EFECTOS DE LAS HORMONAS TIROIDEAS SOBRE LA ANSIEDAD Y EL

DESARROLLO.

Sussane Ayed Carmona Universidad de Valencia (UV)

RESUMEN

La falta de hormonas tiroideas (HT) produce numerosas enfermedades como el

cretinismo (retraso en el crecimiento físico y mental) o, alteraciones en el SNC.

Numerosos experimentos demuestran la necesidad de las HT para que no se produzcan

alteraciones en el desarrollo del cerebro que desemboquen en falta de memoria, de

coordinación locomotora o estados de ansiedad y miedo. La presente investigación

tiene como objetivo el estudio de las funciones de las hormonas tiroideas, sobre todo en

el desarrollo del sistema nervioso central y del cerebro, evaluando los niveles de

ansiedad en ratones con y sin hipotiroidismo en el estado adulto. Para ello se han

sometido a estos ratones al test de campo abierto, los cuales sirven para evaluar estas

propiedades y se ha procedido a pesar los animales al principio de la práctica para

comprobar si los tratamientos han tenido efecto sobre el desarrollo.

Palabras clave: hormonas tiroideas, hipotiroidismo, ansiedad, desarrollo.

INTRODUCCIÓN

Las hormonas tiroideas juegan un papel fundamental en numerosas funciones

corporales. Existen dos tipos, la tiroxina o T4 y la triyodotironina o T3. Son

sintetizadas en la glándula tiroidea a partir de la tiroglobulina, que contiene 140 residuos

de tirosina, sustrato con el que se combina el yodo para formar las HT. Es necesario un

aporte adecuado de yodo para que se dé la reacción de unión del yodo a la tirosina,

donde algunos residuos unen un yodo (monoyodotirosina, MIT) y otros dos

(diyodotirosina, DIT). Cuando se acoplan una molécula de MIT y una molécula de DIT,

se forma T3, mientras que si el acoplamiento se produce entre dos moléculas de DIT, se

produce T4. En los tejidos, se produce la conversión de T4 en T3 que es la forma activa

que interactúa con las células diana.

Las HT se liberan gracias a la inducción neural. El hipotálamo produce la TSH,

que actúa sobre la adenohipófisis dando lugar a la liberación de la neurohormona TRH,

cuya acción sobre la tiroides induce la liberación de HT. El fallo en la acción de la TRH

sobre sus receptores, provoca problemas como hipotiroidismo, comportamiento ansioso

y depresivo (Sun et al., 2009).

Cuando las HT llegan a sus tejidos diana, difunden a través de la membrana

celular para unirse a sus receptores en el núcleo. Muchos de los receptores para las HT

son codificados por dos genes: TR y TR. La acción de las HT se da a través del

control de la regulación de la expresión génica por la interacción de los complejos

hormona-receptor con el DNA, actuando como factores de transcripción (Guadaño-

Ferraz et al., 2003). El receptor sin hormona recluta correpresores, y con hormona,

activadores, suprimiendo o activando la expresión de sus genes diana (Venero et al.,

2005).

Las HT ejercen multitud de funciones en el organismo. Están implicadas en el

desarrollo normal y funciones del SNC (Guadaño-Ferraz et al., 2003). La ausencia de

HT en periodos tempranos del desarrollo da lugar a múltiples alteraciones funcionales y

morfológicas en el desarrollo cerebral (van Wijk et al,. 2008), perjudicando la

neurogénesis y provocando alteraciones comportamentales y déficit cognitivos que

derivan en deficiencias mentales severas e irreversibles (Slone Wilcoxon et al,.

2007),además de efectos sobre el crecimiento de los tejidos musculares dando graves

retardos físicos. Multitud de estudios se han realizado para conocer estos efectos

regulatorios evitando la acción de las HT, al suprimir la expresión de sus receptores,

como el TR1 que está mucho más presente en el cerebro (Venero et al., 2005).

Las hormonas tiroideas son necesarias para el normal desarrollo del crecimiento

y de importantes órganos como el cerebro, el corazón y el aparato respiratorio. Su

déficit o ausencia provocar alteraciones en el desarrollo físico y mental,

Knockouts para TR1 presentan anomalías comportamentales, como un menor

comportamiento exploratorio en el test de campo abierto, ansiedad, reducción de

memoria de reconocimiento y disfunción locomotriz por falta de desarrollo cerebelar

(Venero et al., 2005). Esto correlaciona con una reducción del número de terminales

gabaérgicos en las neuronas piramidales de la capa CA1 del hipocampo y una

disminución en la expresión de genes implicados en el aprendizaje y memoria (Slone

Wilcoxon et al,. 2007). Por tanto, las HT estarían implicadas en la regulación de la

estructura y función del hipocampo modulando respuestas emocionales (Guadaño-

Ferraz et al., 2003).

