DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR LA TÉCNICA DE MILLER
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DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR LA TÉCNICA DE MILLER
(DNS)
Resumen
En la presente práctica se llevará a cabo la determinación de azúcares reductores. La
cantidad de azúcares reductores se determinará colorimétricamente aplicando el método
del ácido dinitrosalicílico (DNS) a una gama de soluciones patrón de glucosa, a objeto de
obtener la correspondiente curva de calibrado.
Palabras clave: carbohidratos, azucares reductores, método colorimétrico.
Abreviaturas empleadas: DNS, ácido dinitrosalicílico.
1. Introducción y objetivo
Los carbohidratos son moléculas formadas por carbono, hidrogeno y oxigeno. Todos los
carbohidratos son azucares pequeños, solubles en agua (glucosa y fructosa, por ejemplo)
o bien cadenas, como el almidón y la celulosa, que se elaboran enlazando subunidades
de azúcar.
En la naturaleza, los carbohidratos se presentan como monosacáridos (azucares
simples), oligosacáridos (contienen de dos a diez unidades monosacáridas) y
polisacáridos (glúcidos poliméricos mas grandes). Los monosacáridos se clasifican en
aldosas si tienen grupo aldehído y cetosas si tienen un grupo cetona. Todos los
monosacáridos, aldosas o cetosas y la mayoría de los disacáridos son azucares
reductores (excepto la sacarosa) porque uno de sus dos carbonos anoméricos no está
formando enlace glucosídico.
Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la capacidad de los
azucares reductores de reducir los iones cúpricos (Cu2+) y aportan un ensayo sencillo
para reconocer azucares que pueden existir como aldehído o cetona libre. Los azucares
que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma
inespecífica a otras moléculas; los que no lo hacen, azucares no reductores.
El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido dinitrosalicílico
para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la
determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares reductores. Esta
técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una
fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática.
Objetivo:
Construcción de una curva patrón para calcular el coeficiente de correlación
mediante el método DNS.
2. Material
3.1. Material
*
* Tubo de ensaye con rosca (25)
* Gradilla para tubos (1)
* Probeta de 100mL (1)
* Vasos de pp de 100mL (2)
* Pipetas de 1mL (2)
* Pipetas de 2mL (2)
* Pipetas de 5mL (2)
* Pipetas de 10mL (2)
* Matraz aforado de 100mL (1)
* Matraz aforado de 250mL (1)
* Baño María (1)
* Piseta con agua destilada (1)
* Agitador magnético (1)
* Termómetro (1)
* Frasco ámbar (1)
* Celdas para espectrofotómetro (2)
* Papel seda
3.2.
3.3. Equipo
*
* Vórtex
* Parrilla de agitación y calentamiento
* Espectrofotómetro
3.4.
3.5. Reactivos
*
* Acido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
* Hidróxido de sodio anhidro (NaOH)
* Fenol (C6H6O)
* Sulfito de sodio anhidro (Na2SO4)
* Glucosa (C6H12O6)
3. Método
4.6. Reactivo DNS
Disolver 2.5g de DNS, 2.5g de NaOH, 0.125g de Na2SO4 y 0.5g de C6H6O en
200mL de agua destilada. Aforar a 250mL con agua destilada. Colocar la solución en el
frasco ámbar y etiquetarla.
4.7. Solución patrón de glucosa (1.0g/L)
Disolver 0.1g de glucosa en 90mL de agua destilada, agitar hasta disolver y aforar a
100mL.
4.8. Curva patrón
A partir de una solución de glucosa y por dilución con agua destilada, preparar una gama
de soluciones de glucosa de distinta concentración (por duplicado), como se indica en el
anexo (An1; Tabla 1).
A cada uno de los tubos, adicionar 1mL del reactivo DNS y agitar con el Vórtex. Poner en
baño María en ebullición durante 5 minutos, enfriar, agregar 8mL de agua destilada y
determinar la absorbancia a 575nm, utilizando como blanco el tubo 1.
4. Resultados
En el anexo (An2) se reportan los valores de las absorbancias obtenidas (tabla 2); la
media de cada duplicado, la desviación estándar y él % de error (tabla 3).
La Grafica 1 muestra la curva patrón obtenida a partir de los datos experimentales (los
valores representados son el promedio de las absorbancias por duplicado); ajustándola a
la recta se obtuvo la ecuación:
y= 0.0442x – 0.0508
donde la pendiente (m) es 0.0442 y la ordenada al origen (b) es 0.0508.
R = 0.9921
5. Discusión
La absorbancia es directamente proporcional a la concentración del material que absorbe
la luz
6. Cuestionario
1. Explique el fundamento de la técnica de DNS.
Se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor
al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo), cuya presencia puede detectarse por
lectura de la Absorbancia en la zona de 540-570nm.
2. ¿Para que se utiliza el NaOH, el fenol y el sulfito de sodio en la técnica de DNS?
