidos en el presente proyecto han sido divulgados a los

hematólogos de los hospitales: San Juan de Dios, Roosevelt y Unidad de

Oncología Pediátrica –UNOP-

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Ampliar el monitoreo a un mayor número de pacientes, para obtener un estudio con

mayor confiabilidad.

2. Estandarizar nuevas técnicas aplicadas a distintos tipos de cáncer que permitan un

mejor manejo de la enfermedad del paciente.

3. Establecer con los hematólogos protocolos de seguimiento y tratamiento, según el

número de copias del gen BCR-ABL, en las instituciones guatemaltecas.

4. Expandir a un mayor número de meses el estudio de estos 30 pacientes, para

determinar cuales alcanzan respuesta molecular mayor en períodos superiores a los 18

meses.

5. Brindar este servicio a los países centroamericanos, ya que Guatemala es el primer país

de Centroamérica que realiza estos monitoreos.

6. Determinar las causas de que en Guatemala la mediana de edad de los pacientes con

leucemia mieloide crónica sea tan baja.

7. Divulgar y publicar a nivel internacional los resultados del presente proyecto de

investigación.

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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IV.4 ANEXOS

ANEXO No. 1: ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE TÉCNIC A

La extracción de células mononucleares se realiza por medio de ficoll, con el fin de

obtener una mayor cantidad de células se probó una nueva metodología la cual consiste en

extraer células mononucleares a partir de una solución de lisis de amonios (Buffer de lisis y

Solución salina isotónica) llevando a cabo una lisis específica de eritrocitos para luego

realizar la separación de leucocitos por centrifugación en frío, al obtener las células

separadas se procedió a realizar la extracción de ARN utilizando el kit con su respectiva

retrotranscripción para verificar que la nueva metodología si había funcionado a la muestra

se le realizó ABL, los resultados fueron muy buenos ya que la banda que se observó fue

bien definida lo cual muestra la buena cantidad de muestra que se obtuvo.

Posteriormente se comparó la extracción de ARN por trizol y con el kit, obteniéndose

mejores resultados con el trizol, como se puede observar en la figura No. 35

FIGURA NO. 35: BANDAS COMPARANDO EXTRACCIÓN DE ARN CON

TRIZOL Y CON KIT.


Las células mononucleares obtenidas de los pacientes se almacenaron en RNAlater a -20 C

( Ver Figura No. 36)

FIGURA NO. 36: ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS DE SANGRE

PERIFÉRICA EN RNALATER


Posteriormente se procedió a realizar la extracción utilizando el método de trizol. En la

figura NO. 37-45, ser observan los pasos para la extracción de ARN, mediante el método de

trizol.

FIGURA NO. 37: TRIZOL, REACTIVO QUE SE UTILIZARÁ P ARA LA

EXTRACCIÓN DE ARN


FIGURA NO. 38: EL REACTIVO TRIZOL ES AGREGADO A LA S MUESTRAS


FIGURA NO. 39: EL TRIZOL DE COLOR ROSA SOBRE LA MU ESTRA DE

PACIENTES


FIGURA NO. 40: LISIS CON TRIZOL DE LA MUESTRA.


FIGURA NO. 41: DISPENSACIÓN DE CLOROFORMO PARA LA S EPARACIÓN

DE FASES DEL ARN OBTENIDO


FIGURA NO. 42: TUBO MEZCLADO CON CLOROFORMO Y TRIZO L, LISTO

PARA CENTRIFUGACIÓN


FIGURA NO. 43: CENTRIFUGACIÓN DE MUESTRAS PARA SEPA RACIÓN DE

FASES


FIGURA NO. 44: SEPARACIÓN DE FASES; LA FASE SUPERIOR

CLOFÓRMICA CONTIENE EL ARN DE INTERÉS.


