Dr. Rafael Castillo Bocanegra

Facultad de Química UNAM

Desarrollo de un fasciolicida

experimental soluble en agua

1

3 de mayo de 2017

Las enfermedades parasitarias continúan siendo un problema de salud en el mundo

Humanos Animales

Introducción

2

• Amoebiosis (Entamoeba histolytica)

• Giardiosis (Giardia intestinalis)

• Tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi)

• Trichinellosis (Trichinella spiralis)

• Taeniosis (Taenia spp)

• Fasciolosis (Fasciola hepatica)

Parasitosis

Protozoosis

Helmintiosis

Algunas parasitosis en humanos y animales

3 http://www.who.int/zoonoses/institutions/Parasitic/en/ (marzo 2014) Parasite Immunol. 2006, 28, 515-523.

MicrobiosPatógenos

Animales Humanos

Medio acuoso

Enfermedades transmitidas por el agua

El agua como medio de transmisión de parasitosis

4 WHO Headquarters, Geneva, Switzerland, October 2006. pp 39.

Fasciolosis

Infección parasitaria causada por el trematodo Fasciola hepatica, ataca al ganado ovino, bovino, caprino y ocasionalmente al hombre. Es endémica de los lugares con climas tropicales y subtropicales.

Kassai et al. Vet. Parasitol. 1988, 29, 299-326.

Relevancia de la fasciolosis

Baja tasa de crecimiento.

Disminución en parámetros productivos y reproductivos.

Decomiso de hígados en rastros.

Boray, J. C. In Food and Agricultural Organization of the United Nations: Rome; 1994

Fasciolosis (F. hepatica): 17 millones de personas infectadas. Parasitosis importante en el ámbito agropecuario (~18 millones de bovinos infectados y en aumento).

Prevalencia fasciolosis

7 Int. J. Parasitol. 2005, 35, 1255-1278. Vet. Parasitol. 2000, 93, 191-200. Infect. Genet. Evol. 2009, 9, 1023-1032. Expert Opin. Pharmacother. 2007, 8, 1885-1902.

Prevalencia de la fasciolosis animal en México

8

Distribución de la fasciolosis

Bulletin of the World Health Organization. 1999, 77, 340-346. Temas selectos de parasitología; FMVZ-UNAM. 2000, 130-131.

Ciclo de vida de F. hepatica

9 Tomado y modificado de J. Clin. Imaging Sci. 2012, 2, 1-7.

3 cm

1.5 cm

Zoonosis

Bovino infectado

Bovino sano

Distintos animales

Hombre

Transmisión • Alimentos contaminados • Fecal-oral • Agua contaminada

Transmisión • Agua contaminada • Pastura

Transmisión • Agua contaminada • Vegetales contaminados

Transmisión • Agua contaminada • Suelos contaminados

10

http://www.who.int/zoonoses/en/ (marzo 2014) Emerg. Infect Dis. 2003, 9, 403-404. PLOS one. 2014, 9(2): e89055.

Espectro de eficacia de los fármacos empleados para el tratamiento de la fasciolosis

Fairweather I., Boray J. C. Vet. J. 1999, 158, 81-112.

Edad de la F. hepatica en semanas y % de reducción

Fármaco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Bitinol, Hexaclorofeno 50-70 80-99

Oxiclosanide, Niclofolán 50-70 80-99

Albendazol 50-70 80-99

Clorsulón +Ivermectina 50-70 80-99

Clorsulón 90-99

Nitroxinil, Closantel 50-90 91-99

Rafoxanida 50-90 91-99

Triclabendazol 99-100

Diamfenetida 100-91 80-50

Administración de triclabendazol

Por vía oral

Sólo el 5 % de la dosis administrada es absorbida.

Difícil control de dosificación para uso veterinario.

Gallay, J.J. et al. Pat US 4197307 (1978, 1980 Ciba Geigy); Wolff et al, Vet. Parasitol., 1983, 13, 145.

N

N

H

O

Cl

S

CH3

Cl

Cl

Administración de triclabendazol

El Triclabendazol es utilizado en una dosis de 12 mg/Kg en bovinos

12 mg-------------1 Kg

X--------------- 450 Kg X=5400 mg (5.4 g)

Ahora bien si tenemos 100 cabezas de ganado

540,000 mg 540 g

Compuesto absorbido 27 g

Peso 450-600 Kg

Wolff et al, Vet. Parasitol., 1983, 13, 145.