Experimentos con grupos de hipotiroideos crónicos o perinatales, demuestran

que el crónico tiene efectos más pronunciados, sugiriendo que los efectos del

hipotiroidismo en el desarrollo del cerebro, pueden ser reversibles dependiendo del

tiempo de deficiencia (van Wijk et al,. 2008).

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales de estudio

Se seleccionaron veinte ratones de la especie Mus musculus del animalario de la

Universidad de Valencia. Siete de esos ratones fueron utilizados como control y no se

les sometió a ningún tratamiento. Otros seis ratones, recibieron tratamiento anti-tiroideo

durante su desarrollo hasta las 7-8 semanas de edad y fueron clasificados dentro del

grupo “desarrollo”. Por último, otros siete ratones fueron mantenidos bajo el

tratamiento anti-tiroideo durante toda la vida, por lo que son hipotiroideos durante todo

el experimento y pertenecen al grupo “anti-tiroideo total”.

En el uso y cuidado de estos animales, se siguieron las directrices recomendadas

en la guía del National Research Council.

Inducción de hipotiroidismo experimental

Las madres de los animales de los grupos “desarrollo” y “anti-tiroideo total”

fueron tratadas con Carbimazol, una droga anti-tiroidea. Esta deficiencia materna en HT

afecta a la neurogénesis fetal y crecimiento cerebral, ya que disminuye el transporte de

T4 al feto (Hasebe et al,. 2008). Los ratones del grupo “desarrollo” fueron sometidos al

tratamiento hasta las 7-8 semanas de edad, primero a través de la lactancia y,

posteriormente mezclado con la comida. Los ratones del grupo “anti-tiroideo total”

estuvieron bajo el tratamiento durante toda su vida. Las madres de los ratones del grupo

control no fueron tratadas.

Test campo abierto

Se introduce el animal, en un campo abierto con un metro de diámetro y 50 cm

de altura. La base está dividida en dos círculos concéntricos delimitando una zona

interna y otra externa. Observamos durante 5 minutos el comportamiento del animal y

contabilizamos los segundos que emplea en diversos comportamientos, los cuales se

corresponden con estados de ansiedad o relajación.

Ensayo Inmuno Enzimático Absorbente (ELISA)

Para valorar los niveles de T4 en sangre de cada uno de los ratones de los distintos

grupos, realizamos los análisis sanguíneos pertinentes (Protocolo de extracción

sanguínea adjuntado en el guión de prácticas). Con las muestras de sangre obtenidas y

debidamente procesadas, realizamos un ensayo ELISA de tipo competitivo (Figura.1),

siguiendo el protocolo del kit comercial Roche® con pocillos conteniendo anticuerpos

anti-T4 adsorbidos. Puesto que es un método colorimétrico, tomamos la lectura de

absorbancia mediante el lector Victor.

Análisis estadísticos

Para evaluar posibles diferencias entre los distintos grupos analizamos

estadísticamente los datos obtenidos del campo abierto. Utilizamos un análisis de tipo

ANOVA para analizar diferencias dentro de una misma sesión entre los diferentes

grupos de ratones para ver el efecto de los diferentes tratamientos. Utilizamos el test t-

Student para analizar las posibles diferencias dentro de un mismo grupo entre ambas

sesiones. Consideramos las diferencias como significativas a un p-valor < 0.05. Todos

los análisis fueron realizados mediante el paquete informático SPSS 15.0 para

Windows.

RESULTADOS

Niveles de T4 en los diversos grupos

Para comprobar el efecto hipotiroideo del tratamiento, medimos los niveles en

sangre de T4. Realizamos un patrón de concentración conocida e interpolamos en la

recta para obtener los µg/dL de T4 y, corregimos la absorbancia de cada una de las

medidas teniendo en cuenta la absorbancia del control negativo. A continuación,

analizamos si las diferencias observadas entre los grupos control, desarrollo y anti-

tiroideo total, son significativas o no, mediante un test ANOVA (Tabla 2). Podemos ver

que no hay diferencias estadísticamente significativas entre los grupos en los niveles de

T4 en sangre.

Test de campo abierto

Uno de los efectos más reportados en la bibliografía sobre el hipotiroidismo son

las alteraciones comportamentales como la ansiedad o el miedo. Para testar esta

hipótesis, realizamos el test de campo abierto con los distintos grupos, sobre los que

medimos variables que nos informan sobre la ansiedad o estrés de los animales.

Para analizar la significatividad de los datos obtenidos entre los distintos grupos dentro

de cada sesión, hemos empleado un test ANOVA. Para ello hemos utilizado únicamente

la variable “tiempo en la zona interna”, que es una medida de la ausencia de ansiedad.