FIGURA NO. 45: DISPENSACIÓN DE ETANOL PARA PRECIPIT ACIÓN DEL

ARN


Una vez extraído el ARN se procedió a agregar los reactivos necesarios para la RT-PCR en

tiempo real, que permitirá cuantificar los genes ABL y BCR-ABL ( Ver figura No. 46)

FIGURA NO. 46: PREPARACIÓN DE MUESTRAS Y REACTIVOS PAR QRT-

PCR


ANEXO No. 2: EVALUACIÓN DEL KIT:

a. Primera evaluación:

Para iniciar la evaluación del kit se hizo la primera corrida, utilizando los

estándares y controles positivos del kit; en la figura No. 13 se observa la

curva estándar del gen ABL y del BCR-ABL. Posteriormente en las figuras

No. 47-51 se observa la amplificación de los estándares de ABL y de

BCRABL. En las figuras No. 52-54, se observa la amplificación de los

controles negativos y positivos del gen ABL y BCR-ABL.

FIGURA NO. 47: CURVA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL Y ABL , PRIMERA

EVALUACIÓN DEL KIT


FIGURA NO. 48: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL

NORMALIZADA DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.


FIGURA NO. 49: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE B CR-ABL,

DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT


FIGURA NO. 50: AMPLIFICACIÓN NORMALIZADA DE LOS

ESTÁNDARES DE ABL DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.


FIGURA NO. 51: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL, DE

LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.


FIGURA NO. 52: AMPLIFICACIÓN DEL GEN ABL DE LOS CON TROLES

POSITIVOS, DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.


FIGURA NO. 53: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS

DEL GEN BCR-ABL NORMALIZADA, DE LA PRIMERA EVALUACI ÓN

DEL KIT.



DEL GEN BCR-ABL DE LA PRIMERA EVALUACIÓN DEL KIT.


De los resultados obtenidos de la primera evaluación se puede observar en la Tabla

No. 10; que todos los parámetros se encuentran dentro del valor de referencia, lo

que confirma que la primera prueba realizada fue exitosa.

TABLA NO. 10: PARÁMETROS EVALUADOS DURANTE LA PRIME RA

CORRIDA

Parámetro a evaluar Resultado

obtenido

Valor de referencia Interpretación

Pendiente BCR-ABL -3.27 -3,45+/- 0.3 Aceptable

Intercepto b BCR-ABL 39.9 Ct 35-40 Aceptable

Coeficiente de correlación BCR-

ABL

1 > 0.99 Aceptable

Blanco 0

No amplificación Aceptable

Control MMR ( copias de ABL) 17,895.00 > 5,000 copias Aceptable

Ratio BCR-ABL/ABL control

MMR

0.05 % 0.06%- 0.24% Aceptable

Control High ( copias de ABL) 18,613.00 > 5,000 copias Aceptable

Ratio BCR-ABL/ABL control

alto

10.5% 6%- 24% Aceptable

Control negativo 0

> 5,000 copias de ABL, no

copias de BCR-ABL

Aceptable


b. Segunda evaluación:

Con el fin de corroborar los resultados obtenidos en la primera evaluación,

se procedió a realizar una segunda evaluación del kit.

En la figura No. 55 se observa la curva estándar del gen ABL y del BCR-

ABL. Posteriormente en las figuras No.56-59 , se observa la amplificación

de los estándares de ABL y de BCR-ABL. En las figuras No. 60-61, se

observa la amplificación de los controles negativos y positivos del gen ABL

y BCR-ABL.

FIGURA NO. 55: CURVA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL Y ABL DE LA

SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT.


FIGURA NO. 56: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL DE

LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT.


FIGURA NO. 57: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL

NORMALIZADA DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT.



DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT.



NORMALIZADA DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KIT .


FIGURA NO. 60: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS DEL

GEN BCR-ABL NORMALIZADA DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DE L KIT.


FIGURA NO. 61: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES POSIT IVOS DEL

GEN ABL NORMALIZADA DE LA SEGUNDA EVALUACIÓN DEL KI T.


De los resultados obtenidos de la segunda evaluación se puede observar en la Tabla

No. 11; que todos los parámetros se encuentran dentro del valor de referencia, lo

que confirma que la primera prueba realizada fue exitosa.

