ESPECTROSCOPÍA LUMINISCENTE:

Existen tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí llamados: fluorescencia y fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos, las moléculas de analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo.

Los métodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes moleculares.

La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitación se consigue mediante la absorción de fotones. Como consecuencia, con frecuencia se alude a los dos fenómenos con el término más general de fotoluminiscencia.

La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transiciones electrónicas responsables de la fluorescencia no conllevan un cambio en el espín del electrón. Como consecuencia, la fluorescencia presenta una vida corta cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).

Por el contrario, las emisiones de fosforescencia están acompañadas por un cambio en el espín del electrón, que hace que la radiación se mantenga durante un tiempo fácilmente detectable, después de haber acabado la irradiación – a menudo varios segundos después o más. En la mayoría de los casos, la emisión fotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es de mayor longitud de onda que la radiación utilizada para su excitación.

Uno de los aspectos más atractivos de la luminiscencia es su inherente sensibilidad, con límites de detección que suelen ser de uno a tres órdenes de magnitud inferiores a los encontrados en la espectroscopia de absorción. Los límites de detección características son del orden de partes por billón.

Debido a su alta sensibilidad, los métodos luminiscencia cuantitativos suelen sufrir serios efectos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra.

Por esta razón las medidas luminiscentes se suelen combinar con las extraordinarias técnicas de cromatografía y electroforesis.

En general los métodos luminiscentes se aplican menos que los métodos de absorción en los analitos cuantitativos debido a que el número de especies que absorben radiación ultravioleta / visible es mucho mayor que el de especies que presentan fotoluminiscencia tras la absorción de radiación en esta región del espectro.

Teoría de la Fluorescencia y de la Fosforescencia

La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, líquidos y sólidos, tanto sencillos como complejos.

El tipo más sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores atómicos diluidos. Por ejemplo:

Los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado 3p mediante la absorción de radiación de longitudes de onda de 5 896 a 5 890 Å.

Después de 10-8 a 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo radiación de estas mismas longitudes de onda en todas las direcciones.

Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sin cambio de frecuencia, se conoce como radiación de resonancia o fluorescencia de resonancia.

Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia

Para diferenciar entre los fenómenos de fotoluminiscencia se requiere una revisión del spín del electrón y de los estados excitados singulete / triplete.

Espín del electrón

El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haber dos

electrones con los cuatro números cuánticos iguales. Esta restricción requiere que no

haya más de dos electrones en un orbital, y además, los dos deben tener los estados de

espín opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que los espines están apareados. Debido al

apareamiento de espines, la mayoría de las moléculas no presentan un campo magnético

neto y se dice, por tanto, que son diamagnéticas, es decir, no son atraídas ni repelidas por

campos magnéticos permanentes.

Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados, tienen un

momento magnético y, consecuentemente, son atraídos cuando se encuentran en un

campo magnético; por ello, se dice que los radicales libres son paramagnéticos

Estados excitados singlete/triplete

Un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de los electrones están

apareados se llama singlete y cuando la molécula se expone a un campo magnético no se

produce un desdoblamiento de niveles de energía. Por otro lado, el estado fundamental

para un radical libre, es un estado doblete, porque el electrón impar puede tomar dos

orientaciones en un campo magnético, lo que comunica ligeras diferencias de energía al

sistema.

Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía superior,

se forma un estado singlete o triplete. En el estado singlete excitado, el espín del electrón

promocionado continua apareado con el electrón del estado fundamental; sin embargo, en

el estado triplete las espiones de los dos electrones se han desapareado y, por tanto,

están paralelos. Estos estados pueden representarse como sigue, donde las flechas

representan la dirección del espín.

Velocidades de absorción y de emisión

La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es enorme, el proceso requiere

del orden de 10-15 a 10-14 s. Por otro lado, la emisión fluorescente, tiene lugar a una

velocidad significativamente más lenta. El tiempo de vida del estado excitado se relaciona

inversamente con la absortividad molar del pico de absorción correspondiente al proceso

de excitación. Por tanto, para absortividades molares comprendidas entre 103 y 105, los

tiempos de vida del estado excitado son de 10-9 a 10-7 s. Para sistemas débilmente

absorbentes, donde la probabilidad del proceso de transición es más pequeña, los

tiempos de vida pueden ser tan largos como de 10-6 a 10-5 s. Como se ha señalado, la

velocidad promedio de una transición triplete a singulete es menor que la correspondiente

transición singulete a singulete. Por ello, la emisión fosforescente requiere tiempos

comprendidos entre 10-4 y 10s o superiores.