Los carbohidratos son particularmente sensible a ácidos fuertes y altas temperaturas.
Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con
una deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen
varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos
para producir compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos
fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más
común es con fenol. Este método es fácil, eficaz y rápido. Todos los azúcares como
oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que éstos bajo
hidrólisis ácida producen monosacáridos. La forma en que procede la reacción no es
estequiométrica y depende de la estructura del azúcar, por lo tanto se realiza una curva
patrón.
3. ¿Porque es importante esta técnica en microbiología?
Sirve en la aplicaciones industriales las cuales hay varios microorganismos que
desarrollan varias rutas, lo que hace la técnica DNS en corresponder a la gama de
azucares reaccionando en su metabolismo donde degradan azúcar para convertirlo en
ATP, ya que varios microorganismo sirven para la producción de vinagre, vinos ,
mantequilla , yogurt y pan enfatizando ayuda a precisar una reacción enzimática.
4. ¿Que interferencias puede tener este método?
Una de las cuales pueda ser que el blanco, se encuentre contaminado, o en su defecto
que la a cantidad de solubilidad de agua con el gradiente de glucosa se en mayor
proporción que la del soluto, haciendo que los valores de la observancia se alteren.
5. De algunos ejemplos de azucares reductores y explique porque la sacarosa no es un
azúcar reductor.
La sacarosa no es un azúcar reductor porque tiene los dos carbonos anoméricos
formando parte del enlace que une los dos monosacáridos.
6. ¿Que es la glucosilación avanzada?
Los azúcares reductores provocan la alteración de las proteínas mediante la reacción de
glucosilación no enzimática también denominada reacción de Maillard o glicación.
Desde el punto de vista químico, la glucosilación se define como la reacción de grupos -
amino primarios de aminoácidos, péptidos y proteínas con el grupo carbonilo de los
azúcares reductores. A lo largo de esta reacción se pueden distinguir tres etapas:
inicialmente se produce la asociación del azúcar con la proteína, formando un compuesto
denominado base de Schiff.
7. Explique con un esquema de reacción como se forman los compuestos bicarbonílicos.
Esta reacción se basa con la base de Schiff que da como subsecuente producto de
Amadori.
Anexo
An1.
Tabla 1. Gama de soluciones de glucosa de diferente concentración. |
Tubo | Volumen de laSolución Patrón (mL) | Volumen de Agua(mL) | Concentración(mg/L)
|
1 | 0.0 | 1.0 | 0.0 |
2 | 0.1 | 0.9 | 100 |
3 | 0.2 | 0.8 | 200 |
4 | 0.3 | 0.7 | 300 |
5 | 0.4 | 0.6 | 400 |
6 | 0.5 | 0.5 | 500 |
7 | 0.6 | 0.4 | 600 |
8 | 0.7 | 0.3 | 700 |9 | 0.8 | 0.2 | 800 |10 | 0.9 | 0.1 | 900 |11 | 1.0 | 0.0 | 1000 |
An2.
Tabla 2. Absorbancia reportada (575nm) |Tubo | Absorbancia | Tubo | Absorbancia |1 | Blanco | 12 | - |2 | 0.041 | 13 | 0.056 |3 | 0.043 | 14 | 0.084 |4 | 0.115 | 15 | 0.149 |5 | 0.169 | 16 | 0.179 |6 | 0.211 | 17 | 0.206 |7 | 0.254 | 18 | 0.242 |8 | 0.320 | 19 | 0.293 |9 | 0.324 | 20 | 0.368 |10 | 0.393 | 21 | 0.393 |11 | 0.423 | 22 | 0.497 |
Tabla 3. Media de absorbancias por duplicado, desviación estándar y % de error |Media | DesviaciónEstándar | % deerror |0 | | |0.04 | | |0.06 | | |0.13 | | |0.17 | | |
0.20 | | |0.24 | | |0.30 | | |0.34 | | |0.39 | | |0.46 | | |
Concentración(mg/L) | PromedioAbsorbancia575nm |0.0 | 0 |100 | 0.04 |200 | 0.06 |300 | 0.13 |400 | 0.17 |500 | 0.20 |600 | 0.24 |700 | 0.30 |800 | 0.34 |900 | 0.39 |1000 | 0.46 |
Grafica 1. Curva patrón para la determinación de azucares reductores (DNS)
ConclusiónDebido a nuestros resultados nos damos cuenta que
Referencias bibliográficas (Chaplin, 1986),Kowluru, R.A., Heidorn, D.B., Edmondson, S.P., Bitensky, M.W., Kowluru, A., Downer, N.W., Whaley, T.W., Trewhella, J. Glycation of calmodulin: chemistry and structural and functional consequences. Biochemistry 28,2220-2228,1989The Glycation Homepage (www.geocities.com/CapeCanaveral/8824/)78 ways sugar can ruin your health (www.rheumatic.org/sugar.htm)Maillard Reaction (chemistry.miningco.com/library/weekly/aa122898.htm)