TABLA NO. 11 PARÁMETROS EVALUADOS DURANTE LA PRIMER A

CORRIDA

PARÁMETRO A

EVALUAR

RESULTADO

OBTENIDO

VALOR DE

REFERENCIA

INTERPRETACIÓN



Coeficiente de correlación

BCR-ABL

0.998 > 0.99 Aceptable

Blanco 0 No amplificación Aceptable

Control MMR ( copias de

ABL)

24509 > 5,000 copias Aceptable

Ratio BCR-ABL/ABL

control MMR

0.09 % 0.06%- 0.24% Aceptable

Control High ( copias de

ABL)


Ratio BCR-ABL/ABL

control alto

12.87% 6%- 24% Aceptable

Control negativo 0 > 5,000 copias de ABL,

no copias de BCR-ABL

Aceptable

c. Evaluación de segundo kit

Para iniciar la evaluación del segundo kit comprado se hizo la primera corrida,

utilizando los estándares y controles positivos del kit; en la figura No. 62 se observa

la curva estándar del gen ABL y del BCR-ABL. Posteriormente en las figuras No.

63-66, se observa la amplificación de los estándares de ABL y de BCR-ABL. En

las figuras No. 67-68, se observa la amplificación de los controles negativos y

positivos del gen ABL y BCR-ABL.

FIGURA NO. 62: CURVA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL Y ABL DE LA

EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.


FIGURA NO. 63: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE

ABL NORMALIZADA DE LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.


FIGURA NO. 64: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE A BL DE

LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.



NORMALIZADA DE LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT .



DE LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.



DEL GEN BCR-ABL NORMALIZADA DE LA EVALUACIÓN DEL

SEGUNDO KIT.



DEL GEN BCR-ABL DE LA EVALUACIÓN DEL SEGUNDO KIT.


De los resultados obtenidos de la segunda evaluación se puede observar en la Tabla No. 12;

que todos los parámetros se encuentran dentro del valor de referencia, lo que confirma que

la primera prueba realizada fue exitosa.

TABLA NO. 12: PARÁMETROS EVALUADOS DURANTE CORRIDA

PARÁMETRO A

EVALUAR

RESULTADO

OBTENIDO

VALOR DE

REFERENCIA

INTERPRETACIÓN


Intercepto b BCR-ABL 40 Ct 35-40 Aceptable


BCR-ABL

1 > 0.99 Aceptable



ABL)


Ratio BCR-ABL/ABL

control MMR

0.20 0.06%- 0.24% Aceptable


ABL)


Ratio BCR-ABL/ABL

control alto

17.74 6%- 24% Aceptable



Aceptable


ANEXO No. 3: RESULTADOS DEL PRIMER MONITOREO DE PAC IENTES

a. Primera corrida

Se observa en la figura No. 69 la amplificación de todos los pacientes

analizados. Posteriormente en la figura No. 70 se observa la curva estándar

del gen ABL y del BCR-ABL. En la figura 71-73, se observa la

amplificación de los estándares para ambos genes. En la figura 74 se

observan los controles positivos, y por último en la figura No. 75 y 76 se

observa la amplificación de las muestras de pacientes.

FIGURA NO. 69: AMPLIFICACIÓN DEL GEN ABL Y BCR-ABL DEL PRIMER

MONITOREO DE PACIENTES .


FIGURA NO. 70: CURVA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL Y ABL DEL

PRIMER MONITOREO DE PACIENTES


FIGURA NO.71: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DE BC R-ABL

NORMALIZADA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.



NORMALIZADA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.



DEL GEN ABL NORMALIZADA DEL PRIMER MONITOREO DE

PACIENTES.



DEL GEN BCR-ABL DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES


FIGURA NO. 75: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE PACIENT ES DE

NO. 1-11 DEL PRIMER MONITOREO


FIGURA NO. 76: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE PACIENT ES DE

NO. 1-11 NORMALIZADA DEL PRIMER MONITOREO


De los resultados obtenidos en el análisis de los primeros 11 pacientes se puede observar

en la Tabla No. 13; que todos los parámetros se encuentran dentro del valor de referencia,

lo que confirma que la primera prueba realizada fue exitosa.

TABLA NO. 13: PARÁMETROS EVALUADOS

PARÁMETRO A

EVALUAR

RESULTADO

OBTENIDO

VALOR DE

REFERENCIA

INTERPRETACIÓN




BCR-ABL




ABL)


Ratio BCR-ABL/ABL

control MMR

0.16 0.06%- 0.24% Aceptable


ABL)

13,279 > 5,000 copias Aceptable

Ratio BCR-ABL/ABL

control alto

16.32 % 6%- 24% Aceptable



Aceptable


Se puede observar en la tabla No. 14, el número de copias obtenidos de los pacientes

analizados, de los cuales los que se encuentran en amarillo se volverán a repetir debido

a que las copias del gen control ABL son muy bajas.