Procesos de desactivación

Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinación

de varias etapas mecanísticas. Como muestran las flechas verticales rectas de la Figura,

dos de estas etapas, fluorescencia y fosforescencia, conllevan la emisión de un fotón de

radiación. Las otras etapas de desactivación, indicadas por flechas onduladas, son

procesos no radiantes. El camino más propicio hacia el estado fundamental es aquel que

minimiza el tiempo de vida del estado excitado. Por ello, si la desactivación por

fluorescencia es más rápida que los procesos no radiantes, se observa tal emisión.

Por otro lado, si la desactivación no radiante tiene una constante de velocidad más

favorable, la fluorescencia desaparece o es menos intensa

La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño de sistemas que

incorporan características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los

procesos de relajación desactivación no radiantes se ralenticen hasta el punto en el que la

reacción de emisión puede competir cinéticamente con ellos. La información referente a

los procesos de emisión es suficientemente completa para permitir un cálculo cuantitativo

de estas velocidades. Sin embargo, la comprensión de los otros caminos de desactivación

es, en el mejor de los casos, rudimentaria; para estos procesos, sólo se pueden realizar

afirmaciones o especulaciones cualitativas sobre las velocidades y los mecanismos.

Fosforescencia

La desactivación del estado electrónico excitado también puede incluir la fosforescencia.

Después del cruce entre sistemas a un estado triplete excitado, la desactivación posterior

puede tener lugar por conversión interna o externa o por fosforescencia.

Una transición triplete singlete es mucho menos probable que una conversión

singlete/singlete; como se ha dicho, el tiempo de vida medio de un estado triplete excitado

respecto a la emisión oscila entre 10-4 y 10 s o más. Por tanto, la emisión causada por una

transición de este tipo puede persistir durante algún tiempo después que la irradiación se

haya interrumpido.

Las conversiones externas e internas compiten con tanto éxito con la fosforescencia que

este tipo de emisión se observa normalmente sólo a bajas temperaturas, en medios

altamente viscosos o por moléculas que están adsorbidas sobre superficies sólidas.

Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia

Tanto la estructura molecular como el entorno químico van a influir en que una sustancia

sea o no luminiscente; estos factores también determinan la intensidad de emisión cuando

tiene lugar la fotoluminiscencia.

En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas variables.

Rendimiento cuántico

El rendimiento cuántico, o la eficacia cuántica, de fluorescencia de fosforescencia es

simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia respecto

al número total de moléculas excitadas. Para moléculas altamente fluorescentes como la

fluoresceína, la eficacia cuántica, bajo determinadas condiciones, se aproxima a la

unidad. Las especies químicas que no presentan una fluorescencia apreciable tienen

eficacias que se aproximan a cero.

Tipos de transiciones en fluorescencia

Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es consecuencia de la absorción de

radiación ultravioleta de longitud de onda menor de 250 nm, ya que tal radiación es

suficientemente energética como para producir la desactivación de los estados excitados

por predisociación o disociación. Por ejemplo, una radiación de 200 nm corresponde a

aproximadamente 140 kcal/mol; la mayoría de las moléculas tienen al menos algún enlace

que se puede romper con energías de esta magnitud.

Como consecuencia, rara vez se observa fluorescencia debida a transiciones * , en

cambio, este tipo de emisión está asociada a los procesos menos energéticos * y

* n.

Fluorescencia y estructura

La fluorescencia más intensa y la más útiles la que presentan los compuestos que

contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones * de baja energía. Los

compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o

estructuras con dobles enlaces altamente conjugados también pueden presentar

fluorescencia, pero el número de estos compuestos es pequeño comparado con el

número de sistemas aromáticos.

La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en

disolución, la eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con su

grado de condensación. Los heterociclos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y

el pirrol,

no presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con éstas

normalmente sí la presentan. En los heterociclos con nitrógeno, se cree que la transición

electrónica de más baja energía implica a un sistema n * que rápidamente se

transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.