14

Planteamiento del problema

o Prevalencia en animales y humanos

o Pocas opciones de tratamiento o Desarrollo de cepas resistentes o Fármacos usados desde décadas

Nuevas alternativas de tratamiento

Moléculas con mayor potencia Menores efectos adversos Mejorar propiedades

fisicoquímicas Cuidado del medio ambiente

Investigación

15

Desarrollar un compuesto antiparasitario útil para el tratamiento de la fasciolosis animal empleando para ello conceptos de Química Farmacéutica como son el reemplazo bioisostérico y el uso de profármacos.

Objetivo de la Investigación

16

N

N

H

SCH3

O

Cl

Cl

ClN

N

H

SCH3

O

ClReemplazo bioisostéricoNo-clásico

Triclabendazol Compuesto Alfa

Diseño isostérico del compuesto Alfa

Chem. Pharm. Bull. 2002, 50, 649-652.

17

NCH3

OH CH3

NCH3

OH CH3

OH

OH

NCH3

OH CH3

Cl

Cl

O

OH

N

H

CH3

CH3

DicloroisoproterenolIsoproterenol

PronetalolPropranolol

Reemplazo bioisostérico

clásico

Reemplazo bioisostéricoNo-clásico

Burguer: bioisósteros son compuestos que poseen grupos funcionales con formas y volúmenes casi iguales, aproximadamente la misma distribución electrónica y que exhiben similares propiedades físicas y biológicas.

Bioisosterismo

Prog. Drug Res. 1991, 37, 287-371. Curr. Med. Chem. 2005, 12, 23-49.

N

N

H

SCH3

O

Cl

Compuesto Alfa

N

N

H

SCH3

O

Cl

Compuesto Beta

Evaluación fasciolicida del compuesto Alfa in vitro

100% de eficacia a una concentración de 9.09 mg/mL. El compuesto

Alfa además de matar las metacercarias también las desintegró.

18 Vet. Méx. 1997, 28, 291-296. Vera-Montenegro, E. Tesis de licenciatura QFB. Facultad de Química UNAM. 1991.

19

(a) K2CO3, DMF, 115 °C; (b) H2 / Ni-Raney o SnCl2 .2H2O; (c) 1) CS2, KOH-EtOH, 2) AcOH;

(d) CH3I, KOH/acetona; (e) KOH/MeOH.

+

1 2a: R = H

2b: R = COCH3

3a: R = H

3b: R = COCH3

4

5Compuesto Alfa

a 3a

c

d

e, b

3b

b

OHCl

Cl

NHR

NO2

O

Cl

NHR

NO2

O

Cl

NH2

NH2

O

Cl

N

N

H

SHO

Cl

N

N

H

SCH3

Metodología de síntesis

Chem. Pharm. Bull. 2002, 50, 649-652.

Rendimiento global ~41-51%

20

Pf: 181-182 °C sólido amorfo; 192-195 °C cristales

IR, pastilla (KBr) cm-1: 3402, 2720, 1453, 1316, 1157.

RMN 1H, (TMS, DMSO-d6, 300 MHz) d ppm: 2.84 (s, 3H, -SCH3); 6.48 (sa,1H, NH, intercambia

con D2O); 6.77 (d, 1H, J= 7.8 Hz, H-2); 7.29 (s, 1H, H-4); 7.40 (dd, 1H, J1= 7.8 Hz, J2= 8.1 Hz, H-

3); 7.53‒7.66 (m, 2H, H-6, H-7); 7.70 (d, 1H, J= 8.1 Hz, H-4); 7.89 (s, 1H, H-7); 7.94‒8.20

(m, 1H, H-5); 8.12‒8.22 (m, 1H, H-8).

RMN 13C, (TMS, DMSO-d6, 75 MHz) d ppm: 13.46 (S-CH3), 102.95 (C-7), 110.2 (C-2´), 113.116

(C-4), 119.7 (C-8´), 120.83 (C-5), 122.04 (C-4´), 123.8 (C-8´a), 124.12 (C-3´), 124.66 (C-6´),

125.25 (C-7´), 126.21 (C-5´), 128.72 (4´a), 131.34 (C-3a), 133.08 (C-7a), 148.05 ( C-1´), 150.75

(C-2), 152.03 (C-6).