TABLA No.14: RESULTADOS DE PACIENTES PRIMERA CORRID A

MUEST

RA GEN CT COPIAS GEN CT COPIAS

INTERPR

ETACIÓN

1 BCR-ABL 34.611469 5.8383417 ABL 33.772156 83.433746 repetir

2 BCR-ABL 36.005787 2.1450379 ABL 31.188538 493.18369

3 BCR-ABL 38.968128 0.2555943 ABL 27.334051 6986.4189

4 BCR-ABL 34.93325 4.6337609 ABL 30.266048 930.11115

5 BCR-ABL 33.280006 15.189419 ABL 31.372162 434.67471

6 BCR-ABL 37.225002 0.8936977 ABL Undetermined repetir


8 BCR-ABL 31.875544 41.644703 ABL 32.489086 201.63454


10 BCR-ABL 29.024527 322.64447 ABL 28.836058 2486.7952

11 BCR-ABL Undetermined ABL Undetermined repetir

Se validaron las muestras No. 2,,3,4,5,8 y 10 debido a que tienen cantidades adecuadas de

BCR-ABL.

b. Segunda corrida

Se realizó una segunda corrida para validar los resultados de los cuatro

pacientes restantes, a los cuales se les tomó nueva muestra de sangre. En la

Figura No. 77 Y 78 se observan las curvas estándares del gen ABL y del

BCR-ABL. En la figura No. 79 se observa la amplificación de todas las

muestras, incluyendo los controles. En la figura 80-81 la amplificación de

los estándares de ambos genes. En la figura No. 82-83 la amplificación de

los controles de ambos genes y por último en la figura No.84-85 la

amplificación de las muestras.

FIGURA NO. 77: CURVA ESTÁNDAR DE BCR-ABL DE LA SEGU NDA

CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES .


FIGURA NO. 78: CURVA ESTÁNDAR DE ABL DE LA SEGUNDA CORRIDA

DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.


FIGURA NO. 79: AMPLIFICACIÓN DE CADA UNA DE LAS MU ESTRAS, DE LA

SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.



NORMALIZADA DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER

MONITOREO DE PACIENTES.



NORMALIZADA DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER

MONITOREO.


FIGURA NO. 82: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES DEL G EN ABL

DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE

PACIENTES.


FIGURA NO. 83: AMPLIFICACIÓN DE LOS CONTROLES DEL G EN

BCR-ABL NORMALIZADA DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIME R

MONITOREO.


FIGURA NO. 84. AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS DEL GE N BCR-

ABL NORMALIZADA DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER

MONITOREO


FIGURA NO. 85: AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS DEL GE N ABL

DE LA SEGUNDA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO.


En la tabla No. 15, se observan los resultados de los pacientes en la segunda corrida; en la

cual sólo se validó la muestra No. 7 ya que tenía cantidad suficiente del gen control ABL,

el resto se volverá a repetir.

TABLA No. 15: RESULTADOS DE PACIENTES DE SEGUNDA CORRIDA

No. de Muestra GEN COPIAS GEN COPIAS INTERPRETACIÓN

Sample 4 BCR-ABL 9.702967 ABL 125.1519 repetir



Sample 7 BCR-ABL 535.4651 ABL 2807.513 valida


C. TERCERA CORRIDA

Se realizó una tercera corrida para validar los resultados de los tres pacientes

restantes, a los cuales se les tomó nueva muestra de sangre. En la Figura No.

86 y 87 se observan las curvas estándares del gen ABL y del BCR-ABL. En

la figura No. 88 se observa la amplificación de todas las muestras,

incluyendo los controles. En la figura 89-90 la amplificación de los

estándares de ambos genes. En la figura No. 91-92 la amplificación de las

muestras.

FIGURA NO. 86: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN ABL DE LA TER CERA

CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.


FIGURA NO. 87: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN BCR-ABL DE LA

TERCERA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO DE PACIENTES.


FIGURA NO. 88: AMPLIFICACIÓN DE TODAS LAS MUESTRAS, DE LA

TERCERA CORRIDA DEL PRIMER MONITOREO


FIGURA NO. 89: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DEL GEN

CONTROL ABL NORMALIZADA DE LA TERCERA CORRIDA DEL

PRIMER MONITOREO.