El motivo de seleccionar este parámetro es que el resto de variables contienen

numerosos valores 0, los cuales no se pueden utilizar para hacer un test ANOVA. Otra

variable que podíamos haber elegido es la latencia, pero hemos preferido la anterior,

porque creemos que en este factor la inexperiencia en la manipulación de los ratones por

parte de los experimentadores, puede introducir un mayor grado de estrés que se

traduzca en un aumento de la latencia. En cuanto a los resultados, no se obtiene nada

significativo en ninguna de las primera sesión (Tabla 4.a), pero en la segunda sesión

hay diferencias significativas (Tabla 4.b) ya que obtenemos un p-valor < 0.05, debido

a que grado de ansiedad entre ambas sesiones varía, disminuyendo el estado de

ansiedad en la segunda sesión.

DISCUSIÓN

El objetivo de los experimentos llevados a cabo ha sido testar el papel de las HT

en el desarrollo. Para ello hemos sometido a los ratones del experimento a un

tratamiento anti-tiroideo de diversa duración. Para comprobar la efectividad del

tratamiento medimos los niveles de T4 en sangre. A la vista de nuestros resultados, no

podemos afirmar que tengamos diferencias estadísticamente significativas en cuanto a

los niveles de T4 entre los diversos grupos. Esto no es lo que esperaríamos, porque

debería al menos haber una diferencia entre los controles y los tratados. Podría deberse

a que el tratamiento no ha sido efectivo, pero en principio este es el tratamiento que

hemos visto que se usa en este tipo de experimentos. Por tanto, nosotros creemos que es

debido a un pequeño tamaño muestral, ya que dos de los grupos tienen una n=7 y n=6,

ya que es el mínimo indispensable para poder hacer el análisis es de n=5.

El otro punto de estudio, es comprobar la ansiedad de los ratones, que se puede

cuantificar con el test del campo abierto. Mediante el análisis ANOVA, podemos decir

que nuestros datos no arrojan evidencia significativa, que demuestren un diferente nivel

de ansiedad entre los distintos grupos, este hecho se produce en la sesión 1. Pero hemos

comprobado que en la sesión 2 hay diferencias significativas (Tabla 4.b) ya que

obtenemos un p-valor < 0.05, debido a que grado de ansiedad entre ambas sesiones

varía, y por lo tanto hay diferencias significativas que evidencian un diferente nivel de

ansiedad entre los distintos grupos.

Como en el caso anterior, también hemos analizado si hay diferencias en cada

grupo entre las 2 sesiones, y en esta ocasión si que obtenemos significatividad para

todos los grupos. Podemos así decir que, en la segunda sesión todos los ratones

muestran una menor ansiedad. Ya que fisiológicamente tiene sentido que el control

tiene una ansiedad constante, ya que no se la ha sometido a ningún tratamiento. Por

tanto, creemos que las diferencias observadas en los diferentes grupos se debe a que en

la segunda sesión los ratones no presentaban la misma ansiedad en relación a la primera

sesión, por otra parte, a la inexperiencia al manipular los animales por parte de los

experimentadores, que puede inducir estrés y ansiedad a los animales, y en la primera

toma de contacto que fue la primera sesión pudo darse este hecho.

En conclusión, con todos nuestros resultados experimentales obtenidos, no

podemos afirmar que el hipotiroidismo influye sobre la ansiedad. Pero creemos que

debería hacerse de nuevo el estudio, con un mayor número de ratones en cada grupo y

minimizando los errores introducidos por el investigador y realizar más sesiones de

toma de datos ya que los datos obtenidos en una sesión y otra son muy diferentes (son

contarios) y para obtener un menor error muestral y experimental.

BIBLIOGRAFÍA

Guadaño-Ferraz A, Benavides-Piccione R, Venero C, Lancha C, Vennström B,

Sandi C, DeFelipe J, Bernal J. Lack of thyroid hormone receptor alpha1 is

associated with selective alterations in behavior and hippocampal circuits. Mol

Psychiatry. 2003 Jan;8(1):30-8.

Hasebe M, Matsumoto I, Imagawa T, Uehara M. Effects of an anti-thyroid drug,

methimazole, administration to rat dams on the cerebellar cortex development in

their pups. Int J Dev Neurosci. 2008 Aug;26(5):409-14. Epub 2008 Mar 30

Reis-Lunardelli EA, Ramirez MR, Castro CC, Coitinho AS, Bavaresco C, da

Trindade LS, Perrenoud MF, Wyse AT, Sarkis JJ, Izquierdo I. Effects of an

acute treatment with L-thyroxine on memory, habituation, danger avoidance,

and on Na+, K+ -ATPase activity in rat brain. Curr Neurovasc Res. 2007

Nov;4(4):259-67.