Sin embargo, la condensación de anillos bencénicos para dar núcleos heterocíclicos, da

lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorción. En estas estructuras,

el tiempo de vida del estado excitado es más corto, así, se observa fluorescencia en

compuestos como la quinolina, la isoquinolina y el indo!.

Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia

La potencia de la emisión fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de

excitación absorbido por el sistema. Esto es,

F = K'(Po- P)

Donde Po es la potencia del haz que incide sobre la disolución y P es su potencia después

de atravesar una longitud b del medio. La constante K' depende de la eficacia cuántica del

proceso de fluorescencia.

Con el objeto de relacionar F con la concentración de la especie fluorescente, se escribe

la ley de Beer de la forma .

INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA

FOSFORESCENCIA

Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros ultravioleta/visible. La siguiente gráfica muestra una configuración característica de estos componentes en los fluorómetros y los espectrofluorímetros. Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz tal como se muestra, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.

Dispositivo de lectura

Amplificador diferencial

Fotomultiplicador de la muestra

Fotomultiplicador de referencia

Atenuador

del haz

Filtro o

Monocromador de emisión

Radiación dispersada Filtro o

Monocromador de excitación

Muestra Fuente

El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro o un monocromador de excitación, que transmite la radiación que provocará la fluorescencia pero excluye o limita la radiación de la longitud de onda de la emisión fluorescente.

La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo más conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de excitación; a otros ángulos, la dispersión producida en la disolución y en las paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes errores en la medida de la intensidad. La radiación emitida llega a un fotodetector después de haber pasado por un segundo filtro o monocromador que aísla la fluorescencia para su medida.

El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a aproximadamente la de la radiación fluorescente (normalmente la potencia se reduce en un factor de 100 o más. Las señales procedentes del fotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o en un registro. Algunos instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condición se consigue con atenuadores ópticos o eléctricos. Los instrumentos más modernos utilizan un circuito divisor analógico o un sistema de adquisición de datos digital seguido de tratamiento de los datos para obtener la relación entre la intensidad de la emisión fluorescente y la intensidad de la fuente de radiación.

Espectrometría de luminiscencia molecular

Diseños de instrumentos

Fluorómetros

Los fluorómetros de filtro proporcionan una forma relativamente simple y barata de llevar a

cabo análisis cuantitativos por fluorescencia. Como ya se ha señalado para seleccionar

las longitudes de onda de la radiación de excitación y de emisión se utilizan filtros de

interferencia y de absorción. Generalmente, los fluorómetros son compactos, robustos y

fáciles de usar.

La Figura muestra un esquema de un fluorómetro de filtros característico que consta de

una lámpara de mercurio para la excitación de la fluorescencia y un par de tubos

fotomultiplicadores como detectores. El haz que sale de la fuente se divide cerca de ella

en un haz de referencia y en un haz de muestra. El haz de referencia se atenúa mediante

el disco de apertura hasta que su intensidad sea aproximadamente la misma que la

intensidad de fluorescencia. Ambos haces pasan a través del filtro primario y a

continuación el haz de referencia se refleja hacia el tubo fotomultiplicador de referencia.

El haz de muestra se enfoca sobre la muestra mediante un par de lentes y provoca la

emisión de fluorescencia. La radiación emitida pasa a través de un segundo filtro que

posteriormente se enfoca sobre un segundo tubo fotomultiplicador. Las señales de salidas

eléctricas de los dos detectores se dirigen hacia un divisor analógico, para obtener la

relación entre las intensidades de la muestra y de referencia, que sirve como parámetro

analítico.

Espectrofluorímetros

Algunos fabricantes de instrumentos ofertan espectrofluorímetros capaces de obtener los

espectros de excitación y los de emisión. En la Figura se muestra el diseño óptico de uno

de ellos, que utiliza dos monocromadores de red. La radiación que procede del primer

monocromador se divide en dos, una parte se dirige hacia el fotomultiplicador de

referencia y la otra hacia la muestra. La radiación fluorescente resultante, después de ser

dispersada en el segundo monocromador, se detecta en un segundo fotomultiplicador.

Un instrumento como el que se muestra en la Figura suministra perfectamente espectros

satisfactorios para el análisis cuantitativo. Sin embargo, los espectros de emisión

obtenidos no son necesariamente comparables con los de otros instrumentos, ya que la

señal de salida depende no sólo de la intensidad de fluorescencia sino también de las

características de la lámpara, del detector y de los monocromadores. Todas estas

características instrumentales varían con la longitud de onda y difieren de un instrumento

a otro. Se han desarrollado varios métodos para obtener el espectro corregido, que es el

verdadero espectro de fluorescencia.