FIGURA NO. 90: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DEL GEN

CONTROL BCR-ABL NORMALIZADA DE LA TERCERA CORRIDA D EL

PRIMER MONITOREO


FIGURA NO. 91: AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS DEL G EN ABL

NORMALIZADA DE LA TERCERA CORRIDA DEL PRIMER

MONITOREO.


FIGURA NO. 92: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL BCR-AB L

NORMALIZADA DE LA TERCERA CORRIDA DEL PRIMER

MONITOREO.


En la tabla No. 16, se encuentran los tres pacientes que se repitieron, y se validaron todos

por tener alta cantidad de copias del gen control ABL

TABLA No. 16: RESULTADOS DE TERCERA CORRIDA DE PACI ENTES

No. Muestra Gen copias Gen copias

Sample 4 BCR-ABL 14.85121 ABL 988.9869 Validado




En la tabla No.17, se observa el resumen de los resultados obtenidos de los 10 pacientes

analizados; encontrándose algunos pacientes con respuesta óptima de acuerdo al

tratamiento y algunos con respuesta subóptima; lo cual se podrá ir confirmando a medida

que se hagan los monitoreos cada tres o cuatro meses.

TABLA No. 17: RESULTADOS GLOBALES DE LOS 10 PACIENT ES


No. MUESTRA RESULTADO SI% MESES EN

TX

INTERPRETACION

01-LMC-TR 1.21 7 CCR(1%) casi alcanza CCR

02-LMC-TR 0.35% 8 Ya CCR, falta para MMR ( 1%)

03-LMC-TR indetectable 3

04-LMC-TR 0.403 % 4 Ya CCR, falta para MMR ( 1%)

05-LMC-TR 2.83 % 5 No CCR ni MMR

06-LMC-TR 3.51 % 8 No CCR ni MMR; posible resistencia

07-LMC-TR 8.11 % 18 No CCR ni MMR; posible resistencia

08-LMC-TR 16.72 % 4 Inicio de Tx.

11-LMC-TR 15.45 % 3 Inicio de Tx

10-LMC-TR 10.51% 10 años Posible resistencia, el paciente falleció

no respondió a la segunda línea de

tratamiento.

EVALUACIÓN DE PACIENTES No. 11-25

Para el 15 de julio se programó la segunda jornada para los pacientes restantes; se realizó la

extracción de ARN, para luego realizar la RT-PCR en Tiempo Real; en la figura No. 93 y

94 se observa la amplificación de los estándares de ABL y en las figuras No.95 y 96 se

observa la amplificación de los estándares de BCR-ABL. La curva de estandización de

ABL y de BCR se puede observar en las figuras No. 97 y 98. Los controles positivos se

observan en la figura No. 99. Y la amplificación del gen control ABL en los pacientes se

observa en la figura No. 100 y 101. Y por último la amplificación del transcrito BCR-ABL

en los pacientes se observa en las figuras No.102 y 103.

FIGURA NO. 93: AMPLIFICACIÓN DE LOS CUATRO ESTÁNDAR ES DEL GEN

CONTROL ABL NORMALIZADA PARA LA CUARTA CORRIDA DEL

SEGUNDA JORNADA


FIGURA NO. 94: AMPLIFICACIÓN DE LOS ESTÁNDARES DEL GEN ABL DE LA

CUARTA CORRIDA DEL SEGUNDA JORNADA.


FIGURA NO. 95: AMPLIFICACIÓN DEL TRANSCRITO BCR-ABL DE LA

CUARTA CORRIDA DEL SEGUNDA JORNADA


FIGURA NO. 96: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DE LA CUARTA

CORRIDA DEL SEGUNDA JORNADA


FIGURA NO. 97: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN CONTROL ABL D E LA



FIGURA NO. 98: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN BCR-ABL DE L A



FIGURA NO. 99: SE OBSERVA LA AMPLIFICACIÓN DE LOS

CONTROLES ALTO, MEDIANO Y NEGATIVO DEL GEN BCR-ABL .


FIGURA NO. 100: SE OBSERVA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN

CONTROL ABL EN LAS MUESTRAS DE PACIENTES NO. 11-25.