EM, (IE) m/z: 342 (M+2, 39%); 340 (M+•,100%); 305(M‒35, 49%); 304 (M‒36); 290 (304‒15,

40%); 271 (304‒33, 20%); 258 (290‒32, 15%); 127 (340‒213, 20%).

EMAR, (IE) (M+•) m/z. Calculado para C18H13ClN2OS: 340.0437. Encontrado: 340.0437.

Análisis Elemental calculado para C18H13ClN2OS: C, 63.43; H, 3.84; N, 8.22; S, 9.41.

Encontrado: C, 62.82; H, 3.69; N, 7.97; S, 9.86.

4

7Cl

O

2'

3'

4'

8'

7'

5'

6'

N

N

H

SCH3

Compuesto Alfa

5-Cloro-2-(metiltio)-6-(1-naftiloxi)-

1H-bencimidazol

Constantes físicas del compuesto Alfa

Chem. Pharm. Bull. 2002, 50, 649-652.

21

Difracción de rayos X

Acta Crys. 2014, E70, o77.

22

Cl

O N

N

H

SCH3

Cl

O N

N

H

S

CH3

O

Cl

O N

N

H

S

CH3

OO

4-6 4-7 4-8

a b

(a) Ac. mCPB, CHCl3 -CH

3CN, 0-5 °C o NaIO

4, calor; (b) Ac. mCPB, CH

3CN, t.a.

Síntesis de metabolitos del Alfa

J. Mex. Chem. Soc. 2005, 49, 349-354.

Grupo (n=5)

Edad de la fasciola % de Reducción (15 mg/Kg)

a,b

1 3 días 100

3 2 semanas 100

5 4 semanas 100

7 6 semanas 100

9 8 semanas 100

11 10 semanas 100

Eficacia del compuesto alfa en ovinos a diferentes edades de la F. hepatica

Ibarra et al. Vet. Méx., 1997, 28, 297-301.

aPreviamente formulado por David Tamayo Esquivel bLos grupos control 2,4,6,8,10 y 12 tuvieron 0% de reducción

N

N

H

O

Cl

SCH3

Resultados ensayos in vitro e in vivo 100% eficacia in vitro

a 29.34 mM 86.9% de eficacia a dosis de 15 mg/kg contra fasciolas adultas de 10 semanas en borregos, en cápsulas de gelatina

100% de eficacia a 15 mg/kg formulado en suspensión contra fasciolas de 3 días a 12 semanas en borregos infectados experimentalmente

Dosis efectiva en bovinos 12 mg/Kg. Edad de las fasciolas 4-10 semanas.

96.4–100% de efectividad a 12 mg/kg en ganado bovino de 3 días a 12 semanas de desarrollo de las fasciolas

100% y 99.1% de reducción de huevos en animales experimental y naturalmente infectados a 12 mg /kg de peso en ganado bovino

100% de reducción de huevos en animales experimentalmente infectados a 15 mg /kg de peso en ganado ovino irlandés y mexicano

62.5% de reducción de fasciolas en animales experimentalmente infectados a 15 mg /kg en ganado ovino Irlandés

No es teratogénico

Dosis máxima tolerada en bovinos mexicanos 180 mg/kg de peso (IS = 15 veces la dosis efectiva)

Vet. Méx. 1997, 28, 297-301. Vet. Méx. 2000, 31, 47-51. Parasitol. Res. 2004, 92, 211-214. J. Vet. Med. B. 2006, 53, 145-149.

25

Resultados a nivel de ultraestructura

Pérdida de espinas, daño en tegumento, exposición de la lámina basal, daño en fibras musculares

Daño estructural en microtúbulos y/o actina, de células de tegumento y musculares

Activo en fasciolas resistentes in vitro

Efecto en las estructuras del sistema reproductor de fasciolas susceptibles a TCBZ (Espermatogénesis y Ovogénesis)

Daño estructural tiempo dependiente (6-72 hrs)

Parasitol. Res. 2004, 93, 283-286. Parasitol. Res. 2007, 100, 365-377. Vet. Parasitol. 2008, 153, 52-64. Parasitol. Res. 2010, 106, 311-323. Vet. Parasitol. 2012, 187, 183-195.