Sun Y, Zupan B, Raaka BM, Toth M, Gershengorn MC. TRH-receptor-type-2-

deficient mice are euthyroid and exhibit increased depression and reduced

anxiety phenotypes. Neuropsychopharmacology. 2009 May;34(6):1601-8. Epub

2008 Dec 10.

Van Wijk N, Rijntjes E, van de Heijning BJ. Perinatal and chronic

hypothyroidism impair behavioural development in male and female rats. Exp

Physiol. 2008 Nov;93(11):1199-209. Epub 2008 Jun 20.

Venero C, Guadaño-Ferraz A, Herrero AI, Nordström K, Manzano J, de Escobar

GM, Bernal J, Vennström B. Anxiety, memory impairment, and locomotor

dysfunction caused by a mutant thyroid hormone receptor alpha1 can be

ameliorated by T3 treatment. Genes Dev. 2005 Sep 15;19(18):2152-63. Epub

2005 Aug 30.

Wilcoxon JS, Nadolski GJ, Samarut J, Chassande O, Redei EE. Behavioral

inhibition and impaired spatial learning and memory in hypothyroid mice

lacking thyroid hormone receptor alpha. Behav Brain Res. 2007 Feb

12;177(1):109-16. Epub 2006 Nov 28.

TABLAS Y FIGURAS

Figura 1. Esquema test ELISA/competicion.

Figura 2. Frecuencias de concentración de T4 en los diferentes grupos experimentales.

Control

Desarrollo

Total

0

5

10

15

20

25

AL1

.1

AL1

.2

AL2

.5

AL2

.6

AL2

.7

AL3

.1

AL3

.2

AL1

.5

AL1

.6

AL2

.8

AL2

.9

AL2

.10

AL3

.4

AL1

.7

AL1

.8

AL2

.1

AL2

.2

AL2

.3

AL2

.4

AL3

.3

[T4

] m

icro

g/d

l

Animales

Evolución [T4] microg/dl

Figura 2. Evolución de la media de la concentración de tiroxina en los tratamientos.

tratamiento

3,0002,0001,000

Me

dia

de

tir

oxin

a

16,000

15,000

14,000

13,000

12,000

11,000

10,000

Figura 4. Evolución resultados en la sesión 1.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

control

desarrollo

Tratamiento

Figura 5. Evolucion resultados en la Sesion 2.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Tº Interna Defec Ext Defec Int Expl Ext Expl Int Aseos Ext Aseos Int

control

desarrollo

tratamiento

Tabla1. Análisis estadístico descriptivo para los niveles de T4.

N Media Desviación

típica Error típico

Intervalo de confianza para la media al 95%

Mínimo Máximo Límite inferior Límite

superior

1,000 7 15,11829 3,920630 1,481859 11,49231 18,74426 9,079 19,617

2,000 6 12,72633 3,207874 1,309609 9,35988 16,09279 7,238 16,257

3,000 7 10,84743 3,605502 1,362752 7,51290 14,18196 2,829 13,363

Total 20 12,90590 3,878384 ,867233 11,09076 14,72104 2,829 19,617

Tabla 2. Resultados análisis estadístico ANOVA para los niveles de T4.

Suma de

cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

npInter-grupos

64,117 2 32,059 2,458 ,115

Intra-grupos 221,678 17 13,040

Total 285,795 19

Tabla3. Análisis estadístico descriptivo campo abierto por sesión.

3a. Sesión 1.

N Media Desviación

típica Error típico

Intervalo de confianza para la media al 95%

Mínimo Máximo Límite inferior Límite

superior

1,000 10 50,20000 21,857112 6,911826 34,56436 65,83564 30,000 107,000

2,000 8 32,37500 18,912864 6,686707 16,56345 48,18655 14,000 76,000

3,000 10 50,30000 16,459040 5,204805 38,52591 62,07409 19,000 80,000

Total 28 45,14286 20,246105 3,826154 37,29224 52,99348 14,000 107,000

3b. Sesión 2

N Media Desviación

típica Error típico

Intervalo de confianza para la media al 95%

Mínimo Máximo Límite inferior Límite

superior

1,000 10 21,70000 10,011660 3,165965 14,53809 28,86191 3,000 36,000

2,000 8 ,37500 ,744024 ,263052 -,24702 ,99702 ,000 2,000

3,000 10 1,10000 ,994429 ,314466 ,38863 1,81137 ,000 3,000

Total 28 8,25000 11,755613 2,221602 3,69165 12,80835 ,000 36,000

Tabla 4. Resultados análisis estadístico ANOVA Campo abierto por sesión.

3a. Sesion 1

Suma de

cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

Inter-grupos 1825,854 2 912,927 2,470 ,105

Intra-grupos 9241,575 25 369,663

Total 11067,429 27

4b.Sesion 2

Suma de

cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

Inter-grupos 2816,375 2 1408,188 38,480 ,000

Intra-grupos 914,875 25 36,595

Total 3731,250 27