FIGURA NO. 101: AMPLIFICACIÓN DEL GEN ABL EN MUESTR AS DE

PACIENTES DE LA CUARTA CORRIDA SEGUNDA JORNADA


FIGURA NO. 102: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL BCR-A BL EN

LAS MUESTRAS DE PACIENTES NO. 11-35.


FIGURA NO. 103: SE OBSERVA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN

CONTROL BCR-ABL EN LA MUESTRAS DE PACIENTE NO. 11-2 5.


Los resultados obetenidos en los pacientes se observan en la tabla No. 18; y el único

paciente que no se pudo validar es la muestra No. 12 por tener demasidas copias del

gen ABL, y por lo tanto haberse inhibido la reacción; el resto de pacientes tienen

arriba de 1000 copias de ABL, que es lo mínimo recomendado para validar un

resultado.

TABLA No. 18 : RESULTADOS OBTENIDOS DE LA CORRIDA D E PCR

EN TIEMPO REAL DE LOS PACIENTES 11-25

No.

muestra

No.

correlativo GEN copias GEN copias ratio % %IS

Sample 1 high BCR-ABL 683.7939 ABL 10806.9 0.063274 6.33 5.13

Sample 2 mmr BCR-ABL 71.68877 ABL 2079.783 0.034469 3.45 2.79

Sample 3 neg BCR-ABL 2.844461 ABL 9109.073 0.000312 0.03 0.03

Sample 4 36 BCR-ABL 7.990568 ABL 4852.754 0.001647 0.16 0.13















En la tabla No. 19, se muestra el análisis de resultado de los pacientes según el número de

meses en tratamiento. Y también se observa los que ya han alcanzado la respuesta

molecular mayor (MMR) o la respuesta citogenética completa (CCR)

TABLA No. 19: RESULTADOS E INTERPRETACIÓN DE LOS

PACIENTES


No. MUESTRA RESULTADO

SI%

MESES EN TX INTERPRETACIO

N

36 0.13 MMR

37 0.12 13 MMR

38 1.16 4 CCR

39 2.68 3 años 7 mese No CCR No MMR

40 0.81 3 años 6 meses CCR

41 0.46 12 meses CCR

42 0.26 9 meses CCR

43 1.45 10 meses No CCR

44 132.48 repetir Repetir

45 0.09 14 meses MMR

46 2.86 4 años 7 meses No CCR

47 1.24 8 años 7 meses No CCR

48 0.10 9 meses MMR

49 13.59 No CCR

50 36.47 No CCR

ANEXO No. 5: SEGUNDO MONITOREO DE LOS 25 PACIENTES:

En el mes de noviembre se realizó el segundo monitoreo de los pacientes incluidos en el

estudio; y se hizo mediante dos jornadas.

Para el 10 de noviembre del 2011, se citaron los primeros 10 pacientes de LMC, para su

segundo monitoreo. Las figuras 104 a 110 muestran las curvas de amplicación de los

estándares y muestras para los genes ABL y BCR-ABL.

FIGURA NO. 104: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DE MU ESTRAS

DE PACIENTES SEGUNDO MONITOREO


FIGURA 105: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL ABL EN MU ESTRAS DE

PACIENTES EN EL SEGUNDO MONITOREO


FIGURA NO. 106: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL EN EL SEGUNDO

MONITOREO


FIGURA NO. 107: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL EN E L

SEGUNDO MONITOREO


FIGURA NO. 108: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL ABL

NORMALIZADA EN EL SEGUNDO MONITOREO


FIGURA NO. 109: AMPLIFICACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DEL GEN

ABL EN EL SEGUNDO MONITOREO


FIGURA NO.110 : AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES Y 10 PACIENTES, DEL

SEGUNDO MONITOREO


El 11 de noviembre se repitieron 6 pacientes, para confirmar los resultados obtenidos en la

primera jornada. Las figuras 111-114, muestran las curvas de amplificación de las muestras

de los pacientes y de las curvas estándar para los genes BCR-ABL y ABL.