FosforÍmetros

Los instrumentos que se utilizan para estudios de fosforescencia tienen diseños similares

a los fluorómetros y a los espectrofluorímetros antes considerados, sólo difieren en que

requieren dos componentes adicionales. El primero es un dispositivo que irradia

alternativamente la muestra y, después de un retraso en el tiempo adecuado, mide la

intensidad de fosforescencia. El retraso en el tiempo es necesario para diferenciar la

emisión fosforescente de larga vida de la emisión fluorescente de corta vida que podrían

originarse en la misma muestra. Se utilizan dispositivos mecánicos y electrónicos y

muchos instrumentos de fluorescencia comerciales tienen accesorios para medidas de

fosforescencia. Un ejemplo de un tipo de dispositivo mecánico se muestra en la Figura.

APLICACIONES Y MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES

Es inherente a los métodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables a intervalos de

concentración más bajos que las medidas espectrofotométricas de absorción y se

encuentran entre las técnicas analíticas más sensibles de las que puedan disponer los

científicos. El aumento de sensibilidad surge del hecho de que el parámetro relacionado

con la concentración en fluorimetría y en fosforimetría F se puede medir

independientemente de la potencia de la fuente Po. Por el contrario, una medida de

absorbancia requiere la evaluación de Po y de P, ya que la absorbancia, que es

proporcional a la concentración, depende de la relación entre estas dos cantidades. La

sensibilidad de un método fluorimétrico puede mejorarse aumentando Po o mediante la

amplificación adicional de la señal de fluorescencia. Por el contrario, en

espectrofotometría, un aumento en Po da lugar a un cambio proporcional en P y, por ello,

no afecta a la A. Por tanto, los métodos fluorimétricos tienen, generalmente,

sensibilidades que son de uno a tres órdenes de magnitud superiores a los

correspondientes de absorción. Por otro lado, la precisión y la exactitud de los métodos

fotoluminiscentes son habitualmente más pobres que las de los procedimientos

espectrofotométricos en un factor entre, quizás, dos y cinco. Generalmente, los métodos

fosforescentes son menos precisos que sus correspondientes métodos fluorescentes.

Determinación fluorimétrica de especies inorgánicas

Los métodos inorgánicos fluorimétricos son de dos tipos. Los métodos directos que

conllevan la formación de un quelato fluorescente y la medida de su emisión. Un segundo

grupo, que se basa en el descenso de la fluorescencia que resulta de la acción

amortiguadora de la sustancia que va a ser determinada.

La última técnica se ha utilizado más en la determinación de aniones.

Determinación fluorimétrica de especies orgánicas

El número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a especies orgánicas y bioquímicas es

impresionante.

Por ejemplo, Weissler y White han recopilado los métodos para la determinación de más

de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad de compuestos orgánicos, enzimas y

coenzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides y vitaminas. Es

incuestionable que las aplicaciones más importantes de la fluorimetría se encuentran en el

campo del análisis de productos alimentarios, farmacéuticos, muestras clínicas y

productos naturales. La sensibilidad y la selectividad del método hacen que sea una

herramienta particularmente valiosa en estos campos.

Espectro de dispersión

El color azul del cielo durante el día y el color rojo del sol en el ocaso se deben a la dispersión de la luz por las pequeñas partículas de polvo, moléculas de agua y otros gases de la atmosfera .La eficiencia con que se dispersa la luz depende de su longitud de onda. El cielo es azul porque las luces violetas y azules se dispersan en mayor medida que otras longitudes de onda mayores de la luz. Por la misma razón, el sol parece rojo al atardecer porque la dispersión de la luz roja es menos eficiente y , por tanto , se transmite mejor que las demás longitudes de onda de la luz .La dispersión de la radiación ha sido objeto de estudios desde finales del siglo xix y sus aplicaciones se iniciaron poco después .Las primeras aplicaciones a cuantitativas de la dispersión , que datan de principios del siglo xx, usaron la dispersión elástica de la luz para determinar la concentración de partículas coloidales en suspensión.