26

Fasciola hepatica (tres semanas)a las 6 h (1), 12 h (2) y 24 h (3) tras exposición al compuesto Alfa. La microscopía electrónica de barrido muestra daño al tegumento de la superficie ventral (flechas negras). Es notoria la pérdida del tegumento después de 24 h, así como el disco succionador (O) y el tegumento de la parte posterior (flechas blancas).

Estudios sobre el efecto del compuesto Alfa en la estructura y ultraestructura de la F. hepatica

Parasitol. Res. 2005, 95, 379-382.

27

Tegumento de Fasciola hepatica resistentes a TCBZ después de 24 h de la exposición al metabolito AlfaSO. (A) Se observa daño evidente en la superficie del tegumento (flechas), el disco y el succionador ventral (OS y VS) y en las espinas (SS). (B) Imagen de la superficie dorsal de F. hepatica. (C y D) Amplificación de la zona dorsal. Es evidente la pérdida de las espinas, importantes para la adhesión y permanencia del parásito en el huésped.

Estudios sobre el efecto in vitro del compuesto Alfa en la estructura y ultraestructura de la F. hepatica

Parasitology. 2006, 133, 195-208.

28

Estudios sobre el efecto en el sistema reproductivo

Vet. Parasitol. 2012, 187, 183-195.

29

Compuesto CI50 mM

G intestinalis

CI50 mM

E. histolytica

CI50 mM

T. vaginalis

ALFA 0.3095 0.0264 0.4518

ABZ 0.0370 56.600 1.5920

NTZ 0.0130 0.0550 0.1100

MTZ 1.2280 0.3500 0.2160

Actividad inhibitoria del compuesto Alfa sobre la enzima Triosafosfato isomerasa (TIM) 100 mM E. histolytica: 66% de inhibición T. cruzi: 13% de inhibición

Otras actividades biológicas

Susceptibilidad in vitro en protozoarios

Ensayos en TIM

J. Mol. Graphics Modell. 2011, 30, 90-99.

30

N

H

N

O

Cl

SCH3

Resultados de farmacocinética

Alfa no se detectó en sangre pero sí sus

metabolitos SO y SO2

pka 2.87

logP 1.44

Unión a proteínas plasmáticas 82-86 %

t1/2 Alfa SO en ovinos 19.86 ±1.18 h

t1/2 Alfa SO2 en ovinos 19.43 ±3.33 h

t1/2 Alfa SO en bovinos 29.87 ±8.84 h

t1/2 Alfa SO2 en bovinos 46.32 ± 15.23 h

Solubilidad a pH 7.4, > 0.02 mg/mL

4% de la dosis se absorbe

Alfa 5-Cloro-2-metiltio-6-(1-

naftiloxi)-1H-bencimidazol

J. Vet. Pharmacol. Therap. 2008, 32, 154-159.

Solubilidad acuosa de los bencimidazoles

Mckellar, Q. A.; Scott, E. W. J. Vet. Pharmacol. Ther. 1990, 13, 223–247.

Pobre

solubilidad

acuosa

Administración de triclabendazol

Por vía oral

Difícil control de dosificación para uso veterinario.

Gallay, J.J. et al. Pat US 4197307 (1978, 1980 Ciba Geigy); Wolff et al, Vet. Parasitol., 1983, 13, 145.

N

N

H

O

Cl

S

CH3

Cl

Cl

33

Compuesto poco soluble en agua

Modificación química

Modificación física

Alteración de la composición del

solvente

Sistemas acarreadores

Profármacos Formación de sales

Molienda Micronizado Nanocristales Co-cristales Estructuras porosas

Ajuste de pH Co-solventes Surfactantes

Ciclodextrinas Micelas Microemulsiones Liposomas Polímeros anfifilicos

Modificación de la solubilidad

34

Profármacos

Mejorar solubilidad

Aumentar biodisponibilidad

Mejorar estabilidad

Mejor selectividad

Biotransformación

Modificador

Derivado biorreversible

Bioprecursor

Oxidoreducción Hidrólisis

Fosfonooximetil derivados de 1H-bencimidazol-2-carbamato de metilo

Chassaing, C. et al. J. Med. Chem. 2008, 51, 1111–4. Christophe, P. A.; Chassaing, S. Pat US 20090131369A1 2009.