FIGURA 111: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE PACIENTES DEL GEN

BCR-ABL EN LA SEGUNDA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO


FIGURA 112: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL ABL DE LO S

PACIENTES ANALIZADOS EN LA SEGUNDA JORNADA DEL SEGU NDO

MONITOREO


FIGURA 113: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS Y ESTÁNDARES DE LA

SEGUNDA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO


FIGURA 114: CURVA DE ESTÁNDARES DEL GEN CONTROL ABL DE LA

SEGUNDA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO.


Los siguiente 15 pacientes se citaron para el 21 de noviembre del 2011; y en las figuras de

la 115-118 se muestran las curvas de amplificación de los pacientes y de los estándares para

los genes BCR-ABL y ABL.

FIGURA 115: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE 15 PACIENT ES Y CURVA

ESTÁNDAR DE LA TERCERA JORNADA DEL SEGUNDO MONITORE O


FIGURA 116: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE PACIENTES DE LA

TERCERA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO.


FIGURA 117: AMPLIFICACIÓN DE GEN CONTROL ABL DE LA TERCERA

JORNADA DE LA SEGUNDA MONITOREO


FIGURA 118: AMPLIFICACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DEL GE N BCR-ABL

DE LA TERCERA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOREO


FIGURA 119: AMPLIFICACIÓN DEL GEN ABL EN MUESTRAS DE

PACIENTES DE LA TERCERA JORNADA DEL SEGUNDO MONITOR EO


ANEXO NO. 6: TERCER MONITOREO DE PACIENTES:

En el mes de marzo se realizó el tercer monitoreo de los pacientes incluidos en el estudio; y

se hizo mediante dos jornadas.

En la tabla No. 20, se muestran los resultados obtenidos en la corrida de los primeros 9

pacientes.

TABLA NO. 20 RESULTADOS DE VALIDACIÓN DE CORRIDAS D EL

TERCER MONITOREO

PARÁMETRO A

EVALUAR

RESULTADO

OBTENIDO

VALOR DE

REFERENCIA

INTERPRETACIÓN




BCR-ABL





Aceptable


Para el 13 de marzo del 2012, se atendieron 9 pacientes de LMC, para su tercer monitoreo.

Las figuras 120 a 126 muestran las curvas de amplificación de los estándares y muestras

para los genes ABL y BCR-ABL.

FIGURA NO. 120: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DE MU ESTRAS

DE PACIENTES DEL TERCER MONITOREO


FIGURA 121: AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL ABL EN

MUESTRAS DE PACIENTES DEL TERCER MONITOREO


FIGURA NO. 122: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DEL T ERCER

MONITOREO


FIGURA NO. 123: AMPLIFICACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DEL GEN

ABL DEL TERCER MONITOREO


FIGURA NO.124 : AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES Y P ACIENTES,

DEL TERCER MONITOREO


FIGURA NO. 125: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN CONTROL ABL DEL TERCER

MONITOREO


FIGURA NO. 126: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN BCR-ABL DEL TERCER

MONITOREO


Y por último en la Tabla no. 21, se muestran los resultados obtenidos en pacientes en

Número de copias.

TABLA No. 21: RESULTADOS EN NUMERO DE COPIAS DE BCR-ABL

MUESTRA GEN CТ

CТ

MEDIA CANTIDAD

Sample 1 BCR-ABL 31.00253 27.95307 78.36212

Sample 2 BCR-ABL 25.71436 28.78662 3314.255

Sample 3 BCR-ABL 31.77541 34.40226 45.33394

Sample 4 BCR-ABL 30.83566 30.83566 88.19154

Sample 5 BCR-ABL 35.68541 35.68541 2.844297

Sample 6 BCR-ABL 31.42579 31.42579 58.06888

Sample 7 BCR-ABL 35.58514 35.58514 3.0536

Sample 8 BCR-ABL 37.99069 37.99069 0.55594

Sample 9 BCR-ABL 26.52043 26.52043 1872.813

Sample 1 ABL 25.98226 32.45761 9451.753

Sample 2 ABL 24.88852 24.88852 20076.82

Sample 3 ABL 29.49559 29.49559 840.4831

Sample 4 ABL 23.49025 23.49025 52598.67

Sample 5 ABL 26.38093 26.38093 7182.145

Sample 6 ABL 24.90013 24.90013 19916.88

Sample 7 ABL 31.50833 31.50833 210.105

Sample 8 ABL Undetermined

Sample 9 ABL 22.27419 22.27419 121548.1

Los siguientes 15 pacientes se citaron para el 19 de marzo 2012; y en las figuras de la 127-

133, se muestran las curvas de amplificación de los pacientes y de los estándares para los

genes BCR-ABL y ABL.