Origen de la dispersión

Un haz de radiación monocromático enfocad de longitud de onda  λ, que pasa a través de

un medio en el que existen partículas cuyas motores dimensiones son inferiores a 32

λ, se

dispersa en todas direcciones. Por ejemplo, la reducir visible de 500 nm es dispersada por partículas de incluso 750 nm de dimensiones máximas. Si las partículas son motores, la radiación puede ser reflejada o refractada. SE reconocen dos categorías generales de dispersión. En la dispersión elástica el analito absorbe la radiación y la vuelve a emitida sin cambio alguno de la energía de la radican .Cuando la radiación es remitida con cambio de su energía, se dice que la dispersión es inelástica. En este texto solo se considera la dispersión elástica.

La dispersión elástica puede ser de dos tipos: dispersión de pequeñas partículas o Rayleigh y dispersión de grandes partículas La dispersión Rayleigh se pr5oduce cuando la dimensión máxima de las partículas que producen la dispersión es inferior al 5% de la longitud de onda de la radiación. La intensidad de la radiación dispersa se distribuye de manera simétrica (Fig.10-53ª) y es proporcional a su frecuencia a la cuarta (v4 ), lo que significa que la dispersión de la luz azul sea mayor que la dispersión de la luz roja .Cuando las partículas son mayores, la distribución de la luz dispersada aumenta en sentido anterógrado y disminuye en sentido. Retrogrado, a causa de las interferencias constructivas y destructivas.

Turbidimetria y nefelometría

La turbidimetria y la nefelometría son dos técnicas relacionadas en las que una fuente de radiación incidente sufre una dispersión elástica ejercida por una suspensión de partículas coloidales. En la turbidimetria, el detector se coloca en línea con la fuente de ración y se mide la disminución de la potencia trasmitida de la radican .En la nefelometría, la radiación dispersada se mide en un ángulo de 90° en relación con la fuete de radiación. La similitud de las medidas de la turbidimetria con la absorbancia y de la nefelometría con la fluorescencia resultan evidentes en los diseños de los aparatos de bloques .De hecho, la turbidez puede medirse con un espectrofotómetro uv/Vis, por ejemplo un spectronic-20, mientras que en nefelometría puede utilizarse un espectrofluorimetro.

Turbidimetria .Método en que se mide la disminución de la radiación transmitida debido a la dispersión

Nefelometría: Método para medir la intensidad de una radiación dispersa en un ángulo de 90° c con respecto a la fuente.

Turbidimetria o nefelometría. La elección entre turbidimetria y nefelometría depende de dos factores. El más importante es la intensidad de la traición transmitida o dispersada en relación con la intensidad de la radiación procedente de la fuente.

Fuente

Fuente

Cuando la concentración de partículas dispersantes presentes en la disolución es pequeña, la intensidad de la radiación transmitida I T . Sera muy similar a la de la fuente de

radiación, I 0. Como ya se dijo en la sección de absorción molecular la determinación de una pequeña diferencia entre dos señales intensas está sometida a una notable incertidumbre. Por tanto, la mejor elección cuando las muestras contienen pocas partículas dispersantes es la nefelometría. Por el contrario, la turbidimetria es una técnica mejor para las muestras que contienen concentraciones elevadas de partículas dispersantes.

La segunda consideración a tener en cuenta se elige entre turbidimetria y nefelometría es el tamaña de las partículas dispersas. EN el caso de la nefelometría la intensidad de la radiación dispersada a 90° será mayor si las partículas son bastante pequeñas para que se produzca una dispersión Reyleigh .Si las partículas son mayores la intensidad de la dispersión disminuirá a 90°. Cuando se utiliza una fuente de tradición ultravioleta o visible el tamaño óptimo de las partículas es de 0.1-1um .El tamaño de las partículas dispersadas provoca un incremento de la reflexión y la refracción (aunque en este caso es posible perder la relación lineal entre la señal y la concentración de partículas dispersantes).