36

O

S

Cl

O N

N

O

P O-

O-

CH3

Na+

Na+

O

S

Cl

O

Cl

Cl

N

N

O

P O-

O-

CH3

Na+

Na+

Profármacos hidrosolubles: Fosfonooximetil derivados

S

Cl

O N

NH

CH3

CH3

S

Cl

O N

NH

Cl

Cl

Compuesto Alfa

Triclabendazol

37

O

O

PO O-

Na+

O

O

PO H

2322

O

O

PO OH

24

a b

Cl

O S

O

O

Cl

27

OHS

O

O

Cl + CH2BrCl

25 26

c

O

O

PO O

Cld

28

Ruta sintética

Reactivos y condiciones: (a) KMnO4, NaHCO3, H2O, 0-5 °C; (b) HCl, 0-5 °C; (c) reflujo 70°C; (d) NaHCO3, n-Bu4NHSO4, CH2Cl2–H2O, 0 °C–temperatura ambiente

38

NH

NSCH3

Cl

O

R1

O

O

PO O

Cl

+

13, 14 28

29a, 30a

e

OO

O

SCH3

Cl

O N

N

O

P

R1

O

OO

O

P

SCH3

Cl

O N

N

R1

+

29b, 30b

f

g

OHOH

O

SCH3

Cl

O N

N

O

P

R1

Na+

Na+

O-OO

-

SCH3

Cl

O N

N

O

P

R1 OH

OHO

O

P

SCH3

Cl

O N

N

R1

Na+

Na+

O-

O-O

O

P

SCH3

Cl

O N

N

R1 ++

31a, 32a 31b, 32bMFR-33a, MFR-34a MFR-33b, MFR-34b

13: Alfa, R1= naftiloxi

14:Triclabendazol, R1= diclorofeniloxi

Ruta sintética

Reactivos y condiciones: (e) NaH, DMF, temperatura ambiente; (f) HCl 4 M en dioxano, temperatura ambiente; (g) NaOH, MeOH/H2O, temperatura ambiente.

Mezcla de regioisómeros obtenidos

O

SCH3Cl

O N

N

OP O

-

O-

SCH3Cl

O N

N

OP O

O- O

-

O

SCH3Cl

O

Cl

Cl

N

N

OP O

-

O-

SCH3Cl

O

Cl

Cl

N

N

OP O

O- O

-

Na+

Na+

Na+ Na

+

Na+

Na+

Na+Na

+

MFR-33a MFR-34a MFR-33b MFR-34b

40

Mezcla de regioisómeros

41

Mezcla de regioisómeros

O

S

Cl

O N

N

O

P O-

O-

S

Cl

O N

N

O

P O

O-

O-

+

Na+

Na+

Na+ Na

+

Molecular Formula = C19

H14

ClN2Na

2O

5PS + Na+

Formula Weight = 494.79616 + Na+ = 516.97

Monoisotopic Mass = 493.984495 Da

Estrategia de profármaco utilizada

Derivatización

13-14

(Soluble en agua)

+H H

O

MFR-33

MFR-34

13-14 III

(Pobre solubilidad acuosa)

K1Hidrólisis

enzimática

Cl

SCH3

O

R1

N

NH

Na+

Na+

O

SCH3

Cl

O

R1

N

N

O

P O

O

+

II I

O

O

OH OP Na+

Na+

SCH3

Cl

O

R1

N

N

OHCl

SCH3

O

R1

N

NH

K2

Descomposición

espontánea

13, MFR-33, II= 1-naftilo

14, MFR-34, II= 2,3-diclorofenilo

Solubilidad, estabilidad acuosa e hidrólisis con fosfatasa alcalina

aDeterminado a 25 °C, b>95% por UV-HPLC determinado a temperatura ambiente, cdeterminado a pH 7.4 y 37°C.