En la tabla No. 22, se muestran los resultados obtenidos en la corrida de los 15 pacientes.

TABLA NO. 22: RESULTADOS DE VALIDACIÓN DE CORRIDAS

PARÁMETRO A

EVALUAR

RESULTADO

OBTENIDO

VALOR DE

REFERENCIA

INTERPRETACIÓN




BCR-ABL





Aceptable


FIGURA 127: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DE 15 PACIENT ES Y CURVA

ESTÁNDAR DE LA SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOREO


FIGURA 128: AMPLIFICACIÓN DE GEN CONTROL ABL DE LA

SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOREO


FIGURA NO. 129: AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES DEL GEN ABL DE LA



FIGURA NO. 130: AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES DEL GEN BCR-ABL DE

LA SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOREO


FIGURA NO. 131: AMPLIFICACIÓN DEL GEN BCR-ABL DE LO S PACIENTES

ANALIZADOS DE LA SEGUNDA JORNADA DEL TERCER MONITOR EO


FIGURA NO. 132: GRÁFICA DE ESTÁNDARES DE BCR-ABL DE LA



FIGURA NO. 133: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN ABL DE LA SE GUNDA

JORNADA DEL TERCER MONITOREO


Y por último en la tabla No. 23, se muestran los resultados de los pacientes en número de

copias de cada gen.

TABLA No. 23: RESULTADOS EN NÚMERO DE COPIAS DE LOS PACIENTES

ANALIZADOS

MUESTRA GEN Cт

Cт

MEDIA CANTIDAD

Sample 4 BCR-ABL 37.1872 37.1872 1.881849

Sample 5 BCR-ABL 37.44374 37.44374 1.574433

Sample 6 BCR-ABL 34.73423 34.73423 10.35709

Sample 7 BCR-ABL 21.66268 21.66268 91639.16

Sample 8 BCR-ABL 36.23236 36.23236 3.655022

Sample 9 BCR-ABL 22.30116 22.30116 58789.46

Sample 10 BCR-ABL 30.83853 30.83853 155.4222

Sample 11 BCR-ABL 30.49467 30.49467 197.3957

Sample 12 BCR-ABL 32.4288 32.4288 51.445

Sample 13 BCR-ABL 31.50919 31.50919 97.50163

Sample 14 BCR-ABL Undetermined

Sample 15 BCR-ABL 30.6846 30.6846 172.9779

Sample 4 ABL 25.95381 25.95381 42197.52

Sample 5 ABL 24.84394 24.84394 92715.45

Sample 6 ABL 25.26685 25.26685 68689

Sample 7 ABL 24.18726 24.18726 147715

Sample 8 ABL 27.55034 27.55034 13599.32

Sample 9 ABL 24.14941 24.14941 151734

Sample 10 ABL 26.95535 26.95535 20739.05

Sample 11 ABL 25.66483 25.66483 51796.44

Sample 12 ABL 26.19166 26.19166 35646.84

Sample 13 ABL 27.69549 27.69549 12268.92

Sample 14 ABL 28.01905 28.01905 9753.071

Sample 15 ABL 25.8228 25.8228 46306.23

ANEXO No. 7 : CUARTA MONITOREO DE PACIENTES

En la figura No.134 a 138; se muestran los resultados de amplificación y curva estándar

para el gen BCR-ABL y el gen ABL

FIGURA NO. 134: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS Y CALIBRA DORES DEL

CUARTO MONITOREO


FIGURA NO. 135: AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES DEL GEN BCR-ABL

DEL CUARTO MONITOREO


FIGURA NO. 136: AMPLIFICACIÓN DE MUESTRAS DEL CUAR TO

MONITOREO


FIGURA NO. 137: AMPLIFICACIÓN DE ESTÁNDARES DEL GEN ABL DEL

CUARTO MONITOREO


FIGURA NO. 138: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN CONTROL ABL DEL

CUARTO MONITOREO


FIGURA NO. 139: CURVA ESTÁNDAR DEL GEN BCR-ABL DEL CUARTO

MONITOREO


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