Determinación de la contracción mediante turbidimetria .En turbidimetria la transmitancia medida, T ,es el cociente entre la intensidad de la fuente de radiación transmitida, I T y la

intensidad de la radiación de la fuente transmitida por un blanco ,I 0 :

T=I TI 0

La relación entre la transmitancia y la concentración de las partículas dispersas es similar a la proporcionada por la ley de Beer

−logT kbC

Donde C es la concentración de las partículas dispersantes expresada como masa por unidad de volumen (p/v), b es la longitud del camino óptico y k es una constante que depende de varios factores entre ellos el tamaño y la forma de las

bb

Fuentes Selector de longitud de

honda

Muestra Detector Procesador de la señal

Fuente Selector de longitud de

onda

Muestra

Partículas dispersantes y la longitud de onda de la fuente de radiación. Igual que sucede en la ley de Beer, la ecuación señalada anterior puede sufrir importantes desviaciones con respecto a la línea recta. La relación exacta se establece mediante una curva de calibración que se prepara usando un conjunto de patrones con concentraciones conocidas.

Determinación de la concentración por nefelometría.

En nefelometría la relación entre la intensidad de la radiación dispersada I s , y la concentración (% p/v ) de las partículas dispersantes se expresa como

I s=K s I 0C

Donde K es una constante empírica del sistema e I 0 es la intensidad de la fuente de

radiación .El valor de K s depende de una curva de calibración preparada usando una serie de patrones de concentración conocida.

Selección de la longitud de onda de la radiación incidente. La selección de la longitud de la onda de la radiación incidente depende, sobre todo, de la necesidad de reducir al mínimo las posibles interferencias. En el caso de la turbidimetria, en la que la radiación incidente se transmite a través de la muestra, hay que evitar la radiación absorbida por la muestra. Como la absorción es un problema habitual, la longitud de onda debe seleccionarse con cierto cuidado, usando para ello un filtro o un selector monocromático. En el caso de la nefelometría, la absorción de la radiación incidente no constituye un problema, a menos que induzca fluorescencia en la muestra. Si la muestra no es fluorescente, no será necesario seleccionar una longitud de onda determinada y podrá usarse una fuente de luz blanco como radicon incidente. Cundo se usa un filtro o un selector monocromático, otros factores a tener en cuenta son la dependencia de la intensidad de la fuente en la longitud de onda.

La mayor parte de los métodos turbidimètricos y nefelómetros se basa en la formación de partículas dispersantes mediante precipitación las propiedades de un precipitado depende de las condiciones en que se produce la precipitación depende de las condición en que se produce la precipitación. Para mantener una distribución reproducible de los tamaños de las partículas entre muestras y patrones, es necesario controlar parámetro tales como la concentración de los reactivos, el orden en que añaden , el pH , la temperatura , la velocidad de agitación , la fuerza iónica y el tiempo entre la formación inicial del precipitado y el momento en que se miden la transmitancia o la dispersión .

En muchos casos, se añaden agentes tensoactivo como la glicerina, la gelatina o la dextrina, para estabilizar el precipitado en un estado coloidal y evitar la coagulación de las partículas.

Espectroscopia de emisión

Un analítico en estado excitado posee una energía E2 mayor que la pose cuando se

encuentra en un estado de menor energía E1 . Cuando el analito se relaja o retorna al estado de energía más baja, el exceso de energía.

∆E=E2 - E1

El tiempo y vida de un analito en estado excitado, A. es breve y dura, en general, de 10−5

a 10−9 segundos para los estados excitados electrónicos y 10−15 segundos para los

estados excitados vibratorios. La relajación se produce mediante colisiones entre A. y otras especies de la muestra, por reacciones fotoquímicas y por la emisión de fotones. En el primero de estos procesos, llamado desactivación vibratoria o relajación no radiactiva, el exceso de energía se libera en forma de calor así:

A. A❑ + Calor

La relajación por reacción fotoquímica puede suponer una reacción de descomposición en la que A. se divide:

A. X + Y

O una reacción de A. y otra especie:

A. + Z X + Y

En todo caso, el exceso de energía se utiliza en la reacción química o se libera en forma de calor.

En el tercer mecanismo, el exceso de energía se libera como un fotón de radiación electromagnética:

A. A + hv

Tiempo de vida

Tiempo durante el cual un analito se mantiene en el estado excitado antes de regresar a su estado de menor energía

Relajación

Cualquier proceso por el que el anilito recupera un estado de baja energía desde un estado de alta energía

La liberación de un fotón tras una excitación termia denomina emisión y la que sigue a la absorción de un fotón es conoce como fotoluminiscencia, en el quimioluminiscencia y en la bioluminiscencia, la excitación de lugar, respectivamente a una reacción química obioquímica. Los métodos espectroscópicos basados en la fotoluminiscencia.