Compuesto

Solubilidad Acuosa (mg/mL)a

Aumento de la solubilidad

Estabilidad Acuosa (h)b

Hidrólisis en solución con fosfatasa alcalinac

pH 7 pH 1 y 7.4 t1/2 (segundos) Promedio ± DE

Alfa 2.6 X10-4 >26

Triclabendazol 2.4 X10-4 >26

MFR-33 20.67 79,500 >26 7.9±2

MFR-34 21.12 88,000 >26 13.6±4

SCH3

Cl

O N

NH

SCH3

Cl

O N

NH

Cl

Cl

Compuesto Alfa Triclabendazol

O

SCH3

Cl

O N

N

O

P O-

O-

Na+

Na+

MFR-33

O

SCH3

Cl

O

Cl

Cl

N

N

O

P O-

O-

Na+

Na+

MFR-34

Eficacia in vivo de MFR-33 en ovinos contra fasciolas adultas

Compuesto y ruta de

administración (n=6)

Dosis

(mg/Kg)

Promedio ± EEa Eficacia (%)

Fasciolas

recuperadas

Huevos

recuperados

Reducción

de fasciolas

Reducción

de huevos

MFR-33 (oral) 12 12.3±7.3 3.6±1.7 83.3 95.2

MFR-33 (intramuscular) 4 9.0±2.8 37.5±14.8 87.8 50.8

MFR-33 (subcutánea) 4 28.5±7.4 23.0±11.4 61.4 69.8

Grupo control Sin

tratamiento

74.0±4.7 76.3±26.8

0 0

aEE. Error estándar.

Compuesto alfa en suspensión es utilizado en ovinos a una concentración de 15

mg/kg obteniendo una reducción de fasciolas de 86.9%.

Flores-Ramos, M.; et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 5814-5817

MFR-33bMFR-33a

+SCH3

Cl

O N

N

O

P OO

- O-Na

+ Na+

O

SCH3

Cl

O N

N

O

P O-

O-

Na+

Na+

Eficacia in vivo de MFR-34 en ovinos contra fasciolas adultas

Compuesto y vía de

administración (n=6)

Dosis

(mg/Kg)

Promedio ± EEa Eficacia (%)

Fasciolas

recuperadas

Huevos

recuperados

Reducción de

fasciolas

Reducción

de huevos

MFR-34 (intramuscular) 4 3.5±1.4 0±0 96.8 100

MFR-34 (intramuscular) 6 1.7±1.1 0±0 98.3 100

MFR-34 (intramuscular) 8 0.8±0.6 0±0 99.2 100

Triclabendazol (14, oral) 12 0.1±0.1 0±0 99.9 100

Grupo control Sin

tratamiento

102.6±12.3 31.5±4.7

0 0

aEE. Error estándar.

Flores-Ramos, M.; et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, en proceso.

MFR-34bMFR-34a

+SCH3

Cl

O

Cl

Cl

N

N

O

P OO

- O-Na

+ Na+

O

SCH3

Cl

O

Cl

Cl

N

N

O

P O-

O-

Na+

Na+

Parte química

Rendimiento global 43 %.

Parte biológica

El compuesto Alfa en suspensión fue efectivo al 100% in vivo contra fasciolas desde 3

días hasta 12 semanas de edad.

Se demostró ampliamente que el compuesto Alfa es un bioisóstero del TCBZ y que

se puede emplear como fármaco alternativo para el tratamiento de la fasciolosis en

ganado ovino y bovino.

Se propone que la tubulina y actina sean los posibles blancos.

El compuesto Alfa se detecta en plasma como sulfóxido y sulfona, los cuales podrían

ser las especies activas.

Mostró ser un potente amebicida, CI50= 26.4 nM.

46

Conclusiones

Se lograron sintetizar dos nuevos profármacos del compuesto Alfa (MFR-33) y del triclabendazol (MFR-34) como sal de fosfato disódico. Rendimiento global 84%.

La solubilidad acuosa.

Se incrementó 79,500 y 88,000 veces en comparación a sus compuestos precursores.

Estabilidad acuosa. >95% después de 26 horas a pH 7.4, ideal para la formulación desde un

punto de vista fisiológico. Los resultados confirman que el compuesto administrado al ganado se

trata del profármaco y no de los compuestos precursores. Con esta estabilidad, se puede garantizar la administración de los

profármacos a una población considerable de animales sin que los compuestos en solución sufran degradación.

47

Conclusiones en relación a los profármacos